JPS58167519A - 細胞毒性複合体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な細胞毒性複合体とその製造法に関する。

、更に詳しくＦｉ、殺すべき細胞（以下標的細胞という
）の本つ特定の抗原と特異的に結合しつる免疫グロブリ
ン、あるいはその抗原結合部位を含むフラグメントから
なる構成部分と、細胞毒性物質を結合した重合体からな
る構成部分を有する、新規な細胞毒性複合体とその製造
方法に関するものである。

□１ 従来、抗盾瘍抗体ＶＣｍ胞毒性を結合して抗腫瘍剤を製
造することは公知である。

例えば、特開５８ＳＬ−６１８４０号ＫＦｉ、抗腫瘍免
疫グロブリンと分子中にアミ７基又はカルボ中シル基を
有する制ガン剤を水溶性カルボジイミドの存在下に反応
させ、免疫グロブリン１分子当り５〜１５分子の制ガン
剤がアミド結合で結合された抗腫瘍剤を得たことが開示
されている。また、特開＠ｓ　１−１４４７２３号には
、抗腫瘍抗体゛として抗腫瘍免疫グロブリンのＩＰａｂ
’ｚ量体を用い、これの遊離アミノ基に１過ゴウ素酸ナ
トリウムで酸化された制ガン剤（例えば、ダウノマイシ
ン）を結合させシッフ塩基とし、次いで水素化ホウ素ナ
トリウムにより生成結合を安定化させるととにより、Ｆ
ａｂ’２量体と制ガン剤からなる抗腫瘍剤を得たことが
開示されている。更に、特開１＠　Ｓ　１−１２６２８
１号には、抗腫瘍免疫グロブリンと、１分子当り制ガン
剤を５〜ｓ”ｏ”ｏ分子共有結合しているポリマーｆｆ
ｉ体（例えば、ポリ′グルタミン酸）を、アミド結合に
よって結合させて抗腫瘍剤を得たことが開示されている
。

これらの方法で得られた抗腫瘍剤は、腫瘍細胞と選択的
に結合し腫瘍細胞に毒性を発揮することが期待されるも
のであシ、非常化興味のある薬剤であろうしかしながら
制ガン剤を直接抗体に結合する場合は、免疫グロブ１７
ンに多数の制ガン剤分子を結合すると、抗体の抗原認識
活性が低下してしまうので、かかる困難を回避するため
には、少数の制ガン剤分子を結合する忙とどめざるをえ
危い。しかるに、後者の場合社、製造した抗体−薬剤結
合体の殺ガン細胞能が充分でないという困難に直面する
。

一方、ポリマーを薬剤の担体として用いる場合は、上記
の難点を改善することができると考えられる。しかし、
特開昭５１−１２６２８１号記−の方注記−ポリマー担
体に多数の制ガン剤を結合する反応と、ポリマー−制ガ
ン剤結合体に抗体を結合する反応が同一な反応のため、
多数の抗体分子がポリマー担体に結合してしまい、その
ため得られる複合体が均一な−のとなり得ないのみなら
ず、治療剤として用いるのが不適当な高分子量物質も含
む、といった問題を生じるのである。

本発明者婢は、かかる先行技術の欠点を解決すべく鋭意
研究を行なった結果、抗体との結合反応に供する反応基
をｌコだけ含有し、かつ、それとは異なる、薬剤を結合
するための、反応基を多数含むポリマー担体を用意し、
先づ多数の反応基によって多数の薬剤を該ポリマー担体
に結合重た後に％抗体との反応基によって抗体と結合す
る、という手順を踏むことによれば、治療剤として用い
るのが不適当な高分子物質を含まず、かつ、多数の薬剤
を結合した抗体−薬剤複合体を製造し得ることを見い出
し、不発明に到達した。

すなわち、本発明は殺すべき細胞のもっている特定の抗
原と特異的に結合し得る免疫グロブリンまたはその７ラ
グメントと、細胞毒性物質を結合した反応性重合体とを
共有結合させてなる式〔１〕 ・・・・・・・臼〕 で表わされる＃ｌ１ｌｌｌ毒性複合体、及び式［１１〕
・・・・・・・・［１］ で表わされる細胞毒性複合体、並び忙それらの製造方法
ＶＣ＠するものである。

本発明において、式［１）の中のＡｂ　　で表わされる
、殺すべき細胞のもっている特定の抗原と特異的忙結合
しうる免疫グロブリン（細胞毒性複合体の誘導部）とは
次のような本のである。

腫瘍＋１１１胞あるいは特定のリンパ球等の標的細胞あ
るいはそれらを含む組織で免疫されたヒト。

サル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット
、ハムスター、ラント、マウス等ノ動物から分離された
抗血清より、エタノール分画。

硫安分画、イオン交換あるいは分子篩カラムクーマドグ
ラフィー等の公知の手段によって＃製される免疫グロブ
リン、あるいは標的細胞で免疫した動物よシ採取された
抗体産生細胞を発癌性のある物質で癌化させたり、ミエ
ローマ細胞と融合させてハイプリドーマを得、これの産
生するモノクロナルな抗体をいう。また標的細胞に結合
した免疫グロブリンを界面活性剤等で分離して得られる
、標的細胞に特異的な免疫グロブリンも不発明の免疫グ
ロブリンに含まれる。

免疫グロブリンには工ｇＧ、■ｇＡ、　ＩＢＭ、　Ｉｇ
Ｄ。

ＩｇＩＣの５つのクラスが知られておシ、さらに各クラ
スはいくつかのサブクラスから成っていることが知られ
ている。しかし、その基本構造は、２本の重鎮と２本の
軽鎖とから成る点、また抗原結合活性をもつＦａｂａ分
とエフェクター活性をもつＰｃ　　部分から成る点にお
いて一致している。ただし、１ｇＭはｓ量体、　ＩｇＡ
は一部２量体で存在するが、Ｉａ胞梅毒性複合体組繊浸
透性という面から考えると、これらをメルカプタ／で還
元し、！量体としてから、複合体の誘導部分に用いる方
が望ましい。

細胞毒性複合体の誘導部としては、免疫グロブリン分子
全体を用いてもよいが、それより４、その抗原結合部位
を含むが、Ｆｃ　　部分をもたない７ラグメントを用い
る仁とが望ましい。それはＦｃ　　部分を含む複合体に
あっては、Ｆｃ　　部分による標的細胞以外の細胞に対
する非特異的吸着及び細胞膜上のＰｃ　　’Ｊセプター
との結合が起こり、細胞毒性複合体の殺すべき細胞九対
する選択性が減じるからである。さらに異種タンパクと
しての免疫グロブリンの抗原性は、Ｐｃ　　部分におい
て％ＩＣ強いので、複合体の抗原性を低下させる点にお
いても、ＩＦｏ　　部分のない免疫グロブリンの７ラグ
メントが、ｍ梅毒性複合体の誘導部として望ましいう一
般に、免疫グロブリンをパパイン（ｐａｐａｉｎ）、　
トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）　。

キモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、プラス
ミン（ｐｌａｓｍｉｎ）等の蛋白分解酵素で分解すると
、抗原結合部分を１つもつ、いわゆるＦａｂ　７ラグメ
ントが得られる。またペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）分解。

条件によってはトリプシン分解によつ【も抗原結合部分
を２つもつ、いわゆるｙ　（ａ　ｂ　’）Ｈフラグメン
トが得られる。このフラグメントはさらにメルカプタン
で処理すると、−価のＦａｂ’フラグメントになる。さ
らに免疫グロブリンを変性させつつ分解させると抗原結
合部分（バリアプル・リージョンｖａｒｉａｂｌｅ　ｒ
ｅｇｉｏｎ　）のみが得られる。

これらの免疫グロブリン由来フラグメントは、原料とし
ての免疫グロブリンがいかなるクラス。

サブクラスであれ、いずれも本発明の複合体の誘導部と
して用いることができる。

式〔１〕で表わされる細胞毒性複合体におりて、Ｙは分
子中にアミノ基又はイミノ基を含む細胞毒性物質のアミ
ノ基又はイミノ基反応残基を表わす。本発明における細
胞毒性物質とは、そのままの状麿で細胞に毒性を発揮す
る物質、あるいはそのままでは毒性を発揮しないが、生
体内で細胞に毒性を発揮し得る物質に転換し得る物質を
いう。これらの例としては、 ｐ　−［Ｎ、Ｎ−ビス（２−クロロエチル）］フェニレ
ンジアミン ｐ　−’　［ビス（２−クロロエチル）アミノ〕Ｌ−フ
ェニルアラニン（メルフアラン）２−アギノー’Ｍ　−
［ｐ−ビス（２−クロロエチル）アξノ］フェニルー３
−ヒドロキシグロピオンアミド ｉ−仙） Ｈ １−（β−Ｄ−アラビノ７５ノビル）シトシンｔたはそ
のモノホスフェート １−［５’−（２−アミノエチルホスホリル）−β−Ｄ
−アラビノフラノシル〕シトシン Ｃ几０１（ ２−アミノ−Ｎ−［ｐ−ビス（２−クロロエチル）アミ
ノコフェニル−３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル
グロピオンアミド ００Ｈ メトトレキセート アクチノマイシンＤ ０１１ マイトマイシンＣ Ｘ卿Ｈ，ダウノマイシン Ｘ鯰ＯＨ，アドリアマイシン 等が挙げられる。

２は水素原子又は１価の陽イオン、例えばＨａ＋、　、
＋、　ＮＨａ＋である。

Ｗは２価の有機基を表わし１本発明の原料として用いる
反応性重合体を得る過程で何ら反応に関与しない不活性
な基である限り特に限定されない。これらの基としては
、例えば、２−アミノエタンチオール残基（−ＣｋｈＣ
Ｈｓ−）の如き直鎖の、あるいはシスティンベンジルエ
ステル残基ルキレン基、４−アミノチオフェノール残基
（Ｑ　）の如き置換基を有しない、あるいは置換基を有
するフェニレン基が挙げられるが、炭素数１〜４のアル
キレン基が特に好ましい。

Ｒ＋は水素原子又は炭素数五〜４のアルキル基であるが
、好ましいのは水素原子である。

Ｒ鵞はα−アミノ酸の６位側鎖又はその誘導体（但しカ
ルボキシル基を有する基は除く入、であり、例えば砿−
アミノ酸がグリシンの場合は九ｗｍ　ｉｉ　、アラニン
の場合はＲｔ−ＯＦＩｍ、　フェニルアラニンの場合は
Ｒｔ　−ＯＨｔ　Ｄ　、セリンの場合はＲ雪−０＆ＯＨ
である。式［１）の複合体において、かかるａ−アミノ
酸からなる単位は、細胞毒性物質との結合には何ら関与
しないが、複合体の脂溶性や水溶性、あるいはＳ絶膜と
のｉＫ和性等を調節するのに役立つものである。従って
、脂溶性や水溶性の調節が格別に必要ない場合にけ、か
かるａ−アミノ酸単位を含有しないものの方（式〔１）
においてｑ−０）が実用的に有利である。

ｍは１〜４の整数を表わすが、好ましいのはｍが１又は
２の場合である。なお、弐ｍで表わされる複合体として
は、例えば、ｍ−１のものとｍｍ２のものが混在してい
る様な重合体も含むう ｎ＃′ｉ細胞毒性物質が結合した構成本位の数を表わし
、ｐは細胞毒性物質が結合していない構成単位の数を表
わし、ｑけ側鎖にカルボキシル基を有しないα−アミノ
酸単位（側鎖は修飾されていてもよい）の数を表わすが
、これらの本位の重合体中での配列状態は任意である。

即ち、式［１］　においては、便宜上ブロック重合体の
如く表わしであるが、これに限られるものではなく、通
常の方法で得られるものはランダム配列の重合体である
。ｎ−ｓ〜１５０Ｇ、好ましくはｔＧ〜５００であり、
ｐｗＱ〜１５００、好ましくはｏＮｓｏｏであ夛、ｑ−
ｏ〜１５０Ｇ。

好ましくはｑ　−０−Ｓ　ＯＯである。

８ＩおよびＢｔは硫黄原子を表わすが、８＋ａＡｂで表
わされる抗体またはその７ラグメントに発生又は導入さ
れたチオール基又は活性ジスルフィド基に由来する硫黄
原子であシ、　ｆｈは細胞毒性物質を結合した反応性重
合体上のチオール基又は活性ジスルフィド基に由来する
硫黄原子を表わすう Ｂ１およびＢｗは２僅の有機基を表わすが、これらは抗
体またはその７２グメントと細胞毒性物質を結合した反
応性重合体とを結合する際に用いることができる後述す
る架橋剤に由来する本のである。

本発明における式〔Ｉ〕で表わされる細胞毒性複合体に
おいてｔ鵞ｓｍＱの場合、即ち、細胞毒性複合体が下記
式（１−１） ・・・・・・・〔ト五〕 で表わされる場合は、該複合体は発生を九は導入したチ
オール基を有する下記式〔厘〕Ａｌ：＋（−（Ｂ→＠、
　８　ｔＦＬ　］　ｖ　　　　　　　　　　　　　　　
・・・・・・・　〔厘〕で表わされる抗体又はその７２
グメントと、下記式ＣＷ〕 ・・・・・　［ＩＩＱ で表わされる活性ジスルフィド基を有する、細胞毒性物
質を結合した反応性重合体を反応せしめるととＫよって
これを製造することができる、式［ｆｆ）　において、
Ｘは水素原子又はｌＩシの硫黄原子と共に活性ジスルフ
ィド結合を形成しうる基を表わすが、後者としては、例
えば２−ビー２−ピリジルチオ基（０ＷＮ−Ｃ％−８−
）　、　２−ベンゾチアゾイルチオ基（α＞８−　）　
＋　２−ぺと 一フェニルアミノーＮ′−フェニルイミノメチル式（１
−１１で表わされる細胞−性複合体は、又、誘導または
導入した活性ジスルフィド基を持つ、下記式〔ｖ〕 （合と同じである。　　　　　　　　　　　　）士表わ
される抗体またはそのフラグメントと、下記式［Ｗ］ ｃｏ　　　　　　ａｏｏｚ ・・・・・・（Ｗ） で表わされるチオール基を有する、細胞毒性物質を結合
した反応性重合体を反応せしめることＫよっても、これ
を製造することができる。

本発明におゆる式［１１で表わされる細胞毒性１複合体
において　ｔ、−１の場合、即ち細胞毒性複合体が下記
式［１−＊］ ・・・・・　［１−２］ で表わされる場合は、発生または導入されたチオール基
を有する式〔厘〕で表わされる抗体またはその７ラグメ
ントと、式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合した
、チオール基を有する反応性重合体とを、チオール基と
反応し得る官能基を２個有等る架橋剤を用いて結合する
ことＫよりこれを製造することができる。この目的のた
めに好適に用いることができる架橋剤とじて［Ｂ４は２
価の有機基である。］ で表わされる架橋剤あるいはベンゾキノンをあげること
ができる。式〔■′〕で表わされる架橋剤の具体例とし
ては、Ｎ、）ｆ’−（１，２−フェニレン）４．４′−
ビス（マレオイルアミノ）アゾペ／ゼンあげることがで
きる。

本反応を行なり場合は、２段階の反応として行なうのが
好ましい。即ち、最初に、式［ａ＋］で表わされる抗体
又はその７ラグメントか、あるいは式［Ｗ］で表わされ
る細胞毒性物質を結合した反応性重合体に、過剰の、例
えば式〔ｗ′〕で表わされる架橋剤を反応させ、精製処
理をほどこして１式〔■〕あるいは式〔■〕 ｃｏ　　　　　　　ｃｏｏｚ ７　　　　　　・・・・・〔■〕２ で表わされるルイミド基が導入された反応中間体を得る
。次に、反応中間体〔■〕Ｋ対しては式［１［］で表わ
される細胞毒性物質を結合した反応性重合体を、又、反
応中間体［Ｋ］　Ｋ対しては式〔厘〕で表わされる抗体
又はそのフラグメントを作用せしめる。以上の反応手順
により１目的物質であみ式［１−４］　Ｋ相当する物質
を製造することができる。

本発明における、細胞毒性物質を結合した、下記式〔厘
〕 ・・・・・・［ｆｉ〕 で表わされるＪＩＩ胞毒梅毒合体を製造するためには、
導入されたマレイミド基をもり下記式〔■〕で表わされ
る抗体又はその７ラグメントと、式［Ｗ］で表わされる
、細胞毒性物質を結合した反応性重合体を反応させるこ
とＫよシこれを達成できる。

かかる式［１］および式〔韮〕で示される細胞毒性複合
体の製造原料である、式（Ｗ）および式［１〕で表わさ
れる、細胞毒物を結合した反応性重合体は本発明者等に
よる発明（特開昭５７−９７２４及び５７−１８７２７
３の方法で製造されるが、その概略を説明すると以下の
通りである。　　　　　　　　　　　　　　・。

例えば、グルタミン酸ベンジルエステル（ｒ−ペンジル
ーＬ−グルタミン酸）にホスゲンを作用させてｒ−ベン
ジル−Ｌ−グルタメートＮ−カルメン酸無水物を得、こ
れを、例えばシスタミン（ｋｈＭＯＦ１＊０Ｆ１ｔＢ８
Ｑ山ｃｕｔａａ雪）を用いて重合させ重合体とし、この
重合体を酸分解又はアルカリ分解すると下記式の重合体
が得られる。

９＆ ＣＯ鵞Ｈ 次いでこの物を、メルカプタンで処理してジスルフィド
結合を切断するととＫより、末端にチオール基を有する
下記のごときポリーＬ−’グルタミン酸が得られる。

ＣＨ童 ００＊Ｈ 次いで、これＫＩ？！ｉ性ジスルフジスルフィド化合物
用させることにより、末端に活性ジスルフィド基を有す
る下記のごときポリ−Ｌ−グルタミン酸を得ることかで
龜る。

ｕｔ ｃｏ禦Ｈ かかる末端活性ポリ−Ｌ−グルタミン酸に、例えば、カ
ルボジイミド試薬の存在下にアミノ基を含有する細胞毒
性物質を反応させるととＫより、式［ｙ］　Ｋ相当する
下記式 ０ （式中Ｙは細胞毒性物質残基を表わす　　　）で示され
るごとき、活性ジスルフィド基を有する、細胞毒性物質
を結合した反応性重合体を得ることかできる。さらＫこ
の物をメルカプタンで処理することにより、チオール基
を生成せしめれば、式［１］　Ｋ相当する下記式 ０ｖｋｉ と で示されるごとき、チオール基を有する細胞毒性物質を
結合した反応性重合体を得ることができる。従って、式
［１］で表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重合
体は、式［Ｗ］で表わされる細胞毒性物質を結合した反
応性重合体に、メルカプタンや水素化ホウ素化合物を作
用させて、ジスルフィド結合を還元的に切断することに
より容易忙得られる物質であろう 次に抗体く免疫グロブリン）またはそのフラグメントに
チオール基を発生または導入する方法について述べる。

先づ、免疫グロブリンまたはその７ラグメントにチオー
ル基を発生せしめる方法、即ち、式〔厘〕においてｔ、
−ｏ１ｃ相当する抗体又はその７ラグメントの製造法に
りいて述べる。免疫グロブリンには、工ｇＧ、工ｇＡ、
工ｇＭ。

工ｇＤ、　Ｉｇｌ　　の５つのクラスが知られているが
、ＩｇＭ　ｉｉＳ量体、　ｌｌ（Ａは一部ｚ量体で存在
する。

これらをメルカプタンで還元し、ｌ量体とすることｋよ
ジチオール基を発生せしめることができる。また、例え
ば工ｇＧのある種のサックラスけ、前述した方法、即ち
トリプシン分解とメルカプタン処理をほどこすととＫよ
りチオール基を１個持つＦａｂ’に導くことができる。

次に１免疫グロブリンまたはそのフラグメントにチオー
ル基を導入する方法、即ち式［１１］　においてｔ、−
ＩＫ相当する抗体またはその７ラグメン）ｆ）製造法に
ついて述べる。免疫グロブリンまたはその７ラグメント
に１適当な架橋剤を反応させ、必要ならさらに適当な処
理をほどこすことによりこれを遂行できる。この目的の
ために好適に用いることができる架橋剤としては、例え
ば、下記式［Ｘｌ Ｘｌ−８−８１−ＢＳ−（！−Ｑ＋　　　　・・・・・
・［Ｘ］１ で表わされる架橋剤、下記式〔夏〕 １ｍ−８−ｌｍ−８−８−Ｂ官・・・・・（：）［）１ １−ＨＬ で表わされる架橋剤、下記式〔罵〕 Ｈ８−ＢＳ　−０−Ｑｔ　　　　　　　　　・・・・・
〔罵〕１ Ｎ■・ＨＬ で表わされる架橋剤、下記式［Ｘｌｌ］で表わされる架
橋剤（２−イミノチ第２クトンλ下記式〔窟〕 で表わされる架橋剤（Ｎ−アセチルホモシスティン）、
下記式〔茸〕 で表わされる架橋剤（Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸
無水物）等をあげることができる。これらの架橋剤によ
シ免疫グロブリン又ａその７ラグメントを処理した場合
、直ちにチオール基を免疫グロブリン又はそのフラグメ
ン）Ｋ導入できる場合、即ち式［Ｘｆｆ）、　［■］、
〔π〕で表わされる架橋剤を使用する場合以外の場合、
即ち、式［’Ｘ］、〔夏〕、〔で〕で処理した場合は、
さらに該免疫グロブリン又はその７ラグメントを、それ
ぞれメルカプタンやアルカリで処理するととＫより、該
免疫グロブリン又はそのフラグメント上にチオール基を
導入することができる。

次に、抗体またはそのフラグメン）ｋ活性ジスルフィド
基を誘導又は導入する方法について述べる。先ず免疫グ
ロブリン又はそのフラグメン）Ｋ活性ジスルフィド基を
発生せしめる方法。

即ち式〔ｖ〕においてｔ、−ＯＫ相当する抗体およびそ
の７ラグメントの製造法について述べる。

前述したＩＢＭや工ｇムの１部あるいはｙａｔ／７ラグ
メントはチオール基を発生しているが、これらに後述す
る活性ジスルフィド化合物を反応することＫより、これ
を遂行することができる。

次に抗体又はそのフラグメントに活性ジスルフィド基を
導入する方法について述べる。抗体又はそのフラグメン
）Ｋ式（Ｘ）　、　　式（Ｘｌ等−７’表わされる活性
ジスルフィド基導入剤を作用させるか、又は、式［）［
］、　［ＸＩ］、　［ｌｆｆ］のごときチオール基導入
剤を作用して抗体又はその７ラグメントにチオール基を
導入した後に、これらＫｖｋ述する活性ジスルフィド化
合物を反応することによりこれを遂行することができる
。

上記の目的に用いることができる活性ジスルフィド化合
物としては、例えば、２−ピリジルｓ、シスルフイＹ　
（ｃ）Ｐ−ｓ−８０８）、　５．５’　−シチオビス（
２−ニトロ安息香酸） Ｎ−オキシ−２−ピリジルスルフィド ↓　　　　↓ ０ ２−ベンゾチアゾイルジスルフィド Ｎ−フェニルアミノ−Ｎ′−フェニルイミノメチけるこ
とができる。

父、萌述のＰ　（ａ　ｔ／　）ｔ　　のヒンジ部分のジ
スルフィド結合を、例えば亜硫酸イオンによりスルホ化
分解して分子中ＫＢ−スルホ基（−ｓ−ｓｏｒ）　　を
有するｙｅｔ／を得ることができるが、この物も。

式〔■〕で表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重
合体と好適に反応して、式（１−１１で表わされる細胞
毒性複合体を生成する。

次に、抗体又はその７ラグメントにマレイミド基を導入
し式〔■〕で表わされる反応原料を得る方法を述べる。

抗体又は、その７ラグメントに下記式〔双〕 ０　　　　　　０ で表わされる架橋剤を反応せしめ、精製等の操作を加え
ることＫよりこれを遂行することができる。〔店〕で表
わされる架橋剤の具体例とじてことができる。

本発明における修飾した抗体（免疫グロブリン）および
その７ラグメントと、細胞毒性物質を結合した反応性重
合体との反応による細胞毒性複合体の製造は、下記の条
件下に実施される。

反応は、修飾した抗体およびそのフラグメントのＰＨ５
−９の緩衝液中濃度が、Ｏ，Ｓ〜１００ｑ／−（より好
ましくは１〜ｚｏｓｐ／ｄ）Ｋなるよう［Ｉ１４整され
た溶液と、細胞毒性物質を結合した反応性重合体の水溶
液、又は、上記の同一の緩衝液溶液を混合し、その゛ま
ま放置、又はゆるやかに攪拌するととＫより進行する。

混合量は、抗体のモル数に対してｏ、ｔ　−ｔ　ｏモル
量の重合体を用いるのが好適である。反応温度は０〜５
０℃である。反応時間は反応スケール。

反応条件にもよるが、一般に２日間以内である。

複合体の反応混合物からの分離、精製は通常用いられる
操作１例えば、分子ふるいのカラムクロマトグラフィー
、透析、アフイニライクロマトグラフイーを用いて行う
ことができる。

抗体またはその７ラグメントと細胞毒性物質を結合した
重合体より成る細胞毒性複合体を製造する反応において
、抗体またはそのフラグメントに架橋剤を反応させる場
合は、架橋剤を反応せしめる蛋白１モルに対し、架橋剤
を１〜１００モル用いるのが好ましい。反応は抗体また
はそのフラグメントの、ｐＨ５−９の緩衝液中蛋白ａｍ
が０．５〜ｌ　ＯＯＫ９　／　Ｉｌｌ　（より好ましく
は五〜２０■／ｄ　）　ＫなるようＫ１１ｌ整された溶
液に、０〜５０℃で攪拌しながら架橋剤の水溶液または
架橋剤が水に溶けない場合は、架橋剤を少量の有機溶媒
１例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルス
ルホキシド、ｌ、２−ジメトキシエタン、メタノール、
エタノール、アセトン等に溶かした溶液を添加して行な
われる。

反応時間は反応しスケール、反応条件によるが、一般に
２日間以内である。修飾抗体の精製は透析または分子ふ
るいのカラムクロマトグラフィーにより低分子を除いて
おζなう。

チオール基を含有する式〔Ｗ）で表わされる醸合体に、
例えば式〔■′〕で表わされる架橋剤を反応せしめる場
合も同様な条件でこれを行うことができる。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例！ （イ）　マウス白血病Ｌｔ２１０ｉＣ特異的な免疫グロ
ブリンの調製 ＤＢＡ／２ｃｒマウスで継代された１ウス白血病細胞Ｌ
１２１０を、Ｄ　Ｂ　Ａ　／　２０Ｆｗウス　の腹水よ
り取り出し、その約１０−個を７０インド完全アジユバ
ントとのエマルジョンとし、家兎に静脈注射した。その
後！Ｋ、１週間間隔で３回、それぞれ約１０＠個（ＱＬ
１２１０１＠胞をアジユバノドと共に皮下注射し、最終
投与Ｈから７日後および１０日後に採血した。得られた
血液をプールし、血清を分離し、その血清を５６℃、３
０分間加熱、非動化した。

こうして得られた抗Ｌ１２１０血清２０（１ｍ／に、硫
安の飽和水溶液２００ｍを加えて、生じた沈澱を遠心分
離によって分取した。この沈澱を０．０１　Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，６）　５０　ｄＫ溶屏し、ｆＫ同緩ＩＩ
液に対して十分に透析した。この透析内液を同じ緩衝液
で平衡化したＤＩｅＡＥセルロースカラムクロＩマドグ
ラフィー（カラムサイズ３　ｅｓｍ　Ｘ　９４　ｅｘａ
　）　Ｋかけて、未吸着分−として抗Ｌ１２１０ＩｇＧ
を含む溶液を得た。

（ロ）　免疫グロブリンより　Ｆ（ａｔ１′）、フラグ
メントの分離 上記０）の如くして得られた抗Ｌ１２１０１ｇＧの１．
２１Ｆを０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）　４０ｉ
１に溶解し、２４吋のペプシンを添加して、３７℃で約
１８時間分解した後、分解生成物を生理食塩水中でセフ
ァデックスＧ２００カラムクロマトグラフイー（カラム
サイズ３．５ａｍ、　Ｘ　１４０　ｃｍ　）　Ｋかけて
、分子量約１０万のところに流出する蛋白を取り出した
。これは８Ｄ８−ＰＡＧＩＣＫかけると、純粋なＦ（ａ
ｂ’）＊フラグメントであることが確認された。

（ハ）　Ｆａｂ’フラグメントの調製 上記（→の如くして得られたＰ　（ａ　ｂ’）ｓフラグ
メント２６吋を含む０．０１　Ｍ　トリス・塩酸−０，
１４Ｍ塩化ナトリウム−２ＷＥ　Ｍｍｌ：ＤＴＡ溶液（
ｐＨ（８，３）　１．Ｏｉｌに、１５ｍＭの２−メルカ
プトエタノール水溶液を０．２ｄ加えて、３７℃で１時
間還元した、反応後、その浴液を５ＷＬＭ酢酸緩衝液−
０，１４Ｍ塩化ナトリウム−１ｍ　ＭＫＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈ５，５）で平衡化したセファデックスＧ　２５　（Ｑ
、８　ＣｍＸ　４’Ｏｃｍ　）のゲル口過によりｚ−メ
ルカプトエタノールを除去し、チオール基ｔａｔ有する
Ｆａｂ’フラグメントを得た。

に）　Ｆａｂ’フラグメント（１）と活性ジスルフィド
。

基を有し、ダウノマイシンを結合したポリーＬ−グルタ
メート（２）との反応による、細胞毒性複合体（３）の
製造。

Ｃ山　　　　　　箔 １ Ｃ００へＮａ ■ Ｙ＋ （２） Ｃル　　　　　　Ｃ山 １ Ｃ山　　　　　　Ｃ山 １ Ｃｏ　　　　　　　　Ｃｏ鵞Ｎａ （３） 上記（ハ）の如くして得られたＦａｂ’フラグメントの
溶液（１１，１８９７Ｍ　）　ｌ−Ｋ、活性ジスルフィ
ド基を有し、ダウノマイシンを結合したポリ−シーグル
タメートのナトリウム塩（２）の溶液（活性ジスルフィ
ド当量ｔ、１ｘ１ｏ−’ｍｏ１ｅ　／ｄ　）　２．２−
を添加し、０．１　Ｍ塩化ナナトリウム２１１１ＭＩＩ
ｉＤＴＡを含む５０１１Ｍグリシン・ナトリウム塩緩衝
液・（ｐＨ９，２）　Ｋ。

４℃で、４８時間透析しつつ反応させ、目的とする複合
体を得た。反応物は、更１１（１０，１ｉｌ−塩化ナト
リウム溶液に透析した。

ＧｔＩＬ　ｔ　２１　Ｇ細胞に対する複合体（見）のａ
ｍ毒性 上記に）の如くして得られた複合体（３）の標的細胞Ｌ
１２１０に対する細胞毒性を検討した。

２４大の培養プレー）１＋１：、５Ｘ１０　　個のＬ１
２１Ｇ細胞を含むＲＰＭＩ　１６４０　　培地（１０憾
牛脂児血清、２０μＭの２−メルカプト−エタノールと
Ｏ，ＩＱ／−のカナマイシンを含む）０．９ｄを分注し
、更に檎々の濃度の被検サンプル０．１−を加え、５憾
Ｃｏｔ雰囲気下で３７℃で４８時間培養後、トリノシン
プルー染色法により生細胞数を測定した。

その結果、第１表に示す如く、複合体（見）は、標的細
胞Ｌ＋１２１０に対し濃度依存的に１着しい細胞増殖抑
制効果を示した。尚、培養は２系列行い、値はその平均
で示した。

実施例２ （イ）活性チオール基を導入したＸｇＧの調製実施例ｔ
ｏｅｏの如くして得られた、１ｇＧ２．４譜を含む０．
１　Ｍリン酸緩衝液（０，１Ｍ塩化ナナトリウム含む、
　ｐＨ７，５）　２−に、１．６ＷＬＭのＮ−サクシン
イミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネートを
含むエタノールＯ，ＯＳ＊を添加し、時々攪拌しながら
室温３０分反応させた。次いで、上記緩衝液で平衡化し
たセファデックスＧ−２５のカラム（ｏ、８℃ｍｘ４ｇ
Ｃ薦）にその反応液をかけ、過剰の試薬を除去した。こ
うして１分子当９１．８ケの３−（２−ピリジル）ジチ
オプロピオニル基を含む１ｇＧが得られた。

（ロ）　ジチオプロピオニル１ｇＧ（４）と、チオール
基を有しダウノマイシンを結合したポリ−シーグルタメ
ート（５）との反応による、細胞毒性複合体（見）の製
造っ “′咬） ！ （！、） 上記０）の頗〈シて得られた３−（２−ピリジル）ジチ
オプロピオニルＩｇＧ　（４）　０．７４１１９を含む
溶液４ｄに、チオール基を有し、ダウノマイシンを結合
したポリ−シーグルタメート（５）の溶液（末端ＢＨ相
当１．Ｉ　Ｘ　ｌｏ−’ｍｏ１ｅ／ｄ　）　Ｇ、０５　
ｍ添加し、室温で１６時間反応させた、用いた緩衝液は
上記（イ）と同じであるうこうして得られた複合体（６
）は、限外ろ過失によ）濃縮し、０゜ｓｌ塩化ナトリウ
ム溶液に透析した。

（９Ｌ　ｌ　２１０　Ｊｌ胞に対する複合体の細胞毒性
上記←）の如くして得られた複合体（６）の、標的ｇ　
胞Ｌ　ｌ　２　ｉ　０　Ｋ対するｍ梅毒性を、上記実施
例１の（へ）Ｋ示した方法に従って検討した。

その結果、第２表に示す如く、マイトマイシフ相当でｌ
ｓＭの複合体（６）を添加すると。

Ｌ１２１Ｇ細胞の増殖が抑制された。

第２表 実施例３ （イ）　マレイミド基を導入したＦ’（ａビ）雪の調製
実施例１の（ロ）の如くして得られたＦ（ａｂす、１０
■を含む１０１１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）１．１
４　ｓｄＫ、　Ｍ−ヒドロキシザクシンイミジル−ｍ−
マレイミド安息香酸０．４２ｗｇを含むＭ、Ｍ−ジメチ
ルホルムアミド０．０５−を添加し、室温で４０分反応
させた。反応後は、０．１４　Ｍ塩化ナトリウム、ＩＩ
ＩＭ−元ＤＴＡを含む５１℃Ｍ酢酸緩債液（ｐＨｓ、ｓ
　）　Ｉｃ透析して過剰の試薬を除き、ｍ−マレイミド
ベンゾイルＦ　（ａ　ｂ’）＠を得た。

←）Ｈ−ｗレイミドベンゾイル′Ｆ（ａｂ′）ｌ（′Ｌ
）と、チオール基を有しメルフアランを結合したポリー
Ｌ−グルタメー）−Ｌ−アラニン共重合体（８）との反
応による、細胞毒性複合体（９）ＣＯＣへ、Ｎａ １”　　　惺） ＣへＮａ 上記０）の如くして得られ九ｍ−マレイミドベンゾイル
Ｆ（ａｂ’）言７）　６．９　ｍｇを含む溶液ｏ、７ｓ
ｄＫ、チオール基を有し、メルフアランを結合したポリ
ーＬ−グルタメートーＬ−アラ二ン共重合体（８）（末
端ＳＲ相轟８．ＯＸｌ　０−’ｍｏｌｅ　／ｄ　）を含
む上記ピ）の酢酸緩衝液０．４７ａ／を添加し、更に０
．６ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　０．１５　ｄを
加え、４℃で１６時間反応させた。こうして得られた複
合体（９）は、０．９１＋塩化ナトリウム溶液に透析し
た。

ＨＬ　ｓ　２１　Ｇ細胞に対する複合体の細胞毒性上記
（ロ）の如くして得られた複合体（９）の標的細胞Ｌ１
２１ＯＫ対する細胞毒性を検討した。

遠心管に：、５Ｘ１０４個のＬ１２’ＩＯ細胞を含むＲ
ＰＭ１６４Ｇ培地（ｔｏ％牛脂児血清。

２０＊Ｍの２−メルカグトエタノールと０．１η／−の
カナマイシンを含む）０．９−を分注し、更に種々の濃
度の被検サンプル０．１−を＝ｊ、３７℃で２０分プレ
インキエペーションし先後、遠心して上清を除き、新た
に１上記の培地１−を添加して、１！にＯＣｈ雰囲気下
［３７℃で４８時間培養した。培養後、トリパンブルー
染色法によシ生細胞数を測定した。

その結果、第３！！に示す如く、メルフアラン相４ｉｏ
ｏμ輩の複合体でブレインキュベーションした時、Ｌｌ
、２１０細胞に対する増殖抑制効果が現れた。２０分の
ブレインキュベーションで試薬を除いているにも拘らず
、効果が現れていることから、初期の２０分で、複合体
と細胞の結合が相当程度おこっている−のと考えられる
。冑、培養は２系列行い、値は、その平均で示した。

実施例４ （イ）　マレイミド基を導入したＦａｂ’の調製上記実
施例１の（ハ）の如くして得られた、遊離チオール基１
ケを有するｐａｔ／ｌｏ叩を含む５１１１Ｍ酢酸緩衝液
（０，１４Ｍ塩化ナトリウム。

１−１１１１−１ｌ１を含む、　ｐＨ５，５）　５．７
’ｄと、１．２１９の０−フェニレンジマレイドを含ｔ
ｒＭ緩衝液２−とを混合し、３０℃で６０分反応させた
後、同緩衝液に透析し過剰の試薬を除いた。

（ロ）　マレイミド基導入Ｆａ　ｂ’（Ｍｑ　）と、チ
オール基を有しアラ−・〕を結合したポリ−も一グルメ
メー　ト（ｌｔ）との反応による、細胞毒性複合体（１
２）の製造。

（１０） ＣＯＣへＮａ Ｙ４　　　　（１す 上記の如くして得られた０−フェニレンシマレイジルＦ
ａゾ（１０）　９．８　Ｑを含む上記０）の緩衝液７．
８−に、チオール基を有しアラ−Ｃを結合したポリ−シ
ーグルタメート（１１）　（末端ＢＨ相当ａ、ｏ　ｘ　
ｔ　ｏ−’ｍｏｌｅ／　ｄ　）を含む同緩衝液０．６７
１ｄ及び０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）ｏ、ａｗ
Ｊを添加し、３０℃で６０分反応させた。

こうして得られた複合体（１ｚ）は、更Ｋ　Ｏ，９９に
塩化す）　ＩＪウム溶液に透析した。

ぐ→　Ｌ１２１Ｇ細胞に対する複合体の細胞毒性上記（
ロ）の如くして得られた複合体（１２）の標的細胞Ｌ１
２１０ｉＣ対する細胞毒性を、上記実施例３のｆ→に示
した方法に従って検討した。

その結果、第４表に示す如（、ＡｒａＯ相当１０ｊＭの
複合体でプレインキユペーションシた時、Ｌ１２１０細
胞に対し中程度の細胞毒性を示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、前記式［１１で表わされる細胞毒性複合体。 ・・・・・・〔！〕 ２、　下記式［１］ ％式％［１１１ で表わされる細胞毒性複合体。 ３．　弐ｍおよび式［ｆｌｌ　においてＷが炭素数１〜
   ４のアルキレン基である。特許請求の範囲第１項および
   第２項記載の細胞毒性複合体。 ４、発生または導入したチオール基を有する下記式［［
   ］ ％式％ で表わされる抗体又はその７ラグメントと、下記式［’
   Ｍ］ ０）　　　　　　　０ＯＯＺ 】 Ｙ　　　　　　　　　・・・・・［Ｗ］で表わされる細
   胞毒性物質を結合した反応性重合体を反応せしめること
   を特徴とする、下記式［１−１］ ％式％］ で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ５、＃導または導入した活性ジスルフィド基を有する下
   記式（Ｖｌ Ａｂ　＋＋Ｂ＋）Ｈ８＋Ｘ］ｖ　　　　　　　　　　　
   　　　−・・　＝　　〔Ｖ）で表わされる抗体又はその
   ７ラグメントと、下記式１ｊ！］ −・・・・・・・［％］ で表わされる、チオール基を有する細胞毒性物質を結合
   した反応性重合体を反応させるととを特徴とする、前記
   式ｔ：ｔ−ｔ〕で表わされる細胞毒性複合体の製造法。 ６、発生または導入されたチオール基を有する前記式〔
   ＩＩ〕で表わされる抗体又はその７ラグメントと、前記
   式（［〕で表わされる、チオール基を有する細胞毒性物
   質を結合した反応性重合体を、千オール基と反応し得る
   官能基を２個有する架橋剤を用いて結合することを特徴
   とする、下記式（１−２３ ％式％［１２］ で表わされる、細胞毒性複合体の製造法つ７、　導入さ
   れたマレイミド基を一つ下記式〔■〕で表わされる抗体
   又はその７ラグメントと、式〔Ｖ）で表わされる、チオ
   ール基を有する細胞毒性物質を結合した反応性重合体を
   反応させることを特徴とする、式〔ｌで表わされる細胞
   毒性複合体の製造法。