JPS61186400A - 細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物 - Google Patents
細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物Info
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- JPS61186400A JPS61186400A JP60285895A JP28589585A JPS61186400A JP S61186400 A JPS61186400 A JP S61186400A JP 60285895 A JP60285895 A JP 60285895A JP 28589585 A JP28589585 A JP 28589585A JP S61186400 A JPS61186400 A JP S61186400A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は共有結合により修飾された細菌由来中性多糖類
、特に肺炎球菌１４型及び同様の多糖類；また共有結合
の証拠となシ生物学的に望ましい物質の精製及び濃縮を
促進する２属のスペーサー（ｂｉｇｅｎｅｒｉｃ ５ｐ
ａｃｅｒ ）によって、免疫原性細菌由来の膜または他
のタン白が結合した、該多糖類の共有結合物（ｃｏｖａ
ｌｅｎｔｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ）に関するものであり
、該結合物は細菌のワクチンの有効成分である。本発明
はまた該多糖類及び結合物の製造法に関する。
、特に肺炎球菌１４型及び同様の多糖類；また共有結合
の証拠となシ生物学的に望ましい物質の精製及び濃縮を
促進する２属のスペーサー（ｂｉｇｅｎｅｒｉｃ ５ｐ
ａｃｅｒ ）によって、免疫原性細菌由来の膜または他
のタン白が結合した、該多糖類の共有結合物（ｃｏｖａ
ｌｅｎｔｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ）に関するものであり
、該結合物は細菌のワクチンの有効成分である。本発明
はまた該多糖類及び結合物の製造法に関する。
精製した細菌由来夾膜多糖類は（多糖を含む菌と）同族
の細菌に対するワクチンの製造に使用されるが、得られ
る免疫応答は特に乳幼児や免疫系が未成熟または欠損し
ているものにとってしばしば望ましいどころか満足すら
与えるものではない。例えば肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｔａｅ ） １４型
夾膜多糖が幼児の免疫応答を惹起することはできず、従
ってこの多糖は単独で肺炎連鎖球菌１４型細菌が原因と
なる重大な小児医療上の問題に対し防御を与えなＡ１例
えばダグラス （Ｄｏｕｇｌａｓ ）ら、ジエー・インフェクト・デイ
ジーズス（Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔ 、 Ｄｉｓｅａｓｅｓ
）第１４８巻、１３１〜１３７頁（１９８３年）、及
びローレンス（Ｌａｕｒｅｎｃｅ ）ら、アム・ジエー
・ディジージスｅオブ・チルドレン（Ａｍ、 Ｊ、 Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓｏｆ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ） 、第１３
７巻、８４６−８５０頁（１９８３年）を参照。この多
糖類の免疫原性はタン白と組合せることによってしばし
ば増強することができる、シニーアソン（Ｓｃｈｎｅｅ
ｒｓｏｎ Ｊら、インフエクション・アンド・インミュ
ニテイー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｎｕｎｉ
ｔｙ）、第４５巻、第３号、５８２−５９７頁（１９８
４年）〔ストレプトコッカス・ニューモニア（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ１６Ａ型の
結合物に関して議論している〕。
の細菌に対するワクチンの製造に使用されるが、得られ
る免疫応答は特に乳幼児や免疫系が未成熟または欠損し
ているものにとってしばしば望ましいどころか満足すら
与えるものではない。例えば肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｔａｅ ） １４型
夾膜多糖が幼児の免疫応答を惹起することはできず、従
ってこの多糖は単独で肺炎連鎖球菌１４型細菌が原因と
なる重大な小児医療上の問題に対し防御を与えなＡ１例
えばダグラス （Ｄｏｕｇｌａｓ ）ら、ジエー・インフェクト・デイ
ジーズス（Ｊ、 Ｉｎｆｅｃｔ 、 Ｄｉｓｅａｓｅｓ
）第１４８巻、１３１〜１３７頁（１９８３年）、及
びローレンス（Ｌａｕｒｅｎｃｅ ）ら、アム・ジエー
・ディジージスｅオブ・チルドレン（Ａｍ、 Ｊ、 Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓｏｆ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ） 、第１３
７巻、８４６−８５０頁（１９８３年）を参照。この多
糖類の免疫原性はタン白と組合せることによってしばし
ば増強することができる、シニーアソン（Ｓｃｈｎｅｅ
ｒｓｏｎ Ｊら、インフエクション・アンド・インミュ
ニテイー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｎｕｎｉ
ｔｙ）、第４５巻、第３号、５８２−５９７頁（１９８
４年）〔ストレプトコッカス・ニューモニア（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ１６Ａ型の
結合物に関して議論している〕。
しかし、該多糖類と結合させるタン白を選定するには注
意を払わねばならない。ある種のタン白〔例えば、パー
チュシノーゲン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｎｏｇｅれ）〕 は
幼児の免疫系を非特異的に活性化する。これらの蛋白は
ある程度多糖抗原の免疫応答を増強することができるが
、残念なことにその非特異的活性化は望ましくない生物
学的効果〔即ち、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉ
ｔｙ ） ）を導く。これらの多糖抗原に対する免疫応
答を好適に増強させるためには、ダブリュ、エフ、ゲー
ベル（Ｗ、 Ｆ。
意を払わねばならない。ある種のタン白〔例えば、パー
チュシノーゲン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｎｏｇｅれ）〕 は
幼児の免疫系を非特異的に活性化する。これらの蛋白は
ある程度多糖抗原の免疫応答を増強することができるが
、残念なことにその非特異的活性化は望ましくない生物
学的効果〔即ち、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉ
ｔｙ ） ）を導く。これらの多糖抗原に対する免疫応
答を好適に増強させるためには、ダブリュ、エフ、ゲー
ベル（Ｗ、 Ｆ。
Ｇｏｅｂｃ ｌ ） とオー、ティー、アベリー（０
，Ｔ。
，Ｔ。
Ａｖｅｒｙ ）とによって最初に報告されたように〔ジ
エー・エクスペリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅｘｐ
ｔｌ 、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ）第５０巻、５２１−５３
１頁（１９２９年）〕該多糖類を適当なタン白と１結合
〃させることにより幼児において達成することができる
。
エー・エクスペリメンタル・メデイシン（Ｊ、 Ｅｘｐ
ｔｌ 、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ）第５０巻、５２１−５３
１頁（１９２９年）〕該多糖類を適当なタン白と１結合
〃させることにより幼児において達成することができる
。
多糖とタン白とを結合させる手段についても注意深く考
慮しなければならない。信じられているように、もし免
疫増強が多糖の抗原決定基のタン白の１輸送（ｃａｒｒ
ｉｅｒ ）“決定基への分子的接近の結果として起きる
ならば、これらの部分は生物系内で容易に分離させるべ
きではない。多くの多糖類のポリアニオン性と１輸送Ｉ
タン白のポリカチオン性とから生じる非共有結合性複合
体は免疫応答を活性化するが、これら複合体は化学的に
不安定で、得られる免疫応答はＴ細胞非依存性を示す。
慮しなければならない。信じられているように、もし免
疫増強が多糖の抗原決定基のタン白の１輸送（ｃａｒｒ
ｉｅｒ ）“決定基への分子的接近の結果として起きる
ならば、これらの部分は生物系内で容易に分離させるべ
きではない。多くの多糖類のポリアニオン性と１輸送Ｉ
タン白のポリカチオン性とから生じる非共有結合性複合
体は免疫応答を活性化するが、これら複合体は化学的に
不安定で、得られる免疫応答はＴ細胞非依存性を示す。
対照的に、多糖類とタン白との共有結合物（ｃｏｖａｌ
ｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ）はよシ大きな化学的
安定性を有しＴ細胞依存性の免疫応答を示すことが証明
された。
ｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ）はよシ大きな化学的
安定性を有しＴ細胞依存性の免疫応答を示すことが証明
された。
多糖−タン白の共有結合物が文献で主張されているが、
共有結合の正確な性質は共有結合物に関し生体内（ｉｎ
ｖｉｖｏ ）で活性を有していることが示されている
のみで証明されていないし定量化されていない。さらに
、文献に開示された製法は再現性に乏しい。シニーアソ
ン（５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ ）ら、ジエー・エクスペリ
メンタル・ミジ（Ｊ、 Ｅｘｐｔｌ、 Ｍｅｄ、 ）、
第１５２巻、３６１頁（１９８０年）及びインフエク
ション舎アンド・インミュニテイー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ） 、第４０巻、２４
５頁（１９８３年）においては、ヘモフィルス・インフ
ルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚ
ａ ） ｂ型及び肺炎連鎖球菌６Ａ型多糖を臭素化シア
ンと反応させ、次にアジピン酸ジヒドラジドと、さらに
破傷風毒素またはカブトガニヘモシアニンタン白と気結
合’ （ｃｏｕｐｌｅ ）させた。
共有結合の正確な性質は共有結合物に関し生体内（ｉｎ
ｖｉｖｏ ）で活性を有していることが示されている
のみで証明されていないし定量化されていない。さらに
、文献に開示された製法は再現性に乏しい。シニーアソ
ン（５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ ）ら、ジエー・エクスペリ
メンタル・ミジ（Ｊ、 Ｅｘｐｔｌ、 Ｍｅｄ、 ）、
第１５２巻、３６１頁（１９８０年）及びインフエク
ション舎アンド・インミュニテイー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ） 、第４０巻、２４
５頁（１９８３年）においては、ヘモフィルス・インフ
ルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ １ｎｆｌｕｅｎｚ
ａ ） ｂ型及び肺炎連鎖球菌６Ａ型多糖を臭素化シア
ンと反応させ、次にアジピン酸ジヒドラジドと、さらに
破傷風毒素またはカブトガニヘモシアニンタン白と気結
合’ （ｃｏｕｐｌｅ ）させた。
肺炎球菌１９Ｆ型多糖と牛血清アルブミンとを、直接多
糖の還元末端とタン自から突出したアミノ基（例えばリ
ジン）とがらイミン（シッフ塩基）を形成させて結合し
くｃｏｕｐｌｅ ）、次にこのイミンをシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムで還元した〔リン（Ｌｉｎ ）ら、イン
ミュノロギー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ） 、第４６巻
、３３３頁（１９８２年）〕。
糖の還元末端とタン自から突出したアミノ基（例えばリ
ジン）とがらイミン（シッフ塩基）を形成させて結合し
くｃｏｕｐｌｅ ）、次にこのイミンをシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムで還元した〔リン（Ｌｉｎ ）ら、イン
ミュノロギー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ） 、第４６巻
、３３３頁（１９８２年）〕。
さらに、ケー、ケー、ニクスドルフ（Ｋ、 Ｋ。
Ｎ１ｘｄｏｒｆｆ ）ら、インミュノロギ−（Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ ）、第２９巻、８７頁（１９７５年）で
はジアゾ化した芳香族アミンに結合した多糖をタン白の
チロシンと結合させ、ニス、ビー、スベンソン（Ｓ、
Ｂ、 ５ｖｅｎｓｏｎ ）とニー、ニー、リンドバーグ
（Ａ、 Ａ、 Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ）、 ジエーーイン
ミュノロギー・メソッド（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ ｏ
ｇ 、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ）、第２５巻、３２３頁（１
９７９年）では芳香族アミンに結合した多糖をイソチオ
シアン類に変換させ、タン白のリジンから突出したアミ
ノ基に結合させた。しかし、各側において得られた結合
物はゲル浸透クロマトグラフィーの挙動のみで確認され
た。また別例（ニス、ヌタニ（Ｓ、 Ｎｕｔａｎｉ ）
ら、 インフエクション・アンド・インミュニテイ−（
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ。
ｎｏｌｏｇｙ ）、第２９巻、８７頁（１９７５年）で
はジアゾ化した芳香族アミンに結合した多糖をタン白の
チロシンと結合させ、ニス、ビー、スベンソン（Ｓ、
Ｂ、 ５ｖｅｎｓｏｎ ）とニー、ニー、リンドバーグ
（Ａ、 Ａ、 Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ）、 ジエーーイン
ミュノロギー・メソッド（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ ｏ
ｇ 、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ）、第２５巻、３２３頁（１
９７９年）では芳香族アミンに結合した多糖をイソチオ
シアン類に変換させ、タン白のリジンから突出したアミ
ノ基に結合させた。しかし、各側において得られた結合
物はゲル浸透クロマトグラフィーの挙動のみで確認され
た。また別例（ニス、ヌタニ（Ｓ、 Ｎｕｔａｎｉ ）
ら、 インフエクション・アンド・インミュニテイ−（
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ。
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ） 、第３６巻、９７１頁（１９８
２年））では、多糖プルランをシアヌルクロリドで活性
化し、破傷風毒素と反応させた。この場合、結合物は電
気泳動で出発物質と異なることのみを示して確認された
。
２年））では、多糖プルランをシアヌルクロリドで活性
化し、破傷風毒素と反応させた。この場合、結合物は電
気泳動で出発物質と異なることのみを示して確認された
。
これらの場合、凝集分子量の意味以外の共有結合の証明
がなく、従って該複合体でも凝集分子量を与えることが
示されるように、共有結合物と分子複合体における電荷
の有無に無関係な巨大分子の自然な相互作用を混同させ
る。
がなく、従って該複合体でも凝集分子量を与えることが
示されるように、共有結合物と分子複合体における電荷
の有無に無関係な巨大分子の自然な相互作用を混同させ
る。
同時係属中の特許、米国特許出願第６０８，７３８号、
１９８４年５月１０日出願（及び参考文献としてここに
組み入れる）に、共有結合により修飾されたポリアニオ
ン性多糖−タン白が二属のスペーサー（ｂｉｇｅｎｅｒ
ｉｃｓｐａｃｅｒ ）により細菌由来免疫原性膜または
他のタン白と結合した該多糖の共有結合物（ｃｏｖａｌ
ｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｌ、これらの製造法、多
糖類とタン白類との間の結合の共有結合性の確認法と共
に示されている。この文献による方法を用いて、Ｔ細胞
依存性が証明され、そして特に使用した多糖類と同族の
細菌に対する防御血清抗体を誘導するワクチンの成分と
して有用であり化学的に安定な多糖−タン白結合物を製
造することができる。しかし、この方法は共有結合によ
り修飾するポリアニオン性多糖に対してのみ有用であり
、有機溶媒または塩類溶液に不溶または半溶解性であり
処理しにくい多糖類には役立たない。
１９８４年５月１０日出願（及び参考文献としてここに
組み入れる）に、共有結合により修飾されたポリアニオ
ン性多糖−タン白が二属のスペーサー（ｂｉｇｅｎｅｒ
ｉｃｓｐａｃｅｒ ）により細菌由来免疫原性膜または
他のタン白と結合した該多糖の共有結合物（ｃｏｖａｌ
ｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｌ、これらの製造法、多
糖類とタン白類との間の結合の共有結合性の確認法と共
に示されている。この文献による方法を用いて、Ｔ細胞
依存性が証明され、そして特に使用した多糖類と同族の
細菌に対する防御血清抗体を誘導するワクチンの成分と
して有用であり化学的に安定な多糖−タン白結合物を製
造することができる。しかし、この方法は共有結合によ
り修飾するポリアニオン性多糖に対してのみ有用であり
、有機溶媒または塩類溶液に不溶または半溶解性であり
処理しにくい多糖類には役立たない。
従って、本発明の目的は化学的に安定な多糖−タン白結
合物の製造において、中性多糖類及び共有結合で修飾さ
れた該中性多糖類の可溶化方法を開発することでおる。
合物の製造において、中性多糖類及び共有結合で修飾さ
れた該中性多糖類の可溶化方法を開発することでおる。
また化学的に安定な結合物がある種の細菌、特に使用し
た多糖類と同族の細菌に対する防御血清抗体を誘導する
ことにより１価−または多価ワクチンの成分として有用
であるため、中性多糖抗原決定基とタン白％輸送〃決定
基の分子的接近を生物系においても保持できるように該
中性多糖類とタン白とを結合させることも本発明の目的
である。さらに、例えば髄膜炎、耳炎に対して使用する
場合の免疫学的に有用なワクチンにおける該結合物を使
用した治療法も本発明の目的である。
た多糖類と同族の細菌に対する防御血清抗体を誘導する
ことにより１価−または多価ワクチンの成分として有用
であるため、中性多糖抗原決定基とタン白％輸送〃決定
基の分子的接近を生物系においても保持できるように該
中性多糖類とタン白とを結合させることも本発明の目的
である。さらに、例えば髄膜炎、耳炎に対して使用する
場合の免疫学的に有用なワクチンにおける該結合物を使
用した治療法も本発明の目的である。
本発明は、共有結合によシ修飾された細菌由来中性多糖
類；結合物が免疫原性細菌性ワクチンの有用な成分であ
り、該中性多糖類が共有結合で修飾された免疫原性膜タ
ン白、ウィルスタン白のサブユニット、合成ポリペプチ
ド、細菌由来変性毒素、その他の適当な免疫原性タン白
と結合した化学的に安定な該結合物に関するものである
。本発明の多−一タン白結合物は、共有チオエーテル基
を含む二属スペーサーを介して結合しており、ここにお
いて該二属のスペーサーは巨大分子（例えば中性多糖と
タン白）に結合する分子鎖であり、該スペーサーの一部
がある修飾を施した巨木分子（例えば、共有結合で修飾
した中性多糖）に、他の部分が他の修飾を施した巨大分
子（例えば、官能基を施したタン白）に由来するもので
ある。
類；結合物が免疫原性細菌性ワクチンの有用な成分であ
り、該中性多糖類が共有結合で修飾された免疫原性膜タ
ン白、ウィルスタン白のサブユニット、合成ポリペプチ
ド、細菌由来変性毒素、その他の適当な免疫原性タン白
と結合した化学的に安定な該結合物に関するものである
。本発明の多−一タン白結合物は、共有チオエーテル基
を含む二属スペーサーを介して結合しており、ここにお
いて該二属のスペーサーは巨大分子（例えば中性多糖と
タン白）に結合する分子鎖であり、該スペーサーの一部
がある修飾を施した巨木分子（例えば、共有結合で修飾
した中性多糖）に、他の部分が他の修飾を施した巨大分
子（例えば、官能基を施したタン白）に由来するもので
ある。
本発明記載の製法では、親電子性中心または突出したチ
オール基を有する多糖を製造するための１つまたはそれ
以上の工程で共有結合により中性多糖に官能基が付与さ
れる。好適には、中性多糖は第一に水性ヒドラジン存在
下またはこれなしの水中で加熱することにより断片化さ
れ、水を除去し、断片化した多糖を二官能性活性化試薬
で誘導体とした後、二端求核剤と反応させる。求核剤で
官能化された中性多糖は、突出した親電子中心を形成す
る試薬と反応させるかまたは突出したチオール基を形成
する試薬と反応させる。二端求核剤を適当に選択、即ち
、活性化された中性多糖と反応し親電子中心またはチオ
ール基が突出した共有結合で修飾された中性多糖に導く
もの、または、適当な求核剤を選択することにより、求
核剤で官能化された中性多糖をさらに官能化することが
避けられる。
オール基を有する多糖を製造するための１つまたはそれ
以上の工程で共有結合により中性多糖に官能基が付与さ
れる。好適には、中性多糖は第一に水性ヒドラジン存在
下またはこれなしの水中で加熱することにより断片化さ
れ、水を除去し、断片化した多糖を二官能性活性化試薬
で誘導体とした後、二端求核剤と反応させる。求核剤で
官能化された中性多糖は、突出した親電子中心を形成す
る試薬と反応させるかまたは突出したチオール基を形成
する試薬と反応させる。二端求核剤を適当に選択、即ち
、活性化された中性多糖と反応し親電子中心またはチオ
ール基が突出した共有結合で修飾された中性多糖に導く
もの、または、適当な求核剤を選択することにより、求
核剤で官能化された中性多糖をさらに官能化することが
避けられる。
中性多糖を共有結合で修飾することとは別に、適当な細
菌由来気輸送（ｃａｒｒｉｅｒ ） “タン白を、突
出したチオール基を形成する試薬または突出した親電子
中心を形成する試薬と１段または２段工程で反応させる
。次に、適当な共有結合で修飾された中性多糖類及びタ
ン白を反応させて共有結合した多糖−タン白結合物をつ
くり、そして共有結合で結合した多糖の量に基づき免疫
原性投与を可能にするように未結合の巨大分子及び過剰
の試薬を除去精製した。
菌由来気輸送（ｃａｒｒｉｅｒ ） “タン白を、突
出したチオール基を形成する試薬または突出した親電子
中心を形成する試薬と１段または２段工程で反応させる
。次に、適当な共有結合で修飾された中性多糖類及びタ
ン白を反応させて共有結合した多糖−タン白結合物をつ
くり、そして共有結合で結合した多糖の量に基づき免疫
原性投与を可能にするように未結合の巨大分子及び過剰
の試薬を除去精製した。
次に、本発明の多糖−タン白結合物、または本発明の多
糖−タン白結合物と他の多糖−タン白共有結合物、例え
ば米国特許出願第６０８．７３８号、１９８４年５月１
０日出願、または他の免疫性物質との混合物、の免疫学
的に有効な量を含む１価または多価免疫原性ワクチンま
たはその誘導体を製造することができる。
糖−タン白結合物と他の多糖−タン白共有結合物、例え
ば米国特許出願第６０８．７３８号、１９８４年５月１
０日出願、または他の免疫性物質との混合物、の免疫学
的に有効な量を含む１価または多価免疫原性ワクチンま
たはその誘導体を製造することができる。
本発明の共有結合で修飾された多糖類は種類を問わずい
ずれの種類の中性（即ち、非アニオン性／非酸性）多糖
類からも修飾されるものであり特定の型の多糖類に限定
するものではない。該細菌由来中性夾膜多糖類の例には
エル、ケンネ（Ｌ、 Ｋｅｎｎｅ ）及びビー、リンド
バーグ（Ｂ、 Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ）、 ザ・ポリサッ
カライド（Ｔｈｅ Ｐｏｌ’ｙｓａｃｃｈａｖｉｄａｓ
）、第２巻、２８７−３６３頁、アカデミツクプレス
（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ ） （１９８３年）及
びニー、ニス、チャウドリ（Ａ、 Ｓ、 Ｃｈａｕｄｒ
ｉ ）ら、カルボヒトラード・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）、第２５巻、１６
１−１７２頁（１９７２年）に記載された肺炎連鎖球菌
（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｗｏｎｉａｅ
）１４、−７Ｆ、３７型多糖類を含む。
ずれの種類の中性（即ち、非アニオン性／非酸性）多糖
類からも修飾されるものであり特定の型の多糖類に限定
するものではない。該細菌由来中性夾膜多糖類の例には
エル、ケンネ（Ｌ、 Ｋｅｎｎｅ ）及びビー、リンド
バーグ（Ｂ、 Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ）、 ザ・ポリサッ
カライド（Ｔｈｅ Ｐｏｌ’ｙｓａｃｃｈａｖｉｄａｓ
）、第２巻、２８７−３６３頁、アカデミツクプレス
（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ ） （１９８３年）及
びニー、ニス、チャウドリ（Ａ、 Ｓ、 Ｃｈａｕｄｒ
ｉ ）ら、カルボヒトラード・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）、第２５巻、１６
１−１７２頁（１９７２年）に記載された肺炎連鎖球菌
（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｗｏｎｉａｅ
）１４、−７Ｆ、３７型多糖類を含む。
本発明のタン白は免疫原性及び安全性が証明されたもの
であるが、特に特定の型に限定されるものではない。適
当なタン白には、細菌由来膜タン白；エデスチンまたは
大豆トリプシン阻害剤のような種々の植物タン白；ヘパ
テイテイスＡまたはＢ、ヘルペスｇＤまたはｇｃｓ
エプスタイン−バーまたは帯状庖疹（ｖａｒｉｃｅｌｌ
ａｚｏｓｔｅｒ ）のサブユニットのようなウィルス性
タン白すブユニット；合成ポリペプチド；ジフテリア変
性毒素；破傷風毒素が含まれるが、好適にはＴ細胞刺激
剤であるナイセリア髄膜炎球菌（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ外膜タン白である
。これらの血清型タン白の例はへルテイング（Ｈｅｌｔ
ｉｎｇ ） ラ、％５ｅｒｏｔｙｐｅ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ’ 、 Ａｃｔａｐａｔｈ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、 ５ｃａｎｄ。
であるが、特に特定の型に限定されるものではない。適
当なタン白には、細菌由来膜タン白；エデスチンまたは
大豆トリプシン阻害剤のような種々の植物タン白；ヘパ
テイテイスＡまたはＢ、ヘルペスｇＤまたはｇｃｓ
エプスタイン−バーまたは帯状庖疹（ｖａｒｉｃｅｌｌ
ａｚｏｓｔｅｒ ）のサブユニットのようなウィルス性
タン白すブユニット；合成ポリペプチド；ジフテリア変
性毒素；破傷風毒素が含まれるが、好適にはＴ細胞刺激
剤であるナイセリア髄膜炎球菌（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ外膜タン白である
。これらの血清型タン白の例はへルテイング（Ｈｅｌｔ
ｉｎｇ ） ラ、％５ｅｒｏｔｙｐｅ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａＭｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ’ 、 Ａｃｔａｐａｔｈ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、 ５ｃａｎｄ。
５ｅｃｔ、 Ｃ，’ 第８９巻、６９−７８頁（１９
８１年）及びフラッシュ（Ｆｒａｓｃｈ ）ら、ジエー
・バクト（Ｊ、 Ｂａｃｔ ） 、第１２７巻、９７３
−９８１頁（１９７６年）に記載されている。
８１年）及びフラッシュ（Ｆｒａｓｃｈ ）ら、ジエー
・バクト（Ｊ、 Ｂａｃｔ ） 、第１２７巻、９７３
−９８１頁（１９７６年）に記載されている。
本発明の結合物はチオエーテル基及びアルキルアミドを
含む二属のスペーサーを介して結合した安定な多糖−タ
ン白結合物であシ、中性多糖とタン白とによって加水分
解で分解される共有結合を形成している。しかし、本発
明の好適な結合物は、式： Ｐｓ−Ａ−Ｅ−８−Ｂ−Ｐ
ｒ。
含む二属のスペーサーを介して結合した安定な多糖−タ
ン白結合物であシ、中性多糖とタン白とによって加水分
解で分解される共有結合を形成している。しかし、本発
明の好適な結合物は、式： Ｐｓ−Ａ−Ｅ−８−Ｂ−Ｐ
ｒ。
またはＰｓ−Ａ’−８−Ｅ’−Ｂ’−Ｐｒｏ ［式中
、Ｐｓは非アニオン性多糖を示し： Ｐｒｏは免疫原性
タン白を示し： Ａ−Ｅ−８−Ｂ及びＡ’−８−Ｅ’−
Ｂ’は加水分解に安定な共有チオエーテル結合を含む二
属のスペーサーを構成するものであり、これは巨大分子
、ＰｒｏどＰｓ とを（加水分解で分解されるエステル
またはアミド結合のような）共有結合で結合するもので
ある〕により示すことができるものである。スペーサー
（中間結合物） Ａ−Ｅ−８−８において、Ｓは硫黄で
あり；Ｅはチオール基と反応した親硫黄基の変換生成物
で、 り はＨまたはＣＨｌであり、ｐは１乃至３である）により
示され；Ａは Ｈ １ｌ −ＣＮ （ＣＨ，＞ｍｙ （ＣＨ，） ｎ−ｍ−Ｃ式中
、Ｗは０またはＮＨ，ｍはＯ乃至４、ｎは０乃至３、Ｙ
はＣＨ，、ＯｌＳ、ＮＲ’、ＣＨＣＯ，Ｈ（式中、Ｒ′
はＨｌＣＩ−またはＣ２−アルキルである）であるが、
但しＹがＣＨ２の場合ｍ及びｎは同時に零とはならず、
またＹがＯまたはＳの場合、ｍは１硫黄であり：Ａ′
は−！ＮＨ（ＣＨｔ ）、 Ｒ“−（式中、ある）で
あり（Ｗ、ｐ、Ｒ’は上記定義に従う従う）でありそし
てＢ′が一？−であるか、またである。さらに、Ａ−Ｅ
−８−８及びＡ’−８−Ｅ’−Ｂ／という二属のスペー
サーのＥ−８−８及びに−８−Ｅ′ 成分は、共有結
合で修飾した非アニオン性多糖から由来するチオエーテ
ル硫黄側と官能基を付与したタン自から由来するスペー
サーの側とを結合する結合の共有結合性を有することを
反映する同定によって決定できかつ定量できる。
、Ｐｓは非アニオン性多糖を示し： Ｐｒｏは免疫原性
タン白を示し： Ａ−Ｅ−８−Ｂ及びＡ’−８−Ｅ’−
Ｂ’は加水分解に安定な共有チオエーテル結合を含む二
属のスペーサーを構成するものであり、これは巨大分子
、ＰｒｏどＰｓ とを（加水分解で分解されるエステル
またはアミド結合のような）共有結合で結合するもので
ある〕により示すことができるものである。スペーサー
（中間結合物） Ａ−Ｅ−８−８において、Ｓは硫黄で
あり；Ｅはチオール基と反応した親硫黄基の変換生成物
で、 り はＨまたはＣＨｌであり、ｐは１乃至３である）により
示され；Ａは Ｈ １ｌ −ＣＮ （ＣＨ，＞ｍｙ （ＣＨ，） ｎ−ｍ−Ｃ式中
、Ｗは０またはＮＨ，ｍはＯ乃至４、ｎは０乃至３、Ｙ
はＣＨ，、ＯｌＳ、ＮＲ’、ＣＨＣＯ，Ｈ（式中、Ｒ′
はＨｌＣＩ−またはＣ２−アルキルである）であるが、
但しＹがＣＨ２の場合ｍ及びｎは同時に零とはならず、
またＹがＯまたはＳの場合、ｍは１硫黄であり：Ａ′
は−！ＮＨ（ＣＨｔ ）、 Ｒ“−（式中、ある）で
あり（Ｗ、ｐ、Ｒ’は上記定義に従う従う）でありそし
てＢ′が一？−であるか、またである。さらに、Ａ−Ｅ
−８−８及びＡ’−８−Ｅ’−Ｂ／という二属のスペー
サーのＥ−８−８及びに−８−Ｅ′ 成分は、共有結
合で修飾した非アニオン性多糖から由来するチオエーテ
ル硫黄側と官能基を付与したタン自から由来するスペー
サーの側とを結合する結合の共有結合性を有することを
反映する同定によって決定できかつ定量できる。
本発明の製法において、多糖は、（ａ）断片化、水性ヒ
ドラジン存在下または無の条件で水中において多糖を加
熱、凍結乾燥によって水を除去、Ｐ２Ｏ，を用いて真空
乾燥、（ｂ）それを非水性極性非プロトン性溶媒中二官
能性試薬で活性化、（ｃ）この活性化された多糖を二端
求核剤と反応、巖後に必要ならば、さらに（ｄ）この修
飾された多糖を以下のいずれかの試薬、（１）親電子（
例えば親チオール）部位を形成する試薬、または（ＩＤ
チオール基を形成する試薬と反応させることにより官能
基を付与、することにより共有結合で修飾される。反対
にタン白を（１）チオール基を形成する試薬、または、
（１１）親チオール部位と形成する試薬と反応させ、次
に共有結合で修飾した多糖と官能基を付与したタン白と
を一緒に反応させて安定な共有結合を形成した結合物を
形成し、そして、最終混合物を精製して未反応の多糖と
タン白を除去する。
ドラジン存在下または無の条件で水中において多糖を加
熱、凍結乾燥によって水を除去、Ｐ２Ｏ，を用いて真空
乾燥、（ｂ）それを非水性極性非プロトン性溶媒中二官
能性試薬で活性化、（ｃ）この活性化された多糖を二端
求核剤と反応、巖後に必要ならば、さらに（ｄ）この修
飾された多糖を以下のいずれかの試薬、（１）親電子（
例えば親チオール）部位を形成する試薬、または（ＩＤ
チオール基を形成する試薬と反応させることにより官能
基を付与、することにより共有結合で修飾される。反対
にタン白を（１）チオール基を形成する試薬、または、
（１１）親チオール部位と形成する試薬と反応させ、次
に共有結合で修飾した多糖と官能基を付与したタン白と
を一緒に反応させて安定な共有結合を形成した結合物を
形成し、そして、最終混合物を精製して未反応の多糖と
タン白を除去する。
本発明の製法はまた、活性化多糖と反応して突出した親
電子部位またはチオール基を有する共有結合で修飾され
た多糖を形成する求 。
電子部位またはチオール基を有する共有結合で修飾され
た多糖を形成する求 。
核剤または二端求核剤の選択を含んでおり、これにより
共有結合で修飾された多糖を共有結合で修飾したタン白
と反応させる前に、二端求核剤で修飾された多糖にさら
に官能基を付与する必要性を除くものである。また、タ
ン白の各徨部位への官能基の付与は該工程における反応
剤の選択に従い１工程を超える工程で達成することがで
きる。
共有結合で修飾された多糖を共有結合で修飾したタン白
と反応させる前に、二端求核剤で修飾された多糖にさら
に官能基を付与する必要性を除くものである。また、タ
ン白の各徨部位への官能基の付与は該工程における反応
剤の選択に従い１工程を超える工程で達成することがで
きる。
Ａ、多糖の製造
共有結合で修飾された多糖への第１工程では、固体で大
部分は不溶性の多糖を可溶化しなければならない。
部分は不溶性の多糖を可溶化しなければならない。
本発明の中性多糖類は有機溶媒または塩類溶液に不溶で
あり、水に対し限界的に溶解性を示し、且つ多糖の求核
性アルコール性水酸基は水溶液において親電子杯薬に対
し化学的に水の水酸基と競争することができないため、
多糖はより溶解性のある形態に修飾しなければならず、
従って非水性（非ヒドロキシ性）溶媒に溶解しなければ
ならない。適当な溶媒はジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド
、Ｎ、Ｎ’−ジメチルイミダゾリジノン、及びその他の
同様な極性非プロトン性溶媒を含み、好適にはジメチル
ホルムアミドである。
あり、水に対し限界的に溶解性を示し、且つ多糖の求核
性アルコール性水酸基は水溶液において親電子杯薬に対
し化学的に水の水酸基と競争することができないため、
多糖はより溶解性のある形態に修飾しなければならず、
従って非水性（非ヒドロキシ性）溶媒に溶解しなければ
ならない。適当な溶媒はジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホルムアミド
、Ｎ、Ｎ’−ジメチルイミダゾリジノン、及びその他の
同様な極性非プロトン性溶媒を含み、好適にはジメチル
ホルムアミドである。
米国特許出願筒６０８，７３８号（１９８４年５月１０
日出願）において、酸性基を有する細菌由来多糖類はま
ずこれらを適当な塩の形に変換することにより非ヒドロ
キシ性有機溶媒に可溶化した。対照的に、出願人は、非
ポリアニオン性中性多糖類を５−１５％水性ヒドラジン
の存在下もしくはそれを含まない蒸留水中７０℃乃至１
００℃で３０秒乃至１分間加熱することにより多糖類を
断片化して、無傷のままではその大部分は不溶性を示す
中性多糖の可溶化を達成する。しかし免疫原性ワクチン
用中性多糖類の効力を長期に維持し、多糖を使用可能な
形態にする。
日出願）において、酸性基を有する細菌由来多糖類はま
ずこれらを適当な塩の形に変換することにより非ヒドロ
キシ性有機溶媒に可溶化した。対照的に、出願人は、非
ポリアニオン性中性多糖類を５−１５％水性ヒドラジン
の存在下もしくはそれを含まない蒸留水中７０℃乃至１
００℃で３０秒乃至１分間加熱することにより多糖類を
断片化して、無傷のままではその大部分は不溶性を示す
中性多糖の可溶化を達成する。しかし免疫原性ワクチン
用中性多糖類の効力を長期に維持し、多糖を使用可能な
形態にする。
次の工程は、多糖類に共有結合を施す際の他の重要な物
理化学的限界の克服を目的とするものであり、その限界
とは多糖類の分子上に結合を目的とする単位の官能基付
与に通常または実際に使用される試薬と充分に反応性が
ある、水酸基以外の官能基が存在しないことである。残
留水（及び水酸基）は凍結乾燥及びｐ、 ｏ、 を用
いた真空乾燥によシ除去される。そして活性化多糖を形
成させるだめの多糖の活性化、求核剤により官能基を付
与された多糖を形成させるための二端求核剤との反応、
及び親電子部位またはチオール基のいずれかを形成する
試薬による官能基付与はすべて多糖を共有結合で修飾す
るため及び結合物裂造時における多糖上に官能基を発現
させるために行うものである。
理化学的限界の克服を目的とするものであり、その限界
とは多糖類の分子上に結合を目的とする単位の官能基付
与に通常または実際に使用される試薬と充分に反応性が
ある、水酸基以外の官能基が存在しないことである。残
留水（及び水酸基）は凍結乾燥及びｐ、 ｏ、 を用
いた真空乾燥によシ除去される。そして活性化多糖を形
成させるだめの多糖の活性化、求核剤により官能基を付
与された多糖を形成させるための二端求核剤との反応、
及び親電子部位またはチオール基のいずれかを形成する
試薬による官能基付与はすべて多糖を共有結合で修飾す
るため及び結合物裂造時における多糖上に官能基を発現
させるために行うものである。
次工程では、解重合した多糖は活性化剤と多種の重量比
が１＝５から１：１２の間にある二官能性試薬と約０’
−１５℃で１０分乃至１時間攪拌反応させることによシ
活性化される。臭素化シアンによる活性化は本発明によ
シ可能であるが、この試薬は多糖類の活性化においてご
くわずかに利用されているのみで好適ではない。
が１＝５から１：１２の間にある二官能性試薬と約０’
−１５℃で１０分乃至１時間攪拌反応させることによシ
活性化される。臭素化シアンによる活性化は本発明によ
シ可能であるが、この試薬は多糖類の活性化においてご
くわずかに利用されているのみで好適ではない。
実際、多糖の活性化を行うのに好適な二官能性試薬は炭
酸誘導体Ｒ２−’５−Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立
にイミダゾリルのようなアゾリル；ハロゲン化物；ｐ−
ニトロフェニル、ポリハロフェニルのようなフェニルエ
ステルである）を含む。
酸誘導体Ｒ２−’５−Ｒ３（式中、Ｒ２及びＲ３は独立
にイミダゾリルのようなアゾリル；ハロゲン化物；ｐ−
ニトロフェニル、ポリハロフェニルのようなフェニルエ
ステルである）を含む。
特に好適な試薬、カルボニルジイミダゾールが水酸基と
反応して多糖のイミダゾリルウレタンを生成する。例え
ばニトロフェニルクロロホルメートを含むアリールクロ
ロホルメートは多糖の混合炭酸ニスエルを生成する。
反応して多糖のイミダゾリルウレタンを生成する。例え
ばニトロフェニルクロロホルメートを含むアリールクロ
ロホルメートは多糖の混合炭酸ニスエルを生成する。
どちらの場合においても、得られる活性化多糖はアミン
類のような求核試薬に対し反応性しやすく、従ってそれ
ぞれのウレタンに変換される。
類のような求核試薬に対し反応性しやすく、従ってそれ
ぞれのウレタンに変換される。
４、ｎはＯ乃至３、ＹはＣＨ，、Ｏ，５ＸＮＲ’、ｃｎ
ｃｏｔａ （式中、Ｒ′はＨＸＣｌ−″またはｃ２−
アルキルである）であシ、但しＹがＣＨ，の場合、ｍと
ｎとは同時に０とはならず、Ｙが０またはＳの場合、ｍ
は１を超えｎも１を超える〕のようなジアミンである求
核試薬と、アミンが大過剰（即ち、例えば、使用した活
性化剤に対しアミンが５０から１００倍過剰のモル濃度
）状態で反応させる。反応は水浴中で１５分乃至１時間
保った後、約１７°−４０℃を１５分乃至１時間保つ。
ｃｏｔａ （式中、Ｒ′はＨＸＣｌ−″またはｃ２−
アルキルである）であシ、但しＹがＣＨ，の場合、ｍと
ｎとは同時に０とはならず、Ｙが０またはＳの場合、ｍ
は１を超えｎも１を超える〕のようなジアミンである求
核試薬と、アミンが大過剰（即ち、例えば、使用した活
性化剤に対しアミンが５０から１００倍過剰のモル濃度
）状態で反応させる。反応は水浴中で１５分乃至１時間
保った後、約１７°−４０℃を１５分乃至１時間保つ。
１．４−ブタンジアミンのようなジアミンと反応させた
場合、活性化多糖は突出したアミンを有するウレタン型
多糖となり、さらにアシル化によシ官能基付与を行うこ
とができる。
場合、活性化多糖は突出したアミンを有するウレタン型
多糖となり、さらにアシル化によシ官能基付与を行うこ
とができる。
混合炭酸エステル体でも容易にジアミン類と反応しアミ
ノ基の突出となる。
ノ基の突出となる。
別法として、活性化多糖は、ジアミノアルカンのモノハ
ロアセトアミド誘導体、例えば４−ブロモアセトアミド
ブチルジアミン〔ダブリュ、ビー、ローソン（Ｗ、 Ｂ
、 Ｌａｗａｏｎ ） ら、ホッパ・ザイラース・ゼ
ット・フイジオロ・ケム（Ｈｏｐｐｅ ５ｅｙｌｅｒ’
ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ 、 ）第３４
９、巻、２５１頁（１９６８年）参照〕のような求核剤
と反応し、親電子部位が突出し共有結合によシ修飾され
た多糖が生成する。また、活性化多糖はシステアミン（
アミノエタンチオール）、シスチン及びペプチド合成分
野においてよく知られている誘導体の例のようなアミノ
チオールと反応すると、突出したチオール基を有する多
糖を製造することができる。
ロアセトアミド誘導体、例えば４−ブロモアセトアミド
ブチルジアミン〔ダブリュ、ビー、ローソン（Ｗ、 Ｂ
、 Ｌａｗａｏｎ ） ら、ホッパ・ザイラース・ゼ
ット・フイジオロ・ケム（Ｈｏｐｐｅ ５ｅｙｌｅｒ’
ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ 、 ）第３４
９、巻、２５１頁（１９６８年）参照〕のような求核剤
と反応し、親電子部位が突出し共有結合によシ修飾され
た多糖が生成する。また、活性化多糖はシステアミン（
アミノエタンチオール）、シスチン及びペプチド合成分
野においてよく知られている誘導体の例のようなアミノ
チオールと反応すると、突出したチオール基を有する多
糖を製造することができる。
両方の場合とも、共有結合で修飾した多糖と修飾した細
菌由来東輸送〃タン白とを結合させる前にさらに官能基
付与を行う必要はない。
菌由来東輸送〃タン白とを結合させる前にさらに官能基
付与を行う必要はない。
多糖製造における最終工程では、もし必要ならば、さら
に求核剤で官能基付与をした多糖を親電子性（即ち、親
硫黄性）部位を形成する試薬またはチオール基を形成す
る試薬のいずれかと反応させ官能基付与を行う。
に求核剤で官能基付与をした多糖を親電子性（即ち、親
硫黄性）部位を形成する試薬またはチオール基を形成す
る試薬のいずれかと反応させ官能基付与を行う。
たはＣＨ３：Ｘはα、Ｂｒ、Ｉであり：Ｘ’はニトロフ
ェノキシ、ジニトロフェノキシ、ペンタクロロフェノキ
シ、ペンタフルオロフェノキシ、ハロゲン化物、０−（
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル）、またはアシドであ
る）のようなα−ハロアセチルまたはα−ハロプロピオ
ニル誘導体へのアシル化剤、特にクロロ酢酸、α−ブロ
モプロピオン酸、を含み、反応はｐＨ６から１１（必要
ならば塩基を添加することによりこの範囲内に維持する
）、約Ｏ０乃至３５℃の温度で１０分乃至１時間行う。
ェノキシ、ジニトロフェノキシ、ペンタクロロフェノキ
シ、ペンタフルオロフェノキシ、ハロゲン化物、０−（
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル）、またはアシドであ
る）のようなα−ハロアセチルまたはα−ハロプロピオ
ニル誘導体へのアシル化剤、特にクロロ酢酸、α−ブロ
モプロピオン酸、を含み、反応はｐＨ６から１１（必要
ならば塩基を添加することによりこの範囲内に維持する
）、約Ｏ０乃至３５℃の温度で１０分乃至１時間行う。
アミノ基を誘導した多糖は、硫黄置換をうけやすい適当
な官能基が付与された多糖類を製造するために、活性マ
レイミドアミノ酸〔オー５ケラ−（０，Ｋｅｌｌｅｒ
）ら、ヘルツ・ヒミ・アクタ（Ｈｅ１ｖ、 Ｃｈｉｍ、
Ａｃｔａ 、 ） 第５８巻、５３１頁（１９７５
年）参照〕によりアシル化し、マレイミド基 る）を製造するか；ブロモ酢酸ｐ−ニトロフェニルエス
テルのような２−ハロアセチル化〔ベリヒテ（Ｂｅｒ暑
、第６７巻、１２０４頁（１９３４年）参照〕でアシル
化することかできる。
な官能基が付与された多糖類を製造するために、活性マ
レイミドアミノ酸〔オー５ケラ−（０，Ｋｅｌｌｅｒ
）ら、ヘルツ・ヒミ・アクタ（Ｈｅ１ｖ、 Ｃｈｉｍ、
Ａｃｔａ 、 ） 第５８巻、５３１頁（１９７５
年）参照〕によりアシル化し、マレイミド基 る）を製造するか；ブロモ酢酸ｐ−ニトロフェニルエス
テルのような２−ハロアセチル化〔ベリヒテ（Ｂｅｒ暑
、第６７巻、１２０４頁（１９３４年）参照〕でアシル
化することかできる。
チオール基を形成させるために使用する適当な試薬は、
例えば、チオラクトンのようなアシル化剤、例えば （式中、Ｒ４はＣ，−Ｃ，アルキルまたはＣ，Ｈ，、Ｃ
１゜Ｈｌ、のような単環または二環性アリール；アルキ
ルまたはＣ６Ｈ＠、 Ｘ’は上記定義に従う）Ｒ’、Ｘ
’は上記定義に従う）による処理、次にジチオスレイト
ールによる処理を含む。これらの反応は窒気雰囲気下約
０６−３５℃、ｐＨ８〜１１（必要ならば、塩基を添加
しｐｎをこの範囲に維持する）で１乃至２４時間行う。
例えば、チオラクトンのようなアシル化剤、例えば （式中、Ｒ４はＣ，−Ｃ，アルキルまたはＣ，Ｈ，、Ｃ
１゜Ｈｌ、のような単環または二環性アリール；アルキ
ルまたはＣ６Ｈ＠、 Ｘ’は上記定義に従う）Ｒ’、Ｘ
’は上記定義に従う）による処理、次にジチオスレイト
ールによる処理を含む。これらの反応は窒気雰囲気下約
０６−３５℃、ｐＨ８〜１１（必要ならば、塩基を添加
しｐｎをこの範囲に維持する）で１乃至２４時間行う。
例えば、アミノ基を誘導された多糖を
与された多糖を製造する。
これらの工程により、Ｐｇ−Ａ−Ｅγ−またはＰｓ−Ａ
’−３Ｈ−（式中、Ｅγは ＾ は上記定義に従う）の形態である共有結合で修飾した中
性多糖類が製造される。
’−３Ｈ−（式中、Ｅγは ＾ は上記定義に従う）の形態である共有結合で修飾した中
性多糖類が製造される。
Ｂ、 タン白の製造
多糖と結合させるべきタン白を別個に官能基付与するこ
とは、米国特許出願第６０８，７３８号（１９８４年５
月１０日出願）に示されているようにタン白とチオール
基を形成させる１種またはそれ以上の試薬との反応、ま
たはタン白と親電子性（即ち、親硫黄性）中心を形成さ
せる１種またはそれ以上の試薬との反応を含む。
とは、米国特許出願第６０８，７３８号（１９８４年５
月１０日出願）に示されているようにタン白とチオール
基を形成させる１種またはそれ以上の試薬との反応、ま
たはタン白と親電子性（即ち、親硫黄性）中心を形成さ
せる１種またはそれ以上の試薬との反応を含む。
親電子性の官能基を付与し念多糖との結合物を製造する
場合、タン白をチオール基を形成させる１種またはそれ
以上の試薬、例えば前に記載したような多糖類の上にチ
オール基を形成させるために使用したアシル化剤と１な
いし２工程で反応させる。またチオール化タン白はアタ
ツシ（Ａｔａｓｓｉ ）ら、バイオヘム・工・バイオフ
ィシ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ｅｔＢｉｏｐｈｙｓ
、 Ａｃｔａ ）、第６７０巻、３００頁（１９８１年
）に示されているようなカルボキシ−活性化タン白をア
ミノチオールでアミノ化することにより製造することが
できる。本製造工程における好適な実施態様には、タン
白の突出したアミノ基（即ち、リシル基）をＮ−アセチ
ルホモシスティンチオラクトンの等重量を用いて約０６
乃至３５℃、ｐＨ８乃至１１で５分乃至２時間直接アシ
ル化することが含まれる。
場合、タン白をチオール基を形成させる１種またはそれ
以上の試薬、例えば前に記載したような多糖類の上にチ
オール基を形成させるために使用したアシル化剤と１な
いし２工程で反応させる。またチオール化タン白はアタ
ツシ（Ａｔａｓｓｉ ）ら、バイオヘム・工・バイオフ
ィシ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ｅｔＢｉｏｐｈｙｓ
、 Ａｃｔａ ）、第６７０巻、３００頁（１９８１年
）に示されているようなカルボキシ−活性化タン白をア
ミノチオールでアミノ化することにより製造することが
できる。本製造工程における好適な実施態様には、タン
白の突出したアミノ基（即ち、リシル基）をＮ−アセチ
ルホモシスティンチオラクトンの等重量を用いて約０６
乃至３５℃、ｐＨ８乃至１１で５分乃至２時間直接アシ
ル化することが含まれる。
り
を付与したタン白の製造条件及び方法は、反対部分の多
糖を活性マレイミド酸と反応させて製造するという前記
の記載に従う。
糖を活性マレイミド酸と反応させて製造するという前記
の記載に従う。
突出したチオール基を有する共有結合で修飾された多糖
との結合物を製造する場合、り化剤でアシル化する。ま
た親電子性中心を有する適当なタン白は、例えば、突出
したりシルアミノ基を、活性マレイミド酸、例えばによ
りアシル化することによるか、または、カルボキシ−活
性化タン白をジアミンのモノハロアセチル誘導体と反応
させることにより製造されるものを含む。
との結合物を製造する場合、り化剤でアシル化する。ま
た親電子性中心を有する適当なタン白は、例えば、突出
したりシルアミノ基を、活性マレイミド酸、例えばによ
りアシル化することによるか、または、カルボキシ−活
性化タン白をジアミンのモノハロアセチル誘導体と反応
させることにより製造されるものを含む。
Ｃ１結合物の製造
結合物の製造は単に、突出した親電子性中心を有し共有
結合で修飾された多糖類のいずれかと突出したチオール
基を有するタン白のいずれかとを窒素雰囲気下大体等重
量比、ｐＨは７乃至９、約１７°乃至４０℃で約６乃至
２４時間反応させることであり、これにより共有結合物
が得られる。該反応の例には；ここにおいて４−ブロモ
アセトアミドブチルアミンと反応させた活性化多糖をＮ
−アセチルホモシスティンチオラクトンと反応させたタ
ン白と反応させると結合物が形成される、（式中、ｙ／
／はＣ，−Ｃ，アルキル基である）、ここにおいて活性
マレイミド酸と反応させアミノ基を誘導された多糖を、
カルボキシを活性化させアミノチオールでアミノ化した
タン白と反応させると結合物が形成されるものを含む。
結合で修飾された多糖類のいずれかと突出したチオール
基を有するタン白のいずれかとを窒素雰囲気下大体等重
量比、ｐＨは７乃至９、約１７°乃至４０℃で約６乃至
２４時間反応させることであり、これにより共有結合物
が得られる。該反応の例には；ここにおいて４−ブロモ
アセトアミドブチルアミンと反応させた活性化多糖をＮ
−アセチルホモシスティンチオラクトンと反応させたタ
ン白と反応させると結合物が形成される、（式中、ｙ／
／はＣ，−Ｃ，アルキル基である）、ここにおいて活性
マレイミド酸と反応させアミノ基を誘導された多糖を、
カルボキシを活性化させアミノチオールでアミノ化した
タン白と反応させると結合物が形成されるものを含む。
同様に、突出したチオール基を有し共有結合で修飾され
た多糖類のいずれかと突出した親電子性中心を有するタ
ン白めいずれかとを反応させると共有結合物が得られる
。該反応の例には： ここにおいてアミノチオールと反応させた活性化多糖を
カルボキシを活性化しジアミンのモノハロアセチル誘導
体と反応させたタン白と反応させると結合物を形成させ
るものである。
た多糖類のいずれかと突出した親電子性中心を有するタ
ン白めいずれかとを反応させると共有結合物が得られる
。該反応の例には： ここにおいてアミノチオールと反応させた活性化多糖を
カルボキシを活性化しジアミンのモノハロアセチル誘導
体と反応させたタン白と反応させると結合物を形成させ
るものである。
これらの結合物は固定角ローターを用いて約１００，０
００ Ｘ？ 、約１°乃至２０℃で約２時間遠心分離す
るか、またはゲル浸透、イオン排除クロマトグラフィー
、密度勾配遠心、その他の特異的吸着クロマトグラフィ
ーを含む他の種々の精製方法のいずれかに付し、共有結
合で結合に関与しなかった多糖類及びタン白を除去し、
そして目的の生物学的活性を確認する方法として二属の
スペーサー（二価中間結合物）に関する共有結合性の検
定（下記参照）を行う。
００ Ｘ？ 、約１°乃至２０℃で約２時間遠心分離す
るか、またはゲル浸透、イオン排除クロマトグラフィー
、密度勾配遠心、その他の特異的吸着クロマトグラフィ
ーを含む他の種々の精製方法のいずれかに付し、共有結
合で結合に関与しなかった多糖類及びタン白を除去し、
そして目的の生物学的活性を確認する方法として二属の
スペーサー（二価中間結合物）に関する共有結合性の検
定（下記参照）を行う。
Ｄ、共有結合性の確認分析
結合物の共有結合性の確認そしてそれ故に結合物の安定
性の確認のだめの結合物の分析は出願人によシ、結合物
を加水分解（好適には６ＮＨα、１１０℃で２０時間）
し、チオエーテル結合及びタン白の構成アミノ酸を含む
加水分解に安定なスペーサー（中間結合物）のアミノ酸
を定量分析することにより達成される。必要ならば、タ
ン白に含まれる適轟なアミノ酸標品と比較することによ
り、結合物の共有結合性を反映する残りのアミノ酸値に
ついてタン白中のアミノ酸の寄与を除くことができるか
、またはスペーサーのアミノ酸が分析におけるタン白の
アミノ酸標品以外に現れることで示されることができる
。共有結合性の分析は、生物学的に活性な成分の濃度の
増強を明らかにするための精製法の検討に対しても有用
である。上記の例において、ペプチド結合及びその他の
加水分解に不安定な結合におけるＰｓ−Ａ−Ｅ−８−Ｂ
−Ｐｒｏの分解によって、 を遊離し； 解は、Ｓ−カルボキシメチルシステアミン、Ｈ，ＮＣＨ
，ＣＨ，Ｓ ＣＨ，Ｃｏ ２Ｈを遊離する。次に、スパ
ックマン（５ｐａｃｌａｎａｎ ） 、ムーア（Ｍｏ６
．ｒｅ ）、及びスタイン（５ｔａｉｎ ）の方法のよ
うなりロフトグラフ法を便利に応用して構成アミノ酸の
比を決定できる。
性の確認のだめの結合物の分析は出願人によシ、結合物
を加水分解（好適には６ＮＨα、１１０℃で２０時間）
し、チオエーテル結合及びタン白の構成アミノ酸を含む
加水分解に安定なスペーサー（中間結合物）のアミノ酸
を定量分析することにより達成される。必要ならば、タ
ン白に含まれる適轟なアミノ酸標品と比較することによ
り、結合物の共有結合性を反映する残りのアミノ酸値に
ついてタン白中のアミノ酸の寄与を除くことができるか
、またはスペーサーのアミノ酸が分析におけるタン白の
アミノ酸標品以外に現れることで示されることができる
。共有結合性の分析は、生物学的に活性な成分の濃度の
増強を明らかにするための精製法の検討に対しても有用
である。上記の例において、ペプチド結合及びその他の
加水分解に不安定な結合におけるＰｓ−Ａ−Ｅ−８−Ｂ
−Ｐｒｏの分解によって、 を遊離し； 解は、Ｓ−カルボキシメチルシステアミン、Ｈ，ＮＣＨ
，ＣＨ，Ｓ ＣＨ，Ｃｏ ２Ｈを遊離する。次に、スパ
ックマン（５ｐａｃｌａｎａｎ ） 、ムーア（Ｍｏ６
．ｒｅ ）、及びスタイン（５ｔａｉｎ ）の方法のよ
うなりロフトグラフ法を便利に応用して構成アミノ酸の
比を決定できる。
Ｅ、応用
本発明の結合物の１種またはそれ以上は用いた多糖を含
む菌と同族の細菌によって惹起される菌血症に対し、受
動または能動免疫、予防的に、または治療用として哺乳
類に使用することができる。本発明の好適な実施態様で
は、本発明の結合物を単独で；肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ） ７
Ｆ 、 １４．３７型のような他の中性多糖類を含む他
の結合物と一緒に：ヘモフイルス・インフルエンザ（）
ｔａｅｍｏｐｈｉｌｕａ １ｎｆｌｕｅｎｚａ ） ｂ
型または肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ） ６ Ｂ 。
む菌と同族の細菌によって惹起される菌血症に対し、受
動または能動免疫、予防的に、または治療用として哺乳
類に使用することができる。本発明の好適な実施態様で
は、本発明の結合物を単独で；肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ） ７
Ｆ 、 １４．３７型のような他の中性多糖類を含む他
の結合物と一緒に：ヘモフイルス・インフルエンザ（）
ｔａｅｍｏｐｈｉｌｕａ １ｎｆｌｕｅｎｚａ ） ｂ
型または肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ） ６ Ｂ 。
１９Ｆ、２３Ｆ型生物のようなポリアニオン性多糖類を
含む他の結合物と一緒に；また肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｎｍｏｎｉａｅ ） ３型
多糖のような非結合型多糖類と一緒に；−価または多価
ワクチンの中に入れて使用することができる。
含む他の結合物と一緒に；また肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｎｍｏｎｉａｅ ） ３型
多糖のような非結合型多糖類と一緒に；−価または多価
ワクチンの中に入れて使用することができる。
能動免疫は、投与時投与する結合物における各結合形態
の多糖の、また投与時投与する非結合型多糖の、また結
合物または結合物類を以前に投与した動物から得た全抗
血清の、また該抗血清のグロブリンまたは他の抗体を含
む分画の有効量（測定可能量の抗体、例えば２乃至５０
μ２を製造できる量）を、滅菌生理食塩水のような薬学
的に許容される担体と共にまたは使用せずに注射するこ
とにより達成することができる。該グロブリンは全抗血
清からクロマトグラフィー、塩またはアルコールによる
分画、電気泳動により得られる。
の多糖の、また投与時投与する非結合型多糖の、また結
合物または結合物類を以前に投与した動物から得た全抗
血清の、また該抗血清のグロブリンまたは他の抗体を含
む分画の有効量（測定可能量の抗体、例えば２乃至５０
μ２を製造できる量）を、滅菌生理食塩水のような薬学
的に許容される担体と共にまたは使用せずに注射するこ
とにより達成することができる。該グロブリンは全抗血
清からクロマトグラフィー、塩またはアルコールによる
分画、電気泳動により得られる。
受動免疫は標準的なモノクローナル抗体法または適当な
哺乳類宿主を免疫することにより達成することができる
。アジュバントし例えば、みょうばん（ａｌｕｍ ）
］ を使用することも本発明の範囲内に含まれること
を企図している。
哺乳類宿主を免疫することにより達成することができる
。アジュバントし例えば、みょうばん（ａｌｕｍ ）
］ を使用することも本発明の範囲内に含まれること
を企図している。
本発明の好適な実施態様では、とりわけ本発明記載の結
合物を含む一価または多価組成物は人間、特に新生児及
び幼児の活性免疫原性ワクチン接種用に使用される。ま
たさらに安定性を維持するために、使用前に該結合物を
乳糖の存在下（例えば、５０μ２／−の肺炎球菌多糖／
１０ｔＩＩｇ／−の乳糖）凍結乾燥することができる。
合物を含む一価または多価組成物は人間、特に新生児及
び幼児の活性免疫原性ワクチン接種用に使用される。ま
たさらに安定性を維持するために、使用前に該結合物を
乳糖の存在下（例えば、５０μ２／−の肺炎球菌多糖／
１０ｔＩＩｇ／−の乳糖）凍結乾燥することができる。
好適な投与レベルは、単回投与において、肺炎球菌多糖
の結合物に関し結合物の形態で多糖２５μ２に対応した
投与結合物またはその誘導体の量、非結合型多糖２５μ
を及び米国特許出願第６０８，７３８号（１９８４年５
月１０日出願）に記載のポリアニオン性多糖類を含む結
合物の結合物またはその誘導体の投与量である。必要な
らば、結合物形態において多糖１０μ２に対応する量の
エイチ・インフルエンザ（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ
） ｂ型多糖の結合物またはその誘導体をさらに１回ま
たは２回の投与を行うことができる。
の結合物に関し結合物の形態で多糖２５μ２に対応した
投与結合物またはその誘導体の量、非結合型多糖２５μ
を及び米国特許出願第６０８，７３８号（１９８４年５
月１０日出願）に記載のポリアニオン性多糖類を含む結
合物の結合物またはその誘導体の投与量である。必要な
らば、結合物形態において多糖１０μ２に対応する量の
エイチ・インフルエンザ（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ
） ｂ型多糖の結合物またはその誘導体をさらに１回ま
たは２回の投与を行うことができる。
本発明はさらに以下の実施例で参考のため定義するが、
説明するためのものであり限定するものではない。
説明するためのものであり限定するものではない。
実施例１゜
肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ ） １４型夾膜多糖の製造 植菌及び稲苗の展開 工程Ａ：実際の種菌の製造 肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ ）１４型菌の植菌用種菌の凍結乾燥試験
管〔ペンシルバニア大学 ロバート オーストリアン博
士（Ｄｒ、 Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕ５ｔｒｉａｎ ）から
入手〕を滅菌ビーフハートインフュージョンブロース〔
水０．９６にハートインフュージョンブロース（Ｄｉｆ
ｅｏ ） ２５ ｆを溶解〕１艷に懸濁、次にこの懸
濁物を５枚のウサギ血液寒天プレート（精製寒天２０ｆ
１ハートインフユージヨンブロース２５ｆ１脱フイブリ
ンウサギ血液１００−１蒸留水０．９１ ）に各プレー
トに約０、２−播種した。３７℃培養約１８時間後、プ
レート上に生育した菌を各ウサギ血液寒天プレート（ビ
ーフハートインフュージョンブロース５ｄずつ）に再懸
濁し保存した。
ｍｏｎｉａｅ ） １４型夾膜多糖の製造 植菌及び稲苗の展開 工程Ａ：実際の種菌の製造 肺炎連鎖球菌（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ ）１４型菌の植菌用種菌の凍結乾燥試験
管〔ペンシルバニア大学 ロバート オーストリアン博
士（Ｄｒ、 Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕ５ｔｒｉａｎ ）から
入手〕を滅菌ビーフハートインフュージョンブロース〔
水０．９６にハートインフュージョンブロース（Ｄｉｆ
ｅｏ ） ２５ ｆを溶解〕１艷に懸濁、次にこの懸
濁物を５枚のウサギ血液寒天プレート（精製寒天２０ｆ
１ハートインフユージヨンブロース２５ｆ１脱フイブリ
ンウサギ血液１００−１蒸留水０．９１ ）に各プレー
トに約０、２−播種した。３７℃培養約１８時間後、プ
レート上に生育した菌を各ウサギ血液寒天プレート（ビ
ーフハートインフュージョンブロース５ｄずつ）に再懸
濁し保存した。
この再懸濁した菌１，５ｄを使用して液体血液培地（ビ
ーフハートインフュージョンブロース９０ｍと脱フィブ
リンウサギ血液１０−）フラスコ６本に接種、そして攪
拌せずに３７℃で約１８時間培養した。
ーフハートインフュージョンブロース９０ｍと脱フィブ
リンウサギ血液１０−）フラスコ６本に接種、そして攪
拌せずに３７℃で約１８時間培養した。
工程Ｂ：２を邪魔板なし三角フラスコ
工程Ａで種菌を培養した肺炎連鎖球菌
（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
） １４型菌のフラスコを集め、この種菌２０−を滅
菌肺炎球菌接種用培地（下記参照）９０〇−及び２５％
ブドウ糖溶液１００ｍを含む２を邪魔板なし三角フラス
コ５本それぞれに接種した。フラスコのｐＨは１２％炭
酸水素ナトリウム溶液の添加によシｐ■６．０ ＝ ７
．０に保ち、３７℃で７時間培養後（その時典型的なｏ
Ｉ）ａａｏ値は２．９０であった）、フラスコ４本から
菌を集めた（その菌液はＯＩ）ａａｏが２．８０、ｐＨ
は６．８であった）。
） １４型菌のフラスコを集め、この種菌２０−を滅
菌肺炎球菌接種用培地（下記参照）９０〇−及び２５％
ブドウ糖溶液１００ｍを含む２を邪魔板なし三角フラス
コ５本それぞれに接種した。フラスコのｐＨは１２％炭
酸水素ナトリウム溶液の添加によシｐ■６．０ ＝ ７
．０に保ち、３７℃で７時間培養後（その時典型的なｏ
Ｉ）ａａｏ値は２．９０であった）、フラスコ４本から
菌を集めた（その菌液はＯＩ）ａａｏが２．８０、ｐＨ
は６．８であった）。
肺炎球菌接種用培地γ
大豆ペプトン ２０２酵母エキ
ス 限外濾過物 （１） １ｏ ｏ ｍｔＮａ
Ｑ！
５９に、Ｈ，Ｐｏ、
２．５９２％フェノールレッド
０．５−蒸留水
１ｔγ溶液は１２１℃、２５分高圧滅菌することにより
滅菌した。
ス 限外濾過物 （１） １ｏ ｏ ｍｔＮａ
Ｑ！
５９に、Ｈ，Ｐｏ、
２．５９２％フェノールレッド
０．５−蒸留水
１ｔγ溶液は１２１℃、２５分高圧滅菌することにより
滅菌した。
塩類及び大豆ペプトンは発熱原を含まない少量の熱水に
溶解しさらに発熱原を含まない熱水を最終容量になるま
で加えた。培養槽またはフラスコは１２１℃で約２５分
滅菌、冷却後、酵母エキス限外濾過物（１）を接種前に
無菌的にフラスコまたは培養槽に加えた。
溶解しさらに発熱原を含まない熱水を最終容量になるま
で加えた。培養槽またはフラスコは１２１℃で約２５分
滅菌、冷却後、酵母エキス限外濾過物（１）を接種前に
無菌的にフラスコまたは培養槽に加えた。
（１）酵母エキス限外濾過物：ビール酵母エキス１００
９ （アンバー（Ａｍｂｅｒ ） 社製〕を蒸留水１
ｔに溶解、分子量５０，０００ を有する分子を除去
するためＨｌｏ Ｘ ５０カートリツヂによるアミコン
（Ａｍ１ｃｏｎ ）社製ＤＣ−３０ホローフアイバーで
限外濾過を行った。涙液を集め、０．２２μの膜を通す
ことにより滅菌生成物とした。
９ （アンバー（Ａｍｂｅｒ ） 社製〕を蒸留水１
ｔに溶解、分子量５０，０００ を有する分子を除去
するためＨｌｏ Ｘ ５０カートリツヂによるアミコン
（Ａｍ１ｃｏｎ ）社製ＤＣ−３０ホローフアイバーで
限外濾過を行った。涙液を集め、０．２２μの膜を通す
ことにより滅菌生成物とした。
工程Ｃニア０を種菌培養槽
工程Ｂの集めた生成物を、開始ｐＨ６，８の肺炎球菌種
菌用培地（下記に示すように調製）を含む７０１培養槽
に接種するために使用した。
菌用培地（下記に示すように調製）を含む７０１培養槽
に接種するために使用した。
培養は３７℃、攪拌を１１００ｒｐに保ち、光学密度（
０，Ｄ、 ）が３．２５に達するまで（約４時間後）０
．Ｄ、、グルコース濃度試験、ｐＨを検査した。
０，Ｄ、 ）が３．２５に達するまで（約４時間後）０
．Ｄ、、グルコース濃度試験、ｐＨを検査した。
完全肺炎球菌種菌用培地
大豆ペプトン ８００ ｆ酵
母エキス 限外濾過物 （１） ４１に
２ＨＰＯ４１００ｔ Ｎａα
２００９２５％グルコース溶液 （２）
４ ｔニーコン（Ｕｃｏｎ） Ｂ ６
２５消泡剤 １４ゴ蒸留水
３１．８ｔ（２）グルコースはガラス
器具で蒸留した水を用いて滅菌２５％溶液として調製し
、酵母エキス限外濾過物と共に７０を培養槽に添加した
。
母エキス 限外濾過物 （１） ４１に
２ＨＰＯ４１００ｔ Ｎａα
２００９２５％グルコース溶液 （２）
４ ｔニーコン（Ｕｃｏｎ） Ｂ ６
２５消泡剤 １４ゴ蒸留水
３１．８ｔ（２）グルコースはガラス
器具で蒸留した水を用いて滅菌２５％溶液として調製し
、酵母エキス限外濾過物と共に７０を培養槽に添加した
。
工程Ｄ ： ８００を生産培養槽
工程Ｃの生成物的４０１を肺炎球菌生産用培地（下記に
示すように調製） ５３０１を含む８００を培養槽に接
種するために使用した。
示すように調製） ５３０１を含む８００を培養槽に接
種するために使用した。
培養は３７℃、攪拌を１１００ｒｐに保ち、０、Ｄ、
、グルコース濃度、ｐＨを約２時間毎に検査しなから
０．Ｄ、が２時間前と同じになるまで行い、その時点で
培養が終了した（６時間後典型的な最終０． Ｄ、は５
．２であった）。
、グルコース濃度、ｐＨを約２時間毎に検査しなから
０．Ｄ、が２時間前と同じになるまで行い、その時点で
培養が終了した（６時間後典型的な最終０． Ｄ、は５
．２であった）。
肺炎球菌生産用培地
大豆ペプトン １０．５Ｋｇ
酵母エキス限外ヂ過物 （１） ５２．５
ｔＫ２ＨＰ ０４ １．３
１３ Ｋ９Ｎａα ２
．６２５Ｋｖ２５％グルコース溶液
５８ｔＵｃｏｎＢ６２５消泡剤 ９
５−蒸留水 ４１８．５ｔ
収穫及び不活性化 培養液は液化フェノール８．２ｔを含む一殺菌槽〃に収
穫し不活性化した。
酵母エキス限外ヂ過物 （１） ５２．５
ｔＫ２ＨＰ ０４ １．３
１３ Ｋ９Ｎａα ２
．６２５Ｋｖ２５％グルコース溶液
５８ｔＵｃｏｎＢ６２５消泡剤 ９
５−蒸留水 ４１８．５ｔ
収穫及び不活性化 培養液は液化フェノール８．２ｔを含む一殺菌槽〃に収
穫し不活性化した。
３４及び５８％エタノール沈殿
殺菌培養液６４０ｔに９５％エタノール２１３３ｔを２
０乃至２６℃で攪拌しながら３．６ｔ１分の割合で添加
し、次に９５％エタノール１１７ｔを２１／分の割合で
添加、最終容量を９５０ｔ、最終濃度を３５容量チエタ
ノールとした。混合物は２２℃でさらに４時間攪拌し分
画を完全にし、上澄液を５台の４インチシャープレス（
５ｈａｒｐｌｅｓ ）遠心機１５０００ ｒｐｍ（約４
１７分の流速）で集めた。不溶性沈殿物を廃棄し、透明
な液体にさらに９５％エタノール５５９ｔを７．６ｔ／
分の割合で添加し５８％エタノールとした。混合物を２
１℃でさらに５時間攪拌し沈殿を完全なものとした。
０乃至２６℃で攪拌しながら３．６ｔ１分の割合で添加
し、次に９５％エタノール１１７ｔを２１／分の割合で
添加、最終容量を９５０ｔ、最終濃度を３５容量チエタ
ノールとした。混合物は２２℃でさらに４時間攪拌し分
画を完全にし、上澄液を５台の４インチシャープレス（
５ｈａｒｐｌｅｓ ）遠心機１５０００ ｒｐｍ（約４
１７分の流速）で集めた。不溶性沈殿物を廃棄し、透明
な液体にさらに９５％エタノール５５９ｔを７．６ｔ／
分の割合で添加し５８％エタノールとした。混合物を２
１℃でさらに５時間攪拌し沈殿を完全なものとした。
第二沈殿物の回収
得られた３４％エタノール可溶−５８％エタノール不溶
沈殿物を４イ゛ンチシヤ一プレス遠心機１５０００ ｒ
ｐｍ （流速約４ｔ１分）を用いて遠心分離により集め
、５８％エタノール上澄液は廃棄した。粗生成物の収量
は湿重量で２．４３５匂であった。
沈殿物を４イ゛ンチシヤ一プレス遠心機１５０００ ｒ
ｐｍ （流速約４ｔ１分）を用いて遠心分離により集め
、５８％エタノール上澄液は廃棄した。粗生成物の収量
は湿重量で２．４３５匂であった。
２４％イソプロピルアルコール沈殿
５８％エタノール不溶性物質２．４３５Ｋｖを同様の方
法による２回目の培養で製造した物質１．６２６Ｋｔと
合わせ、得られた物質４．０６１Ｋｆを、ディマックス
（Ｄａｙｍａｘ ）分散容器中１５から２９℃でガラス
器具で蒸留した水３０ｔを用いて、懸濁物が均質になる
まで１２分混合した。さらに蒸留水６６１を懸濁物に添
加しこの混合物を４時間攪拌した。５％酢酸ナトリウム
溶液２４１をこの混合物に添加し、ｐＨは氷酢酸を添加
することにより６．５とした。
法による２回目の培養で製造した物質１．６２６Ｋｔと
合わせ、得られた物質４．０６１Ｋｆを、ディマックス
（Ｄａｙｍａｘ ）分散容器中１５から２９℃でガラス
器具で蒸留した水３０ｔを用いて、懸濁物が均質になる
まで１２分混合した。さらに蒸留水６６１を懸濁物に添
加しこの混合物を４時間攪拌した。５％酢酸ナトリウム
溶液２４１をこの混合物に添加し、ｐＨは氷酢酸を添加
することにより６．５とした。
溶液１２（ｌに、インプロパツール３７．９１を１５乃
至２９℃で攪拌しながら０．３ｔ１分の割合で添加する
ことにより、２４％イソプロピルアルコール濃度とした
。さらに４時間攪拌後、混合物を４インチシャープレス
遠心機ｔｓｏｏｏ ｒｐｍ （流速０．３５℃１分）、
さらにエレクトロヌクレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｕｃｌｅｏｎｉｃｓ ）社製に３−超遠心機（２８，Ｏ
ＯＯｒｐｍ ） ２００−４００ ｒａｔ、／分を用
いて流出液が透明になるまで遠心分離し、不溶性沈殿物
を廃棄した。
至２９℃で攪拌しながら０．３ｔ１分の割合で添加する
ことにより、２４％イソプロピルアルコール濃度とした
。さらに４時間攪拌後、混合物を４インチシャープレス
遠心機ｔｓｏｏｏ ｒｐｍ （流速０．３５℃１分）、
さらにエレクトロヌクレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｕｃｌｅｏｎｉｃｓ ）社製に３−超遠心機（２８，Ｏ
ＯＯｒｐｍ ） ２００−４００ ｒａｔ、／分を用
いて流出液が透明になるまで遠心分離し、不溶性沈殿物
を廃棄した。
３９％イソプロピルアルコール沈殿及びペレット状粗生
成物の取得 前段階で得た２４チイソプロピルアルコール可溶性上澄
液に、攪拌しながらイソプロピルアルコール３８．８ｔ
を０．３ｔ１分の割合で添加することにより３９％イソ
プロパツールとした。混合物（１９４ｔ）を攪拌しなが
ら３２５時間放置した後、２台の４−インチシャープレ
ス遠心機１５．００Ｏｒｐｍ （流速０．５ｔ１分）を
用いて約１８時間遠心分離を行い、ペレット状粗多糖（
２，００６初）を得た。
成物の取得 前段階で得た２４チイソプロピルアルコール可溶性上澄
液に、攪拌しながらイソプロピルアルコール３８．８ｔ
を０．３ｔ１分の割合で添加することにより３９％イソ
プロパツールとした。混合物（１９４ｔ）を攪拌しなが
ら３２５時間放置した後、２台の４−インチシャープレ
ス遠心機１５．００Ｏｒｐｍ （流速０．５ｔ１分）を
用いて約１８時間遠心分離を行い、ペレット状粗多糖（
２，００６初）を得た。
限外濾過
遠心分離で得たペレットを、蒸留水２０１を含むディマ
ックス（Ｄａｙｍａｘ ）混合機へ移し、懸濁物が均質
になるまで３０分間攪拌した。
ックス（Ｄａｙｍａｘ ）混合機へ移し、懸濁物が均質
になるまで３０分間攪拌した。
この懸濁物をガラス器具で蒸留した冷水３００ｔで希釈
、１０台のＨＦ ２６．５−４５− ＸＭ５０カートリ
ッヂを用いたアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ） 限外濾過器
により約２３℃、定常圧で限外濾過した。内部保留液は
最小量まで濃縮、アミコン容器を洗浄し洗浄液は内部保
留液に加え、その最終容量は８６１であった。限外濾過
液は廃棄した。
、１０台のＨＦ ２６．５−４５− ＸＭ５０カートリ
ッヂを用いたアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ） 限外濾過器
により約２３℃、定常圧で限外濾過した。内部保留液は
最小量まで濃縮、アミコン容器を洗浄し洗浄液は内部保
留液に加え、その最終容量は８６１であった。限外濾過
液は廃棄した。
セタブロン沈殿
セタブロン（Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−１−ヘキサデカ
ンアミニウムプロミド） １．８４Ｋｆを蒸留水６ｔに
溶解、この溶液を前工程で得た内部保留液（ｒｅｔｅｎ
ｔａｔｅ ） ８６ Ｌに攪拌しながら約１時間かけ
て添加した。４時間経過後、沈殿後た不純物（１，９２
５１１ｗ） をに３超遠心機（２８，００Ｏｒｐｍ
） 、５℃で８時間遠心分離することにより集め、上澄
液を集めた。
ンアミニウムプロミド） １．８４Ｋｆを蒸留水６ｔに
溶解、この溶液を前工程で得た内部保留液（ｒｅｔｅｎ
ｔａｔｅ ） ８６ Ｌに攪拌しながら約１時間かけ
て添加した。４時間経過後、沈殿後た不純物（１，９２
５１１ｗ） をに３超遠心機（２８，００Ｏｒｐｍ
） 、５℃で８時間遠心分離することにより集め、上澄
液を集めた。
インプロパツール分画
酢酸ナトリウム三水和物２８．５５に４を上記の上澄液
８６ｔに攪拌しながら１０分かけて添加し、溶液のｐｎ
は氷酢酸を添加することによす６．６とした。この溶液
にイソプロパツール４５．１ｔを攪拌しながら０．３８
ｔ／分 の割合で添加し２８％イソプロパツールとし、
さらに４時間攪拌した後、Ｋ３超遠心機（２８，００Ｏ
ｒｐｍ ）に移し、ここで得る沈＃１２ｆを集め廃棄し
た。イソプロパツール３８．９Ｌを攪拌しながら上澄液
１１６ｔＫ ０．３１１分の割合で加え（最終濃度４２
％）、さらに４時間攪拌後、溶液を２台の４インチシャ
ープレス遠心機に１５から２９℃、１５．００Ｏｒｐｍ
（各々流速１．３ｔ／分）で循環させ、流出液は廃
棄した。
８６ｔに攪拌しながら１０分かけて添加し、溶液のｐｎ
は氷酢酸を添加することによす６．６とした。この溶液
にイソプロパツール４５．１ｔを攪拌しながら０．３８
ｔ／分 の割合で添加し２８％イソプロパツールとし、
さらに４時間攪拌した後、Ｋ３超遠心機（２８，００Ｏ
ｒｐｍ ）に移し、ここで得る沈＃１２ｆを集め廃棄し
た。イソプロパツール３８．９Ｌを攪拌しながら上澄液
１１６ｔＫ ０．３１１分の割合で加え（最終濃度４２
％）、さらに４時間攪拌後、溶液を２台の４インチシャ
ープレス遠心機に１５から２９℃、１５．００Ｏｒｐｍ
（各々流速１．３ｔ／分）で循環させ、流出液は廃
棄した。
磨砕及び最終生成物の取得
得られたペレット状多糖は無水エタノール３ｔを加え３
０秒攪拌−３０秒停止による方法を用いた１ガロンワー
リング（Ｗａｒｉｎｇ ）ブレンダーによりペレットが
無色堅牢な粉末になるまで磨砕した。この粉末をテフロ
ン濾過板を備えたブフナーロートで集め、そのままで無
水エタノール１ｔで４回、アセトン２ｔで２回洗浄した
。生成物をロートから取出し時計器に移し２０乃至２５
℃で真空乾燥した（約１８時間）。生成物の最終収量は
乾燥重量で３１５．２９であった。またその性質は以下
に示す通りである： 表１−１ 肺炎球菌１４型多糖の化学分析結果 分析項目 結果水分（ＴＧ）
６．３％タタン
４．８％核酸
０．６％へキソサミン ２８．６％窒
素 １．６％リン
０．２％分子サイズ
０．１９−０．２１（セファロース４Ｂにお
けるＫＤ） 以下の方法を上記分析結果を求めるために使用した。
０秒攪拌−３０秒停止による方法を用いた１ガロンワー
リング（Ｗａｒｉｎｇ ）ブレンダーによりペレットが
無色堅牢な粉末になるまで磨砕した。この粉末をテフロ
ン濾過板を備えたブフナーロートで集め、そのままで無
水エタノール１ｔで４回、アセトン２ｔで２回洗浄した
。生成物をロートから取出し時計器に移し２０乃至２５
℃で真空乾燥した（約１８時間）。生成物の最終収量は
乾燥重量で３１５．２９であった。またその性質は以下
に示す通りである： 表１−１ 肺炎球菌１４型多糖の化学分析結果 分析項目 結果水分（ＴＧ）
６．３％タタン
４．８％核酸
０．６％へキソサミン ２８．６％窒
素 １．６％リン
０．２％分子サイズ
０．１９−０．２１（セファロース４Ｂにお
けるＫＤ） 以下の方法を上記分析結果を求めるために使用した。
１、 水分−パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ ）社製熱天秤ＴＳＧ−１を用いた標準的な熱重量
測定（１００℃まで損失重量） ２、 タン白−ローリー法；ローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）
ら、ジエー・バイオ口・ケミ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
ｅｒ ）社製熱天秤ＴＳＧ−１を用いた標準的な熱重量
測定（１００℃まで損失重量） ２、 タン白−ローリー法；ローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）
ら、ジエー・バイオ口・ケミ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
（’ｈｅｍ、 ）、第１９３巻、２６５頁（１９５１年
）。
）。
３、核酸−紫外吸収法；ワールブルグ（Ｗａｒｂｕｒｇ
）とクリスチャン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ） 、バイオ
ヘミ−・ゼット（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｚ、 ） 、第３
１０巻、３８４頁（１９４２年）。
）とクリスチャン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ） 、バイオ
ヘミ−・ゼット（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｚ、 ） 、第３
１０巻、３８４頁（１９４２年）。
４、 ヘキンサミンーエルソン（Ｅｌｓｏｎ ） とモ
ルガン（Ｍｏｒｇａｎ ） 、バイオケミ・ジェー（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ） 、第２７巻、１８２４頁（
１９３３年）。
ルガン（Ｍｏｒｇａｎ ） 、バイオケミ・ジェー（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、 ） 、第２７巻、１８２４頁（
１９３３年）。
５、窒素−パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ ）２４０−ＣＨＮ元素分析機を用いた燃焼法。
ｅｒ ）２４０−ＣＨＮ元素分析機を用いた燃焼法。
６、 リン−モリブデン酸法；チェノ（Ｃｈｅｎ ）ら
、アナリティカル・ケミ−（Ａｎａｌ、 Ｃｈｅｍ、）
、第２８巻、１７５６頁（１９５６年）。
、アナリティカル・ケミ−（Ａｎａｌ、 Ｃｈｅｍ、）
、第２８巻、１７５６頁（１９５６年）。
実施例２
Ｎｅｉｇｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ
１１ 血清型２膜タン白の製造 Ａ、培養 １、 ナイセリア髄膜炎菌（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ） ８１１群 ナイセリア髄膜炎菌の凍結乾燥菌体を含む試験管〔エム
パアーテンスタイン（Ｍ、 Ａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ ）
博士、Ｗａｉｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆＲｅｓｅａｒｃｈ （ＷＲＡＩＲ） 、
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，より入手〕を開封し
ユーゴンブロース（八ｇｏｎｂｒｏｔｈ ）（ＢＢＬ）
を添加した。菌体をチョコレート寒天プレート（ＢＢＬ
） に画線し、５％ＣＯ，下３７℃で３６時間培養、
その後菌体を１０％スキムミルク培地〔ディフコ（Ｄｉ
ｆｃｏ ） ）に収穫し、一定量に分注、−７０℃で凍
結した。微生物はウライル（ＷＲＡＩＲ） より提供
される特異抗血清及びディフコ（Ｄｉｒｃｏ ）社よシ
提供される型別血清による凝集で明確に同定された。
１１ 血清型２膜タン白の製造 Ａ、培養 １、 ナイセリア髄膜炎菌（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ） ８１１群 ナイセリア髄膜炎菌の凍結乾燥菌体を含む試験管〔エム
パアーテンスタイン（Ｍ、 Ａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ ）
博士、Ｗａｉｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆＲｅｓｅａｒｃｈ （ＷＲＡＩＲ） 、
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｄ、Ｃ，より入手〕を開封し
ユーゴンブロース（八ｇｏｎｂｒｏｔｈ ）（ＢＢＬ）
を添加した。菌体をチョコレート寒天プレート（ＢＢＬ
） に画線し、５％ＣＯ，下３７℃で３６時間培養、
その後菌体を１０％スキムミルク培地〔ディフコ（Ｄｉ
ｆｃｏ ） ）に収穫し、一定量に分注、−７０℃で凍
結した。微生物はウライル（ＷＲＡＩＲ） より提供
される特異抗血清及びディフコ（Ｄｉｒｃｏ ）社よシ
提供される型別血清による凝集で明確に同定された。
この初代培養菌体をチョコレート寒天プレートに画線し
、５％ｃｏ２下３７℃で１８時間培養、その後菌体を１
０％スキムミルク培地に収穫し、１−ずつに分注、−７
０℃で凍結した。微生物は再びＷＲＡＩＲより提供され
る特異抗血清及びディフコにより提供される型別血清に
よる凝集で明確に同定された。
、５％ｃｏ２下３７℃で１８時間培養、その後菌体を１
０％スキムミルク培地に収穫し、１−ずつに分注、−７
０℃で凍結した。微生物は再びＷＲＡＩＲより提供され
る特異抗血清及びディフコにより提供される型別血清に
よる凝集で明確に同定された。
第２代培養菌体のバイアルを融解し、１０枚のコロンビ
アシープ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ５ｈｅｅｐ ）血液寒天
プレート（ＣＢＡＢ−ＢＢＬ ）に画線した。
アシープ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ５ｈｅｅｐ ）血液寒天
プレート（ＣＢＡＢ−ＢＢＬ ）に画線した。
このプレートは５％ＣＯ１下３７℃で１８時間培養、そ
の後菌体を１０％スキムミルク培地１００−に収穫し、
０．５−ずつに分注、−７０℃で凍結した。微生物は特
異抗血清による凝集、糖の資化性、グラム染色から明確
に同定された。
の後菌体を１０％スキムミルク培地１００−に収穫し、
０．５−ずつに分注、−７０℃で凍結した。微生物は特
異抗血清による凝集、糖の資化性、グラム染色から明確
に同定された。
この代の培養菌体のバイアルを融解し、ミュラー−ヒン
トン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ） ブロース
で希釈、４０枚のミュラー ヒントン寒天培地に画線し
た。このプレートは６％ＣＯ２下３７℃で１８時間培養
、その後菌体を１０％スキムミルク培地１７−に収穫し
、０．３−ずつに分注、−７０℃で凍結した。微生物は
グラム染色、特異的抗血清による凝集、オキシダーゼの
試験により明確に同定された。
トン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ） ブロース
で希釈、４０枚のミュラー ヒントン寒天培地に画線し
た。このプレートは６％ＣＯ２下３７℃で１８時間培養
、その後菌体を１０％スキムミルク培地１７−に収穫し
、０．３−ずつに分注、−７０℃で凍結した。微生物は
グラム染色、特異的抗血清による凝集、オキシダーゼの
試験により明確に同定された。
２、 培養及びペレット状細胞の取得
ａ、°接種の展開接種は上記ナイセリア髄膜炎菌Ｂ群、
Ｂ−１１菌（第４代）の凍結バイアル０．５ ＷｔＺ本
から行った。４本のミューラーーヒントン（Ｍｕｅｌｌ
ｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ）寒天培地を入れたブレーク（Ｂ
ｌａ’ｋｅ ）瓶に接種し、約１８時間収穫、ゴシュリ
ヒ（Ｇｏｓｃｈｌｉｃｈ ） 酵母透析物培地ｐＨ７
，２９５ｔへ接種した。Ｏ，Ｄ、 ［パーキンエルマ
ー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ）社製〕は６６０ｎｍ
で０．０６５と調節した。菌は５本の２６三角フラスコ
（培地１を含；下記参照）で３７℃、振盪培養とした。
Ｂ−１１菌（第４代）の凍結バイアル０．５ ＷｔＺ本
から行った。４本のミューラーーヒントン（Ｍｕｅｌｌ
ｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ）寒天培地を入れたブレーク（Ｂ
ｌａ’ｋｅ ）瓶に接種し、約１８時間収穫、ゴシュリ
ヒ（Ｇｏｓｃｈｌｉｃｈ ） 酵母透析物培地ｐＨ７
，２９５ｔへ接種した。Ｏ，Ｄ、 ［パーキンエルマ
ー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ）社製〕は６６０ｎｍ
で０．０６５と調節した。菌は５本の２６三角フラスコ
（培地１を含；下記参照）で３７℃、振盪培養とした。
０．Ｄ、は４５−１７５−１１２〇−分の時間で検査し
た。
た。
培養液約４ｔはＯ−ｎａａｏが０．８１（：スペクトロ
ニツク（５ｐｅｃｔｒｏｎｉｅ ） ２０により〕とな
った。
ニツク（５ｐｅｃｔｒｏｎｉｅ ） ２０により〕とな
った。
試料３−はグラム染色、ＣＢＡＢ、ミューラーーヒント
ン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ）、酵母エキス−
グルコースプレート上での生育、凝集について試験を行
った。すべての結果は満足を与えるものであった。
ン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ）、酵母エキス−
グルコースプレート上での生育、凝集について試験を行
った。すべての結果は満足を与えるものであった。
ｂ、’ｒｏｔ種菌培養槽
培養種菌約３６００−を完全生産培地
（下記参照）４２．６ｔを含む滅菌７０を培養槽に接種
した。
した。
７０を培養槽の設定は、３７℃、通気
１０ｔ／分、１８５ｒｐｍで、一定のｐＨ７，０に制御
しながら５．５時間行った。
しながら５．５時間行った。
培養液はミューラーーヒントン（Ｍｘｅｌｌｅｒ−Ｈｉ
ｎｔｏｎ ）寒天プレート、酵母エキス−グルコース、
ウサギ血液寒天プレート 〔メルク（Ｍｅｒｃｌ（）製〕に植菌、３７℃で培養及
びナイセリア髄膜炎菌Ｂ群抗血清と凝集の検査を行った
。ミューラ一 ヒントン寒天プレート、酵母エキス−グルコースプレー
ト、ウサギ血液寒天プレートの生育は正常で凝集反応は
陽性であった。この培養に関し、５．５時間後の最終０
． Ｄａａｏは０．８４０であった。
ｎｔｏｎ ）寒天プレート、酵母エキス−グルコース、
ウサギ血液寒天プレート 〔メルク（Ｍｅｒｃｌ（）製〕に植菌、３７℃で培養及
びナイセリア髄膜炎菌Ｂ群抗血清と凝集の検査を行った
。ミューラ一 ヒントン寒天プレート、酵母エキス−グルコースプレー
ト、ウサギ血液寒天プレートの生育は正常で凝集反応は
陽性であった。この培養に関し、５．５時間後の最終０
． Ｄａａｏは０．８４０であった。
ｅ、 ８００を生産培養槽
培養種菌約４６．２１を完全生産培地（下記参照）５６
８．２ｔを含む滅菌８００を培養槽へ接種した。培養は
３７℃、６０ｔ／分の通気、１１００ｒｐ及びｐｉ ７
．０での一定ｐＨへの制御によシ行った。
８．２ｔを含む滅菌８００を培養槽へ接種した。培養は
３７℃、６０ｔ／分の通気、１１００ｒｐ及びｐｉ ７
．０での一定ｐＨへの制御によシ行った。
培養液を不活性化する前に、培養液をミューラーーヒン
トン寒天プレート、酵母エキス−グルコースプレート、
ウサギ血液寒天プレートに接種、３７℃で培養及びナイ
セリア髄膜炎菌の抗血清と凝集の検査を行った。ミュー
ラーーヒントン寒天プレート、酵母エキス−グルコース
プレート、ウサギ血液寒天プレート上での生育は正常で
凝集反応は陽性であつた。この培養に関し、接種１３時
間後の最終０、Ｄ、は２．２４であった。
トン寒天プレート、酵母エキス−グルコースプレート、
ウサギ血液寒天プレートに接種、３７℃で培養及びナイ
セリア髄膜炎菌の抗血清と凝集の検査を行った。ミュー
ラーーヒントン寒天プレート、酵母エキス−グルコース
プレート、ウサギ血液寒天プレート上での生育は正常で
凝集反応は陽性であつた。この培養に関し、接種１３時
間後の最終０、Ｄ、は２．２４であった。
３、比濁計用フラスコ及び７０−と５ｏｏ−を培養槽の
完全培地 Ａ画分 Ｌ−グルタミン酸 １．５ ９／ｌＮ
ａα ６．０ ？／ｌ
Ｎａ ２ＨＰ ０４無水物 ２．５
９／１ＮＩ（４α １．２
５ ｆ／ｌＫα ０．０
９ ｔ／ｌＬ−システィン Ｈα塩 ０．０
２ｔｌｔＢ画分〔ゴシュリヒ（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ
）酵母透析物〕 ディフコ社製酵母エキス１２８０ ｆを蒸留水６．４ｔ
に溶解した。この溶液を３個ＨＩＯ８Ｍカートリッヂ使
用アミコン（Ａｍ１ｅＯｎ ） 社製ＤＣ−３０ホーロ
ーファイバー透析器２台により透析した。透析物及びＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０３８４９、グルコース３２００ ｆ
を透析物で溶解し、総量を蒸留水で１５ｔにした。ｐＨ
はＮａＯＨにより７．４に調節し、ミリポア（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ ） （０，２２μ）を用いた濾過滅菌後、
Ａ画分を含む培養槽に加えた。
完全培地 Ａ画分 Ｌ−グルタミン酸 １．５ ９／ｌＮ
ａα ６．０ ？／ｌ
Ｎａ ２ＨＰ ０４無水物 ２．５
９／１ＮＩ（４α １．２
５ ｆ／ｌＫα ０．０
９ ｔ／ｌＬ−システィン Ｈα塩 ０．０
２ｔｌｔＢ画分〔ゴシュリヒ（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ
）酵母透析物〕 ディフコ社製酵母エキス１２８０ ｆを蒸留水６．４ｔ
に溶解した。この溶液を３個ＨＩＯ８Ｍカートリッヂ使
用アミコン（Ａｍ１ｅＯｎ ） 社製ＤＣ−３０ホーロ
ーファイバー透析器２台により透析した。透析物及びＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０３８４９、グルコース３２００ ｆ
を透析物で溶解し、総量を蒸留水で１５ｔにした。ｐＨ
はＮａＯＨにより７．４に調節し、ミリポア（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ ） （０，２２μ）を用いた濾過滅菌後、
Ａ画分を含む培養槽に加えた。
比濁計フラスコｍ：Ａ画分１を及び８画分２５−を添加
し、ｐＨをＮａＯＨにより７．０−７．２に調節した。
し、ｐＨをＮａＯＨにより７．０−７．２に調節した。
７０１培養槽用：Ａ画分４１．８を及び８画分９００−
を添加し、ｐＨをＮａＯＨによ！７７．０−７．２に調
節した。
を添加し、ｐＨをＮａＯＨによ！７７．０−７．２に調
節した。
５ｏｏｚ培養槽用：Ａ画分５５３を及び８画分１５、Ｏ
４を添加し、ｐＨをＮａＯＨにより７．０−７．２に調
節した。
４を添加し、ｐＨをＮａＯＨにより７．０−７．２に調
節した。
ｄ、収穫及び不活性化
培養終了後、フェノール（０，５％ｖ／ｖ最終濃度）を
別容器に入れ、これに培養物を入れる。この物質は室温
で菌が生存しなくなるまで穏やかに攪拌する（約２４時
間）。
別容器に入れ、これに培養物を入れる。この物質は室温
で菌が生存しなくなるまで穏やかに攪拌する（約２４時
間）。
ｅ、遠心分離
４℃で２４時間放置後、不活性化培養
液６１４．４ｔをシャープレス遠心機により遠心分離し
た。フェノール添加後のペレット状菌体は３．８７５１
にであった。
た。フェノール添加後のペレット状菌体は３．８７５１
にであった。
Ｂ、単離精製
工程１．細菌菌体の洗浄
単離精製のため、上記０．５％フェノールによる不活性
化ペレット２００２を滅菌蒸留水８００−に懸濁、マグ
ネチツクスターラーで攪拌し粒状懸濁物とした。懸濁し
た菌体を５℃、２０．０００Ｘｆで６０分遠心処理〔ベ
ックマン（ＢｅｃｋｒｒＩａｎ ） 社製 １９ Ｔ
Ｌ ローター、１４．５０ Ｏｒｐｍ ］することに
よりペレットにした。
化ペレット２００２を滅菌蒸留水８００−に懸濁、マグ
ネチツクスターラーで攪拌し粒状懸濁物とした。懸濁し
た菌体を５℃、２０．０００Ｘｆで６０分遠心処理〔ベ
ックマン（ＢｅｃｋｒｒＩａｎ ） 社製 １９ Ｔ
Ｌ ローター、１４．５０ Ｏｒｐｍ ］することに
よりペレットにした。
工程２．抽出
洗浄菌体を、ンルバール（５ｏｒｖａｌ ）社製２ ｑ
ｕａｒｔ ｏｍｎｉｍｔｘｅｒ で３の指示にて６０
秒の条件を用い、０．５％デオキシコール酸ナトリウム
含有０．１ Ｍ トリス−０，０１ＭＥＤＴＡ 緩衝
液（ＴＥＤ緩衝液） ２０００−に懸濁した。均質な懸
濁物を５００ｄ三角フラスコ１６本に分注し、振盪湯剪
機５６℃で１５分間抽出を行った（ ａｔ ｔｅｍｐｅ
ｒａｔｕｒｅ ） 。
ｕａｒｔ ｏｍｎｉｍｔｘｅｒ で３の指示にて６０
秒の条件を用い、０．５％デオキシコール酸ナトリウム
含有０．１ Ｍ トリス−０，０１ＭＥＤＴＡ 緩衝
液（ＴＥＤ緩衝液） ２０００−に懸濁した。均質な懸
濁物を５００ｄ三角フラスコ１６本に分注し、振盪湯剪
機５６℃で１５分間抽出を行った（ ａｔ ｔｅｍｐｅ
ｒａｔｕｒｅ ） 。
抽出物は５℃、２０，０００ｘｆ （ベックマン社製１
９７’ｊローター、１４．５０Ｏｒｐｍ ）で６０分間
遠心した。粘液性上澄液を傾斜法により得（総量１９８
０ ｍ ）、４℃で保存した。
９７’ｊローター、１４．５０Ｏｒｐｍ ）で６０分間
遠心した。粘液性上澄液を傾斜法により得（総量１９８
０ ｍ ）、４℃で保存した。
抽出したペレット状菌体は上記ＴＥＤ緩衝液２０００
、ｄに再懸濁した。懸濁物は前記のように５６℃で１５
分間抽出、を行った後遠心処理をした。上澄液を傾斜法
により得（総量２１００ ｍｊ ）、４℃で保存した。
、ｄに再懸濁した。懸濁物は前記のように５６℃で１５
分間抽出、を行った後遠心処理をした。上澄液を傾斜法
により得（総量２１００ ｍｊ ）、４℃で保存した。
工程３．限外ν過による濃縮
工程２で得た抽出上澄液をひとまとめにした（総量４０
０５．／）。この上澄液の２ｔを、２枚の０，４５μデ
ユラポア膜（表面積１／２平方１１ ） を装着した
ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ） 社製ペリコン（
Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ ） （ｐ過器材ニューブランズウィ
ック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ）社製２を培養器
へ入れた。抽出上澄液を培養器中２５℃で９０分間の濃
縮操作に付した。試料を平均膜圧２７．５ｐｓｉにより
１０倍に濃縮した。
０５．／）。この上澄液の２ｔを、２枚の０，４５μデ
ユラポア膜（表面積１／２平方１１ ） を装着した
ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ） 社製ペリコン（
Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ ） （ｐ過器材ニューブランズウィ
ック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ）社製２を培養器
へ入れた。抽出上澄液を培養器中２５℃で９０分間の濃
縮操作に付した。試料を平均膜圧２７．５ｐｓｉにより
１０倍に濃縮した。
工程４．血清型タン白の収集と洗浄
工程３における内部保留液（２０５ｍ ）を５℃、１６
０，０ＯＯｘｆ （ベックマン社製４５ Ｔｉロータ
ー、３７．００Ｏｒｐｍ ）で２時間遠心処理を行い血
清型タン白をペレット化した。上澄液は傾斜法により除
き廃棄した。
０，０ＯＯｘｆ （ベックマン社製４５ Ｔｉロータ
ー、３７．００Ｏｒｐｍ ）で２時間遠心処理を行い血
清型タン白をペレット化した。上澄液は傾斜法により除
き廃棄した。
ペレット化したタン白を秤量（８，１２Ｍ、次にガラス
棒とダンス（Ｄｏｕｎｃｅ ）ホモゲナイザーを手動操
作しＴＥＤ緩衝液（緩衝液１９０ｍ１：２０ｄｌ？ペレ
ツト）に懸濁した。懸濁物は５００コ三角フラスコ中５
６℃で振盪しながら１５分間抽出を行った（ ａｔ ｔ
ｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ）。
棒とダンス（Ｄｏｕｎｃｅ ）ホモゲナイザーを手動操
作しＴＥＤ緩衝液（緩衝液１９０ｍ１：２０ｄｌ？ペレ
ツト）に懸濁した。懸濁物は５００コ三角フラスコ中５
６℃で振盪しながら１５分間抽出を行った（ ａｔ ｔ
ｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ）。
懸濁物は５℃、１６．０，０ＯＯｘｆ （ベックマン
社製４５７’ｊローター、３７．００Ｏｒｐｍ ）で２
時間遠心分離に付した。上澄液は傾斜法により除き廃棄
した（量は１９０ｍＡ）。ペレットは上記のようにして
ＴＥＤ緩衝液１９０ｄで２回洗浄した。
社製４５７’ｊローター、３７．００Ｏｒｐｍ ）で２
時間遠心分離に付した。上澄液は傾斜法により除き廃棄
した（量は１９０ｍＡ）。ペレットは上記のようにして
ＴＥＤ緩衝液１９０ｄで２回洗浄した。
工程５．生成物の回収
工程４で得た洗浄ペレット化タン白はガラス棒とダンス
ホモゲナイザーを用い蒸留水１００−に懸濁し、完全な
懸濁物とした。この懸濁物に関しローリ−（Ｌｏｗｒｙ
）法によるタン白値は１７．０＋＋ｖ／−であった。
ホモゲナイザーを用い蒸留水１００−に懸濁し、完全な
懸濁物とした。この懸濁物に関しローリ−（Ｌｏｗｒｙ
）法によるタン白値は１７．０＋＋ｖ／−であった。
この時点で懸濁物２０σηを実験用に残した。残された
大部分の懸濁物（９１ｄ）をガラス器具で蒸留した蒸留
水１０２．４ｍ’に、よ、す８．０■／−まで希釈した
。水性懸濁物は凝集物を除くために１２，０００ｘｒ
（ベックマン社製４５ Ｔｉローター、１０．００Ｏｒ
ｐｍ ）で１５分遠心処理した。
大部分の懸濁物（９１ｄ）をガラス器具で蒸留した蒸留
水１０２．４ｍ’に、よ、す８．０■／−まで希釈した
。水性懸濁物は凝集物を除くために１２，０００ｘｒ
（ベックマン社製４５ Ｔｉローター、１０．００Ｏｒ
ｐｍ ）で１５分遠心処理した。
上澄生成物は軟かいペレット状凝集物を避けるためにピ
ペットで注意深く集めた。生成物にラベルを付しく総量
１８２．５．ｄ） ある一定量は無菌性と発熱性物質
の試験を行った（滅菌生成物；発熱性物質は含まれず）
。生成物は結合物製造において使用するまで４℃で滅菌
物質として保存し、使用時に分析によシ性質を明らかに
した。収率は９．５■ローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）法タン
白／を元の菌体ペレットであった。
ペットで注意深く集めた。生成物にラベルを付しく総量
１８２．５．ｄ） ある一定量は無菌性と発熱性物質
の試験を行った（滅菌生成物；発熱性物質は含まれず）
。生成物は結合物製造において使用するまで４℃で滅菌
物質として保存し、使用時に分析によシ性質を明らかに
した。収率は９．５■ローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）法タン
白／を元の菌体ペレットであった。
表２−１
髄膜炎球菌Ｂ血清型２タン白溶液の
化学分析結果
分析 結果
タン白
ローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）法 ４．ｘｍ
ｙ／＋＋ｇ核酸” ＲＮＡ［：バイアル（Ｂｉａｌ） ） １
．８％ＤＮＡ（ジフェニルアミン）０．６％ 中性糖” アンスロン法 １．０５シアル
酸８ ３．０％分子量 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ ４０，０００
ダルトン骨ローリ−法タン白に対し百分率で計算以下の
方法が上記分析を行うために使用したものである： １、 タン白−実施例１に同じ λ 核酸−呈色反応はオルシノール反応［バイアル（Ｂ
ｉａｌ ） ］ で観察しタン白濃度に対し百分率で
計算し１．８％ＲＮＡに対応した。ＤＮＡに対するジフ
ェニルアミン試験は滅菌保存溶液中のタン白に対し百分
率で計算し０．６％のＤＮＡ含量を示した。
ｙ／＋＋ｇ核酸” ＲＮＡ［：バイアル（Ｂｉａｌ） ） １
．８％ＤＮＡ（ジフェニルアミン）０．６％ 中性糖” アンスロン法 １．０５シアル
酸８ ３．０％分子量 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ ４０，０００
ダルトン骨ローリ−法タン白に対し百分率で計算以下の
方法が上記分析を行うために使用したものである： １、 タン白−実施例１に同じ λ 核酸−呈色反応はオルシノール反応［バイアル（Ｂ
ｉａｌ ） ］ で観察しタン白濃度に対し百分率で
計算し１．８％ＲＮＡに対応した。ＤＮＡに対するジフ
ェニルアミン試験は滅菌保存溶液中のタン白に対し百分
率で計算し０．６％のＤＮＡ含量を示した。
３、 中性糖−タン白に対する百分率含量で求めた中性
糖含量はアンスロン比色法〔スコツト（５ｃｏｔｔ ）
とメルビン（Ｍｅｌｖｉｎ ）、アナリテイカル・
ケミストリー（Ａｎａｌ。
糖含量はアンスロン比色法〔スコツト（５ｃｏｔｔ ）
とメルビン（Ｍｅｌｖｉｎ ）、アナリテイカル・
ケミストリー（Ａｎａｌ。
Ｃｈｅｍ 、 ）第２５巻、１６５６頁（１９５３年
）〕を用いて測定した。
）〕を用いて測定した。
４、 シアル酸−シアル酸含量はレゾルシノール−塩酸
法〔スベナーホルム（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ）、バイ
オケミ・バイオフィシ・アクタ（Ｂｉｏｅｈｅｍ。
法〔スベナーホルム（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ）、バイ
オケミ・バイオフィシ・アクタ（Ｂｉｏｅｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ） 、第２４巻、６０４
頁（１９５７年）〕を用いて測定した。
頁（１９５７年）〕を用いて測定した。
５、 分子量−メルカプトエタノール変性タン白の分子
量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動〔ネーチュ
アー（Ｎａｔｕｒｅ ） 第２２７巻：６８０頁（１
９７０年）、ＬＫＢ応用ノート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｎｏｔｅ ） ３０６号〕を用いて決定した。
量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動〔ネーチュ
アー（Ｎａｔｕｒｅ ） 第２２７巻：６８０頁（１
９７０年）、ＬＫＢ応用ノート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ Ｎｏｔｅ ） ３０６号〕を用いて決定した。
実施例３６
肺炎連鎖球菌１４型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型
外膜タン白結合物の結合工程中に遠心分離を使用する製
造。
外膜タン白結合物の結合工程中に遠心分離を使用する製
造。
■、水性ヒドラジしを用いる肺炎球菌１４型多糖の断片
化 １０〇−丸底フラスコにＨ２Ｏ２４ｒｄ、９７％ヒドラ
ジン１．９２１Ｒｔを入れ、温度が１００℃になるまで
沸騰した湯浴中で処理した（約３分）。
化 １０〇−丸底フラスコにＨ２Ｏ２４ｒｄ、９７％ヒドラ
ジン１．９２１Ｒｔを入れ、温度が１００℃になるまで
沸騰した湯浴中で処理した（約３分）。
これに少量ずつ肺炎連鎖球菌１４型多糖（Ｐｎ １４
） ２４０ｗ１ｌを加え、得られた溶液を迅速に７．０
分攪拌した。次にフラスコを水浴中で急冷し、内容物は
スペクトロボール２チユービング（分子量排除限界１２
，０００−１４．０００３罠対しＨ，０３２ｔ、５時間
で透析した。透析は新しいＨ，０３２１で１６時間くり
返した。
） ２４０ｗ１ｌを加え、得られた溶液を迅速に７．０
分攪拌した。次にフラスコを水浴中で急冷し、内容物は
スペクトロボール２チユービング（分子量排除限界１２
，０００−１４．０００３罠対しＨ，０３２ｔ、５時間
で透析した。透析は新しいＨ，０３２１で１６時間くり
返した。
透析物は５０ＴＲｔ遠心管に移し、臨床用遠心機で遠心
分離し泥滓を除いた。上澄液を凍結乾燥すると断片化Ｐ
ｎ１４１６３■ を与えた。
分離し泥滓を除いた。上澄液を凍結乾燥すると断片化Ｐ
ｎ１４１６３■ を与えた。
■、解重合Ｐｎ１４のブタンジアミン誘導体の形成
断片化Ｐｎ １４１５０■ を乾燥した５〇−丸底フラ
スコに入れ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）９−で
覆い、Ｎ２で封じた。混合物を５４℃で５．０分、さら
に、室温で５分攪拌した。断片化Ｐｎ１４のほとんど大
部分がこの時点で溶液となった。カルボニルジイミダゾ
ール３６−をこれに加え、この溶液を４０分攪拌した。
スコに入れ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）９−で
覆い、Ｎ２で封じた。混合物を５４℃で５．０分、さら
に、室温で５分攪拌した。断片化Ｐｎ１４のほとんど大
部分がこの時点で溶液となった。カルボニルジイミダゾ
ール３６−をこれに加え、この溶液を４０分攪拌した。
この間に１，４−ブタンジアミン２塩酸塩溶液（３００
Ｗ／Ｈ，０６ｒｎｔ ： ２．５ Ｎ ＮａＯＨでｐＨ
を９．４５に調節する）を準備し水浴中で冷却した。４
０分攪拌後、ＤＭＳＯ溶液を冷却したブタンジアミン溶
液に加え、室温で４．５時間攪拌した。これをＨ，Ｏの
３ＯＬに対し１７２５時間、さらに新しくＨ２０の４ｔ
に対し４時間透析した。得られた透析物を凍結乾燥する
とｐＨ１４のブタンジアミン誘導体、Ｐ ｎ −Ｂ ｕ
Ａ４１５２■が得られた。ＫＤ＝Ｏ１７０比濁計単位
（基本多糖の１５３％）；フルオレスカミン力価＝１５
０ ＋１モルＮＨ，／Ｉｌｖ。
Ｗ／Ｈ，０６ｒｎｔ ： ２．５ Ｎ ＮａＯＨでｐＨ
を９．４５に調節する）を準備し水浴中で冷却した。４
０分攪拌後、ＤＭＳＯ溶液を冷却したブタンジアミン溶
液に加え、室温で４．５時間攪拌した。これをＨ，Ｏの
３ＯＬに対し１７２５時間、さらに新しくＨ２０の４ｔ
に対し４時間透析した。得られた透析物を凍結乾燥する
とｐＨ１４のブタンジアミン誘導体、Ｐ ｎ −Ｂ ｕ
Ａ４１５２■が得られた。ＫＤ＝Ｏ１７０比濁計単位
（基本多糖の１５３％）；フルオレスカミン力価＝１５
０ ＋１モルＮＨ，／Ｉｌｖ。
７ｆ１． ｐＨ１４の１，４−ブタンジアミン誘導体
（Ｐｎ １４− ＢｕＡ４ ） のブロモアセチル化
Ｐｎ １４− ＢｕＡ、 １４（Ｃ１０をｐ１１９．１
５緩衝液１〇−に溶解、この溶液に、アセトニトリルｌ
＋ｄに溶解したブロモ酢酸ｐ−ニトロフェニルエステル
１４０■を加えた。これをＨ，Ｏの４６に対し６時間、
さらに新しくＨ６０の４ｔに１６時間、３回目としてＨ
，Ｏの４ｔに対し７時間透析した。透析物を凍結乾燥す
るとｐＨ１４−ＢｕＡ、 のブロモアセチル誘導体（
Ｐｎ １４−ＢｕＡ２− ＢｒＡｅ ） １３９− が
得られた。
（Ｐｎ １４− ＢｕＡ４ ） のブロモアセチル化
Ｐｎ １４− ＢｕＡ、 １４（Ｃ１０をｐ１１９．１
５緩衝液１〇−に溶解、この溶液に、アセトニトリルｌ
＋ｄに溶解したブロモ酢酸ｐ−ニトロフェニルエステル
１４０■を加えた。これをＨ，Ｏの４６に対し６時間、
さらに新しくＨ６０の４ｔに１６時間、３回目としてＨ
，Ｏの４ｔに対し７時間透析した。透析物を凍結乾燥す
るとｐＨ１４−ＢｕＡ、 のブロモアセチル誘導体（
Ｐｎ １４−ＢｕＡ２− ＢｒＡｅ ） １３９− が
得られた。
ＫＤ＝ ０．７９比濁計単位：基本多糖の１２０％フル
オレスカミン力価＝６ナノモル／■、差をとることによ
り（Δ＝ １５０−６ ） １４４ナノモルのブロモア
セチル残基／■を示している。
オレスカミン力価＝６ナノモル／■、差をとることによ
り（Δ＝ １５０−６ ） １４４ナノモルのブロモア
セチル残基／■を示している。
’ＰＪ、 ｐＨ１４−ＢｕＡ４− ＢｒＡｃ と官
能基付与したＮ、 ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ タン白
（ＮＭＰ） の結合全遠心操作はポリカーボネート試
験管を用い、特に記載しない場合、ベックマン社製ｎ７
５０−ターにより４℃、４３．ＯＯＯｒｐｍで２時間行
った。
能基付与したＮ、 ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ タン白
（ＮＭＰ） の結合全遠心操作はポリカーボネート試
験管を用い、特に記載しない場合、ベックマン社製ｎ７
５０−ターにより４℃、４３．ＯＯＯｒｐｍで２時間行
った。
官能基を付与していないタン白（１０＋＋ｔ。
５．５Ｗｑ／ｄ）を遠心分離し、ペレットをエチレンジ
アミン四酢酸５９ｑ１ジチオスレイトール１１．２■、
ｐＨ１１，３ホウ酸ナトリウム緩衝液を含むチオール化
混合物７−とダンス＜Ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイザーを
用いて再懸濁した。再懸濁後、混合物を遠心管に移し、
血清用ゴム栓で栓をし、空気をＮ２で置換した。これを
窒素充填箱に入れ、Ｎ−アセチルホモシスティンチオラ
クトン５４■を加えた。栓をし窒素充填箱中に２２時間
放置後、ｐＨをＩ Ｍ ＫＨ，ＰＯ４の添加により８．
０に調節した。得られた混合物を遠心分離しペレットを
Ｏ５ＩＭＰＯ，ｐＨ８，０緩漬液１０−に再懸濁した。
アミン四酢酸５９ｑ１ジチオスレイトール１１．２■、
ｐＨ１１，３ホウ酸ナトリウム緩衝液を含むチオール化
混合物７−とダンス＜Ｄｏｕｎｃｅ）ホモゲナイザーを
用いて再懸濁した。再懸濁後、混合物を遠心管に移し、
血清用ゴム栓で栓をし、空気をＮ２で置換した。これを
窒素充填箱に入れ、Ｎ−アセチルホモシスティンチオラ
クトン５４■を加えた。栓をし窒素充填箱中に２２時間
放置後、ｐＨをＩ Ｍ ＫＨ，ＰＯ４の添加により８．
０に調節した。得られた混合物を遠心分離しペレットを
Ｏ５ＩＭＰＯ，ｐＨ８，０緩漬液１０−に再懸濁した。
これをまた遠心処理し残っている低分子を除いた。２回
目のペレットをｐｉｆ ８．０緩衝液８．５ ｆＲｌに
ダンス（１）ｏｕｎｃｅ ）ホモゲナイザーを用いて再
懸濁した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ ）試験は全量にチ
オールを６．４マイクロモル含んでいることを示した。
目のペレットをｐｉｆ ８．０緩衝液８．５ ｆＲｌに
ダンス（１）ｏｕｎｃｅ ）ホモゲナイザーを用いて再
懸濁した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ ）試験は全量にチ
オールを６．４マイクロモル含んでいることを示した。
再懸濁したチオール化タン白にＰｎ１４− Ｂｕ〜Ｂｒ
Ａｃ５０■を添加し、得られた溶液を窒素充填箱に室温
で１７時間放置した。これをＨ２Ｏ４１に対し６時間透
析した。この溶液の半量（５，ｄ）を遠心管に移し、こ
れにＣｓα４．０９を溶解した。遠心管にＨ，Ｏを口ま
で満７ｔＬ（１０ｍ）、ｎＯ−ター、４℃、４３．００
Ｏｒｐｍで２０時間遠心分離した。得られたＣｓα密
度勾配遠心物を１．３−ずつ、ハーグ ブヒラー（Ｈａ
ａｋｅ Ｂｕｃｈｌｅｒ ）社製自動Ｄｅｎｓｉ ＦＩ
ＯＷ ２Ｃ装置を用いて分画した。９分画を集め、その
中の第５．６．７番目の分画を一緒にして、遠心管に移
し、ＣｓＣｌ３．５９を加えた。混合物は口までＨ，Ｏ
を満たし上記のように２４時間遠心分離した。遠心物は
上記のように分画し、適当な分画を比濁計で検出し、第
３及び４番目を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）４ｔ
に対し１６時間、さらにＨ，０４ｔに対し４時間透析し
た。得られた透析物はＨ，Ｏで１０＋ｄに希釈した。
Ａｃ５０■を添加し、得られた溶液を窒素充填箱に室温
で１７時間放置した。これをＨ２Ｏ４１に対し６時間透
析した。この溶液の半量（５，ｄ）を遠心管に移し、こ
れにＣｓα４．０９を溶解した。遠心管にＨ，Ｏを口ま
で満７ｔＬ（１０ｍ）、ｎＯ−ター、４℃、４３．００
Ｏｒｐｍで２０時間遠心分離した。得られたＣｓα密
度勾配遠心物を１．３−ずつ、ハーグ ブヒラー（Ｈａ
ａｋｅ Ｂｕｃｈｌｅｒ ）社製自動Ｄｅｎｓｉ ＦＩ
ＯＷ ２Ｃ装置を用いて分画した。９分画を集め、その
中の第５．６．７番目の分画を一緒にして、遠心管に移
し、ＣｓＣｌ３．５９を加えた。混合物は口までＨ，Ｏ
を満たし上記のように２４時間遠心分離した。遠心物は
上記のように分画し、適当な分画を比濁計で検出し、第
３及び４番目を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）４ｔ
に対し１６時間、さらにＨ，０４ｔに対し４時間透析し
た。得られた透析物はＨ，Ｏで１０＋ｄに希釈した。
実測値：多糖 ０．２０５■／−タン白
０．５５０η／ゴ ５ｐｉｎｃｏ ： Ｓ−カルボキシメチルホモシスティ
ン ０．０２０ マイクロモルリ
ジン ０．１５６ マイクロモル比
０．１２８ 実施例４６ 肺炎連鎖球菌１４型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型
外膜タン白結合物の結合工程中にカラムを使用する製造
。
０．５５０η／ゴ ５ｐｉｎｃｏ ： Ｓ−カルボキシメチルホモシスティ
ン ０．０２０ マイクロモルリ
ジン ０．１５６ マイクロモル比
０．１２８ 実施例４６ 肺炎連鎖球菌１４型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型
外膜タン白結合物の結合工程中にカラムを使用する製造
。
実施例３の工程ＬＩＥ、■に従って製造した肺炎球菌１
４型多糖のブロモアセチル化１゜４−ブタンジアミン誘
導体を実施例２に従って製造したタン白と実施例３の工
程■の変法で結合した。
４型多糖のブロモアセチル化１゜４−ブタンジアミン誘
導体を実施例２に従って製造したタン白と実施例３の工
程■の変法で結合した。
Ｐｎ １４−ＢｕＡｚ−ＢｒＡｃとナイセリア髄膜炎菌
外膜タン白（ＮＭＰ）の結合。
外膜タン白（ＮＭＰ）の結合。
ＮＭＰ溶液（１２，４ｍ９／ｄ ） １．２−を、飽和
ＮａＢＯｓ （ｐ）１１１．００ ）、エチレンジアミ
ン四酢酸４２■／−、ジチオスレイトール８■／−ヲ含
む緩衝溶液０．４ｗｔと共に遠心管に入れた。
ＮａＢＯｓ （ｐ）１１１．００ ）、エチレンジアミ
ン四酢酸４２■／−、ジチオスレイトール８■／−ヲ含
む緩衝溶液０．４ｗｔと共に遠心管に入れた。
遠心管を血清用ゴム栓で栓をし、脱気後空気を窒素に置
換した。窒素充填箱中でこれにＮ−アセチルホモシステ
ィンチオラクトン１０■を加えた。この溶液を室温で１
７時間放置した。２本のセファデックスＧ２５カラム（
ＰＤ／１０ ）をｐＨ８，０リン酸緩衝ｉ （０，１Ｍ
）で平衡化した。反応混合物にｐ■８緩衝液０．９−
を加え、全量を最初のカラムに付した。これをｐｎ Ｂ
緩衝液３．５−で溶出した。溶出液の２、５ ｍｇを２
回目のＧ−２５カラムに付し、これをｐＨＢの緩衝液３
．５ ｍで溶離した。この溶出液はエルマン（Ｅｌｌｍ
ａｎ ）試験によりチオールを５２５ナノモル（全量）
含んでいた。これにＰｎ １４−ＢｕＡ、 −ＢｒＡｃ
１３ ｒｎｇを加え、Ｎ２下７時間放置した。これを
水４Ｌに対し２回（５時間と１６時間）透析した。小量
の試料はアミノ酸分析用に凍結乾燥した。実測値Ｓ−カ
ルボキシメチルホモシスティン０．００７３ マイク
ロモル；リジン０．１０４マイクロモル、生成物を１０
０．ＯＯＯｘｇ で遠心分離し、ペレットをＨ，０１０
＋ｄに再懸濁後再遠心分離を行った。
換した。窒素充填箱中でこれにＮ−アセチルホモシステ
ィンチオラクトン１０■を加えた。この溶液を室温で１
７時間放置した。２本のセファデックスＧ２５カラム（
ＰＤ／１０ ）をｐＨ８，０リン酸緩衝ｉ （０，１Ｍ
）で平衡化した。反応混合物にｐ■８緩衝液０．９−
を加え、全量を最初のカラムに付した。これをｐｎ Ｂ
緩衝液３．５−で溶出した。溶出液の２、５ ｍｇを２
回目のＧ−２５カラムに付し、これをｐＨＢの緩衝液３
．５ ｍで溶離した。この溶出液はエルマン（Ｅｌｌｍ
ａｎ ）試験によりチオールを５２５ナノモル（全量）
含んでいた。これにＰｎ １４−ＢｕＡ、 −ＢｒＡｃ
１３ ｒｎｇを加え、Ｎ２下７時間放置した。これを
水４Ｌに対し２回（５時間と１６時間）透析した。小量
の試料はアミノ酸分析用に凍結乾燥した。実測値Ｓ−カ
ルボキシメチルホモシスティン０．００７３ マイク
ロモル；リジン０．１０４マイクロモル、生成物を１０
０．ＯＯＯｘｇ で遠心分離し、ペレットをＨ，０１０
＋ｄに再懸濁後再遠心分離を行った。
１０ｄＫ再懸濁するとＰｎ １４−ＢｕＡ２− ＢｒＡ
ｃ ＮＭＰ結合結合液溶液られた。
ｃ ＮＭＰ結合結合液溶液られた。
多糖：タン白＝０．２５
Ｓ−カルボキシホモシスティン：リジン＝０．０７
実施例５゜
肺炎連鎖球菌１４型多糖−ナイセリア髄膜炎菌Ｂ血清型
外膜タン白結合物のマウスによる抗体反応試験 実施例４に従って製造した肺炎連鎖球菌１４型多糖−ナ
イセリア髄膜炎菌Ｂ血清型外膜タン白結合物をマウスを
用いて免疫原性反応を試験し、結果を下記の表に示した
。
外膜タン白結合物のマウスによる抗体反応試験 実施例４に従って製造した肺炎連鎖球菌１４型多糖−ナ
イセリア髄膜炎菌Ｂ血清型外膜タン白結合物をマウスを
用いて免疫原性反応を試験し、結果を下記の表に示した
。
マウスの血清抗体反応
結合物 ０．１ 幼令Ｉ ＣＲ／Ｈａマウス
１８０４６（生後７日） ２２２５６
結合物 ０．１ ” Ｉ ＣＲ／Ｈａマウス
１９０２４＃ ０．５’
７４６６４結合物 ０．５” ＣＢＡ
／乍マウス ７０６６対照の ０．５
幼令Ｉ ＣＲ／Ｈａマウス ４９多糖 採血３４−３５日ｌ０ ■結果は２種のひと腹のマウスを用いた血清によシ示し
た。
１８０４６（生後７日） ２２２５６
結合物 ０．１ ” Ｉ ＣＲ／Ｈａマウス
１９０２４＃ ０．５’
７４６６４結合物 ０．５” ＣＢＡ
／乍マウス ７０６６対照の ０．５
幼令Ｉ ＣＲ／Ｈａマウス ４９多糖 採血３４−３５日ｌ０ ■結果は２種のひと腹のマウスを用いた血清によシ示し
た。
手続補正書
昭和６１年３月１１日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白とがチオエー
テル結合を含む二属のスペーサ ー〔該二属のスペーサーは式Ａ−Ｅ−Ｓ− Ｂで示すことができ、｛式中、Ｅは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
式、表等があります▼（式中、Ｒは ＨまたはＣＨ＿３である）であり；Ａは−ＣＮ（ＣＨ＿
２）＿ｎＹ（ＣＨ＿２）＿ｎＮＨ−（（式中、ｍは０乃
至４；ｎは０乃至３であり；Ｗは０またはＮＨ；Ｙは ＣＨ＿２、Ｏ、Ｓ、ＮＲ′またはＣＨＣＯ＿２Ｈ（Ｒ′
はＨ、Ｃ＿１−またはＣ＿２−アルキルである）である
が、もしＹがＣＨ＿２の場合ｍとｎとの両者は同時に零
とならず、またＹが０または Ｓの場合ｍは１を超えｎも１を超える。））であり；Ｂ
は▲数式、化学式、表等があります▼（（式中、 ｐは１−３、ｑは０−２であり、ＺはＮＨ＿２、▲数式
、化学式、表等があります▼、ＣＯ＿２ＨまたはＨであ
り、Ｄは▲数式、化学式、表等があります▼、ＮＲ′、
▲数式、化学式、表等があります▼であり（但しＲ′は
上 記の定義に従う）））である｝〕を介して結合されてい
る安定な共有結合で結合した多 糖−タン白結合物。 ２、二属のスペーサーが式： ▲数式、化学式、表等があります▼で 示すことができる特許請求の範囲第１項に 記載した安定な共有結合で結合した多糖− タン白結合物。 ３、細菌由来中性夾膜多糖が肺炎連鎖球菌の７Ｆ、１４
、３７型多糖から成る群から選 択される特許請求の範囲第１項記載の多糖 −タン白結合物。 ４、免疫原性タン白が髄膜炎球菌Ｂ血清型外膜タン白ま
たはエデスチンタン白である特 許請求の範囲第１項記載の多糖−タン白結 合物。 ５、細菌由来中性夾膜多糖が肺炎連鎖球菌 １４型多糖、免疫原性タン白が髄膜炎球菌 Ｂ血清型外膜タン白、二属のスペーサーが 式： ▲数式、化学式、表等があります▼で 示すことができる特許請求の範囲第１項記 載の多糖−タン白結合物。 ６、非ポリアニオン性多糖類を蒸留水中で加熱し、残留
水を除去し、非水性極性非プロ トン性溶媒に該多糖を溶解させることを含 んでなる該多糖類の可溶化法。 ７、５−１５％水性ヒドラジンを蒸留水に加える特許請
求の範囲第６項記載の製法。 ８、多糖類を７０℃−１００℃の温度で３０秒から１０
分加熱し、凍結乾燥及びＰ＿２Ｏ＿５を用いた真空乾燥
により水を除去し、また非水性 極性非プロトン性溶媒がジメチルホルムア ミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルア セトアミド、ホルムアミド、またはＮ、Ｎ′−ジメチル
イミダゾリジノンである特許請 求の範囲第６項記載の製法。 ９、（ａ）多糖を断片化し、その断片化した多糖を非水
性極性非プロトン性溶媒で可溶化 （ｂ）該多糖を二官能性試薬で活性化、 （ｃ）この活性化多糖を二端求核剤と反応させる、 ことを含んで成る中性多糖の共有結合的修 飾法。 １０、二端求核剤と反応させた活性多糖を突出した親電
子部位を形成する薬剤と反応させる、ことを含んで成る
特許請求の範囲第９項記 載の方法。 １１、多糖を蒸留水中で加熱し、次に凍結乾燥で水を除
去しＰ＿２Ｏ＿５を用いた真空乾燥を行うによって該多
糖を断片化；非水性極性非プ ロトン性溶媒がジメチルホルムアミド、ジ メチルスルホキシド、ジメチルアセトアミ ド、ホルムアミド、またはＮ、Ｎ′−ジメチルイミダゾ
リジノンであり：二官能性試薬 が炭酸誘導体、▲数式、化学式、表等があります▼（式
中、Ｒ２とＲ３ とは別々にアゾリル、ハロゲン化物、フェ ニルエステルである）から成る群から選択 され；そして二端求核剤が式、Ｈ＿２Ｎ（ＣＨ＿２）ｍ
Ｙ（ＣＨ＿２）＿ｎＮＨ＿２のジアミン〔式中、ｍは０
乃至４；ｎは１乃至３であり；ＹはＣＨ＿２、Ｏ、Ｓ、
ＮＲ′、ＣＨＣＯＯＨ（Ｒ′はＨ、Ｃ＿１−またはＣ２
−アルキルである）であるが、もしＹがＣＨ＿２の場合
、ｍとｎとが同時に零とはならず、またＹが０またはＳ
の場合、ｍは １を超えｎも１を超える〕である特許請求 の範囲第９項記載の製法。 １２、非水性極性非プロトン性溶媒がジメチルホルムア
ミドであり、二官能性試薬がカル ボニルジイミダゾールであり、そして二端 求核剤が１，４−ブタンジアミンである特許請求の範囲
第１１項記載の製法。 １３、親電子部位を形成する試薬がＸ′▲数式、化学式
、表等があります▼（式中、Ｘ′はニトロフェノキシ、
ジニトロフェノキシ、ペンタクロロフェノキシ、ペ ンタフルオロフェノキシ、ハロゲン化物、 Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル）、またはアジ
ドであり、ＲはＨまたはＣＨ３であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｉ
である）または活 性マレイミド酸、 ▲数式、化学式、表等があります▼（式中、ｐは１乃至
３で あり、Ｘ′は上記の定義に従う）である特許請求の範囲
第１０項記載の製法。 １４、親電子部位を形成する試薬がブロモ酢酸ｐ−ニト
ロフェニルエステルである特許請 求の範囲第１３項記載の製法。 １５、細菌由来中性夾膜多糖と免疫原性タン白とがチオ
エーテル結合を含む二属のスペー サーを介して結合している多糖−タン白結 合物の製造方法が、 （ａ）多糖を断片化し、その解重合多糖を非水性極性非
プロトン性溶媒に溶解、 （ｂ）該多糖を二官能性試薬で活性化、 （ｃ）この活性化多糖を二端求核剤と反応させ、 （ｄ）この二端求核剤と反応した活性化多糖を、親電子
部位を形成する試薬と反応さ せ、突出した親電子部位を有する多糖を 形成させ、 （ｅ）免疫原性タン白を、チオール基を形成する試薬と
独立的に反応させ、突出した チオール基を有するタン白を形成させ、 （ｆ）突出した親電子部位を有する多糖を突出したチオ
ール基を有するタン白と反応 させ、チオエーテル共有結合を介して結 合した多糖−タン白結合物を形成させ、 そして （ｇ）得られた混合物を遠心して、共有結合を形成しな
かった多糖及びタン白を除去 する、 ことを含んでいる多糖−タン白結合物の製 法。 １６、同族の生物により惹起される菌血症から哺乳類を
能動的または受動的に保護するた めに免疫学的に有効な量の、特許請求の範 囲第１項記載の、安定で共有結合を介して 結合した多糖−タン白結合物、その結合物 から誘導される抗血清またはその抗血清の ガンマグロブリンまたは他の抗体含有画分、及び薬学的
に許容される担体を含んでいる 組成物。 １７、さらにアジュバンドを含んでいる特許請求の範囲
第１６項記載の組成物。 １８、多糖−タン白結合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼の 二属のスペーサーを介して髄膜炎球菌Ｂ血 清型外膜タン白に結合した肺炎球菌１４型 多糖を含み、免疫学的に有効な量が各結合 物が結合物の形態で多糖を２−５０μｇ含 む組成物中における各結合物の量であり、 哺乳類が人間である、特許請求の範囲第 １６項記載の組成物。 １９、チオエーテル結合を含む二属のスペーサーを介し
て免疫原性タン白と結合した細菌 由来中性夾膜多糖類と、薬学的に許容され る担体、アジュバント、及び薬学的に許容 される担体とアジュバントから成る群の１ つとから成る、１種またはそれ以上の多糖 −タン白結合物を含む組成物の免疫学的に 有効な量を哺乳類に投与することを含んで 成る、哺乳類の多糖由来同族生物の菌血症 に対する治療法。 ２０、該多糖−タン白結合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼の 二属のスペーサーを介して髄膜炎球菌Ｂ血 清型外膜タン白に結合した肺炎球菌１４型 多糖を含み、治療する哺乳類が新生児であ り、単回投与の組成物の有効量が肺炎球菌 多糖結合物の結合物形態において多糖２５ μｇに対応する量である、特許請求の範囲 第１９項記載の哺乳類の治療法。 ２１、結合物の形態において多糖２５μｇに対応する二
属のスペーサーを介して免疫原性 タン白に結合した細菌由来中性夾膜多糖を 含む多糖−タン白結合物を含んでいる多糖 −タン白結合物のある量の１種または２種 の効能促進剤を新生児に投与することを含 んでなる特許請求の範囲第１９項記載の哺 乳類の治療法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68440184A | 1984-12-20 | 1984-12-20 | |
| US684401 | 1984-12-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61186400A true JPS61186400A (ja) | 1986-08-20 |
| JPH0825900B2 JPH0825900B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=24747887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60285895A Expired - Fee Related JPH0825900B2 (ja) | 1984-12-20 | 1985-12-20 | 細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0186576B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0825900B2 (ja) |
| KR (1) | KR910002704B1 (ja) |
| CN (1) | CN1017867B (ja) |
| AT (1) | ATE78492T1 (ja) |
| AU (1) | AU584149B2 (ja) |
| CA (1) | CA1256250A (ja) |
| CY (1) | CY1766A (ja) |
| DE (1) | DE3586398T2 (ja) |
| DK (2) | DK171421B1 (ja) |
| ES (1) | ES8701498A1 (ja) |
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| HK (1) | HK18794A (ja) |
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| NZ (1) | NZ214503A (ja) |
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| SG (1) | SG14294G (ja) |
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