JP2003116549A - Ｐ９０抗体またはプローブを用いた前癌細胞または癌細胞の検出方法 - Google Patents

Ｐ９０抗体またはプローブを用いた前癌細胞または癌細胞の検出方法

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Cathy A Finlay
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Carlos Cordon-Cardo
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明は、ｐ５３とｄｍ２の発現レベル
または遺伝子増幅を測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れ
か一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレベルの上昇によ
り癌であると診断する癌診断方法を提供する。また本発
明は、ｐ５３とｄｍ２の発現レベルまたは遺伝子増幅を
測定し、ｐ５３とｄｍ２の内の何れか一方またはｐ５３
とｄｍ２の両方のレベルの上昇により予後が悪いと判断
する癌の進行を予測する方法を提供する。 【効果】 癌の予後が診断できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は癌の予後の判断方法
に関する。本出願は、１９９３年６月２５日出願のＰＣ
Ｔ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６０６３号の一部継続出
願であり、このＰＣＴ出願は１９９３年２月１７日出願
の米国特許出願第０８／０１８６４９号の一部継続出願
である。そして、その米国特許出願は１９９２年６月２
６日出願の米国特許出願第０７／９０４７６６号の一部
継続出願であり、その米国特許出願第０７／９０４７６
６号は１９９１年７月１２日出願の米国特許出願第０７
／７０３１８５号の一部継続出願である。さらに、その
米国出願第０７／７０３１８５号は１９９０年６月２７
日出願の米国特許出願第０７／５４３９６３号の一部継
続出願であり、これらの出願は本出願の一部を構成する
ものとする。
【０００２】
【従来の技術】体細胞における癌原遺伝子における突然
変異がヒトの癌の誘発に大きな影響を与えていることが
徐々に認識されてきている。そのような癌遺伝子の突然
変異の例としては、ｎｅｕ、ｆｅｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、
ｍｙｂ、ｆｍｓ、Ｈａ−ｒａｓおよびＫｉ−ｒａｓが挙
げられる。癌原遺伝子が癌遺伝子に転換する突然変異は
点変異であることが多い。癌原遺伝子およびその発現産
物がどの様にして正常な細胞を癌細胞に転換するのかを
理解するために更に検討する必要がある。一般に癌遺伝
子は優性的に作用すると考えられている。これは、癌原
遺伝子から癌遺伝子への変換により、新しい機能、即ち
強化転換が生じていることを意味すると考えられてい
る。
【０００３】癌に関連する別の形式の突然変異は、腫瘍
抑制遺伝子が改変されその遺伝子産物が腫瘍抑制機能を
失った時に生じる。腫瘍抑制遺伝子の例は網膜芽細胞腫
感受性遺伝子Ｒｂである。厳密に言うと腫瘍抑制遺伝子
は腫瘍の形成に寄与しないが、腫瘍抑制遺伝子は時とし
て劣性癌遺伝子と呼ばれる。両対立遺伝子が突然変異し
た場合には、腫瘍抑制遺伝子が無いことで腫瘍形成が促
進するためその表現型は劣性である。
【０００４】優性および劣性の癌原遺伝子の両方の特性
を示す遺伝子産物は５３ｋｄのリンタンパクｐ５３であ
る。ｐ５３遺伝子の突然変異が種々の癌の多くのものに
関連していることが徐々に立証されてきている。例え
ば、Ｉｇｇｏら著のＬａｎｃｅｔ３３５、ページ６７５
〜６７９（１９９０年）には、ｐ５３は、肺癌において
突然変異を受ける最も一般的な癌原遺伝子であるとの見
解が示されている。
【０００５】ｐ５３について知られていることの多く
は、野生型と突然変異型のマウスｐ５３をネズミの繊維
芽細胞に移入した場合の影響を調べることによって得た
ものである。この研究は、Ｌｅｖｉｎｅらによる「小形
ＤＮＡ腫瘍ウイルスによる転換の一般的メカニズム」に
おける"ｐ５３癌原遺伝子とその産物"、Ｌ．Ｖｉｌｌａ
ｒｒｅａｌ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒ Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｙの第２章（１９８９
年）；同書におけるＨｉｎｄｓらによる第７章；および
ＬｅｖｉｅによるＢｉｏＥｓｓａｙｓ１２、ページ６０
〜６６（１９９０年）において見直しが行われている。
【０００６】ｐ５３遺伝子は、転写調節に関与している
ようであり（Ｆｉｅｌｄｓ，ＳとＪａｎｇ，Ｓ．Ｋ．
（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９、ページ１０４
６〜１０４９；Ｒａｙｃｒｏｆｔ，Ｌ．、Ｗｕ，Ｈ．お
よびＬｏｚａｎｏ，Ｇ．（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９、ページ１０４９〜１０５１；およびＬｅｖｉ
ｎｅ，Ａ．Ｊ．、Ｍｏｍａｎｄ，Ｊ．およびＦｉｎｌａ
ｙ，Ｃ．Ａ．（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ ３５１、ペ
ージ４５３〜４５６）、また細胞サイクルにおける調節
上のチェックポイントとして作用し、Ｇ−１相の細胞を
捕収するようである（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．、Ｇｅｏ
ｒｇｏｆｆ，Ｉ．および Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．（１
９９１年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５、ページ１５１〜１
５９；Ｈｕｐｐ，Ｔ．Ｒ．、Ｍｅｅｋ，Ｄ．Ｗ．、Ｍｉ
ｄｇｌｅｙ，Ｃ．Ａ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ｐ．（１９
９２年）Ｃｅｌｌ ７１、ページ８７５〜８８６；およ
びＹｉｎ，Ｙ．、Ｔａｉｎｓｋｙ，Ｍ．Ａ．、Ｂｉｓｃ
ｈｏｆｆ，Ｆ．Ｚ．、Ｓｔｒｏｎｇ，Ｃ．Ｃ．およびＷ
ａｈｌ，Ｅ．Ｍ．（１９９２年）Ｃｅｌｌ ７０、ペー
ジ９３７〜９４８）。
【０００７】遺伝子内突然変異、ホモ接合性欠失および
構造再配置などのｐ５３遺伝子の遺伝子的変更はヒトの
癌においてよく見られる（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．
とＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．（１９９２年）Ｃｅｌｌ ７
０、ページ５２３〜５２６；Ｂａｋｅｒ，Ｓ．Ｊ．ら
（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０、ページ７
７１７〜７７２２；Ｍｏｒｉ，Ｎ．ら（１９８９）Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ４９、ページ５１３０〜５１３５；Ｌ
ｅｅ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
５０、ページ２７２４〜２７２８；Ｖａｒｌｅｙ，
Ｊ．Ｍ．ら（１９９１年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６、ペー
ジ４１３〜４２１；Ｐｒｅｓｔｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９
１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１、ページ５４０５；
およびＤａｌｂａｎｇｉ，Ｇ．ら（１９９３年）Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇ
ｙ ２，ページ４〜１３）。これらのｐ５３の変更形態
は、機能的ホモテトラマーユニットの活性を減少するか
または阻止する（Ｓｔｅｎｇｅｒ Ｊ．Ｅ．ら（１９９
２年）Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ ５、ページ１０２〜
１０６；Ｓｔｕｒｚｂｅｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．ら（１９９
２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ７，ページ１５１３〜１５２
３）。突然変異ｐ５３タンパク質は半減期が長く、また
退化も遅いため、腫瘍細胞の核中に不活性の複合体と自
己凝集性分子が生じる（Ｓｔｕｒｚｂｅｃｈｅｒ，Ｈ．
Ｗ．ら（１９８７年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１、ページ２０
１〜２１１；Ｈａｌｅｖｙ，Ｏ．ら（１９８９年）Ｍｏ
ｌ ＣｅｌｌＢｉｏｌ ９、ページ３３８５〜３３９
２）。
【０００８】ヒトにおいては、ｐ５３遺伝子の胚芽系突
然変異は、リ・フローメニ（Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ）
症候群によって影響を受けている家族に見られる。この
症候群は、各個人を、軟組織の肉腫を含む種々の腫瘍に
かかり易くする稀な常染色体優性の特徴を有する（Ｌ
ｉ，Ｆ．Ｐ．とＦｒａｕｍｅｎｉ，Ｊ．Ｆ．（１９６９
年）Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ７１、ページ７４
７〜７５２；Ｍａｌｋｉｎ，Ｄ．ら（１９９０年）Ｎ．
Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２５０、ページ１２３３〜１２
３８）。より最近では、ｐ５３胚芽系突然変異は、明ら
かに癌の家系ではない癌患者においても検出されており
（Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ，Ｊら（１９９２年）Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３２６、ページ１３０１〜１３０
８）、また、第二の一次新生物を呈する患者の小集団に
おいても検出されている（Ｍａｌｋｉｎ Ｄ．ら（１９
９２年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３２６、ページ
１３０９〜１３１５）。さらに、軟組織の肉腫において
ｐ５３遺伝子の体性突然変異が発生したことが報告され
ている（Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら（１９９０年）
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５、ページ１２９７〜１３０１；Ｍ
ｕｌｌｉｇａｎ，Ｌ．Ｍ．ら（１９９０年）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７、ページ５
８６３〜５８６７；Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ，Ｊ．ら（１９
９２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２、ページ６１９４
〜６１９９；Ｄｒｏｂｎｊａｋ，Ｍ．ら（１９９３年）
提出済；Ｌａｔｒｅｓ，Ｅ．ら（１９９３年）提出
済）。
【０００９】癌原遺伝子になる可能性があると認識され
ている他の遺伝子は、マウス・ダブル・ミニッツ−２
（ｍｄｍ２）である（Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈら（１９
９１年）、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０
（６）、ページ１５６５〜１５６９）。マウスとヒトの
ｍｄｍ２遺伝子とタンパク質の配列は知られている。
（Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ１０（６）、ページ１５６５〜１５６９（１
９９１年）；Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２年）
Ｎａｔｕｒｅ ３５８、ページ８０〜８３；およびＣａ
ｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌ
ｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１３（３）、ページ２３５〜２４４（１９８７年））。
配列は、マウス、ラット、ハムスターおよびヒトの遺伝
子を含む種の間で、進化的に一定に保たれている（Ｃａ
ｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌ
ｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１３（３）、ページ２３５〜２４４（１９８７年））。
【００１０】文献においては、ｍｄｍ２遺伝子は、ＭＤ
Ｍ２、１ＭＤＭ２０、ｈｄｍ２（ヒト種）、および１ｍ
ｄｍ２０（マウス種）として呼ばれる。９０ｋＤのリン
タンパク質であるｍｄｍ２遺伝子産物は文献ではｐ９０
と呼ばれ、これはマウスとヒトの両方の種を示し、ま
た、ヒト種であるＭＤＭ２を示す。ｐ９０タンパク質
は、本出願人の関連公報であるＬｅｖｉｎｅらの１９９
１年６月２７日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４
６０８に記載されている。ｄｍ２は本出願全体を通して
使用されているが、これは、ｍｄｍ２遺伝子とタンパク
質について文献において用いられている種々の語を含む
ものとし、全ての種の中での同族種のものも含む。
【００１１】骨肉腫と軟組織の肉腫の両方において１Ｍ
ＤＭ２０の増殖とＭＤＭ２（遺伝子産物）過発現がある
ことが立証されている（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１
９９２年）Ｎａｔｕｒｅ ３５８、ページ８０〜８３；
Ｌａｄａｎｙｉ，Ｍ．ら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ ５３、ページ１６〜１８；Ｌｅａｃｈ，Ｆ．
Ｓ．ら（１９９３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３、ペ
ージ２２３１〜２２３４）。
【００１２】ｈｄｍ２遺伝子または１ＭＤＭ２０または
ＭＤＭ２と呼ばれるｍｄｍ２遺伝子のヒト種は、クロー
ニングされ染色体１２の長腕にマッピングされた（１２
ｑ１３−１４）（Ｏｌｉｎｅｒら、１９９２年、"ヒト
肉腫におけるｐ５３関連タンパク質をコードする遺伝子
の増殖"、Ｎａｔｕｒｅ ３５８、ページ８０〜８
３）。この領域には、骨肉腫と軟組織の肉腫において増
殖することが既に発見されている、２種の遺伝子ＳＡＳ
とＧＬＩを含有している。ＳＡＳ遺伝子は、確認されて
いない機能を有するタンパク質をコードする。この遺伝
子は、悪性繊維性組織球腫（ＭＦＨ）から分離され、Ｍ
ＦＨおよび脂肪肉腫において増殖することが示された
（Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌ，Ｃ．ら（１９８６年）Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ ２３、ペー
ジ２９１〜２９９；Ｍｅｌｔｚｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら（１９
９１年）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆ ２、ペー
ジ４９５〜５０１）。ＧＬＩ遺伝子は、ＤＮＡ結合ジン
クフィンガータンパク質をコードする。この遺伝子は最
初グリア芽細胞腫から分離されたが、横紋筋肉腫および
骨肉腫にて増殖することが報告されている（Ｋｉｎｚｌ
ｅｒ，Ｋ．ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６、
ページ７０〜７３）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明以前において
は、突然変異したｐ５３が癌に関連するものと考えられ
ていた。また、ｍｄｍ２の過発現が腫瘍に関係すること
が本発明より以前から知られていた。しかし、本発明以
前には、変更されたｐ５３とｄｍ２遺伝子の関係、細胞
中における種々の発現の態様、および診断を行うととも
に、癌患者の臨床上の関連性または予後を決定するため
にその関係を如何に利用するかという点については開示
されていなかった。本発明の目的は、過発現または増殖
されたｐ５３およびｄｍ２遺伝子の関係を利用すること
によって、癌の診断を行うとともに、癌患者の予後を決
めることにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物学的試料
におけるｐ５３とｄｍ２のレベルを測定し、ｐ５３とｄ
ｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレ
ベルが上昇した場合に癌の発生を示すようにした癌診断
方法を提供するものである。
【００１５】また、本発明の別の目的は、生物学的試料
におけるｐ５３とｄｍ２のレベルを測定し、ｐ５３とｄ
ｍ２の内の何れか一方またはｐ５３とｄｍ２の両方のレ
ベルが上昇した場合に予後が悪いとして癌の進行を予想
することによって達成される。
【００１６】また、本発明は生物学的試料を３グループ
に分類する方法を提供する。この方法は、試料中のｐ５
３またはｄｍ２のレベルが異常に上昇したか否かを測定
すことを含んでおり、第１グループはｐ５３およびｄｍ
２のレベルは何れも異常に上昇していない場合を含み、
第２グループはｐ５３のレベルは異常に上昇しているが
ｄｍ２のレベルは異常に上昇していないか、ｄｍ２のレ
ベルは異常に上昇しているがｐ５３のレベルは異常に上
昇していない場合を含み、第３グループはｐ５３とｄｍ
２の両方のレベルが異常に上昇している場合を含む。
【００１７】さらに、本発明は生物学的試料である癌細
胞、または癌性または前癌性になる危険性のある細胞
で、少なくとも１つの正常なｐ５３対立遺伝子を含有す
る細胞を測定する方法を提供する。この方法は、生物学
的試料中におけるｄｍ２のレベルが異常に上昇している
か否かを測定することを含み、生物学的試料中における
ｄｍ２のレベルが、正常な生物学的試料と比較して上昇
している場合には、癌細胞、または癌性または前癌性に
なる危険性のある細胞であることが示される。
【００１８】本発明は、分離されたｐ５３／ｄｍ２タン
パク質複合体とｄｍ２タンパク質に対する抗体をも提供
する。
【００１９】
【発明の実施の形態】定 義：ｐ５３ ：本明細書中では、"野生型の"ｐ５３という語
は、Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．13、
ページ３２５７〜３２６２（１９８４年）；Ｚａｋｕｔ
−Ｈｏｕｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．４、ページ１２５１〜
１２５５（１９８５年）；およびＬａｍｂとＣｒａｗｆ
ｏｒｄ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、ページ１３
７９〜１３８５（１９８６年）にて報告されているヌク
レオチドまたはアミノ酸配列を意味する。この配列はＧ
ｅｎＢａｎｋから入手可能である。野生型のｐ５３に
は、アミノ酸７２におけるプロリン／アルギニン多型お
よび対応するヌクレオチド多型が含まれる。
【００２０】野生型のｐ５３遺伝子またはタンパク質の
突然変異は前癌または癌の状態を呈す。前癌細胞とは、
通常１個の正常なｐ５３対立遺伝子と１個の突然変異し
たｐ５３対立遺伝子を有する細胞である。例えば、突然
変異は点変異である。癌細胞においては、通常ｐ５３の
対立の両方が突然変異する。例えば、一方の突然変異が
点変異で、他方の突然変異が、ｐ５３遺伝子の全てまた
は大部分の欠失によるものであるあろう。
【００２１】ｄｍ２：本発明においては、ｄｍ２は、９
０ｋＤリンタンパク質（ｐ９０）を含むタンパク質の
族、タンパク質ｐ８５（８５ｋＤ）、タンパク質ｐ７６
（７６ｋＤ）、タンパク質ｐ７４（７４ｋＤ）およびタ
ンパク質ｐ５８−５７（５８ｋＤと５８ｋＤ）（ｐ５７
はラットｐ５８と同等のマウス種である）などの９０ｋ
Ｄリンタンパク質の断片または産物、およびこれらの同
族種または類似種を表す。ｐ５３タンパク質は、ｄｍ２
タンパク質と共免疫沈降する。ｄｍ２タンパク質には、
配列化されたマウス・ダブル・ミニッツ─２（ｍｄｍ
２）９０ｋＤリンタンパク質が含まれる。また、ｄｍ２
という語は、上記のｄｍ２タンパク質をコードする遺伝
子を示す。ｍｄｍ２遺伝子とタンパク質の配列はＦａｋ
ｈａｒｚａｄｅｈら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ １０（６）、ページ１５６５〜１５６９（１９９１
年）；およびＣａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら、Ｓｏｍ
ａｔｉｃＣｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ，１３（３）、ぺージ２３５〜２４４（１
９８７年）に開示されている。ｐ９０ ｄｍ２と同種の
配列は、ヒト"ｈｄｍ２"などの幾つかの種のゲノム中に
存在する。ラット、マウスおよびハムスターだけでな
く、ヒトの遺伝子も配列され、それは約９０ｋＤの分子
重量を有している（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９
２年）Ｎａｔｕｒｅ ３５８、ページ８０〜８３）。好
ましい実施態様では、ｄｍ２遺伝子とタンパク質はヒト
種である。
【００２２】約９０ｋＤのｄｍ２タンパク質は明らか
に、ｐ５８タンパク質は高い確率でｐ５３に結合する。
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３から得られる３Ｔ３ＤＭ細胞は、増
殖したｍｄｍ２遺伝子の複写に反応して５個のｍｄｍ２
を過剰に生成する。
【００２３】ｄｍ２および／またはｐ５３のレベル評価
（ｄｍ２＋および／またはｐ５３＋）：本明細書では、
細胞内のｄｍ２および／またはｐ５３のレベル上昇は、
ｄｍ２またはｐ５３遺伝子の増殖、または細胞などの生
物的試料におけるｄｍ２またはｐ５３タンパク質生成物
の過発現または蓄積を示す。ｄｍ２またはｐ５３タンパ
ク質のレベルは、生物学的試料、好ましくは細胞におけ
るｄｍ２またはｐ５３タンパク質の合計測定値であり、
遊離タンパク質であるか複合体であるかは関係ない。幾
つかの場合においては、ｄｍ２の増殖がないのにも関わ
らずｄｍ２タンパク質のレベルが上昇したことは、ｄｍ
２と突然変異したｐ５３生成物との間にヘテロダイマー
／ヘテロテトラマーが形成されたことを示す。突然変異
体のｐ５３タンパク質は長い半減期を持ち、退化が遅い
ため、細胞核中に蓄積する。ｐ５３ミスセンス突然変異
は、免疫化学的に検出できるｐ５３突然変異の少なくと
も約８５％で大部分を占める。しかし、幾つかの場合に
は、腫瘍組織内における野生型のｐ５３遺伝子とタンパ
ク質のレベル上昇が検出される。
【００２４】生物学的試料におけるｄｍ２および／また
はｐ５３のレベルが、正常な生物学的試料と比べて上昇
した場合、癌細胞、または癌性または前癌性になる危険
性のある細胞であることを示す。生物学的試料には、組
織抽出物、細胞の試料、またはリンパ液、血液または尿
などの生物学的流体が含まれるが、これらに限定される
ものではない。
【００２５】本発明は生物学的試料を３グループに分類
する方法を提供する。この方法は、試料中のｐ５３また
はｄｍ２の何れかのレベル、またはｐ５３とｄｍ２の両
方のレベルが異常に上昇したか否かを測定することを含
んでいる。第１グループであるグループＡはｐ５３およ
びｄｍ２の何れも異常なレベル上昇がない場合（ｐ５３
−／ｄｍ２−）を含む。第２グループであるグループＢ
はｄｍ２のレベルは異常に上昇しているがｐ５３のレベ
ルは異常に上昇していない場合（ｐ５３−／ｄｍ２＋）
と、ｐ５３のレベルは異常に上昇しているがｄｍ２のレ
ベルは異常に上昇していない（ｐ５３＋／ｄｍ２−）場
合とを含み、第３グループであるグループＣはｐ５３と
ｄｍ２の両方のレベルが異常に上昇している場合（ｐ５
３＋／ｄｍ２＋）を含む。
【００２６】本発明は、ｄｍ２とｐ５３の発現の種々の
態様を分類することが、種々の癌に患っている患者の臨
床的な経過を診断しまた予測するために臨床的に非常に
重要であることを示す。癌の例としては、肉腫、癌腫、
白血病、またはリンパ腫である。特に肉腫には軟組織肉
腫、骨肉腫などが含まれる。他の態様においては癌には
膀胱癌が含まれる。他の態様では、結腸直腸癌、肺癌、
卵巣癌、頸部癌、副腎皮質癌、骨癌、胸部癌、脳癌、お
よび慢性骨髄性白血病が対象となるがこれらに限定され
るものではない。したがって、本発明は、被検者の前癌
組織または腫瘍から生物学的試料を得ることによって被
検者の予後を評価し、生物学的試料３つのグループの何
れに属するかを決定する方法を提供する。これらの分類
の内、第３グループは最も予後が悪いことを示し、第１
グループは最も予後が良いことを示す。
【００２７】グループＣ（ｐ５３＋／ｄｍ２＋）：本発
明は、ｄｍ２のレベルが上昇しているか否かを測定する
ことにより、癌細胞、または癌性または前癌性になる危
険性のある細胞で、少なくとも１個の突然変異ｐ５３対
立遺伝子を含む細胞を検出するための方法を提供する。
予想外にも、ｄｍ２タンパク質のレベル上昇は、ｐ５３
のレベルが上昇したとして、即ち、ｐ５３＋／ｄｍ２＋
グループ（図４参照）として検出されるｐ５３の過発現
野生型だけでなく、突然変異を含むｐ５３タンパク質の
レベル上昇と相互作用し、生存率や腫瘍の進行などの悪
い予後を示す臨床病理的変数となる。これらのグループ
の内、グループＣは最も予後が悪いことを示す。例２と
図３は、グループＡ（ｐ５３のレベルもｄｍ２のレベル
も上昇していない）とグループＢ（これらのタンパク質
の内の一方のみのレベルが上昇）とを比較した時におけ
る、非常に生存率が悪いグループで生じた同じ腫瘍部に
おけるｄｍ２とｐ５３の異常なレベル上昇が免疫学的に
検出された状態を示す。
【００２８】これは予想外のことである。なぜならば、
本発明者によって発見されたように、ｄｍ２タンパク質
がｐ５３の転写作用を不活性にし、このためｐ５３タン
パク質のレベルが上昇した細胞中においてはｄｍ２のレ
ベル上昇がないためである。
【００２９】グループＢ（ｐ５３−／ｄｍ２＋およびｐ
５３＋／ｄｍ２−）：グループＢは２つのサブセット、
即ちｐ５３のレベルは正常であるがｄｍ２のレベルが上
昇した場合（ｐ５３−／ｄｍ２＋）と、ｐ５３のレベル
は上昇したがｄｍ２のレベルは正常である場合（ｐ５３
＋／ｄｍ２−）を含む。３グループの内、グループＢ
は、グループＡよりは悪いがグループＣよりは良い予後
を示す。
【００３０】グループＢのサブセットｐ５３＋／ｄｍ２
−：突然変異や過発現による野生型ｐ５３遺伝子および
タンパク質などのｐ５３タンパク質のレベルが上昇した
ことが検出された場合、即ち、ｐ５３＋／ｄｍ２−グル
ープが検出された場合、前癌のまたは癌の状態を示す。
ｐ５３の突然変異体は野生型ｐ５３の機能を不活性化
し、ｐ５３遺伝子の突然変異体およびタンパク質を含有
する細胞は腫瘍形成の可能性が高い。また野生型のｐ５
３タンパク質のレベル上昇は、予後を悪化させる一因と
なる。細胞中におけるＤＮＡの損傷またはウイルス性癌
原遺伝子生成物の結合は、野生型ｐ５３タンパク質を安
定にし、その濃度が増加する。
【００３１】グループＢのサブセットｐ５３−／ｄｍ２
＋：本発明は、予想外にもｄｍ２のレベルが上昇した場
合にも、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（３Ｔ３ ＤＭ細胞）
または前癌または癌細胞などの細胞に対してｐ５３のレ
ベルが上昇した場合と同様な特性を与えること明らかに
した。何れの場合においても、動物においては、細胞中
のｄｍ２またはｐ５３のレベルが上昇し、腫瘍発生の可
能性が高くなる。
【００３２】ｐ５３−／ｄｍ２＋に関しては、細胞中に
おける野生型ｐ５３対立遺伝子のレベルが正常であって
も、ｄｍ２のレベルが上昇している場合には細胞の腫瘍
化の可能性が高まる。
【００３３】本発明は、細胞が少なくとも２個の正常な
ｐ５３対立遺伝子、即ち野生型ｐ５３または正常レベル
のｐ５３を含む場合において、癌細胞、または癌性また
は前癌性になる危険性のある細胞を検出するための方法
を提供するもので、この方法は、生物学的試料中におけ
るｄｍ２のレベルが異常に上昇したか否かを検出するこ
とを含み、このレベル上昇は、正常な生物学的試料中に
おけるｄｍ２のレベルと比較した場合のレベル上昇を意
味する（図４参照）。
【００３４】グループＡ（ｐ５３−／ｄｍ２−）：グル
ープＡは、ｐ５３とｄｍ２の両方ともが正常のレベルで
ある場合を含む。このグループにおける前癌細胞と癌細
胞は、ｐ５２および／またはｄｍ２のレベル上昇以外の
原因によるものである可能性が高い。３グループの内、
グループＡの予後が最もよい。
【００３５】ＤＭ２またはＰ５３の上昇レベルの検出：増幅 ：ｄｍ２あるいはｐ５３遺伝子の増幅は、核酸プロ
ーブ法などの公知の方法を用いて検出できるであろう。
ＤＮＡの高次の複写数は例えばサザンブロット法によっ
て検出でき、増大したＲＮＡ量はノーザンブロット法に
よって検出できるであろう（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｌ．お
よびＰｏｗｅｒｓ，Ｖ．Ｅ．、Ｃｅｌｌ２４：１１７−
１２３（１９８１）；Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｌ．ら、ＥＭ
ＢＯＪ．，４：１１９９−１２０３（１９８５）；Ｓｉ
ｎｇｈ，Ｌ．およびＪｏｎｅｓ，Ｋ．Ｗ．、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：５６２７−５６３
８（１９８４）参照）。
【００３６】過発現：生物学的試料中のｄｍ２およびｐ
５３タンパクレベルは、抗ｄｍ２および抗ｐ５３抗体を
用いた免疫組織化学染色法等の公知の方法で検出され
る。免疫組織化学に基づく陽性核染色により、ｐ５３、
ｄｍ２、あるいはｐ５３／ｄｍ２複合体レベルの上昇が
示される。過発現されたｐ５３タンパクはｐ５３遺伝子
の突然変異に関連付けられる。本発明の一実施態様にお
いては、ｄｍ２とｐ５３の各種腫瘍における核の過発現
は、腫瘍細胞核染色における染色割合（％）から、次の
３グループのいずれかに分類される：（ａ）陰性（＜２
０％）、（ｂ）異性（２０−７０％）、（ｃ）相同（＞
７０％）。
【００３７】本発明の他の実施態様においては、ｄｍ２
レベルの上昇の検出にあたって、前癌状態あるいは癌状
態が正常な生物学的試料（細胞など）のレベルの２−１
００倍であることが示される。好ましい実施態様におい
ては、上昇したレベルとは正常な生物学的試料（細胞な
ど）のレベルの５−５０倍である。
【００３８】ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
は公知の方法によって調製されるであろう。本発明の抗
体には、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５
−１２８１（１９８９年）の方法に従って調製されたリ
コンビナント・ポリクローナルあるいはモノクローナル
のＦａｂフラグメントが含まれる。さらに以下の文献を
参照されたい：Ｂｕｒｄｏｎら編、「生化学と分子生物
学における実験室技法」第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダ
ム（１９８５年）中に掲載された、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、
「モノクローナル抗体技術、齧歯類およびヒトハイブリ
ドーマの産生と特徴」。癌遺伝子間における一つのアミ
ノ酸の相違に対して特異性を発現するポリクローナルお
よびモノクローナル抗体を調製する方法は、ＭｃＣｏｒ
ｍｉｃｋらによる米国特許第４７９８７８７号に記載さ
れている。
【００３９】簡単に言えばポリクローナル抗体は、突然
変異体ｐ５３と野生型ｐ５３とを区別する抗体産生能の
あるｐ５３タンパクやそのフラグメントをウサギ、マウ
ス、ラット、ヤギなどの哺乳類宿主に注入して得る。注
入されたペプチドやペプチドの断片は、野生型または突
然変異型の配列を含有しているであろう。哺乳類からの
血清は抽出・スクリーニング工程にかけ、そのペプチド
やペプチド断片に特異的なポリクローナル抗体を得る。
同様の方法をｄｍ２タンパクにも適用できるであろう。
【００４０】モノクローナル抗体を産生するには、哺乳
類宿主に上記のペプチドまたはペプチド断片を接種し、
これを増殖させる。最終増殖から２、３日経過後、脾臓
を被接種哺乳類から摘出する。脾臓から得た細胞浮遊液
を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによるＮａｔ
ｕｒｅ２５６、４９５−４９７ページ（１９７５年）に
記載の一般的な方法によって腫瘍細胞と融合させる。ペ
プチド断片として役に立つものであるためにはペプチド
断片は、検出されるＰ５３またはｄｍ２分子のエピトー
プを定めるのに充分なアミノ酸残基を含有しなければな
らない。
【００４１】もし断片が抗原性であるには短すぎる場合
には、分子担体に結合してもよい。適切な担体分子とし
ては、キーホールリンペットヘモシアニン、子牛血清ア
ルブミンが挙げられる。結合は本分野で公知の方法によ
って行うことができる。そのような方法の一つとして、
断片のシステイン残基と担体分子のシステイン残基とを
結合する方法がある。
【００４２】ペプチド断片は本分野で公知の方法によっ
て合成することができる。好適な方法の幾つかがＳｔｕ
ａｒｔとＹｏｕｎｇによる「固相ペプチド合成」（第２
版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、１９８
４年）に記載されている。
【００４３】ｐ５３とｄｍ２の共免疫沈降法に適する抗
体としては、ＰＡｂ４２１とＡｂ２が挙げられる。ＰＡ
ｂ４２１は、ヒト、マウス、ラットなどを含む種々の宿
主から得られたｐ５３のカルボキシ末端を認識し、Ｈａ
ｒｌｏｗらによって"Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ"３９、８６１−８６９（１９８１年）に記載
されている。Ａｂ２はヒトｐ５３のアミノ末端に特異的
であり、ニューヨーク州、マンハセットのオンコジェン
サイエンス社から入手できる。ｐ５３を発現しないＲＥ
Ｆ細胞が同じ抗体で同様に処理されたときには、ｄｍ２
タンパクは免疫沈降しない。
【００４４】免疫沈降物は遠心分離で回収できる。遠心
分離やカラムからの溶出に続き、ｄｍ２がｐ５３／ｄｍ
２複合体からＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分離される。
９０ＫＤの単一バンドは切断され、配列される。本発明
は単離されたｄｍ２／ｐ５３複合体をも提供するもので
あるが、これは種々の形質転換細胞からのｄｍ２とｐ５
３を共免疫沈降することによって得られる。
【００４５】ｄｍ２を精製する他の方法は、Ａｅｂｅｒ
ｓｏｌｄらによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８４、６９７０−６９７４（１９８７年）
に記載された方法である。
【００４６】本発明はｄｍ２（ｐ９０）遺伝子産物に対
してモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを提
供する。これらのハイブリドーマのあるものはＡｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：３Ｇ５ ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＨＢ１１１８２）、４Ｂ1 １（ＡＴＣＣ受託
番号ＨＢ１１１８３）、２Ａ１０（ＡＴＣＣ受託番号Ｈ
Ｂ１１１８４）、２Ａ９（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１
８５）、および４Ｂ２（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８
６）。ハイブリドーマ３Ｇ５、４Ｂ１１、２Ａ１０、２
Ａ９、および４Ｂ２は、特許手続上のための微生物の寄
託の国際的承認に関するブダペスト条約の要請に従って
この要請を満たすべく、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８
２，ＨＢ１１１８３、ＨＢ１１１８４、ＨＢ１１１８５
およびＨＢ１１１８６としてそれぞれメリーランド州２
０８５２、ロックヴィル、パークローン・ドライブ１２
３０１にあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され
た。
【００４７】細胞中のＤｍ２のレベルを測定し調整する
ためのアッセイ：細胞中のｄｍ２および／またはｐ５３
のレベルは、増幅されたまたは過発現されたｄｍ２およ
び／またはｐ５３遺伝子またはタンパクを認識できる、
本分野で公知のアッセイ法で決定される。
【００４８】標識抗体を用いてタンパクを検出するため
に種々のアッセイが利用できる。一段階アッセイにおい
ては、標的分子は、もしそれが存在する場合には標識抗
体で固定化されインキュベートされる。標識抗体は固定
化された標的分子と結合する。未結合の分子を洗浄除去
した後、アッセイでサンプルの標識の存在を調べる。
【００４９】二段階アッセイにおいては、固定化された
標的分子は未標識の抗体とともにインキュベートされ
る。標的分子と未標識抗体の複合体は、もしそれが存在
する場合には、その後当該未標識抗体に特異的な第二の
標識抗体に結合する。サンプルを洗浄し、上記のように
標識の存在を調べるアッセイを行う。
【００５０】標識抗ｄｍ２抗体はイメージング法によっ
てｄｍ２を検出するのに用いることができる。イメージ
ングの一方法としては、イメージ化されるべき腫瘍細胞
を検出可能なマーカーによって標識された抗ｄｍ２抗体
と接触させる方法がある。この方法は標識抗体がｄｍ２
に結合する条件下で行われる。ｄｍ２に結合した抗体が
検出されることで、ｄｍ２がイメージ化され検出され
る。
【００５１】抗体を標識するのに用いられるマーカーは
その用途によって選ぶ。当業者はマーカーを容易に選
択、決定できる。標識された抗体は腫瘍の存在を検出す
るためのイムノアッセイや組織学的応用分野において用
いることができる。標識抗体はポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体であってよいがモノクローナル抗
体が好ましく、ＡＴＣＣに寄託された上記の抗体が挙げ
られる。
【００５２】本発明の好ましい実施態様においては、標
識は放射性原子、酵素あるいは発色団である。放射性原
子の例としてはＰ32、Ｉ125、Ｈ3、およびＣ14が挙げら
れる。酵素の例としてはホースラディッシュペロキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが
挙げられる。発色団の例としてはフルオレセンやローダ
ミンが挙げられる。抗体とこれらの標識との結合は公知
の方法によるものであってよい。例えば酵素および発色
団はジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなど
のカップリング剤によって抗体と結合される。あるい
は、結合はリガンド−レセプターのペアを介したもので
あることもできる。適切なリガンド−レセプターのペア
の例としてはビオチン−アビジン、または−ストレプト
アビジン、および抗体−抗原が挙げられる。
【００５３】ｄｍ２タンパクに対する抗体を用いて細胞
や組織中のｄｍ２タンパクの上昇したレベルを検出する
ことができる。一実施態様においては、ｄｍ２のエピト
ープに向けられた抗体は、免疫組織病理学的技法により
原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）で用いることができる。これ
らの方法は、ポリープ、非定型胸部組織、あるいは転移
や再発の恐れがより高い腫瘍細胞中などにおいて、組織
が癌性となる恐れの高い場合の診断に利用できる。
【００５４】ハイブリドーマ１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ
６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ
７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４
Ｂ１１、および５Ｂ１０はｄｍ２タンパクのエピトープ
（図１参照）に対するモノクローナル抗体を産生する。
これらハイブリドーマのいくつかはＡＴＣＣ（上記参
照）に寄託されている。モノクローナル抗体は、ネズミ
およびヒトの両者のタンパクのエピトープ、さらに宿主
の種の間に同型なｄｍ２配列が保存されているかぎり他
の種のものとも反応する。
【００５５】本発明の他の実施態様においては、癌細胞
はｄｍ２を放出することがあり、これが患者の血液やリ
ンパ液中のｄｍ２量を増大させる。そこでイムノアッセ
イなどのアッセイによって細胞や体液中の正常ｄｍ２値
や正常値を超えたｄｍ２レベルを検出できる。
【００５６】野生型ｐ５３に対するｄｍ２の結合を阻止
する治療剤のスクリーニング：野生型ｐ５３に対するｄ
ｍ２の結合を阻止するための治療剤のスクリーニングを
各種アッセイによって行うことができる。本発明は、野
生型ｐ５３に対するｄｍ２の有害な結合を防ぐのに充分
な親和性を有するｄｍ２と複合体を形成する治療剤を選
択するための方法を開示する。方法は種々のアッセイを
包含し、一例として、ｄｍ２を支持体に固定化して野生
型のｐ５３と標識された治療剤の双方に同時あるいは順
番に接触させ、この治療剤がｄｍ２の野生型ｐ５３への
結合を充分に防ぐように野生型のｐ５３と効果的に競合
するかどうかを決定するものが挙げられる。他の態様で
は野生型のｐ５３を標識化し、治療剤には標識しない。
さらに他の態様においては、ｐ５３を支持体に固定化し
標識したｄｍ２と治療剤の双方（または標識しないｄｍ
２と標識した治療剤）と接触させたうえ、ｐ５３に結合
したｄｍ２の量が治療剤を添加しない場合と比べて減少
しているかどうかを調べる。ｄｍ２は本発明の抗ｄｍ２
抗体で標識化することができる。
【００５７】一態様においては、本発明方法は以下のス
テップを包含する： ａ）固体支持体に所定量のｄｍ２をｄｍ２が支持体の表
面に付着するような条件下で接触（たとえば抗ｄｍ２抗
体を用いてｄｍ２を固体支持体に接触）させ、ｂ）支持
体に未結合のｄｍ２を除去し、ｃ）ｄｍ２が結合してい
る固体支持体を、その結合しているｄｍ２に野生型ｐ５
３が結合してこれと複合体を形成するような条件下で野
生型のｐ５３に結合させ、ｄ）未結合のｐ５３を除去
し、ｅ）このようにして形成されたｄｍ２／ｐ５３複合
体に、サンプル中に存在する標識された潜在的治療剤が
野生型ｐ５３と競合しながら結合ｄｍ２へと結合するよ
うな条件下で、検出可能なマーカーで標識された所定量
のサンプルを接触させ、ｆ）固体支持体に未結合である
標識化潜在的治療剤の濃度を定量的に決定し、ｇ）ｄｍ
２と特異的に結合しｄｍ２が野生型ｐ５３に結合するの
を阻止する潜在的治療剤のサンプル中の濃度を決定す
る。
【００５８】固体支持体は、当業者が容易に選択、決定
できる。好ましい一方法においては、固体支持体は不活
性ポリマーからなるビーズであり、また別法においては
固体支持体はマイクロウェルである。上記の方法におい
て用いられるマーカーについては当業者はこれを任意に
選択できる。検出可能なマーカーは好ましくは酵素、常
磁性イオン、ビオチン、蛍光体、発色団、重金属、ある
いはラジオアイソトープである。より好ましいマーカー
としては酵素が挙げられ、中でも最も好ましくはホース
ラディッシュペロキシダーゼまたはアルカリフォスファ
ターゼである。
【００５９】本発明方法の更なる態様によれば、潜在的
治療剤は酵素で標識されているとともに、ステップｆ）
では固体支持体に結合しなかった標識化潜在的治療剤を
除去し、これを、酵素が基質と反応して検出可能な生成
物を形成するような条件の下で、酵素に対する特異的基
質と接触させる。
【００６０】本発明はさらに、マウス、ラット、ハムス
ター、ヒトを含む哺乳類における癌を治療する方法を提
供するものであり、この方法においては野生型ｐ５３へ
のｄｍ２の有害な結合が阻止される。この方法の一態様
によれば、野生型ｐ５３へのｄｍ２の結合の阻止は、ｄ
ｍ２を充分量の抗ｄｍ２抗体と接触させることによって
なされる。また別の態様では、野生型ｐ５３へのｄｍ２
の結合の阻止は、ｄｍ２を過剰量の抗イディオタイプｐ
５３抗体と接触させることによってなされる。他の態様
では、ｐ５３の転写プロモーターを阻止しないｄｍ２抗
イディオタイプ抗体を投与してもよい。腫瘍を治療する
ための他の方法においては、遺伝子治療によって増幅さ
れたｄｍ２遺伝子を正常な数のｄｍ２遺伝子で置き換
え、上昇したｐ５３値レベルを正常化する。さらに別の
腫瘍治療方法においては、アンチセンス遺伝子治療によ
って増幅されたｄｍ２遺伝子をアンチセンスｄｍ２遺伝
子で置き換える。
【００６１】相対的結合親和性を決定するための方法は
本技術分野で公知の方法であってよい。たとえば、ｐ５
３タンパクがｈｓｃ７０に結合しているかどうかを決定
する方法は、Ｆｉｎｌｅｙら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．８、５３１−５３９（１９８８）および
Ｈｉｎｄｓら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
７、２８６３−２８６９（１９８７）に記載されてい
る。これらの論文に記載の方法では、抗ｐ５３および抗
ｈｓｃ７０抗体を用いた共免疫沈降法が行われている。
【００６２】
【実施例】実施例１ ｃＤＮＡクローンの単離 ：ＨｅＬａ細胞から調製された
λｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを、低緊縮下でマウ
スｍｄｍ２ ｃＤＮＡをプローブとして用いてスクリー
ニングした。ｃＤＮＡインサートを陽性ファージから単
離し、さらに特徴付けるためにブルースクリプトベクタ
ー中にサブクローニングした。全コード領域を含有する
完全長ｃＤＮＡを二つの重複したクローンから再構築
し、Ｓａｎｇｅｒの方法によって完全に配列決定した
（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７年、"ＤＮＡ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ１４：５４６３−５４６
７）。
【００６３】ｈｄｍ２に対するモノクローナル抗体の生
成：ライブラリーのスクリーニングによって得られたｃ
ＤＮＡクローンは、ｈｄｍ２コード領域のＮ−末端コー
ド領域を含有し、最初のメチオニン開始コドンでトラン
ケートされていた。このｃＤＮＡを完全長のｈｄｍ２
ｃＤＮＡとリコンビナントしてリーダー配列と最初のメ
チオニンのないコード領域を得た。このコード配列をｐ
ＱＥ１１ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）に挿入し６個のヒ
スチジン残基がｈｄｍ２のＮ−末端に融合した完全オー
プンリーディングフレームを得た。発現プラスミドを
Ｅ．Ｃｏｌｉに導入し、ヒスチジン−ｈｄｍ２融合タン
パクをＮｉ−2+−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｕｉａｇｅ
ｎ）カラムクロマトグラフィーで精製した。精製物中の
主なタンパク種の易動度はｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳さ
れたｈｄｍ２と同等であった。
【００６４】Ｂａｌｂ／Ｃマウスをｈｄｍ２タンパクを
産生するそのＥ．ｃｏｌｉで免疫した。ハイブリドーマ
は通常の手順により準備した。そしてエンザイム−リン
クトイムノソルベントアッセイとインビトロで変換され
たｈｄｍ２タンパクの免疫沈降法によりスクリーニング
した。３回のクローニングにより安定したクローンを確
率した。
【００６５】ヒトｄｍ２ ｃＤＮＡの単離：ＨｅＬａ細
胞から構築したλｇｔ１１ライブラリーを、低緊縮下で
マウスｍｄｍ２ ｃＤＮＡを用いてスクリーニングし
た。計１４個の陽性クローンが単離され、さらに分析す
るためにｃＤＮＡインサートをブルースクリプトベクタ
ー中にサブクローニングした。予備的な制限地図化と部
分的な配列決定によって、それらはヒトｄｍ２ ｃＤＮ
Ａのクローンの一部であることが判明した（Ｆａｋｈａ
ｒｚａｄｅｈ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９１年、「マウス腫瘍
細胞株中で増幅された遺伝子の亢進発現を伴う腫瘍形成
潜在能」ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１５６５−１５６９）。
完全長コード領域を二つの重複したｃＤＮＡクローンか
ら構築し、配列決定した。ｈｄｍ２と呼ばれる、このｃ
ＤＮＡクローンのＤＮＡ配列は、文献に記載のｈｄｍ２
配列と類似のものであり（Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら、
１９９２年、「ヒトサルコーマにおけるｐ５３−関連タ
ンパクをコードする遺伝子の増幅」、Ｎａｔｕｒｅ３５
８：８０−８３）、コード領域においては完全に同一で
非コード領域においては多少相違がある。これらの二つ
のｃＤＮＡクローンが二つの大きく異なる細胞源（Ｈｅ
Ｌａ細胞と結腸カルチノーマ）から得られたにもかかわ
らず同等なコード配列を有しているという事実は、それ
らが野生型のｈｄｍ２コード配列を体現したものである
かあるいは異なる癌細胞中に系統的突然変異が或ること
を示唆している。
【００６６】実施例２ 臨床的にも病理学的にもよく特徴が把握されている成人
軟組織サルコーマ２１１例のコホートを分析した。７３
名の患者からなる部分集団において腫瘍と正常検体が入
手できた。分子レベルおよび生物学的観点からの考察を
この７３名の患者からなる群にもとづいておこなった。
しかしながら、臨床病理との相関付けを行うにあたって
は、免疫組織化学的手法を利用するとともに、メモリア
ル・スローアン−ケタリング・癌センターにおいて患者
が得ることができ、頻繁にデータ更新がなされている臨
床および病理学的情報データベースから得た２１１人の
軟組織サルコーマ患者に関する情報を利用した。
【００６７】組織 この実施例で用いられた軟組織サルコーマ（ＳＴＳ）に
罹患した２１１人の成人患者のコホート中、腫瘍病巣の
分析結果はリポサルコーマ７１例、平滑筋肉腫５３例、
悪性繊維性組織球腫２２例、繊維肉腫１５例、末梢神経
鞘腫瘍（ＰＮＳＴ）１５例、滑膜肉腫１３例、横紋筋肉
腫４例、および未分化型肉腫１８例であった。分析した
ＳＴＳの多くは原発性腫瘍であり（１２９例）、残る病
巣は再発性（３９例）あるいは転移性（４１例）であっ
た。２例の分娩時胎位については不明である。分析した
２１１例のＳＴＳにおいては、１６９例が進行したサル
コーマに分類され、３９例の腫瘍が進行度の低い病変に
分類された。３例の進行度については不明である。これ
らの患者からなるコンホートの追跡調査期間の中央値と
平均値はそれぞれ２９カ月および３４カ月であった。完
全な追跡調査データは２１１名の患者中２０９名から得
ることができた。腫瘍試料は凍結保存液（ＯＣＴ化合
物、マイルズ・ラボラトリーズ、エルクハート、インデ
ィアナ州）に包埋し、イソペンタン中で急速冷凍し−７
０℃で保存した。各ブロックからヘマトキシリン−エオ
ジンで染色された代表的部分をとり、顕微鏡下で観察し
て腫瘍の存在を確認するとともにこれらの病変部に存在
する腫瘍細胞の割合（％）と腫瘍壊死の範囲を評価し
た。付近の腫瘍および正常組織試料を採集し、分子的遺
伝子アッセイを２１１例中７３例に基づいて行った（下
記参照）。これらの組織サンプルは外科的に摘出された
あと直ちに凍結し−７０℃で保存後、ＤＮＡを取り出し
た。
【００６８】モノクローナル抗体と免疫組織化学 ｐ９０遺伝子でコードされた遺伝子産物に対するマウス
モノクローナル抗体の一団を用いて本研究を行った。抗
体４Ｂ２はアミノ末端領域に位置するエピトープを検出
する。抗体２Ａ９と２Ａ１０はｐ９０の中央部の二つの
異なるエピトープを同定する。抗体４Ｂ１１はｐ９０の
カルボキシ末端領域に位置する配列を認識する。ｐ５３
タンパク上の異なるエピトープを検出する三つのマウス
モノクローナル抗体を本研究で使用した。抗ｐ５３抗体
ＰＡｂ１８０１（Ａｂ−２、"Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ"、マンハセット、ニュウヨーク）は、野生
型および突然変異型双方のヒトｐ５３タンパクのアミノ
酸（ａａと略記）３２−７９の間に位置するエピトープ
を認識する（Ｂａｎｋｓ，Ｌ．ら、１９８６年、Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １５９、５２９−５３４）。
抗体ＰＡｂ２４０（Ａｂ−３、"Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ"）は、突然変異体ｐ５３産物のあるもの
の特徴となっている、ａａ１５６−３３５の間に位置す
るコンフォーメーションエピトープを認識する（Ｇａｎ
ｎｏｎ，Ｊ．Ｖ．ら、１９９０年、ＥＭＢＯ．Ｊ．９、
１５９５−１６０２）。抗体ＰＡｂ１６２０（ＡＢ−
５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）は野生型のｐ
５３と特異的に反応する（Ｂａｌｌ，Ｒ．Ｋ．ら、１９
８４年、ＥＭＢＯ．Ｊ．３、１４８５−１４９２）。抗
ｐ９０及び抗ｐ５３抗体と同じサブクラスのマウスモノ
クローナル抗体である、ＭＩｇＳ−Ｋｐ Ｉを同様の稀
釈率で陰性のコントロールとして使用した。
【００６９】冷メタノール−アセトン（１：１稀釈）で
固定した５μｍの厚さの凍結組織片を用いてアビジン−
ビオチンペルオキシダーゼ法を行った。簡単に言えば、
組織片を１５分間１０％の正常ウマ血清（Ｏｒｇａｎｏ
ｎ Ｔｅｃｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．、ウエストチェスタ
ー、ペンシルバニア州）でインキュベートし、次いで適
切に稀釈した一次抗体（２Ａ９、４Ｂ２および４Ｂ１１
を稀釈率１：１００で、２Ａ１０を稀釈率１：１０００
で使用）（Ａｂ−２は２００ｎｇ／ｍｌ、Ａｂ−３は２
５０ｎｇ／ｍｌ、Ａｂ−５は３μｇ／ｍｌ）で２時間イ
ンキュベートした。充分に洗浄したあと、組織片を２０
０倍稀釈したビオチン化ホースラディッシュ抗マウスＩ
ｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
バーリンゲーム、カリフォルニア州）で３０分間、アビ
ジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：２５稀釈）で３０分
間インキュベートした。ジアミノベンジディン（０．０
６％ＤＡＢ）を最終色素原として、またヘモトキシリン
を核の対比染色のために使用した。
【００７０】免疫組織化学的評価を少なくとも二人の別
々の研究者によって行い、核染色を示した腫瘍細胞の概
算パーセントを算出した。ｐ９０とｐ５３双方の核免疫
反応性を次の三つのカテゴリーに分類した：陰性（＜２
０％の腫瘍細胞が核染色を示す）、異性（２０−７９％
の腫瘍細胞が核の反応性を示す）、および相同（＞／＝
８０％の腫瘍細胞が強い核染色を示す）。
【００７１】サザンブロッティング法とＲＥＬＰ分析 １．６ｋｂのヒトｄｍ２ ｃＤＮＡ断片プローブである
ｐＨＤＭ（ＥｃｏＲＩ）を用いて遺伝子増幅をサザンブ
ロッティング法で評価した。ｂ−アクチンプローブであ
る（ＥｃｏＲＩ）をコントロールとして用いた。二つの
プローブを染色体１７の短腕の対立遺伝子欠失の解析の
ために用いた：ＰＹＮＺ２２（１７ｐ１３．３、Ｄ１７
Ｓ５、ＴａｑＩ）およびｐｈｐ５３Ｂ（１７ｐ１３．
１、ｐ５３、ＢｇｌＩＩ）。サザンブロッティング法に
よる解析は文献記載に従った（Ｐｒｅｓｔｒｉ，Ｊ．
Ｃ．ら、（１９９１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１、
５４０５；Ｄａｌｂａｇｎｉ，Ｇら、（１９９３）、Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏ
ｌｏｇｙ ２、４−１３）。簡単に言えば、ＤＮＡをＯ
ｎｃｏｒ社によって開発された方法によって対にした正
常及び腫瘍試料から非有機的に抽出し（Ｏｎｃｏｒ、ガ
イザーズバーグ、メリーランド州）、適切な制限酵素で
分解し、０．７％アガロースゲル中で電気泳動を行い、
ナイロン膜上にブロッティングした。膜は４２℃で１時
間、Ｈｙｂｒｉｓｏｌ Ｉ（Ｏｎｃｏｒ社）で予備ハイ
ブリダイズし、［Ｐ３２］ｄＣＴＰに高い特異活性よう
に標識したプローブで一夜ハイブリダイズした。膜を洗
浄し、−７０℃で増感スクリーンを使用して放射線写真
撮影した。Ｕｌｔｒａｓｃａｎ ＸＬ Ｌａｓｅｒ Ｄ
ｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ファルマシアＬＫＢバイオテ
クノロジー社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）
とＢｅｔａｓｃｏｐｅ ６３０ Ｂｌｏｔ Ａｎａｌｙ
ｚｅｒ（ベターゲン社、ウオルサム、マサチューセッツ
州）で濃度を測定し結果を確認した。少なくとも５コピ
ー遺伝子／細胞であったときにｄｍ２増幅があったと考
えた。異型性の喪失（ＬＯＨ）については、腫瘍試料中
の対立遺伝子のシグナル強度が４０％を超えて低下した
ときに異型性が喪失したものと定義した（Ｐｒｅｓｔｒ
ｉ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
５１、５４０５；Ｏｌｕｍｉ，Ａ．Ｆ．ら、（１９９
０）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０、７０８１−７０８
３）。
【００７２】一本鎖配座多形性（ＳＳＣＰ）分析および
ＤＮＡ塩基配列決定 これらについてはＯｒｉｔａら（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら
（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５、８７４−８７
９）によって報告された方法を僅かにかえて行った。増
幅は上述の試料から抽出した１００ｎｇのゲノムＤＮＡ
を用いて行った。使用したプライマーはヒトｐ５３遺伝
子のイントロン配列のフランキングエキソン５から９か
ら得たものであり、この配列についてはすでに論文が発
行されている（Ｍｏｌｌ，Ｕ．Ｍ．ら、（１９９２年）
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８
９、７２６２−７２６６）。ＤＮＡはＴｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）を用いてＰＣＲ（９４℃で３０秒、エキソン８と９
に対して５８℃で３０秒、エキソン５、６、７に対して
は６３℃で３０秒、そして最後にすべての試料に対して
７２℃で６０秒）の３０サイクル後に増幅された。増幅
された試料は変性され、１０％グリセロールを含有する
非変性アクリルアミドゲル上に置き、室温で１２−１６
時間１０−１２ワットで処理した。ゲルは８０℃、真空
下で乾燥し、−７０℃で４−１６時間Ｘ線フィルムに曝
した。
【００７３】配列決定アッセイにおけるゲノムＤＮＡの
増幅はＳＳＣＰ分析において用いたものとは独立したも
のであり、３５サイクル（９４℃で６０秒、上記の条件
で５８℃と６３℃で６０秒、さらに７２℃で９０秒）か
けて増幅した。ＤＮＡ断片を２％の低融点アガロースゲ
ルから単離し、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、
（１９７７年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃ
ｉ ＵＳＡ７４、５４６３−５４６７）で精製・配列決
定した。両方の鎖は、分析した各ＤＮＡについて配列決
定するとともに、野生型のｐ５３を含有するコントロー
ル試料から得たゲノムＤＮＡも突然変異を確認するため
に平行して配列決定した。
【００７４】ＤＭ２の増幅とＤＭ２タンパクの過剰生産 ｄｍ２遺伝子の増幅を７３例の成人軟組織サルコーマ
（ＳＴＳ）中の１１例で調べたところ、５倍から３５倍
に増幅していた。ｄｍ２の増幅は、病気の進行度が低い
場合（４例）より病気の進行度が高い場合（７例）にお
いてより高頻度で検出された。転移性のＳＴＳ（１１例
中３例、２７％）において原発性のＳＴＳ（４８例中４
例、８％）におけるより増幅はより普通に観察された。
【００７５】抗ｄｍ２抗体の免疫染色のパターンはまず
３Ｔ３−Ｂａｌｂｃと３Ｔ３−ＤＭ細胞を用いて評価し
た。ＤＭ細胞においては強い核染色が見られ、増幅ｄｍ
２遺伝子を有しｄｍ２タンパクを過発現していることが
報告されたが、一方Ｂａｌｂ−ｃ細胞は反応せず（図
４）ｄｍ２タンパクレベルが低かった。１１例の増幅し
たケース中６例が、抗ｄｍ２抗体で核免疫反応性を示す
腫瘍細胞が２０％を超えることを示した。しかしなが
ら、残る５例では反応は見られなかった。６２例中、明
らかに増幅されていないｄｍ２遺伝子を有する１７例に
おいて、組織片を用いてｄｍ２抗体で検出されたように
ｄｍ２タンパクのレベルの上昇を示した（ｄｍ２陽性表
現形）。
【００７６】ｐ５３欠失、点変異、およびｐ５３核免疫
反応性 体細胞および腫瘍ＤＮＡの７３個のペアを、染色体１７
の短腕に対する二つの異なったプローブを用いて調べ
た。調査した情報通知例５１例中２７例（５３％）で染
色体１７の短腕の欠失が見いだされた。染色体１７ｐの
異形性の喪失（ＬＯＨ）が進行度の高いサルコーマと進
行度の低いサルコーマの両者で観察された。染色体１７
ｐのＬＯＨは原発腫瘍（３３例中１３例、４１％）より
転移腫瘍（８例中６例、７５％）においてより高頻度で
見いだされた。
【００７７】ｐ５３が細胞内での過発現に関連している
と思われることから、ｐ５３の具体的な遺伝子内突然変
異をより特徴付けるために、７３例のＳＴＳをＳＳＣＰ
で（エキソン５から９）分析し、このアッセイで陽性で
あったものをＤＮＡ配列決定した。突然変異の存在が１
４例で確認された。これら１４例のＳＴＳのうち１１例
が抗体ＰＡｂ１８０１に対しｐ５３核免疫反応性を示し
た。点変異を１１例のサルコーマ中７例において、配列
決定によって点変異が特徴付けられ、５例がＡＴからＧ
Ｃの変異を、２例がＧＣからＡＴへの変異を示した。４
例において移動度の変化がＳＳＣＰによって検出された
が、突然変異を同定するための配列決定は行われなかっ
た。突然変異の１４例中３例はＰＡｂ１８０１に対して
陰性の免疫染色結果を示した。突然変異の内の１例は停
止コドンを産生し、コドン１６５中において同定され
た。他の１例はコドン２７８でＣ欠失があり、３４４の
位置で停止コドンを産生した。他の突然変異はスプライ
ス供与位置に影響するエキソン５において起こった。一
つを除いて、染色体１７ｐの状態に関する全ての情報提
供突然変異体に随伴する短腕欠失が認められた。加え
て、１３例が研究中のエキソンに対する点変異の証拠な
しに陽性の核染色を示した。
【００７８】結局、分析した２１１例のＳＴＳ中５６例
が陽性核免疫染色パターンをＰＡｂ１８０１に対して示
した（表１）。ｐ５３陽性の表現形と腫瘍の進行度の間
には大きな開きがあった。さらに、ＳＴＳに罹患してい
る患者は、２０％を超える腫瘍細胞でｐ５３核免疫染色
を示し、生存率が顕著に低かった。
【００７９】
【表１】
【００８０】ＤＭ２とＰ５３の遺伝子型と表現型の変
化：臨床病理学との関連 ７３例からなるサブグループ中のただ１例が増幅ｄｍ２
とｐ５３遺伝子の突然変異体を示したが、これは転移繊
維肉腫であった。しかしながら、コホートの全２１１例
中２２例がｄｍ２とｐ５３の両方のタンパクに対して連
続した組織片で陽性の核免疫反応性を示した（表１）。
これらの分子の染色パターンは、それらが共発現した場
合には、一般に異性であった。表現形の組み合わせ（グ
ループＡ：ｄｍ２−／ｐ５３−；グループＢ：ｄｍ２−
／ｐ５３−およびｄｍ２−／ｐ５３＋；グループＣ：ｄ
ｍ２＋／ｐ５３＋）を臨床病理学的パラメーターと比較
したところ、陽性表現形と予後不良の間に相関関係が認
められた。データにより、グループＡが最も予後が良
く、グループＣが最も予後不良であることが示された
（図３参照）。
【００８１】実施例３ ｐ９０の免疫沈降あるいはｐ９０とｐ５３の共免疫沈降
のための抗体を調製するのにｐ９０を用いることができ
る。ｐ９０は沈降物から単離し、精製される。高ｐ９０
抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。ｐ
９０に対するポリクローナル抗体を調製する方法として
以下のものがあげられる。
【００８２】ウサギにおけるｐ９０抗体の産生手続： ｐ９０タンパク断片は０．７ｍｇ／ｍｌの濃度で使用す
る。次のように免疫を行う： ０日目： ２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩ
（アジュバンド）中２５μｇ、 ７日目： ２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢＩ
（アジュバンド）中５０μｇ、 １４日目： ２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢ
Ｉ（アジュバンド）中５０μｇ、 ２１日目： 休止 ２８日目： ２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢ
Ｉ中５０μｇ ３９日目： 採血−アッセイ ５２日目： ２００μｌのＰＢＳと２００μｌのＲＩＢ
Ｉに５０μｇを加え動物に投与、 ５９日目： 採血−最終注入後７日後におけるアッセイ ６２日目： 放血死
【００８３】ＥＬＩＳＡ法を適用し、４℃でウェルを一
夜コーティング（２００ｎｇ／ウェル）してアッセイを
行った。３７℃で１時間２％ＢＳＡでブロックする。１
％ＢＳＡ中に血清を加え稀釈し、３７℃で２時間インキ
ュベートする。１％ＢＳＡで調製した第二抗体稀釈液
（ＴＡＧＯ ヤギ抗ウサギペロキシダーゼ−ｃａｔ＃６
４３０）では３７℃で１時間インキュベートする。血清
抗体価は最初のアッセイで１：２５０００（カットオフ
吸光度：４５０ｎｍで０．４００）、最終アッセイで＞
５００００。Ｋｉｒｋｅｇａｒｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ
ＴＭＢ ペロキシダーゼ基質溶液で展開し、４５０ｎｍ
での吸光度を読み取る。
【００８４】実施例４ ＡＴＣＣ（前述）に寄託されたハイブリドーマ、１Ｆ
５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３
Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２
Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１、および５Ｂ１０はｐ９０タ
ンパクのエピトープに対するモノクローナル抗体を産生
する（図１参照）。以下に記載のプロトコールは、これ
らのモノクローナル抗体と他の抗ｐ９０抗体を一時抗体
として用いて、ＤＭ２遺伝子コード産物であるｐ９０タ
ンパクを組織中、好ましくはヒト組織中で免疫組織化学
的方法によって検出するものである。アビジン−ビオチ
ン免疫パーオキシダーゼ法は、感度が高いため適切な手
法である。ヒトの正常および腫瘍組織切片をクリオスタ
ットで切り出し、マイクロスライドに載置する。これら
の切片を阻止血清で、次いで過酸化水素およびアビジン
−ビオチンブロック剤でインキュベートする。第一抗
体、即ち抗ｐ９０抗体を適切な濃度で使用する。この適
切な濃度は、各抗体について滴定を行うことによって経
験的に決定される。次に、切片をビオチン化第二ウマ抗
マウス抗体、次いでアビジン−ビオチンパーオキシダー
ゼ複合体でインキュベートする。ジアミノベンジディン
を用いて最終反応を行う。切片をヘマトキシリンで対比
染色し、載物台に載せて最終分析する。
【００８５】上記の免疫組織化学方法においては、典型
的にはｐ９０タンパクのみが正常レベルからはずれた上
昇値で組織において検出されるが、この理由は上記の例
で試験した組織について、モノクローナル抗体は細胞中
のｐ９０の上昇のみを検出できるからである。
【００８６】免疫組織化学的 アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ法 パラフィン埋め込み切片 １）ポリ−Ｌ−リジンで被覆したスライド上に５μｍの
組織切片を置く。 ２）切片を６０℃のオーブンに３０分入れてパラフィン
を溶かす。 ３）スライドを室温まで冷却し、脱パラフィンおよび再
水化のための処理を行う。 キシレン−３回（各回５分） １００％エタノール−３回（各回３分） ９５％エタノール−３回（各回３分） ４）蒸留水中で洗浄し、ＰＢＳに移す。 ５）１％のＨ2Ｏ2を用いて１５分間冷却し、内因性のパ
ーオキシダーゼ活性を除去する。 ６）ＰＢＳ中で洗浄（３回）。 ７）内因性のパーオキシダーゼ活性を除去するために、
肝臓、膵臓、脳等のビオチンを含有する細胞中に、アビ
ジン−ビオチン阻止キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を適用す
る。溶液は順番に用い（アビジンの後でビオチン）、ス
ライドは各溶液を用いて１５分インキュベートするこ
と。 ８）ＰＢＳ中で洗浄する。
【００８７】９）酵素分解−酵素の選択は、各抗体に対
して最適になるように経験的に行う。 共通の酵素： ペプシン（ブタの胃の粘膜，Ｓｉｇｍａ）：ＨＣＬ溶液
（２５０ｍｌの蒸留水に２００μｌのＨＣｌを加えたも
の）に０．２５グラムのペプシンを加え、３０分インキ
ュベートする。 トリプシン（ウシの膵臓タイプＩ，Ｓｉｇｍａ）：２５
０ｍｌのＴＲＩＳに０．０６２５グラムのトリプシンを
加え、５分間インキュベートする。蒸留水中で洗浄し、
トリプシン阻止剤（Ｓｉｇｍａ）（２５０ｍｌのＰＢＳ
と０．０２５グラムのトリプシン阻止剤との混合液）を
用いて１５分間インキュベートする。 プロナーゼ（カルビオケム・ベーリング）：２５０ｍｌ
のＴＲＩＳに０．００５５グラムのプロナーゼを加え、
４分間インキュベートする。 フィシン（懸濁液、Ｓｉｇｍａ）：そのまま使用可能。
滴下し、４５分インキュベートする。 サポニン（洗剤、Ｓｉｇｍａ）：２５０ｍｌの蒸留水の
混合液に０．１２５グラムのサポニンを加え、３０分間
インキュベートする。
【００８８】１０）スライドを蒸留水中で洗浄し、ＰＢ
Ｓに移す。 １１）阻止血清−１０％の通常血清（特定の種−第２抗
体と同じ）を加え、２０〜３０分間インキュベート。 １２）阻止血清を真空で吸い上げ除去し、適切な希釈し
た第１抗体を加え、加湿チャンバー内で４℃で一晩イン
キュベートする。第１抗体は、１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ
６、４Ｂ２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ
７、２Ａ９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４
Ｂ１１、および５Ｂ１０のハイブリドーマによって生産
される抗ｐ９０モノクローナル抗体から選択する。第１
抗体は最適な濃度となるように経験的に適宜希釈する。 １３）ＰＢＳを用いて丁寧に洗浄する。ＰＢＳを３回交
換（各回５分） １４）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、３
０分間インキュベートする。 １５）ＰＢＳを用いて洗浄（各５分で３回）。 １６）１：２５（Ａ：Ｂは等割合）希釈のアビジン−ビ
オチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）を３０分間インキュベー
トする。 １７）ＰＢＳを用いて洗浄（各５分で３回）。 １８）色原体基質溶液：パーオシキダーゼ−ジアミノベ
ンザディン（０．０６％ＤＡＢ）（５ｍｇ／ＤＡＢ／１
００ｍｌのＰＢＳに１００μｌの０．３％Ｈ2Ｏ2）。望
ましい色強さになるまでインキュベートする（約５
分）。 １９）ヘマトキシリンを用いて対比染色を行なう。 免疫組織化学的 アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ法 冷凍組織切片 １）５μｍの冷凍組織切片を室温中に３０分間置いて切
片を解凍し、乾燥する。 ２）適切な固定液を１０分間加える（各抗体に最適な固
定液を選択）。 ３）１％のＨ2Ｏ2を用いて１５分間冷却し、内因性のパ
ーオキシダーゼ活性を除去する。 ４）ＰＢＳ中で洗浄（３回）。 ５）内因性のパーオキシダーゼ活性を除去するために、
内在性ビオチンに富む細胞中に、アビジン−ビオチン阻
止キットを加える。アビジン１５分インキュベートし、
ＰＢＳを用いて洗浄し、そしてビオチンを用いて１５分
インキュベートする。 ６）ＰＢＳ中で洗浄する（３回）。 ７）阻止血清−１０％の通常血清（特定の種−第２抗体
と同じ）を加え、加湿チャンバー内で１０〜３０分間イ
ンキュベートする。 ８）阻止血清を真空で吸い上げ除去し、適切な希釈した
第１抗体を加えて１〜２時間インキュベートする。第１
抗体は、１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ２、２Ｅ１
２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ９、３Ｇ
９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１、および５
Ｂ１０のハイブリドーマによって生産される抗ｐ９０モ
ノクローナル抗体から選択する。第１抗体は最適な濃度
となるように経験的に適宜希釈するが、典型的には、ハ
イブリドーマの上澄みとリン酸緩衝血清（ＰＢＳ）との
容量比で１〜１０００である。 ９）ＰＢＳを用いて丁寧に洗浄。 １０）適切に希釈されたビオチン化第２抗体を加え、３
０分間インキュベートする。 １１）ＰＢＳを用いて洗浄（３回）。 １２）１：２５希釈（Ａ：Ｂは等割合）のアビジン−ビ
オチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ）を３０分間インキュベー
トする。 １３）ＰＢＳとＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎを用いて洗浄（３
回）。 １４）色原体基質溶液：パーオシキダーゼ−ジアミノベ
ンザディン（０．０６％ＤＡＢ）で約５分間。 １５）ヘマトキシリンを用いて対比染色を行う。
【図面の簡単な説明】
【図１】この図は、本発明の抗ｐ９０単クーロン抗体と
反応するｐ９０タンパク質のエピトープを示す図であ
る。ハイブリドーマ１Ｆ５、６Ｃ１０、１Ｄ６、４Ｂ
２、２Ｅ１２、３Ｆ３、３Ｇ５、３Ｆ８、６Ｈ７、２Ａ
９、３Ｇ９、１Ｄ１１、２Ａ１０、１Ｇ２、４Ｂ１１、
および５Ｂ１０によって生成された抗ｐ９０単クーロン
抗体が、これらの抗体が反応するエピトープを示す位置
のｐ９０アミノ酸エピトープマップの下に、示されてい
る。
【図２】このグラフは、軟組織肉腫患者２１１人の９０
か月間における全体的な生存を示す。
【図３】このグラフはｐ５３とｍｄｍ２のレベル上昇
と、軟組織肉腫患者２１１人（図２参照）のグループに
おける生存を示す。グラフ中に示した表現型の類型は下
記の通りである。グループＡ：ｄｍ２−／ｐ５３−（ｄ
ｍ２、ｐ５３の何れもレベル上昇がない）。グループ
Ｂ：ｄｍ２＋／ｐ５３−およびｄｍ２−／ｐ５３＋。グ
ループＣ：ｄｍ２＋／ｐ５３＋（ｄｍ２、ｐ５３の両方
ともレベルが上昇）。
【図４】抗ｄｍ２抗体と抗ｐ５３抗体を使用した免疫染
色パターンを示す。上側の２個のスライドはコントロー
ルグループを示す。左上のスライドは、ｄｍ２−である
３Ｔ３−Ｂａｌｂ／ｃ細胞系の染色パターンを示す。右
上のスライドは、ｄｍ２＋である３Ｔ３−ＤＭ細胞系の
染色パターンを示す。中央の２個のスライドは、同じ患
者から採取したヒト腫瘍組織切片の染色パターンを示
す。中央左側のスライドはｐ５３の−の染色パターンを
示し、中央右側のスライドはｄｍ２＋の染色パターンを
示す（以下に述べるグループＢサブセットｐ５３−／ｄ
ｍ２＋サブセットに対応する）。下側の２個のスライド
は別患者から採取したヒト腫瘍組織切片の染色パターン
を示す。左下のスライドは、ｐ５３＋の染色パターンを
示し、右下のスライドはｄｍ２＋の染色パターンを示す
（以下に述べるグループＣに対応する）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 1/68 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｚ 33/574 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (71)出願人 399026731 スローン − ケタリング・インスティテ ュート・フォー・キャンサー・リサーチ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10021、 ニューヨーク、ヨーク・アベニュー 1275 (72)発明者 レビン，アーノルド，ジェー. アメリカ合衆国 08540 ニュージャージ ー州，プリンストン，フリッツランドルフ ロード 138 (72)発明者 フィンレー，キャシー，エー. アメリカ合衆国 19067 ペンシルバニア 州，ヤードリー，ベイベリー レーン 660 (72)発明者 コードン−カード，カルロス アメリカ合衆国 10021 ニューヨーク州, ニューヨーク，イースト 63 ストリート 504，エーピーティ 24アール Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA36 BA41 CA03 CA04 CA05 CA07 CA09 DA02 DA06 EA04 GA01 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ52 QQ58 QR32 QR38 QR41 QR55 QR66 QR82 QS12 QS25 QS34 QS36 QS39 QX01 QX07 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE12 DA14 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AB04 AC14 BA01 BA21 CA25 CA46 4C085 AA14 CC02 CC03 CC04 CC05 DD23 DD32 DD61 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 DA86 EA51 FA72 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として
    寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５によって生産されるモ
    ノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として
    寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１１によって生産される
    モノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として
    寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０によって生産される
    モノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として
    寄託されたハイブリドーマ２Ａ９によって生産されるモ
    ノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として
    寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２によって生産されるモ
    ノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】 トキシンに結合された請求項１〜５のい
    ずれか１項記載のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】 検出可能なマーカによって標識が付けら
    れた請求項１〜５のいずれか１項記載のモノクローナル
    抗体。
  8. 【請求項８】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として
    寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ
    Ｂ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１
    １、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託された
    ハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１
    ８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡ
    ＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブ
    リドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマ
    によって生産されるモノクローナル抗体によって認識さ
    れるエピトープと同じエピトープを認識するモノクロー
    ナル抗体。
  9. 【請求項９】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２として
    寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号Ｈ
    Ｂ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１
    １、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託された
    ハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１
    ８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡ
    ＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブ
    リドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマ
    によって生産されるモノクローナル抗体によって認識さ
    れるエピトープと同じエピトープと競合するモノクロー
    ナル抗体。
  10. 【請求項１０】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２とし
    て寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号
    ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１
    １、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託された
    ハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１
    ８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡ
    ＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブ
    リドーマ４Ｂ２を含む群から選択されたハイブリドーマ
    によって生産されるモノクローナル抗体によって認識さ
    れるエピトープと同じエピトープを５０〜１００％の範
    囲で阻止する請求項９記載のモノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８２とし
    て寄託されたハイブリドーマ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号
    ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ１
    １、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８４として寄託された
    ハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１
    ８５として寄託されたハイブリドーマ２Ａ９、およびＡ
    ＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブ
    リドーマ４Ｂ２を含む群から選択されるハイブリドー
    マ。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜５記載のモノクローナル抗
    体の群から選択されるモノクローナル抗体によって認識
    されるエピトープ。
  13. 【請求項１３】 請求項３記載のモノクローナル抗体に
    よって認識されるエピトープ。
  14. 【請求項１４】 （ａ）ｐ５３タンパク質を認識する抗
    ｐ５３抗体を含む容器と、（ｂ）ｄｍ２タンパク質を認
    識する抗ｄｍ２抗体を含む容器とを含有する診断キッ
    ト。
  15. 【請求項１５】 抗体に標識が付けられている請求項１
    ４記載の診断キット。
  16. 【請求項１６】 （ａ）抗ｐ５３抗体を認識する標識化
    抗体と、（ｂ）抗ｄｍ２抗体を認識する標識化抗体とを
    さらに含有する請求項１４記載の診断キット。
  17. 【請求項１７】 癌細胞、または癌性または前癌性にな
    る危険性のある細胞であって、少なくとも１個の正常な
    ｐ５３対立遺伝子を含む細胞が生物学的試料の中にある
    かどうかを検出する方法であって、生物学的試料中にお
    けるｄｍ２のレベルがｄｍ２発現のレベルに比較して異
    常に上昇したか否かを検出することを含み、生物学的試
    料中におけるｄｍ２のレベルが異常に上昇したことによ
    って癌細胞、または癌性または前癌性になる危険性のあ
    る細胞であると判断する方法。
  18. 【請求項１８】 レベルの上昇を生物学的試料の免疫組
    織化学的な染色パターンによって決定する請求項１７記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 ｄｍ２遺伝子の増殖または発現のレベ
    ルをプローブを用いて決定する請求項１７に記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 プローブが核酸プローブである請求項
    １９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 プローブが抗体である請求項１９に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３
    Ｇ５によって生産されるものである請求項２２記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８３として寄託されたハイブリドーマ４
    Ｂ１１によって生産されるものである請求項２２記載の
    方法。
  25. 【請求項２５】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８４として寄託されたハイブリドーマ２
    Ａ１０によって生産されるものである請求項２２記載の
    方法。
  26. 【請求項２６】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリドーマ２
    Ａ９によって生産されるものである請求項２２記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８６として寄託されたハイブリドーマ４
    Ｂ２によって生産されるものである請求項２２記載の方
    法。
  28. 【請求項２８】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３
    Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託され
    たハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１
    １８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴ
    ＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリ
    ドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６
    として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選
    択されたハイブリドーマによって生産されるモノクロー
    ナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトー
    プを認識するものである請求項２２記載の方法。
  29. 【請求項２９】 モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受託
    番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドーマ３
    Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託され
    たハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１
    １８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、ＡＴ
    ＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイブリ
    ドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８６
    として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群から選
    択されたハイブリドーマによって生産されるモノクロー
    ナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピトー
    プと競合するものである請求項２２記載の方法。
  30. 【請求項３０】 競合モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ
    受託番号ＨＢ１１１８２として寄託されたハイブリドー
    マ３Ｇ５、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８３として寄託
    されたハイブリドーマ４Ｂ１１、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ
    １１１８４として寄託されたハイブリドーマ２Ａ１０、
    ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１８５として寄託されたハイ
    ブリドーマ２Ａ９、およびＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１１
    ８６として寄託されたハイブリドーマ４Ｂ２を含む群か
    ら選択されたハイブリドーマによって生産されるモノク
    ローナル抗体によって認識されるエピトープと同じエピ
    トープの５０〜１００％の範囲で阻止するものである請
    求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ｐ５３／ｄｍ２複合体。
  32. 【請求項３２】 請求項６記載の抗体を腫瘍に接触させ
    ることにより抗体を腫瘍に結合させる腫瘍を持つ患者の
    治療方法。
  33. 【請求項３３】 請求項７記載の抗ｄｍ２抗体が映像化
    すべき腫瘍と結合するような条件下でその抗体を腫瘍に
    接触させ、結合した抗体を検出することによって腫瘍を
    映像化する腫瘍の映像化方法。
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