JPH0825900B2 - 細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物 - Google Patents

細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との
安全な、共有結合された多糖−タンパク質結合体、該結
合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物に関す
る。
精製した細菌由来夾膜多糖類は（多糖を含む菌と）同
族の細菌に対するワクチンの製造に使用されるが、得ら
れる免疫応答は特に乳幼児や免疫系が未成熟または欠損
しているものにとつてしばしば望ましいどころか満足す
ら与えるものではない。例えば肺炎連鎖球菌（Streptoc
occus pneumoniae）14型夾膜多糖が幼児の免疫応答を惹
起することはできず、従つてこの多糖は単独で肺炎連鎖
球菌14型細菌が原因となる重大な小児医療上の問題に対
し防御を与えない、例えばダグラス（Douglas）ら、ジ
エー・インフエクト・デイジーズス（J.Infect.Disease
s）第148巻、131−137頁（1983年）、及びローレンス
（Laurence）ら、アム・ジエー・デイジージス・オブ・
チルドレン（Am.J.Diseases of Children）、第137巻、
846−850頁（1983年）を参照。この多糖類の免疫原性は
タン白と組合せることによつてしばしば増強することが
できる、シニーアソン（Schneerson）ら、インフエクシ
ヨン・アンド・インミユニテイー（Infection and Immu
nity）、第45巻、第３号、582−597頁（1984年）〔スト
レプトコツカス・ニユーモニア（Streptococcus pneumo
niae）6A型の結合体に関して議論している〕。
しかし、該多糖類と結合させるタン白を選定するには
注意を払わねばならない。ある種のタン白〔例えば、パ
ーチユシノーゲン（pertussinogen）〕は幼児の免疫系
を非特異的に活性化する。これらの蛋白はある程度多糖
抗原の免疫応答を増強することができるが、残念なこと
にその非特異的活性化は望ましくない生物学的効果〔即
ち、反応原性（reactogenicity）〕を導く。これらの多
糖抗原に対する免疫応答を好適に増強させるためには、
ダブリユ．エフ．ゲーベル（W.F.Goebcl）とオー．テイ
ー．アベリー（O.T.Avery）とによつて最初に報告され
たように〔ジエー・エクスペリメンタル・メデイシン
（J.Exptl.Medicine）第50巻、521−531頁（1929年）〕
該多糖類を適当なタン白と“結合”させることにより幼
児において達成することができる。
多糖とタン白とを結合させる手段についても注意深く
考慮しなければならない。信じられているように、もし
免疫増強が多糖の抗原決定基のタン白の“輸送（carrie
r）”決定基への分子的接近の結果として起きるなら
ば、これらの部分は生物系内で容易に分離させるべきで
はない。多くの多糖類のポリアニオン性と“輸送”タン
白のポリカチオン性とから生じる非共有結合性結合体は
免疫応答を活性化するが、これら結合体は化学的に不安
定で、得られる免疫応答はＴ細胞非依存性を示す。対照
的に、多糖類とタン白との共有結合体（covalent conju
gates）はより大きな化学的安定性を有しＴ細胞依存性
の免疫応答を示すことが証明された。
多糖−タン白の共有結合体が文献で主張されている
が、共有結合の正確な性質は共有結合体に関し生体内
（in vivo）で活性を有していることが示されているの
みで証明されていないし定量化されていない。さらに、
文献に開示された製法は再現性に乏しい。シニーアソン
（Schneerson）ら、ジエー・エクスペリメンタル・ミジ
（J.Exptl.Med.）、第152巻、361頁（1980年）及びイン
フエクシヨン・アンド・インミユニテイー（Infection
and Immunity）、第40巻、245頁（1983年）において
は、ヘモフイルス・インフルエンザ（Haemophilus infl
uenza）ｂ型及び肺炎連鎖球菌6A型多糖を臭素化シアン
と反応させ、次にアジピン酸ジヒドラジドと、さらに破
傷風毒素またはカブトガニヘモシアニンタン白と“結
合”（couple）させた。肺炎球菌19F型多糖と牛血清ア
ルブミンとを、直接多糖の還元末端とタン白から突出し
たアミノ基（例えばリジン）とからイミン（シツフ塩
基）を形成させて結合し（couple）、次にこのイミンを
シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元した〔リン（Li
n）ら、インミユノロギー（Immunology）、第46巻、333
頁（1982年）〕。
さらに、ケー．ケー．ニクスドルフ（K.K.Nixdorff）
ら、インミユノロギー（Immunology）、第29巻、87頁
（1975年）ではジアゾ化した芳香族アミンに結合した多
糖をタン白のチロシンと結合させ、エス．ビー．スベン
ソン（S.B.Svenson）とエー．エー．リンドバーグ（A.
A.Lindberg）、ジエー・インミユノロギー・メソツド
（J.Immunolog.Methods）、第25巻、323頁（1979年）で
は芳香族アミンに結合した多糖をイソチオシアン類に変
換させ、タン白のリジンから突出したアミノ基に結合さ
せた。しかし、各例において得られた結合体はゲル浸透
クロマトグラフイーの挙動のみで確認された。また別例
（エス．ヌタニ（S.Nutani）ら、インフエクシヨン・ア
ンド・インミユニテイー（Infection and Immunity）、
第36巻、971頁（1982年））では、多糖プルランをジア
ヌルクロリドで活性化し、破傷風毒素と反応させた。こ
の場合、結合体は電気泳動で出発物質と異なることのみ
を示して確認された。
これらの場合、凝集分子量の意味以外の共有結合の証
明がなく、従つて該結合体でも凝集分子量を与えること
が示されるように、共有結合体と分子結合体における電
荷の有無に無関係な巨大分子の自然な相互作用を混同さ
せる。
同時係属中の特許、米国特許出願第608,738号、1984
年５月10日出願（及び参考文献としてここに組み入れ
る）に、共有結合により修飾されたポリアニオン性多糖
−タン白が二属のスペーサー（bigenericspacer）によ
り細菌由来免疫原性膜または他のタン白と結合した該多
糖の共有結合物（covalent conjugates）、これらの製
造法、多糖類とタン白類との間の結合の共有結合性の確
認法と共に示されている。この文献による方法を用い
て、Ｔ細胞依存性が証明され、そして特に使用した多糖
類と同族の細菌に対する防御血清抗体を誘導するワクチ
ンの成分として有用であり化学的に安定な多糖−タン白
結合体を製造することができる。しかし、この方法は共
有結合により修飾するポリアニオン性多糖に対してのみ
有用であり、有機溶媒または塩類溶液に不溶または半溶
解性であり処理しにくい多糖類には役立たない。
従つて、本発明の目的は化学的に安定な多糖−タン白
結合物の製造方法を開発することである。また化学的に
安定な結合体がある種の細菌、特に使用した多糖類と同
族の細菌に対する防御血清抗体を誘導することにより１
価−または多価ワクチンの成分として有用であるため、
中性多糖抗原決定基とタン白“輸送”決定基の分子的接
近を生物系においても保持できるように該中性多糖類と
タン白とを結合させることも本発明の目的である。
本発明は、共有結合により修飾された細菌由来中性多
糖類；結合体が免疫原性細菌性ワクチンの有用な成分で
あり、該中性多糖類が共有結合で修飾された免疫原性膜
タン白、ウイルスタン白のサブユニツト、合成ポリペプ
チド、細菌由来変性毒素、その他の適当な免疫原性タン
白と結合した化学的に安定な該結合体に関するものであ
る。本発明の多糖−タン白結合体は、共有チオエーテル
基を含む二属スペーサーを介して結合しており、ここに
おいて該二属のスペーサーは巨大分子（例えば中性多糖
とタン白）に結合する分子鎖であり、該スペーサーの一
部がある修飾を施した巨大分子（例えば、共有結合で修
飾した中性多糖）に、他の部分が他の修飾を施した巨大
分子（例えば、官能基を施したタン白）に由来するもの
である。
本発明記載の製法では、親電子性中心または突出した
チオール基を有する多糖を製造するための１つまたはそ
れ以上の工程で共有結合により中性多糖に官能基が付与
される。好適には、中性多糖は第一に水性ヒドラジン存
在下またはこれなしの水中で加熱することにより断片化
され、水を除去し、断片化した多糖を二官能性活性化試
薬で誘導体とした後、二端求核剤と反応させる。求核剤
で官能化された中性多糖は、突出した親電子中心を形成
する試薬と反応させるかまたは突出したチオール基を形
成する試薬と反応させる。二端求核剤を適当に選択、直
ち、活性化された中性多糖と反応し親電子中心またはチ
オール基が突出した共有結合で修飾された中性多糖に導
くもの、または、適当な求核剤を選択することにより、
求核剤で官能化された中性多糖をさらに官能化すること
が避けられる。
中性多糖を共有結合で修飾することとは別に、適当な
細菌由来“輸送（carrier）”タン白を、突出したチオ
ール基を形成する試薬または突出した親電子中心を形成
する試薬と１段または２段工程で反応させる。次に、適
当な共有結合で修飾された中性多糖類及びタン白を反応
させて共有結合した多糖−タン白結合体をつくり、そし
て共有結合で結合した多糖の量に基づき免疫原性投与を
可能にするように未結合の巨大分子及び過剰の試薬を除
去精製した。
次に、本発明の多糖−タン白結合体、または本発明の
多糖−タン白結合体と他の多糖−タン白共有結合体、例
えば米国特許出願第608,738号、1984年５月10日出願、
または他の免疫性物質との混合物、の免疫学的に有効な
量を含む１価または多価免疫原性ワクチンまたはその誘
導体を製造することができる。
本発明の共有結合で修飾された多糖類は種類を問わず
いずれの種類の中性（即ち、非アニオン性／非酸性）多
糖類からも修飾されるものであり特定の型の多糖類に限
定するものではない。該細菌由来中性夾膜多糖類の例に
はエル．ケンネ（L.Kenne）及びビー．リンドバーグ
（B.Lindberg）、ザ・ポリサツカライド（The Polysacc
havides）、第２巻、287−363頁、アカデミツクプレス
（Academic Press）（1983年）及びエー．エス．チヤウ
ドリ（A.S.Chaudri）ら、カルボヒドラート・リサーチ
（Carbohydrate Research）、第25巻、161−172頁（197
2年）に記載された肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneuw
oniae）14、7F、37型多糖類を含む。
本発明のタン白は免疫原性及び安全性が証明されたも
のであるが、特に特定の型に限定されるものではない。
適当なタン白には、細菌由来膜タン白；エデスチンまた
は大豆トリプシン阻害剤のような種々の植物タン白；ヘ
パテイテイスＡまたはＢ、ヘルペスgDまたはgC、エプス
タイン−バーまたは帯状疱疹（varicellazoster）のサ
ブユニツトのようなウイルス性タン白サブユニツト；合
成ポリペプチド；ジフテリア変性毒素；破傷風毒素が含
まれるが、好適にはＴ細胞刺激剤であるナイセリア髄膜
炎球菌（Neisseria meningitidis）血清型Ｂ外膜タン白
である。これらの血清型タン白の例はヘルテイング（He
lting）ら、“Serotype Determinant Proteins of Neis
seria Meningitidis",Actapath Microbiol.Scand.Sect.
C,"第89巻、69−78頁（1981年）及びフラツシユ（Frasc
h）ら、ジエー・バクト（J.Bact）、第127巻、973−981
頁（1976年）に記載されている。
本発明の結合体はチオエーテル基及びアルキルアミド
を含む二属のスペーサーを介して結合した安定な多糖−
タン白結合体であり、中性多糖とタン白とによつて加水
分解で分解される共有結合を形成している。しかし、本
発明の好適な結合体は、式:Ps−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Proま
たはPs−Ａ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′−Pro〔式中、Psは非ア
ニオン性多糖を示し;Proは免疫原性タン白を示し;A−Ｅ
−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′は加水分解に安定な
共有チオエーテル結合を含む二属のスペーサーを構成す
るものであり、これは巨大分子、ProとPsとを（加水分
解で分解されるエステルまたはアミド結合のような）共
有結合で結合するものである〕により示すことができる
ものである。スペーサー（中間結合物）Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ
において、Ｓは硫黄であり;Eはチオール基と反応した親
硫黄基の変換生成物で、 （式中、ＲはＨまたはCH3であり、ｐは１乃至３であ
る） により示され;Aは 〔式中、ＷはＯまたはNH、ｍは０乃至４、ｎは０乃至
３、ＹはCH2、Ｏ、Ｓ、NR′、CHCO2H（式中、Ｒ′は
Ｈ、C1−またはC2−アルキルである）であるが、但しＹ
がCH2の場合ｍ及びｎは同時に零とはならず、またＹが
ＯまたはＳの場合、ｍは１を超え、ｎも１を超える〕で
あり;Bは 〔式中、ｑは０乃至２、ＺはNH2、 COOH、Ｈ（式中、Ｒ′及びｐは上記定義に従う）、Ｄは NR′、 である〕である。スペーサー（中間結合体）Ａ′−Ｓ−
Ｅ′−Ｂ′において、Ｓは硫黄であり;A′は （式中、ａは１乃至４、Ｒ″はCH2である）または （式中、Ｙ′はNH2、NHCOR′である）であり（Ｗ、ｐ、
Ｒ′は上記定義に従う）;E′はチオール基と反応した親
硫黄基の変換生成物で、 （式中、Ｒは上記定義に従う）でありそしてＢ′が であるか、またはＥ′が でありそしてＢ′が （式中、ｐは１乃至３である）である。さらに、Ａ−Ｅ
−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′という二属のスペー
サーのＥ−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′成分は、共有結合
で修飾した非アニオン性多糖から由来するチオエーテル
硫黄側と官能基を付与したタン白から由来するスペーサ
ーの側とを結合する結合の共有結合性を有することを反
映する同定によつて決定できかつ定量できる。
本発明の製法において、多糖は、（ａ）断片片、水性
ヒドラジン存在下または無の条件で水中において多糖を
加熱、凍結乾燥によつて水を除去、P2O5を用いて真空乾
燥、（ｂ）それを非水性極性非プロトン性溶媒中二官能
性試薬で活性化、（ｃ）この活性化された多糖を二端求
核剤と反応、最後に必要ならば、さらに（ｄ）この修飾
された多糖を以下のいずれかの試薬、（ｉ）親電子（例
えば親チオール）部位を形成する試薬、または（ii）チ
オール基を形成する試薬と反応させることにより官能基
を付与、することにより共有結合で修飾される。反対に
タン白を（ｉ）チオール基を形成する試薬、または、
（ii）親チオール部位と形成する試薬と反応させ、次に
共有結合で修飾した多糖と官能基を付与したタン白とを
一緒に反応させて安定な共有結合を形成した結合体を形
成し、そして、最終混合物を精製して未反応の多糖とタ
ン白を除去する。
本発明の製法はまた、活性化多糖と反応して突出した
親電子部位またはチオール基を有する共有結合で修飾さ
れた多糖を形成する求核剤または二端求核剤の選択を含
んでおり、これにより共有結合で修飾された多糖を共有
結合で修飾したタン白と反応させる前に、二端求核剤で
修飾された多糖にさらに官能基を付与する必要性を除く
ものである。また、タン白の各種部位への官能基の付与
は該工程における反応剤の選択に従い１工程を超える工
程で達成することができる。
A. 多糖の製造 共有結合で修飾された多糖への第１工程では、固体で
大部分は不溶性の多糖を可溶化しなければならない。
本発明の中性多糖類は有機溶媒または塩類溶液に不溶
であり、水に対し限界的に溶解性を示し、且つ多糖の求
核性アルコール性水酸基は水溶液において親電子試薬に
対し化学的に水の水酸基と競争することができないた
め、多糖はより溶解性のある形態に修飾しなければなら
ず、従つて非水性（非ヒドロキシ性）溶媒に溶解しなけ
ればならない。適当な溶媒はジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホルムア
ミド、N,N′−ジメチルイミダゾリジノン、及びその他
の同様な極性非プロトン性溶媒を含み、好適にはジメチ
ルホルムアミドである。
米国特許出願第608,738号（1984年５月10日出願）に
おいて、酸性基を有する細菌由来多糖類はまずこれらを
適当な塩の形に変換することにより非ヒドロキシ性有機
溶媒に可溶化した。対照的に、出願人は、非ポリアニオ
ン性中性多糖類を５−15％水性ヒドラジンの存在下もし
くはそれを含まない蒸留水中70℃乃至100℃で30秒乃至
１分間加熱することにより多糖類を断片化して、無傷の
ままではその大部分は不溶性を示す中性多糖の可溶化を
達成する。しかし免疫原性ワクチン用中性多糖類の効力
を長期に維持し、多糖を使用可能な形態にする。
次の工程は、多糖類に共有結合を施す際の他の重要な
物理化学的限界の克服を目的とするものであり、その限
界とは多糖類の分子上に結合を目的とする単位の官能基
付与に通常または実際に使用される試薬と充分に反応性
がある、水酸基以外の官能基が存在しないことである。
残留水（及び水酸基）は凍結乾燥及びP2O5を用いた真空
乾燥により除去される。そして活性化多糖を形成させる
ための多糖の活性化、求核剤により官能基を付与された
多糖を形成させるための二端求核剤との反応、及び親電
子部位またはチオール基のいずれかを形成する試薬によ
る官能基付与はすべて多糖を共有結合で修飾するため及
び結合体製造時における多糖上に官能基を発現させるた
めに行うものである。
次工程では、解重合した多糖は活性化剤と多種の重量
比が1:5から1:12の間にある二官能性試薬と約０゜−15
℃で10分乃至１時間撹拌反応させることにより活性化さ
れる。臭素化シアンによる活性化は本発明により可能で
あるが、この試薬は多糖類の活性化においてごくわずか
に利用されているのみで好適ではない。
実際、多糖の活性化を行うのに好適な二官能性試薬は
炭酸誘導体 （式中、R2及びR3は独立にイミダゾリルのようなアゾリ
ル；ハロゲン化物;p−ニトロフエニル、ポリハロフエニ
ルのようなフエニルエステルである）を含む。
特に好適な試薬、カルボニルジイミダゾールが水酸基
と反応して多糖のイミダゾリルウレタンを生成する。例
えばニトロフエニルクロロホルメートを含むアリールク
ロロホルメートは多糖の混合炭酸エステルを生成する。
どちらの場合においても、得られる活性化多糖はアミン
類のような求核試薬に対し反応性しやすく、従つてそれ
ぞれのウレタンに変換される。
次工程では、活性化多糖は、アミン、特に 〔式中、ｍは０乃至４、ｎは０乃至３、ＹはCH2、Ｏ、
Ｓ、NR′、CHCO2H（式中、Ｒ′はＨ、C1−またはC2−ア
ルキルである）であり、但しＹがCH2の場合、ｍとｎと
は同時に０とはならず、ＹがＯまたはＳの場合、ｍは１
を超えｎも１を超える〕のようなジアミンである求核試
薬と、アミンが大過剰（即ち、例えば、使用した活性化
剤に対しアミンが50から100倍過剰のモル濃度）状態で
反応させる。反応は氷浴中で15分乃至１時間保つた後、
約17゜−40℃を15分乃至１時間保つ。
1,4−ブタンジアミンのようなジアミンと反応させた
場合、活性化多糖は突出したアミンを有するウレタン型
多糖となり、さらにアシル化により官能基付与を行うこ
とができる。混合炭酸エステル体でも容易にジアミン類
と反応しアミノ基の突出となる。
別法として、活性化多糖は、ジアミノアルカンのモノ
ハロアセトアミド誘導体、例えば４−ブロモアセトアミ
ドブチルジアミン〔ダブリユ．ビー．ローソン（W.B.La
wson）ら、ホツペ・ザイラース・ゼツト・フイジオロ・
ケム（Hoppe Seyler's Z.Physiol.Chem.）第349巻、251
頁（1968年）参照〕のような求核剤と反応し、親電子部
位が突出し共有結合により修飾された多糖が生成する。
また、活性化多糖はシステアミン（アミノエタンチオー
ル）、シスチン及びペプチド合成分野においてよく知ら
れている誘導体の例のようなアミノチオールと反応する
と、突出したチオール基を有する多糖を製造することが
できる。両方の場合とも、共有結合で修飾した多糖と修
飾した細菌由来“輸送”タン白とを結合させる前にさら
に官能基付与を行う必要はない。
多糖製造における最終工程では、もし必要ならば、さ
らに求核剤で官能基付与をした多糖を親電子性（即ち、
親硫黄性）部位を形成する試薬またはチオール基を形成
する試薬のいずれかと反応させ官能基付与を行う。
親電子部位を形成するのに使用する適当な試薬は、例
えば、 （式中、ＲはＨまたはCH3;XはCl、Br、Ｉであり;X′は
ニトロフエノキシ、ジニトロフエノキシ、ペンタクロロ
フエノキシ、ペンタフルオロフエノキシ、ハロゲン化
物、Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル）、または
アシドである）のようなα−ハロアセチルまたはα−ハ
ロプロピオニル誘導体へのアシル化剤、特にクロロ酢
酸、α−ブロモプロピオン酸、を含み、反応はpH8から1
1（必要ならば塩基を添加することによりこの範囲内に
維持する）、約０゜乃至35℃の温度で10分乃至１時間行
う。アミノ基を誘導した多糖は、硫黄置換をうけやすい
適当な官能基が付与された多糖類を製造するために、活
性マレイミドアミノ酸〔オー．ケラー（O.Keller）ら、
ヘルフ・ヒミ・アクタ（Helv.Chim.Acta,）第58巻、531
頁（1975年）参照〕によりアシル化し、マレイミド基 （式中、ｐは１乃至３である）を製造するか；ブロモ酢
酸ｐ−ニトロフエニルエステルのような２−ハロアセチ
ル化剤でアシル化するか；またはα−ハロケトンカルボ
ン酸誘導体、例えば 〔ベリヒテ（Ber.）、第67巻、1204頁（1934年）参照〕
でアシル化することができる。
チオール基を形成させるために使用する適当な試薬
は、例えば、チオラクトンのようなアシル化剤、例えば （式中、R4はC1−C4アルキルまたはC6H5、C10H13のよう
な単環または二環性アリール;pは１乃至３である）； （式中、ｍは０乃至４、R5はC1−C4アルキルまたはC
6H5、Ｘ′は上記定義に従う）を含み、次にHSCH2CH2OH
による処理；または （式中、ｍ、R5、Ｘ′は上記定義に従う）による処理、
次にジチオスレイトールによる処理を含む。これらの反
応は窒気雰囲気下約０゜−35℃、pH8−11（必要なら
ば、塩基を添加しpHをこの範囲に維持する）で１乃至24
時間行う。例えば、アミノ基を誘導された多糖を と反応させて適当に官能基が付与された多糖を製造す
る。
これらの工程により、Ps−Ａ−Ｅγ−またはPs−Ａ′
−SH−（式中、Ｅγは Ａ、Ａ′、Ｒ、Ｘ、ｐは上記定義に従う）の形態である
共有結合で修飾した中性多糖類が製造される。
B. タン白の製造 多糖と結合させるべきタン白を別個に官能基付与する
ことは、米国特許出願第608,738号（1984年５月10日出
願）に示されているようにタン白とチオール基を形成さ
せる１種またはそれ以上の試薬との反応、またはタン白
の親電子性（即ち、親硫黄性）中心を形成させる１種ま
たはそれ以上の試薬との反応を含む。
親電子性の官能基を付与した多糖との結合体を製造す
る場合、タン白をチオール基を形成させる１種またはそ
れ以上の試薬、例えば前に記載したような多糖類の上に
チオール基を形成させるために使用したアシル化剤と１
ないし２工程で反応させる。またチオール化タン白はア
タツシ（Atassi）ら、バイオヘム・エ・バイオフイシ・
アクタ（Biochem.et Biophys.Acta）、第670巻、300頁
（1981年）に示されているようなカルボキシ−活性化タ
ン白をアミノチオールでアミノ化することにより製造す
ることができる。本製造工程における好適な実施態様に
は、タン白の突出したアミノ基（即ち、リシル基）をＮ
−アセチルホモシステインチオラクトンの等重量を用い
て約０゜乃至35℃、pH8乃至11で５分乃至２時間直接ア
シル化することが含まれる。
Ｅ′Ｂ′が の場合、官能基を付与したタン白の製造条件及び方法
は、反対部分の多糖を活性マレイミド酸と反応させて製
造するという前記の記載に従う。
突出したチオール基を有する共有結合で修飾された多
糖との結合体を製造する場合、タン白を親電子性中心を
形成させる試薬、例えば （式中、XX′は上記定儀を従う）；及び （式中、Ｘ′は上記定義に従う）を含むアシル化剤でア
シル化する。また親電子性中心を有する適当なタン白
は、例えば、突出したリシルアミノ基を、活性マレイミ
ド酸、例えば によりアシル化することによるか、または、カルボキシ
−活性化タン白をジアミンのモノハロアセチル誘導体と
反応させることにより製造されるものを含む。
C. 結合体の製造 結合体の製造は単に、突出した親電子性中心を有し共
有結合で修飾された多糖類のいずれかと突出したチオー
ル基を有するタン白のいずれかとを窒素雰囲気下大体等
重量化、pHは７乃至９、約17゜乃至40℃で約６乃至24時
間反応させることであり、これにより共有結合体が得ら
れる。該反応の例には： ここにおいて４−ブロモアセトアミドブチルアミンと反
応させた活性化多糖をＮ−アセチルホモシステインチオ
ラクトンと反応させたタン白と反応させると結合体が形
成される、及び： （式中、Ｙ″はC2−C8アルキル基である）、ここにおい
て活性マレイミド酸と反応させアミノ基を誘導された多
糖を、カルボキシを活性化させアミノチオールでアミノ
化したタン白と反応させると結合体が形成されるものを
含む。
同様に、突出したチオール基を有し共有結合で修飾さ
れた多糖類のいずれかと突出した親電子性中心を有する
タン白のいずれかとを反応させると共有結合体が得られ
る。該反応の例には： ここにおいてアミノチオールと反応させた活性化多糖を
カルボキシを活性化しジアミンのモノハロアセチル誘導
体と反応させたタン白と反応させると結合体を形成させ
るものである。
これらの結合体は固定角ローターを用いて約100,000X
g、約１゜乃至20℃で約２時間遠心分離するか、または
ゲル浸透、イオン排除クロマトグラフイー、密度勾配遠
心、その他の特異的吸着クロマトグラフイーを含む他の
種々の精製方法のいずれかに付し、共有結合で結合に関
与しなかつた多糖類及びタン白を除去し、そして目的の
生物学的活性を確認する方法として二属のスペーサー
（二価中間結合物）に関する共有結合性の検定（下記参
照）を行う。
D. 共有結合性の確認分析 結合体の共有結合性の確認そしてそれ故に結合体の安
定性の確認のための結合体の分析は出願人により、結合
体を加水分解（好適には6NHCl、110℃で20時間）し、チ
オエーテル結合及びタン白の構成アミノ酸を含む加水分
解に安定なスペーサー（中間結合物）のアミノ酸を定量
分析することにより達成される。必要ならば、タン白に
含まれる適当なアミノ酸標品と比較することにより、結
合体の共有結合性を反映する残りのアミノ酸値について
タン白中のアミノ酸の寄与を除くことができるか、また
はスペーサーのアミノ酸が分析におけるタン白のアミノ
酸標品以外に現れることで示されることができる。共有
結合性の分析は、生物学的に活性な成分の濃度の増強を
明らかにするための精製法の検討に対しても有用であ
る。上記の例において、ペプチド結合及びその他の加水
分解に不安定な結合におけるPs−Ａ−Ｅ−Ｂ−Proの分
解によつて、 の加水分解はＳ−カルボキシメチルホモシステイン、 を遊離し； の加水分解はアミノジカルボン酸、 を遊離し； の加水分解は、Ｓ−カルボキシメチルシステアミン、H2
NCH2CH2SCH2CO2Hを遊離する。次に、スパツクマン（Spa
ckman）、ムーア（Moore）、及びスタイン（Stein）の
方法のようなクロマトグラフ法を便利に応用して構成ア
ミノ酸の比を決定できる。
E. 応用 本発明の結合体の１種またはそれ以上は用いた多糖を
含む菌と同族の細菌によつて惹起される菌血症に対し、
能動免疫、予防的に、または治療用として哺乳類に使用
することができる。本発明の好適な実施態様では、本発
明の結合体を単独で；肺炎連鎖球菌（Streptococcus pn
eumoniae）7F、14、37型のような他の中性多糖類を含む
他の結合体と一緒に；ヘモフイルス・インフルエンザ
（Haemophilus influenza）ｂ型または肺炎連鎖球菌（S
treptococcus pneumoniae）6B、19F、23F型生物のよう
なポリアニオン性多糖類を含む他の結合体と一緒に；ま
た肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）３型多糖
のような非結合型多糖類と一緒に；一価または多価ワク
チンの中に入れて使用することができる。
能動免疫は、投与時投与する結合体における各結合形
態の多糖の、また投与時投与する非結合型多糖の有効量
（測定可能量の抗体、例えば２乃至50μｇを製造できる
量）を、滅菌生理食塩水のような薬学的に許容される担
体と共にまたは使用せずに注射することにより達成する
ことができる。アジユバント〔例えば、みようばん（al
um）〕を使用することも本発明の範囲内に含まれること
を企図している。
本発明の好適な実施態様では、とりわけ本発明記載の
結合体を含む一価または多価組成物は人間、特に新生児
及び幼児の活性免疫原性ワクチン接種用に使用される。
またさらに安定性を維持するために、使用前に該結合体
を乳糖の存在下（例えば、50μg/mlの肺炎球菌多糖/10m
g/mlの乳糖）凍結乾燥することができる。
好適な投与レベルは、単回投与において、肺炎球菌多
糖の結合体に関し結合体の形態で多糖25μｇに対応した
投与結合体またはその誘導体の量、非結合型多糖25μｇ
及び米国特許出願第608,738号（1984年５月10日出願）
に記載のポリアニオン性多糖類を含む結合体の結合体ま
たはその誘導体の投与量である。必要ならば、結合体形
態において多糖10μｇに対応する量のエイチ・インフル
エンザ（H.influenzae）ｂ型多糖の結合体またはその誘
導体をさらに１回または２回の投与を行うことができ
る。
本発明はさらに以下の実施例で参考のため定義する
が、説明するためのものであり限定するものではない。
実施例1. 肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）14型夾膜多
糖の製造 植菌及び種菌の展開 工程A:実際の種菌の製造 肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）14型菌の
植菌用種菌の凍結乾燥試験管〔ペンシルバニア大学、
ロバート オーストリアン博士（Dr.Robert Austrian）
から入手〕を滅菌ビーフハートインフユージヨンブロー
ス〔水0.9にハートインフユージヨンブロース（Difc
o）25gを溶解〕1mlに懸濁、次にこの懸濁物を５枚のウ
サギ血液寒天プレート（精製寒天20g、ハートインフユ
ージヨンブロース25g、脱フイブリンウサギ血液100ml、
蒸留水0.9）に各プレートに約0.2ml播種した。37℃培
養約18時間後、プレート上に生育した菌を各ウサギ血液
寒天プレート（ビーフハートインフユージヨンブロース
5mlずつ）に再懸濁し保存した。
この再懸濁した菌1.5mlを使用して液体血液培地（ビ
ーフハートインフユージヨンブロース90mlと脱フイブリ
ンウサギ血液10ml）フラスコ６本に接種、そして撹拌せ
ずに37℃で約18時間培養した。
工程B:2邪魔板なし三角フラスコ 工程Ａで種菌を培養した肺炎連鎖球菌（Streptococcu
s pneumoniae）14型菌のフラスコに集め、この種菌20ml
を滅菌肺炎球菌接種用培地（下記参照）900ml及び25％
ブドウ糖溶液100mlを含む２邪魔板なし三角フラスコ
５本それぞれに接種した。フラスコのpHは12％炭酸水素
ナトリウム溶液の添加によりpH6.0−7.0に保ち、37℃で
７時間培養後（その時典型的なOD660値は2.90であつ
た）、フラスコ４本から菌を集めた（その菌液はOD660
が2.80、pHは6.8であつた）。
肺炎球菌接種用培地γ 大豆ペプトン 20 g 酵母エキス 限外過物（１） 100 ml NaCl ５ g K2HPO4 2.5 g ２％フエノールレツド 0.5ml 蒸留水 １ γ溶液は121℃、25分高圧滅菌することにより滅菌し
た。
塩類及び大豆ペプトンは発熱原を含まない少量の熱水
に溶解しさらに発熱原を含まない熱水を最終容量になる
まで加えた。培養槽またはフラスコは121℃で約25分滅
菌、冷却後、酵母エキス限外過物（１）を接種前に無
菌的にフラスコまたは培養槽に加えた。
（１） 酵母エキス限外過物：ビール酵母エキス100g
〔アンバー（Amber）社製〕を蒸留水１に溶解、分子
量50,000を有する分子を除去するためH10×50カートリ
ツヂによるアミコン（Amicon）社製DC−30ホローフアイ
バーで限外過を行つた。液を集め、0.22μの膜を通
すことにより滅菌生成物とした。
工程C:70種菌培養槽 工程Ｂの集めた生成物を、開始pH6.8の肺炎球菌種菌
用培地（下記に示すように調製）を含む70培養槽に接
種するために使用した。
培養は37℃、撹拌を100rpmに保ち、光学密度（O.D.）
が3.25に達するまで（約４時間後）O.D.、グルコース濃
度試験、pHを検査した。
完全肺炎球菌種菌用培地 大豆ペプトン 800 g 酵母エキス 限外過物（１） ４ K2HPO4 100 g NaCl 200 g 25％グルコース溶液（２） ４ ユーコン（Ucon）B625消泡剤 14 ml 蒸留水 31.8 （２） グルコースはガラス器具で蒸留した水を用いて
滅菌25％溶液として調製し、酵母エキス限外過物と共
に70培養槽に添加した。
工程D:800生産培養槽 工程Ｃの生成物約40を肺炎球菌生産用培地（下記に
示すように調製）530を含む800培養槽に接種するた
めに使用した。
培養は37℃、撹拌を100rpmに保ち、O.D.、グルコース
濃度、pHを約２時間毎に検査しながらO.D.が２時間前と
同じになるまで行い、その時点で培養が終了した（６時
間後典型的な最終O.D.は5.2であつた）。
肺炎球菌生産用培地 大豆ペプトン 10.5 Kg 酵母エキス限外過物（１） 52.5 K2HPO4 1.313Kg NaCl 2.625Kg 25％グルコース溶液 58 Ucon B625消泡剤 95 ml 蒸留水 418.5 収穫及び不活性化 培養液は液化フエノール8.2を含む“殺菌槽”に収
穫し不活性化した。
34及び58％エタノール沈殿 殺菌培養液640に95％エタノール213.3を20乃至26
℃で撹拌しながら3.6／分の割合で添加し、次に95％
エタノール117を２／分の割合で添加、最終容量を9
50、最終濃度を35容量％エタノールとした。混合物は
22℃でさらに４時間撹拌し分画を完全にし、上澄液を５
台の４インチシヤープレス（Sharples）遠心機15000rpm
（約４／分の流速）で集めた。不溶性沈殿物を廃棄
し、透明な液体にさらに95％エタノール559を7.6／
分の割合で添加し58％エタノールとした。混合物を21℃
でさらに５時間撹拌し沈殿を完全なものとした。
第二沈殿物の回収 得られた34％エタノール可溶−58％エタノール不溶沈
殿物を４−インチシヤープレス遠心機15000rpm（流速約
４／分）を用いて遠心分離により集め、58％エタノー
ル上澄液は廃棄した。粗生成物の収量は湿重量で2.435K
gであつた。
24％イソプロピルアルコール沈殿 58％エタノール不溶性物質2.435Kgを同様の方法によ
る２回目の培養で製造した物質1.626Kgと合わせ、得ら
れた物質4.061Kgを、デイマツクス（Daymax）分散容器
中15から29℃でガラス器具で蒸留した水30を用いて、
懸濁物が均質になるまで12分混合した。さらに蒸留水66
を懸濁物に添加しこの混合物を４時間撹拌した。５％
酢酸ナトリウム溶液24をこの混合物に添加し、pHは氷
酢酸を添加することにより6.5とした。
溶液120に、イソプロパノール37.9を15乃至29℃
で撹拌しながら0.3／分の割合で添加することによ
り、24％イソプロピルアルコール濃度とした。さらに４
時間撹拌後、混合物を４インチシヤープレス遠心機1500
0rpm（流速0.35／分）、さらにエレクトロヌクレオニ
クス（Electronucleonics）社製K3−超遠心機（28,000r
pm）200−400ml/分を用いて流出液が透明になるまで遠
心分離し、不溶性沈殿物を廃棄した。
39％イソプロピルアルコール沈殿及びペレツト状粗生成
物の取得 前段階で得た24％イソプロピルアルコール可溶性上澄
液に、撹拌しながらイソプロピルアルコール38.8を0.
3／分の割合で添加することにより39％イソプロパノ
ールとした。混合物（194）を撹拌しながら3.25時間
放置した後、２台の４−インチシヤープレス遠心機15,0
00rpm（流速0.5／分）を用いて約18時間遠心分離を行
い、ペレツト状粗多糖（2.006Kg）を得た。
限外過 遠心分離で得たペレツトを、蒸留水20を含むデイマ
ツクス（Daymax）混合機へ移し、懸濁物が均質になるま
で30分間撹拌した。この懸濁物をガラス器具で蒸留した
冷水300で希釈、10台のHF26.5−45−XM50カートリツ
ジを用いたロミコン（Romicon）限外過器により約23
℃、定常圧で限外過した。内部保留液は最小量まで濃
縮、ロミコン容器を洗浄し洗浄液は内部保留液に加え、
その最終容量は86であつた。限外過液は廃棄した。
セタブロン沈殿 セタブロン（N,N,N−トリメチル−１−ヘキサデカン
アミニウムブロミド）1.84Kgを蒸留水６に溶解、この
溶液を前工程で得た内部保留液（retentate）86に撹
拌しながら約１時間かけて添加した。４時間経過後、沈
殿後た不純物（1.925Kg）をK3超遠心機（28,000rpm）、
５℃で８時間遠心分離することにより集め、上澄液を集
めた。
イソプロパノール分画 酢酸ナトリウム三水和物28.55Kgを上記の上澄液86
に撹拌しながら10分かけて添加し、溶液のpHは氷酢酸を
添加することにより6.6とした。この溶液にイソプロパ
ノール45.1を撹拌しながら0.38／分の割合で添加し
28％イソプロパノールとし、さらに４時間撹拌した後、
K3超遠心機（28,000rpm）に移し、ここで得る沈殿12gを
集め廃棄した。イソプロパノール38.9を撹拌しながら
上澄液116に0.3／分の割合で加え（最終濃度42
％）、さらに４時間撹拌後、溶液を２台の４インチシヤ
ープレス遠心機に15から29℃、15,000rpm（各々流速1.3
／分）で循環させ、流出液は廃棄した。
磨砕及び最終生成物の取得 得られたペレツト状多糖は無水エタノール３を加え
30秒撹拌−30秒停止による方法を用いた１ガロンワーリ
ング（Waring）ブレンダーによりペレツトが無色堅牢な
粉末になるまで磨砕した。この粉末をテフロン過板を
備えたブフナーロートで集め、そのままで無水エタノー
ル１で４回、アセトン２で２回洗浄した。生成物を
ロートから取出し時計皿に移し20乃至25℃で真空乾燥し
た（約18時間）。生成物の最終収量は乾燥重量で315.2g
であつた。またその性質は以下に示す通りである： 表１−１ 肺炎球菌14型多糖の化学分析結果 分析項目 結果 水分（TG） 6.3％ タン白 4.8％ 核酸 0.6％ ヘキソサミン 28.6％ 窒素 1.6％ リン 0.2％ 分子サイズ 0.19−0.21 （セフアロース4BにおけるKD） 以下の方法を上記分析結果を求めるために使用した。
1. 水分−パーキンエルマー（Perkin−Elmer）社製熱
天秤TSG−１を用いた標準的な熱重量測定（100℃まで損
失重量） 2. タン白−ローリー法；ローリー（Lowry）ら、ジエ
ー・バイオロ・ケミ（J.Biol.Chem.）、第193巻、265頁
（1951年）。
3. 核酸−紫外吸収法；ワールブルグ（Warburg）とク
リスチヤン（Christian）、バイオヘミー・ゼツト（Bio
chem.Z.）、第310巻、384頁（1942年）。
4. ヘキソサミン−エルソン（Elson）とモルガン（Mor
gan）、バイオケミ・ジエー（Biochem.J.）、第27巻、1
824頁（1933年）。
5. 窒素−パーキン−エルマー（Perkin Elmer）240−C
HN元素分析機を用いた燃焼法。
6. リン−モリブデン酸法；チエン（Chen）ら、アナリ
テイカル・ケミー（Anal.Chem.）、第28巻、1756頁（19
56年）。
実施例2. Neisseria meningitidis B11血清型２膜タン白の製造 A. 培養 1. ナイセリア髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）B1
1群 ナイセリア髄膜炎菌の凍結乾燥菌体を含む試験管〔エ
ム・アーテンスタイン（M.Artenstein）博士、Walter R
eed Army Institute of Research（WRAIR）、Washingto
n、D.C.より入手〕を開封しユーゴンブロース（Eugonbr
oth）（BBL）を添加した。菌体をチヨコレート寒天プレ
ート（BBL）に画線し、５％CO2下37℃で36時間培養、そ
の後菌体を10％スキムミルク培地〔デイフコ（Difc
o）〕に収穫し、一定量に分注、−70℃で凍結した。微
生物はウライル（WRAIR）より提供される特異抗血清及
びデイフコ（Difco）社より提供される型別血清による
凝集で明確に同定された。
この初代培養菌体をチヨコレート寒天プレートに画線
し、５％CO2下37℃で18時間培養、その後菌体を10％ス
キムミルク培地に収穫し、1mlずつに分注、−70℃で凍
結した。微生物は再びWRAIRより提供される特異抗血清
及びデイフコにより提供される型別血清による凝集で明
確に同定された。
第２代培養菌体のバイアルを融解し、10枚のコロンビ
アシープ（Columbia Sheep）血液寒天プレート（CBAB−
BBL）に画線した。このプレートは５％CO2下37℃で18時
間培養、その後菌体を10％スキムミルク培地100mlに収
穫し、0.5mlずつに分注、−70℃で凍結した。微生物は
特異抗血清による凝集、糖の資化性、グラム染色から明
確に同定された。
この代の培養菌体のバイアルを融解し、ミユラー−ヒ
ントン（Mueller−Hinton）ブロースで希釈、40枚のミ
ユラー ヒントン寒天培地に画線した。このプレートは
６％CO2下37℃で18時間培養、その後菌体を10％スキム
ミルク培地17mlに収穫し、0.3mlずつに分注、−70℃で
凍結した。微生物はグラム染色、特異的抗血清による凝
集、オキシダーゼの試験により明確に同定された。
2. 培養及びペレツト状細胞の取得 a. 接種の展開接種は上記ナイセリア髄膜炎菌Ｂ群、Ｂ
−11菌（第４代）の凍結バイアル0.5ml2本から行つた。
４本のミユーラー−ヒントン（Mueller−Hinton）寒天
培地を入れたブレーク（Blake）瓶に接種し、約18時間
収穫、ゴシユリヒ（Goschlich）酵母透析物培地pH7.295
へ接種した。O.D.〔パーキンエルマー（Perkin Elme
r）社製〕は660nmで0.065と調節した。菌は５本の２
三角フラスコ（培地１含；下記参照）で37℃、振盪培
養とした。O.D.は45−、75−、120−分の時間で検査し
た。培養液約４はO.D660が0.81〔スペクトロニツク
（Spectronic）20により〕となつた。
試料3mlはグラム染色、CBAB、ミユーラー−ヒントン
（Mueller−Hinton）、酵母エキス−グルコースプレー
ト上での生育、凝集について試験を行つた。すべての結
果は満足を与えるものであつた。
b. 70種菌培養槽 培養種菌約3600mlを完全生産培地（下記参照）42.6
を含む滅菌70培養槽に接種した。
70培養槽の設定は、37℃、通気10／分、185rpm
で、一定のpH7.0に制御しながら5.5時間行つた。
培養液はミユーラー−ヒントン（Mueller−Hinton）
寒天プレート、酵母エキス−グルコース、ウサギ血液寒
天プレート〔メルク（Merck）製〕に植菌、37℃で培養
及びナイセリア髄膜炎菌Ｂ群抗血清と凝集の検査を行つ
た。ミユーラー−ヒントン寒天プレート、酵母エキス−
グルコースプレート、ウサギ血液寒天プレートの生育は
正常で凝集反応は陽性であつた。この培養に関し、5.5
時間後の最終O.D660は0.840であつた。
c. 800生産培養槽 培養種菌約46.2を完全生産培地（下記参照）568.2
を含む滅菌800培養槽へ接種した。培養は37℃、60
／分の通気、100rpm及びpH7.0での一定pHへの制御に
より行つた。
培養液を不活性化する前に、培養液をミユーラー−ヒ
ントン寒天プレート、酵母エキス−グルコースプレー
ト、ウサギ血液寒天プレートに接種、37℃で培養及びナ
イセリア髄膜炎菌の抗血清と凝集の検査を行つた。ミユ
ーラー−ヒントン寒天プレート、酵母エキス−グルコー
スプレート、ウサギ血液寒天プレート上での生育は正常
で凝集反応は陽性であつた。この培養に関し、接種13時
間後の最終O.D.は2.24であつた。
3. 比濁計用フラスコ及び70−と800−培養槽の完全
培地 Ａ画分 Ｌ−グルタミン酸 1.5 g/ NaCl 6.0 g/ Na2HPO4無水物 2.5 g/ NH4Cl 1.25g/ KCl 0.09g/ Ｌ−システインHCl塩 0.02g/ Ｂ画分〔ゴシユリヒ（Gotschlich）酵母透析物〕 デイフコ社製酵母エキス1280gを蒸留水6.4に溶解し
た。この溶液を３個H10SMカートリツヂ使用アミコン（A
micon）社製DC−30ホーローフアイバー透析器２台によ
り透析した。透析物及びMgSO4・7H2O 384g、グルコース
3200gを透析物で溶解し、総量を蒸留水で15にした。p
HはNaOHにより7.4に調節し、ミリポア（Millipore）
（0.22μ）を用いた過滅菌後、Ａ画分を含む培養槽に
加えた。
比濁計フラスコ用:A画分１及びＢ画分25mlを添加し、
pHをNaOHにより7.0−7.2に調節した。
70培養槽用:A画分41.8及びＢ画分900mlを添加し、p
HをNaOHにより7.0−7.2に調節した。
800培養槽用:A画分553及びＢ画分15.0を添加し、
pHをNaOHにより7.0−7.2に調節した。
d. 収穫及び不活性化 培養終了後、フエノール（0.5％v/v最終濃度）を別容
器に入れ、これに培養物を入れる。この物質は室温で菌
が生存しなくなるまで穏やかに撹拌する（約24時間）。
e. 遠心分離 ４℃で24時間放置後、不活性化培養液614.4をシヤ
ープレス遠心機により遠心分離した。フエノール添加後
のペレツト状菌体は3.875Kgであつた。
B. 単離精製 工程1. 細菌菌体の洗浄 単離精製のため、上記0.5％フエノールによる不活性
化ペレツト200gを滅菌蒸留水800mlに懸濁、マグネチツ
クスターラーで撹拌し粒状懸濁物とした。懸濁した菌体
を５℃、20,000Xgで60分遠心処理〔ベツクマン（Beckma
n）社製19Tiローター、14,500rpm〕することによりペレ
ツトにした。
工程2. 抽出 洗浄菌体を、ソルバール（Sorval）社製2quart omnim
ixerで３の指示にて60秒の条件を用い、0.5％デオキシ
コール酸ナトリウム含有0.1Mトリス−0.01MEDTA緩衝液
（TED緩衝液）2000mlに懸濁した。均質な懸濁物を500ml
三角フラスコ16本に分注し、振盪湯剪機56℃で15分間抽
出を行つた（at temperature）。
抽出物は５℃、20,000xg（ベツクマン社製19Tiロータ
ー、14,500rpm）で60分間遠心した。粘液性上澄液を傾
斜法により得（総量1980ml）、４℃で保存した。
抽出したペレツト状菌体は上記TED緩衝液2000mlに再
懸濁した。懸濁物は前記のように56℃で15分間抽出を行
つた後遠心処理をした。上澄液を傾斜法により得（総量
2100ml）、４℃で保存した。
工程3. 限外過による濃縮 工程２で得た抽出上澄液をひとまとめにした（総量40
05ml）。この上澄液の２を、２枚の0.45μデユラポア
膜（表面積1/2平方ft）を装着したミリポア（Millipor
e）社製ペリコン（Pellicon）過器付ニユーブランズ
ウイツク（New Brunswick）社製２培養器へ入れた。
抽出上澄液を培養器中25℃で90分間の濃縮操作に付し
た。試料を平均膜圧27.5psiにより10倍に濃縮した。
工程4. 血清型タン白の収集と洗浄 工程３における内部保留液（205ml）を５℃、160,000
xg（ベツクマン社製45Tiローター、37,000rpm）で２時
間遠心処理を行い血清型タン白をペレツト化した。上澄
液は傾斜法により除き廃棄した。
ペレツト化したタン白を秤量（8.12g）、次にガラス
棒とダンス（Dounce）ホモゲナイザーを手動操作しTED
緩衝液（緩衝液190ml;20ml/gペレツト）に懸濁した。懸
濁物は500ml三角フラスコ中56℃で振盪しながら15分間
抽出を行つた（at temperature）。懸濁物は５℃、160,
000xg（ベツクマン社製45Tiローター、37,000rpm）で２
時間遠心分離に付した。上澄液は傾斜法により除き廃棄
した（量は190ml）。ペレツトは上記のようにしてTED緩
衝液190mlで２回洗浄した。
工程5. 生成物の回収 工程４で得た洗浄ペレツト化タン白はガラス棒とダン
スホモゲナイザーを用い蒸留水100mlに懸濁し、完全な
懸濁物とした。この懸濁物に関しローリー（Lowry）法
によるタン白値は17.0mg/mlであつた。この時点で懸濁
物200mgを実験用に残した。残された大部分の懸濁物（9
1ml）をガラス器具で蒸留した蒸留水102.4mlにより8.0m
g/mlまで希釈した。水性懸濁物は凝集物を除くために1
2,000xg（ベツクマン社製45Tiローター、10,000rpm）で
15分遠心処理した。
上澄生成物は軟かいペレツト状凝集物を避けるために
ピペツトで注意深く集めた。生成物にラベルを付し（総
量182.5ml）ある一定量は無菌性と発熱性物質の試験を
行つた（滅菌生成物；発熱性物質は含まれず）。生成物
は結合体製造において使用するまで４℃で滅菌物質とし
て保存し、使用時に分析により性質を明らかにした。収
率は9.5mgローリー（Lowry）法タン白/g元の菌体ペレツ
トであつた。
以下の方法が上記分析を行うために使用したものであ
る： 1. タン白−実施例１に同じ 2. 核酸−呈色反応はオルシノール反応〔バイアル（Bi
al）〕で観察しタン白濃度に対し百分率で計算し1.8％R
NAに対応した。DNAに対するジフエニルアミン試験は滅
菌保存溶液中のタン白に対し百分率で計算し0.6％のDNA
含量を示した。
3. 中性糖−タン白に対する百分率含量で求めた中性糖
含量はアンスロン比色法〔スコツト（Scott）とメルビ
ン（Melvin）、アナリテイカル・ケミストリー（Anal.C
hem.）第25巻、1656頁（1953年）〕を用いて測定した。
4. シアル酸−シアル酸含量はレゾルシノール−塩酸法
〔スベナーホルム（Svennerholm）、バイオケミ・バイ
オフイズ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、第24巻、
604頁（1957年）〕を用いて測定した。
5. 分子量−メルカプトエタノール変性タン白の分子量
はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動〔ネーチユアー
（Nature）第227巻:680頁（1970年）、LKB応用ノート
（Application Note）306号〕を用いて決定した。
実施例3. 肺炎連鎖球菌14型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型
外膜タン白結合体の結合工程中に遠心分離を使用する製
造。
I. 水性ヒドラジンを用いる肺炎球菌14型多糖の断片化 100ml丸底フラスコにH2O24ml、97％ヒドラジン1.92ml
を入れ、温度が100℃になるまで沸騰した湯浴中で処理
した（約３分）。これに少量ずつ肺炎連鎖球菌14型多糖
（Pn14）240mgを加え、得られた溶液を迅速に7.0分撹拌
した。次にフラスコを氷浴中で急冷し、内容物はスペク
トロポール２チユービング（分子量排除限界12,000−1
4,000）に対しH2O32、５時間で透析した。透析は新し
いH2O32で16時間くり返した。透析物は50ml遠心管に
移し、臨床用遠心機で遠心分離し泥滓を除いた。上澄液
を凍結乾燥すると断片化Pn14 163mgを与えた。
II. 解重合Pn14のブタンジアミン誘導体の形成 断片化Pn14 150mgを乾燥した50ml丸底フラスコに入
れ、ジメチルスルホキシド（DMSO）9mlで覆い、N2で封
じた。混合物を54℃で5.0分、さらに、室温で５分撹拌
した。断片化Pn14のほとんど大部分がこの時点で溶液と
なつた。カルボニルジイミダゾール36mlをこれに加え、
この溶液を40分撹拌した。この間に1,4−ブタンジアミ
ン２塩酸塩溶液（300mg/H2O 6ml;2.5NNaOHでpHを9.45に
調節する）を準備し氷浴中で冷却した。40分撹拌後、DM
SO溶液を冷却したブタンジアミン溶液に加え、室温で4.
5時間撹拌した。これをH2Oの30に対し17.25時間、さ
らに新しくH2Oの４に対し４時間透析した。得られた
透析物を凍結乾燥するとPn14のブタンジアミン誘導体、
Pn−BuA2152mgが得られた。KD＝0.70比濁計単位（基本
多糖の153％）；フルオレスカミン力価＝150 ナノモル
NH2/mg。
III. Pn14の1,4−ブタンジアミン誘導体（Pn14−Bu
A2）のブロモアセチル化 Pn14−BuA2 140mgをpH9.15緩衝液10mlに溶解、この
溶液に、アセトニトリル1mlに溶解したブロモ酢酸ｐ−
ニトロフエニルエステル140mgを加えた。これをH2Oの４
に対し６時間、さらに新しくH2Oの４に16時間、３
回目としてH2Oの４に対し７時間透析した。透析物を
凍結乾燥するとPn14−BuA2のブロモアセチル誘導体（Pn
14−BuA2−BrAc）139mlが得られた。
KD＝0.79比濁計単位＝基本多糖の120％ フルオレスカミン力価＝６ナノモル/mg、差をとること
により（△＝150−６）144ナノモルのブロモアセチル残
基/mgを示している。
IV. Pn14−BuA2−BrAcと官能基付与したN.menigitidis
タン白（NMP）の結合 全遠心操作はポリカーボネート試験管を用い、特に記
載しない場合、ベツクマン社製Ti75ローターにより４
℃、43.000rpmで２時間行つた。
官能基を付与していないタン白（10ml、5.5mg/ml）を
遠心分離し、ペレツトをエチレンジアミン四酢酸59mg、
ジチオスレイトール11.2mg、pH11.3ホウ酸ナトリウム緩
衝液を含むチオール化混合物7mlとダンス（Dounce）ホ
モゲナイザーを用いて再懸濁した。再懸濁後、混合物を
遠心管に移し、血清用ゴム栓で栓をし、空気をN2で置換
した。これを窒素充填箱に入れ、Ｎ−アセチルホモシス
テインチオラククトン54mgを加えた。栓をし窒素充填箱
中に22時間放置後、pHを1MKH2PO4の添加により8.0に調
節した。得られた混合物を遠心分離しペレツトを0.1MPO
4pH8.0緩衝液10mlに再懸濁した。これをまた遠心処理し
残つている低分子を除いた。２回目のペレツトをpH8.0
緩衝液8.5mlにダンス（Dounce）ホモゲナイザーを用い
て再懸濁した。エルマン（Ellman）試験は全量にチオー
ルを6.4マイクロモル含んでいることを示した。
再懸濁したチオール化タン白にPn14−BuA2BrAc 50mg
を添加し、得られた溶液を窒素充填箱に室温で17時間放
置した。これをH2O4に対し６時間透析した。この溶液
の半量（5ml）を遠心管に移し、これにCsCl4.0gを溶解
した。遠心管にH2Oを口まで満たし（10ml）、Tiロータ
ー、４℃、43,000rpmで20時間遠心分離した。得られたC
sCl密度勾配遠心物を1.3mlずつ、ハーケ ブヒラー（Ha
ake Buchler）社製自動Densi Flow 2C装置を用いて分画
した。９分画を集め、その中の第5,6,7番目の分画を一
緒にして、遠心管に移し、CsCl 3.5gを加えた。混合物
は口までH2Oを満たし上記のように24時間遠心分離し
た。遠心物は上記のように分画し、適当な分画を比濁計
で検出し、第３及び４番目を0.1Mリン酸塩緩衝液（pH
7）４に対し16時間、さらにH2O4に対し４時間透析
した。得られた透析物はH2Oで10mlに希釈した。
実測値： 多糖 0.205mg/ml タン白 0.550mg/ml Spinco: Ｓ−カルボキシメチルホモシステイン 0.020マイクロモ
ル リジン 0.156マイクロモル 比 0.128 実施例4. 肺炎連鎖球菌14型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型
外膜タン白結合体の結合工程中にカラムを使用する製
造。
実施例３の工程Ｉ、II、IIIに従つて製造した肺炎球
菌14型多糖のブロモアセチル化1,4−ブタンジアミン誘
導体を実施例２に従つて製造したタン白と実施例３の工
程IVの変法で結合した。
Pn14−BuA2−BrAcとナイセリア髄膜炎菌外膜タン白
（NMP）の結合。
NMP溶液（12.4mg/ml）1.2mlを、飽和NaBO3（pH11.0
0）、エチレンジアミン四酢酸42mg/ml、ジチオスレイト
ール8mg/mlを含む緩衝溶液0.4mlと共に遠心管に入れ
た。遠心管を血清用ゴム栓で栓をし、脱気後空気を窒素
に置換した。窒素充填箱中でこれにＮ−アセチルホモシ
ステインチオラクトン10mgを加えた。この溶液を室温で
17時間放置した。２本のセフアデツクスG25カラム（PD/
10）をpH8.0リン酸緩衝液（0.1M）で平衡化した。反応
混合物にpH8緩衝液0.9mlを加え、全量を最初のカラムに
付した。これをpH8緩衝液3.5mlで溶出した。溶出液の2.
5mlを２回目のＧ−25カラムに付し、これをpH8の緩衝液
3.5mlで溶離した。この溶出液はエルマン（Ellman）試
験によりチオールを525ナノモル（全量）を含んでい
た。これにPn14−BuA2−BrAc13mgを加え、N2下７時間放
置した、これを水４に対し２回（５時間と16時間）透
析した。小量の試料はアミノ酸分析用に凍結乾燥した。
実測値Ｓ−カルボキシメチルホモシステイン0.0073マイ
クロモル；リジン0.104マイクロモル、生成物を100,000
xgで遠心分離し、ペレツトをH2O10mlに再懸濁後再遠心
分離を行つた。10mlに再懸濁するとPn14−BuA2−BrAc N
MP結合物溶液が得られた。
多糖：タン白＝0.25 Ｓ−カルボキシホモシステイン：リジン＝0.07 実施例5. 肺炎連鎖球菌14型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型外
膜タン白結合体のマウスによる抗体反応試験 実施例４に従つて製造した肺炎連鎖球菌14型多糖−ナ
イセリア髄膜炎菌Ｂ血清型外膜タン白結合体をマウスを
用いて免疫原性反応を試験し、結果を下記の表に示し
た。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ａ６１Ｋ 39/385 39:09 39:095） (72)発明者 デボラー エー．ジヨルン アメリカ合衆国．07728 ニユージヤーシ イ．フリーホールド．テイコンデロガ ブ ールヴアード 27 (56)参考文献 特開 昭58−167519（ＪＰ，Ａ) Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．29 （1975），ＰＰ．87−102 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｔｈｏ ｄｓ，Ｖｏｌ．15（1979），ＰＰ．323− 335

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】チオエーテル結合を含む二価スペーサーを
    介して結合された、中性細菌性多糖類及び免疫原性タン
    パク質からなる安定な、共有結合された多糖−タンパク
    質結合体であって、 該二価スペーサーが、式:A−Ｅ−Ｓ−Ｂ （式中、Ｅは 又は であって、ＲはＨまたはCH3であり;Aは であり;mは０〜４、ｎは０〜３、ＷはＯ又はNH、ＹはCH
    2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC1
    若しくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合にはｍお
    よびｎがともに０ではなく、ＹがＯまたはＳの場合には
    ｍが１より大でｎが１より大であり；さらに、Ｂは であって、ｐは１〜３、ｑは０〜２、ＺはNH2、 COOH、またはＨであり、ＤはＣ＝Ｏ、NR′、 であって、Ｒ′は上記定義の通りである）であわらさ
    れ、 該中性細菌性多糖は、肺炎連鎖球菌の7F、14、37型多糖
    からなる群より選ばれ； 該免疫原性タンパク質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質又はエデスチンタンパク質である、上記細菌感染
    症に対するワクチンとして使用できる共有結合された多
    糖−タンパク質結合体。
  2. 【請求項２】二価スペーサーが、式： によって表される特許請求の範囲第１項に記載の、共有
    結合された多糖−タンパク質結合体。
  3. 【請求項３】中性細菌性多糖が、肺炎連鎖球菌14型多糖
    であり、免疫原性タンパク質が髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜
    タンパク質であり、さらに二価スペーサーが で表される、特許請求の範囲第１項に記載の共有結合さ
    れた多糖−タンパク質結合体。
  4. 【請求項４】共有結合された多糖−タンパク質結合体の
    製造方法であって、 該結合体がチオエーテル結合を含む二価スペーサーを介
    して結合された、中性細菌性多糖類及び免疫原性タンパ
    ク質からなる安定な、共有結合された多糖−タンパク質
    結合体であって、 該二価スペーサーが、式:A−Ｅ−Ｓ−Ｂ （式中、Ｅは 又は であって、ＲはＨまたはCH3であり;Aは であり;mは０〜４、ｎは０〜３、ＷはＯ又はNH、ＹはCH
    2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC1
    若しくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合にはｍお
    よびｎがともに０ではなく、ＹがＯまたはＳの場合には
    ｍが１より大でｎが１より大であり；さらに、Ｂは であって、ｐは１〜３、ｑは０〜２、ＺはNH2、 COOH、またはＨであり、ＤはＣ＝Ｏ、NR′、 であって、Ｒ′は上記定義の通りである）であらわさ
    れ、 該中性細菌性多糖は、肺炎連鎖球菌の7F、14、37型多糖
    からなる群より選ばれ； 該免疫原性タンパク質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質又はエデスチンタンパンク質である、上記細菌感
    染に対するワクチンとして用いられる共有結合された多
    糖−タンパク質結合体であり、 該方法が （ａ）中性細菌性多糖を断片化し、その解重合多糖を非
    水性極性非プロトン性溶媒に溶解して可溶化し、 （ｂ）該多糖を二官能性試薬で活性化し； （ｃ）この活性化多糖を二求核剤と反応させ； （ｄ）二求核剤と反応させた活性化多糖を、親電子部位
    を生成する試薬と反応させて、ペンダント状親電子部位
    含有多糖を形成させ、 （ｅ）別個に、免疫原性タンパク質を、チオール基を生
    成する試薬と反応させて、ペンダント状チオール基含有
    タンパク質を形成させ、 （ｆ）ペンダント状求電子部位含有多糖をペンダント状
    チオール基含有タンパク質と反応させて、チオエーテル
    共有結合を介して結合させた多糖−タンパク質結合を結
    合させ、 （ｇ）得られた混合物を遠心分離して、共有結合を形成
    しなかった多糖及びタンパク質を除去する ことからなる共有結合された多糖−タンパク質結合体の
    製造方法。
  5. 【請求項５】中性細菌性多糖類の可溶化が、 中性多糖類を蒸留水中で加熱し、水を除去し、次いで非
    水性で極性の非プロトン性溶媒に溶解させる事からな
    る、特許請求の範囲第４項記載の製造方法。
  6. 【請求項６】５−15％水性ヒドラジンを蒸留水に加える
    特許請求の範囲第５項に記載の製造方法。
  7. 【請求項７】多糖類を70〜100℃の温度で30秒から10分
    加熱し、凍結乾燥及びP2O5を用いた真空乾燥により水を
    除去し、また非水性で極性の非プロトン性溶媒が、ジメ
    チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルア
    セトアミド、ホルムアミド及N,N′−ジメチルイミダゾ
    リジノンからなる群から選ばれる特許請求の範囲第５項
    に記載の製造方法。
  8. 【請求項８】多糖を蒸留水中で加熱し、次に凍結乾燥で
    水を除去し、P2O5を用いた真空乾燥を行うことによって
    該多糖を断片化し、非水性極性非プロトン性溶媒がジメ
    チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルア
    セトアミド、ホルムアミド、またはＮ、Ｎ′−ジメチル
    イミダゾリジノンであり、二官能性試薬が炭酸誘導体 （式中、R2及びR3はそれぞれ独立してアゾリル、ハライ
    ド、又はフェニルエステルである）であり、二求核剤
    が、式： H2N（CH2）mY（CH2）nNH2 （式中、ｍは０〜４、ｎは０〜３、ＹはCH2、Ｏ、Ｓ、N
    R′、 CHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC1若しくはC2のアルキル
    であり、ＹがCH2の場合はｍ及びｎがともに０であって
    はならず、ＹがＯ又はＳの場合はｍが１より大でｎが１
    より大である）のジアミンである特許請求の範囲第４項
    記載の製造方法。
  9. 【請求項９】非水性極性非プロトン性溶媒がジメチルホ
    ルムアミドであり、二官能性試薬がカルボニルジイミダ
    ゾールであり、そして二求核剤が1,4−ブタンジアミン
    である特許請求の範囲第８項記載の製造方法。
  10. 【請求項１０】親電子部位を生成する試薬が、 （式中、Ｘ′はニトロフェノキシ、ジニトロフェノキ
    シ、ペンタクロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキ
    シ、ハライド、Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジ
    ル）又はアジドであり、ＲはＨ又はCH3であり、ＸはC
    l、BrまたはＩである）；あるいは活性化されたマレイ
    ミド酸 （式中、ｐは１〜３、Ｘ′は上記定義の通りである。） である特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】求電子部位を生成する試薬がブロム酢酸
    ｐ−ニトロフェニルエステルである特許請求の範囲第10
    項に記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】菌血症から哺乳動物種を能動的に保護す
    るための組成物であって、チオエーテル結合を含む二価
    スペーサーを介して結合された、中性細菌性多糖類及び
    免疫原性タンパク質からなる安定な、共有結合された多
    糖−タンパク質結合体 ［該二価スペーサーが、次式:A−Ｅ−Ｓ−Ｂ （式中、Ｅは 又は であって、ＲはＨまたはCH3であり;Aは であり;mは０〜４、ｎは０〜３、ＷはＯ又はNH、ＹはCH
    2、Ｏ、Ｓ、NR′又はCHCO2Hであって、Ｒ′はＨ又はC1
    若しくはC2のアルキルであり、ＹがCH2の場合にはｍお
    よびｎがともに０ではなく、ＹがＯまたはＳの場合には
    ｍが１より大でｎが１より大であり；さらに、Ｂは であって、ｐは１〜３、ｑは０〜２、ＺはNH2、 COOH、またはＨであり、ＤはＣ＝Ｏ、NR′、 であって、Ｒ′は上記定義の通りである） 該中性細菌性多糖は、肺炎連鎖球菌の7F、14F、37型多
    糖からなる群より選ばれ； 該免疫原性タンパク質が、髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質又はエデスチンタンパク質である］の免疫学的有
    効量、並びに薬学上許容される担体からなる組成物。
  13. 【請求項１３】さらに、アジュバントを含有する特許請
    求の範囲第12項記載の組成物。
  14. 【請求項１４】共有結合された多糖−タンパク質結合体
    が、式 の二価スペーサーを介して髄膜炎菌Ｂ血清型の外膜タン
    パク質に結合された肺炎球菌14型多糖を含み、免疫学的
    有効量が、組成物中の結合体が結合多糖として多糖を２
    −50μｇを含んでいるものである特許請求の範囲第12項
    に記載の組成物。
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