DE69632870T2

DE69632870T2 - Nachweis von melanomenmetastasen unter verwendung eines mehrfachmarker-tests

Info

Publication number: DE69632870T2
Application number: DE69632870T
Authority: DE
Inventors: S. Dave HOON; Fukashi Doi; J. Andrew CONRAD; Peter Schmid
Original assignee: NAT GENETICS INST CULVER CITY; John Wayne Cancer Institute; National Genetics Institute
Current assignee: NAT GENETICS INST CULVER CITY; John Wayne Cancer Institute; National Genetics Institute
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-13
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-03-14
Also published as: EP0871768B1; ATE270712T1; EP1505159B1; AU5310296A; DE69637552D1; DE69632870D1; US6057105A; EP0871768A1; ATE397097T1; WO1996029430A1; EP1505159A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein Teil der in dieser Anmeldung beschriebenen Arbeit wurde unter der Bewilligungsnummer PO1 CA1038 vom National Cancer Institute gestützt.
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der krebsdiagnostischen Verfahrenstechniken. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf den Nachweis genetischer Marker, die auf Melanom- oder Brustkrebszellen hindeuten. In einem Beispiel wird der Nachweis multipler Marker durch den Polymerase-Ketten-Reaktionstest erlangt.
2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets
Maligne Tumoren sind eine der Hauptkrankheitsursachen und verantwortlich für jährlich 526.000 Tote in den Vereinigten Staaten (Boring et al., 1993). Zum Beispiel ist Brustkrebs die meistverbreitete Form einer bösartigen Erkrankung bei Frauen in westlichen Ländern, und in den Vereinigten Staaten ist sie die meistverbreitete Todesursache bei Frauen im Alter zwischen 40 und 55 Jahren (Forrest, 1990). Das maligne Melanom ist eine andere Krebsform, deren Auftreten mit erschreckender Geschwindigkeit zunimmt, wenigstens um das Sechsfache in den Vereinigten Staaten seit 1945, und ist die einzige aller Hautkrankheiten, die meist tödlich ist (Fitzpatrick, 1986).
Einer der verheerendsten Aspekte von Krebs ist die Neigung von Zellen aus malignen Neoplasmen, von der Primärlokalisierung zu entfernten Organen zu streuen und sich zu Metastasen zu entwickeln. Trotz Fortschritten in der chirurgischen Behandlung primärer Neoplasmen und trotz aggressiver Therapien sterben die meisten Krebspatienten infolge Metastasierung. Tierversuche zeigen an, dass ca. 0,01% der zirkulierenden Tumorzellen aus soliden Tumoren erfolgreich Metastasenabsiedlungen bilden (Fidler, 1993).
Daher ist der Nachweis okkulter Krebszellen im Kreislauf wichtig bei der Beurteilung des Grades der Tumorprogression und Metastasierung. Da eine Metastasierung ohne klinische Symptome sich viele Jahre lang still verhalten kann, kann sich das Kontrollieren des Blutes der Patienten auf zirkulierende Tumorzellen als vorteilhaft zum Nachweis einer Tumorprogression erweisen, bevor eine Metastasierung zu anderen Organen stattfindet. Die Beurteilung zirkulierender Tumorzellen würde ferner ein schnelles Kontrollsystem bereitstellen, um zu bestimmen, ob eine spezifische Therapie wirksam ist.
Zum Beispiel hat sich die Erkennung von Metastasen in Tumor-Filterlymphknoten (TDLN) nun als kritisch bei der Patientenversorgung erwiesen. Es ist bekannt, dass 25–30% der Brustkrebspatienten mit örtlich beschränkter Erkrankung und negativem Lymphknoten innerhalb von fünf Jahren nach dem operativen Eingriff einen Rückfall erleiden (Henderson et al, 1989). Ein genaues TDLN-Staging der Achsellymphknoten bei der Erfassung von Metastasen ist ein wichtiger Faktor bei der Auswahl von Patienten für eine adjuvante Therapie gewesen (NIH, 1992; Giuliano et al., 1995; Giuliano et al., 1994). Mehrere retrospektive Studien über Brustkrebs-TDLN zeigten auf, dass bei der Analyse multipler Knotenschnitte, die sich als tumornegativ darstellten, okkulte Metastasen gefunden wurden (Bettelheim et al., 1990; Chen et al., 1991; Neville et al., 1991). Bei der Identifizierung von Knoten mit okkulten Metastasen zeigte sich eine signifikante Wechselbeziehung zu einer schlechteren Prognose (Bettelheim et al., 1990; Neville et al., 1991).
Frühere Tumor-Diagnoseverfahrenstechniken haben sich auf den Nachweis tumorassoziierter Antigene oder auf von Tumorzellen freigesetzte Moleküle konzentriert (Smart, 1990; Moertel et al., 1993; Stamey et al., 1989). Diese Tests weisen bestenfalls nur Tumoren ohne Hinweis auf metastatisches Potential oder Tumorprogression nach. Außerdem werten solche Tests ein einzelnes Antigen aus, dessen Freisetzung oft proportional zur Größe des Tumors ist, und sie können die Heterogenität individueller Marker in Tumorläsionen nicht erklären, weder beim individuellen Patienten noch bei Patientengruppen.
Die kürzliche Entwicklung des PCR-Assays (Mullis und Faloona, 1987; Erlich, 1989) zum Nachweis okkulter metastatischer Tumorzellen im Blut unter Verwendung spezifischer Marker hat einen neuen Weg zur Beurteilung der Tumorprogression bereitgestellt (Smith et al., 1991; Naito et al., 1991). In einer Studie wurden zirkulierende Melanomzellen im Blut durch PCR-Analyse unter Verwendung des Tyrosinase-Genmarkers nachgewiesen (Smith et al., 1991). Sieben Melanompatienten mit Metastasierung wurden untersucht, aber nur vier waren positiv. Andere Studien unter Verwendung der PCR sind zum Nachweis zirkulierender Tumorzellen bei Melanom- sowie Brust-, Prostata- und Neuroblastom-Krebspatienten verwendet worden (Smith et al., 1991; Datta et al., 1994; Moreno et al., 1992; Naito et al., 1991). Eine andere Studie ist in der EP 0 520 794 beschrieben, die Verfahren zum Nachweis von Karzinommetastasen durch Nukleinsäure-Amplifikation offenbart. Unter Anderem wird ein Verfahren zur Identifizierung einer karzinomassoziierten RNA-Sequenz bereitgestellt, die als Krebsmarker zum Nachweis von Karzinommetastasen in Körpergeweben oder -flüssigkeiten geeignet ist. Es werden unterschiedliche spezielle, spezifische Marker bereitgestellt. Diese Studien, bei denen ein einziger Marker verwendet wird, waren begrenzt durch ihre Fähigkeit, Tumorzellen von normalen Zellen zu unterscheiden, die den Marker ebenfalls tragen, wodurch Spezifität und Zuverlässigkeit vermindert wurden. Außerdem hat die Tumorheterogenität dort Empfindlichkeitsprobleme verursacht, wo ein einziger spezifischer Marker verwendet wurde.
Wie oben angedeutet, sind Tumoren bekanntermaßen heterogen, insbesondere in fortgeschrittenen Stadien der Tumorprogression (Morton et al., 1993; Fidler und Hart, 1982; Nowell, 1982; Elder et al., 1989; Bystryn et al., 1985). Obwohl Tumorzellen innerhalb eines Primärtumors oder der Metastasierung alle dasselbe Markergen exprimieren können, kann der Grad der spezifischen mRNA-Expression erheblich variieren (Elder et al., 1989). Es ist daher notwendig, ein Nachweissystem zu entwickeln, das solchen heterogenen Zielen gewachsen ist.
Daher können diese Marker trotz der Identifizierung von Melanomamarkern Tumorzellen nicht auf eine hochspezifische und empfindliche Art und Weise individuell nachweisen. Dies ist auf die breite phänotypische Verschiedenartigkeit zurückzuführen, die in Tumorzellen zu jedem einzelnen Zeitpunkt und während der Krankheitsdifferenzierung zu finden ist. Es besteht weiterhin ein Bedarf, eine hochverfeinerte Methode zu entwickeln, die eine biologisch-heterogene Situation bewältigen kann, um Metastasierung und diagnostisches Krankheitsstadium sensitiv und spezifisch nachzuweisen.
3. Wesen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung versucht, diese und andere dem Stand der Technik innewohnenden Nachteile durch Bereitstellung empfindlicher und genauer Verfahren zum Nachweis von Melanomzellen in einer biologischen Probe zu beseitigen.
Zuerst wird ein Verfahren zum Nachweisen melanomaspezifischer mRNA-positiver Zellen in einem Patienten bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Eine Nukleinsäure wird aus einer biologischen Probe eines Patienten isoliert, wobei die Nukleinsäure mRNA enthält. Nukleinsäureziele werden, sofern vorhanden, aus einem Satz von Melanomamarker-Genen amplifiziert, der Tyrosinase, MART-1 und MAGE-3 einschließt. Als dritter Schritt wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäurezielen nachgewiesen. Das Vorliegen eines oder mehr amplifizierter Melanomamarker-Nukleinsäureziele indiziert das Vorhandensein von melanomaspezifischen mRNA-positiven Zellen bei diesem Patienten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin einen Schritt des Revers-Transkribierens der mRNA in cDNA. Dieser weitere Schritt wird zwischen den Isolierungsschritt und den Amplifizierungsschritt eingeschoben.
Des Weiteren wird eine Verwendung des Verfahrens zur Kennzeichnung einer Tumorbiopsie-Probe eines Melanomapatienten präsentiert. Die Verwendung umfasst die folgenden Schritte: Zuerst wird mRNA aus der Tumorbiopsie-Probe isoliert und die mRNA ggf. in cDNA revers transkribiert. Danach wird die cDNA mit Polymerase-Ketten-Reaktion unter Verwendung von wenigstens zwei Primerpaaren amplifiziert, wobei jedes Primerpaar komplementär ist zu einem separaten Bereich eines Melanomamarker-Nukleinsäurezieles, sofern vorhanden, aus einem Satz von Melanomamarker-Genen, der Tyrosinase, MART-1 und MAGE-3 einschließt. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäurezielen wird nachgewiesen. Das Vorliegen amplifizierter Melanomamarker-Nukleinsäureziele erzeugt ein Profil des Patiententumors.
Ferner wird eine Verwendung des Verfahrens zum Nachweisen von okkulten metastatischen Melanomzellen bei einem Patienten bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Zuerst wird RNA aus einer biologischen Probe des Patienten isoliert und ggf. in cDNA revers transkribiert. Dann wird die cDNA mit Polymerase-Ketten-Reaktion unter Verwendung von wenigstens zwei Primerpaaren amplifiziert, wobei jedes Primerpaar komplementär ist zu einem separaten Bereich eines Melanomamarker-Nukleinsäurezieles, sofern vorhanden, aus einem Satz von Melanomamarker-Genen, der Tyrosinase, MART-1 und MAGE-3 einschließt. Schließlich wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäurezielen nachgewiesen, wobei das Vorliegen von einem oder mehreren Melanomamarker-Nukleinsäurezielen die Melanoma-Mikrometastasen indiziert.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die biologische Probe ein Körpergewebe oder eine Körperflüssigkeit. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Körpergewebe Knochenmarksaspirat, Knochenmarksbiopsie, Lymphknotenaspirat, Lymphknotenbiopsie, Milzgewebe, Feinnadelaspirat, Hautbiopsie oder Organgewebebiopsie. Andere Ausführungsformen schließen Proben ein, wo die Körperflüssigkeit peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Aszites, seröse Flüssigkeit, pleurale Flüssigkeit, Sputum, zerebrospinale Flüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl oder Urin ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe menschlichen Ursprungs.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung schließt das Verfahren das Separieren des Amplifikationsproduktes durch Gel-Elektrophorese ein. In anderen Ausführungsformen erfolgt das Separierungsverfahren durch chromatographische Techniken. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gestattet Hybridisierung mit einer markierten Probe die Identifizierung des Amplifikationsproduktes im Anschluss an das Separieren.
4. Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft einen empfindlichen Multimarkertest zum Nachweisen okkulter Melanomzellen im Blut von Patienten mit oder ohne klinische Krankheitszeichen. Dieser Test ist dazu gedacht, Beschränkungen in vorhandenen Technologien sowohl hinsichtlich Empfindlichkeit als auch Spezifität zu beseitigen.
In ihrer allgemeinsten Form umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Melanomzellen in einer biologischen Probe durch Amplifizieren und Nachweisen von Nukleinsäuren entsprechend Melanomzellmarkern. Die biologische Probe kann jedes Gewebe oder jede Flüssigkeit sein, in denen Melanomzellen vorhanden sein könnten. Bevorzugte Ausführungsformen schließen Knochenmarksaspirat, Knochenmarksbiopsie, Lymphknotenaspirat, Lymphknotenbiopsie, Milzgewebe, Feinnadelaspirat, Hautbiopsie oder Organgewebebiopsie ein. Andere Ausführungsformen schließen Proben ein, wo die Körperflüssigkeit peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Aszites, seröse Flüssigkeit, pleurale Flüssigkeit, Sputum, zerebrospinale Flüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl oder Urin ist.
Als Matrize zur Amplifizierung verwendete Nukleinsäure wird gemäß Standardmethodologie aus Zellen isoliert, die in der biologischen Probe enthalten sind. (Sambrook et al., 1989). Die Nukleinsäure kann genomische DNA oder fraktionierte oder Ganzzellen-RNA sein. Wo RNA verwendet wird, kann es erwünscht sein, die RNA in eine komplementäre cDNA umzuwandeln. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die RNA Ganzzellen-RNA und wird direkt als Matrize zur Amplifizierung verwendet.
Primerpaare, die selektiv zu Genen entsprechend spezifischen Markern hybridisieren, werden unter Bedingungen mit der isolierten Nukleinsäure kontaktiert, die selektive Hybridisierung gestatten. Wenn sie einmal hybridisiert sind, wird der Nukleinsäure/Primer-Komplex mit einem oder mehr Enzymen kontaktiert, die matrizenabhängige Nukleinsäuresynthese erleichtern. Multiple Amplifizierungsrunden, auch als "Zyklen" bezeichnet, werden durchgeführt, bis eine ausreichende Amplifikationsproduktmenge erzeugt ist.
Als Nächstes wird das Amplifikationsprodukt nachgewiesen. In bestimmten Anwendungen wird der Nachweis durch visuelle Mittel durchgeführt. Alternativ kann der Nachweis indirekte Identifizierung des Produktes via Chemilumineszenz, radioaktive Szintigraphie mit inkorporierter Markierung mit radioaktiven Atomen oder Fluoreszenzmarkierung oder sogar über ein System mit Verwendung von elektrischen oder Wärmeimpulssignalen einbeziehen (Affymax Technology, Bellus, 1994).
Das vorstehende Verfahren wird wenigstens zweimal an einer gegebenen Probe durchgeführt, wobei wenigstens zwei unterschiedliche Primerpaare verwendet werden, die für zwei unterschiedliche spezifische Marker spezifisch sind. Im Anschluss an den Nachweis können die bei einem gegebenen Patienten gesehenen Ergebnisse mit einer statistisch signifikanten Vergleichsgruppe von normalen Patienten und Melanomapatienten verglichen werden. Auf diese Weise ist es möglich, die Anzahl und Art der Marker mit verschiedenen klinischen Zuständen zu korrelieren.
(i) Melanomaspezifische Marker
Ein Marker, wie er hierin verwendet wird, ist ein beliebiges proteinisches Molekül (oder entsprechendes Gen), dessen Produktion oder fehlende Produktion charakteristisch für eine Melanomzelle ist. Abhängig von dem speziellen Satz von Markern, der in einer gegebenen Analyse verwendet wird, wird die statistische Analyse variieren. Wo beispielsweise eine spezielle Markerkombination hochspezifisch für Melanome ist, wird die statistische Bedeutung eines positiven Ergebnisses hoch sein. Es kann jedoch sein, dass diese Spezifität auf Kosten der Empfindlichkeit erlangt wird, d. h. selbst bei Vorhandensein eines Melanoms kann ein negatives Ergebnis vorkommen. Aus dem gleichen Grund kann eine unterschiedliche Kombination sehr sensitiv sein, d. h. wenig falsch negativ, aber mit niedrigerer Spezifität.
Wenn neue Marker identifiziert werden, können unterschiedliche Kombinationen entwickelt werden, die optimale Wirksamkeit bei unterschiedlichen ethnischen Gruppen oder Geschlechtern, unterschiedlichen geographischen Verteilungen, unterschiedlichen Krankheitsstufen, unterschiedlichen Spezifitätsgraden oder unterschiedlichen Graden an Empfindlichkeit zeigen. Ferner können Markerkombinationen entwickelt werden, die besonders empfindlich für Auswirkungen therapeutischer Vorschriften bei Krankheitsfortschritt sind. Patienten können nach Operation, Hyperthermie, Immuntherapie, Cytokintherapie, Gentherapie, Radiotherapie oder Chemotherapie beobachtet werden, um zu bestimmen, ob eine spezifische Behandlung wirksam ist.
Eine besonders nützliche Kombination für die Verwendung bei einem Verfahren gemäß Anspruch 9 ist Tyrosinase und p97. Human-Tyrosinase ist ein wesentliches Enzym, das die Produktion von Melanin steuert (Nordlund et al., 1989; Hoon et al., 1993), eine Gruppe brauner oder schwarzer Pigmente in der Haut und den Augen von Menschen. Genauer gesagt, katalysiert Tyrosinase die Konversion von Tyrosin zu Dopa und von Dopa zu Dopaquinon p97, auch bekannt als Melanotransferrin, ist ein Zelloberflächen-Sialoglycoprotein, das gewisse Sequenzhomologie zu Transferrin trägt (Brown et al., 1981; Rose et al., 1986). Ebenso wie Transferrin bindet p97 Eisen, um hierdurch im Eisenstoffwechsel eingebunden zu sein.
Es gibt viele andere Marker, die in Kombination mit jenen und weiteren Markern verwendet werden können. Ein Beispiel ist β-Human-Choriongonadotropin (β-HCG). β-HCG wird von trophoblastischen Zellen der Placenta schwangerer Frauen erzeugt und ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft in den frühen Stadien (Pierce et al., 1981; Talmadge et al., 1984). Von β-HCG ist bekannt, dass es von trophoblastischen oder Keimzellen entstammenden Tumoren erzeugt wird, wie Chorionkarzinom- oder Hodenkarzinomzellen (Madersbacher et al., 1994; Cole et al., 1983). Ferner wurde ektopische Expression von β-HCG durch eine Anzahl unterschiedlicher Immuntests in verschiedenen, nicht-gonadalen Tumoren, wie in Brust, Lunge, Magen, Kolon und Pancreas etc. nachgewiesen. (McManus et al., 1976; Yoshimura et al., 1994; Yamaguchi et al., 1989; Marcillac et al., 1992; Alfthan et al., 1992). Obwohl die Funktion der β-HCG-Produktion in diesen Tumoren noch unbekannt ist, legt es die atavistische Expression von β-HCG durch Tumorzellen und nicht von normalen Zellen nicht-gonadaler Herkunft nahe, dass es potentiell ein guter Marker beim Nachweis von Melanomen sein könnte (Tormey et al., 1977; Tormey et al., 1975).
Ein weiteres exemplarisches Beispiel eines Markers ist Glycosyltransferase β-1, 4-N-acetylgalactosaminyltransferase (GalNAc). GalNAc katalysiert die Übertragung von N-acetylgalactosamin durch β1,4-Verbindungen auf beiden Gangliosiden GM3 und GD3, um GM2 bzw. GD2 zu erzeugen (Nagata et al., 1992; Furukawa et al., 1993). Es katalysiert ferner die Übertragung von N-acetylgalactosamin an andere Karbohydratmoleküle, wie Muzine. Gangliosiden sind Glycosphingolipide, die Sialinsäuren enthalten, welche eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Anhaftung und malignen Umwandlung von Zellen spielen. In Melanomen wird die GM2- und GD2-Gangliosiden-Expression oft auf sehr hohe Pegel verstärkt und mit Tumorprogression einschließlich metastatischer Tumore verbunden (Hoon et al., 1989; Ando et al., 1987; Carubia et al., 1984; Tsuchida et al., 1987a). Die Gangliosiden GM2 und GD2 sind bei Menschen immunogen und können als ein Ziel für spezifische Immuntherapie wie als monoklonale Antikörper beim Menschen oder Krebsimpfstoffe verwendet werden (Tsuchida et al., 1987b; Irie, 1985).
GalNAc-mRNA kann als ein Marker von GM2- und GD2-Expression verwendet werden und folglich als ein Marker für Melanomzellen. GalNAc wird allgemein in normalen Lymphozyten, Epithelialzellen, Melanozyten, Verbindungsgewebe oder Lymphknotenzellen nicht exprimiert. Wenn es nachgewiesen wird, ist dies auf sehr geringen Pegeln.
Weitere mit der vorliegenden Erfindung beabsichtigte Marker umfassen cytolytische T-Lymphozyten-(CTL-)Ziele. MAGE-3 ist ein in Melanomzellen identifizierter Marker. MAGE-3 wird in vielen Melanomen sowie anderen Tumoren exprimiert und ist ein (CTL)Ziel (Gaugler et al., 1994). MAGE-1 und MAGE-2 sind andere Mitglieder der MAGE-Genfamilie. Die MAGE-1-Gensequenz zeigt 73% Übereinstimmung mit MAGE-3 und exprimiert ein Antigen, das ferner durch CTL erkannt wird (Gaugler et al., 1994). MART-1 ist ein anderes potentielles CTL-Ziel (Robbins et al., 1994) und kann auch in die vorliegende Erfindung eingeschlossen sein.
MUC18 ist ein weiterer Marker, der bei der Identifizierung von Melanomzellen nützlich ist (Lehmann et al., 1989; Lehmann et al., 1987). MUC18 ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein, das ein Teil der Immunglobulin-Obergruppe ist und Sequenzhomologie zu Neuralzellen-Adhäsionsmolekülen (NCAM) aufweist. Weitere Muzinfamilienmitglieder umfassen MUC1, MUC2, MUC3 und MUC4. Für diese wurde gefunden, dass sie in bestimmten Tumorzelllinien mit hohen Pegeln exprimiert werden (Hollingsworth et al., 1994) und auch als Marker in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Andere Mitglieder der Immunglobulin-Obergruppe von Adhäsionsmolekülen, die mit der Entwicklung von Melanomen-Metastasierung verbunden sind (Denton et al., 1992) können in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden. Bevorzugte Beispiele umfassen interzelluläre Adhäsionsmoleküle-1 (ICAM-1), NCAM, VCAM-1 und ELAM. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung schließt Zelladhäsionsmoleküle ein, die mit anderen Metastasierungen, wie carcinoembryonales Antigen (CEA) und DCC (gelöscht in Colorektalkrebs) verbunden sind (Johnson, 1991).
Weitere mit Brust- oder Hautkrebs assoziierte Proteine und ihre entsprechenden Nukleinsäuren können in der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Bevorzugte Beispiele umfassen das Melanomantigen gp75 (Vijayasardahi et al., 1990), Humancytokeratin 8 (HKer 8) (Pittman et al., 1993), ein Melanomantigen mit hohem Molekulargewicht (Natali et al., 1987) und Keratin 19 (K19) (Datta et al., 1994).
Andere Proteine und ihre entsprechenden Nukleinsäuren, die mit dem Melaninsynthesepfad gekoppelt sind, können als Marker verwendet werden, wie z. B. Tyrosinase-bezogenes Protein 1 und 2 und Mitglieder der pMel 17 Genfamilie (Kwon et al., 1993).
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beziehen viele unterschiedliche Kombinationen von Markern zum Nachweis von Melanomzellen ein. Jeglicher Marker, der auf Neoplasie in Melanozyten hindeutet, kann bei dieser Erfindung eingesetzt werden. Bevorzugte Ausführungsformen umfassen jedoch Kombinationen von Tyrosinase, MAGE-3, MUC18, p97, β-HCG, GalNAc und MAGE-1. Die hierin gezeigte Tabelle 1 stellt nützliche Kombinationen von Markern, die zum Nachweis von Melanomzellen verwendet werden können teilweise dar. Tabelle 1: Bevorzugte Mehrfachmarker-Kombinationen Tabelle 1A: Kombinationen von sechs oder sieben Mehrfachmarkern
Tabelle 1B: Kombinationen von fünf Mehrfachmarkern
Tabelle 1C: Kombinationen von vier Mehrfachmarkern
Tabelle 1D: Kombinationen von drei Mehrfachmarkern
Tabelle 1E: Kombinationen von zwei Mehrfachmarkern

+: Marker in der Kombination enthalten;
–: Marker nicht enthalten

(ii) Primer
Der hierin definierte Begriff "Primer" soll jegliche Nukleinsäure umfassen, die zur Primeranlagerung bei der Synthese einer ursprünglichen Nukleinsäure in einem matrizenabhängigen Verfahren geeignet ist. Typischerweise sind Primer Oligonucleotide von zehn bis zwanzig Basenpaaren Länge, aber es können auch längere Sequenzen verwendet werden. Primer können in doppelsträngiger oder einzelsträngiger Form vorliegen, obwohl die einzelsträngige Form bevorzugt ist.
In den meisten Fällen wird bevorzugt werden, erwünschte Oligonucleotide zu synthetisieren. Geeignete Primer können unter Verwendung handelsüblicher Synthetisierer wie solche, die von Applied Biosystems (Foster City, CA) geliefert werden, synthetisiert werden, wobei dem Durchschnittsfachmann wohl bekannte Verfahren angewandt werden. Wo doppelsträngige Primer gewünscht werden, wird die Synthese komplementärer Primer separat durchgeführt und die Primer unter Bedingungen gemischt, die ihre Hybridisierung erlauben.
Die Auswahl der Primer basiert auf einer Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, abhängig vom Verfahren der Amplifizierung und des verwendeten spezifischen Markers. Zum Beispiel wird die Wahl des Primers die Spezifität der Amplifizierungsreaktion bestimmen. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Markernukleinsäure spezifisch zu hybridisieren und um die Synthese von Amplifikationsprodukten in der Anwesenheit des Polymerisationmittlers und unter entsprechenden Temperaturbedingungen zu gestatten. Kürzere Primermoleküle erfordern allgemein kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Markernukleinsäure zu bilden und können eine nicht-spezifische Hybridisierung und Amplifizierung befürchten lassen.
Primersequenzen müssen nicht genau zur spezifischen Markersequenz passen. Nicht-komplementäre Nucleotidfragmente können am 5'-Ende des Primers mit dem Rest der Primersequenz angelagert werden, die komplementär zur Matrize ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen im Primer zwischengeschaltet sein, vorausgesetzt dass die Primersequenz, insbesondere am 3'-Ende, ausreichend komplementär mit der Matrize ist, um anzulagern und die Synthese eines komplementären DNA-Strangs zu bewerkstelligen und zu gestatten.
In bevorzugten Ausführungsformen können Primer dazu ausgelegt sein, spezifische Bereiche der Marker-Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Zum Beispiel sind GC-reiche Bereiche bevorzugt, da sie stärkere Hybridisierungskomplexe als AT-reiche Bereiche bilden. Bei einem anderen Beispiel sind Primer dazu gedacht, allein mit wenigstens einem Intron dazwischen, an ein Paar von Exonsequenzen zu hybridisieren. Dies erlaubt hinsichtlich der Aktivität eines Markergens, nachgewiesen zu werden, im Gegensatz zu seiner Anwesenheit durch Minimierung von Hintergrundamplifizierung der genomischen Sequenzen und unterscheidet die Zielamplifizierung einfach durch Größe.
Primer können ferner dazu ausgelegt sein, ein spezielles Segment der Markernukleinsäure zu amplifizieren, das Beschränkungsstellen kodiert. Eine Beschränkungsstelle im endgültigen Amplifikationsprodukt würde das Aufschließen an jener speziellen Stelle durch das relevante Beschränkungsenzym erlauben, um zwei Produkte einer spezifischen Größe herzustellen. Jegliches Beschränkungsenzym kann in dieser Hinsicht verwendet werden. Diese zusätzliche Verfeinerung des Amplifizierungsverfahrens kann beim Amplifizieren einer Markernukleinsäuresequenz mit enger Sequenzähnlichkeit zu anderen Nukleinsäuren notwendig werden. Alternativ kann es als eine zusätzliche Bestätigung der Spezifität des Amplifikationsprodukts angewendet werden.
(iii) Musterabhängige Amplifikationsverfahren
Ein Anzahl von muster- bzw. matrizenabhängigen Verfahren ist verfügbar, um die in einer vorgegebenen Matrizenprobe vorhandenen Markersequenzen zu amplifizieren. Eines der bekanntesten Amplifizierungsverfahren ist die Polymerase-Ketten-Reaktion (bezeichnet als PCR), welche im Detail in den US-Patenten No. 4,683,195; 4,683,202 und 4,800,159, sowie in Innis et al., 1990 beschrieben ist. Kurz gesagt, werden bei der PCR zwei Primersequenzen vorbereitet, die komplementär zu Bereichen auf entgegengesetzt komplementären Strängen der Markersequenz sind. Ein Überschuss an Deoxynucleosid-Triphosphaten wird einem Reaktionsgemisch zugefügt, zusammen mit einer DNA-Polymerase, z. B. Taq-Polymerase. Wenn die Markersequenz in einer Probe vorhanden ist, werden sich die Primer an den Marker binden und die Polymerase wird die Primer veranlassen, sich entlang der Markersequenz durch Anlagern an Nukleotiden zu erstrecken. Durch Erhöhen und Absenken der Temperatur des Reaktionsgemisches spalten sich dann die verlängerten Primer von dem Marker ab und bilden Reaktionsprodukte, überschüssige Primer binden an den Marker und die Reaktionsprodukte, und der Vorgang wird wiederholt. Vorzugsweise kann ein Revers-Transkriptase-PCR-Amplifizierungsverfahren durchgeführt werden, um den amplifizierten mRNA-Anteil zu quantifizieren. Verfahren zur reversen Transkriptase von RNA in cDNA sind hinlänglich bekannt und in Sambrock et al., 1989 beschrieben. Alternativ verwenden bevorzugte Verfahren zur Umkehrtranskription thermostabile DNA-Polymerasen. Diese Verfahren sind in der WO 90/07641 beschrieben, eingereicht am 21. Dezember 1990. Polymerase-Ketten-Reaktion-Verfahrenstechniken sind auf diesem Fachgebiet hinlänglich bekannt.
Ein anderes Verfahren zur Amplifizierung ist die Ligase-Ketten-Reaktion ("LCR"), offenbart in EP 0 320 308 . In der LCR werden zwei komplementäre Probenpaare hergestellt, und in Anwesenheit der Markersequenz wird jedes Paar derart an entgegengesetzt komplementäre Stränge des Markers binden, dass es daran anliegt. Bei Vorliegen einer Ligase verbinden sich die zwei Probenpaare dann und bilden eine einzige Einheit. Durch Temperatur-Cycling wie in der PCR werden sich gebundene ligierte Einheiten von dem Marker abspalten und dienen dann als "Zielsequenz" zur Ligation überschüssiger Probenpaare. Das US-Patent Nr. 4,883,750 beschreibt ein ähnliches Verfahren wie LCR zum Binden von Probenpaaren an eine Markersequenz.
Qbeta-Replikase, beschrieben in der PCT-Anmeldung PCT/US87/00880, kann ferner als noch ein anderes Amplifizierungsverfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die einen komplementären Bereich zu dem eines Markers aufweist, einer Probe in Anwesenheit einer RNA-Polymerase zugefügt. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, die dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermes Amplifizierungsverfahren, in dem Restriktionsendonucleasen und -ligasen verwendet werden, um die Amplifizierung von Markermolekülen zu erreichen, die Nucleotid 5'-[alpha-thio]-triphosphate in einem Strang eines Restriktionsortes enthalten, kann bei der Amplifizierung von Nukleinsäuren in der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich sein (Walker et al., 1992).
Strangverdrängungsamplifizierung (SDA) ist ein anderes Verfahren zur Ausführung der isothermen Amplifizierung von Nukleinsäuren, das mehrfache Durchgänge der Strangverdrängung und -synthese beinhaltet, d. h. Nick-Translation. Ein ähnliches Verfahren, Reparatur-Ketten-Reaktion (RCR) genannt, beinhaltet die Doppelstrangbildung mehrerer Proben über einen Amplifizierungszielbereich hinweg, gefolgt von einer Reparaturreaktion, bei der nur zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen beiden Basen können zum leichten Nachweis als biotinylierte Derivate zugefügt werden. Eine ähnliche Methode wird bei der SDA verwendet. Markerspezifische Sequenzen können auch unter Verwendung einer zyklischen Probenreaktion (CPR) nachgewiesen werden. In der CPR wird eine Probe mit einer 3'- und 5'-Sequenz von unspezifischer DNA und einer Mittelsequenz von spezifischer RNA zu DNA hybridisiert, die in einer Probe vorliegt. Bei der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt und die Produkte der Probe als charakteristische Produkte identifiziert, die nach dem Aufschließen freigesetzt werden. Die Originalmatrize wird mit einer anderen im Kreislauf befindlichen Probe verbunden und die Reaktion wiederholt.
Noch andere Amplifizierungsverfahren, beschrieben in der britischen Patentanmeldung Nr. 2,202,328 und in der PCT-Anmeldung PCT/US89/01025, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der früheren Anmeldung werden "modifizierte" Primer in einer PCR-ähnlichen matrizen- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markieren mit einem Einfanganteil (z. B. Biotin) und/oder einem Detektoranteil (z. B. Enzym) modifiziert werden. In der letzteren Anmeldung wird ein Überschuss markierter Proben einer Substanzprobe zugefügt. In Anwesenheit der Markersequenz bindet die Probe und wird katalytisch abgespalten. Nach der Abspaltung wird die Markersequenz intakt freigesetzt, um durch die Überschussprobe gebunden zu werden. Die Abspaltung der markierten Probe signalisiert das Vorhandensein der Markersequenz.
Andere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren schließen Amplifizierungssysteme auf Transkriptionsbasis (TAS) einschließlich Amplifizierung auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA) und 3SR ein (Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., PCT-Anmeldung WO 88/10315). Bei der NASBA können die Nukleinsäuren durch Standard-Phenol/Chloroform-Extraktion, Wärmedenaturierung einer klinischen Substanzprobe, Behandlung mit Lysepufferlösung und Minispinsäulen zur Isolierung von DNA und RNA oder Guanidiniumchloridextraktion von RNA zur Amplifizierung präpariert werden. Diese Amplifizierungstechniken beinhalten die Doppelstrangbildung eines Primers, der markerspezifische Sequenzen aufweist. Im Anschluss an die Polymerisation werden die DNA/RNA-Hybride mit RNase H aufgeschlossen, während die Doppelstrang-DNA-Moleküle erneut wärmedenaturiert werden. In jedem Fall wird die Einzelstrang-DNA durch Zufügen eines zweiten markerspezifischen Primers, gefolgt von Polymerisation, zu einem kompletten Doppelstrang hergestellt. Die Doppelstrang-DNA-Moleküle werden dann durch eine Polymerase wie z. B. T7 oder SP6 mehrfach transkribiert. In einer isothermen zyklischen Reaktion werden die RNAs zu einer Doppelstrang-DNA revers transkribiert und mit einer Polymerase wie z. B. T7 oder SP6 noch einmal transkribiert. Die resultierenden Produkte, ob beschnitten oder vollständig, indizieren markerspezifische Sequenzen.
Die EP 0 329 822 von Davey et al., offenbart ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, das zyklisches Synthetisieren von Einzelstrang-RNA ("ssRNA"), ssDNA und Doppelstrang-DNA (dsDNA) beinhaltet, welches in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist eine erste Matrize für ein erstes Primer-Oligonucleotid, das durch Revers-Transkriptase verlängert wird (RNA-abhängige DNA-Polymerase). Die RNA wird dann durch die Wirkung von Ribonuclease H (RNase H, eine für RNA im Doppelstrang mit entweder DNA oder RNA spezifische RNase) aus dem resultierenden DNA:RNA-Doppelstrang entfernt. Die resultierende ssDNA ist eine zweite Matrize für einen zweiten Primer, der ferner die Sequenzen eines RNA-Polymerasepromotors (beispielhaft gezeigt durch T7 RNA-Polymerase) 5' zu seiner Homologie mit der Matrize einschließt. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase verlängert (beispielhaft gezeigt durch das große "Klenow"-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I) und geht daraus hervor als Doppelstrang-DNA-("dsDNA"-)Molekül mit einer Sequenz, die identisch mit derjenigen der Original-RNA zwischen den Primern ist und mit zusätzlich einer Promotorsequenz an einem Ende. Diese Promotorsequenz kann durch die entsprechende RNA-Polymerase zur Herstellung vieler RNA-Kopien der DNA verwendet werden. Diese Kopien können dann wieder in den Zyklus eintreten, was zu einer sehr raschen Amplifizierung führt. Mit der richtigen Enzymwahl kann diese Amplifizierung isotherm ohne Zusatz von Enzymen bei jedem Zyklus erfolgen. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Prozesses kann die Startersequenz so gewählt werden, dass sie in Form von entweder DNA oder RNA vorliegt.
Die PCT-Anmeldung WO 89/06700 von Miller et al. offenbart ein Nukleinsäuresequenz-Amplifizierungsschema basierend auf der Hybridisierung einer Promotor/Primer-Sequenz zu einer Marker-Einzelstrang-DNA ("ssDNA") gefolgt von einer Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, d. h. aus den resultierenden RNA-Transkripten werden keine neuen Matrizen erzeugt. Andere Amplifizierungsverfahren schließen "RACE" und "einseitige PCR" ein (Frobman, M. A., 1990 und Ohara et al., 1989).
Im Amplifizierungsschritt der vorliegenden Erfindung können ferner Verfahren verwendet werden, die auf der Ligation von zwei (oder mehr) Oligonucleotiden in Anwesenheit von Nukleinsäure basieren, die die Sequenz des resultierenden "Dioligonucleotids" aufweist, wodurch das Dioligonucleotid amplifiziert wird; Wu et al., 1989.
(iv) Separierungsverfahren
Im Anschluss an die Amplifizierung kann es erwünscht sein, das Amplifikationsprodukt von der Matrize und dem Überschussprimer zu separieren, um zu bestimmen, ob eine spezifische Amplifizierung stattgefunden hat. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Amplifikationsprodukte unter Verwendung von Standardverfahren durch Agarose-, Agarose-Acrylamid- oder Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese separiert (siehe Sambrook et al., 1989). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gel ein 2%iges Agarosegel.
Alternativ können chromatographische Techniken verwendet werden, um die Separierung zu bewirken. Es gibt viele Arten von Chromatographie, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch und Molekularsieb, und viele spezialisierte Verfahrenstechniken zu deren Verwendung, darunter Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie (Freifelder, 1982).
(v) Identifizierungsverfahren
Amplifikationsprodukte müssen visualisiert werden, um die Amplifizierung der Markersequenzen zu bestätigen. Ein typisches Visualisierungsverfahren bezieht das Färben eines Gels mit Ethidiumbromid und die Sichtbarmachung unter UV-Licht ein. Wenn alternativ die Amplifikationsprodukte ganz mit Nucleotiden, die mit radioaktiven Atomen markiert sind, oder mit fluorimetrisch markierten Nucleotiden markiert sind, können die Amplifikationsprodukte dann im Anschluss an die Separierung auf Röntgenfilm belichtet oder unter den geeigneten Erregungsspektren sichtbar gemacht werden.
Alternativ kann das Separieren unnötig sein. Diese Verfahren können gesammelt als Sequencing By Hybridization oder SBH [Sequenzieren durch Hybridisierung oder SBH] bezeichnet werden (Cantor et al., 1992; Drmanac & Crkvenjakov, US-Patent Nr. 5,202,231). Die Entwicklung bestimmter dieser Verfahren hat neue trägerfixierte Sequenzierungsinstrumente entstehen lassen, die als Sequenzierungschips bekannt sind. Der Nutzen von SBH im Allgemeinen ist durch die Tatsache bewiesen, dass US-Patente auf diese Technologie erteilt worden sind.
SBH kann auf zwei grundlegende Arten durchgeführt werden, die oft als Format 1 und Format 2 bezeichnet werden (Cantor et al., 1992). Im Format 1 werden Oligonucleotide mit unbekannter Sequenz, allgemein von ca. 100–1000 Nucleotiden Länge, auf einem festen Träger oder Filter angeordnet, so dass die unbekannten Proben selbst immobilisiert werden (Strezoska et al., 1991; Drmanac & Crkvenjakov, US-Patent Nr. 5,202,231). Repliken der Anordnung werden dann durch Hybridisierung mit Sätzen von markierten Proben von ca. 6 bis 8 Resten Länge untersucht.
Im Format 2 wird ein Sequenzierungschip aus einer Anordnung von Oligonucleotiden mit bekannten Sequenzen von ca. 6 bis 8 Resten Länge geformt (Southern, WO 89/10977; Khrapko et al., 1991; Southern et al., 1992). Die Nukleinsäuren mit unbekannter Sequenz werden dann markiert und zu den trägerfixierten Oligos hybridisieren gelassen. In einer andern Ausführungsform kann Hybridisierung durch elektrische oder Wärmeimpulssignale nachgewiesen werden (Affymax Technology, Bellus, 1994).
In einem bevorzugten Verfahren wird die Sichtbarmachung jedoch indirekt erlangt. Im Anschluss an die Separierung des Amplifikationsproduktes wird eine markierte Nukleinsäureprobe mit der amplifizierten Markersequenz in Kontakt gebracht. Die Probe wird vorzugsweise mit einem Chromophor konjugiert, kann aber mit radioaktiven Atomen markiert sein. In einer anderen Ausführungsform wird die Probe mit einem Bindungspartner konjugiert, wie z. B. ein Antikörper oder Biotin, wobei das andere Element des Bindungspaars einen nachweisbaren Anteil trägt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis durch "Southern-Blotting" und Hybridisierung mit einer markierten Probe. Die beim "Southern-Blotting" einbezogenen Verfahrenstechniken sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und können in vielen Standardbücher über Molekülprotokolle gefunden werden (siehe Sambrook et al., 1989). Kurz gesagt, Amplifikationsprodukte werden durch Gel-Elektrophorese separiert. Das Gel wird dann mit einer Membran kontaktiert, wie z. B. Cellulosenitrat, was den Transfer der Nukleinsäure und eine nichtkovalente Bindung erlaubt. Anschließend wird die Membran mit einer chromophorkonjugierten Probe inkubiert, die in der Lage ist, mit einem Zielamplifikationsprodukt zu hybridisieren. Der Nachweis erfolgt durch Röntgenfilm- oder Ionenemissionsnachweisvorrichtungs-Exposition der Membran.
Ein Beispiel für das Vorstehende ist im US-Patent Nr. 5,279,721 beschrieben, das eine Vorrichtung und ein Verfahren für automatische Elektrophorese und Transfer von Nukleinsäuren offenbart. Die Vorrichtung erlaubt Elektrophorese und Blotting ohne externe Manipulation des Gels und ist ideal zur Ausführung von Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
(vi) Klinische Stadien maligner Melanome
Maligne Tumoren werden gemäß einer wohldefinierten, sorgfältig ausgearbeiteten progressiven Skala in Stadien eingeteilt, die vom American Joint Committee on Cancer [AJCC: Vereinigtes amerikanisches Krebskomitee] entwickelt wurde.
Maligne Melanome können in jedem Hautbereich entstehen, der Melanozyten enthält, aber Körpermale, auch Pigmentnävi genannt, sind besonders anfällig. Obwohl manche Muttermale, vor allem solche im Gesicht und am Rumpf, in Pigmentzellen entstehen, enthalten sie manchmal wenig Pigment und sind von heller Farbe. Alle Muttermale sind anfangs benigne Tumoren von unterschiedlicher Gestalt, aber es ist wichtig zu beachten, dass ca. 20 bis 30% aller Melanome in den Pigmentzellen von Muttermalen ihren Anfang nehmen.
Früh erkannt sind Melanome sehr oft heilbar. Andererseits haben Melanome, die erst nachgewiesen werden, wenn sie, wenn auch nur wenige Millimeter, in tiefere Hautschichten eingedrungen sind, eine weitaus schlechtere Prognose. Die Fünfjahres-Überlebensrate schwankt erheblich abhängig vom Stadiumsstand. Bei Melanomen des Stadiums I und des Stadiums II beträgt die Fünfjahres-Überlebensrate über 80%. Beim Stadium IV beträgt die Überlebensrate jedoch weniger als 20% (AJCC).
Eine vereinfachte Zusammenfassung der Skala, entwickelt vom American Joint Committee for the Staging of Melanoma [Vereinigtes amerikanisches Komitee für Melanom-Einstufung] ist in Tabelle 2 dargelegt.
Tabelle 2: Einstufung von Melanomen
Metastasierung an ein distales Organ kann zu Sekundärmetastasierung an anderen Organen führen oder nicht. Da eine Metastasierung ohne klinische Symptome sich noch viele Jahre lang still verhalten kann, kann das Kontrollieren des Blutes eines Patienten auf zirkulierende Tumorzellen beim Nachweis einer Tumorprogression hilfreich sein, bevor klinisch evidente Metastasen an anderen Organen nachgewiesen werden.
5. Beispiele
BEISPIEL I
Nachweis von Mehrfachmarker-RNA Expression in Melanomzellen
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
(i) Melanomzelllinien
Im John Wayne Cancer Institute [John-Wayne-Krebs-Institut] (JWCI) wurden Melanomzelllinien M10, M12, M24, M101, Mke, Mst, Mmu, Mka und Mkn gebildet und charakterisiert. Zellen wurden in RPMI 1640 plus 10% fötales Kälberserum (hitzeinaktiviert) gezüchtet (Gemini, Calabasas, CA) plus Penicillin und Streptomycin (GIBCO, Long Island, NY) in T75-cm²-Glaskolben. Anhaftende Zelllinien wurden routinemäßig alle 3–4 Tage durch Trypsinisierung passagiert (Hoon et al., 1993). Für PCR-Studien wurden Zelllinien verwendet, wenn sie 75–85% konfluierend waren.
(ii) Blutpräparation und RNA-Extraktion
Periphere Blutlymphozyten (PBL) wurden aus der Leukozytenmanschette von 15 ml Blut von gesunden, normalen Spendern erhalten. Die Zellen wurden fünf Minuten durch Zentrifugierung gewaschen.
Die gesamte Zell-RNA wurde unter Verwendung des UltraSpec-Isolierungssystems (Biotecx, Houston, TX) oder des Tri-Reagent-Isolierungssystems (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) extrahiert, wie vom Hersteller beschrieben. Beim UltraSpec wurden die Zellen in 2 ml UltraSpec-RNA-Reagens durch wiederholtes Pipettieren lysiert und fünf Minuten in Eis gesetzt. 400 μl Chloroform wurden zugefügt und 15 Sekunden exakt gemischt und fünf Minuten auf Eis gesetzt. Die Lösung wurde bei 4°C für 15 Minuten mit 12.000 × g zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein RNAse-freies Eppendorf-Röhrchen übertragen, 1 Volumen an Isopropanol zugefügt und die Lösung bei 4°C für 10 Minuten präzipitiert. Das Röhrchen wurde mit 12.000 g bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert. Die Probe wurde mit 70%-Ethanol gewaschen, getrocknet, und wieder in 50 μl DEPC(Diethyldicarbonat)-behandelter Tris-EDTA (TE) Pufferlösung aufgemischt.
Bei Tri-Reagent wurden die Zellen in 1 ml Tri-Reagent durch wiederholtes Pipettieren lysiert und für 5 Minuten auf Eis gelegt. Zweihundert μl Chloroform wurde zugefügt und heftig für 15 Sekunden gemischt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Die Lösung wurde dann bei 12.000 × g bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein RNAse-freies Eppendorf-Röhrchen übertragen, dann gleiches Volumen Isopropanol hinzugefügt und die Nukleinsäure wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten präzipitiert. Das Röhrchen wurde dann mit 12.000 × g bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Die Probe wurde zweimal mit 70%-Ethanol gewaschen, vakuumgetrocknet und in 10 mnM Tris-HCl mit 1 ml EDTA-Lösung (pH 7,4) wieder aufgemischt. Die Konzentration der gesamten RNA wurde unter Verwendung eines Beckman-Spektrophotometer bestimmt. Ein μg der Gesamt-RNA wurde im PCR-Test verwendet, um mRNA nachzuweisen.
Alle Extraktionsverfahren für jede Probe wurden in einer bestimmten Laminarströmungshaube unter sterilen Bedingungen separat durchgeführt, um mögliche RNA-Kreuzkontamination zu vermeiden. Die PCR-Reagenszubereitung und Gel-Elektrophorese nach PCR wurden in getrennten Räumen ausgeführt, um mögliche RNA-Kreuzkontamination zu vermeiden.
(iii) Oligonucleotidprimer und Proben
Oligonucleotidprimer wurden am Molecular Biology Institute Core Facility, UCLA synthetisiert und gereinigt. Oligonucleotid-5'- und 3'-Primer für einzelne Gene waren wie folgt: MAGE-3 Primer waren 5'-GAAGCCGGCCCAGGCTCG-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-GGAGTCCTCATAGGATTGGCTCC-3 (SEQ ID NO: 2); MUC18 Primer waren 5'-CCAAGGCAACCTCAGCCATGTC-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-CTCGACTCCACAGTCTGGGACGACT-3' (SEQ ID NO: 4); MUC18 zugefügte Primer waren 5'-GTCATCTTCCGTGTGCGCCA-3' (SEQ ID NO: 5) und 5'-GTAGCGACCTCCTCAGGCTCCTTAC-3' (SEQ ID NO: 6); Tyrosinase waren 5'-TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3' (SEQ ID NO: 8); Tyrosinase zugefügte Primer waren 5'-GTCTTTATGCAATGGAACGC-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3' (SEQ ID NO: 10); und p97 Primer waren 5'-TACCTGGTGGAGAGCGGCCGCCTC-3' (SEQ ID NO: 11) und 5'-AGCGTCTTCCCCATCAGTGT-3' (SEQ ID NO: 12). Die Amplifikationsprodukte von MAGE-3, MUC18, MUC18 "zugefügt" (bzw. verschachelt), Tyrosinase, Tyrosinase "zugefügt" (bzw. verschachelt) und p97 waren 423, 437, 262, 284, 207 bzw. 286 bp.
(iv) Umkehrtranskription und Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR)
Der RT-PCR-Test wurde wie früher beschrieben (Hoon et al., 1993) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Ein Oligo (dT)₁₅ Primer wurde für den Schritt der Umkehrtranskription verwendet, um cDNA zu produzieren und ihre Amplifizierung über genomische DNA sicherzustellen. Das Umkehrtranskription(RT)-Gemisch bestand aus 4 μl 25 mM MgCl₂, 2 μl 10 × RT Pufferlösung, 4 μl 10 mM Dinucleotidtriphosphatmischung, 0,5 μl RNAs in (40 U/μl), 1 μl AMV Revers-Transkriptase (9 U/μl), und 1 μl Oligo(dT)₁₅ Primer (1,5 μg/μl). Drei μg der Proben-RNA wurden zum RT-Gemisch hinzugefügt und H₂O zugegeben, um das Volumen auf 20 μl zu bringen. Alle Reagentien wurden von Promega (Madison, WI) bezogen. Die Reaktion wurde bei 42°C für 2 Std., 99°C für 5 Minuten und auf Eis für 5 Minuten inkubiert.
Die PCR-Mischung bestand aus 10 μl 10 × PCR Pufferlösung (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 8 μl 10 mM dNTPs Mischung, 1 μl 5'-Primer (100 pmol/μl), 1 μl 5'- und 3'-Primer, 0,5 μl AmpliTaq 5 U/μl (100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0,01%-Gelatine, Perkin Elmer Cetus) und 20 μl an RT-Mischung. Steriles, doppelt-distilliertes H₂O wurde zu der Mischung hinzugefügt, um die Mischung auf 100 μl zu bringen. Die Mischung wurde mit Mineralöl überdeckt. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt eingestellt: 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 95°C für 70 Sekunden, 52°C für 70 Sekunden, 72°C für 70 Sekunden für 40 Zyklen, und 72°C für 10 Minuten Verlängerungszeit und bei 4°C getränkt. Die PCR-Reaktion wurde in einem OmniGene Temperaturcycler (Hybaid, Middlesex, England) durchgeführt.
Zur Beurteilung angefügter Primer an ein spezielles Gen wurde der PCR-Mischung nach Abschluss durch den PCR-Kreislauf (10 μl) zu 10 μl an 10 × PCR-Pufferlösung, 8 μl an 10 mM dNTPs, 1 μl an 5'-angefügter Primer (100 pmol/μl), 1 μl an 3'-angefügter Primer (100 pmol/μl) und 0,5 μl an AmpliTaq Polymerase (5 U/ml) zugegeben. Das Volumen der Mischung wurde auf 100 μl gebracht. Der PCR-Kreislauf wurde wie bei der ersten Reaktion durchgeführt, außer dass die Strangbildungstemperatur 55°C war. Die Vorbereitung der PCR-Mischung für den Temperaturcycler wurde in einem dazu bestimmten PCR-Raum in einer speziellen Laminarströmungshaube durchgeführt.
Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde durch Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel (GIBCO BRL, Grand Island, N.Y.) nachgewiesen und durch Ethidiumbromidfärbung unter Ultraviolettlicht visualisiert. Ein ϕX174RF DNA/Hae III Fragment-DNA-Leiter (BRL) wurde als ein Größenreferenzmarker für alle Tests verwendet.
B. RESULTATE
Das Screeningverfahren umfasste die Überprüfung von 10 gebildeten Melanomzelllinien (106 Zellen/Linie) und 39 normalen PBL (10⁷ Zellen/Blutprobe) als Kontrollen. In Tabelle 4 ist die Expression dieser Marker für Melanomzellen und PBL gezeigt. Als positive Reaktion wurde ein durch Gel-Elektrophorese mit Ethidiumbromidfärbung sichtbares, spezifisches PCR-Amplifikationsprodukt angesehen.
Tabelle 4 PCR-Analyse von Melanomamarker-Genen
RNA wurde aus Melanomen und PBL extrahiert und auf Expression individueller Marker durch PCR beurteilt. Vorliegende Daten als positive Zelllinien oder PBL zur Gesamtzahl beurteilter Proben. Positive PCR bezieht sich auf PCR-Amplifikationsprodukt, beurteilt durch Gelelektrophorese.
Alle vier Marker wurden in all den Melanomalinien transkribiert, außer MAGE-3. Eine Melanomzelllinie, die alle vier Marker exprimiert, würde cDNA PCR-Produkte mit Größe: 284 Basenpaare (bp), 286 bp, 423 bp und 437 bp hervorbringen (Tyrosinase, p97, MAGE-3 bzw. MUC18), wie dies nach Elektrophorese durch ein Agarosegel mit Ethidiumbromidfärbung beobachtet und mit DNA-Größenmarker verglichen wurde. In einer Melanomzelllinie war die Tyrosinaseexpression durch PCR negativ; wenn jedoch eine verschachtelte bzw. angefügte PCR für Tyrosinase durchgeführt wurde, wurde Tyrosinasegenexpression nachgewiesen. Es gab keinen Nachweis für Melanomamarker in PBL von 39 Normalspendern, außer zwei Spendern, welche positiv auf MUC18 Gentranskription waren. Diese Individuen wurden mehrfach aus separaten Blutproben getestet und blieben immer positiv auf MUC18. Dies deutet an, dass dies keine falschen Positivergebnisse wegen PCR-Kontamination oder Kontamination aus Normalgewebe während der Blutentnahme waren.
Bei allen Tests, wurde PCR mit MUC18 angefügtem Primer durchgeführt; diese Vorgehensweise erhöhte die Empfindlichkeit, um eine Verifikation und Amplifizierung von schwachen Banden zu erlauben, die durch PCR nur mit MUC18 Primern erzeugt wurde. Melanomzelllinien und PBL wurden wenigstens zweimal getestet, um die Spezifität zu verifizieren. Entsprechende Kontrollen bei jedem Test umfassten Proben mit positiver RNA für die zu beurteilenden Gene, PCR-Reagentien und Primer ohne RNA, Humantumor-Zelllinien, welche negativ auf individuelle Genexpression waren, und β-actin Genexpression.
MAGE-1, ein Genfamilienelement von MAGE-3, wurde auch getestet und herausgefunden, dass es in weniger als 50% der Melanomzelllinien transkribiert. Es wurde beschlossen, dass dieser Marker nicht für Melanome benutzt wird, da MAGE-3 in Melanomen weit höher exprimiert wird und MAGE-3 gewöhnlich auch aufgefunden wird, wenn MAGE-1 exprimiert wird (Gaugler et al., 1994). Eine Expression beider Gene wurde in PBL von normalen, freiwilligen Spendern nicht nachgewiesen.
BEISPIEL II
Empfindlichkeit von Mehrfach-Melanomenmarker
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
RNA wurde isoliert und von für individuelle Marker positive Melanomzelllinien quantifiziert. Dann wurde eine PCR-Analyse mit seriell verdünnter RNA ausgeführt, wie im Beispiel I beschrieben.
(i) Southern-Blot-Analyse
Nach der Elektrophorese von PCR-Amplifikationsprodukten wurden über Nacht Agarosegele auf Cellulosenitrat-Membrane (Schleicher & Schull, Keene, N.H.) mit 20 × SSC Pufferlösung übertragen, wie vorstehend beschrieben. Die cDNA wurde dann auf der Membran UV-vernetzt und über Nacht mit einer Digoxigenin-markierten Probe (Morisaki et al., 1992) hybridisiert. Nach Hybridisierung wurde die Membran in 2 × SSC, 0,1% SDS für 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und dann in 0,1 × SSC, 0,1% SDS für 30 Minuten bei 68°C, um nichtspezifische Bindungen zu entfernen (Sambrook et al., 1989). Spezifische Bindungen wurden nachgewiesen unter Verwendung von Anti-Digoxigenin, alkalischen Phosphatasekonjugierten Antikörpern, wie vom Hersteller beschrieben (Genius Kit; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Tyrosinaseproben wurden entweder mit voller Länge aus PCR-cDNA-Produkten unter Verwendung der äußersten PCR-Oligonucleotidprimer hergestellt oder als 2K bp Proben, wobei Eco R1 aus die Tyrosinase-Gensequenz enthaltenden Plasmiden aufgeschlossen wurde (Kwon et al., 1987). Alle anderen beim "Southern-Blotting" verwendeten Proben wurden aus PCR-cDNA-Produkten unter Verwendung der äußersten Oligonucleotidprimer hergestellt.
Gel-Elektrophorese und "Southern-Blotting" wurden auch automatisch unter Verwendung des automatischen Elektrophoresesystems, National Genetics, Inc. und US-Patent Nr. 5,279,721 durchgeführt (vgl. oben).
B. RESULTATE
Im Allgemeinen konnten alle Marker mit Picogrammpegeln an RNA durch Sichtprüfung der PCR-Amplifikationsprodukte nach Gel-Elektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen werden. RNA aus Melanomzelllinien wurde seriell von 1 bis 10^–9 μg verdünnt und auf Marker Tyrosinase, p97, MUC18 und MAGE-3 beurteilt. Die Empfindlichkeit variierte für individuelle Linien mit unterschiedlichen Pegeln der Genexpression. Im Allgemeinen wurde durch PCR mRNA für p97, MUC18 und MAGE-3 mit rund 10–100 pg nachgewiesen. Tyrosinase mRNA konnte durch PCR mit 10–100 fg nachgewiesen werden.
Die Spezifität der Amplifikationsprodukte wurde durch "Southern-Blotting" mit entsprechend spezifischen Proben (Tyrosinase, p97) aufgezeigt. Die Empfindlichkeit des PCR-Tests konnte 10- bis 100-fach verbessert werden, wenn PCR von Probenblotting gefolgt wurde. Verschachtelte bzw. angefügte PCR für Tyrosinase erhöhte die Nachweispegel 10- bis 100-fach gegenüber PCR für Tyrosinase. Angefügte PCR für MUC18 verbesserte die Resultate noch etwa 10-fach, verglichen mit Standard-PCR für MUC18.
BEISPIEL III
Nachweis von Melanomzellen, gemischt mit PBL in vitro Ein Modellsystem wurde entwickelt, das zirkulierende Melanomzellen in Blut simulierte. In diesem Testsystem wurde 10⁷ Normal-PBL mit reihenweisen Verdünnungen der Melanomzellen (10⁶ bis 1 Zelle) gemischt und durch PCR auf individuelle Genmarker beurteilt. Die PCR-Amplifikationsprodukte wurden dann durch Ethidiumbromidfärbung von Gelen und durch Southern-Blot-Analyse beurteilt. RT-PCR-Amplifizierung wurde auch auf RNA, extrahiert aus 10⁷ PBL und 10¹ Melanomzellen, als Kontrollen durchgeführt. Southern-Blot-Analyse, durchgeführt für Tyrosinase, verifizierte die Spezifität der PCR-Amplifikationsprodukte und zeigte erhöhte Empfindlichkeit. Materialien und Verfahren wurden bereits in Beispielen I und II beschrieben.
Gel-Elektrophorese oder angefügte Primeranalyse zeigten auf, dass Melanomzellen bei etwa 1 Zelle in 10⁷ PBL für Tyrosinase, p97 und MUC18 nachgewiesen werden konnten. PBL-Kontrollen waren für individuelle Marker sowohl bei Gelfärbung und Southern-Blot-Analyse als auch bei Standard- und angefügter PCR negativ. Spezifische Verdünnungen von Melanomzellen wurden auch in 50 Millionen-PBL analysiert und es zeigte sich, dass etwa 1 bis 5 Melanomzellen in 50 Millionen-PBL mit angefügter Primer-Tyrosinase-PCR, gefolgt von einer Probennahme mit Tyrosinase cDNA nachgewiesen werden konnten.
Um die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Nachweises von 1 Melanomzelle in 10 Millionen PBL zu demonstrieren, wurde eine Poisson-Verteilungsanalyse durchgeführt. In 8 von 11 Proben wurde ein positives PCR-Amplifikationsprodukt, entwickelt durch Tyrosinase PCR mit Gel-Elektrophorese nachgewiesen. Der Nachweispegel wurde auf > 90% erhöht, wenn Tyrosinase- mit angefügten PCR-Primern oder Southern-Blot-Analyse mit Tyrosinase-Proben durchgeführt wurde.
BEISPIEL IV
Beurteilung von zirkulierenden Melanomazellen in Patientenblut
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
(i) Patienten
Alle Melanomapatienten mit vollständig dokumentierten körperlichen und medizinischen Historien wurden vom JWCI bereitgestellt. Die untersuchten Melanomapatienten wiesen AJCC (American Joint Committee on Cancer)-Stadium I, II, III und IV auf. Die beurteilten Patienten waren NED (kein Befund klinischer Krankheit), AWD (lebend mit klinischer Krankheit) oder EXP (verstorben in der Folgezeit). Die Auswahl und Untersuchung der Patienten wurde als Doppelblindversuch durchgeführt. Der Krankheitsstatus der Patienten war der Person, die die PCR-Tests durchführte oder die PCR-Daten analysierte, nicht bekannt. Der klinische Krankheitsstatus wurde zur Zeit der Blutentnahme und erneut nach 8–15 Monatszeiträumen dokumentiert. Die PCR-Datenresultate waren den Personen, die den Patientenstatus während der Nachfolgezeit aufzeichneten, nicht bekannt.
Fünfzehn ml Blut wurde von Patienten entnommen und in Natriumcitratröhrchen gesammelt. Das gesamte Blut wurde in der John Wayne Krebsklinik unter Verwendung des selben Verfahrens entnommen. Das Blut wurde erst nach schriftlicher Zustimmung durch den Patienten entnommen. Das Protokoll für die Studie wurde durch das Saint John's Hospital und das Kommitee für menschliche Belange am John Wayne Krebsinstitut genehmigt. Die Röhrchen wurden 20 Minuten lang mit 2000 × g zentrifugiert. Die Leukozytenmanschette wurde sorgfältig entfernt und in doppelt-distilliertem Wasser verdünnt. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung über 5 Minuten gewaschen. Alle anderen Materialien und Verfahren wurden wie in Beispiel I und II beschrieben durchgeführt.
(ii) Protokoll
Materialien und Verfahren waren so, wie in Beispielen I und II beschrieben. PBL von Melanomapatienten wurden unter Verwendung eines optimierten PCR-Test-Nachweissystems untersucht. Das Protokoll war wie folgt: PCR-Tests wurden durchgeführt, um Transkripte von Tyrosinase, p97, MAGE-3 und MUC18 nachzuweisen. Alle Melanomapatienten wurden allen vier Tests unterzogen. Wenn die Probe für Tyrosinase oder MUC18 negativ war, wurde eine verschachelte/angefügte PCR mit entsprechenden Primern durchgeführt. Wenn die PBL-Probe im PCR-Test auf Tyrosinase mit angefügten Primern und p97-Marker negativ war, dann würde eine Southern-Blot-Analyse mit entsprechenden Proben durchgeführt werden. PBL, das negativ auf all die Marker und Tests war, wurde als tatsächlich negativ angesehen.
Anfänglich wurde PBL, das durch Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugierung isoliert wurde, mit leukozytenisolierter PBL verglichen. In der Analyse erschienen leukozytenisolierte Zellen besser für den Nachweis von zirkulierenden Melanomzellen in Blut durch PCR.
B. RESULTATE
Eine Zusammenfassung der Analyse von Blutproben durch PCR unter Verwendung von Mehrfachmarkern, wie beurteilt durch ethidiumbromidgefärbte Gele, ist in Tabelle 5 gezeigt. Die größte Anzahl von positiven Patienten wurde mit MUC18 (73%) beobachtet, mit Tyrosinase (59%), mit p97 (54%) und mit MAGE-3 (10%), das nur wenige identifizierte. Die Analyse mit angefügten Tyrosinase-Primer gegenüber Tyrosinaseprimern erhöhte die Anzahl von positiven Patienten signifikant von 2 auf 57. Weitere Analyse von p97-negativen und Tyrosinase-negativen Patienten mit entsprechend spezifischen Proben erhöhte die Anzahl von positiven Patienten signifikant. Die signifikanteste Verbesserung wurde durch "Southern-Blotting" mit der p97-Probe beobachtet. Sechs Patienten waren positiv auf alle vier Marker. Alle sechs Patienten befanden sich in Stadium IV.
Tabelle 5 Analyse von Melanomapatienten unter Verwendung von Mehrfachmarkern-PCR-Tests
Melanomapatienten (120) wurden überprüft. PCR und cDNA Blot bezieht sich auf Tests, die positiv auf individuelle Markergene sind. Angefügte PCR bezieht sich auf Proben, die negativ auf Tyrosinase-PCR getestet wurden, und + oder – für MUC18-PCR, die positiv wurden nach angefügter PCR. cDNA blot bezieht sich auf Patienten, die negativ entweder auf PCR oder angefügte PCR getestet wurden und nach cDNA Blotting positiv wurden.
Die PCR-Analysen wurden mit Krankheitsstadien und -status (AWD & EXP, NED) der Patienten korreliert. Die Nachfolgezeit für klinischen Status nach Blutabnahme zur PCR-Analyse war 8–15 Monate. In der Studie gab es 4, 18, 32, und 66 Stadium I, II, III bzw. IV Patienten. Die Mehrheit der Patienten in individuellen Stadien II bis IV waren PCR positiv.
Tabelle 6 Korrelation PCR-positiver Patienten zum Krankheitsstatus des Patienten
Die Werte stellen Patienten mit positiver PCR dar (1 oder mehr Marker) gegenüber der Gesamtzahl untersuchter Patienten. NP bezeichnet "kein Patient". AWD & EXP beziehen sich auf AWD-Patienten AWD und jene, die während der Blutentnahme AWD waren, und während der Nachfolgezeit verstarben (EXP).
Der Nachweis der PCR-Marker wurde mit der Breslow-Dicke und dem Clark-Level des Primärmelanom nach dessen chirurgischer Entfernung korreliert. Die zwei letzteren Faktoren spielen bei der Bestimmung der Patientenprognose eine Rolle (Breslow, 1970; Morton et al., 1993). Die Breslow-Dicke hat sich als sehr gut korreliert mit der Krankheitsprogression gezeigt. Die Breslow-Dicke wurde in Untergruppen von 0,75 mm oder weniger, > 0,75 mm bis 1,49 mm, ≥ 1,5 mm bis 3,0 mm und > 3,0 mm unterteilt. Jedoch gab es keine signifikante Korrelation von Breslow-Dicke und Nachweis von PCR-Marker. Obwohl die Mehrzahl der Patienten entweder Clark-Level 3 oder 4 waren, wurde kein signifikantes Muster zwischen Clark-Level und Anzahl von positiven PCR-Markern beobachtet. Weder die Anzahl der tumorpositiven, regionalen Lymphknoten noch die Stellen distaler Metastasen korrelierten signifikant mit der Anzahl von positiven PCR-Markern.
Das Fehlen einer Korrelation zwischen Breslow-Dicke der Primärmelanoma und Clark-Level mit der Anzahl an PCR-positiven Marker kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass die Tumorprogression nicht länger von diesen ursprünglichen pathologischen Parametern des Primärtumors abhängig ist, sobald dieser entfernt worden ist.
BEISPIEL V
Statistische Analyse
Um den Unterschied zwischen der Verwendung von Tyrosinase allein als einen Marker und von Tyrosinase, MUC18, p97 und MAGE-3 zusammen zu beurteilen, wurde ein Pegelkoeffizient für kleine Probenproportionanalyse durchgeführt. Die Beurteilung der Bedeutung des Krankheitsstadiums gegenüber PCR-Daten wurde untersucht, wie nachfolgend zusammengefasst ist:
n = 120 Stadium I = 4 NED = 65
Stadium II = 18 AWD = 38
Stadium III = 32 EXP = 17
Stadium IV = 66
Von den 120 Patienten wurden 49 negativ auf Tyrosinase getestet. 42 von diesen wurden auf wenigstens einen der anderen drei Marker (MUC18, p97, MAGE-3) positiv getestet. Diese Verbesserung ist statistisch mit einer Zuverlässigkeit von 99% signifikant. Daher kann zusammengefasst werden, dass der PCR-Test mit vier Markern empfindlicher als der Test mit einem einzigen Marker (Tyrosinase) ist.
Als Nächstes wurde ein Versuch unternommen, das Krankheitsstadium (I, II, III oder IV) und die Anzahl von positiven Markern (0–4) eines Patienten zu korrelieren. Tabelle 7 zeigt den Abriss.
Tabelle 7 Anzahl von PCR-Markern, korreliert mit Stadium und Krankheitsstatus
Positive Marker beziehen sich auf den Nachweis von Tyrosinase, p97, MUC18 und MAGE-3 entweder durch PCR, eingefügte PCR oder "Southern-Blotting".
Die Ergebnisse zeigen eine positive Korrelation zwischen dem Stadium und der Anzahl von positiven Markern, p = 0,0025, d. h. mit höher werdendem Stadium scheint auch der Anteil von positiven Markern ferner zuzunehmen.
In der Nachsorgezeit nach der Blutentnahme wurden die Patienten eingeteilt in solche mit klinischer Krankheitszeichenprogression und solche ohne Anzeichen. Die Anzahl der Patienten, die bei 0 bis 4 PCR-Markern positiv waren, wurde mit der Krankheitsprogression korreliert. Ferner wurde das Verhältnis zwischen der Progression und der Anzahl von positiven Marker beurteilt. Die Analyse zeigte, dass eine signifikante Korrelation (p < 0,05) zwischen der Anzahl von positiven Marker und Krankheitsprogression bestand (Tabelle 8).
Tabelle 8 Anzahl von PCR-Markern, korreliert mit der Krankheitsprogression
Obwohl in einem früheren Bericht Tyrosinase als Marker verwendet worden ist, indizieren die hierin offenbarten Studien daher, dass Tyrosinase allein beim Nachweise zirkulierender Melanomzellen nicht immer empfindlich ist. Die Verwendung von mehr als einem Marker kann das Vorhandensein okkulter Melanomzellen belegen und die Empfindlichkeit zum Nachweisen von Melanomzellen, die wenig oder keine Kopien von Tyrosinase-mRNA exprimieren, signifikant erhöhen. Die Studie zeigte auf, dass die Verwendung von vier Markern deutlich besser war als Tyrosinase allein. Außerdem korrelierte die Anzahl von in einzelnen Patienten nachgewiesenen Markern signifikant mit dem Stadium und der Krankheitsprogression. Diese höhere Expression individueller Markergene indiziert, dass es in voranschreitenden Krankheitsstadien eine Zunahme der Heterogenität von Tumorzellen oder eine Zunahme der Anzahl von Zellen im Kreislauf gibt.
Insgesamt war Nachweisgrad für Tyrosinase und p97-Marker ähnlich. Der MUC18-Marker war der am häufigsten, MAGE-3 der am wenigsten nachgewiesene. Obwohl MAGE-3 in Zelllinien und Biopsien in größerer Häufigkeit exprimiert wird, ist die Anzahl von mRNA-Kopien in einer einzigen Tumorzelle wahrscheinlich sehr niedrig. Dies kann auf den Status der Zelle oder des klonalen Phänotyps während des Kreislaufs im Blut bezogen werden.
BEISPIEL VI
Nachweis von β-HCG-mRNA-Expression in Melanomzellen
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
(i) Melanomzelllinien
24 Melanomzelllinien wurden im John Wayne Cancer Institute gebildet und charakterisiert, wie zuvor beschrieben (Hoon et al., 1991). Zelllinien wurden kultiviert und passagiert, wie in Beispiel I beschrieben.
(ii) RNA-Extraktion
Die gesamte Zell-RNA wurde extrahiert, isoliert und gereinigt unter Verwendung von Tri-Reagens gemäß Herstellerprotokoll (Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH) und in Beispiel I im Einzelnen beschrieben. Zellen von Melanomalinien wurden leicht trypsiniert und von Gewebekulturflaschen aufgefangen. Eventuell kältekonservierte Biopsieproben wurden rasch aufgetaut und in einem Eiswasserbad gehalten. Tumorbiopsien wurden beim Zerkleinern in einem Eiswasserbad gehalten. Die gesamte RNA-Extraktion wurde in einer steril gestalteten Laminarströmungshaube mit RNase-freiem Laborgeschirr ausgeführt. Gereinigte RNA wurde quantifiziert und durch UV-Spektralphotometrie auf Reinheit beurteilt.
(iii) Oligonucleotidprimer und Proben
Oligonucleotidprimer wurden in der Molecular Biology Institute Core Facility, UCLA synthetisiert und gereinigt. Die β-HCG-Primersequenzen waren wie folgt: 5'-Primer war 5'-ATGCCACCCTGGC TGTGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 13), und der 3'-Primer war 5'-GGGAGTCGGGATGGACTTGGAA-3' (SEQ ID NO: 14). Das RT-PCR-cDNA-Produkt war 367 bp. Der 5'-Primer weist nur eine fehlende Übereinstimmung mit dem β-luteinisierenden Hormon auf (LH, siehe unten), während der 3'-Primer sowohl homolog zu β-HCG- als auch zu β-LH-codierenden Bereichen ist. Ein PCR-Produkt mit voller Länge, amplifiziert aus β-HCG-DNA, wurde als Probe für die Southern-Blot-Analyse verwendet.
Die Sequenzen von α-HCG-Primern wurden von der GenBank hergeleitet; 5'-AAAGGAGCGCCATGGATTAC-3' (SEQ ID NO: 15); und 3'-Primer, 5'-CCATTACTGTGACCCTGTTA-3' (SEQ ID NO: 16). Das α-HCG-PCR-cDNA-Produkt war 297 bp. Die Primersequenzen für β-HCG/LH-Rezeptoren waren 5'-Primer, 5'-CCCGATGTGCTCCTGAACCAGA-3' (SEQ ID NO: 17) und 3'-Primer, 5'-GCTGACACCGACAAGGGGCAA-3' (SEQ ID NO: 18). Das RT-PCR-cDNA-Produkt für β-HCG/LH-Rezeptoren war 496 bp. Die β-Actin-Primersequenzen waren wie folgt: 5'-Primer war 5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3' (SEQ ID NO: 21), und der 3'-Primer war 5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3' (SEQ ID NO: 22). Das RT-PCR-Produkt war 201 bp. Die Tyrosinase und MAGE-3-Primer waren dieselben, wie in Beispiel I beschrieben.
(iv) RT-PCR-Assay
Der RT-PCR-Assay wurde ausgeführt, wie zuvor beschrieben (Morisaki et al., 1992, und in Beispiel I). Kurz gesagt, die Umkehrtranskription wurde mit Oligo-(dT)₁₅-Primer und die AMV-Revers-Transkriptase mit 5 μg RNA ausgeführt und zwei Stunden bei 420°C und fünf Minuten bei 99°C inkubiert. Die RT-PCR-Bedingungen wurden aufgestellt wie folgt: Fünf Minuten bei 95°C, gefolgt von eine Minute bei 95°C, eine Minute bei 65°C, eine Minute bei 72°C und zehn Minuten bei 72°C für die End-Primerverlängerungssequenz und durchgeführt in einem OmniGene-Thermocycler (Hybaid, Middlesex, England).
(v) Restriktionsaufschluss
β-HCG ist ein gonadotropes Hormon, zusammengesetzt aus einer α- und einer β-Untereinheit (Giuliano et al., 1995; Fiddes et al., 1979; Boorstein et al., 1982). Die Aminosäuresequenz von α-HCG ist im Wesentlichen nicht zu unterscheiden von denen der anderen humangonadotropen Hormone wie z. B. follikelstimulierende, luteinisierende und thyroideastimulatierende Hormone (Fiddes et al., 1979; Pierce et al., 1981). Die β-HCG-Untereinheit ist jedoch anders als die anderen Hormonuntereinheiten, bis auf die β-LH-Untereinheit; sie teilen sich 82% gemeinsame Aminosäuresequenz (Talmadge et al., 1984). Bis heute wurde herausgestellt, dass die β-Untereinheit von HCG aus einem Cluster von sechs verwandten Genen besteht, die eng mit dem β-LH-Einzelgen verbunden sind (Bo et al., 1992). Da β-HCG und β-LH hochhomolog sind, ist es nicht möglich, eine absolut spezifische Primersequenz für β-HCG zu bestimmen.
Das β-HCG-PCR-cDNA-Produkt weist jedoch einen einzigartigen Sty I Restriktionsort auf, der in dem β-LH-PCR-cDNA-Produkt nicht vorhanden ist. Das Aufschließen von PCR-Produkten mit diesem Enzym ermöglicht es, β-HCG von β-LH zu unterscheiden. Das RT-PCR-cDNA-Produkt wurde mit 10 ×-NE-Pufferlösung 3 (New England BioLabs, Beverly, MA) und Sty I (10 U/ml) (New England Biolabs) inkubiert, und das Gemisch wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Das endonuclease-aufgeschlossene Produktgemisch wurde auf ein 2%iges Agarosegel gegossen und mit Etbr angefärbt. Das mit Sty I aufgeschlossene β-HCG-RT-PCR-cDNA-Produkt erzeugt eine Bande von 271 und 96 bp. Wenn kein Aufschließen stattfand, wurde die Reaktion zur Bestätigung wenigstens zweimal wiederholt.
(vi) "Southern-Blotting"
Auf ein 2%iges Agarosegel gegossene RT-PCR-cDNA-Produkte wurden denaturiert und über Nacht auf eine Nylonmembran (Micron Separations, Inc.) übertragen, wie zuvor in Beispiel II beschrieben. Eine β-HCG-cDNA-Probe wurde durch PCR hergestellt, gereinigt und Digoxigenin-markiert, wie in Beispiel II beschrieben.
3. RESULTATE
Die Beurteilung von β-HCG-Expression in Zellen durch molekulare Verfahrenstechniken war wegen der Sequenzhomologien sowohl der α- als auch der β-Untereinheiten zu verwandten Hormonen schwierig. Das Abschlussende der β-Ketten-Untereinheitskette wurde als Ziel für die RT-PCR gewählt, weil es die auffälligsten Unterschiede verglichen mit anderen verwandten Hormon-β-Ketten-Untereinheiten aufwies.
Anfänglich 24 gebildete menschliche Melanomzelllinien, hergeleitet von unterschiedlichen anatomischen Stellen wurden beurteilt, um zu bestimmen, ob sie eine β-HCG-Kette exprimierten. Ein Oligo-dT₁₅-Priming wurde ausgeführt, um nur Poly-A-mRNA β-HCG zu beurteilen. Von den 24 durch RT-PCR geprüften Zelllinien erzeugten 16 von 24 ein spezifisches cDNA-Produkt der richtigen Größe (367 bp), wie durch Etbr-Gelfärbung belegt.
Als interne Kontrolle wurde auf alle Proben β-Actin gegossen, um RNA-Ertrag und Effizienz des RT-PCR-Assays zu belegen. Jeder Test besaß eine negative Kontrolle bestehend aus RT-PCR-Reagentien allein, ohne RNA und eine positive Kontrolle für β-HCG. Die Southern-Blot-Analyse des PCR-cDNA-Produktes mit der β-HCG-Probe zeigte, dass drei der bei Etbr-Färbung negativen Zelllinien eine spezifische cDNA-Bande besaßen. Eine Zelllinie, in der die Etbr-Färbung verdächtig war, zeigte bei der Southern-Blot-Analyse jedoch keine spezifische Bande. Insgesamt 18 von 24 Zelllinien waren positiv (75%) für β-HCG-Markerexpression.
Zur weiteren Belegung der β-HCG-Markerexpression wurde ein Endonuclease-Restriktionsaufschluss mit Sty I an den RT-PCR-cDNA-Produkten ausgeführt. Alle aufgeschlossenen cDNA-Produkte erzeugten zwei Banden, 271 bp und 96 bp, wie an Etbr-Gelen beobachtet, die β-HCG-Marker indizierten. Diese aufgeschlossenen Produkte wurden durch Southern-Blot-Analyse mit der β-HCG-cDNA-Probe weiter geprüft.
BEISPIEL VII
Nachweis von β-HCG-mRNA-Expression in Melanoma-Tumorbiopsieproben
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
(i) Melanom-Tumorbiopsieproben und Blutpräparation
Es wurden Melanom-Tumorbiopsieproben beurteilt, die durch Histopathologie als maligne Melanome definiert waren. Die Melanombiopsien wurden aus Primärläsionen und aus mehreren anatomische Stellen von Metastasenläsionen aus unterschiedlichen Patienten erhalten. Die Proben wurden sofort eingefroren oder verarbeitet, wie aus dem Operationssaal erhalten. In dieser Studie wurden mit flüssigem Stickstoff kältekonservierte und Tumorbiopsien frisch von der Operation beurteilt. Bei Erhalt der Melanombiopsien wurde nicht-melanomatöses Gewebe unter sterilen Bedingungen in einer Laminarströmungshaube sorgfältig vom normalen Gewebe abpräpariert.
Die PBL wurden von 25 normalen männlichen und weiblichen freiwilligen Spendern erhalten und die Leukozytenmanschette zur RNA-Isolierung gesammelt, wie in Beispiel I beschrieben. Alle anderen Verfahrenstechniken einschließlich RT-PCR, "Southern-Blotting" und Endonucleaseaufschlusss waren, wie in Beispiel VI beschrieben.
Normales Achsellymphknotengewebe, das als histopathologisch tumornegativ beurteilt wurde, wurde von Melanoma- und Brustkrebspatienten erhalten, die sich einem Wahleingriff unterzogen. Die Achsellymphknoten wurden durch herkömmliche Standardanfärbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E-Anfärbung) histopathologisch auf Malignität beurteilt.
3. RESULTATE
Es wurde gezeigt, dass Primärmelanome und Metastasen infiltrierende immune Zellen aufweisen (Cochran und Hoon, 1987). Um sicher zu sein, dass β-HCG-mRNA durch die Tumorzellen exprimiert wurde und nicht ein Produkt infiltrierender Lymphoidzellen war, wurden ferner periphere Blutlymphozyten auf die Expression von β-HCG-mRNA analysiert. Die PBL von 25 normalen freiwilligen Spendern wurden durch RT-PCR analysiert, aber kein Anzeichen von β-HCG-Expression beobachtet, selbst nach der Southern-Blot-Analyse (bis auf eine Einzelperson, die bei einer zweiten Blutentnahme positiv war).
Fünf Lymphknoten von zwei Brust- und Melanomapatienten wurden bei H&E-Anfärbung und durch RT-PCR und "Southern-Blotting" für negativ befunden.
Sowohl kältekonserviertes als auch frisches Biopsiegewebe wurden durch Histopathologie und RT-PCR, Restriktionsaufschluss und "Southern-Blotting" analysiert. Von 40 Patienten wurden 38 durch Histopathologie als melanompositiv identifiziert, während durch RT-PCR auf β-HCG-Marker 16 als positiv identifiziert wurden. Mit anderen Worten, geschätzte 42% der Melanombiopsien waren β-HCG-positiv. Alle Proben, die bei der Histopathologie für melanomnegativ befunden wurden, waren auch bei der β-HCG-Markerexpression negativ. Verglichen mit Melanomzelllinien war der Nachweis von β-HCG-mRNA in Melanombiopsiegeweben viel schwächer. Diese nachgewiesene niedrigere Genaktivität kann auf die Heterogenität von Tumoren, Variabilität der wirtsphysiologischen Regelung von β-HCG oder einfach die Verdünnung von RNA durch normales Zellinfiltrat zurückzuführen sein.
Es gab keinen signifikanten Unterschied im β-HCG-mRNA-Nachweis zwischen kältekonservierten und frischen Biopsieproben. β-Actinexpression wurde in allen Proben nachgewiesen und auf diese Weise die Integrität des mRNA- und PCR-Assays belegt. Ferner wurde die HCG-Untereinheitexpression in fünf α-HCG-positiven Melanomzelllinien und fünf Melanombiopsien untersucht. Es wurde jedoch keine α-HCG-Expression durch RT-PCR nachgewiesen, selbst wenn eine Southern-Blot-Analyse folgte.
BEISPIEL VIII
Vergleich von β-HCG-mRNA-Expression mit anderen Melanomamarkern
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
(i) OP-Proben
Nach einem TDLN-Wahleingriff wurde Achsellymphknotengewebe von sieben Melanomapatienten genommen. Die TDLN wurden durch Anfärbung mit der herkömmlichen Standard-Anfärbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E-Anfärbung) histopathologisch auf Malignität beurteilt. Die β-HCG-mRNA-Expression wurde mit der Tyrosinase- und MAGE-3-mRNA-Expression durch RT-PCR verglichen. Alle anderen Materialien und Verfahren waren, wie in Beispiel VI beschrieben.
B. RESULTATE
Von acht Tumorabfluss-Lymphknoten (TDLN) (von sieben Melanomapatienten) waren fünf positiv bei der β-HCG-Expression, sechs bei Tyrosinase und drei bei MAGE-3. In zwei Patienten wurde keiner der Marker nachgewiesen.
Tabelle 9 Analyse von β-HCG-Expression in Melanom-TDLN
Daraus folgt, dass β-HCG eine nützliche Erweiterung der in den Beispielen I bis V beschriebenen Gruppe von Melanomamarkern ist. Die Expressionshäufigkeit von β-HCG-mRNA in Melanomen scheint derjenigen der Melanomtumorantigene MAGE-3 und MAGE-1 ähnlich zu sein.
BEISPIEL IX
Nachweis von GalNAc-mRNA-Exression in Melanomzellen und Biopsien
A. MATERIALIEN UND VERFAHREN
(i) Melanomzelllinien und OP-Proben
Die Melanomzelllinien wurden alle am JWCI gebildet und vermehrt, wie in Beispiel I beschrieben. 20 Melanoma-Tumorbiopsieproben wurden erhalten, wie in Beispiel VII beschrieben. RNA-Extraktion und RT-PCR-Assay waren, wie in Beispiel BI beschrieben.
(iv) Oligonucleotid-Primers und Proben
Oligonucleotid-Primers wurden in der Molecular Biology Institute Core Facility, UCLA synthetisiert und gereinigt. Die verwendeten GalNAc-Primers waren: 5'-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3' (SEQ ID NO: 19) und 3' GATCATAACGGAGGAAGGTC-3' (SEQ ID NO: 20). cDNA-Proben, amplifiziert durch PCR mit diesen Primern, wurden beim Southern-Blotting verwendet, das durchgeführt wurde, wie in Beispiel II beschrieben. Die Tyrosinase- und MAGE-3-Primer waren dieselben, wie in Beispiel I beschrieben, und die β-HCG-Primer waren dieselben, wie in Beispiel VI beschrieben.
Tabelle 10 GalNAc-Expression in Melanombiopsien und Zelllinien
TABELLE 10 (FORTGESETZT)
B. ERGEBNISSE
Wie in Tabelle 7 gezeigt, wurde der Nachweis von GalNAC-mRNA in 13 von 14 Melanomzelllinien und 10 von 20 Biopsieproben erfolgreich geführt. Des Weiteren wurde in normalen Lymphknoten oder PBL keine GalNAc-Markerexpression beobachtet. Dies sind ähnliche Ergebnisse wie diejenigen, die in früheren Beispielen für β-HCG und MAGE-3 gefunden wurden. Dies zeigt an, dass die GalNAc-mRNA-Expression ein weiterer Marker ist, der zum Nachweis von Melanomen und Metastasen verwendet werden kann.
Die Amplifizierung von GalNAc-mRNA ist ein Indikator für die Expression der Ganglioside GM2 und GD2. Ein direkter Nachweis von GM2 und GD2 in okkulten Metastasen und kleinen Tumorläsionen wie z. B. Primärmelanomen ist sehr schwierig und oft nicht praktikabel, wenn biochemische Standardverfahren verwendet werden. Monokolonale Antikörper von Gangliosiden sind verfügbar, sind aber oft kreuzreagierend mit anderen Kohlenhydratstrukturen und sind daher nicht zuverlässig und repräsentieren keine absolute Gangliosidexpression (Hoon et al., 1993).
Der Nachweis von Tumorzellen mit dem Marker GalNAc durch RT-PCR stellt eine neuartige Methode zum Nachweis metastatischer Melanom- und Brustkrebszellen im Blut oder in Flüssigkeiten bereit, der mit den geläufigen biochemischen oder immunologischen Verfahrenstechniken nicht möglich wäre.
Frühere PCR-Studien haben keine großen Patientenzahlen mit unterschiedlichen klinischen Melanomstadien untersucht. Dies ist bei der Auswertung der Empfindlichkeit und klinischen Bedeutung des Tests von Bedeutung. Des Weiteren sind diese Informationen nützlich beim Staging der Krankheit in klinische Untergruppen, insbesondere der Identifizierung von Untergruppen von Patienten, die intensiverer therapeutischer Maßnahmen bedürfen. Zum Beispiel kann bei NED-Patienten mit zirkulierenden Tumorzellen eine sofortige therapeutische Maßnahme ein sehr wirksames Mittel zur Kontrolle einer potentiellen Tumorprogression sein und somit eine klinische Erkrankung verhindern. Der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen kann sich ferner bei der Verfolgung der Reaktion eines Patienten auf operative und adjuvante Therapien als nützlich erweisen.
Die Anwendung eines Verfahrens mit multiplen Melanomamarkern zur Einschätzung von zirkulierenden Tumorzellen liefert ferner Informationen über den Phänotyp des Tumors. Die Identifizierung von (einem) spezifischen tumorassoziierten Antigenen) gestattet einen rationellen Einsatz von spezifischen Immuntherapieprotokollen wie z. B. monokolonale Antikörper und Krebsimpfstoff (Hoon et al., 1993). Der PCR-Assay stellt ferner ein schnelles Kontrollsystem als Nachsorge bereit, um zu bestimmen, ob eine spezifische Therapie wirksam ist.
QUELLENANGABEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweisen von melanomaspezifischen mRNA-positiven Zellen bei einem Patienten, umfassend: (a) Isolieren von Nukleinsäure aus einer biologischen Probe eines Patienten, wobei die Nukleinsäure mRNA enthält; (b) Amplifizieren von Nukleinsäurezielen, sofern vorhanden, aus einem Satz von Melanomamarker-Genen, der Tyrosinase, MART-1 und MAGE-3 einschließt; und (c) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäurezielen, wobei das Vorliegen von einem oder mehreren amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäurezielen das Vorhandensein von melanomaspezifischen mRNA-positiven Zellen bei diesem Patienten indiziert.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend nach Schritt (a) den Schritt des Revers-Transkribierens der mRNA in cDNA.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mRNA in Abwesenheit von DNAse isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei Polymerase-Ketten-Reaktion eingefügt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäureziele durch Gel-Elektrophorese oder Chromatographie separiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die amplifizierten Melanomamarker-Nukleinsäureziele durch "Southern blotting" identifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die biologische Probe eine Körperflüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus peripherem Blut, Lymphflüssigkeit, Aszites, seröser Flüssigkeit, pleuraler Flüssigkeit, peritonealer Flüssigkeit, Organsäften, Sputum, zerebrospinaler Flüssigkeit, lacrimaler Flüssigkeit, Stuhl und Urin, oder ein Körpergewebe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Knochenmarksaspirat, Knochenmarksbiopsie, Lymphknotenaspirat, Lymphknotenbiopsie, Milzgewebe, Feinnadelaspirat, Hautbiopsie, Organgewebebiopsie.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes Primerpaar ein Intron des Melanomamarker-Nukleinsäureziels überspannt und wobei genomische DNA-Amplifikationsprodukte von cDNA-Amplifikationsprodukten basierend auf die Größe oder durch "Southern blotting" unterschieden werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei weitere Melanomamarker-Nukleinsäureziele aus der Gruppe bestehend aus MUC18, p97, MAGE-1, GalNAc, und β-HCG ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei wenigstens drei Primerpaare entsprechend unterschiedlichen Melanomamarker-Nukleinsäurezielen verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Melanomamarker-Nukleinsäureziele Tyrosinase und p97 sind.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 2–6 und 8–11 zur Kennzeichnung einer Tumorbiopsieprobe eines Melanomapatienten, wobei mRNA aus der Tumorbiopsieprobe isoliert wird; wobei die cDNA mit Polymerase-Ketten-Reaktion unter Verwendung von wenigstens zwei Primerpaaren amplifiziert wird, wobei jedes Primerpaar komplementär ist zu einem separaten Bereich eines Melanomamarker-Nukleinsäurezieles, sofern vorhanden, aus einem Satz von Melanomamarker-Genen, der Tyrosinase, MART-1 und MAGE-3 einschließt; und wobei die Anwesenheit amplifizierter Melanomamarker-Nukleinsäureziele ein Profil des Patiententumors erzeugt.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Tumorbiopsieprobe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Knochenmarksaspirat, Knochenmarksbiopsie, Lymphknotenaspirat, Lymphknotenbiopsie, Milzgewebe, Feinnadelaspirat, Hautbiopsie, Organgewebebiopsie.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 2–11 zum Nachweisen von okkulten metastatischen Melanomzellen bei einem Patienten, wobei RNA aus einer biologischen Probe des Patienten isoliert wird; wobei die cDNA mit Polymerase-Ketten-Reaktion unter Verwendung von wenigstens zwei Primerpaaren amplifiziert wird, wobei jedes Primerpaar komplementär ist zu einem separaten Bereich eines Melanomamarker-Nukleinsäurezieles, sofern vorhanden, aus einem Satz von Melanomamarker-Genen, der Tyrosinase, MART-1 und MAGE-3 einschließt; und wobei die Anwesenheit von einem oder mehreren Melanomamarker-Nukleinsäurezielen die Melanoma-Mikrometastasen indiziert.