JP3455228B2 - 第１３染色体連鎖−乳癌感受性遺伝子 - Google Patents

第１３染色体連鎖−乳癌感受性遺伝子

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細
には、本発明は、そのうちの幾つかの突然変異対立遺伝
子が癌、特に女性および男性において乳癌に対する感受
性を引起すヒト癌素因遺伝子（BRCA2）を単離および検
出するために用いる方法および材料に関する。より詳細
には、本発明は、BRCA2遺伝子中の生殖系突然変異、お
よび乳癌への素因の診断におけるその使用に関する。さ
らに、本発明は、ヒト乳癌におけるBRCA2遺伝子中の体
細胞突然変異、およびヒト乳癌の診断および予後におけ
るその使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌に
おけるBRCA2遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト癌
の診断および予後におけるその使用に関する。本発明
は、また、遺伝子治療、蛋白質置換療法、および蛋白質
ミメティクスを包含する、BRCA2遺伝子中に突然変異を
有するヒト癌の治療にも関する。さらに、本発明は、癌
治療用の薬剤のスクリーニングに関する。最後に、本発
明は、乳癌への素因を診断するのに有用である、突然変
異についてのBRCA2遺伝子のスクリーニングに関する。
本明細書中にて用いる刊行物および他の材料は本発明
の背景を説明するためのものであって、特に実施に関連
するさらなる説明を記載する場合には、出典明示して本
明細書の一部とみなし、簡便のために、以下の明細書中
において著者および発行年によって参照し、各々、添付
する参考文献リストにグループ化する。
発明の背景 癌の遺伝学は複雑であり、複優性、トランスフォーム
状態の正の調節遺伝子（癌遺伝子）ならびに複劣性、負
の調節遺伝子（癌抑制遺伝子）が包含される。100種を
超える癌遺伝子が特徴付けされている。１ダースも癌抑
制遺伝子は同定されていないが、その数は50種を超えて
増加すると予想される（Knudson,1993）。
かくも多種の遺伝子の関与は、正常組織の完全性を維
持するために細胞中で作動する増殖制御機構の複雑性を
強調している。この複雑性は、もう１つの方法によって
も明らかである。現在までに、全てまたは大部分のヒト
癌でさえ、その発病に関与することが示された単一の遺
伝子は全くない。最も一般的な癌遺伝子性突然変異は、
全ての固形癌の10−15％において見出されているＨ−ra
s遺伝子中に存在する（Andersonら,1992）。最も頻繁に
突然変異した癌抑制遺伝子は、検査した全ての腫瘍のお
およそ50％でホモ接合的に欠失しているTP53遺伝子、お
よび検査した46％の腫瘍セルラインにおいてホモ接合的
に欠失しているCDKN2である（Kambら,1994a）。全ての
トランスフォーメーションした細胞に共通である標的が
なくては、正常組織は無害のまま残しつつ癌細胞を破壊
または復帰させることができる「魔法の弾丸（magic b
ullet）」の夢は叶えられそうにない。特異的に標的化
する抗腫瘍薬剤の新たな創製に対する希望は、細胞***
の制御に一般的な役割を果たしている腫瘍抑制遺伝子ま
たは癌遺伝子を同定する能力にかかり得る。
クローン化され特徴付けられている癌抑制遺伝子は、
１）網膜芽細胞腫（RB1）;2）ウィルムス腫瘍（WT1）;
3）リー・フラウメニ症候群（TP53）;4）家族性大腸腺
腫瘍（APC）;5）神経繊維腫症１型（NF1）;6）神経繊維
腫症２型（NF2）;7）フォンヒッペル・リンドウ症候群
（VHL）;8）多発性内分泌腫瘍症2A型（MEN2A）；および
９）メラノーマ（CDKN2）；に対する感受性に影響す
る。
遺伝的に地図作成されているが未だ単離されていない
癌抑制遺伝子座には、多発性内分泌腫瘍症１型（MEN
1）；リンチ癌家族性症候群２型（LCFS2）；神経芽細胞
腫（NB）；基底細胞母斑症候群（BCNS）；ベックウィズ
・ビーデマン症候群（BWS）；腎細胞癌（RCC）；結節性
硬化症１型（TSC1）；および結節性硬化症２型（TSC2）
についての遺伝子が包含される。現在までに特徴付けら
れている癌抑制遺伝子は、DNA結合蛋白質（WT1）、補助
転写調節遺伝子（RB1）、GTPエース活性化蛋白質もしく
はGAP（NF1）、細胞体質コンポーネント（NF2）、膜結
合受容体キナーゼ（MEN2A）、細胞周期調節遺伝子（CDK
N2）、および公知の蛋白質（APCおよびVHL）に明らかな
類似性を有しない他のもの；を包含する種々の蛋白質型
に類似性を有する生成物をコードしている。
多くの場合においては、遺伝子研究を通して元来同定
された癌抑制遺伝子は、幾つかの散発性腫瘍においては
欠失または突然変異していることが示されている。この
結果は、染色体異常の領域が、癌への遺伝的素因および
散発性癌の両方に関与する重要な癌抑制遺伝子の位置を
表し得るということを示している。
現在までに特徴付けられている幾つかの癌抑制遺伝子
の顕著な特徴のうちの１つは、それらがある種の癌の型
では高頻度で欠失しているということである。該欠失
は、しばしば単一対立遺伝子の欠失、いわゆるヘテロ接
合性の欠失（LOH）を含むが、両方の対立遺伝子のヘテ
ロ接合欠失も含み得る。LOHについては、予め存在する
遺伝した突然変異であるか、または二次的な散発性突然
変異であるかのいずれかであるためであるため、残りの
対立遺伝子が非機能性であると予想される。
乳癌は、女性に影響する最も重要な疾病のうちの１つ
である。最近の比率では、アメリカ女性は95歳までに乳
癌を発病させる８の危険性のうちの１を有している（Am
erican Cancer Society,1992）。後期ステージにおける
乳癌の治療では、しばしば役に立たず、醜くなってしま
い、該疾病の医学的管理においては早期の検出が非常に
重要なものとなっている。乳癌よりも低い頻度ではある
が、卵巣癌はしばしば迅速に死にいたり、アメリカ女性
における癌死亡者の４番目の最も一般的な原因である。
乳癌発病率の不明確な比率に寄与する遺伝的因子は全ケ
ースの約５％であるが、40歳以前に診断されたケースの
ほぼ25％と概算される（Clausら,1991）。乳癌は、年齢
−特異的発病率曲線中の50歳付近の変曲点に基いて２つ
のタイプ；早期年齢開始および後期年齢開始に分けられ
ている。１つの遺伝子、BRCA1の突然変異は、ほぼ45％
の家族性乳癌の原因であると考えられているが、乳癌お
よび卵巣癌の双方を有する少なくとも80％の家族の原因
であると考えられている（Eastonら,1993）。
BRCA1遺伝子は、それが1990年に地図作成された（Hal
lら,1990;Narodら,1991）後、猛烈な努力の末単離され
た（Futrealら,1994;Mikiら,1994）。第２の遺伝子座、
BRCA2は最近第13染色体に地図作成され（Woosterら,199
4）、BRCA1におよそ等しい比率の早期開始乳癌の原因の
ようであるが、卵巣癌にはより低い危険性を付与してい
るようである。早期開始乳癌に対する残りの感受性は、
家族性癌の未だ地図作成されていない遺伝子とTP53のご
とき遺伝子中のより稀な生殖系突然変異との間に分けら
れる（Malkinら,1990）。毛細管拡張性運動失調遺伝子
の欠損形のヘテロ接合性キャリアーが、乳癌に対してよ
り高い危険性にあることも示されている（Swiftら,197
6;Swiftら,1991）。後期年齢開始乳癌も、早期年齢開始
乳癌ほど比率における危険性は高くないが、しばしば家
族性である（Cannon−Albrightら,1994;Mettlinら,199
0）。しかしながら、遺伝的感受性に起因するかかるケ
ースのパーセンテージはわかっていない。
乳癌は、長い間ずっと、部分的に家族性の疾病である
と認識されてきた（Anderson,1972）。膨大な数の研究
者が遺伝的承継に関する事実を調べ、データは主要感受
性遺伝子座または座群についての優性遺伝と大部分一致
すると結論している（BishopおよびGardner,1980;Goら,
1983;WilliamsおよびAnderson,1984;Bishopら,1988;New
manら,1988;Clausら,1991）。最近の結果によれば、乳
癌ならびに他の癌に対する感受性を運搬している少なく
とも３個の遺伝子座が存在することが立証されている。
これらの遺伝子座は、第17p染色体上のTP53遺伝子座（M
alkinら,1990）、BRCA1として知られている17q−連鎖感
受性遺伝子座（Hallら,1990）、および地図作成されて
いない残りのものに寄与する１または２以上の遺伝子座
である。Hallら（1990）は、早期年齢開始を有する家系
で遺伝された乳癌感受性が、第17q21染色体に連鎖して
いることを示している；しかし、より適当な遺伝モデル
を用いたこのグループによる続く実験は、早期年齢乳癌
への限定に部分的に異議を唱えている（Margaritteら,1
992）。
第13染色体連鎖−乳癌素因遺伝子（BRCA2）をクロー
ニングする大部分のストラテジーは、正確な遺伝子位置
決定実験を要する。BRCA2の機能的な役割に関る最も単
純なモデルは、癌への素因となるBRCA2の対立遺伝子が
野生型対立遺伝子に対して劣性である；すなわち、少な
くとも１個の野生型BRCA2対立遺伝子を含む細胞は癌性
ではない；ということを保持する。しかしながら、１個
の野生型BRCA2対立遺伝子および１個の素因対立遺伝子
を含む細胞は、ランダム突然変異によるか、または細胞
***の間の染色体欠失（非分離）によるかのいずれかに
よる野生型対立遺伝子の欠失を時々被り得る。かかる突
然変異細胞の全子孫はBRCA2の野生型機能を欠いてお
り、腫瘍を発病し得る。このモデルによれば、BRCA2の
素因対立遺伝子は劣性であり、癌に対する感受性もまた
優性様式で遺伝され:1個の素因対立遺伝子（および１個
の野生型対立遺伝子）を有する女性は、彼女らの***上
皮細胞が野生型BRCA2対立遺伝子を自然に欠失し得るた
め、癌を発病する危険がある。このモデルは、網膜芽細
胞腫遺伝子および神経繊維腫症遺伝子を包含する遺伝子
のクラスである、癌抑制遺伝子または抗癌遺伝子（anti
oncogene）として知られている癌感受性遺伝子座に適用
される。推論により、このモデルは、最近示唆されてい
るごとく（Smithら,1992）、BRCA1機能を説明すること
ができる。
第２の可能性は、BRCA2素因対立遺伝子が真に優性で
あり；すなわち、BRCA2の野生型対立遺伝子は素因対立
遺伝子の腫瘍形成機能に打ち勝つことはできない；とい
うものである。かくして、野生型および突然変異対立遺
伝子の両方を運搬している細胞は、悪性細胞を生じる前
に必ずしもBRCA2の野生型コピーを欠失していないであ
ろう。その代りに、素因のある（predisposed）個人の
***細胞は、癌に通じる幾つかの他の確率論的な変化
（群）を起こすであろう。
BRCA2素因対立遺伝子が劣性であるならば、BRCA2遺伝
子は正常***組織で発現されているが、乳癌においては
機能的に発現されていないと予想される。それとは反対
に、BRCA2素因対立遺伝子が優性であるならば、野生型B
RCA2遺伝子は正常***組織で発現されていることも、さ
れていないこともあり得る。しかしながら、素因対立遺
伝子は乳癌細胞で発現しているようである。
BRCA2の第13染色体連鎖は、BRCA1に連鎖していなかっ
た複数ケースの早期年齢開始乳癌ケースを有する15家族
を調査することによって別々に確認された（Woosterら,
1994）。これらの調査は、13q12−13によって画定され
る物理的領域中にBRCA2を位置させる、マーカーD13S289
とD13S267との間の６センチモルガン（cM）またはほぼ
6,000,000塩基対の大きな領域内に該遺伝子が位置決定
されることを主張している。これらの領域のサイズおよ
びそれらに関連する不確定性は、BRCA2遺伝子を単離す
るための物理的地図作成および／またはクローニング・
ストラテジーを設計し実行することを困難としてきた。
BRCA1のように、BRCA2は女性に早期年齢開始乳癌の高い
危険性を付与しているようである。しかしながら、BRCA
2は男性乳癌の上昇した危険性を付与するようである
が、卵巣癌の実質的に上昇した危険性を付与しないよう
である（Woosterら,1994）。
乳癌感受性遺伝子座の同定により、感受性個人の早期
の検出が可能となり、癌に通じる初期段階を理解するた
めの本発明者らの能力を大きく増大させるであろう。感
受性遺伝子座はしばしば腫瘍進行の間に変化するため、
これらの遺伝子をクローニングすることは、より良好な
診断製品および予後製品、ならびにより良好な癌療法の
開発にも重要となり得る。
発明の概要 本発明は一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細に
は、本発明は、そのうちの幾つかの対立遺伝子が癌、特
に女性および男性における乳癌に対する感受性を引起す
ヒト乳癌素因遺伝子（BRCA2）を単離および検出するた
めに使用する方法および材料に関する。より詳細には、
本発明は、BRCA2遺伝子における生殖系突然変異、およ
び乳癌への素因の診断におけるその使用に関する。さら
に、本発明は、ヒト乳癌におけるBRCA2遺伝子中の体細
胞突然変異、およびヒト乳癌の診断および予後における
その使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌にお
けるBRCA2遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト癌の
診断および予後におけるその使用に関する。また、本発
明は、遺伝子治療、蛋白質置換療法および蛋白質ミメテ
ィクスを包含する、BRCA2中に突然変異を有するヒト癌
の治療にも関する。さらに、本発明は、癌治療用の薬剤
のスクリーニングに関する。最後に、本発明は、乳癌へ
の素因を診断するのに有用である、突然変異についての
BRCA2遺伝子のスクリーニングに関する。
図面の簡単な説明 図１は、BRCA2領域中のSTS、P1、BACおよびYACの模式
的地図を示す。
図２は、BRCA2転写配列を組合わせるために用いたcDN
Aクローン、ハイブリッド選抜クローン、cDNA PCR生成
物およびゲノム配列の間の配列−空間関係を示す。２−
Br−C:RACEはヒト***およびヒト乳腺cDNAの両方から得
られたビオチン−捕捉RACE生成物である。cDNAクローン
λsC713.1はヒト精巣およびHepG2 cDNAライブラリーの
プールをハイブリッド選抜クローンGT713でスクリーニ
ングすることによって同定した。配列１−BR:CG026→5k
bは、（λsC713.1内の）エキソン7/8接合部で始まりエ
キソン11の一部であるハイブリッド選抜クローン内で終
結するPCR生成物から生成した。エキソン11の配列は、
公開されているドメインおよび放射性同位元素標識DNA
配列決定ゲルにおけるゲノム配列であるハイブリッド選
抜クローンと比較することによって修正した。そのエキ
ソン内に位置するハイブリッド選抜クローン（nHまたは
GTで始まるクローン名）をその下側に記載する。cDNAク
ローンλwCBF1B8.1、λwCBF1A5.1、λwCBF1A5.12、λwC
BF1B6.2およびλwCBF1B6.3は、ヒト乳腺、胎盤、精巣お
よびHepG2 cDNAライブラリーのプールをエキソン・ト
ラッピングクローンwXBF1B8、wXPF1A5およびwXBF1B6で
スクリーニングすることによって同定した。クローンλ
wCBF1B6.3は（破線で示す）キメラであるが、その5'末
端はλwCBF11A5.1との重要な重複を含んでいる。翻訳イ
ニシエーターを示す。翻訳ターミネーターを示す。
図3A−3Dは、BRCA2遺伝子のDNA配列（配列番号:1にも
記載する）を示す。
図４は、BRCA2遺伝子のゲノム体制を示す。エキソン
（四角および／または縦線）は、それらのサイズおよび
間隔が比例するように、ゲノム配列（ftp://genome.wus
t1.edu/pub/gscl/brca;）（横線）を横切って分離され
ている。各ゲノム配列の名称を図の左側に記載する。配
列92M18.00541および92M18.01289は実際に重複してい
る。他のゲノム配列の間の距離はわかっていない。公共
のデータベースにも本発明者らのデータベースにも、エ
キソン21と重複するゲノム配列は含まれていなかった。
エキソン１、11および21は番号付けられている。「＊」
はこのスケールでは分割できないほど十分に近接して位
置する２個の隣接エキソンを示す。
図5A−5Dは、一次乳癌のヘテロ接合性の喪失（loss
of heterozygosity）（LOH）分析を示す。STRマーカー
の対立遺伝子はクロマトグラムの下側に示す。示したの
は、BRCA2における腫瘍ヘテロ接合型の１つの例（図5A
および5B）と、BRCA2においてLOHを有する腫瘍の１つの
例である（図5Cおよび5D）。蛍光単位が縦座標であり；
塩基対におけるサイズが横座標である。Ｎは正常につい
てであって（図5Aおよび5C）、Ｔは腫瘍についてである
（図5Bおよび5D）。
発明の詳細な説明 本発明は一般的にヒト遺伝学の分野に関する。詳細に
は、本発明は、そのうちの幾つかの対立遺伝子が癌、特
に女性および男性における乳癌に対する感受性を引起す
ヒト乳癌素因遺伝子（BRCA2）を単離し検出するために
使用する方法および材料に関する。より詳細には、本発
明は、BRCA2遺伝子における生殖系突然変異、および乳
癌への素因の診断におけるその使用に関する。さらに、
本発明は、ヒト乳癌におけるBRCA2遺伝子中の体細胞突
然変異、およびヒト乳癌の診断および予後におけるその
使用に関する。加えて、本発明は、他のヒト癌における
BRCA2遺伝子中の体細胞突然変異、およびヒト癌の診断
および予後におけるその使用に関する。また、本発明
は、遺伝子治療、蛋白質置換療法および蛋白質ミメティ
クスを包含する、BRCA2中に突然変異を有するヒト癌の
治療に関する。さらに、本発明は、癌治療用の薬剤のス
クリーニングに関する。最後に、本発明は、乳癌への素
因を診断するのに有用である、突然変異についてのBRCA
2遺伝子のスクリーニングに関する。
本発明は、BRCA2遺伝子座または突然変異BRCA2遺伝子
座の全体または一部分、好ましくは少なくとも８塩基長
であって約100kb以下を含む単離ポリヌクレオチドを提
供する。かかるポリヌクレオチドはアンチセンス・ポリ
ヌクレオチドであってもよい。本発明は、また、かかる
単離ポリヌクレオチドを含む組換え構築物、例えば形質
転換宿主細胞における発現に適当な組換え構築物も提供
する。
また、被検体中のBRCA2遺伝子座の一部分を含むポリ
ヌクレオチドまたはその発現産物を検出する方法も提供
する。さらに、かかる方法は、BRCA2遺伝子座の部分を
増幅する工程を含んでいてもよく、さらに、BRCA2遺伝
子座の該部分を増幅させるためのプライマーである一連
のポリヌクレオチドを得る工程を含んでいてもよい。該
方法は、癌への素因の診断、または癌の診断もしくは予
後のいずれかに有用である。
また、本発明は、BRCA2遺伝子座によってコードされ
ている少なくとも５個のアミノ酸残基よりなる単離ポリ
ペプチドに特異的に結合する単離抗体、好ましくはモノ
クローナル抗体も提供する。
また、本発明は、BRCA2遺伝子座の一部分を含むポリ
ヌクレオチドを被検体中で検出するキットも提供し、該
キットは適当な容器中に密閉されたBRCA2遺伝子座の一
部分に相補的なポリヌクレオチド、およびそれを使用す
るための指示書を含む。
さらに、本発明は、ヌクレオチドを重合して、BRCA2
遺伝子座の少なくとも８個のヌクレオチドよりなる配列
を得ることからなるポリヌクレオチドの調製法も提供
し；該ポリヌクレオチドの調製法はアミノ酸を重合させ
て、BRCA2遺伝子座内にコードされている少なくとも５
個のアミノ酸を含む配列を得ることからなる。
さらに、本発明は、BRCA2遺伝子をスクリーニングし
て突然変異を同定する方法も提供する。さらに、かかる
方法はBRCA2遺伝子座の一部分を増幅させる工程を含ん
でいてもよく、さらに、BRCA2遺伝子座の該部分を増幅
させるためのプライマーである一連のポリヌクレオチド
を得る工程を含んでいてもよい。該方法は、癌への素因
の診断または癌の診断もしくは予後のいずれかで使用し
て突然変異を同定するのに有用である。
さらに、本発明は、予想されるBRCA2突然変異対立遺
伝子をスクリーニングしてBRCA2遺伝子中の突然変異を
同定する方法も提供する。
加えて、本発明は、癌治療用の薬剤をスクリーニング
して、BRCA2遺伝子産物機能を回復させるのに適した薬
剤を同定する方法を提供する。
最後に、本発明は、癌細胞に指向される遺伝子ベース
の治療剤の生成に必要な手段を提供する。この治療剤
は、BRCA2蛋白質の機能が復元されるように、適当なベ
クターに挿入するか、またはより直接的な方法で標的細
胞にデリバリーされたBRCA2遺伝子座の全体または一部
分を含むポリヌクレオチドの形態を採り得る。また、治
療剤は、BRCA2の一部分または全体の蛋白質配列のいず
れかに基くポリペプチドの形態をも採り得る。これら
は、BRCA2の活性をイン・ビボ（in vivo）で機能的に
置換えることができる。
個人を乳癌に罹りやすくするBRCA2遺伝子座が、BRCA2
蛋白質をコードしている遺伝子であることが本発明の発
見である。本明細書中においてはこの遺伝子をBRCA2と
称する。生殖系におけるBRCA2遺伝子座中の突然変異が
男性および女性の双方における乳癌への素因を示唆する
ことが本発明の発見である。最後に、BRCA2遺伝子座中
の体細胞突然変異も乳癌および他の癌と関連し、これら
の癌の、またはこれらの癌の予後のインジケーターを示
すことも本発明の発見である。BRCA2遺伝子座の突然変
異事象には、コーディング配列および非−コーディング
配列内の欠失、挿入および点突然変異が包含され得る。
約6,000,000塩基対と概算されるサイズを有するヒト
ゲノムの第13染色体上の領域から出発する、乳癌を含む
癌に対して感受性を引起す遺伝子座BRCA2を含む1,000,0
00〜1,500,000塩基の小さい方の領域を同定した。
BRCA2遺伝子座を含む領域は、種々の遺伝子技術を用
いて同定した。最初に遺伝子地図作成技術により、遺伝
子マーカーとの組換えによってBRCA2領域を画定した。
乳癌の複数ケースを有する大きく広がる家族（「家系
（kindred）」の調査に基いて、BRCA2遺伝子を含む染色
体領域を正確に位置決定した。BRCA2遺伝子座を含む領
域は、マーカーD13S289とD13S267とによって物理的に制
限される。
本発明により提供される遺伝子マーカーを使用するこ
とにより、ヒト酵母人工染色体（YAC）またはヒト細菌
人工染色体（BAC）ライブラリーからの領域をカバーす
るクローンを同定することができた。また、それによ
り、この領域からのより簡便に操作したP1およびBACク
ローンを同定および調製し、ならびにサブセットのクロ
ーンからの隣接を構築することもできた。これらのP1、
YACおよびBACにより、BRCA2遺伝子座のクローニングの
基礎が提供され、例えば、乳癌および／または卵巣癌の
診断および治療に有効な試薬を開発するための基礎が提
供される。BRCA2遺伝子および他の潜在的な感受性遺伝
子がこの領域から単離されている。該単離は、該領域中
で、P1およびBACからの全体または部分的cDNAを用い
た、ソフトウエア捕捉（software trapping）（隣接ま
たは非隣接のゲノムDNA配列からコーディングエキソン
を含んでいそうな配列を同定するためのコンピュータ的
方法）、ハイブリッド選抜技術および直接スクリーニン
グを用いて行い、cDNAライブラリーをスクリーニングし
た。これらの方法を用いて、***および他の組織中で発
現している遺伝子座の配列を得た。これらの候補遺伝子
座を分析して、癌感受性を付与する配列を同定した。本
発明者らは、BRCA2として知られている第13染色体連鎖
−癌感受性に寄与する、家系におけるBRCA2遺伝子座の
コーディング配列中に突然変異が存在することを発見し
た。本発明は、患者の生存に極めて重大なある種の癌の
早期の検出を促進するのみならず、個人が癌を発病する
前に感受性個人を検出することもできる。
集団資源 大きなよく報告されているユタ州家系は、ヒト遺伝学
研究の良好な資源を提供する点で極めて重要である。各
大家系は、独立して、その家族においてBRCA2感受性対
立遺伝子が分離しているか否かを検出する能力を提供す
る。BRCA2遺伝子座の位置決定および単離に有益な組換
え体は、感受性対立遺伝子の存在を確認するのに十分に
大きな家系からのみ得ることができた。大きな同胞群
は、BRCA2感受性対立遺伝子の浸透度は、年齢および性
別の双方によって減じられて有益な同胞群を見出すのが
困難となるため、乳癌を研究するために極めて重要であ
る。大きな同胞群は、死亡した個人に近い親族関係のハ
プロタイプからの推論によって死亡した個人のハプロタ
イプを構築するのに必須である。
他の集団でも有益な情報を提供し得るが、かかる研究
は一般的に非常に大きな労力を要し、該家族は通常遥か
に小さく、したがって有益性が低い。ユタ州の年齢−調
整乳癌発病率は20％であって、これは平均合衆国比率よ
りも低い。ユタ州におけるより低い発病率は、恐らく、
ユタ州家系において見出されたケースが遺伝的素因を運
搬していることの確率を上昇させる、初回妊娠時の低年
齢に大きく起因している。
遺伝子地図作成 一連の有益な家族が得られれば、疾病を染色体の領域
に連鎖させるのに遺伝子マーカーが必須である。かかる
マーカーには、制限断片長多形（RFLP）（Botsteinら,1
980）、VNTR（variable number of tandem repeat
s）を有するマーカー（Jeffreysら,1985;Nakamuraら,19
87）、および短タンデムリピート（STR）、特にCpAの反
復（WeberおよびMay,1989;Littら,1989）に基づく多量
クラスのDNA多形性が包含される。遺伝子地図を作成す
るためには、強力な遺伝子マーカーを選択し、研究する
家系のメンバーから抽出したDNAを用いて該遺伝子マー
カーを試験する。
疾病と関連する遺伝子座を探索するのに有用な遺伝子
マーカーは、特定の染色体を密にカバーするか、または
染色体の特定の領域を詳細に分析することにより、アド
・ホック（ad hoc）ベースで選抜し得る。疾病と連鎖す
る遺伝子マーカーを選抜するために好ましい方法には、
家系の有益性の程度を評価して所定の程度の多形性の遺
伝子マーカー間の理想距離を測定し、次いで最大効率に
つき理想的に間隔の空いている知られている遺伝子地図
からマーカーを選抜することが含まれる。家系の有益性
は、該マーカーが無関係な個人においてヘテロ接合性と
なる確率によって測定する。PCRを用いた標的核酸配列
の増幅によって検出されるSTRマーカーを用いることも
最も有効であり；かかるマーカーは非常に有益であって
アッセイするのが容易であり（WeberおよびMay,198
9）；多重ストラテジーを用いて同時にアッセイするこ
とができ（SkolnickおよびWallace,1988）、必要な実験
回数を大幅に減少する。
連鎖が確立されれば、疾病遺伝子座にフランク（flan
k）するマーカー、すなわち該疾病遺伝子座に隣接する
１または２以上のマーカーと、該疾病遺伝子座に遠位の
１または２以上のマーカーとを見出す必要がある。可能
な場合には、知られている遺伝子地図から候補マーカー
を選抜することができる。知られているものがない場合
には、実施例で示すごとき、STR技術によって新たなマ
ーカーを同定することができる。
遺伝子地図作成は、通常、反復プロセスである。本発
明においては、BRCA2遺伝子座周辺のフランクする遺伝
子マーカーを画定にすることによって開始し、次いで、
これらのフランスするマーカーをBRCA2遺伝子座に順次
近い他のマーカーで置換える。最初の工程としては、大
きく広がった家系によって明確になった組換え事象が、
特定の遺伝子マーカーに遠位かまたは隣接するかのいず
れかのBRCA2遺伝子座を位置決定するのに特に助けとな
る（Woosterら,1994）。
本発明が開示されるまで、BRCA2を囲む領域はよく地
図作成されておらず、マーカーはほとんど存在しなかっ
た。したがって、短反復配列は、コスミド、P1、BACお
よびYACから開発し、物理的に地図作成し、新たな遺伝
子マーカーを開発するために該領域を分析した。新たな
STRは双方とも多形性であり、BRCA2領域に地図作成され
ることが判明した。
物理的地図作成 ３種の異なる方法を用いて該領域を物理的に地図作成
した。第１のものは、BRCA2領域をクローン化するため
の酵母人工染色体（YAC）の使用である。第２のもの
は、BRCA2遺伝子座を含む領域をカバーする一連のP1、B
ACおよびコスミドクローンの創製であった。
酵母人工染色体（YAC） BRCA2遺伝子座を含む十分に小
さい領域を同定したら、該領域をカバーする一連の重複
するYACを同定することによって該領域中のDNAの物理的
単離を進めた。有用なYACはSt.LouisおよびCEPH YACラ
イブラリーのごとき知られているライブラリーから単離
することができ、これらは広く分布し、各々がほぼ50,0
00のYACを含む。単離したYACはこれらの公共的にアクセ
ス可能なライブラリーからのものであり、Michigan Gen
ome Centerを包含する多数の供給源から得ることができ
る。明らかに、これらのYACにアクセスしたものであれ
ば、彼らはBRCA2遺伝子座を含む最小領域の中にどのYAC
が存在し、どのYACがその外側に存在するのかが理解で
きないであろうから、本発明の開示がなくては、本発明
者らが選抜した特定のYACの価値を理解しないであろ
う。
P1およびBACクローン 本発明においては、P1およびBAC
クローンを得て、この領域をカバーすることによって進
めるのが有利である。YACインサートに比してより小さ
いサイズのこれらのインサートは、特異的なハイブリダ
イゼーション・プローブとしてそれらをより有用とす
る。さらに、酵母細胞中よりも細菌細胞中にクローン化
DNAを有することは、簡便性を大きく増大させ、それで
もって目的のDNAを操作することができ、ハイブリダイ
ゼーション・アッセイのシグナル−対−ノイズ比を改善
することができる。
P1およびBACクローンは、本明細書中に記載するごと
く単離したYAC、P1およびBAC由来の特定の標識化部位
（STS）を用いて全ヒトゲノムから構築したライブラリ
ーをスクリーニングすることによって得る。
これらのP1およびBACクローンは、散在性反復配列（I
RS）PCRおよび／または制限酵素消化につづくゲル電気
泳動および得られたDNAフラグメント（「フィンガープ
リント」）の比較によって比較することができる（Mani
atisら,1982）。該クローンは、STSの存在によっても特
徴付けることができる。該フィンガープリントを用い
て、該領域をカバーするが過剰に余分ではない、重複隣
接セットのクローンを画定する。本明細書中においては
これを「最小タイル路（minimum tiling path）」と
いう。かかる最小タイル路は、BRCA2遺伝子座からの起
源となり得るcDNAを同定する続く実験の基礎をなす。
P1クローン（Sternberg,1990;Sternbergら,1990;Pier
ceら,1992;Shizuyaら,1992）は、スクリーニング用に本
発明者らによって提供されたPCRプライマーを用いてGen
ome Sciences社によって単離された。BACは、Mel Sim
on博士の研究室のハイブリダイゼーション技術および本
発明者らの研究室のPCRプールの分析によって得られ
た。P1およびBACクローンを用いるストラテジーによ
り、YAC由来ではない独立セットのクローンを用いてゲ
ノム領域のカバーも可能となった。このことは、YAC中
の欠失の可能性に対して保護される。P1およびBACクロ
ーン由来のこれらの新たな配列は、以下に説明するごと
く、候補遺伝子についてさらにスクリーニングするため
の材料を提供する。
遺伝子単離 単離しようとする遺伝子座のコーディング配列の候補
となりそうな配列の存在についてゲノムクローンを試験
するための多種の技術が存在し、それには限定されるも
のではないが、（ａ）ゾー・ブロット（zoo blot）、
（ｂ）HTF島を同定すること、（ｃ）エキソン・トラッ
ピング、（ｄ）cDNAをP1、BAC、またはYACにハイブリダ
イズさせること、および（ｅ）cDNAライブラリーをスク
リーニングすることが含まれる。
（ａ）ゾー・ブロット 第１の技術は、サザンブロット
にコスミドをハイブリダイズさせて、進化的に保存さ
れ、したがって（サル、雌ウシ、ニワトリ、ブタ、マウ
スおよびラットのごとき）ヒトに対して変化する程度の
近縁関係の種からのDNAと陽性ハイブリダイゼーション
シグナルを供するDNA配列を同定することである。種々
の種からのかかるDNAを含むサザン・ブロットは市販さ
れている（Clonetech社，カタログ番号7753−１）。
（ｂ）HFT島を同定すること 第２の技術には、しばし
ばコーディング領域の付近またはその中に発生するヌク
レオチドＣおよびＧがリッチな領域を見出すことが含ま
れる。かかる配列は、CpGダイマーを含む部位に特異的
な制限酵素がこれらの領域中を頻繁に切断するため、HF
T（Hpal小フラグメント、Hpal tiny fragment）またはC
pG島と称されている（Lindsayら,1987）。
（ｃ）エキソン・トラッピング 第３の技術はエキソン
・トラッピングであり、この方法はスプライシング接合
部を含み、したがって遺伝子のコーディング領域を含ん
でいそうなゲノムDNA中の配列を同定する。エキソン増
幅（Bucklerら,1991）を用いて前記のDNAクローンから
エキソンを選抜し、増幅する。エキソン増幅は、機能的
な5'および／または3'スプライシング部位によって挟ま
れているRNA配列の選抜に基いている。該エキソン増幅
の産物を用いて***cDNAライブラリーをスクリーニング
して、さらなる研究のために管理可能な数の候補遺伝子
を同定する。エキソン・トラッピングは、コンピュータ
プログラムを用いるか、またはソフトウエア・トラッピ
ングによって配列決定したDNAの小セグメント上で行う
こともできる。
（ｄ）cDNAをP1、BACまたはYACにハイブリダイズさせる
こと 第４の技術は、コスミド、P1、BACまたはYACに対
するcDNAのハイブリダイゼーションを利用し、クローン
化したゲノムDNA中に同定すべき、およびそれから回収
すべき配列を転写させることができる選択的豊富化技術
の修飾形である（Kandpalら,1990）。本発明の目的のた
めに変形した該選択的豊富化技術には、YAC中に存在す
るBRCA2の領域からのDNAをカラムマトリックスに結合さ
せ、該結合したDNAとハイブリダイズする適当なライブ
ラリーからcDNAを選抜し、つづいて結合したDNAを増幅
し精製して、その結果クローン化ゲノムDNAによって示
される領域中のcDNAを大きく豊富化させることが含まれ
る。
（ｅ）cDNAの同定 第５の技術は、BRCA2遺伝子座に相
当するcDNAを同定することである。前記技術のいずれか
を用いて選抜した推定コーディング配列を含むハイブリ
ダイゼーション・プローブを用いて、***組織cDNAライ
ブラリーおよびいずれかの他の必要なライブラリーを包
含する種々のライブラリーを選抜する。
cDNAの直接選抜の趣旨の他の変形を用いても、BRCA2
の候補遺伝子を見出すことができる（Lovettら,1991;Fu
treal,1993）。この方法はコスミド、P1、またはBACのD
NAをプローブとして用いる。該プローブDNAをHae IIIの
ごとき平滑切断制限酵素で消化する。ついで、該DNAに
二本鎖アダプターを連結させ、ビオチン標識プライマー
を用いるつづくPCR増幅反応におけるプライマーの結合
部位を供する。標的cDNAは、ランダムプライムまたはオ
リゴ（dT）プライムしたいずれかの第１鎖につづいて第
２鎖を合成することによって、例えば***組織のような
組織試料由来のmRNAから作製する。cDNA末端を平滑化
し、二本鎖アダプターに連結する。このアダプターは、
PCR用の増幅部位として供される。該標的およびプロー
ブ配列を変性させ、ヒトC0t−１ DNAと混合して反復配
列をブロックする。溶液ハイブリダイゼーションを行っ
てC0t−1/2値を高くし、稀な標的cDNAのハイブリダイゼ
ーションを確実なものとする。ついで、アニールした材
料をアビジンビーズ上に捕捉し、高ストリンジェンシー
で洗浄し、保持されたcDNAを溶出し、PCRによって増幅
する。選抜したcDNAは、分析用のプラスミドベクターに
クローニングする前に、さらなるラウンドの豊富化に付
す。
候補性についてのcDNAの試験 cDNAがBRCA2遺伝子座であることの証拠は、異常なBRC
A2遺伝子産物または異常なレベルのBRCA2遺伝子産物を
生成する影響する家系メンバーから抽出したDNA中に配
列を見出すことによって得られる。かかるBRCA2感受性
対立遺伝子は、大きな家系における疾病と共分離（co−
segregate）するであろう。また、それは、乳癌を有す
る非家系個人に、ついで一般集団中の個人に、遥かに高
頻度に存在するであろう。最後に、腫瘍は、しばしば、
生殖系中で突然変異した他の例にもある遺伝子座中で体
細胞突然変異するため、本発明者らは、腫瘍組織から抽
出されたDNA中のBRCA2感受性対立遺伝子と同一またはそ
れに類似する配列中に突然変異した正常生殖系BRCA2対
立遺伝子が見出されると予想した。腫瘍組織からのBRCA
2配列と同一個人の生殖系からのBRCA2対立遺伝子を比較
するか、あるいは、癌ケースからの生殖系BRCA2対立遺
伝子と非影響の個人からのものを比較するかは、遺伝子
産物の正常機能に明らかな崩壊を引起すに十分に重大で
ある突然変異を見出すことが鍵である。これらの突然変
異は多数の形態を採り得る。最も重い形態は、異常蛋白
質をコードする遺伝子を引起すか、または蛋白質発現を
大きく変化させるであろうフレームシフト突然変異また
は大きな欠失であろう。あまり重くない崩壊性突然変異
には、産生される蛋白質に重大な影響を及ぼすであろ
う、システイン残基へのまたはそれからの変化、塩基性
から酸性アミノ酸へのまたはその反対の変化、疎水性か
ら親水性アミノ酸へのまたはその反対の変化、あるいは
二次、三次または四次蛋白質構造に影響するであろう他
の突然変異のごとき、小さな読み枠内欠失および非同類
塩基対置換が含まれるであろう。サイレント突然変異ま
たは同類アミノ酸置換を生じるものは、一般的に蛋白質
機能を崩壊するとは予想されないであろう。
本発明の診断および予後方法により、野生型BRCA2遺
伝子座の変化が検出される。加えて、該方法は、野生型
BRCA2遺伝子座を検出し、該BRCA2遺伝子座における癌へ
の素因の欠損を確認することによって行うことができ
る。「野生型遺伝子の変化」には、コーディングおよび
非コーディング領域中の欠失、挿入、および点突然変異
を含む全ての形態の突然変異が包含される。欠失は遺伝
子全体のものでも遺伝子の一部分のみのものであっても
よい。点突然変異は終止コドン、フレームシフト突然変
異またはアミノ酸置換を生じ得る。体細胞突然変異はあ
る種の組織、例えば腫瘍組織でのみ生じるものであり、
生殖系中に遺伝されない。生殖系突然変異はいかなる身
体の組織においても見出すことができ、遺伝される。単
一の対立遺伝子のみが体細胞突然変異している場合に
は、初期新生生物状態が示される。しかしながら、両方
の対立遺伝子が体細胞突然変異している場合には、後期
新生生物が示される。したがって、BRCA2突然変異の発
見により、診断および予後の双方の情報が提供される。
（例えば、BRCA2欠失を運搬している染色体の姉妹染色
体上に見出されるような）欠失していないBRCA2対立遺
伝子は、挿入、小さな欠失および点突然変異のごとき他
の突然変異についてスクリーニングすることができる。
腫瘍組織中に見出される多くの突然変異はBRCA2遺伝子
産物の発現の低下に通じるものであろうと考えられてい
る。しかしながら、非機能性遺伝子産物に通じる突然変
異も癌状態に通じるであろう。点突然変異事象は、mRNA
の発現の欠損または遺伝子のプロモーター中のごとき調
節領域中に生じ得る。点突然変異は、適切なRNAプロセ
ッシングも廃止し得、これはBRCA2遺伝子産物の発現の
欠損またはmRNA安定性または翻訳効率における低下に通
じる。
有用な診断技術には、限定されるものではないが、後
に詳細に論じるような、蛍光イン・サイチュ（in sit
u）ハイブリダイゼーション（FISH）、直接DNA配列決
定、PFGE分析、サザンブロット分析、一本鎖立体構造分
析（SSCA）、RNエース保護アッセイ、対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチド（ASO）、ドットブロット分析およ
びPCR−SSCPが含まれる。
乳癌および本明細書で同定した他の癌のごとき癌への
素因は、BRCA2遺伝子の突然変異についていずれかのヒ
ト組織を試験することによって確かめることができる。
例えば、生殖系BRCA2突然変異を遺伝しているヒトは癌
を発病しがちであろう。このことは、該ヒトの身体のい
ずれかの組織からのDNAを試験することによって判定す
ることができる。最も単純には、採血し、血液細胞から
DNAを抽出することができる。加えて、胎児期診断は、B
RCA2遺伝子の突然変異について、胎児細胞、胎盤細胞ま
たは羊膜細胞を試験することによって行うことができ
る。例えば、点突然変異によるか欠失によるかにかかわ
らず、野生型BRCA2対立遺伝子の変化は、本明細書中に
て論じるいずれの手段によっても検出することができ
る。
DNA配列変異型を検出するために用いることができる
幾つかの方法が存在する。手動配列決定または自動化蛍
光配列決定のいずれかの直接DNA配列決定は、配列変異
型を検出することができる。BRCA2ほど大きな遺伝子に
ついては、手動配列決定は非常に労働集約的であるが、
最適条件下においては、遺伝子のコーディング配列中の
突然変異をめったに見逃さない。もう１つのアプローチ
は、一本鎖立体構造多形アッセイ（SSCA）である（Orit
aら,1989）。この方法は、特にDNAフラグメントサイズ
が200bpよりも大きな場合には全ての配列変化を検出す
ることはできないが、最適化して大部分のDNA配列変異
型を検出することができる。低下した検出感度は不利で
あるが、SSCAを用いて処理量を増加することができるた
め、魅力的であり、研究ベースにおける突然変異検出の
直接配列決定の別法を実行可能としている。ついで、SS
CAゲル上でシフトした移動度を有するフラグメントを配
列決定して、DNA配列変動の正確な性質を判定する。２
種の相補的DNA鎖間の誤対合の検出に基く他のアプロー
チには、クランプ（clamped）変性ゲル電気泳動（CDG
E）（Sheffieldら,1991）、ヘテロデュプレックス分析
（HA）（Whiteら,1992）および化学的誤対合切断（CM
C）（Grompeら,1989）が包含される。上記した方法では
いずれも大きな欠失、重複または挿入は検出されず、ま
た転写もしくは蛋白質の翻訳に影響する調節突然変異も
検出されないであろう。蛋白質切頭アッセイまたは非対
照アッセイのごときクラスの突然変異を検出できるであ
ろう他の方法は、特定のタイプの突然変異のみしか検出
せず、ミスセンス突然変異は検出されないであろう。DN
A配列変異型を検出する最新の利用可能な方法の概説
は、Grompe（1993）による最近の概説に見出すことがで
きる。突然変異が判明したら、対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチド（ASO）ハイブリダイゼーションのごとき
対立遺伝子特異的な検出アプローチを利用して、その同
一の突然変異について多数の他の試料を迅速にスクリー
ニングすることができる。
組織における野生型BRCA2遺伝子の変化を検出するた
めには、周辺の正常組織を含まない組織を単離すること
が助けとなる。腫瘍細胞の組織調製物を豊富化する方法
は当該技術分野で知られている。例えば、該組織はパラ
フィンまたはクライオスタット切片から単離することが
できる。癌細胞はフローサイトメトリーによっても正常
細胞から分離することができる。これらの技術ならびに
正常細胞から腫瘍細胞を分離する他の技術は当該技術分
野で知られている。腫瘍組織が正常細胞で非常に汚染さ
れている場合には、突然変異の検出はより困難となる。
１または２種以上の制限酵素、好ましくは多種の制限
酵素で切断したDNAの一連のサザンブロットを見ること
により、DNA配列中の多形性を検出する迅速な予備分析
を行うことができる。各ブロットは一連の正常個人およ
び一連の癌ケース、腫瘍、またはその双方を含んでい
る。（BRCA2遺伝子座付近またはそれを含む配列でプロ
ーブ（probe）した場合に対照DNAとは長さが異なる）ハ
イブリダイズしたフラグメントを示すサザンブロット
は、可能性のある突然変異を示している。非常に大きな
制限フラグメントを生成する制限酵素を用いる場合に
は、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いる。
点突然変異の検出は、BRCA2対立遺伝子（群）の分子
クローニングおよび当該技術分野でよく知られている技
術を用いて該対立遺伝子（群）を配列決定することによ
ってなし得る。別法として、該遺伝子配列は、知られて
いる技術を用いて、腫瘍組織からのゲノムDNA調製物か
ら直接増幅することができる。ついで、増幅した配列の
DNA配列を決定することができる。
感受性対立遺伝子の存在を確認するためのより完全で
はあるがなお間接的な試験のための６種のよく知られた
方法が存在する:1）一本鎖形成立体構造分析（SSCA）
（Oritaら,1989）;2）変性グラジエントゲル電気泳動
（DGGE）（Wartellら,1990;Sheffieldら,1989）;3）RN
エース保護アッセイ（Finkelsteinら,1990;Kinszlerら,
1991）;4）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（AS
O）（Connerら,1983）;5）エシェリキア・コリ（E.col
i）mutS蛋白質のごときヌクレオチド誤対合を認識する
蛋白質の使用（Modrich,1991）；および６）対立遺伝子
特異的PCR（RanoおよびKidd,1989）。対立遺伝子特異的
PCRについては、特定のBRCA2突然変異に当該プライマー
の3'末端でハイブリダイズするプライマーを用いる。特
定のBRCA2突然変異が存在しない場合には、増幅産物は
認められない。増幅不応性突然変異系（Amplification
Refractory Mutation System）（ARMS）も、欧州特許
出願公開番号0332435号およびNewtonら,1989に開示され
ているのと同様にして用いることができる。遺伝子の挿
入および欠失は、クローニング、配列決定および増幅に
よっても検出することができる。加えて、遺伝子または
囲むマーカー遺伝子についての制限断片長多形（RFLP）
を用いて、対立遺伝子の変化または多形フラグメント中
の挿入を記録することができる。かかる方法は、影響す
る個人に見出されたBRCA2突然変異の存在についてその
個人の親族をスクリーニングするのに特に有用である。
当該技術分野で知られているごとき挿入および欠失を検
出するための他の技術も用いることができる。
最初の３種の方法（SSCA、DGGEおよびRNエース保護ア
ッセイ）において、新たな電気泳動バンドが現れる。配
列変化が一本鎖の、分子内塩基対形成における相異を生
じるため、SSCAは異なって移動するバンドを検出する。
RNエース保護には、突然変異ポリヌクレオチドの１また
は２以上のより小さなフラグメントへの切断が含まれ
る。DGGEは、変性勾配ゲルを用いて、野生型配列と比較
した突然変異配列の移動速度における相異を検出する。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいて
は、オリゴヌクレオチドは特定の配列を検出するように
設計され、ハイブリダイゼーション・シグナルの存在ま
たは不存在を検出することによってアッセイを行う。mu
tSアッセイにおいては、突然変異と野生型配列との間の
ヘテロデュプレックス中のヌクレオチド誤対合を含む配
列にのみ蛋白質が結合する。
本発明による誤対合とは、その中の２本の鎖が100％
相補的ではないハイブリダイズした核酸デュプレックス
である。合計相同性の欠損は、欠失、挿入、転位または
置換によることがあり得る。誤対合検出を用いて遺伝子
中の、またはそのmRNA生成物中の点突然変異を検出する
ことができる。これらの技術は配列決定よりも感度が低
いが、これらは多数の腫瘍試料で行うにはより単純であ
る。誤対合切断技術の一例はRNエース保護法である。本
発明の実施においては、該方法は、ヒト野生型BRCA2遺
伝子コーディング配列に相補的である標識リボプローブ
の使用が含まれる。該リボプローブと腫瘍組織から単離
されたmRNAまたはDNAのいずれかとを一緒にアニール
（ハイブリダイズ）させ、つづいてデュプレックスRNA
構造中の幾つかの誤対合を検出することができる酵素RN
アシンＡで消化する。RNアシンＡによって誤対合が検出
された場合には、それが誤対合の部位を切断する。した
がって、アニールしたRNA調製物を電気泳動ゲルマトリ
ックス上で分離する場合に、誤対合が検出され、RNアシ
ンＡによって切断されれば、リボプローブおよびmRNAま
たはDNAについての完全長デュプレックスRNAよりもより
小さなRNA生成物が認められるであろう。該リボプロー
ブはBRCA2のmRNAまたは遺伝子の完全長である必要はな
いが、いずれかのセグメントとすることができる。リボ
プローブがBRCA2のmRNAまたは遺伝子のみを含む場合に
は、多数のこれらプローブを用いて誤対合について全mR
NA配列をスクリーニングするのが望ましい。
同様にして、DNAプローブを用いて、酵素的または化
学的切断を介して誤対合を検出することができる。例え
ば、Cottonら,1988;Shenkら,1975;Novackら,1986を参照
されたし。別法として、対合デュプレックスに対する誤
対合形成デュプレックスの電気泳動移動度におけるシフ
トによって誤対合を検出することもできる。例えば、Ca
riello,1988を参照されたし。リボプローブまたはDNAプ
ローブのいずれかを用いれば、ハイブリダイゼーション
の前にPCR（後記を参照されたし）を用いて突然変異を
含み得る細胞mRNAまたはDNAを増幅することができる。
特に変化が欠失および挿入のごとき著しい転位である場
合には、サザンハイブリダイゼーションを用いてもBRCA
2のDNA中の変化を検出することができる。
PCRの使用によって増幅したBRCA2遺伝子のDNA配列
は、対立遺伝子特異的プローブを用いてもスクリーニン
グすることができる。このプローブは核酸オリゴマーで
あって、その各々は、知られている突然変異を載せてい
るBRCA2遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、１つ
のオリゴマーは、BRCA2遺伝子配列の一部分に相当する
約30ヌクレオチド長とすることができる。かかる一群の
対立遺伝子特異的プローブの使用により、PCR増幅産物
をスクリーニングして、BRCA2遺伝子中の以前に同定さ
れた突然変異の存在を同定することができる。対立遺伝
子特異的プローブと増幅したBRCA2配列とのハイブリダ
イゼーションは、例えばナイロンフィルター上で行うこ
とができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下における特定のプローブへのハイブリダイゼー
ションは、対立遺伝子特異的プローブ中の突然変異と同
一の突然変異が腫瘍組織中に存在することを示してい
る。
候補遺伝子座中の突然変異についての最も決定的な試
験は、癌患者からのゲノムBRCA2配列と対照集団からの
ものとを直接比較することである。別法として、例えば
PCRによって増幅した後のメッセンジャーRNAを配列決定
することができ、それによって候補遺伝子のエキソン構
造を決定する必要を省略することができる。
BRCA2のコーディング領域の外側に入る癌患者からの
突然変異は、BRCA2遺伝子付近またはその中にあるイン
トロンまたは調節領域のごとき非コーディング領域を検
査することによって検出することができる。非コーディ
ング領域中の突然変異が重要であるという早期の示唆
は、対照個人に比しての癌患者における異常なサイズま
たは豊富性のメッセンジャーRNA分子を出現させるノザ
ンブロット実験から生じ得る。
BRCA2のmRNA発現の変化は、当該技術分野で知られて
いるいずれかの技術によって検出することができる。こ
れらには、ノザンブロット分析、PCR増幅およびRNエー
ス保護が包含される。低下したmRNA発現は、野生型BRCA
2遺伝子の変化を示している。野生型BRCA2の変化は、野
生型BRCA2蛋白質の変化についてのスクリーニングによ
っても検出することができる。例えば、BRCA2と免疫反
応性であるモノクローナル抗体を用いて組織をスクリー
ニングすることができる。同族抗原の欠如はBRCA2突然
変異を示しているであろう。突然変異対立遺伝子の産物
に対して特異的な抗体を用いても、突然変異BRCA2遺伝
子産物を検出することができる。かかる免疫学的アッセ
イは、当該技術分野で知られているいずれの簡便な様式
でも行うことができる。これらには、ウエスタンブロッ
ト、免疫組織化学的アッセイ、およびELISAアッセイが
包含される。変化したBRCA2蛋白質を検出するためのい
ずれの手段を用いても、野生型BRCA2遺伝子の変化を検
出することができる。蛋白質結合性決定のごとき機能ア
ッセイを用いることができる。加えて、BRCA2生化学的
機能を検出するアッセイを用いることができる。突然変
異BRCA2遺伝子産物が見出されることは、野生型BRCA2遺
伝子の変化を示している。
突然変異BRCA2の遺伝子または遺伝子産物は、血清、
便、尿および唾液のごとき他のヒト身体試料中において
も検出することができる。突然変異BRCA2の遺伝子また
は遺伝子産物の検出について前記に論じたのと同一の技
術は、他の身体試料に適用することができる。癌細胞は
腫瘍から剥がれ落ち、かかる身体試料中に現れる。加え
て、BRCA2遺伝子産物自体は細胞外空間に分泌され得、
癌細胞が存在しない場合でさえこれらの身体試料中に見
出され得る。かかる身体試料をスクリーニングすること
によって、多くのタイプの癌について単純な早期診断を
達成することができる。加えて、突然変異BRCA2の遺伝
子または遺伝子産物についてかかる身体試料を試験する
ことによって、化学療法または放射線療法の進行をより
簡便にモニターすることができる。
本発明の診断方法は、その中でBRCA2が腫瘍発生に役
割を有するいずれの腫瘍にも適用することができる。本
発明の診断方法は、臨床医が治療の適当な工程を決定で
きるため彼らに有用である。
本発明のプライマーの対は、PCRを用いた特定のBRCA2
対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。一
本鎖DNAプライマーの対は、BRCA2遺伝子自体の増幅する
DNA合成をプライムさせるために、第13染色体上のBRCA2
遺伝子の中またはその周辺の配列にアニーリングさせる
ことができる。これらの完全セットのプライマーによ
り、BRCA2遺伝子コーディング配列の全ヌクレオチド、
すなわちエキソンの合成が可能となる。一連のプライマ
ーにより、好ましくは、イントロンおよびエキソン配列
の双方の合成が可能となる。対立遺伝子特異的プライマ
ーも用いることができる。かかるプライマーは特定のBR
CA2突然変異対立遺伝子にのみアニールし、したがっ
て、鋳型としての突然変異対立遺伝子存在下においての
み産物を増幅するであろう。
増幅した配列のつづくクローニングを促進するため
に、プライマーは、その5'末端に付加された制限酵素部
位配列を有していてもよい。かくして、プライマーの全
ヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するために必要な
幾つかのヌクレオチドを除き、BRCA2配列またはBRCA2に
近接する配列由来である。かかる酵素および部位は当該
技術分野でよく知られている。プライマー自体は、当該
技術分野でよく知られている技術を用いて合成すること
ができる。一般的に、市販されているオリゴヌクレオチ
ド合成器を用いてプライマーを作製することができる。
配列番号:1および図３に示すBRCA2オープンリーディン
グフレームの配列、特定のプライマーの設計は、以下に
開示するものに加えて、当業者の能力の十分に範囲内で
ある。
本発明により提供される核酸プローブは、多種の目的
に有用である。それは、前記にすでに論じた点突然変異
を検出するためのゲノムDNAに対するサザン・ハイブリ
ダイゼーションおよびRNエース保護法に用いることがで
きる。このプローブを用いてPCR増幅産物を検出するこ
とができる。それは他の技術と共に用いて、BRCA2遺伝
子またはmRNAの誤対合を検出することもできる。
野生型BRCA2遺伝子を有する個人はBRCA2対立遺伝子か
ら生じる癌を有していないことが発見された。しかしな
がら、BRCA2蛋白質の機能を妨害する突然変異は癌の病
理に関与する。したがって、機能を欠損したか、または
変化した機能を有する蛋白質を産生する変化した（また
は突然変異した）BRCA2遺伝子の存在は、癌の危険性の
増大と直接的に相関する。BRCA2遺伝子突然変異を検出
するために、生物試料を調製し、分析するBRCA2対立遺
伝子の配列と野生型BRCA2対立遺伝子の配列との間の相
異について分析する。突然変異BRCA2対立遺伝子は、前
記したいずれの技術によっても最初に同定することがで
きる。ついで、突然変異対立遺伝子を配列決定して、特
定の突然変異対立遺伝子の特異的突然変異を同定する。
別法として、突然変異BRCA2対立遺伝子は、慣用技術を
用いて、突然変異（変化した）BRCA2蛋白質を同定する
ことによって最初に同定することができる。ついで、突
然変異対立遺伝子を配列決定して各対立遺伝子について
の特異的突然変異を同定する。ついで、突然変異、特に
変化した機能のBRCA2蛋白質に通じる突然変異を、本発
明の診断および予後方法に用いる。
定義 本発明は以下の定義を用いる： 「ポリヌクレオチドの増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）、連結増幅（またはリガーゼ連鎖反応、LCR）
およびＱβレプリカーゼの使用に基く増幅方法のごとき
方法を用いる。これらの方法はよく知られており、当該
分野において広く実施されている。例えば、米国特許第
4,683,195号および第4,683,202号ならびに（PCRについ
ては）Innisら,1990;ならびに（LCRについては）Wuら,1
989aを参照されたし。PCRを行うための試薬およびハー
ドウエアは市販されている。BRCA2領域からの配列を増
幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、BRCA2領
域中の配列またはその中の標的領域を挟む領域中の配列
に相補的であってそれに特異的にハイブリダイズする。
増幅によって作製したBRCA2配列は直接的に配列決定す
ることができる。別法として、あまり望ましくはない
が、増幅した配列（群）は配列分析する前にクローン化
することもできる。酵素増幅したゲノムセグメントの直
接クローニングおよび配列分析の方法は、Scharf,1986
によって記載されている。
「被検体ポリヌクレオチド」および「被検体鎖」と
は、標的配列を含むと予想される一本鎖または二本鎖ポ
リヌクレオチドをいい、それは生物試料を含む種々のタ
イプの試料中に存在し得る。
「抗体」 本発明は、BRCA2ポリペプチドおよびそのフ
ラグメント、あるいはBRCA2領域、特にBRCA2遺伝子座ま
たはその一部分からのポリヌクレオチド配列に特異的に
結合することができる、ポリクローナルおよび／または
モノクローナル抗体およびそれらのフラグメント、なら
びにそれらの免疫結合性の相当物も提供する。「抗体」
なる語は、均一な分子、または複数の異なる分子より構
成される血清産物のごとき混合物の双方をいうのに用い
る。ポリペプチドはペプチド合成器中で合成的に調製
し、（例えば、鍵穴吸着性ヘモシアニンのような）キャ
リアー蛋白質に結合させ、数ヶ月にわたってウサギに注
射することができる。BRCA2ポリペプチドまたはフラグ
メントに対する免疫反応性について、ウサギ血清を試験
する。モノクローナル抗体は、マウスに蛋白質ポリペプ
チド、融合蛋白質またはそれらのフラグメントを注射す
ることによって生成することができる。モノクローナル
抗体はELISAによってスクリーニングし、BRCA2ポリペプ
チドまたはそのフラグメントとの特異的免疫反応性につ
いて試験する。HarlowおよびLane,1988を参照された
し。これらの抗体は、アッセイならびに医薬に有用であ
ろう。
十分な量の目的のポリペプチドを得たら、種々の目的
にそれを用いることができる。典型的な用途は、結合性
につき特異的な抗体の生成である。これらの抗体は、ポ
リクローナルまたはモノクローナルのいずれであっても
よく、当該技術分野でよく知られているイン・ビトロ
（in vitro）またはイン・ビボ（in vivo）の技術に
よって生成することができる。ポリクローナル抗体の生
成については、適当な標的免疫系、典型的にはマウスま
たはウサギを選抜する。実質的に精製された抗原を、そ
の動物について適当な方法によるか、または免疫学者に
よく知られている他のパラメーターによって決定した様
式で免疫系に提示する。注射の適当な部位は、フットパ
ッド、筋肉内、腹膜内、または皮内である。勿論、他の
種をマウスおよびウサギに代用することができる。つい
で、目的の特異性に調整した当該技術分野で知られてい
る技術を用いてポリクローナル抗体を精製する。
免疫学的応答性は、通常、イムノアッセイでアッセイ
する。通常、かかるイムノアッセイには、抗原の供給
源、例えば、抗原と同一の細胞により同一の様式で生成
した抗原の供給源の幾分かの精製が含まれる。種々のイ
ムノアッセイ法が当該技術分野でよく知られている。例
えば、HarlowおよびLane,1988またはGoding,1986を参照
されたし。
10-8M-1または好ましくは10-9〜10-10M-1またはより
強力な親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的に
は、例えばHarlowおよびLane,1988またはGoding,1986に
記載されている標準的な手法によって生成されるであろ
う。簡単には、適当な動物を選抜し、目的の免疫化プロ
トコールに準じる。適当な時間の後に、かかる動物の脾
臓を切除し、適当な選抜条件下にて、固定化ミエローマ
細胞に個々の脾臓細胞を融合させる。その後、細胞をク
ローン的に分離し、各クローンの上清を、抗原の目的領
域に特異的な適当な抗体のその産生について試験する。
他の適当な技術には、抗原性ポリペプチドに対する、
または別法として、ファージまたは同様のベクター中の
抗体のライブラリーの選抜に対するリンパ球のイン・ビ
トロでの曝露が含まれる。Huseら,1989を参照された
し。本発明のポリペプチドペプチドまたは抗体は、修飾
してか、または修飾なしに用いることができる。しばし
ば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを
供する物質に共有的かまたは非共有的かのいずれかで連
結させることによって標識されよう。広範な種々の標識
およびコンジュゲート技術が知られており、科学および
特許文献の双方において広く報告されている。適当な標
識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビタ
ー、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などが含まれる。か
かる標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,
837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345
号；第4,277,437号，第4,275,149号および第4,366,241
号が包含される。また、組換え免疫グロブリンを作製す
ることもできる（米国特許第4,816,567号を参照された
し）。
「結合パートナー」とは、例えば抗原と抗原特異的抗
体または酵素とそのインヒビターのごとき、高い特異性
でリガンド分子に結合することができる分子をいう。一
般的に、該特異的結合パートナーは、単離条件下にて、
十分な親和性で結合して、（ポリヌクレオチド・ハイブ
リダイゼーションの場合においては）被検体コピー／相
補鎖デュプレックスを固定化しなければならない。特異
的結合パートナーは当該技術分野で知られており、例え
ば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジ
ン、IgGおよび蛋白質Ａ、膨大な、知られている受容体
−リガンド・カップル、ならびに相補的ポリヌクレオチ
ド鎖が含まれる。相補的なポリヌクレオチド結合パート
ナーの場合には、該パートナーは通常少なくとも約15塩
基長であり、少なくとも40塩基長とすることができる。
該ポリヌクレオチドは、DNA、RNAまたは合成ヌクレオチ
ド・アナログよりなっていてもよい。
「生物試料」とは、個人からの被検体ポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを含有すると予想される組織また
は流体の試料をいい、限定されるものではないが、例え
ば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼
吸、腸、および尿生殖器管、涙、唾液、血液細胞、腫
瘍、器官、組織、ならびにイン・ビトロ細胞培養構成物
の試料が包含される。
本明細書中で用い、新生生物の文脈で用いる「診断す
る」または「予後する」なる語は、１）新生生物として
の病変の分類、２）新生生物の重度の判定、または３）
治療の前、間および後の疾病進行のモニターを示すため
に用いる。
「コードする」 ポリヌクレオチドは、その天然状態ま
たは当業者によく知られている方法によって操作した場
合にはポリペプチドを「コードする」といい、それは転
写および／または翻訳されて、mRNAおよび／もしくはポ
リペプチドまたはそのフラグメントを生成し得る。アン
チセンス鎖はかかる核酸の相補体であり、コードする配
列はそれから推定することができる。
「単離（した）」または「実質的に純粋な」 「単離
（した）」または「実質的に純粋な」核酸（例えば、RN
A、DNA、または混合ポリマー）とは、天然のヒト配列ま
たは蛋白質、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多く
の他のヒトのゲノム配列および蛋白質を自然に付随する
他の細胞コンポーネントから実質的に分離されているも
のである。該用語は、その自然発生環境から取り出され
た核酸配列または蛋白質を包含し、組換えまたはクロー
ン化DNA単離体および化学合成アナログ、ならびに外来
系によって生物的に合成したアナログが包含される。
「BRCA2対立遺伝子」とは、BRCA2遺伝子座の正常対立
遺伝子、ならびに、例えば乳、卵巣および胃癌を含む多
くの部位に癌を発病させる素因を個人につくる変異型を
運搬している対立遺伝子をいう。かかる素因対立遺伝子
は「BRCA2感受性対立遺伝子」とも称する。
「BRCA2遺伝子座」、「BRCA2遺伝子」、「BRCA2核
酸」または「BRCA2ポリヌクレオチド」とは、各々、そ
の全てがBRCA2領域中に存在するポリヌクレオチドをい
い、それらは正常組織中で発現しているようであり、そ
のうちのある種の対立遺伝子が個人に乳、卵巣および胃
癌を発病させる素因をつくる。BRCA2遺伝子座における
突然変異は、他のタイプの腫瘍のイニシエーションおよ
び／またはプログレッションに関与し得る。該遺伝子座
は、一部分、個人に癌を発病させる素因をつくる突然変
異によって示される。これらの突然変異は、下記のBRCA
2領域内に入る。BRCA2遺伝子座には、コーディング配
列、介在配列、ならびに転写および／または翻訳を制御
する調節エレメントが含まれることを意図する。BRCA2
遺伝子座には、DNA配列の全ての対立遺伝子変異型が含
まれることを意図する。
核酸に適用する場合のこれらの用語は、例えば、蛋白
質の融合および欠失を含む、BRCA2ポリペプチド、フラ
グメント、相同形または変異型をコードする核酸をい
う。本発明の核酸は、天然BRCA2をコードする遺伝子ま
たは該天然BRCA2をコードする遺伝子もしくはその一部
分と実質的な相同性を有する遺伝子由来であるか、また
はそれらに実質的に類似するかのいずれかである配列を
有するであろう。BRCA2ポリペプチドのコーディング配
列を、配列番号:2に示すアミノ酸配列と一緒に配列番
号:1および図３に示す。
本発明のポリヌクレオチド組成物には、センスおよび
アンチセンス鎖の双方の、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成
形態、および混合ポリマーが包含され、当業者によって
容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾
されていてもよく、または非天然または誘導化ヌクレオ
チド塩基を含んでいてもよい。かかる修飾には、例え
ば、標識、メチル化、アナログでの天然発生ヌクレオチ
ドの１または２箇所以上の置換、非荷電結合（例えば、
メチル ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホア
ミデート、カルバメート他）、荷電結合（例えば、ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエート他）、ペンダン
ト基（例えば、ポリペプチドペプチド他）、インターカ
レーター（例えば、アクリジン、プソラレン他）、キレ
ート剤、アルキル剤、および修飾結合（例えば、αアノ
マー核酸他）のごときヌクレオチド間修飾が包含され
る。また、その能力で、水素結合および他の化学的相互
作用を介して示す配列に結合するポリヌクレオチドをミ
メティクスする合成分子も包含される。かかる分子は当
該技術分野で知られており、例えば、分子骨格中のリン
酸結合がペプチド結合に置換えられたものが包含され
る。
本発明は、BRCA2領域の全体または一部分を含む組換
え核酸を提供する。該組換え構築物は、宿主細胞中で自
律的に複製することができる。その起源または操作によ
る、ゲノム、cDNA、半合成または合成起源のポリヌクレ
オチドを含むかかる組換えポリヌクレオチドは、１）天
然でそれと会合するポリヌクレオチドの全体または一部
分と会合せず;2）天然でそれが結合するもの以外のポリ
ヌクレオチドに結合し；または３）天然で発生しない。
したがって、天然に発生しない他の配列を含む組換え
核酸が本発明により提供される。野生型配列を用いるこ
ともできるが、それはしばしば、例えば欠失、置換また
は挿入によって変化しているであろう。
種々のタイプのcDNAまたはゲノムのライブラリーを、
本発明の核酸の天然供給源としてスクリーニングするこ
とができ、あるいは、かかる核酸は、例えばPCRによる
ゲノムDNAまたは他の天然供給源中に存在する配列の増
幅によって得ることができる。cDNAライブラリーの選択
は、通常、目的の蛋白質のmRNAが豊富である組織供給源
に対応する。ファージライブラリーが通常好ましいが、
他のタイプのライブラリーを用いることもできる。ライ
ブラリーのクローンをプレート上に広げ、スクリーニン
グ用の基質に移し、変性させ、目的の配列の存在につい
てプローブする。
本発明で用いるDNA配列は、通常、少なくとも約５コ
ドン（15ヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７
−15コドン、最も好ましくは少なくとも約35コドンを含
むであろう。１または２以上のイントロンも存在してい
てもよい。この数のヌクレオチドが、通常ほぼ、BRCA2
をコードしている配列と特異的にハイブリダイズする首
尾よいプローブに要求される最小の長さである。
核酸操作の技術は、例えばSambrookら,1989またはAus
belら,1992に一般的に記載されている。制限酵素などの
ごときかかる技術を適用するのに有用な試薬は、当該技
術分野で広く知られており、New England BioLabs社、B
oehringer Mannheim社、Amersham社、Promega Biotec
社、U.S.Biochemicals社、New England Nuclear社なら
びに他の多数の供給源のごとき販売業者から市販されて
いる。本発明の融合蛋白質を生成するのに用いる組換え
核酸配列は、天然または合成配列由来とし得る。多種の
天然遺伝子配列が、適当なプローブを用いて種々のcDNA
またはゲノムライブラリーから得ることができる。GenB
ank,National Institute of Healthを参照された
し。
「BRCA2領域」とは、マーカーtdj3820およびYS−Ｇ−
B10Tによって画定されるヒト第13染色体の部分をいう。
この領域には、BRCA2遺伝子を含むBRCA2遺伝子座が含ま
れる。
本明細書中にて用いる「BRCA2遺伝子座」、「BRCA2対
立遺伝子」および「BRCA2領域」なる語は、全ての該遺
伝子座、対立遺伝子または領域を含む二本鎖DNA、なら
びに該遺伝子座、対立遺伝子または領域を含む一本鎖DN
Aのいずれかをいう。
本明細書中にて用いるBRCA2遺伝子座または領域また
は対立遺伝子の「部分」は、少なくとも約８ヌクレオチ
ド、または好ましくは約15ヌクレオチド、またはより好
ましくは少なくとも約25ヌクレオチドの最小サイズを有
すると定義され、少なくとも約40ヌクレオチドの最小サ
イズを有し得る。
「BRCA2蛋白質」または「BRCA2ポリペプチド」とは、
BRCA2遺伝子座、その変異型またはフラグメントによっ
てコードされる蛋白質またはポリペプチドをいう。「ポ
リペプチド」なる語はアミノ酸およびその相当物のポリ
マーをいい、特定の長さの生成物をいうものではなく；
したがって、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および蛋
白質がポリペプチドの定義の中に含まれる。また、この
語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化な
どのようなポリペプチドの修飾をいうものではなく、ま
たはそれらを除く。該定義に含まれるのは、例えば、天
然または非天然の双方の、（例えば、非天然アミノ酸他
を含む）１または２以上のアミノ酸のアナログ、置換結
合を有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で知ら
れている他の修飾物である。通常、かかるポリペプチド
は、天然BRCA2配列に対して少なくとも約50％相同性で
あり、好ましくは約90％以上、より好ましくは少なくと
も約95％相同性である。また、含まれるのは、高または
低ストリンジェンシー条件下にてBRCA2をコードする核
酸にハイブリダイズするDNAによってコードされている
蛋白質、およびBRCA2蛋白質（群）に対する抗血清によ
って回収される緊密に関係するポリペプチドまたは蛋白
質である。
相同性につき比較されるポリペプチド配列の長さは、
一般的に少なくとも約16アミノ酸、通常少なくとも約20
残基、より通常には少なくとも約24残基、典型的には少
なくとも約28残基、好ましくは約35残基を超えるであろ
う。
「作動可能に結合した」とは、前記したコンポーネン
トがその意図した様式で機能し得る関係にある近位（ju
xtaposition）をいう。例えば、プロモーターがその転
写または発現に影響する場合には、該プロモーターはコ
ーディング配列に作動可能に結合されている。
「プローブ」 ある種の癌への素因を有するか、または
大部分の癌と関連するBRCA2対立遺伝子と関連するポリ
ヌクレオチド多形性は、ストリンジェントないし適度に
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄
条件下にて、標的配列のものと安定なハイブリッドを形
成するポリヌクレオチド・プローブとのハイブリダイゼ
ーションによって検出される。該プローブが標的配列に
完全に相補的であろうと予想される場合には、ストリン
ジェントな条件が用いられるであろう。幾つかの誤対合
が予想される場合、例えば、プローブは完全に相補的で
はないであろうという変異型が予想される場合には、ハ
イブリダイゼーション・ストリンジェンシーを低下し得
る。条件は、非特異的／偶然の結合が除外される、すな
わち、ノイズを最小限にするように選択する。かかる指
標は中性（neutral）のDNA多形性ならびに突然変異を同
定するため、これらの指標はBRCA2感受性対立遺伝子の
検出を立証するためにはさらなる分析を要する。
BRCA2対立遺伝子のプローブはBRCA2領域またはそのcD
NAの配列由来とすることができる。該プローブは、BRCA
2領域の全体または一部分に広がり、BRCA2領域への特異
的なハイブリダイゼーションを許容するいずれの適当な
長さであってもよい。標的配列がプローブの配列と同一
の配列を含む場合には、該プローブは、例えば約８−30
塩基対の範囲のような短いものであってもよい。なぜな
らば、ストリンジェントな条件下でさえそのハイブリッ
ドは比較的安定であろうからである。該プローブとのあ
る程度の誤対合が予想される場合、すなわち、プローブ
が変異型領域にハイブリダイズするであろうと予想され
る場合には、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズ
するより長いプローブを用いることができる。
該プローブには、標識またはレポーター分子に結合し
た単離ポリヌクレオチドが含まれ、標準的な方法によっ
て配列類似を有する他のポリヌクレオチド配列を単離す
るために用い得る。プローブを調製し標識する技術につ
いては、Sambrookら,1989またはAusubelら,1992を参照
されたし。他の類似するポリヌクレオチドは、相同性ポ
リヌクレオチドを用いることによって選抜することがで
きる。別法として、これらのまたは類似するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝コード中の余
分の使用によって合成または選抜することができる。例
えば、（それによって種々の制限部位が作製される）サ
イレント変化によってか、または特定の系の発現を最適
化するために、種々のコドン置換を導入することができ
る。突然変異を導入してポリペプチドの特性を改善し、
恐らく、リガンド−結合親和性、鎖間親和性、またはポ
リペプチドの分解もしくは代謝速度を改善させることが
できる。
本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌク
レオチドを含むプローブは、天然発生、または組換え一
本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド由来とすることが
でき、あるいは化学合成することができる。プローブは
ニックトランスレーション、クレノー・フィルイン反応
（Klenow fill−in reaction）または当該技術分野で
知られている他の方法によって標識することもできる。
少なくとも約８ヌクレオチドを有するポリヌクレオチ
ド配列の部分は、通常、少なくとも約15ヌクレオチドで
あって、BRCA2をコードしているポリヌクレオチド配列
よりも約6kb小さい、通常約1.0kb小さいものがプローブ
として好ましい。該プローブを用いてBRCA2をコードす
るmRNAが細胞または組織中に存在するか否かを判定する
こともできる。
「蛋白質修飾物またはフラグメント」は、一次構造配
列に実質的に相同的であるBRCA2ポリペプチドまたはそ
のフラグメントが本発明により提供されるが、例えば、
イン・ビボまたはイン・ビトロの化学的および生化学的
な修飾物または異常なアミノ酸を取込んだものが包含さ
れる。かかる修飾には、例えば、当業者に容易に理解さ
れるであろう、アセチル化、カルボキシル化、リン酸
化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種で
の標識および種々の酵素的修飾が包含される。ポリペプ
チドを標識する種々の方法、およびかかる目的に有用な
種々の置換または標識は当該技術分野でよく知られてお
り、32Pのごとき放射性同位元素、標識化抗リガンド
（例えば抗体）、蛍光団、化学発光剤、酵素に結合する
リガンド、ならびに標識化リガンドに対する特異的結合
対のメンバーとして作用し得る抗リガンドが包含され
る。標識の選択は要する感度、プライマーとの結合性の
簡便性、安定性要件、および入手可能な機器に依存す
る。ポリペプチドの標識方法は、当該技術分野でよく知
られている。Sambrookら,1989またはAusubelら,1992を
参照されたし。
実質的に完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、
該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントも提供
する。重要な生物活性には、リガンド結合性、免疫活性
およびBRCA2ポリペプチドに特有の他の生物活性が包含
される。免疫活性には、標的免疫系における免疫機能、
ならびにBRCA2蛋白質のエピトープに対する競合物また
は代替抗原のいずれかとして作用する、結合性に関する
免疫学的エピトープを有することの双方が含まれる。本
明細書中にて用いる「エピトープ」とは、ポリペプチド
の抗原決定基をいう。エピトープは、当該エピトープに
ユニークである螺旋立体構造中に３個のアミノ酸を含む
ことができた。一般的に、エピトープは少なくとも５個
のかかるアミノ酸、より通常には少なくとも８−10個の
かかるアミノ酸よりなる。かかるアミノ酸の螺旋立体構
造を決定する方法は当該技術分野で知られている。
免疫学的な目的には、縦列反復ポリペプチドセグメン
トを免疫原として用いることができ、それによって非常
に抗原性の高い蛋白質が生成される。別法として、かか
るポリペプチドは特異的結合性についての非常に有効な
競合物質として作用するであろう。BRCA2ポリペプチド
またはそのフラグメントに対して特異的な抗体の生成を
以下に記載する。
本発明は、BRCA2ポリペプチドおよびフラグメントを
含む融合ポリペプチドも提供する。相同ポリペプチド
は、２または３以上のBRCA2ポリペプチド配列の間、ま
たはBRCA2の配列と関連する蛋白質との間で融合するこ
とができる。同様にして、誘導蛋白質の特性または活性
の組合せを示すであろう、異種融合物を構築することが
できる。例えば、リガンド−結合性または他のドメイン
を異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの
間で「交換する」ことができる。かかる相同または異種
融合ポリペプチドは、例えば、変化した強さまたは結合
性の特異性を示し得る。融合パートナーには、免疫グロ
ブリン、細菌のβ−ガラクトシダーゼ、trpE、蛋白質
Ａ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ、および酵母のα接合因子が包含され
る。例えば、Godowskiら,1988を参照されたし。
融合蛋白質は、典型的には、以下に記載するごとき組
換え核酸法のいずれかによって作製するか、または化学
合成することができる。ポリペプチドを合成する技術
は、例えば、Merrifield,1963に記載されている。
「蛋白質精製」とは、BRCA2をコードする組換え核酸
で形質転換した細胞からのごとき、他の生物の試料から
BRCA2ポリペプチドを単離するための種々の方法をい
い、これらは当該技術分野でよく知られている。例え
ば、かかるポリペプチドは、例えば本発明によって提供
される抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製することができる。蛋白質精製の種々
の方法が当該技術分野でよく知られており、それらには
Deutscher,1990およびScopes,1982に記載されているも
のが包含される。
「単離（した）」、「実質的に純粋な」および「実質
的に均一な」なる語は、互換的に用いて、その天然状態
において蛋白質またはポリペプチドを伴うコンポーネン
トから分離された該蛋白質またはポリペプチドを説明す
る。単量体蛋白質は、試料の少なくとも60〜75％が単一
のポリペプチド配列を示す場合には実質的に純粋であ
る。実質的に純粋な蛋白質は、典型的には、約60〜90％
w/wの、より通常には約95％の、好ましくは約99％純粋
を超える蛋白質試料を含むであろう。蛋白質の純度また
は均一性は、蛋白質試料のポリアクリルアミドゲル電気
泳動につづく該ゲル染色における単一ポリペプチドバン
ドの視覚化のごとき当該技術分野でよく知られている多
種の手段によって示し得る。ある種の目的には、HPLCま
たは精製に利用される当該技術分野でよく知られている
他の手段を用いることによってより高い分離度を提供し
得る。
BRCA2蛋白質は、その天然状態においてそれを伴う天
然狭雑物から分離された場合には自然に関連するコンポ
ーネントを実質的に含まない。かくして、化学合成され
たか、またはまたは天然起源とする細胞とは異なる細胞
系で合成されたポリペプチドは、その天然に関連するコ
ンポーネントを実質的に含まないであろう。蛋白質は、
当該技術分野でよく知られている蛋白質精製技術を用い
た単離によって、天然に関連するコンポーネントを実質
的に含まないようにすることができる。
単離または操作した遺伝子配列の発現産物として産生
されたポリペプチドは、同種細胞型で発現された場合で
さえ、本明細書中で用いる「単離ポリペプチド」であ
る。合成生成形態または異種細胞によって発現された分
子は、固有に単離される分子である。
「組換え核酸」とは、天然に発生しない核酸であり、
あるいは、単離された配列の分離セグメント他の２種の
人工的な組合せによって作製される核酸である。この人
工的な組合せは、しばしば、化学合成手段、または核酸
の単離セグメントの人工的な操作、例えば遺伝子操作技
術、のいずれかによって行なわれる。通常かかる操作を
行って、典型的には配列認識部位を導入するかまたは除
去しつつ、同一または保存的なアミノ酸をコードする余
分なコドンでコドンを置換える。別法として、それを行
って、目的の機能の核酸セグメントを共に連結して目的
の機能の組合せを生成する。
「調節配列」とは、（遺伝子の転写、メッセンジャー
RNAの翻訳、スプライシング、安定性などを包含する）
遺伝子の発現に影響する、遺伝子座のコーディング領域
の通常は100kb以内の配列をいうが、それはコーディン
グ領域からより離れていてもよい。
「実質的な相同性または類似性」 他の核酸（またはそ
の相補鎖）と（適当なヌクレオチド挿入または欠失で）
最適に整列させた場合に、少なくとも約60％のヌクレオ
チド塩基で、通常には少なくとも約70％の、より通常に
は少なくとも約80％の、好ましくは少なくとも約90％、
より好ましくは少なくとも約95−98％のヌクレオチド塩
基でヌクレオチド配列同一性が存在する場合には、もう
１種のものに対してその核酸またはフラグメントは「実
質的に相同的」（または実質的に類似する）である。
別法として、核酸またはそのフラグメントが、選択的
ハイブリダイゼーション条件下にてもう１種の核酸（ま
たはその相補鎖）に、鎖に、またはその相補体にハイブ
リダイズするであろう場合には、実質的な相同性または
（類似性）が存在する。特異性の合計不足よりも実質的
により選択的であるハイブリダイゼーションが生じる場
合には、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。
典型的には、少なくとも約14ヌクレオチドのストレッチ
にわたって、少なくとも約55％の、好ましくは少なくと
も約65％の、より好ましくは少なくとも約75％、最も好
ましくは少なくとも約90％の相同性が存在する場合に
は、選択的なハイブリダイゼーションが生じるであろ
う。Kanehisa,1984を参照されたし。記載したごとく、
相同物の長さの比較は、より長いストレッチにわたるも
のとすることができ、ある種の具体例においては、しば
しば、少なくとも約９ヌクレオチドの、通常には少なく
とも約20ヌクレオチドの、より通常には少なくとも24ヌ
クレオチドの、典型的には少なくとも約28ヌクレオチド
の、より典型的には少なくとも約32ヌクレオチドの、好
ましくは少なくとも約36の、またはそれを超えるヌクレ
オチドのストレッチにわたるであろう。
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に簡単に理解
されようごとく、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイ
ブリダイズしている核酸の間のヌクレオチド塩基誤対合
の数に加えて、塩濃度、温度、または有機溶媒のごとき
条件によって影響されるであろう。ストリンジェントな
温度条件には、一般的に、30℃を超える、典型的には37
℃を超える、好ましくは45℃を超える温度が包含される
であろう。ストリンジェントな塩条件は、通常、1000mM
未満、典型的には500mM未満、好ましくは200mM未満であ
ろう。しかしながら、パラメーターの組合わせは、いず
れの単一パラメーターの測定値よりも遥かに重要であ
る。例えば、WetmurおよびDavidson,1968を参照された
し。
プローブ配列も、ある種の条件下にてデュプレックス
DNAに特異的にハイブリダイズして、トリプレックスま
たは他のより高次元のDNA複合体を形成し得る。かかる
プローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条
件は当該技術分野でよく知られている。
「実質的な相同性」または「実質的な同一性」なる語
は、ペプチドについていう場合には、問題のポリペプチ
ドまたは蛋白質が天然に発生する蛋白質またはその部分
と、少なくとも約30％の同一性、通常には少なくとも約
70％の同一性、好ましくは少なくとも約95％の同一性を
示すことを示す。
「実質的に類似する機能」とは、野生型BRCA2核酸ま
たは野生型BRCA2ポリペプチドに参照して、修飾された
核酸または修飾された蛋白質の機能をいう。修飾ポリペ
プチドは、野生型BRCA2ポリペプチドに対して実質的に
相同性であって、実質的に同一の機能を有するであろ
う。修飾ポリペプチドは変化したアミノ酸配列を有し
得、および／または修飾アミノ酸を含み得る。機能の類
似性に加えて、修飾ポリペプチドは、より長い半減期の
ごとき他の有用な特性を有し得る。修飾ポリペプチドの
機能（活性）の類似性は、野生型BRCA2ポリペプチドの
活性と実質的に同一とし得る。別法として、修飾ポリペ
プチドの機能（活性）の類似性は、野生型BRCA2ポリペ
プチドの活性よりもより高くし得る。該修飾ポリペプチ
ドは、慣用技術を用いて合成され、あるいは修飾核酸に
よってコードされ、慣用技術を用いて生成する。該修飾
核酸は、慣用技術によって調製される。野生型BRCA2遺
伝子機能に実質的に類似する機能を有する核酸は、前記
した修飾蛋白質を生成する。
ポリペプチドに関する相同性は、典型的には配列分析
ソフトウエアを用いて測定する。例えば、“the Sequen
ce Analysis Software Package of the Genetics Compu
ter Group",University of Wisconsin Biotechnology C
enter,910 University Avenue,Madison,Wisconsin,5370
5を参照されたし。蛋白質分析ソフトウエアは、種々の
置換、欠失、および他の修飾に指定された相同性の測定
を用いて類似する配列を対合させる。同類置換には、典
型的には、以下の群内の置換が包含される：グリシン、
アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラ
ギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セ
リン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニ
ルアラニン、チロシン。
ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」または
「セグメント」とは、少なくとも約５〜７個の隣接する
アミノ酸の、しばしば少なくとも約７〜９個の隣接する
アミノ酸の、典型的には少なくとも約９〜13個の隣接す
るアミノ酸の、最も好ましくは少なくとも約20〜30個
の、またはそれを超える隣接するアミノ酸のストレッチ
またはアミノ酸残基である。
本発明のポリペプチドは、可溶性の場合には、例え
ば、ニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材（例え
ば、Sepharoseビーズ）、磁性ビーズ、ガラスウール、
プラスチック、金属もしくはポリマーゲル、細胞または
他の基体のような固体相支持体にカップリングさせるこ
とができる。かかる支持体は、例えば、ビーズ、ウェ
ル、計量棒またはメンブレンのような形態を採り得る。
「標的領域」とは、増幅および／または検出する核酸
の領域をいう。「標的配列」なる語は、所望の条件下に
てそれとプローブまたはプライマーとが安定なハイブリ
ッドを形成するであろう配列をいう。
本発明の実施は、別段示されない限り、化学、分子生
物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学および免疫学の慣
用技術を用いる。例えば、Maniatisら,1982;Sambrook
ら,1989;Ausubelら,1992;Glover,1985;Anand,1992;Guth
rieおよびFink,1991を参照されたし。ヒト第13染色体の
地図作成を含むヒト遺伝子地図作成に関する技術および
材料の一般的議論は、例えば、WhiteおよびLalouel,198
8に記載されている。
組換えまたは化学合成核酸の調製；ベクター、形質転
換、宿主細胞 本発明の多量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞
中における複製によって産生することができる。目的の
フラグメントをコードしている天然または合成ポリヌク
レオチドフラグメントは、原核生物または真核生物の細
胞中に導入し、複製させることができる、組換えポリヌ
クレオチド構築物、通常はDNA構築物に取込ませるであ
ろう。通常、該ポリヌクレオチド構築物は、酵母または
細菌のごとき単細胞宿主中における複製に適しているで
あろうが、培養哺乳動物または植物または他の真核生物
セルラインへの（ゲノム内への一体化を伴うか伴わない
で）導入も意図し得る。本発明の方法により産生した核
酸の精製は記載されている。例えば、Sambrookら,1989
またはAusubelら,1992を参照されたし。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成によって、例
えば、BeaucageおよびCarruthers,1981によって記載さ
れているホスホルアミダイト法、またはMatteucciおよ
びCarruthers,1981によるトリエステル法によっても産
生させることができ、市販の自動化オリゴヌクレオチド
合成器で行うことができる。二本鎖フラグメントは、相
補鎖を合成しその鎖を適当な条件下にて一緒にアニーリ
ングさせることによってか、または適当なプライマー配
列と共にDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を添加するこ
とによってかのいずれかの化学合成の一本鎖産物から得
ることができる。
原核生物または真核生物宿主に導入するために調製す
るポリヌクレオチド構築物には、目的のポリペプチドを
コードする意図するポリヌクレオチドフラグメントを含
有する、宿主によって認識される複製系を含ませること
ができ、好ましくは、該ポリペプチドをコードするセグ
メントに作動可能に連結された転写および翻訳開始調節
配列も含むであろう。発現ベクターには、例えば、複製
開始点または自律複製配列（ARS）および発現制御配
列、プロモーター、エンハンサーおよびリボソーム結合
部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位、
転写ターミネーター配列、ならびにmRNA安定化配列のご
とき必要なプロセシング情報部位を含ませることができ
る。分泌シグナルは、適当には、天然BRCA2蛋白質から
のものか、あるいは他の受容体からのものからか、また
は同一もしくは関連する種の分泌ポリペプチドからのも
のにかかわらず、蛋白質が細胞膜を通過および／または
その中に留まることを許容し、かくしてその機能がトポ
ロジーが達成され、または細胞から分泌される、ものも
含ませることができる。かかるベクターは、当該技術分
野でよく知られており、例えば、Sambrookら,1989また
はAusubelら,1992に論じられている標準的な組換え技術
によって調製することができる。
適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列
は、宿主中で機能的であろうように選択され、適当に
は、BRCA2遺伝子と天然で関連するものを含ませること
ができる。セルラインおよび発現ベクターの作動可能な
組合わせの例は、Sambrookら,1989またはAusubelら,199
2に記載されており；例えば、Metzgerら,1988を参照さ
れたし。多くの有用なベクターが当該技術分野で知られ
ており、Stratagen社、New England BioLabs社、Prom
ega Biotech社、などのごとき販売業者から得ることが
できる。trp、lacおよびファージプロモーター、tRNAプ
ロモーターならびに解糖酵素プロモーターのごときプロ
モーターを原核生物宿主で用いることができる。有用な
酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホ
グリセレートキナーゼ、またはエノラーゼもしくはグリ
セルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ
のごとき他の解糖酵素、マルトースおよびガラクトース
利用に寄与する酵素ほかが包含される。酵母発現に使用
するのに適したベクターおよびプロモーターは、Hitzem
anら，欧州特許73,675A号にさらに記載されている。適
当な非−天然哺乳動物プロモーターには、SV40からの初
期および後期プロモーター（Fiersら,1978）またはげっ
歯類モロニー白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、ニ
ワトリ肉腫ウイルス、II型アデノウイルス、ウシ乳頭腫
ウイルスまたはポリオーマ由来のプロモーターが包含さ
れ得る。加えて、該構築物は、遺伝子の多重コピーが生
成され得るように増幅性遺伝子（例えば、DHFR）に連結
することができる。適当なエンハンサーおよび他の発現
制御配列については、“Enhancers and Eukaryotic Gen
e Expression",Cold Spring Harbor Press社,Cold Spri
ng Harbor,New York（1983）をも参照されたし。
かかる発現ベクターは自律的に複製し得るが、それら
は当該技術分野でよく知られている方法によって宿主細
胞のゲノムに挿入させることによっても複製し得る。
発現およびクローニングベクターには、選抜マーカ
ー、当該ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または
増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子が含まれよう。
この遺伝子の存在により、インサートを発現する宿主細
胞のみの増殖が保証される。蛋白質をコードする典型的
な選抜遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質、例
えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート他
に対する抵抗性を付与し;b）栄養欠失を補足し、または
ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養、例えば、Ba
ciliiについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする
遺伝子を供給する。適当な選抜マーカーの選択は、宿主
細胞に依存し、種々の宿主に適当するマーカーは当該技
術分野でよく知られている。
目的の核酸を含むベクターは、イン・ビトロで転写さ
せ、得られたRNAをよく知られた方法、例えば、注射（K
uboら,1988）によって宿主細胞に導入することができ、
あるいはエレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩
化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストラン
または他の物質を用いるトランスフェクション；マイク
ロプロジェクタイル衝突（microprojectile bombardmen
t）；リポフェクション；（ベクターがレトロウイルス
ゲノムのごとき感染性因子である場合には）感染；およ
び他の方法を包含する、細胞宿主の型に依存して変動す
る当該技術分野でよく知られている方法によって宿主細
胞に直接導入することができる。一般的には、Sambrook
ら,1989およびAusubelら,1992を参照されたし。とりわ
け前記したものを包含する当該技術分野で知られている
いずれかの方法によるポリヌクレオチドの宿主細胞の導
入を、本明細書においては「形質転換」という。前記し
た核酸が導入される細胞とは、かかる細胞の子孫をも包
含することを意味する。本発明の多量の核酸およびポリ
ペプチドは、BRCA2核酸またはその部分を原核生物また
は真核生物宿主細胞に和合性のベクターまたは他の発現
担体中で発現させることによって調製することができ
る。最も一般的に用いられる原核生物宿主は、Bacillus
subtilisまたはPseudomonasのごとき他の原核生物も用
いることができるが、Escherichia coliの株である。
哺乳動物あるいは酵母、糸状菌、植物、昆虫、または
両性類または鳥類のごとき他の真核生物宿主細胞も、本
発明の蛋白質の産生に有用となり得る。培養における哺
乳動物細胞の増殖は、それ自体、よく知られている。Ja
kobyおよびPastan,1979を参照されたし。一般的に用い
られる哺乳動物宿主セルラインの例は、例えば、より高
い発現、望ましいグリコシル化パターンまたは他の特徴
を提供するためには他のセルラインが適当となり得るこ
とは当業者によって理解されるであろうが、VEROおよび
HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、
ならびにWI38、BHK、およびCOSセルラインである。
クローンは、ベクター構築の様式に依存するマーカー
を用いることによって選択する。該マーカーは、同一ま
たは異なるDNA分子上、好ましくは同一DNA分子上に存在
し得る。原核生物宿主においては、例えば、アンピシリ
ン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する抵抗
性によって、形質転換体を選抜することができる。温度
感受性に基く特定の生成物の産生も、適当なマーカーと
して作用し得る。
本発明のポリヌクレオチドで形質転換した原核生物ま
たは真核生物細胞は、本発明の核酸およびポリペプチド
の産生のみならず、例えば、BRCA2ポリペプチドの特徴
の研究にも有用であろう。
アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、当業者によ
り理解されるであろう、BRCA2遺伝子座の発現を妨害す
るかまたは低下させるのに有用である。例えば、BRCA2
遺伝子座の全体もしくは一部分またはBRCA2領域（特にB
RCA2遺伝子座を挟むもの）を含むポリヌクレオチドベク
ターからの他の配列を、アンチセンス向きでプロモータ
ーの制御下に置き、細胞に導入することができる。細胞
内でのかかるアンチセンス構築物の発現は、BRCA2の転
写および／または翻訳および／または複製を妨害するで
あろう。
本明細書に開示したBRCA2遺伝子配列に基くプローブ
およびプライマーを用いて、他の種の相同性BRCA2遺伝
子配列および蛋白質を同定する。これらのBRCA2遺伝子
配列および蛋白質は、それらが単離させた種について
の、本明細書中に開示した診断／予後、治療および薬剤
スクリーニング法に用いる。
使用方法：核酸診断および診断キット 個人を癌にさせる素因を有するBRCA2対立遺伝子の存
在を検出するためには、血液のごとき生物試料を調製
し、BRCA2の感受性対立遺伝子の存在または不存在につ
いて分析する。新生生物、前駆病変の悪性に向けての進
行、または予後インジケーターの存在を検出するために
は、該病変の生物試料を調製し、BRCA2の突然変異対立
遺伝子の存在または不存在について分析する。これらの
試験の結果および解釈情報は、試験した個人へのコミュ
ーニケイションのためにヘルスケア提供者に戻される。
かかる診断は、診断研究所によって行うことができ、あ
るいは別法として、診断キットを製造して、ヘルスケア
提供者または自己診断用に個人に販売することができ
る。
まず、該スクリーニング方法には、関連するBRCA2配
列の増幅が含まれる。本発明のもう１つの好ましい具体
例において、該スクリーニング方法には、非−PCRベー
スのストラテジーが含まれる。かかるスクリーニング方
法には、２工程標識増幅方法が包含され、それは当該技
術分野でよく知られている。PCRおよび非−PCRベースの
スクリーニングストラテジーは双方とも、高レベルの感
度で標的配列を検出することができる。
今日最も一般的な方法は、標的増幅である。ここにお
いては、標的核酸配列をポリメラーゼで増幅する。ポリ
メラーゼ作動増幅を用いる１つの特に好ましい方法は、
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。ポリメラーゼ連
鎖反応および他のポリメラーゼ作動増幅アッセイは、ポ
リメラーゼ作動増幅サイクルの使用を通してコピー数に
おいて1,000,000倍を超える増加を達成し得る。増幅し
たら、得られた核酸を配列決定し、あるいはDNAプロー
ブの基質として使用することができる。
（例えば、癌感受性についてのスクリーニングにおい
て）プローブを用いて標的配列の存在を検出する場合に
は、血液または血清のごとき分析すべき生物試料を処理
して、望むなら核酸を抽出し得る。該試料核酸は、種々
の方法で調製し、標的配列の検出；例えば、変性、制限
分解、電気泳動またはドットブロッティングを促進する
ことができる。被検体核酸の標的化領域は、通常、少な
くとも部分的には一本鎖であって、プローブの標的配列
とハイブリッドを形成しなければならない。配列が元来
一本鎖である場合には、変性は要求されないであろう。
しかしながら、配列が二本鎖である場合には、恐らくは
該配列を変性させる必要があるであろう。変性は当該技
術分野で知られている種々の技術によって行うことがで
きる。
被検体核酸およびプローブは、当該プローブ中の標的
配列と被検体中の推定標的化配列との安定なハイブリッ
ド形成を促進する条件下にてインキュベートする。被検
体に結合させるために用いるプローブの領域は、ヒト第
13染色体の標的化領域に完全に相補的に作製することが
できる。したがって、偽陽性を防ぐためには高ストリン
ジェンシー条件が望ましい。しかしながら、高ストリン
ジェンシーの条件は、プローブが、ゲノム中にユニーク
である染色体の領域に相補的である場合にのみ用いる。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温
度、イオン強度、塩基組成、プローブ長、およびホルム
アミドの濃度を包含する、ハイブリダイゼーションの間
および洗浄工程の間の多数の因子によって決定する。こ
れらの因子は、例えば、Maniatisら,1982およびSambroo
kら,1989に概説されている。ある種の環境下では、標的
配列を検出する手段を提供するために、トリプレック
ス、クアドラプレックス他のごときより高次元のハイブ
リッドを形成させることが望ましいものとなり得る。
いずれの場合にも、得られたハイブリッドの検出は、
通常、標識プローブを用いることによって行なわれる。
別法として、該プローブは非標識であってもよいが、直
接的にかまたは間接的にかのいずれかで、標識されてい
るリガンドと特異的に結合させることによって検出可能
なものとし得る。適当な標識、ならびにプローブおよび
リガンドを標識するための方法は、当該技術分野で知ら
れており、例えば、（ニックトランスレーション、ラン
ダムプライムまたはキナージング（kinasing））などの
知られている方法によって取込ませ得る放射性同位元素
標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキ
セタン、特に活性化（triggered）ジオキセタン）、酵
素、抗体が包含される。この基本スキームの変形は、当
該技術分野で知られており、外来材料からの検出すべき
ハイブリッドの分離を容易にし、および／または標識化
基からのシグナルを増幅する変形が包含される。多種の
これらの変異型は、例えば、MatthewsおよびKricka,198
8;Landegrenら,1988;Mittlin,1989;米国特許第4,868,10
5号および欧州特許公開番号225,807号に概説されてい
る。
前記したごとく、非−PCRベースのスクリーニングア
ッセイも本発明において意図される。例示的な非−PCR
ベースの手法を実施例６に記載する。この手法は、核酸
プローブ（または、正常のホスホジエステルをホスホン
酸メチル骨格に置換えたごときアナログ）を、低レベル
のDNA標的にハイブリダイズさせる。このプローブは、
共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を妨害しな
いようにプローブに共有結合させた酵素を有する。つい
で、この酵素−プローブコンジュゲート−標的核酸複合
体を遊離プローブ酵素コンジュゲートから単離し、酵素
を検出するために基質を添加することができる。酵素活
性は、発色またはルミネセント出力における変化として
観察され、その結果103−106倍の感度の上昇を生じる。
オリゴデオキシヌクレオチド−アルカリ性ホスファター
ゼコンジュゲートの調製およびそのハイブリダイゼーシ
ョン・プローブとしての使用に関する例については、Ja
blonskiら,1986を参照されたし。
二工程標識増幅法は当該技術分野で知られている。こ
れらのアッセイは、（ジゴキシゲニン、ビオチンなどの
ごとき）小リガンドがBRCA2に特異的に結合し得る核酸
プローブに結合するという原理で作用する。例示的なプ
ローブは、本特許出願の配列番号:1および図３に記載す
る配列に基いて開発することができる。対立遺伝子特異
的プローブも、この例の範囲内に意図され、例示的な対
立遺伝子特異的プローブには、表２に記載するものを含
む、以下に記載する素因突然変異を包含するプローブが
含まれる。
１の例において、核酸プローブに結合した小リガンド
は、抗体−酵素コンジュゲートによって特異的に認識さ
れる。この例の１の具体例において、ジゴキシゲニンが
核酸プローブに結合される。ハイブリダイゼーション
は、化学発光基質に転じる抗体−アルカリ性ホスファタ
ーゼコンジュゲートによって検出する。この具体例によ
る核酸プローブを標識する方法については、例えば、Ma
rtinら,1990を参照されたし。第２の例において、該小
リガンドは、第１のリガンドに特異的に複合化すること
ができる第２のリガンド−酵素コンジュゲートによって
認識される。この例のよく知られている具体例は、ビオ
チン−アビジン型の相互作用である。核酸プローブを標
識する方法およびビオチン−アビジンベースのアッセイ
におけるその使用については、Rigbyら,1977およびNguy
enら,1992を参照されたし。
本発明の核酸プローブアッセイがBRCA2を検出するこ
とができる核酸プローブのカクテルを用いるであろうこ
とも本発明の発明の範囲内に意図されている。かくし
て、細胞試料中のBRCA2の存在を検出するための１つの
例において、BRCA2に相補的な１を超えるプローブを用
い、特に、多種の異なるプローブは、択一的に、２、３
または５種の異なる核酸プローブ配列である。患者にお
けるBRCA2遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するた
めのもう１つの例において、BRCA2に相補的な１を超え
るプローブを用い、ここに、カクテルにはBRCA2中に変
化を有する患者の集団で同定された対立遺伝子特異的突
然変異に結合することができるプローブが含まれる。こ
の具体例において、いずれのかの種のプローブを使用す
ることができ、好ましくは、個人を乳癌にさせる素因と
して同定された主要遺伝子突然変異に相当するプローブ
が含まれるであろう。本発明の範囲内に意図される幾つ
かの候補プローブには、以下に記載する対立遺伝子特異
的突然変異を含むプローブ、および突然変異部位の5'お
よび3'側の両方の、配列番号:1および図３に示すBRCA2
領域を有するプローブが包含される。
使用方法：ペプチド診断および診断キット 病変の新生生物症状は、野生型BRCA2ポリペプチドの
変化に基いて検出することもできる。かかる変化は、慣
用技術による配列分析によって判定することができる。
より好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクロ
ーナル）を用いて、BRCA2ペプチド中の相異またはその
不存在を判定する。抗体は、「抗体」なる標題にて前記
に論じたごとく調製することができ、実施例９および10
にてさらに示す。抗体を生起させ精製する他の技術は当
該技術分野でよく知られており、かかる技術のうちのい
ずれかを選択して、本発明で特許請求する調製を達成す
ることができる。本発明の好ましい具体例において、抗
体は、溶液からBRCA2蛋白質を免疫沈降させ、ポリアク
リルアミドゲルのウエスタンまたは免疫ブロット上でBR
CA2蛋白質と反応するであろう。もう１つの好ましい具
体例において、抗体は、免疫組織化学的技術を用いて、
パラフィンまたは凍結組織切片中のBRCA2蛋白質も検出
するであろう。
BRCA2またはその突然変異体を検出する方法に関する
好ましい具体例には、モノクローナルおよび／またはポ
リクローナル抗体を用いたサンドウィッチアッセイを含
む、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラ
ジオイムノアッセイ（RIA）、イムノラジオメトリック
アッセイ（IRMA）および免疫酵素アッセイ（IEMA）が包
含される。例示的なサンドウィッチアッセイは、（出典
明示して本明細書の一部とみなす）米国特許番号第4,37
6,110号および第4,486,530号中でDavidらによって記載
されており、実施例９に例示する。
使用方法：薬剤スクリーニング 本発明は、特に、種々の薬剤スクリーニング技術のう
ちのいずれかで、BRCA2ポリペプチドまたはその結合性
フラグメントを用いることによって化合物をスクリーニ
ングするのにも有用である。
かかる試験で用いるBRCA2ポリペプチドまたはフラグ
メントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定
化されているか、あるいは細胞表面に担持（borne）さ
れているかのいずれであってもよい。薬剤スクリーニン
グの１つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおい
て、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え
ポリヌクレオチドで安定に形質転換した真核生物または
原核生物宿主細胞を用いる。生存しているかまたは固定
化形態かのいずれかのかかる細胞を標準的な結合アッセ
イに用いることができる。例えば、BRCA2ポリペプチド
またはフラグメントと試験すべき剤との間の複合体の形
成を測定することができ、あるいは、BRCA2ポリペプチ
ドまたはフラグメントと知られているリガンドとの間の
複合体の形成が試験すべき剤によって妨害される程度を
検査することができる。
かくして、本発明は、剤とBRCA2ポリペプチドまたは
そのフラグメントとを接触させ、次いで、当該技術分野
でよく知られている方法によって、（ｉ）剤とBRCA2ポ
リペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在に
ついて、または（ii）BRCA2ポリペプチドまたはフラグ
メントとリガンドとの間の複合体の存在についてアッセ
イすることからなる薬剤スクリーニング方法を提供す
る。かかる競合結合アッセイにおいて、BRCA2ポリペプ
チドまたはフラグメントは典型的には標識されている。
蛋白質：蛋白質複合体および遊離（すなわち、非複合
化）標識量中に存在する遊離BRCA2ポリペプチドまたは
フラグメントは、各々、BRCA2に対する試験すべき剤の
結合性またはBRCA2:リガンド結合性のその妨害の尺度で
ある。
薬剤スクリーニングのもう１つの技術は、BRCA2ポリ
ペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物の非
常に徹底したスクリーニングを提供し、これは1984年９
月13日に公開されたGeysenによるPCT国際公開番号WO84/
03564号に詳記されている。簡単に述べれば、膨大な種
々の小ペプチド試験化合物を、プラスチック製ピンまた
はある他のものの表面のごとき固体基体上で合成する。
ペプチド試験化合物をBRCA2ポリペプチドと反応させ、
洗浄する。次いで、結合したBRCA2ポリペプチドを、当
該技術分野でよく知られている方法によって検出する。
精製したBRCA2は、前記の薬剤スクリーニング技術で用
いるために、プレート上に直接コートすることができ
る。しかしながら、該ポリペプチドに対する非−中和抗
体を用い抗体を捕捉して、固相上にBRCA2ポリペプチド
を固定化することができる。
本発明は、BRCA2ポリペプチドに特異的結合すること
ができる中和抗体が、BRCA2ポリペプチドまたはそのフ
ラグメントに対する結合性について試験化合物と競合す
る、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図す
る。この様にして、抗体を用いて、BRCA2ポリペプチド
の１または２以上の抗原決定基を分有するいずれかのペ
プチドの存在を検出することができる。
薬剤スクリーニングのさらなる技術には、非機能性BR
CA2遺伝子を有する（前記したごとき）宿主真核生物セ
ルラインまたは細胞群の使用が含まれる。これらの宿主
セルラインまたは細胞群は、薬剤化合物存在下にて増殖
させる。宿主細胞の増殖速度を測定して、化合物がBRCA
2欠損細胞の増殖を調節することができるかを判定す
る。
使用方法：合理的ドラッグデザイン 合理的ドラッグデザインの最終目標は、例えば、目的
の生物学的に活性なポリペプチドのより活性または安定
な形態である薬剤、または例えば、ポリペプチドの機能
をイン・ビボで向上または妨害する薬剤を生成するため
に、該ポリペプチドの構造アナログ、または（例えば、
アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビターなどの）そ
れと相互作用する小分子の構造アナログを生成すること
にある。例えば、Hodgsonら,1991を参照されたし。１つ
のアプローチにおいて、最初に目的の蛋白質（例えば、
BRCA2ポリペプチド）または例えばBRCA2−受容体もしく
はリガンド複合体の三次元構造をＸ線結晶学によって、
コンピュータ・モデリングによって、最も典型的には、
アプローチの組合せによって決定する。あまりしばしば
ではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報
は、相同性蛋白質の構造に基いてモデリングすることに
よっても得ることができる。合理的ドラッグデザインの
一例は、HIVプロテアーゼ・インヒビターの開発である
（Ericksonら,1990）。加えて、ペプチド（例えば、BRC
A2ポリペプチド）はアラニンスキャン（Wells,1991）に
よって分析する。この技術においては、アミノ酸残基を
Alaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を判定
する。ペプチドの各アミノ酸残基をこのようにして分析
して、ペプチドの重要な領域を決定する。
また、機能アッセイによって選抜した標的特異的抗体
を単離し、次いでその結晶構造を解明することもでき
る。原則として、このアプローチは、その上においてつ
づくドラッグデザインが基礎とし得る薬剤コア（pharma
core）を得る。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する
抗−イディオタイプ抗体（抗−ids）を創製することに
よって蛋白質結晶学を全く迂回することも可能である。
鏡像に対する鏡像のごとき、抗−idsの結合部位は、元
の受容体のアナログであると予想される。ついで、抗−
idを用いて、ペプチドの化学的または生物学的に生成し
たバンクからペプチドを同定し、単離することができ
る。ついで、選抜したペプチドは、薬剤コアとして作用
するであろう。
かくして、例えば、改善されたBRCA2ポリペプチド活
性または安定性を有する薬剤、またはBRCA2ポリペプチ
ド活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト他
として作用する薬剤をデザインすることができる。クロ
ーン化BRCA2配列の入手性によって、十分量のBRCA2ポリ
ペプチドを入手可能とすることができ、Ｘ線結晶学のご
とき分析実験を行うことができる。加えて、本明細書中
に記載したBRCA2蛋白質配列の知見は、Ｘ−線結晶学の
代りに、またはそれに加えて、コンピュータモデリング
技術を用いるものを案内するであろう。
使用方法：遺伝子治療 本発明によれば、該方法は、突然変異BRCA2対立遺伝
子を運搬する細胞に野生型BRCA2機能を供給することも
提供される。かかる機能を提供することは、レシピエン
ト細胞の新生生物増殖を抑制するにちがいない。野生型
BRCA2遺伝子または該遺伝子の一部分は、該遺伝子が染
色体外に残るように、ベクターで細胞に導入することが
できる。かかる状況においては、該遺伝子は、染色体外
位置から細胞によって発現されるであろう。遺伝子フラ
グメントを突然変異BRCA2対立遺伝子を運搬している細
胞中に導入し、その中で発現させる場合には、該遺伝子
フラグメントは細胞の非新生生物増殖に必要であるBRCA
2蛋白質の一部分をコードしていなければならない。よ
り好ましくは、野生型BRCA2遺伝子またはその一部分
が、細胞中に存在する内因性の突然変異BRCA2遺伝子と
組換わるように、それを突然変異細胞に導入する状況で
ある。かかる組換えには、BRCA2遺伝子突然変異の修正
を生じる二重組換え事象が必要である。組換えよび染色
体外維持性の双方の遺伝子を導入するためのベクターは
当該技術分野で知られており、いずれの適当なベクター
も用いることができる。エレクトロポレーション、リン
酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入のごとき細胞
にDNAを導入する方法は、当該技術分野で知られてお
り、方法の選択は従事者の能力の範囲内である。野生型
BRCA2遺伝子で形質転換した細胞は、モデル系として用
いて、癌軽減およびかかる軽減を促進する薬剤処理を実
験することができる。
前記に一般的に論じたごとく、BRCA2遺伝子またはフ
ラグメントは、適用し得る場合には、癌細胞中における
かかる遺伝子の発現産物の量を増加させるために、遺伝
子療法に用いることができる。かかる遺伝子治療は、BR
CA2ポリペプチドのレベルが不存在または正常細胞に比
して低下ている、癌性または前癌性細胞の双方における
使用に特に適している。突然変異遺伝子が「正常」レベ
ルで発現しているが、その遺伝子産物が完全に機能的で
ない腫瘍細胞中でさえ、所定のBRCA2遺伝子の発現レベ
ルを上昇させるのにも有用である。
遺伝子治療は、例えば、friedman,1991によって記載
されているごとき認可された方法に従って行なわれるで
あろう。患者の腫瘍からの細胞を、まず前記した診断方
法によって分析し、腫瘍細胞中のBRCA2ポリペプチドの
産生を確認するであろう。発現制御エレメントに連結
し、腫瘍細胞の内側で複製することができるBRCA2遺伝
子のコピーを含む、ウイルスおよびプラスミドベクター
（さらなる詳細は後記を参照されたし）を調製する。米
国特許第5,252,479号およびPCT国際公開番号WO93/07282
号に開示されているごとき適当なベクターは知られてい
る。次いで、（他の部位に転位し得るいずれの腫瘍細胞
にも到達させるために）該ベクターを腫瘍部位に局所的
にか、または全身的にかのいずれかで患者に注射する。
トランスフェクト遺伝子が各標的腫瘍細胞のゲノムに恒
久的に取込まれない場合には、該治療を定期的に繰返さ
なければならないかもしれない。
当該技術分野で知られている遺伝子トランスファー系
が、本発明の遺伝子治療方法の実施に有用となり得る。
これらには、ウイルスおよび非ウイルストランスファー
方法が包含される。例えばSV40（Madzakら,1992）、ア
デノウイルス（Berkner,1992;Berknerら,1988;Gorzigli
aおよびKapikian,1992;Quantinら,1992;Rosenfeldら,19
92;Wilkinsonら,1992;Stratford−Perricaudetら,199
0）、ワクシニアウイルス（Moss,1992）、アデノ随伴ウ
イルス（Muzyczka,1992;Ohiら,1991）のようなパポーバ
ウイルス科、HSVおよびEBVを包含するヘルペスウイルス
（Margolskee,1992;Johnsonら,1992;Finkら,1992;Break
fieldおよびGeller,1987;Freeseら,1990）、ならびに鳥
類（BrandyopadhyayおよびTemin,1984;Petropoulosら,1
992）、げっ歯類（Miller,1992;Millerら,1985;Sorge
ら,1984;MannおよびBaltimore,1985;Millerら,1988）お
よびヒト（Shimadaら,1991;Helsethら,1990;Pageら,199
0;BuchschacherおよびPanganibian,1992）起源のレトロ
ウイルスを包含する多種のウイルスが、遺伝子トランス
ファーベクターとして用いられている。大部分のヒト遺
伝子治療プロトコールは、無能化したマウスレトロウイ
ルスに基いている。
当該技術分野で知られている非ウイルス遺伝子トラン
スファー法には、リン酸カルシウム共沈（Grahamおよび
van der Eb,1973;Pellicerら,1980）のごとき化学的
技術；例えば、マイクロインジェクション（Anderson
ら,1980;Gordonら,1980;Brinsterら,1981;Constantini
およびLacy,1981）のような機械的技術；リポソームを
介した膜融合−媒介トランスファー（Felgnerら,1987;W
angおよびHuang,1989;Kanedaら,1989;Stewartら,1992;N
abelら,1990;Limら,1992）；直接DNA取込みおよび受容
体−媒介DNAトランスファー（Wolffら,1990;Wuら,1991;
Zenkeら,1990;Wuら,1989b;Wolffら,1991;Wagnerら,199
0;Wagnerら,1991;Cottenら,1990;Curielら,1991a;Curie
lら,1991b）が包含される。ウイルス−媒介遺伝子トラ
ンスファーは、リポソームデリバリーを用いる直接イン
・ビボ遺伝子トランスファーと合して、ウイルスベクタ
ーを、取囲む非***性細胞ではなく腫瘍細胞に指向させ
ることができる。別法として、レトロウイルスベクター
産生セルラインを腫瘍に注射することができる（Culver
ら,1992）。次いで、産生細胞の注射は、ベクター粒子
の連続した供給源を提供する。この技術は、手術不能の
脳腫瘍を有するヒトにおける使用に認可されている。
生物学的および物理学的遺伝子トランスファー法を合
するアプローチにおいて、いずれかのサイズのプラスミ
ドDNAをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポ
リリジン−コンジュゲート抗体と結合させ、得られた複
合体をアデノウイルスベクターに結合させる。ついで、
三分子複合体を用いて細胞に感染させる。該アデノウイ
ルスベクターにより、効率的な結合性、インターナリゼ
ーション、およびカップリングさせたDNAが障害を受け
る前のエンドソームの分解が許容される。
リポソーム/DNA複合体は、直接イン・ビボ遺伝子トラ
ンスファーを媒介できることが示されている。標準的な
リポソーム調製物においては遺伝子トランスファー工程
は非特異的であるが、例えば、直接イン・サイチュ投与
後に、位置決定されたイン・ビボの取込みおよび発現が
腫瘍沈殿物で報告されている（Nabel,1992）。
***および卵巣組織、例えば***または卵巣の上皮細
胞にDNAを直接標的化する遺伝子トランスファーが好ま
しい。受容体−媒介遺伝子トランスファーは、例えば、
ポリリジンを介して蛋白質リガンドに（通常、共有的に
閉環した超螺旋プラスミドの形態の）DNAをコンジュゲ
ートすることによって行う。リガンドは、標的細胞の細
胞表面上の相当するリガンド受容体の存在／組織型に基
いて選択する。１つの適当な受容体／リガンド対には、
エストロゲン受容体とそのリガンドであるエストロゲン
（およびエストロゲン・アナログ）が包含され得る。こ
れらのリガンド−DNAコンジュゲートは、望むなら血液
に直接注射することができ、受容体結合性およびDNA−
蛋白質複合体のインターナリゼーションが起こる標的組
織に指向することができる。DNAの細胞内破壊の問題を
克服するために、アデノウイルスとの同時感染を含ませ
て、エンドソーム機能を破壊することができる。
該治療には、単独または結合して行うことができる二
工程が含まれる。第１の工程では、BRCA2感受性対立遺
伝子を運搬する思春期前の女性を、その乳管上皮前駆細
胞の幾つかまたは全てが少なくとも１つの機能性正常BR
CA2対立遺伝子のさらなるコピーを受けるように、遺伝
子デリバリー担体で治療する。この工程において、治療
した個人は、感受性対立遺伝子の効果が正常対立遺伝子
の存在によって対抗される程度まで低下された乳癌の危
険性を有する。予防的治療の第２の工程において、素因
低年齢女性、特に提唱した遺伝子治療処理を受けた女性
は、妊娠全期間の***に対する作用をミメティクスする
ためのホルモン療法を受ける。
使用方法：ペプチド療法 BRCA2活性を有するペプチドは、突然変異BRCA2を運搬
しているか、またはBRCA2を欠失している細胞に適用す
ることができる。BRCA2蛋白質の配列を配列番号:2に開
示する。蛋白質は、例えば、知られている発現ベクター
を用いて、細菌中でcDNA配列を発現させることによって
産生することができる。別法として、BRCA2ポリペプチ
ドは、BRCA2−産生哺乳動物細胞から抽出することもで
きる。加えて、合成化学の技術を用いて、BRCA2蛋白質
を合成することもできる。かかる技術のいずれも、BRCA
2蛋白質を含む本発明の調製物を提供することができ
る。該調製物は、他のヒト蛋白質を実質的に含まない。
これは、微生物内またはイン・ビトロで合成することに
よって最も容易に行われる。
活性BRCA2分子は、例えば、マイクロインジェクショ
ンによってか、またはリポソームを使用することによっ
て細胞に導入することができる。別法として、能動的ま
たは拡散によって、幾分かの活性分子を細胞によって取
込ませることができる。BRCA2遺伝子産物の細胞外適用
は、腫瘍増殖に影響するのに十分なものとし得る。BRCA
2活性を有する分子の適用は、新生生物状態の部分的な
逆転に通じるにちがいない。BRCA2活性を有する他の分
子（例えば、ペプチド、薬剤、または有機化合物）を用
いてもかかる逆転に影響することができる。実質的に同
様な機能を有する修飾ポリペプチドもペプチド療法に用
いられる。
使用方法：形質転換宿主 同様にして、突然変異BRCA2対立遺伝子を運搬してい
る細胞または動物を、治療剤としての潜在性を有する物
質について実験し、試験するためのモデル系として用い
ることができる。該細胞は、典型的には培養上皮細胞で
ある。これは、体細胞または生殖系のいずれかの、BRCA
2突然変異を有する個人から単離することできる。別法
として、該セルラインは、前記したごとく、BRCA2対立
遺伝子中に突然変異を運搬するように設計することもで
きる。試験物質を該細胞に適用した後に、細胞の新生生
物的なトランスフォーメーションを判定する。固定−独
立増殖性、ヌードマウスにおける発癌性、細胞の侵入
性、および成長因子依存性を包含する、新生生物的にト
ランスフォームした細胞のいずれの特性をも検査するこ
とができる。これらの各特性についてのアッセイは当該
技術分野で知られている。
治療剤を試験する動物は、全動物の突然変異誘発後、
または生殖系細胞もしくは接合体の処理の後に選抜する
ことができる。かかる処理には、通常第２の動物種から
の突然変異BRCA2対立遺伝子の挿入、ならびに破壊した
（disrupted）相同性遺伝子の挿入が包含される。別法
として、動物の内因性BRCA2遺伝子（群）は、挿入また
は欠失突然変異または慣用技術を用いる他の遺伝的変化
によって破壊させることができる（Capecchi,1989;Vala
nciusおよびSmithies,1991;Hastyら,1991;Shinkaiら,19
92;Mombaertsら,1992;Philpottら,1992;Snouwaertら,19
92;Donehowerら,1992）。試験物質を動物に投与した後
に、腫瘍の増殖性を評価しなければならない。試験物質
が腫瘍の増殖を妨害または抑制する場合には、該試験物
質がここに同定された癌治療用の候補治療剤となる。こ
れらの動物モデルは、候補治療生成物に対する重要な試
験担体を提供する。
本発明を以下の実施例によって記載するが、これは例
示的なものであって、断じて本発明を限定するものでは
ない。当該分野で良く知られた標準的技術次いでまたは
後記にて特記する技術を利用した。
実施例１ 染色体13−連鎖乳癌罹患性遺伝子座を有するらしい家系
の確認および研究 研究に利用できる、乳癌の複数ケースを持つ拡大され
た家系および多くの親族の大きな組を供するはっきりと
した集団から、広範な癌に罹りやすい家系を確認した。
これらの大家系に存在する非常に多数の減数***は、BR
CA2遺伝子座が分離するか否かを検出する能力を供し、
情報的組換え体が調査すべき小領域内で起こる機会を増
加させた。これは、BRCA2領域への連鎖を確立する機会
を大いに改良し、BRCA2領域を管理可能なサイズへ低下
させるのをかなり容易とし、これはBRCA2遺伝子座それ
自体の同定を可能とする。
各家系は、全ての利用可能な関係親族を介して、各発
端者または癌ケースの全ての情報的一親等親族まで拡大
された。これらの家系では、該家系においてやはり出現
する、興味ある他の部位において癌を持つさらなる乳癌
ケースおよび個体を、主要登録連鎖ファイルを介して同
定した。ユタ州癌登録所で確認されていない家系で報告
された全乳癌を調べた。全ての癌の確認のために、医療
記録または死亡証明書を入手した。DNAがそれから抽出
された血液試料を供することによって、個体および全て
の情報的個体を結び付ける各鍵を参画させた。また、我
々は、故人ケースの遺伝子型がそれらの親族の遺伝子型
から推定できるように、故人の配偶者および親族もサン
プリングした。
推定できる遺伝子型を持つ３以上の癌ケースを有する
家系を、染色体13マーカーに対する連鎖実験で選択し
た。これらは、増殖性***病気および乳癌の研究につい
ての連結データベースから外来確認された家系を含む
（Skolnickら、1990）。これらの家系の選択用基準は、
乳癌を持つ２人の姉妹または母親および彼女の娘の存在
であった。加えて、我々の乳癌連鎖研究の一部として19
80年以来研究した家系および男性および女性乳癌のクラ
スターの存在についての連結データベースから確認され
た家系および初期開始乳癌を持つ自己言及家系が含まれ
た。これらの家系を調査し、前記したごとくに我々のク
リニックで拡張させた。
これらの家系で収集した各試料については、標準的な
研究室プロトコルを用い、血液またはパラフィン−埋没
組織ブロックからDNAを抽出した。本実験における遺伝
型は短いタンデムリピート（STR）マーカーに限定され
た。というのは、一般に、それらは高ヘテロ接合性を有
し、PCR方法は非常に少量のDNAを使用しつつ迅速な方向
転換（turnaround）を供するからである。この努力を助
けるために、Rb腫瘍サプレッサー遺伝子座の領域におけ
る短腕に位置付けられる２、３または４の短いタンデム
リピートを含有するクローンについての染色体特異的コ
スミドライブラリーをスクリーニングすることによっ
て、染色体13上のSTRマーカーを開発した。我々の研究
所で開発されなかったマーカーについてのオリゴヌクレ
オチド配列は、公開された報告から、あるいはBreast C
ancer Linkage Consortiumの一部として、あるいは他の
研究者から入手した。対立遺伝子の一貫したコーディン
グを維持するのに使用した標準レーンマーカーにて、盲
検により、全ての遺伝子型フィルムをスコア取りした。
鍵となる試料は、すべての関連マーカーにつき二連型別
を受けた。
各家系についてのLODスコアは、２つの組換え分率値
0.001および0.1について計算した。（LODスコアの計算
については、Ott 1985参照）。尤度は、Clausら、1991
によって誘導されたモデル下で計算し、該モデルは推定
遺伝子頻度0.003、女性遺伝子キャリアにおける寿命危
険性約0.80、および非遺伝子キャリアにおける乳癌につ
いての集団ベース年齢−特異的危険性を推定した。LOD
スコア計算で使用したマーカーについての対立遺伝子頻
度は、CEPHパネルにおける無関係個体の我々自身の研究
所型別から計算した（WhiteおよびLalouel、1988）。
家系107は、いずれのグレープによっても今日までに
報告されている最大の染色体13−連鎖乳癌家族である。
この家族についての染色体13に対する連鎖の証拠は圧倒
的である。より小さい家系においては、散発性癌は、連
鎖解析および鍵となる組換え体の正しい同定を大いに混
乱させる。
我々の組換え体の特徴付けを改良し、より近いフラン
キングマーカーをはっきりとさせるために、染色体13上
の比較的小さな領域の密なマップが必要であった。我々
のアプローチは、他の研究者によって提供された現存の
STRマーカーおよび我々の染色体連鎖家系における我々
の実験室から新しく開発されたいずれものマーカーを分
析することであった。図１は、遺伝子分析で使用された
10のマーカーの位置決めを示す。表１は我々の実験にお
ける19家系の各々に対する連鎖についてのLODスコアを
与え、これは該領域をほぼ1.5Mbまで減少させた。
また、表１はLODスコアに基づくBRCA2突然変異を有す
る家系の事後確率および先験的確率も与える。これらの
マーカーの４つ（D13S171、D13S260、D13S310およびD13
S267）は従前に公知であった。他の６つのマーカーはBR
CA2についての我々の研究の一部として見出された。我
々は、左側境界におけるマーカーtdj3820を持つ家系107
における組換え体およびAC6およびD13S310とほぼ同一位
置である右側境界（図１）におけるマーカーYS−Ｇ−B1
0Tを持つ家系2043における第２の組換え体に基づいて該
領域を1.5メガベースにまで減少させることができた。
さらに、BRCA2自体によって駆動され得るBRCA2領域にお
ける膵臓腫瘍細胞系でホモ接合性欠失が見出された；こ
の欠失を図１においてSchutte/Kern欠失という（Schutt
eら、1995）。図１におけるSchutte/Kern cotigは、該
欠失をカバーするこれらの著者らの物理的マップをい
う。
実施例２ 注目する領域における遺伝子的および物理的源の開発 BRCA2領域における高度に多形な遺伝子座の数を増加
させるために、我々は、物理的に該領域にマップされる
P1、BACおよびYACから我々の研究室において多数のSTR
マーカーを開発した。これらのマーカーは、我々が、さ
らに該領域を精査することを可能とした（表１および前
記議論参照）。
所望の領域におけるSTSを用いて、それらを含有するY
ACを同定した。次いで、これらのYACを用いて、P1また
はBACにおけるサブクローンを同定した。次いで、これ
らのサブクローンを、短いタンデムリピートの存在につ
きスクリーニングした。強力なシグナルを持つクローン
を優先的に選択した。というのは、それらは非常に多数
の反復を有しおよび／または該パターンに対してほとん
ど完全に忠実である反復を表すようだからである。これ
らの特徴は共に多形の確率を増加させることが知られて
いる（Weberら、1990）。これらのクローンをベクター
から直接配列決定して該反復を位置付けた。我々は、該
反復の末端に相補的な潜在的プライマー組の１つを用い
ることによって、短いタンデムリピートの一方側のユニ
ークな配列を得た。このユニークな配列に基づいて、プ
ライマーをして他の向きに反復を横切って逆に配列決定
させ、それに隣接する第２プライマーの設計用のユニー
クな配列を得た。次いで、STRを、小さな群の無関係個
体に対する多形につきスクリーニングし、ハイブリッド
パネルに対してテストして、それらの物理的位置を確認
した。次いで、これらの基準を満足する新しいマーカー
をユタ州からの無関係個体の組においてタイプ分けし
て、この集団の研究に適する対立遺伝子頻度を得た。こ
の研究で報告された他のマーカーの多くも無関係個体で
テストして、同様に適する対立遺伝子頻度を得た。
前記した手法を用い、新規なSTRは、多形であってBRC
A2領域に位置付けられるこれらのYACから見出された。
図１は、BRCA2領域におけるSTS、P1、BACおよびYACの模
式的地図を示す。
実施例３ contig領域のゲノム分析によるBRCA2遺伝子座について
の候補cDNAクローンの同定 1.一般的方法 もっともらしい領域の完全なスクリーニング 相当の労働ではあるが、候補cDNAを同定する第１の方
法では公知の技術を用いた。該方法は、該contigにおい
てP1およびBACクローンをスクリーニングして推定コー
ディング配列を同定することを含むものであった。次い
で、推定コーディング配列を含有するクローンを、cDNA
ライブラリーのフィルター上のプローブとして用いて、
さらなる分析用の候補cDNAクローンを同定した。該クロ
ーンを、２つの方法のいずれか１つによって、推定コー
ディング配列につきスクリーニングした。
分析すべきP1クローンを制限酵素で消化して、ヒトDN
AをベクターDNAから遊離させた。該DNAを、20ボルトに
おいて16時間、14cmの0.5％アガロースゲル泳動で一晩
分離した。ヒトDNAバンドをゲルから切り出し、0.5×ト
リス酢酸緩衝液中にて、100ボルトで少なくとも２時
間、ゲルウェッジから電気溶出させた（Maniatisら、19
82）。次いで、溶出したNot Ｉ消化DNA（−15kbないし
5.0kb）をEcoR I制限酵素で消化してより小さな断片
（−0.5kbないし5.0kb）が得られ、これはDNAを放射性
ヌクレオチドで標識する次の工程で容易に融解する。ヘ
キサマーランダム起点標識方法Boehringer−Mannheim,C
at.＃1004760）によって該DNA断片を標識した。標識し
たDNAをスペルミン沈殿させ（100μｌ TE、５μｌ 0.
1Mスペルミン、および５μｌの10mg/mlサケ***DNAを添
加）、取り込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去し
た。次いで、標識DNAを65℃にて0.5M NaCl 100μｌに
５分間再懸濁し、次いで、製造業者の指示（Gibco/BR
L、カタログ番号＃6279SA）に従い、ヒトC0t−1DNAで２
−４時間でブロックした。C0t−１でブロックしたプロ
ーブを、ブロッキング溶液中、フィルター上で42℃にて
一晩インキュベートした。該フィルターを２×SSC、0.1
％SDS中、室温で30分間洗浄し、次いで、同緩衝液中、5
5℃で30分間洗浄した。次いで、該フィルターを、増感
スクリーンを含むKodak XAR−５フィルムに−70℃で３
日間暴露した。かくして、ブロットをインサートからの
EcoR I断片のプールとまたは個々に各断片とハイブリダ
イズさせた。
該領域におけるクローンからのヒトDNAを全インサー
トして、またはEcoR I断片として単離し、前記したごと
くに標識した。cDNAフィルターが0.1×SSC、0.1％SDSの
よりストリンジェントな洗浄を65℃で30分間にて２回受
ける以外は同一条件下で、該標識DNAを用いて種々のcDN
Aライブラリーのフィルターをスクリーニングした。
我々の実験で今日まで使用したcDNAライブラリーのほ
とんど（正常***組織、妊娠８カ月の婦人からの***組
織および***悪性度からのラリブラリー）はClonetech,
Inc.で調製した。８カ月妊娠婦人の***組織から生成し
たcDNAライブラリーはラムダgt−10ベクター中にて、Cl
onetech（カタログ番号HL1037a）から入手でき、C600Hf
1細菌宿主細胞で増殖させる。正常***組織および悪性
***組織試料は37歳の白人女性から単離し、各組織1gを
mRNAプロセッシングおよびcDNAライブラリー構築のため
にClonetechに送った。後者の２種のライブラリーはラ
ンダムおよびオリゴ−dT両プライミングを用いて生成さ
せ、最終産物のサイズを選択し、次いで、これをラムダ
Zap IIベクターにクローン化し、製造業者によって記載
されているごとくに殺菌のXL1−ブルー株中で増殖させ
た。さらなる組織−特異的cDNAライブラリーは、ヒト胎
児脳（Stratagene,カタログ番号、936026）、ヒト精巣
（ClonetechカタログHL3024）、ヒト胸腺（Clonetechカ
ログHL1127n）、ヒト脳（ClonetechカタログHL1181
0）、ヒト胎盤（Clonetechカタログ1075b）、およびヒ
ト骨格筋（ClonetechカタログHL1124b）を含む。
該cDNAライブラリーをNZCYMプレート上でそれらの宿
主細胞と共に平板培養し、フィルターリフトをManiatis
ら（1982）に従って各プレートから二連で作成した。候
補ゲノムクローンからの昆虫（ヒト）DNAを精製し、高
特異的活性まで放射性標識した。次いで、放射性DNAをc
DNAフィルターにハイブリダイズさせて、それらのcDNA
を同定し、これは候補コスミドクローン内に位置する遺
伝子に対応する。この方法によって同定されたcDNAを拾
い、再度平板培養し、標識クローンインサートまたはそ
の誘導されたEcoR I断片DNAで再度スクリーニングし
て、それらの陽性状態を確認した。次いで、その第２ラ
ウンドのスクリーニングの後に陽性であったクローンを
増殖させ、それらのDNAをサザーンブロット分析および
配列決定のために精製した。製造業者からのプロトコル
に記載されているように、ラムダベクターからのプラス
ミドのイン・ビボ切り出しを介して、クローンをプラス
ミドとして精製するか、あるいは制限断片としてラムダ
ベクターから単離し、プラスミドベクターにサブクロー
ンした。
サザーンブロット分析は二連で行い、１つはブローブ
として元のゲノムインサートDNAを用いて、cDNAインサ
ートがハイブリダイズする配列を含有するかを確認し
た。第２のブロットは最大cDNAクローンからのcDNAイン
サートDNAとハイブリダイズさせて、いずれのクローン
が同一遺伝子を表すかを同定した。ゲノムクローンにハ
イブリダイズし、ユニークである全てのcDNAを配列決定
し、該DNAを分析して、該配列が公知またはユニーク遺
伝子を表すか否かを判断した。ユニークのように見える
全てのcDNAクローンを、候補BRCA2遺伝子座としてさら
に分析した。具体的には、該クローンをノーザンブロッ
トにハイブリダイズさせて、正常−対−***腫瘍RNAに
おいて***特異的発現および異なる発現を探した。ま
た、それらをBRCA2領域におけるクローンに対するPCRに
よって分析してそれらの位置を確認する。遺伝子座の程
度をマップするために、全長cDNAを単離し、それらの配
列をYACおよび元の同定クローンを囲むおよびそれを含
むクローン上でPCRプローブとして使用した。イントロ
ン−エキソン境界を、次いで、配列分析によってさらに
はっきりとさせた。
我々は、該領域におけるコスミドBACおよびP1クロー
ンからのEcoR I断片を持つ正常***、８カ月妊娠***お
よび胎児脳cDNAライブラリーをスクリーニングした。潜
在的BRCA2 cDNAクローンを３つのラリブラリーのうち
から同定した。クローンを拾い、再度平板培養し、元の
プローブで再度スクリーニングしてそれらが陽性である
ことを確認した。
ハイブリッド−選択cDNAの分析 プローブDNAに対するサザーンブロットハイブリダイ
ゼーションによって、直接的選択から得られたcDNA断片
をチェックして、それらがcontigに由来することを確認
した。このテストをパスしたものを、それらの全体につ
いて、配列決定した。このようにして得られたDNA配列
の組を、次いで、相互に対して再度チェックして、重複
する独立クローンを見つけた。
cDNAの直接的選択方法（Loventら、1991;Futeral、19
93）は、プローブとしてP1およびBAC DNAを用いて利用
する。該プローブDNAをHae IIIのごとき平滑切断末端制
限酵素で消化する。次いで、二本鎖アダプターを該DNA
に連結し、ビオチン化プライマーを用いる引き続いての
PCR増幅反応におけるプライマー用の結合部位として供
する。ランダム起点またはオリゴ（dT）起点第１鎖の合
成、続いての第２鎖の合成によって、組織試料、例えば
***組織に由来するmRNAから、標的cDNAを生じさせた。
該cDNA末端を平滑とし、二本鎖アダプターに連結する。
これらのアダプターは、PCR用の増幅部位として供す
る。標的およびプローブ配列を変性させ、ヒトC0t−１
と混合して各配列をブロックする。サザーンハイブリダ
イゼーションを行って、高C0t−1/2値とし、稀な標的cD
NA分子のハイブリダイゼーションを確実とする。次い
で、アニールした物質をアビジンビーズ上に捕獲し、高
ストリンジェンシーで洗浄し、保持されたcDNAを溶出
し、PCRによって増幅する。分析用のプラスミドベクタ
ーへクローニングする前に、cDNAをさらなるラウンドの
富化に付す。
HIF島分析 cDNAライブラリー上でプローブとして使用するコスミ
ドを同定する方法はHIF島分析であった。HIF島は、非メ
チル化CpGジヌクレオチドの非常に高い頻度を含有するD
NAのセグメントであり（Tonolioら、1990）、その認識
配列がCpGジヌクレオチドを含む酵素の制限部位をクラ
スター化することによって明らかとされる。HIF−島分
析で有用であることが知られている酵素はAsc I、Not
I、BssH II、Eag I、Sac II、Nae I、Nar I、Sma I、お
よびMlu Iである（Anand、1992）。
候補クローンの分析 前記から生じた１以上の候補遺伝子を配列決定し、該
情報を各予測される遺伝子の同定および分類で使用し
た。ヌクレオチド配列比較によっておよび全てのフレー
ムにおける翻訳、続いての公知アミノ酸配列との比較に
よって、DNA配列を公知遺伝子と比較した。これは、局
所的および離れた配列データベース（例えば、GenBan
k）に対する配列比較については、Genetic Data Enviro
nment（GDE）バージョン2.2ソフトウェアおよびクライ
エント／サーバーソフトウェアパッケージのBasic Loca
l Alignment Search Tool（Blast）シリーズを用い、Su
n SPARCワークステーションで実行することによって達
成された。コスミドおよびP1で同定されたcDNAクローン
の収集から再構築された配列が生じた。新しい配列を表
した全ての候補遺伝子をさらに分析して、推定BRCA2遺
伝子座についてのそれらの候補性をテストした。
突然変異スクリーニング 罹患血縁において突然変異をスクリーニングするため
に、２つの異なるアプローチを引き続いて行った。ま
ず、BRCA2の罹患性対立遺伝子を担持することが知られ
ている家族メンバーから単離されたゲノムDNAを、PCRに
よる候補遺伝子配列の増幅用の鋳型として使用した。も
しPCRプライマーがイントロン／エキソン境界に隣接し
またはそれと重複するならば、増幅された断片はcDNA配
列から予測されるものよりも大きく、あるいは増幅され
た混合物に存在しないであろう。設計されたプライマー
の組を用いるP1またはBACクローンのかかる増幅実験お
よび配列決定の組合せによって、イントロン／エキソン
構造を確立し、最終的に家系からのゲノムDNAのDNA配列
を得ることができる。
もし候補遺伝子のイントロン／エキソン構造が複雑で
あれば、かなり迅速な第２のアプローチは、設計された
プライマーの組を用いるPCR増幅用の基質として使用さ
れる血縁血液から抽出されたリンパ球mRNAから合成した
cDNAから増幅された断片を配列決定することを含む。も
し候補遺伝子がリンパ球で有意な程度まで発現されれ
ば、かかる実験は、通常、イントロン／エキソン結合の
知識なくして直接的に配列決定できる増幅断片を生じ
る。
ゲル電気泳動によってかかる配列決定反応の産物を分
析して、欠失または挿入、あるいはアミノ酸変化または
他の有害効果を引き起こす置換のごとき突然変異を含有
する配列中位置を決定した。
***で発現されたBRCA2領域内のいずれの配列も、BRC
A2についての候補遺伝子であるとみなされる。所与の候
補遺伝子がBRCA2に対応するという強制的証拠は、家系
家族が該候補の欠陥対立遺伝子を含有するという証明に
由来する。
2.特異的方法 ハイブリッド選択 ハイブリッド選択の２つの異なる方
法をこの仕事で用いた。
方法1:cDNA調製および選択 ランダム起点cDNAは、乳腺、卵巣、胎児脳および胎盤
組織のポリ（Ａ）+RNAから、および細胞系Caco−２（AT
CC HTB 37）の全RNAから調製した。cDNAにホモポリマ
ーをテールし、次いで、従前に記載されてるごとく、２
連続ラウンドの固定化P1またはBAC DNAへのハイブリダ
イゼーションにつきハイブリッドを選択した（Parimoo
ら、1991;Rommernら、1994）。２ないし４の重複するP1
および／またはBACクローンの群を個々の選択実験で使
用した。ハイブリダイズするcDNAを収集し、G50 Fine
Sephadexカラムを通し、テールドプライマーを用いて増
幅した。次いで、産物をEcoR Iで消化し、アガロースゲ
ルでサイズを選択し、RcoR Iで消化し、子ウシアルカリ
性フォスファターゼ（Boehringer Mannheim）で処理し
てあるpBluescript（Stratagene）に連結させた。連結
産物はコンピテントDH5αイー・コリ（E.coli）細胞（L
ife Technologies,Inc.）に形質転換した。
回収cDNAの特徴付け （ゲノムDNAの各250キロベースからの）各連結からの
200ないし300の個々のコロニーを拾い、順序付けおよび
貯蔵用のマイクロタイタープレートに格子状に配した。
培養を、アンピシリンを含むLB寒天で裏打ちされたHybo
ndN膜（Amersham）にレプリカ移動させた。コロニーを
増殖させ、引き続いて標準的な手法で溶解させた。cDNA
クローンの最初の分析は、リボソーム配列用のプレスク
リーニングおよび重複および冗長度の検出用の引き続い
ての交差スクリーニンクを含むものであった。
クローンのほぼ10−25％は排除した。というのは、そ
れらは全RNAから得られた放射性cDNAと強力にハブリダ
イズするからである。プレスクリーニングでハイブリダ
イズしなかった各選択実験からの25ないし50クローンか
らのプラスミドをさらなる分析のために単離した。その
ヒト物質としてのみの染色体13を含有するハムスターハ
イブリッド細胞系（GM10898A）の、出発クローンのDNA
の制限消化物への、およびヒトゲノムDNAへのハイブリ
ダイゼーションによって、回収cDNA断片が、個々の出発
ゲノムクローン起源であることが確認された。該クロー
ンは、暫定的に、ゲノムクローンの重複または非重複イ
ンターバルに基づいて群に帰属させた。テストしたクロ
ーンのうち、ほぼ85％は出発クローンに適切にマップさ
れた。
方法２（Lovettら、1991）;cDNA調製 ヒト乳腺、脳、リンパ球および胃からのポリ（Ａ）富
化RNAを、テールドランダムプライマーXN12 ［5'−（NH2）−GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNNNNN
N］（配列番号３） およびSuperscript II逆転写酵素（Gibco）用いて逆転
写した。第２鎖の合成および末端仕上げの後、Sepharos
e CL−4Bカラム（PharmaciaPh）でds cDNAを精製し
た。T4 DNAリガーゼを用いて、それらの5'末端（mRNA
に対して5'側）への、 ［5'−GAACAATGACGGCCGTTAGAATTCTACTCA−（NH2）
（配列番号５）］ にアニールされた二本鎖オリゴRP 5'−（NH2）−TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTGTTC（配
列番号４）］ の連結によって、DNAを「係留した」。係留されたcDNA
を、次いで、Sepharose CL−4Bカラム上で再度精製し
た。
選択 乳腺、脳、リンパ球および胃組織からのcDNAを、RP （RP.A:5'−TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCAT）（配列番号
５）および XPCR［5'−（PO4）−GTAGTGCAAGGCTCGAGAAC（配列番
号７）］ の入れ子バージョンを用いてまず増幅させ、Sepharose
CL−4B上での分画によって精製した。選択プローブは、
Hindf IおよびエキソヌクレアーゼIIIでの消化によって
精製P1、BACまたはPACから調製した。一本鎖プローブは
製造業者の推奨に従ってホトビオチン（Gibco BRL）で
光標識した。プローブ、cDNAおよびCot−１ DNAは2.4M
TEA−CL、10mM NaPO4、1mM EDTA中でハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイズしたcDNAをストレプトアビジ
ン−常磁性粒子（Dynal）上に捕獲し、溶出させ、RP［R
P.B;5'−（PO4）−TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTG（配列
番号８）］ およびXPCRのさらなる入れ子バージョンで再増幅させ、
Sepharose CL−6B上でサイズ選択した。選択し、増幅し
たcDNAをプローブおよびC0t−１ DNAのさらなるアリコ
ットとハイブリダイズさせた。捕獲し、溶出させた産物
をPR.BおよびXPCRで再度増幅し、ゲル電気泳動によって
サイズ選択し、脱リン酸化HInc II 切断pUC18にクロー
ン化した。連結産物をXL2−Blue超コンピテント細胞（S
tratagene）に形質転換した。
分析 各単一−プローブ選択実験からのほぼ192コロニー
を、ベクタープライマーを用いるコロニーPCRによって
増幅させ、二連にてZeta Probe ナイロンフィルター
（Bio−Rad）にブロットした。ランダム起点C0t−DNQA
またはプローブDNA（P1、BACまたはPAC）いずれかでの
標準的手法を用いて該フィルターをハイブリダイズさせ
た。プローブ−陽性C0t−１陰性クローンを、ABI 377
シーケンサー上でベクタープライマーを用いて両方向で
配列決定した。
エキソン トラッピング BAC、P1およびPACの最小重複セットを用いてエキソン
増幅を行って、BRCA2候補領域から多数の遺伝子を単離
した。１−３の重複ゲノムクローンの形態の100−300kb
のDNAを含有するゲノムクローンのプールを組立た。ゲ
ノムクローンをPst IまたはBamH I＋Bgl IIで消化し、p
SPL3スプライシングベクターのPst IまたはBamH I部位
に連結した。エキソン増幅技術を行い（Cheurchら、199
3）、Uracil DNA Glycosylateクローニングシステム（B
RL）からのpAMP1プラスミドにおいて末端産物をクロー
ン化した。ほぼ6000クローンを拾い、96ウェルプレート
で増殖させ、フィルターにスタンプし、ハイブリダイゼ
ーションによってベクターおよび反復配列の存在につき
分析した。各クローンインサートをPCR増幅し、エキソ
ンのグリッドへのハイブリダイゼーションおよび親ゲノ
ムDNAのドットブロットによって冗長度、位置決めおよ
びヒト特異性につきテストした。ユニーク候補エキソン
を配列決定し、データベースに対してサーチし、cDNAラ
イブラリーへのハイブリダイゼーションで使用した。
5'RACE ビオチン捕獲RACEと呼ばれる修飾されたRACEプロトコ
ルによってBRCA2の5'末端を同定した。ヒト乳腺および
胸腺からのポリ（Ａ）富化RNAを、テールドランダムプ
ライマーXN12 ［5'−（NH2）−GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNNNNNN
（配列番号３）］ およびSuperscript II逆転写酵素（Gibco BRL）を用い
て逆転写した。RNA鎖をNaOH中で加水分解し、Sepharose
CL−4B（Pharmacia）上の分画によって第１鎖cDNAを精
製した。T4 DNAリガーゼを用いて7bpランダム5'突出を
持つ二本鎖オリゴ ［ds UCA:5'−（PO4）−GTGACTAATCGATACGCGTGTGAAGGT
GA（配列番号10）］にアニールした5'−CCTTCACACGCGTA
TCGATTAGTCACNNNNNNN−（NH2）（配列番号９）］ のそれらの3'末端への連結によって第１鎖cDNAを「係
留」した。連結後、Sepharose CL−4B上の分画によって
係留cDNAを再度精製した。ビオチン化逆方向プライマー
［5'−（Ｂ）−TTGAAGAACAACAGGACTTTCACTA］（配列番
号11）およびUCAの入れ子バージョン［UCP.A:5'−CACCT
TCACACGCGTATCG（配列番号12）］を用いてBRCA2の5'末
端を増幅した。PCR産物をアガロースゲル上で分画し、
ゲル精製し、ストレプトアビジン−常磁性粒子（Dyna
l）上に捕獲した。捕獲cDNAを、入れ子逆方向プライマ
ー［5'−GTTCGTAATTGTTGTTTTTATGTTCAG］（配列番号1
3）およびUCAのさらなる入れ子バージョン［UCP.B 5'
−CCTTCACACGCGTATCGATTAG］（配列番号14）を用いて捕
獲cDNAを再度増幅した。このPCR反応はアガロースゲル
上の単一の鋭いバンドを与えた；該DNAをゲル精製し、A
BI 377シーケンサー上で両方向にて配列決定した。
cDNAクローン ヒトcDNAライブラリーを32P−標識ハイブリッド選択
またはエキソン捕獲クローンでスクリーニングした。三
次プラークから溶出したファージをベクター−特異的プ
ライマーてPCR増幅し、次いで、ABI 377シーケンサー
で配列決定した。
ノーザンブロット 多数のヒト組織から由来するポリ（Ａ）＋RNAのレー
ン当たり２μｇで負荷した多重組織ノーザン（MIN）フ
ィルターはClonetechから購入した。回収cDNA GT 713
（BRCA2エキソン３−７）、λ wCPF1B8.1（エンソン20
へのエキソン11の3'末端）、およびグルセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に対応する32P
−ランダム−プライマー標識プローブを用いてフィルタ
ーをプローブした。プレハイブリダイゼーションは、50
％ホルムアミド、５×SSPE、１％SDS、５×デンハルト
の混合物、0.2mg/ml変性サケ精巣DNAおよび２μg/ml
ポリ（Ａ）中、42℃におけるものであった。ハイブリダ
イゼーションは、４％までのデキストラン硫酸およびプ
ローブを添加した同一溶液中におけるものであった。ス
トリンジェンシー洗浄は、50℃における0.1×SSC/0.1％
SDS中におけるものであった。
RT−PCR分析 ５つのヒト乳癌細胞系（ZR−75−１、Ｔ−47D、MDA−
MB−231、MDA−MB468およびBT−20）および３つのヒト
前立腺癌細胞系（LNCaP、DU145およびPC−３）（Claude
Labrie博士、CHUL Research Centerによって供給され
たRNA）から抽出された全RNA10μｇは、プライマーmH20
−ID05＃RA ［5'TTTGGATCATTTTCACACTGTC］（配列番号15） およびSuperscript II逆転写酵素（Gibco BRL）を用い
て逆転写した。しかる後、プライマーCG026＃FB: ［5'−GTGCTCATAGTCAGAAATGAAG］（配列番号16）およ
びmH20−1D05＃RA（これは、エキソン11へのエキソン7/
8結合からの島ホップに対して用いたプライマー対であ
る;PCR産物は約1.55kbである）を用いて一本鎖cDNAを増
幅した。PCR産物は1.2％アガロースゲル上で分画した。
PCR増幅および突然変異スクリーニング BRCA2の全ての26コーディングエキソンおよびそれら
の関連するスプライス部位を、記載されているごとくに
ゲノムDNAから増幅した（Kambら、1994b）。プライマー
のDNA配列（そのうちいくつかは増幅および配列決定で
用いたフランキングイントロン配列に存在する）は表２
に出現する。エキソンのいくつかは（２ないし10、11−
５、11−６、11−７および23ないし27）は、単一工程方
法によって増幅した。これらのエキソンについてのPCR
条件は:95℃の単一の変性工程（１分間）;4サイクルの9
6℃（６秒間）、Ｔann.＝55℃（15秒間）、72℃（１分
間）であった。他のエキソン（11−22）は一次プラスマ
ーPCR反応後に入れ子再増幅を必要とした。これらのケ
ースにおいて、最初の増幅は前記したごとく表２の最初
の２欄におけるプライマーにて19サイクルで行った。こ
れらのエキソンについての入れ子再増幅は、表２の第３
欄に現れるプライマーにて同一条件において28または32
サイクルの間行った。緩衝液条件は記載されているもの
であった（Kambら、1994b）。Qiaexビーズ（Qiagen）を
用いて産物を0.8％アガロースゲルから精製した。精製
産物を、Ampli−CycleTM配列決定キット（Perkin Elme
r,Branchburg、NJ）を用いるα−P32 dATPでのサイク
ル配列決定によって分析した。６％ポリアクリルアミド
ゲル上で反応産物を分画した。全ての（Ａ）反応は相互
に隣接して負荷し、続いて（Ｃ）反応等を行った。多形
の検出は、肉眼で行い、他の鎖について確認した。
実施例４ BRCA2の同定 全長BRCA2配列の組立 増幅用の鋳型としてcDNAを用い、ハイブリッド選択、
エキソン捕獲、cDNAライブラリースクリーニング、ゲノ
ム配列決定、およびPCR実験から得られたいくつかのよ
り小さい配列を組み合せることによって、BRCA2Cの全長
配列を組立た（すなわち、「島ホッピング」）（図
２）。予測される翻訳スタート部位を含めたmRNAの極端
5'末端を、修飾された5'RACEプロトコルによって同定し
た（Stoneら、1995）。配列における最初のヌクレオチ
ド（ヌクレオチド１）は、非鋳型Ｇである（mRNAキャッ
プが当該配列に含まれる指標）。BRCA2 cDNAの内部に
位置したエキソンの１つ（エキソン11）はほぼ5kbであ
る。公開ドメイン（ftp://ゲノム、wustl.edu/pub/gscl
/brca）におけるおおまか900bkのゲノム配列の分析によ
って、エキソン11の一部を同定した。このゲノム配列
は、160配列contigの組に我々によって決定されたゲノ
ム配列と縮合させた。縮合ゲノム配列をオープンリーブ
ングフレーム（ORF）につき走査すると、長ORFにわたる
ほぼ6kbの隣接ストレッチが同定された。２つの従前に
同定されている候補遺伝子断片にての島ホッピング実験
によってこの配列を一緒に連結した。現行複合BRCA2 c
DNA配列は11,385bpからなるが、、ポリアデニル化シグ
ナルまたはポリ（Ａ）テールを含まない。このcDNA配列
を配列番号１および図３に示す。
BRCA2遺伝子およびBRCA2ポリペプチドの構造 cDNAの仮説翻訳は、ヌクレオチド229で始まり、3418
アミノ酸の予測蛋白質をコードするORFを明らかとし
た。該ペプチドは配列組成とは別の他の蛋白質に対する
識別できる同様性を担持しない。アミノ末端にはシグナ
ル配列はなく、明らかな膜貫通領域はない。BRCA1と同
様に、BRCA2蛋白質は大いに荷電している。残基のほぼ1
/4は酸性または塩基性であった。
cDNAおよびゲノム配列の比較によってBRCA2遺伝子構
造を決定した。BRCA2は、ほぼ70kbのゲノムDNAにわたっ
て分布した27エキソンからなる。上流に伸びるBRCA2の
5'末端におけるCpG−リッチ領域は、GpG「島」としばし
ば関連する調節シグナルの存在を示唆する。サザーンブ
ロット実験に基づくと、BRCA2Cはユニークであるらし
く、ヒトゲノムにおいて近いホモローグはない。
BRCA2の発現実験 ヒト複数組織ノーザンフィルターに対する標識cDNAの
ハイブリダイゼーションは、精巣のみで検出可能であっ
た11−12kb転写体を明らかとした。この転写体のサイズ
は、BRCA2 mRNA配列は我々の複合cDNAから失われたも
のはほとんどないことを示唆する。ノーザンフィルター
は乳腺RNAは含まないので、BRCA2 cDNAを用いるRT−PC
R実験は、５つの***および３つの前立腺癌細胞系RNAで
行った。全ての系は陽性シグナルを生じた。加えて、BR
CA2アンプリコン（１−BrCG206→5kb）および5'RACEのP
CRを用いて、増幅用の鋳型としての乳腺および胸腺cDNA
を比較した。両方の場合において、産物は胸腺からより
も***からより効率的に増幅した。
BRCA2における生殖系突然変異 18の推定BRCA2家系からの個体を、DNA配列決定分析に
よってBRCA2生殖系突然変異につきスクリーニングした
（Woosterら、1994）。12の家系は男性乳癌の少なくと
も１つのケースを有し、４つの家系は２以上のケースを
有し；および４つの家系は連鎖BRCA2ハプロタイプを有
する卵巣癌に罹患した少なくとも１つの個体を含む。18
家系の各々は、少なくとも69％のBRCA2突然変異を有す
る事後確率を有し、９つの家系は90％を超える事後確率
を有する。これらの組合せた確率に基くと、18家系のう
ち16は、BRCA2突然変異を分離すると予測される。cDNA
またはゲノムDNAを用い、９つの家系からの複数個体に
おいて、全コーディンク配列および関連するスプライス
結合を突然変異につきスクリーニンクした（表３）。残
存する９つの家系からの個体は、ゲノムDNAのみを用い
て突然変異につきスクリーニングした。これらの後者の
スクリーニング実験は、コーディング配列（エキソン15
を除く全てのエキソン）の99％およびスプライス結合の
２つの除く全てを含むものであった。
配列改変は18家系のうち９家系で同定された。１つを
除く全ては、リーディングフレームを改変するヌクレオ
チド欠失を含み、予測されたBRCA2蛋白質の切形に導
く。１つの例外は、３つのヌクレオチドの欠失を含有し
た（家系1019）。全ての９つの突然変異は相互に異なっ
た。
家系のサブセットは、転写体喪失につきテストした。
cDNA試料は９つの家系の群で入手可能であった、該群に
おける９つの家系のうち３つは、フレームシフト突然変
異を有した。ゲノムDNAでヘテロ接合性であることが知
られている特異的多形部位は、家系個体からのcDNAで調
べた。これらの多形部位におけるヘミ接合性の出現は、
mRNAレベルの減少に導く突然変異のための証拠と解釈さ
れた。検出可能な配列改変を持たない６ケースのうちた
だ１つ（家系2367）において、かかる調節突然変異が推
定された。加えて、フレームシフト突然変異を持つ３つ
の家系のうち１つ（家系2044）は、転写体喪失の徴候を
呈した。これは、BRCA2コーディング配列におけるいく
つかの突然変異は、蛋白質配列を破壊するに加えて、転
写体を脱安定化させる可能性があることを意味する。か
かる突然変異はBRCA1で観察されている（Friedmanら、1
995）。かくして、家系（10ないし18）の56％は、改変B
RCA2遺伝子を含有した。
癌におけるBRCA2の役割 現在までに同定されているほとんどの腫瘍サプレッサ
ー遺伝子は、機能が存在しない、非機能的または機能が
低下した蛋白質産物を生起する。TP53突然変異の大部分
はミスセンスであり；これらのうちのいくつかは、野生
型産物の機能に干渉する異常p53分子を生じることが示
されている（Shaulianら、19912;Srivastavaら、199
3）。作用の同様の優性陰性メカニズムは、切形分子を
生じるいくつかの腺腫ポリポシス・コリ（polyposis co
li）（APC）対立遺伝子（Suら、1993）、および蛋白質
のDNA結合を改変するWilm腫瘍遺伝子（WT1）における点
突然変異を提案している（Littleら、1993）。BRCA2コ
ーディング配列で観察された突然変異の性質は、優性陰
性蛋白質または非機能的蛋白質の産生に合致する。
実施例５ BRCA2遺伝子の分析 BRCA2遺伝子の構造および機能は、以下の方法に従っ
て決定した。
生物学的実験 BRCA2 cDNAを含有する哺乳動物発現ベクターを構築
し、当該遺伝子における病巣を持つ適当な***カルシノ
ーマ細胞にトランスフェクトした。野生型BRCA2 cDNA
ならびに改変BRCA2 cDNAを利用する。改変NRCA2 cDNA
は、改変BRCA2対立遺伝子から得ることができ、後記す
るごとくに生産した。培養における（例えば、細胞形
態、倍化時間、器壁依存性増殖）および動物における
（例えば、腫瘍原性）表現型復帰変異を調べる。該実験
は、当該遺伝子の野生型および突然変異体形態（セクシ
ョンＢ）を使用する。
分子遺伝学実験 イン・ビトロ突然変異誘発を行って、欠失突然変異体
およびミスセンス突然変異体を構築する（個体コドンに
おける単一塩基対置換およびクラスター荷電→アラニン
走査突然変異誘発による）。該突然変異体を生物学的、
生化学および生物物理学実験で使用する。
メカニズム実験 公知および未知DNA配列に結合するBRCA2蛋白質の能力
を調べる。プロモーターをトランス活性化するその能力
は、哺乳動物細胞における一過性レポーター発現系によ
って分析する。粒子−捕獲および酵母２−ハイブリッド
系のごとき常法手法を用いて、いずれかの機能的パート
ナーを見出し、同定する。パートナーの性質および機能
を特徴付ける。今度は、これらのパートナーは薬物発見
のための標的である。
構造実験 組換え蛋白質はイー・コリ、酵母、昆虫および／また
は哺乳動物細胞で産生させ、これを結晶学的およびNMR
実験で使用する。蛋白質の分子モデリングも使用する。
これらの実験は構造−駆動薬物設計を容易とする。
実施例６ 試料においてBRCA2の存在を検出するための２工程アッ
セイ Antonarakisら（1985）によって開示されている方法
に従って患者試料を加工し、１％アガロースゲルを通し
て分離し、サザーンブロット分析のためにナイロン膜に
移す。GS Gene Linker（Bio−Rad）を用い、150mJに
て、膜をUV架橋結合させる。図３に示した配列から選択
したBRCA2AプローブをpTZ18Uにサブクローンする。M13K
07ヘルパーファージ（Bio−Rad、リッチモンド、CA）で
感染させたイー・コリMV1190にファゲミド（phagemid）
を形質転換する。標準的な手法（Sambrookら、1989参
照）に従って一本鎖DNAを単離する。
0.5M NaPO4中の７％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
中で、65℃にて、ブロットを15−30分間プレハイブリダ
イズさせる。該方法に続いてNguyenら、1992に記載され
ている方法を行う。25−30ng/ml一本鎖標準プローブDNA
を含む７％ SDS、0.5M NaPO4中、65℃にて、ブロット
を一晩ハイブリダイズさせる。ポストハイブリダイゼー
ション洗浄は、65℃における５％SDS、40mM NaPO4中で
の２回の30分間洗浄、続いての１％SDS、40mM NaPO4中
での２回の30分間洗浄よりなるものであった。
次に、ブロットを室温にて５分間、リン酸緩衝生理食
塩水（pH6.8）ですすぎ、室温にて、30−60分間、PBS中
の0.2％カゼインと共に30−60分間インキュベートし、P
BS中で５分間すすぐ。次いで、6M尿素、0.3M NaClおよ
び５×デンハルト溶液よりなるハイブリダイゼーション
緩衝液にて、45℃の震盪水浴中、ブロットを５−10分間
プレインキュベートする（Sambrookら、1989）。緩衝液
を除去し、50−70μl/cm2の新鮮なハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液＋ユニバーサルプライマー部位（UP−AP、Bi
o−Rad）に相補的なヌクレオチド配列との2.5nM共有結
合架橋オリゴヌクレオチド−アルカリ性ホスファターゼ
コンジュゲートで置き換える。45℃にて、ブロットを20
−30分間ハイブリダイズさせ、45℃において、6M尿素、
１×標準生理食塩水クエン酸塩（SSC）、0.1％SDS中で
の２回の10分間の洗浄および１×SSC、0.1％トリトン
Ｘ−100中の１回の10分間の洗浄としてブロットをイン
キュベートする。ブロットを室温にて１×SSCで10分間
すすぐ。
0.1Mジエタノールアミン、1mM MgCl2、0.02％アジ化
ナトリウム、pH10.0からなる基質緩衝液中、震盪しつ
つ、ブロットを室温にて10分間インキュベートする。基
質緩衝液および0.2mM AMPPD（３−（2'−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（3'−ホスホリルオキ
シ）フェニル−1,2−ジオキセタン、二ナトリウム塩、B
io−Rad）を含むヒートシール可能バッグに個々のブロ
ットを入れる。震盪しつつ室温で20分間インキュベーシ
ョンした後、過剰のAMPPD溶液を除去する。ブロットを
Ｘ−線フィルムに一晩暴露する。陽性バンドはBRCA2の
存在を示す。
実施例７ BRCA2に対するポリクローナル抗体の作成 BRCA2コーディング配列のセグメントをイー・コリに
おいて融合蛋白質として発現させる。過剰発現蛋白質を
ゲル溶出によって精製し、これを用いて、Harlowおよび
Lane、1988によって記載されているものと同様の手法を
用いてウサギおよびマウスを免疫化する。この手法は、
種々の他の蛋白質に対してAbを生じることが示されてい
る（例えば、Kraemerら、1993参照）。
略言すると、図３で示される配列から選択したBRCA2
コーディング配列のストレッチを、プラスミドPET5Aに
おいて融合蛋白質としてクローン化する（Novagen,In
c.,マジソン、WI）。IPTGでの誘導の後、予測される分
子量を持つ融合蛋白質の過剰発現をSDS/PAGEによって確
認する。融合蛋白質を電気泳動によってゲルから精製す
る。Ｎ−末端における蛋白質配列決定によって、BRCA2
融合産物としての蛋白質の同定を確認する。次に、精製
蛋白質をウサギにおいて免疫源として使用する。フロイ
ントの完全アジュバント中、100μｇの蛋白質でウサギ
を免疫化し、最初フロイントの不完全アジュバント中の
免疫源100μｇ、続いてPBS中の免疫原源100μｇにて、
３週間間隔にて２回ブースター注射する。血清を含有す
る抗体をその後２週間収集する。
この手法を反復して、BRCA2遺伝子の突然変異体形態
に対する抗体を得る。野生型BRCA2に対する抗体と組み
合わせて、これらの抗体を用いて、種々の組織および生
物学的流体における突然変異体形態の存在および相対的
レベルを検出する。
実施例８ BRCA2に特異的なモノクローナル抗体の作成 モノクローナル抗体は以下のプロトコルに従って作成
する。良く知られているようにグルタルアルデヒドまた
はEDCを用いてキイホールリンペットヘモシアニンにコ
ンジュゲートさせた無傷BRCA2またはBRCA2ペプチド（野
生型および突然変異体）を含む免疫源でマウスで免疫化
する。
免疫源をアジュバントと混合する。各マウスには、10
ないし100μｇの免疫源の４回の注射を摂取させ、第４
回目の注射の後、血液試料をマウスから採取して、血清
が免疫源に対する抗体を含有するか否かを決定する。血
清力価はELISAまたはRIAによって測定する。免疫源に対
する抗体の存在を示す血清を持つマウスを、ハイブリド
ーマ産物につき選択する。
脾臓を免疫マウスから摘出し、単一細胞懸濁液を調製
する（HarlowおよびLane、1988参照）。細胞融合は、Ko
hlerおよびMilstein、1975によって実質的に記載されて
いるごとくに行う。略言すると、HarlowおよびLane、19
88に記載されているごとくにポリエチレングリコールを
用い、P3.65.3骨髄腫細胞（American Type Culture Col
lection,ロックビル、MD）を免疫脾臓細胞と融合させ
る。96ウェル培養プレート中、２×105細胞／ウェルの
密度にて細胞を平板培養する。個々のウェルを増殖につ
き調べ、野生型または突然変異体BRCA2標的蛋白質を用
い、ELISAまたはRIAによって、増殖したウェルの上清を
BRCA2特異的抗体の存在につきテストする。陽性ウェル
中の細胞を増殖させ、サブクローンしてモノクローナル
性を確立し、確認する。
所望の特異性を持つクローンを増殖させ、マウスにお
いて腹水としてまたは中空繊維系において生育させて、
特徴付けおよびアッセイ開発用の十分量の抗体を得る。
実施例９ BRCA2についてのサンドイッチアッセイ プレート、チューブ、ビーズまたは粒子のごとき個体
表面にモノクローナル抗体を付着させる。好ましくは、
抗体を96−ウェルELISAプレートのウェル表面に付着さ
せる。BRCA2ペプチド／蛋白質（野生型または突然変異
体）を含有する100μｌ試料（例えば、血清、尿、組織
サイトゾル）を固相抗体に添加する。試料を室温で２時
間インキュベートする。次に、試料流体をデカントし、
固相を緩衝液で洗浄して未結合物質を除去する。（BRCA
2ペプチド／蛋白質上の抗原決定基に対する）第２のモ
ノクローナル抗体100μｌを固相に添加する。この抗体
をディテクター分子（例えば、125I、酵素、蛍光体また
は色原体）で標識し、第２抗体を持つ固相を室温で２時
間インキュベートする。第２の抗体をデカントし、固相
を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。
試料に存在するBRCA2ペプチド／蛋白質の量に比例す
る結合標識の量を定量する。野生型BRCA2に特異的なモ
ノクローナル抗体ならびにBRCA2で同定された突然変異
の各々に特異的なモノクローナル抗体を用いて別のアッ
セイを行う。
実施例10 乳癌に罹患したアシケナズユダヤ人婦人に共通な6174de
lT突然変異 6174delT突然変異（表３参照）は、乳癌を有するアシ
ケナズユダヤ人婦人の多くの場合に存在することが判明
している（Neuhausenら、1996）。＃発端者の２群は、
この実験についての確認よりなるものであった。最初の
群は開始の年齢および陽性家族履歴両者に基づいて確認
した。最初の群は、乳癌の家族履歴の有り無しを問わず
41歳以前に乳癌に罹患した発端者よりなるものであっ
た。第２の群に含ませる基準は、発端者が、50歳以下で
乳癌または卵巣癌に罹患した１人以上の一親等親族がい
る41および51歳の間の乳癌に罹患しているもの；あるい
は発端者が、50歳以前に乳癌または卵巣癌に罹患した２
人以上の二親等親族がいる41および51歳の間の乳癌に罹
患していること；あるいは発端者が、一次乳癌および一
次卵巣癌双方を持つ41および51歳の間で罹患しているこ
とであった。発端者は、医療腫瘍学および遺伝子カウン
セリングクリニックを介して確認し、全ての適当な患者
に研究参画を供するように努力した。家族履歴は、自己
−報告アンケートによって得た。診断の組織学的確認
は、全てのケースにおいて発端者につき得た。宗教的背
景は、自己報告またはインタビューによって全ての発端
者に対して確認した。
突然変異検出 BRCA2 6174delT突然変異は、標準的ポリメラーゼ鎖反
応（PCR）手法（Saikiら、1985;Mullisら、1986;Weber
およびMay,1989）に従い、各患者からのゲノムDNAを増
幅することによって検出した。PCRで使用したプライマ
ーは、 BC11−RP:GGGAAGCTTCATAAGTCAGTC（配列番号:115）
（順方向プライマー）および BC11−LP:TTTGTAATGAAGCATCTGATACC（配列番号:116）
（逆方向プライマー） である。反応は、20ng DNAを含有する10.0μｌの合計
容量で行い、55℃でアニールした。この手法は、野生型
試料において97bp長さの、6174delT突然変異が存在する
場合は96bpの長さのPCR産物を生じる。放射性標識PCR産
物は、65Wにて２時間、標準６％ポリアクリルアミド変
性配列決定ゲル上の電気泳動に付した。次いで、ゲルを
乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。1bp欠失を
呈する全てのケースを配列決定して、6174delT突然変異
を確認した。配列決定では、試料の半分を１組のPCRプ
ライマーで増幅し、コーディング鎖を配列決定し、試料
の他の半分は第２組のPCRプライマーで増幅し、非コー
ディング鎖を配列決定した。１の組のPCRプライマー
は、 TD−SFB:AATGATGAATGTAGCACGC（配列番号:117）（順
方向プライマー）および CGORF−RH:GTCTGAATGTTCGTTACT（配列番号:118）（逆
方向プライマー） であった。この結果、野生型において342bpの、6174del
T突然変異を含有する試料につき341bpの増幅産物が得ら
れた。この組の試料については、配列決定プライマーの
ためのCGORF−RHプライマーを用い、増幅DNAを配列決定
した。試料の他の半分は、BC11−RP順方向プライマーお
よびCGORF−RH逆方向プライマーを用いて増幅し、野生
型試料で183bpの、6174delT突然変異を含有する試料で1
82bpの断片が得られた。これを、配列決定プライマーと
してBC11−RPを用いて配列決定した。
結果 42歳前の乳癌を持つアシケナズユダヤ人家系の18人の
婦人の内６人は6174delT突然変異を有していた。これ
は、42歳前に乳癌を有した非ユダヤ人婦人の対照群に突
然変異が存在するゼロケースに匹敵する。これらのケー
スは、家族履歴に関することなく確認された。表４は、
研究の結果を示す。6174delT突然変異を持つ６つのケー
スのうち４つは、一親等または二親等親族において乳癌
または卵巣癌の家族履歴を有していた。複数試料が分析
のために入手可能である２つの各家系において、6174de
lT突然変異は乳癌または卵巣癌の２以上のケースと共分
離した。42−50歳で乳癌を持ち、および乳癌または卵巣
癌に罹患した少なくとも１つのさらなる親族の履歴をつ
27人のアシケナジムの第２のコホートは、6174delT突然
変異の頻度のさらなる見積もりを供した。27人婦人のこ
の群において、２人はBRCA2 6174delT突然変異につき
ヘテロ接合性であった。これらの個体のうち１人は、卵
巣癌および乳癌を共に持つ一親等親族を有していた。示
されたデータより、およびBRCA2突然変異（Offitら、19
96;Langstonら、1996）と同様の浸透度を仮定し、アシ
ケナジムにおける6174delT突然変異の頻度は1000人当た
りほぼ３人であると見積もることができる。しかしなが
ら、もしこの突然変異の浸透度がBRCA1よりも低いと、
この突然変異の頻度はより高いであろう。アシケナズユ
ダヤ人家系の個体における6174delT突然変異のキャリア
頻度のより正確な見積もりは、大規模な集団研究から出
現するであろう。
実施例11 BRCA2は、***癌腫ならびに卵巣癌および膵臓癌を含
めた他の癌における低体細胞突然変異率を示す。
BRCA2は腫瘍サプレッサー遺伝子である。この遺伝子
のホモ接合欠失は乳癌ならびに他の癌に至り得る。膵臓
異種移植片におけるホモ接合欠失は、ポジショナルクロ
ーニングによってBRCA2を単離する努力において役立
つ。もし１つのBRCA2対立遺伝子の欠如および残りの対
立遺伝子における突然変異（ヘテロ接合性またはLOHの
喪失）があると、癌の結果となり得る。また、両対立遺
伝子における突然変異は、癌の進展に至り得る。ここに
研究のために、異なる癌に由来する150細胞系の分析
は、BRCA2遺伝子のホモ接合喪失であるケースを明らか
としなかった。ホモ接合性喪失が明らかに稀であるゆえ
に、BRCA2における点突然変異のごときより小さい病巣
を実験するように研究を行った。複合突然変異体ヘテロ
接合体および突然変異体ホモ接合体は稀であるので、腫
瘍サプレッサー遺伝子不活化はほとんど常にLOHを含
む。残りの対立遺伝子は、もし不活性であると、典型的
には、破壊的突然変異を含有する。これらを同定するた
めには、注目する遺伝子座においてLOHを呈する腫瘍ま
たは細胞系を予備選択するのが有用である。
LOHを呈する腫瘍および細胞系の同定 104の一次***腫瘍試料の群および269の細胞系の組
を、BRCA2領域におけるLOHにつきテストした。一次腫瘍
については、蛍光を用いて３つの短いタンデムリピート
マーカー（STR）を定量的に比較した。蛍光的にタッグ
を付したSTRの以下の３つの組： （１）mM4247.4A.2F1 ACCATCAAACACATCATCC（配列番
号:119） mM4247.4A.2R2 AGAAAGTAACTTGGAGGGAG（配列番号:12
0） （２）STR257−FC CTCCTGAAACTGTTCCCTTGG（配列番号:
1.21） STR257−RD TAATGGTGCTGGGATATTTGG（配列番号:12
2） （３）mMB561A−3.1FA2 GAATGTCGAAGAGCTTGTC（配列番
号:123） mMB561A−3.1RB AAACATACGCTTAGCCAGAC（Ｇ配列番
号:124） でのPCRによって、ほぼ10ngのゲノムDNAを増幅した。AB
I 377シーケンサーを用いてPCR産物を解像し、Genesca
nソフトウェア（ABI）で定量した。腫瘍については、正
常および腫瘍試料から増幅した対立遺伝子の間の明瞭な
ピーク高差異は、LOHを有するものとしてスコア取りし
た。細胞系については、もし１つのSTRがヘテロ接合性
であると、試料は非−LOHとしてスコア取りした。１つ
のケースにおいてのみ、単一塩基多形の後になっての分
析に基づいて誤って呼ばれた細胞系または腫瘍があっ
た。マーカーについてのヘテロ接合性指標は:STR4247＝
0.89;STR257＝0.72;STR561A＝0.88である（S.Neuhause
n、私信;B.Swedlund,未公開データ）。それらの組み合
わせたヘテロ接合性指標に基づいて、マーカーが特定の
個人（連鎖平衡を仮定）において全てホモ接合性である
チャンスは、250のうち１に過ぎない。一次腫瘍試料に
おける正常細胞の存在のため、LOHは、専ら、腫瘍で喪
失した対立遺伝子からのシグナルをほとんど排除しな
い。むしろ、２つの対立遺伝子の相対的強度は改変され
る。これは、正常組織からの対立遺伝子ピーク高を腫瘍
からのピーク高と比較することによって明瞭に観察でき
る（図5A−5D）。この分析に基づいて、30腫瘍（29％）
はBRCA2遺伝子座においてLOHを有するものとして分類さ
れた（図５）。従前の見積もりと同様の図（Collins
ら、1995;Cleton−Jansenら、1995）。
LOHは、異なる方法で、細胞系の組で評価された。全
ての３つのSTRのホモ接合性は不確定であり、かつ正常
細胞は存在しないので、全てのSTRにおける見掛けのホ
モ接合性はBRCA2領域におけるLOHとして解釈された。こ
の基準を用い、細胞系の85/269はLOHを呈した（表
５）。頻度は、考慮した特定の腫瘍細胞型に従って変化
した。例えば、4/6卵巣細胞系および31/62肺癌細胞系
は、17/81メラノーマ系および2/11乳癌細胞系と比較し
て、LOHを呈した。
LOH一次***腫瘍および細胞系の配列分析 BRCA2領域でLOHを示した前記にて同定した30の一次乳
癌は、配列変異体のためのDNA配列分析によってスクリ
ーニングした。95％を超えるコーディング配列およびス
プライス接合を調べた。DNA配列決定は、ABI 377（App
lied Biosystems Division,Perkin−Elmer）で、または
手動で行った。放射性活性突然変異スクリーニングで
は、Qiagenビーズ（Qiagen,Inc.）によって増幅産物を
精製した。DNA配列は、Cyclist配列決定キット（Strata
gene）を用いて生じさせ、６％ポリアクリルアミドゲル
で解像した。平行して、TaqFS配列決定キットを用い、
蛍光標識色素を用いる非放射性配列決定を行い、続いて
ABI 377シーケンサーで電気泳動を行った。試料を96−
ウェルトレイに格子状に入れて、PCRおよび配列決定を
容易とした。特定のPCRおよび配列決定反応の脱落は、
＞95％適用範囲が各試料で得られるまで反復した。配列
情報は、Sequencherソフトウェア（Gene Codes Corpora
tion）で分析した。全ての検出された突然変異は、新し
く増幅したPCR産物を配列決定することによって確認し
て、配列改変がPCR人工物による可能性排除した。
セルラインおよび原発性乳癌のLOH分析 パーセンテー
ジLOHは２つの方法：合計およびパーセンテージの平均
（平均）として算出した 30試料のうち、２つの検体はフレームシフト突然変異
を、１つはナンセンス突然変異を、および２つはミスセ
ンス変化を含んでいた（が、これらの腫瘍のうち１つは
フレームシフトも含んでいた）。ナンセンス突然変異
は、Ｃ−末端で156コドンを欠失し、これは、BRCA2のＣ
−末端が腫瘍サプレッサー活性で重要であることを示唆
する。また、全ての配列変異体はこれらの癌キャリアか
らの対応する正常DNAで存在した。LOHについての予備選
択が突然変異検出に対する全体的偏り（例えば、突然変
異の優性挙動、複合ヘテロ接合性）を導入するというあ
りそうにない可能性を排除するために、BRCA2において
ヘテロ接合性であることが示されている12試料もスクリ
ーニングした。これらのうち３つは、正常試料でも見出
されるミスセンス変化を明らかとした。かくして、42乳
癌腫試料の組において（そのうち30はBRCA2遺伝子座でL
OHを呈した）、体細胞突然変異は同定されなかった。フ
レームシフト突然変異およびナンセンス変化は、これら
の患者において乳癌の進展に影響する病気素因突然変異
であるらしい。ミスセンス変異体は稀であり；それらは
115の染色体の分析の間に、各々、１回観察されたに過
ぎなかった。これらのデータから、稀な中性多形および
病気素因突然変異を区別するのは不可能である。
LOHを呈した85の細胞系のうち（表５参照）58は配列
変化についてもスクリーニングした。各試料の95％を超
えるコーディング配列をスクリーニングした。たった一
つのフレームシフト突然変異が、このDNA配列分析によ
って同定された。この突然変異（6174delT）は膵臓癌細
胞系に存在し、BT111一次腫瘍試料で見出されたもの、
および従前に検出された生殖系フレームシフト（Tavtig
ianら、1996）と同一である。これは、この特定のフレ
ームシフトが比較的普通の生殖系BRCA2突然変異である
らしいことを示唆する。加えて、多数のミスセンス配列
変異体が検出された（表6Aおよび6B）。
膵臓腫瘍細胞系における可能な生殖系BRCA2突然変異
の検出は、BRCA2突然変異が膵臓癌の病気素因であり得
ることを示唆する（徹底的には究明されていない確
率）。また、この突然変異は、膵臓異種移植片で観察さ
れたホモ接合性欠失によって従前に示唆されている（Sh
utteら、1995）、散発性膵臓癌におけるBRCA2の関与に
重きを加える。３つの膵臓細胞系のみが我々の研究で調
べられたので、膵臓癌におけるBRCA2突然変異のさらな
る調査が正当化される。
生殖系突然変異がBRCA2中で同定された リストはBRCA2
のGenbankエントリーに基く突然変異ポジションである
（Schutteら,1995） 共通多形およびサイレント置換はDNA配列決定によってB
RCA2中に検出した。幾つかの稀なサイレント変異型が遺
伝子機能に影響し得るため（例えば、スプライシング
（RichardおよびBeckmann,1995））、これらは「PM」に
先行させていない。示した多形の頻度には第２のヌクレ
オチド対が含まれる。以前の実験で報告された頻度を括
弧内に示す（Tavtigianら,1996）。数字付けは表6Aと同
様である。
産業上の利用性 前記したごとく、本発明は、個体のBRCA2対立遺伝子
をテストするのに使用される物質および方法ならびに該
対立遺伝子の正常または病気素因性質の解釈を提供す
る。正常危険性よりも高い個体は、適当には、それらの
ライフスタイルを修飾し得る。BRCA2の場合では、ほと
んどの有意な非遺伝的危険因子は早期全期間妊娠の保護
効果である。従って、危険な婦人は早期子供獲得または
設計された療法が早期全期間妊娠のホルモン効果を刺激
すると考慮し得る。高危険度の婦人は、早期検出を努力
し、***自己検査を習い実行することが大いに動機付け
られる。かかる婦人は、生規の***造影図を得るよう大
いに動機付けられ、一般集団よりも早い年齢で恐らくは
開始するであろう。より高い頻度にて卵巣スクリーニン
グがなされ得る。BRCA2遺伝子座の配列分析に基づく診
断方法は、腫瘍検出および分類に適用し得る。配列分析
を用いて、前駆体病巣を診断し得る。該方法の進歩およ
びBRCA2および他の原因遺伝子座についての情報の蓄積
により、癌を良性および悪性に別けることが可能とな
る。
乳癌を持つ婦人は、もしそれらが病気素因であり、従
って、それらが病気素因でないというよりむしろ、さら
なる癌を有するかも知れなければ、外科手法に従うこと
ができる。ペプチドまたは小さな分子（合理的薬物デザ
イン）いずれかを用い、他の療法を開発し得る。ペプチ
ドは、ミスセンス遺伝子産物それ自体またはミスセンス
遺伝子産物の一部であり得る。別法として、治療剤は、
有害遺伝子機能を模擬するもう１つの分子、または受け
継いだ遺伝子座の有害効果に逆作用することを求めるペ
プチドまたは非ペプチド分子であり得る。また、療法
は、有害対立遺伝子の効果に逆作用する蛋白質を作成さ
せるために、正常BRCA2対立遺伝子を個体に導入するこ
とを介する、遺伝子ベースのものであり得る。これらの
遺伝子療法は、多くの形態を取ることができ、腫瘍が形
成されるのを妨げる、一旦癌が発生したらそれを治癒す
る、あるいは癌が転移するのを停止させることに向ける
ことができる。
本発明の方法および組成物は、種々の具体例の形態で
一体化することができ、そのうちのいくつかここに開示
したにすぎないことは理解されるであろう。他の具体例
が存在し、本発明の精神を逸脱しないことは当業者に明
らかであろう。かくして、記載した具体例は例示的なも
ので、限定的なものと解釈されるべきではない。
配 列 表 （１）一般情報： （ｉ）出願人:Myriad Genetics,Inc. The Trustees of the University
of Pennsylvania Endo Recherche,Inc. HSC Research ＆ Development Lim
ited Partnership （ii）発明の名称：第13染色体連鎖−乳癌感受性遺伝
子 （iii）配列の数:124 （iv）通信住所： （Ａ）受信人:Venable,Baetjer,Howard ＆ Civil
etti （Ｂ）通り:1201 New York Avenue N.Y.,Suite
1001 （Ｃ）都市:Washington （Ｄ）州:D.C. （Ｅ）国籍:USA （Ｆ）郵便番号:22204 （ｖ）コンピュータ判読形態： （Ａ）媒質型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC compatible （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS−/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウエア:Word for Windows 6.0 （vi）最新出願データ： （Ａ）出願番号:WO （Ｂ）出願日:1996年12月27日 （Ｃ）分類： （viii）代理事務所／出願人情報： （Ａ）氏名:Ihnen,Jeffrey L. （Ｂ）登録番号:28,957 （Ｃ）参照／ファイル番号:24884−116802−WO （ix）電信電話通信情報： （Ａ）電話番号:202−962−4810 （Ｂ）ファックス番号:202−962−8300 （２）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:11385塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）存在位置:299..10482 （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:3418アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:32塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／キー:misc_feature （Ｂ）存在位置:1..2 （Ｄ）他の情報:/note＝“（NH2）at Nucleotide
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33" （xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号:10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:29塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明:/desc＝“primer" （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト（Homo sapiens） （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／キー:misc_feature （Ｂ）存在位置:1..2 （Ｄ）他の情報:/note＝“（PO4）at nucleotide
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ０８／５７６，５５９ (32)優先日 平成７年12月21日(1995．12．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／５８５，３９１ (32)優先日 平成８年１月11日(1996．1．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／６３９，５０１ (32)優先日 平成８年４月29日(1996．4．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 早期審査対象出願 前置審査 (73)特許権者 501478311 エイチエスシー リサーチ アンド デ ヴェロップメント リミテッド パート ナーシップ カナダ国 エム５ジー １エックス８ オンタリオ トロント，ユニバーシティ ー アヴェニュー 555 (73)特許権者 598009810 アンドルシェルシュ・インコーポレイテ ッド ＥＮＤＯＲＥＣＨＥＲＣＨＥ， ＩＮ Ｃ. カナダ、ジィ・１・ダブリュ ２・ジェ イ・５ ケベック州、サン−フォワ、ド ゥ・ラ・プロムナード、2989 (72)発明者 タブティジャン，ショーン・ブイ アメリカ合衆国84103ユタ州ソルト・レ イク・シティ、イースト・ファースト・ アベニュー・ナンバー３、557番 (72)発明者 カンブ，アレキサンダー アメリカ合衆国84102ユタ州ソルト・レ イク・シティ、イースト・600・サウス 1103番 (72)発明者 シマール，ジャック カナダ、ジー３エイ・１ゼット９、ケベ ック、サン・オギュスタン・ドゥ・デス ムーレ、ピレ4808番 (72)発明者 コーチ，ファーガス アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州 セント・デイビッズ、アイベン・アベニ ュー・ナンバー２ビー、250番 (72)発明者 ロメンス，ヨハンナ・エム カナダ、エム５ティ・２エックス４、オ ンタリオ、トロント、マッコール・スト リート105番 (72)発明者 ウェーバー，バーバラ・エル アメリカ合衆国19066ペンシルベニア州 メリオン、モールウィッド・ロード331 番 (56)参考文献 国際公開97／019110（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号:2記載のアミノ酸配列を含むBRCA
    2ポリペプチドをコードするcDNAまたは対応するRNAを含
    む単離された核酸。
  2. 【請求項２】（ｉ）配列番号:1記載のヌクレオチド配列
    または対応するRNA、および （ii）配列番号:1のヌクレオチド229〜10482を含むヌク
    レオチド配列または対応するRNA よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求
    項１記載の単離された核酸。
  3. 【請求項３】配列番号:1記載のヌクレオチド配列の突然
    変異形態、または 乳癌への素因と関連する配列番号:1のヌクレオチド229
    〜10482を含むヌクレオチド配列の突然変異形態を含むD
    NAであって、ここに、該突然変異形態が、配列番号:1に
    参照して規定する以下： （ａ）ヌクレオチドポジション277および278のACが欠失
    し；もしくは （ｂ）ポジション982〜985の４個のヌクレオチドが欠失
    し；もしくは （ｃ）ポジション4706〜4709の４個のヌクレオチドが欠
    失し；もしくは （ｄ）ヌクレオチドポジション8525のＣが欠失し；もし
    くは （ｅ）ポジション9254〜9258の５個のヌクレオチドが欠
    失し；もしくは （ｆ）ヌクレオチドポジション4075および4076のGTが欠
    失し；もしくは （ｇ）ポジション999〜1003の５個のヌクレオチドが欠
    失し；もしくは （ｈ）ヌクレオチドポジション6174のＴが欠失し；もし
    くは （ｉ）ポジション4132〜4134の３個のヌクレオチドが欠
    失しているの突然変異のうちの１から選択される単離さ
    れた核酸。
  4. 【請求項４】（ａ）請求項１ないし３のいずれか１記載
    の単離された核酸を含むベクター；および （ｂ）請求項１ないし３のいずれか１記載の単離された
    核酸を含み、ここに該核酸が該ベクターについての宿主
    細胞中の該核酸の発現を指示することができるプロモー
    ター配列に作動可能に連結されているベクター よりなる群から選択されるベクター。
  5. 【請求項５】請求項４記載のベクターで形質転換された
    宿主細胞。
  6. 【請求項６】請求項１ないし３のいずれか１記載の単離
    された核酸によってコードされるポリペプチドの産生方
    法であって、（ｉ）該ポリペプチドの産生に適した条件
    下にて該ポリペプチドをコードする発現ベクターを含有
    する請求項５記載の宿主細胞を培養し；次いで、 （ii）該ポリペプチドを回収することを特徴とする該方
    法。
  7. 【請求項７】さらに、回収したポリペプチドを標識する
    ことを特徴とする請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】さらに、請求項３記載の突然変異形態を含
    む請求項３記載の核酸の少なくとも15個の隣接するヌク
    レオチドを含む単離された核酸。
  9. 【請求項９】（ａ）配列番号:2記載のアミノ酸配列を含
    むポリペプチド； （ｂ）請求項３記載の核酸の発現によって得ることがで
    きる突然変異ヒトBRCA2ポリペプチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを含有
    する融合蛋白質 よりなる群から選択される他のヒト蛋白質を実質的に含
    んでいない単離されたポリペプチド。
  10. 【請求項１０】該ポリペプチドが標識された請求項９記
    載の単離されたポリペプチド。
  11. 【請求項１１】抗体産生用の免疫原としての請求項９記
    載のポリペプチドの使用。
  12. 【請求項１２】１以上の抗体生成物が実質的に標識され
    ているか、または固体支持体に結合されている請求項11
    記載の使用。
  13. 【請求項１３】予想される突然変異体BRCA2対立遺伝子
    のヌクレオチド配列と、野生型BRCA2ヌクレオチド配列
    とを比較することからなり、ここに、予想される突然変
    異配列と野生型配列との間の相異により突然変異体BRCA
    2ヌクレオチド配列を同定し、ここに、該野生型BRCA2配
    列は、配列番号:1のヌクレオチド229〜10482またはその
    対立遺伝子変異型を含むことを特徴とする乳癌への素因
    に関連する予想される突然変異体BRCA2対立遺伝子中の
    突然変異体BRCA2ヌクレオチド配列の同定方法。
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