KR100376361B1 - 면역원성구조체의제조를위하여신규한시아닐레이팅시약을사용하여용해성탄수화물을활성화하는방법 - Google Patents
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Abstract
최소한 하나의 제1 탄수화물 함유 모이어티를 시아닐레이팅 시약으로서 활성화시키고, 상기 활성화된 제1 모이어티를 제2 모이어티에 공유적으로 결합하는 방법으로 이루어진 면역원성 구조체의 제조 방법. 면역원성 구조체는 제1 모이어티 및 제2 모이어티를 직접 콘쥬게이션하여 제조될 수 있고 또한 이관능성 시약으로 간접 콘쥬게이션하여 제조될 수도 있다.
Description
미합중국 정부를 위한 발명
미합중국 정부의 이익을 위해서라면 본 발명자에게 사용료를 지불하지 않아도 본 발명의 생산, 실시 계약의 체결 및 사용이 가능하다.
산업상 이용 분야
본 발명은 면역원성 구조체(immunogenic constructs) 구조를 제조하기 위한 계량된 방법에 관한 것이다.
종래기술
백신을 제조하는 과정에 있어서, 의학계에서는 침입 병원체(invading agent)에 대하여 생체 자신을 보호하기 위하여 항원(antigen)으로 생체를 면역시키는 생체의 선천적인 능력을 사용하는데, 이러한 항원은 직접 질병을 치료하지는 않지만 질병에 대항하는 항체(antibody)의 생성을 촉진시킨다. 예를 들면, 장티푸스 열병(typhoid fever) 및 백일해(whooping cough)와 같은 박테리아성 질병에 대하여서는 죽은 조직이 주사되며, 파상풍(tetanus) 및 보툴리즘(botulism)에 대하여서는 독소(toxin)가 주사되고, 폴리오(Poliomyelitis) 및 홍역(measles)과 같은 바이러스성 질병에 대하여서는 독성이 약화된 t생물(attenuated organism)이 주사된다.
그러나 단지 외부 병원체(foreign agent)를 주입함으로써 항상 항체의 생성을 촉진할 수 있는 것은 아니다. 백신의 제조는 면역학적으로 적당하여야 하며, 반드시 면역 응답(immune response)을 유도할 수 있어야 한다. 이러한 면역 응답은 일련의 복잡한 반응으로서, 일반적으로 다음과 같이 기술될 수 있다.
1. 항원이 생체에 침투되면 항원을 진행시키고, 표면에 항원의 단편(fragment)을 지니는 항원 제공 세포(antigen-Presenting cell)와 만난다;
2. 항원 제공 세포에 있는 항원의 단편은 B세포를 돕는 T 세포에 의하여 인식된다.
3. B 세포는 항원에 대하여 항체를 분비하는 항체 제공 세포로 과증식되고 나누어지도록 촉진된다.
파상풍 톡소이드(toxoid)와 같은 병원체는 선천적으로 면역 응답을 유발할 수 있으며, 아무런 변형 없이 백신에 투여될 수 있다. 그렇지만 다른 중요한 병원체는 면역원으로 적당하지 않으며, 이들이 면역 응답을 이끌어 내기 위해서는 반드시 면역원으로 적당한 분자로 전환되어야 한다.
면역원성 분자를 생성하기 위한 한 가지 방법으로서 1992년 2월 11일날 출원된 미합중국 특허출원번호 07/834,067호 및 이의 부분계속출원으로서 1993년 2월 10일날 출원된 08/055,163호에 기재된 것을 소개한다. 상기의 두 관련 출원은 이중 담체(dual carrier) 면역원성 구조체에 대하여 기술하고 있는데, 이것은 아주 바람직한 면역원성 구조체이다.
상기의 미합중국 특허출원번호 07/834,067호 및 08/055,163호의 이중 담체 면역원성 구조체 및 기타의 면역원성 구조체와 같은 면역원성 분자를 제조하는데있어서 사용되는 방법은 중요한 항원성의 위치 즉, 분자상의 에피토프(epitope)를 유지하기에 충분하여야 한다. 말하자면, 구조의 완전성을 유지하고, 이들 화합물 내에 에피토프를 유지하는 것이 바람직하다. 그러나 불행하게도, 현재까지 사용되고 있는 제조 과정은 종종 에피토프를 유지하기에 충분하지 못하며 기존의 탄수화물(carbohydrate) 및/또는 단백질(protein) 구조를 파괴하는 경우도 있다. 게다가 탄수화물을 변경하는 대부분의 기술은 물이 없는 상태가 요구되는데, 불행하게도 탄수화물은 유기용매에 불용인 경우가 많다. Marburg 등, J. Amer. Cem. Soc., 108:5282 (1986).
면역원성 구조체를 제조하기 위한 두 가지 일반적인 방법은 다음과 같다.
(1) 탄수화물 및 단백질의 직접 콘쥬게이션(conjugation); 또는
(2) 이관능성 링커(bifunctional linker) 또는 스페이서 시약(spacer reagent)을 통한 탄수화물 및 단백질의 콘쥬게이션.
일반적으로, 상기와 같은 두 가지 형태의 콘쥬게이션은 탄수화물 모이어티(moiety)가 유도체를 형성하기 전에 화학적으로 활성화되어져야 한다. 화학적 활성이란 관능기가 어떤 한 형태로 변화하는 것을 의미하는데, 이 형태는 부가적인 화학적 반응 즉, 관능기의 부가 또는 단백질과 같은 큰 모이어티의 부가를 수행할 수 있다. 유도체를 형성하는 과정(derivatization)이란 화학적 관능기 또는 스페이서 시약 단백질에 부가되는 것이다.
아미노(amino) 또는 카르복실(carboxyl)기와 같은 작용기를 지니는 일부 탄수화물은 콘쥬게이션 이전에 보다 용이하게 활성화되거나 유도체를 생성할 수 있다. 예를 들면, Pseudomonas Fisher Type I의 아미노기는 요오드아세틸(iodoacetyl)기로 쉽게 유도되고 티오 단백질(tiolated protein)과 결합한다. Pneumonococcal Type III와 같은 탄수화물에 있는 카르복실기는 EDC와 같은 수용성 카르보디이미드(carbodiimide)와 함께 쉽게 활성화되며, 직접 단백질과 커플링할 수 있다. 그러나 불행하게도, 이러한 탄수화물 작용기는 제한되어 있다.
최종 환원 말단부(terminal reducing end)에 알데히드(aldehyde)기를 가진 기타의 탄수화물은 유도체 생성 및 콘쥬게이션에 이용될 수 있다. 과요오드산 나트륨(sodium periodate)을 이용하면 최종 환원 말단부에 알데히드기를 생성하는 것 또한 가능하다. 알데히드기의 존재는 유리한 조건이 될 수도 있는데 왜냐하면, 탄수화물의 활성은 알데히드가 사용된다면 필요하지 않을 수도 있기 때문이다.
이러한 알데히드기는 단백질상의 아미노기 또는 이관능성 결합 시약에 의하여 축합될 수 있다. 그렇지만, 이러한 축합 반응(condensation reaction), 특히 최종 환원 말단부를 지닌 축합 반응은 종종 아주 완만하고 비효율적으로 진행되는 경우가 있다. 이러한 현상은 탄수화물 알데히드를 단백질에 콘쥬게이트할 경우에 더욱 촉발된다. 그러므로 이러한 방법에 의한 반응의 수율은 종종 형편없이 낮다. 게다가, 과요오드산 나트륨은 탄수화물을 단편으로 파괴하고 및/또는 에피토프를 파괴할 수도 있는데 이것은 바람직하지 않을 수 있다.
그렇지만 대부분의 탄수화물은 콘쥬게이션 이전에 활성화되어야만 하며, 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)는 흔히 선택되어지는 활성화제이다. 참조, e.q., Chu 등, Inf. & Imm, 40:245 (1983). 요약하자면, 시아노겐 브로마이드는 높은 pH, 전형적으로 pH 10 내지 12의 조건에서 탄수화물과 반응한다. 이러한 높은 pH에서는 시아네이트 에스테르(cyanate ester)는 탄수화물의 히드록실기와 함께 생성된다. 이들은 순차적으로 이관능성 시약에 의하여 반응하는데, 이러한 이관능성 시약으로서는 흔히 디아민(diamine) 또는 디히드라지드(dihydrazide)가 사용된다. 이와 같이 유도된 탄수화물은 이관능성 작용기를 통하여 콘쥬게이션 된다. 또한 시아네이트 에스테르는 단백질과 직접 반응한다.
상기와 같은 높은 pH는 히드록실기를 이온화하기 위하여 필요한데, 왜냐하면 이러한 반응은 시아네이트 이온(CN-)상의 히드록실 이온의 친핵성 공격(nucleophilic attack)을 필요로 하기 때문이다. 결과적으로, 시아노겐 브로마이드는 여러 가지 부반응을 생성하며 전기적으로 중성이 아닌 작용기 및 네오-항원(neo-antigen)을 다당류(polysaccharide)에 부가시킨다. M. Wilcheck등, Affinity Chromatography. Meth. Enzymol., 104C:3-55. 그러나 보다 중요한 것은, 많은 탄수화물은 시아노겐 브로마이드의 활성을 위하여 요구되는 높은 pH의 조건에서 가수분해되거나 또는 손상을 입을 수 있다는 것이다.
게다가, 시아노겐 브로마이드와 함께 활성화된 후 생성된 시아네이트 에스테르는 높은 pH에서는 불안정하며, 빠른 속도로 가수분해됨으로써 유도된 탄수화물의 수율을 저하시키고, 결과적으로 단백질에 콘쥬게이트되는 탄수화물의 전체 수율을 저하시킨다. 카르바메이트(carbamate) 및 선상 이미도카르보네이트(linear imidocarbonate)를 생성하는 것과 같이 반응에 불필요한 많은 기타의 부반응은 높은 pH의 조건에서 촉진된다. Kohn등, Anal. Biochem., 115:375 (1981). 또한, 시아노겐 브로마이드 자체는 매우 불안정하여 높은 pH에서는 저절로 가수분해되며 결과적으로 전체 수율을 저하시킨다.
게다가, 시아노겐 브로마이드는 활성화시키기 곤란하며, 불안정한 문제점이 있다. 시아노겐 브로마이드는 독성이 크며 폭발 위험이 내재해 있다. 모든 조작은 적절한 연기 배출 장치(fumehood)가 완비된 상태에서 수행되어야 한다. 또한 이러한 활성화는 어떤 시아노겐 브로마이드 조작에서는 수행되고 어떤 조작에서는 수행되지 않는 등의 쉽게 재생되지 않는 문제점이 있다는 것은 당해분야에서는 널리 알려진 사실이다. 또한 시아노겐 브로마이드는 물에 거의 용해되지 않아서, 탄수화물과 반응하는 용해성 시아노겐 브로마이드의 양을 조절하기 곤란하다. 동일한 반응 조건의 시아노겐 브로마이드 조작에서도 상이한 결과가 나타나는 경우가 흔하게 발생한다.
상기와 같은 불이익 제외하고라도, 시아노겐 브로마이드를 사용함으로써 달성되는 탄수화물의 활성화 정도를 조절하기는 거의 불가능하다. 또한 이러한 방법에 의하면 높은 탄수화물 활성을 달성하기도 거의 불가능하다. 시아노겐 브로마이드의 양을 증가시키면 반응이 비효율적으로 되며, 활성화를 유도하기보다는 부반응만을 초래한다. Kohn 등, Applied Biochem and Biotech, 9:285 (1984). 그러므로 면역원성 구조체를 제조하는 방법에 있어서 면역원으로 적합하며, 탄수화물 및 단백질의 구조적인 완결성을 유지할 수 있으며, 화합물내의 에피토프를 보존할 수 있으며, 조작이 용이하고, 안전하며, 용이하게 재생산이 가능한 방법이 필요하게 되었다.
발명의 요약
콘쥬게이션 방법의 제공에 의한 면역원성 구조체를 생산하는데 있어서, 본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점 및 약점을 해결할 수 있다. 본 발명의 콘쥬게이션 방법에 있어서는 안전하고, 용이하며, 경제적이고 탄수화물에 영향을 거의 미치지 않는 탄수화물의 활성화 방법이 채용된다.
본 발명의 방법에 있어서는 탄수화물을 포함하는 항원을 활성화시키기 위하여 신규한 시아닐레이팅 시약(cyanylating reagent)이 사용된다. 왜냐하면 시아닐레이팅 시약의 반응 조건은 전혀 가혹하지 않으므로 탄수화물 구조의 파괴가 현저하게 감소되며, 그리하여 자연적으로 발생되는 에피토프의 파괴 또한 현저하게 감소시키기 때문이다. 이러한 방법은 다양한 종류의 용해성 탄수화물에 적용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 활성화된 탄수화물은 단백질에 직접 콘쥬게이션 되거나 또는 스페이서 또는 링커의 사용을 통하여 간접적으로 단백질에 콘쥬게이션될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면 종래 기술을 사용하여 제조된 면역원성 구조에 비하여 보다 효과적인 면역원성 구조를 보다 효율적이고 경제적으로 제조할 수 있다. 하기한 표 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 방법은 현재 사용되고 있는 시아노겐 브로마이드에 비하여 훨씬 유리하다.
표 1
콘쥬게이트의 합성 과정에서 탄수화물의 활성 비교
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 방법은 제1 탄수화물 함유 모이어티를 CDAP(1-cyano-4-(dimethylamino)-pyridinium tetrafluoroborate) 시약을 사용하여 활성화하는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 활성화된 탄수화물 함유 모이어티를 제2 모이어티로 직접 콘쥬게이션하는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 방법은 상기 활성화된 탄수화물 함유 모이어티를 CDAP를 사용하여 활성화하고, 이관능성 시약을 활성화된 모이어티에 공유적으로 결합하고, 나아가서 이관능성 시약과 전형적으로 T 의존성(T-dependent) 항원인 제2 모이어티를 반응시키고, 면역원성 구조체를 형성하는 것을 포함한다. 여기에서 상기한 탄수화물 함유 모이어티 및 TD 모이어티는 이관능성 시약에 의하여 결합되어 있다.
CDAP를 사용하는 기타의 장점은 (1) 상기 시약을 미리 제조하여서 여러 달 동안 용액의 형태로 저장할 수 있고, (2) 활성화 시약이 301 nm의 파장을 흡수하므로 그 농도를 용이하게 결정할 수 있는 것이다. Kohn 등, Anal. Biochem, 115:375 (1981). 이러한 특징은 시약의 농도를 표준화하는 것을 가능하게 하고, 탄수화물의 유도 반응을 보다 용이하게 재생 가능하게 하는데, 이것은 백신의 제조 과정에 있어서 아주 중요하다.
상기에서 언급한 모든 장점들은 탄수화물의 단백질에 대한 직접 콘쥬게이션에 적용될 수도 있으며, 스페이서를 통한 간접 콘쥬게이션에도 적용될 수 있다.
본 발명의 또다른 목적 및 장점은 본 명세서에 하기되어 있으며, 본 명세서의 기재만으로도 명백한 부분도 있을 것이고, 실험을 통하여 학습되어질 수 있는 부분도 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 장점은 본 발명의 청구항에서 특정적으로 지적된 구성 성분 및 조합들에 의하여 객관화되고 달성될 수 있을 것이다.
앞서 기술된 일반적인 설명 또는 하기한 상세한 설명은 단지 본 발명의 한 형태일 뿐이며 본 발명의 청구 범위가 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서에 첨부된 도면은 본 발명의 설명과 마찬가지로 본 발명의 몇 가지 실시예를 예시하고 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이다.
제1도는 시아닐레이팅 시약을 사용하여 탄수화물의 활성화를 나타내는 개략도.
제2도는 활성화된 탄수화물이 단백질에 직접 콘쥬게이션 되는 개략도(도면의왼쪽) 및 이관능성 시약을 사용하여 활성화된 탄수화물이 단백질에 간접 콘쥬게이션 되는 개략도(도면의 오른쪽).
제3도는 면역원성 구조체를 나타내는 개략도.
제4도는 덱스트란(dextran)의 단위몰에 대하여 첨가되는 CDAP의 몰수와 덱스트란에 투입되는 NH2기와의 관계를 나타내는 그래프.
제5도는 S400SF 겔 여과 칼럼(gel filteration column)에서의3H-BSA-dextran 콘쥬게이션의 용출 형태(elution profile)를 나타내는 그래프.
제6도는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 면역원성 구조체가 S400SF 겔 여과 칼럼에서 용출되는 OD280 흡광도(absorbance)를 나타내는 그래프(A, PT-PRP; B, P28-PT-Pn14).
제7도는 Hδa/1-(CDAP)-dextran이 S400SF 겔 여과 칼럼에서 용출되는 형태를 나타내는 그래프.
제8도는 Hδa/NH2-(CDAP)-dextran으로 채워진 S400SF 겔 여과 칼럼에서 용출되는 칼럼 시편의 OD280 및 OD430의 값을 나타내는 그래프.
제9도는 본 발명의 방법에 의하여 제조된 면역원성 구조체의 면역활성도(immunoreactivity)를 나타내는 그래프이다.
현재로서는 본 발명의 바람직한 실시예를 구성하기 위한 언급들을 첨부된 도면과 함께 상세하게 기술한다.
본 발명은 면역원성 구조체의 제조에 있어서 탄수화물 함유 항원을 용도에 따라서 활성화하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 시아닐레이팅 시약을 사용하여 탄수화물 함유 모이어티를 활성화하는 면역원성 구조체의 제조에 관한 것이다. 시아닐레이팅 시약을 사용하여 탄수화물을 활성화하는 일반적인 방법이 제1도에 예시되어 있다. 제2도에는 활성화된 탄수화물을 단백질에 직접 콘쥬게이션하는 것 또는 이관능성 결합제 시약의 사용을 통하여 간접 콘쥬게이션하는 것이 묘사되어 있다.
본 명세서에서 사용된 면역원성 구조체란 면역 응답을 촉진할 수 있는 어떤 물질을 의미한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기의 면역원성 구조체는 단백질인 최소한 하나의 제2모이어티에 콘쥬게이트된 최소한 하나의 탄수화물 함유 모이어터를 의미한다. 본 명세서에서 "탄수화물"이란 용해성 단당류(soluble monosacchande), 이당류(disaccharide), 올리고당류(oligosaccharide) 또는 다당류를 의미한다. 다당류는 전분(starch), 셀룰로오스 및 펙틴(pectine) 등을 포함하지만 이러한 것에 제한되지는 않는다. 또다른 바람직한 실시예에 있어서는, 제3도에서 알 수 있듯이, 제2 모이어티란 탄수화물에 콘쥬게이트된 T 의존성 항원을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 모이어티(moiety)이란 어떤 물질(substance)을 의미하며 그 자체로서 또는 결합하여 면역 체계를 촉진한다. 상기의 모이어티로서는 탄수화물, 단백질, 펩티드, 기타의 항원들, 애쥬번트 분자(adjuvant molecule),합텐(hapten) 또는 이들로 결합된 물질이 사용 가능하다. 합텐은 화합물, 먼지(dust), 알레르겐(allergen) 등의 작은 분자를 의미하며, 이러한 물질은 그 자체로서는 항체 반응을 일으킬 수 없으나 담체(carrier)와 결합하면 항체 반응을 일으킬 수 있다. 항원이란 적절한 조건에서는 항체의 형성을 이끌어낼 수 있는 분자를 의미한다. 이러한 합텐 및 항원은 박테리아, 리케차(rickettsiae), 균류, 바이러스, 기생충(parasite), 약물 또는 화합물로부터 유도될 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기의 합텐 및 항원은 예를 들면, 펩티드, 올리고당(예를 들면, H influenzae의 Polyribosyl-ribitol-phosphate), 독소, 내독소(endotoxin) 등의 작은 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 구조를 합성하는 공정에 있어서는 최종 제품의 물리적 및 화학적 성질을 유리하게 조절하는 것이 가능하다. 이러한 조절이 가능한 성질로서는 제1 및 제2 모이어티의 전하량을 조절하는 것(양전하를 가지는 단백질이 면역원으로 보다 유리하다는 증거가 있다), 탄수화물 함유 모이어티의 크기를 변경함으로써 본 발명의 구조의 크기를 변경하는 것, 구조의 가교결합 정도를 선택하는 것(크기를 다양하게 조절하기 위하여), 탄수화물 함유 모이어티에 콘쥬게이트된 제2 모이어티의 복제수를 선택하는 것, 선택된 세포수를 타겟팅(targeting)하는 것(항원의 존재를 강화하기 위하여 대식세포(macrophage)에 행하듯) 등이 있다. Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114 (1989).
본 발명의 구조체에 대한 면역 응답은 면역 조절 물질(immunomodulator) 및/또는 세포 타켓팅 모이어티의 첨가에 의하여 강화될 수 있다. 이러한 물질의 예를 들면, (1) 독성이 제거된 리포다당류(lipopolysaccharide) 또는 그 유도체, (2) 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), (3) 면역학적으로 적당한 세포에 상기 구조를 타켓팅하는 세포 표면 결정인자와 상호작용이 가능한 탄수화물, 지질, 및 펩티드 (4) 인터류킨(interleukin) 및 (6) 항체 등이 있다.
탄수화물 함유 모이어티는 거대 분자량을 지닌 분자가 반합성(semisynthetic) 또는 전체적으로 합성되어 천연적으로 생성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 최소한 하나의 탄수화물 함유 모이어티란 E. coli 다당류, S. aureus 다당류, 덱스트란, 카르보메틸 셀룰로오스, 아가로즈(agarose), Pneumococcal 다당류, 피콜(Ficoll), 크리토코쿠스 네오-포르만(crytococcus neo-forman), 헤모필루소(haemophilus) 인플루엔자 PRP,P. aeroginosa, S, pmeumoniae, 리포다당류 및 이들의 결합물에서 선택된 탄수화물을 포함한다.
가장 바람직한 실시예에 있어서는, 상기의 탄수화물 함유 모이어티는 덱스트란인 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 덱스트란은 단당(single sugar)으로 이루어진 다당류를 의미하며, Pharmacia 회사를 비롯하여 여러 산업 분야에서 얻어질 수 있다. 반합성 폴리머의 한 예인 피콜은 불활성 합성 비이온화된 거재분자량의 폴리머이다. 합성폴리머의 예로써는 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol)을 들 수 있다. 상기한 모든 것은 탄수화물 함유 모이어티의 예이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 제2 모이어티는 알부민(albumin), 톡소이드, 단백질, 펩티드, T 세포 또는 B 세포 애쥬버트(adjuvant) 또는 T 세포 헬프(help)를 활성화하거나 강화할 수 있는 기타의 화합물을 의미한다. 단백질은 바이러스성, 박테리아성, 기생성 동물 및 균류 단백질에서 선택될 수 있으나, 상기한 것에 한정되지는 않는다. 보다 바람직한 실시예에 있어서는 제2 모이어티로서는 보빈 시럼 알부민(bovine serum albumin), 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 디프테리아(diphtheria) 톡소이드, 열 쇼크(heat shock) 단백질, T세포 초항원(superantigen) 또는 박테리아성 외부 멤브레인 단백질이 사용될 수 있으며, 이러한 모든 것들은 기존의 생화학 회사 또는 제약 회사에서 생산되고 있으며, 표준적인 면역학적 방법에 의하여 제조할 수 있다(J.M. Cruse & R.E. Lewis, (eds.), Conjugate Vaccine in Contribution to Microbiology and Immunology, Vol. 10 (1989), 본 발명에 인용참증으로 특별히 언급되어 있다). 기타의 단백질은 면역학의 분야에서 통상의 지식을 가진 사람들에게 충분히 알려져 있다.
본 발명의 제2 머이어티는 최소한 하나의 탄수화물 함유 모이어티에 콘쥬게이션될 수 있다. 이러한 제2 모이어티는 탄수화물 함유 모이어티와 반응할 수 있는 관능기를 지니고 있을 수도 있으며, 상기에서 언급된 탄수화물 함유 모이어티와 반응이 가능하도록 화학적으로 조작될 수도 있다.
제2 모이어티의 종류뿐만 아니라 특정한 제2 모이어티의 수많은 복제체(copy)도 탄수화물 함유 모이어티에 콘쥬게이션될 수 있다. 제2모이어티의 복수 복제체가 제1 모이어티에 커플링되는 것은 제2 모이어티에 대한 항원 생성을 현저하게 증가시킨다.
또 다른 실시예에 있어서는, 제3 모이어티는 하나 또는 그 이상의 제1 및/또는 제2 모이어티에 추가적으로 콘쥬게이션될 수 있다. 상기에서 언급한 관련 출원에 기술되어 있듯이, 이러한 콘쥬게이션은 제3 모이어티에 대한 강화된 항체응답을 고무시킨다. 이러한 다양한 모이어티를 제1 및 제2 모이어티에 콘쥬게이션시키는 기술은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 충분히 알려져 있다. 이러한 기술의 예로서는 사용 가능한 관능기(아미노기, 카르복실기, 티오 및 알데히드기)를 커플링하는 것 등이 있다. 참조 S.S. Wong, chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press (1991), 및 Brenkeley 등, "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents," Bioconjugate Chemistry, 3:1 (Jan. 1992), 이에 대하여서는 본 발명에서 인용참증으로 사용하였다.
본 발명의 방법에 있어서, 탄수화물 함유 모이어티는 시아닐레이팅 시약을 사용하여 활성화된다. 시아닐레이팅 시약은 탄수화물 함유 모이어티와 같이 반응하여 시아네이트의 전자 친화도(electrophilicity)를 증가시키며, 시아노기를 탄수화물의 히드록실기로 전환시켜 추가적인 반응이 가능하도록 한다. 즉, 단백질에 직접 또는 간접 콘쥬게이션되도록 한다. 이러한 활성화 반응은 중성 pH에서 수행되며 다당류의 안전성 및 완전성을 향상시킨다.
시아닐레이팅 시약으로서는 CTEA(N-cyanotriethylammonium tetrafluoroborate), CDAP(1-cyano-4-(dimethylamino) -pyridinium tetrafluoroborate), pNPC(p-nitrophenylcyanate) 등이 알려져 있다. Wakselman 등은 CDAP는 단백질 시스테인(protein cysteine)기의 변경에 사용될 수 있는 저자극성의 시약이라고 보고한 바 있다. J.C.S. Chem. Comn., 1976:21 (1976). 이러한 시약들 중에서도 CDAP가 가장 바람직한데, 그 이유는 CDAP는 가장 안정적이며, 가스 배출구 없이도 사용이 가능하다. 그러나 CTEA 및 pNPC도 본 발명의 권리 범위에 포함되어 있다. 반대 이온(counter ion)을 가진 시아네이트와 함께 사용되는 기타의 3차 아민 화합물도 본 발명의 권리 범위에 포함된다. 특별히 유용한 것은 테트라플루오르보레이트(tetrafluoroborate)와 같은 비핵친화성(non-nucleophilic) 반대이온이다.
Kohn 등은 비용해성 다당류 레진(resin)인 아가로즈(agarose)에 활성화 시약으로 사용되는 CDAP, CTEA 및 pNPC를 비교하였다. Kohn 등, Anal. Biochem, 115:375 (1981). 그리고 일부의 연구자들은 세파로즈(Sepharose) 및 글리세릴-조절 다공성 유리(glyceryl-controlled pore glass)와 같은 여러 형태의 비용해성 입자를 활성화하기 위하여 CDAP를 사용하였다. A. Carpenter 등, Journal of Chromatography, 573:132-135 (1992). 본 발명의 면역원성 구조체에 의한 제조품과는 상이하게, 이러한 논문에서는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로서 겔(gel)을 제조하기 위하여 활성화된 비용해성 입자를 사용하였다.
단백질을 콘쥬게이션하는 종래 기술에 있어서 CDAP를 사용하여 용해성 다당류를 활성화하는 유일한 연구 결과인 Andersson 등, International Journal of Cancer, 47:439-444 (1991)에서 Andersson 등은 시아네이트와 같이 활성화된 저분자량의 40 kDa 덱스트란에 표피 성장 팩터(EGF)를 직접 콘쥬게이션하였다. 아들은덱스트란-EGF 콘쥬게이트를 생성하기 위하여 약 50:1 (wt/wt)의 고농도의 덱스트란-EGF를 사용하였으며, 이들 콘쥬게이트를 배양 세포(cultured cell)와 결합하는 방법을 연구하였으나 상기 콘쥬게이트를 면역원(immunogen)으로써는 사용하지 않았다. 실제적으로, 저분자량의 덱스트란에 단백질을 콘쥬게이션하는 것은 용이하지 않으며, 면역원으로도 적합하지 않다. T.E. Wileman, J. Pharm, Pharmocology, 38:264 (1985).
시아닐레이팅 시약을 사용하여 활성화하는 바람직한 방법은 pH 6-8의 비핵친화성 버퍼(buffer)에서 수행하는 것이다. 시아닐레이팅 시약의 활성화 방법은 pH 6-8의 범위내에서 널리 사용되는 안정된 버퍼에서 수행될 수 있다. 안정된 비핵 친화성 버퍼로서는 식염수(saline), HEPES, 포스페이트(phosphate), 물 및 여러 가지 유기 용매를 들 수 있으나, 이들은 상기 열거된 물질에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서는, CDAP는 건조 아세토니트릴(acetonitrile)에 100 mg/㎖의 농도로 용해된 저장 용액에 용해된다. 0.1 내지 10 mg/㎖ 농도의 CDAP는 본 발명의 방법에 사용되기에 안정된 농도이다. 사용되는 탄수화물 함유 모이어티의 성질에 따라서 그리고 요구되는 활성화의 정도에 따라서 상기에서 벗어난 농도도 선택되어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 탄수화물 함유 모이어티의 농도는 1 내지 15 mg/㎖가 선택되어질 수 있다. 활성화 반응은 탄수화물 함유 모이어티의 농도가 약 100 mg/㎖의 농도 이상일 경우에 성공적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 단백질에 직접 콘쥬게이션할 수 있는CDAP-탄수화물 함유 모이어티의 비는 탄수화물 함유 모이어티 100 kDa 당 1:100 내지 1:500이 바람직하다. 또 다른 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 단백질에 간접적으로 콘쥬게이션할 수 있는 CDAP-탄수화물 함유 모이어티의 비는 탄수화물 함유 모이어티 100 kDa 당 1:10 내지 1:500가 바람직하다. 사용되는 모이어티의 성질에 따라서 그리고 기타의 반응 조건에 따라서 여러 종류의 모이어티비가 선택되어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 시아닐레이팅 시약을 사용하여 활성화된 탄수화물 함유 모이어티는 면역원성 구조체를 생성하기 위하여 제2 모이어티에 직접적으로 콘쥬게이션 된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 있어서는, 시아닐레이팅 시약을 사용하여 활성화된 탄수화물 함유 모이어티는 적절한 이관능성 시약에 공유적으로 결합한다. 사용될 수 있는 이관능성 시약으로서는 에틸렌디아민(ethylene diamine), 1,6-헥산디아민(1,6-hexane diamine), 아디픽 디히드라지드(adipic dihydrazide), 시스타민(cystamine), 및 리진(lysine), 글루타민 산(glutamic acid), 티올 히드라지드(thiol hydrazide), 티올 아민(thiol amine) 등을 들 수 있으며, 상기 열거한 것에 제한되지는 않는다. 참조, Wong 등, "Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking," CRC Press (1991). 상기 제2 모이어티는 이관능성 시약과 공유적으로 결합하는데, 이러한 이관능성 시약은 탄수화물 함유 모이어티와 그것의 다른 말단(terminus)에 이미 공유적으로 결합되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 트리에틸아민(triethylamine)은 중간적인 본 브라운 착화합물(intermediate Von Braun complex)의 형성에 의하여 시아닐레이팅 반응을 촉진하기 위하여 사용된다. 상기 TEA는 본 브라운 착화합물을 형성할 수 있는 여러 가지 4차 아민으로 대체할 수 있다. J. Von Braun, Chem. Ber., 33:1438 (1900).
일부의 콘쥬게이션 반응에 있어서, 글리세린 아미노 에탄올 또는 기타의 아미노-함유 시약은 반응을 종결시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 면역원성 구조체로 이루어진 백신에 관한 것이다. 이러한 백신은 적당량의 담체와 함께 치료에 충분한 양의 면역원성 구조체를 포함시켜 환자들에게 투여할 수 있는 적당한 형태로 제공될 수 있다. 이러한 백신은 알럼(alum) 및 애쥬번트로 이루어질 수 있다.
제약학적으로 허용되는 담체로서는 물 및 오일과 같은 무균액(sterile liquid)이 사용 가능하며, 이러한 오일로서는 땅콩유(peanut oil), 대두유(soybean oil), 미네랄유(mineral oil), 참깨유(sesame oil) 등과 같은 페트롤륨성(petroleum), 동물성, 식물성 및 합성 오일 등이 사용될 수 있다. 물은 약물이 정맥내에 투여될 경우에 담체로서 적합하다. 또한 식염수 용액 및 수용성 덱스트란 및 글리세릴 용액도 상기 액체 담체로서 사용될 수 있으며, 특히 주사 용액으로서 적합하다. 제약적으로 적합한 담체는 E.W. Martin, Remington's pharmaceutical Science,에 기술되어 있으며 본 명세서상에서 인용 참증으로 사용되었다.
본 발명의 면역원성 구조체로부터 제조될 수 있는 백신을 하기한 도표 1에 나타내었다. 하지만 제조 가능한 백신이 하기한 도표 1에만 제한되는 것은 아니다.
도표 1
또한 본 발명은 면역적 자극을 일으키기에 충분한 양의 상기 백신을 환자에 투여하여 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 환자란 인간, 말, 소, 개 및 고양이와 같은 포유류뿐만 아니라 닭과 같은 기타의 동물도 포함된다. 면역적 자극을 일으키는 백신의 양이란 예방, 회복 및 질병의 치료를 위하여 환자의 면역 응답을 촉진할 수 있는 양을 의미한다. 본 발명의 백신은 모든 경로를 통하여 투여할 수 있지만 정맥 주사, 근육 주사 및 피하 주사로 투여되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 박테리아, 바이러스, 기생충, 균류 또는 화학 약품에 의한 감염에 대항할 수 있는 면역적 치료 시약의 제조 방법을 제공한다. 이러한 면역적 치료 시약은 상기한 백신으로 환자를 면역시켜 백신에 직접적으로 대항하는 항체를 형성하는 역할을 한다. 항체는 격리되거나 또는 단클론성(monoclonal)의 항체를 생성하는 골수종(myeloma) 세포와 융합되기 위하여 B세포가 얻어질 수도 있다. 단클론성의 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에서는 널리 알려져 있다. 이러한 방법은 Kohler등, Nature, 246:495 (1975)에서 찾아볼 수 있고, 본 명세서상에서 인용 참증으로 언급되어 있다. 본 명세서상에서 면역적 치료 시약이란 환자의 수동적 치료에 사용되는 특정한 항원에 대항하는 항체의 조성물을 의미한다. 플라즈마 도우너(plasma donor)는 백신과 함께 주사되어 백신내에 포함되어 있는 항원에 대항하는 항체를 생성하는 물질이다.
실시예 1
A 스페이서에 의한 A 모델의 탄수화물 함유 모이어티의 유도
A. 물질
Aldrich 회사(Milwaukee, Wisconsin)로부터 CDAP, 피리딘, 헥산 디아민, 소디움 보레이트, HEPES 및 트리에틸렌아민을 구입하였다. Pharmacia 회사(Piscataway, New Jersey)로부터 평균 분자량 2000 kDa인 탄수화물 함유 모이어티 T2000 덱스트란을 구입하였다.
건조 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하여 100 mg/㎖의 농도로 조절한 CDAP 용액을 -20℃의 온도에서 저장하여 사용할 때까지 냉동 상태로 유지하였다. 식염수 + 0.02 % 아지드(azide)로써 10.5 mg/㎖의 T2000 덱스트란을 제조하였다. 트리에틸아민 수용액은 2.0 M로 제조하여 사용할 때까지 냉동 상태로 유지하였다.
헥산 디아민은 0.1 M 소더움 보레이트로 0.5 M로 제조하였다.
아미노기의 결정은 트리니트로벤젠 술포네이트(TNBS)를 사용하여 366 nm에서 흡광 계수 11,000-1에서 행해졌다. T2000 덱스트란을 표준으로서 사용하고, M. Monsigny 등의 Anal. Chem., 175:525 (1988)의 방법으로 탄수화물을 분석하였다.
B. 반응의 조절
다음의 실험은 본 발명의 유도 반응에서 사용되는 모든 성분은 중요한 것이며, 최종 콘쥬게이트의 아미노기는 탄수화물에 공유적으로 결합되어 있고, 이들의 존재는 시약에 존재하는 성분이 최종 제품에서 나타나는 것이 아님을 증명한다. 반응은 냉동 상태에서 수행된다. 시험적인 실험을 통하여, 시약을 사용하지 않았을 경우 또는 시약을 다른 물질로써 대체하였을 경우를 표 2에 나타내었다.
표 2의 1행의 모든 시약을 사용하는 과정에서, CDAP는 300 ㎕의 교반된 덱스트란(3.1 mg)에 첨가된 후 냉동 용기에 다시 넣어졌다. 30 초 경과후 상기 교반된 용액에 TEA를 첨가하였다. CDAP를 첨가하고 2분이 경과한 후 200 ㎕의 디아민을 첨가하고, 상기 용액을 1 시간 동안 냉동 보관하였다. 상기 시료를 하룻밤 동안 투석시키고, Millex GV 필터를 사용하여 여과한 후 1×15cm의 P6DG 칼럼(BioRad)을 이용하여 탈염하였다.
하기한 표 2에서 볼 수 있듯이, 덱스트란에 아미노기를 도입하는 것은 덱스트란, CDAP, TEA 및 헥산 디아민의 존재하에서 가능하다. 표 2의 결과에서 알 수 있듯이, 콘쥬게이트되지 않은 시약의 성분이 최종 제품에서 나타남으로서 아미노기가 발견되는 것이 아니다. 전달 시약으로서 TEA가 존재하지 않는다면, 단지 최소한의 유도 반응이 이루어질 뿐이다.
표 2
C. 헥산 1,6-디아민을 사용한 T2000 덱스트란의 유도
본 실험은 높은 비 및 낮은 비에서 아미노기의 도입을 위한 탄수화물의 유도반응에 CDAP가 사용될 수 있음을 증명한다. T2000 덱스트란은 탄수화물로서 사용되었다. 덱스트란은 글루코오스 단량체(glucose monomer)로 이루어진 폴리머이다.
다양한 종류의 콘쥬게이트 백신을 제조하는 제1 단계는 스페이서의 첨가이다(Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigen,"Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114(1989)). 이와 같은 일련의 실험은 표 3에 요약되어 있으며, 스페이서가 다당류에 첨가될 수 있음을 강조하기 위한 것이다.
표 3
* 2000 kDa 덱스트란에 대한 NH2의 몰수
** 이 값을 계산하기 위하여 NH2/덱스트란 값을 CDAP 몰수/덱스트란 몰수로 나누고 100을 공하였다.
*** NH2기에 결합된 덱스트란 내부의 글루코오스 단위체의 백분율.
**** 실온(room temperature)에서 수행되었다.
상기 실험은 두 가지 온도에서 수행되었다. 표 2의 1-7 행 및 11 행에서는모든 시약이 냉동 상태에서 보관되었으며, 8-10 행에 있어서는 실온에서 보관되었다. 절차 및 사용된 시약은 상기 표 2에 기술된 바와 같으며, 시약의 양은 표 3에 나타난 바와 같다. 11 행에 있어서, 디아민이 0.15 M의 HEPES에 첨가되었다. 반응은 낮은 pH 값에서는 약간 비효율적인 것으로 나타났다. 또 다른 실시예에 있어서, 헥산 디아민은 pH 9의 0.1 M 보레이트에서 제조되었다.
효율은 사용된 CDAP의 단위 몰수에 대한 스페이서의 몰수로써 정의되며, 백분율로 나타내었다. 마지막 세로줄의 유도량(%)은 스페이서에 의하여 변경된 덱스트란의 글루코오스 모노머 단위체의 백분율이다.
보다 상세한 결과가 제4도에 나타나 있으며, 이것은 덱스트란(dextran)의 단위몰에 대하여 첨가되는 CDAP의 몰수와 덱스트란에 투입되는 아미노기(즉, 첨가되는 스페이서 시약)의 전체수를 보여준다. 이러한 데이터가 CDAP의 몰수/덱스트란 단위몰에 대하여 도입되는 NH2로 전환된다면, 이것은 1 이하의 CDAP:글루코오스의 비는 높은 수준의 NH2의 도입에 충분하다는 증거가 된다. 그러므로 NH2기를 충분히 도입하기 위해서는 덱스트란 다당류의 최소한의 변경이 필요하다.
나아가서, 활성 시아네이트 에스테르의 결정되지 않은 양은 스페이서를 첨가하지 않아도 가수분해되므로, CDAP/글루코오스의 비는 실제적으로 폴리머의 변경 정도를 과대 평가한 것이다. 그러므로, 실제 적인 변경의 정도는 상기 계산된 CDAP/글루코오스 비보다 적다.
1 행에서 수행된 3.1 %의 최소한의 시약 양에서의 스페이서기의 도입 정도는콘쥬게이트 백신의 합성에 사용된 양과 비교할 수 있다(Chu 등, Inf. & Imm., 40:245 (1983); Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114 (1989)).
상기 표 및 그에 나타난 수치는 스페이서 시약을 첨가하기 위한 CDAP 반응의 높은 효율을 보여준다. 반응 조건의 보다 최적화하면 효율을 상승시킬 수 있을 것이다. 도시된 모든 것은 사용 가능한 CDAP를 사용한 다당류에 도입되는 스페이서기의 수준이 매우 높음을 보여준다. 첨가된 CDAP의 최고량(7 행)에 있어서, 글루코오스 단위체 5에서 약1이 스페이서에 의하여 변경되었다(20 %). 시아노겐 브로마이드를 사용하여 이러한 정도의 스페이서의 도입을 얻기는 불가능하다(Kagedal a Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25:1855 (1971)).
반응이 진행되는 동안, 덱스트란 다당류의 침전을 명확하게 확인할 수 없었다. 반대로, 시아노겐 브로마이드를 사용하는 방법에 있어서는 다당류의 응집(aggregation) 및 침전이 문제가 될 수 있다(Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25:1855 (1971)).
이러한 반응은 소량(<1 ㎖)으로서 행하여졌으므로 많은 반복 실험을 행함으로써 편리한 실험 방법을 택할 수 있었다. 이것은 귀중한 탄수화물의 낭비 없이 실험 방법을 최적화하는데 있어서 매우 중요하다. 반대로, 아주 작은 양의 시아노겐 브로마이드로써는 효과적인 수행이 불가능한데, 그 이유는 시아노겐 브로마이드의 낮은 수용성, 불확정적인 전화량 및 독성에 기인한다.
게다가 표 3의 8-10 행과 1-7 행 및 11 행을 비교할 경우 덱스트란으로 도입되는 아미노기의 수치는 0 ℃ 또는 실온에서 커플링 반응(coupling reaction)이 수행될 때의 수치와 대략 같다.
D. CDAP를 사용한 콘쥬게이션 반응의 효율 증명 및 방사능이 표시된 단백질을 사용한 콘쥬게이션의 증명
CDAP를 사용한 콘쥬게이션 반응은 280 nm(단백질의 농도를 추정하기 위하여 통상적으로 사용되는 파장)에서 특별한 흡광도를 나타내므로 방사능이 표시된(radiolabeled) 단백질이 덱스트란에 직접 콘쥬게이션되었다. 이것은 단백질의 농도를 해당 단백질의 비활동도(specific activity)로부터 독립적으로 결정하는 것을 가능하게 한다. 단백질의 수율 및 회수율이 결정되었다.
1. BSA를 Brunswick 등이 기술한 것과 마찬가지의 방법으로 N-hydroxysuccinimide (3H-2,3) propionate (Amersham)을 이용하여 방사능 표지를 하였다. 방사능이 표지된 BSA를 PBS + 0.02 % 아지드로 완전히 투석하고, 응집물을 제거하기 위하여 S100HR 칼럼 (Pharmacia)에서 겔 여과 크로마토그래피를 실시하고, YM30 필터 (Amicon)를 사용한 한외여과(ultrafiltration)로서 농축하였다. BSA의 농도는 21 mg/㎖이었으며, 280 nm(44,000 M-1)에서의 흡광 계수(extinction coefficient)로부터 결정되었다. 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)에 의하여 결정된 저장 용액의 비활동도는 5.48 × 1012cpm/mole이었다.
2. 기타의 시약은 다음과 같다: T2000 덱스트란(약 2000 kDa)(Pharmacia)을물에 용해하여 10.5 mg/㎖의 농도로 하였다. CDAP는 건조 아세토니트릴을 사용하여 100 mg/㎖의 농도로 하였으며, 트리에탄올아민(TEA)은 물로서 0.2 M로 하였다. 글리신(pH 5.0)은 물을 사용하여 1 M로 준비하였다.
3. 프로토롤(protocol): 시약은 냉동 상태에서 보관되었으며, 모든 반응은 냉동상태에서 수행되었다. 첨가가 행하여질 때마다 반응 혼합물에 교반을 실시하였다. 25 ㎕의 CDAP를 0.5 ㎖(5.25 mg)의 덱스트란에 첨가하고 30초가 경과한 후 25 ㎕의 TEA를 첨가하였다. 전체적으로 2.5분이 경과한 후에 5.25 mg의 방사능 BSA를 첨가하였다. 30분이 경과한 후에 100 ㎕의 글리신 용액을 첨가함으로써 반응을 종결시키고, 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이중에서 0.6 ㎖를 취하여 Spin-X 멤브레인(COSTAR)을 사용하여 여과하였다. 여과 전과 여과 후의 방사능을 띤 상기에서 취해진 것을 비교한 결과 여액에서 방사능이 100 % 회수되었다.
500 ㎕의 여액이 식염수 +0.02 % 아지드를 사용하여 평형을 이룬 1 × 57 cm S400SF 겔 여과 칼럼(Pharmacia)에 0.2 ㎖/min의 속도로 적용되었다. 이중 0.89 ㎖를 취하여 분석하였다. 덱스트란의 농도는 480 nm에서의 흡광도를 사용한 Monsigny 등의 방법을 이용하여 결정하였다. 액체 섬광 계수를 사용하여 각 튜브에서 취해진 50 ㎕의 물질의 방사능을 결정하고, 활동도로써 (3H)BSA의 농도를 계산하였다. 칼럼 용출에서의 콘쥬게이션되지 않은 BSA의 포지션(position)은 독립적인 칼럼의 조작으로 결정하였다.
4. 제5도에서 볼 수 있듯이, cpm으로 나타낸 BSA의 많은 부분이 거대 분자량의 형태를 가지는데, 이것은 OD480으로 나타낸 덱스트란의 경우와 같은 포지션을 통과함을 나타낸다. 콘쥬게이트되지 않은 단백질을 나타내는 소량의 잉여 BSA 피크(peak)도 있다. 정제 데이터를 하기한 표 4에 나타내었다.
표 4
상기한 칼럼에서는 콘쥬게이트된 단백질로부터 덱스트란-BSA 콘쥬게이트가 완전하게 분리되지 않았다. 이러한 예는 자주 발생하는 것으로서, 거대분자량의 폴리머가 겔 여과 칼럼내에서 선광 찌꺼기(tailing)를 발생시키는 경우가 종종 있기 때문이다. 게다가, T2000 덱스트란은 분별되지 않았으므로, 크기에 대한 스펙트럼을 지니고 있다. 결합된 BSA 및 결합되지 않은 BSA가 중복된 영역에서의 콘쥬게이트션 BSA의 양을 추정하기 위하여, 덱스트란에 대하여 결합된 BSA의 일정한 비를 가정하였다. BSA:덱스트란의 비와 전체 덱스트란의 몰수를 곱하여 계산된 콘쥬게이트된 전체 BSA 양은 2.55 mg으로 추정되었다. 이것은 단백질의 87 %가 콘쥬게이트 형태로 전환되었음을 의미한다.
표 5
이러한 BSA-덱스트란 실험의 결과는 표 5의 1행에 요약하여 나타내었으며, CDAP 및 TEA의 양을 달리한 3 가지 실험 결과로 함께 나타내었다(2-4 행). 상기의 표에 나타난 TEA 및 CDAP의 양은 직접 콘쥬게이션을 통하여 탄수화물에 단백질의 비율을 최대한으로 하기 위한 양이다. 작은 양으로도 충분한 실험이 이루어질 수 있으므로 시약의 양을 최적화하기는 용이하다.
카르보디이미드(carbodiimide) 또는 헤테로리게이션(heteroligation) 커플링 방법과는 달리, 직접 콘쥬게이션 반응은 콘쥬게이션되지 않은 단백질을 변경하지 않으며, 가혹한 조건이 사용되지 않는다는 것은 매우 중요한 것이다. 그러므로 콘쥬게이션되지 않은 단백질을 쉽게 회수할 수 있다. 많은 단백질 항원이 매우 고가이므로, 이것은 직접 콘쥬게이션 방법의 주요한 장점으로 작용한다.
실시예 2
PT-Pn14 콘쥬게이트의 제조
본 실험의 목적은 (1) 저분자량의 형태에서 고분자량의 형태로 단백질이 전환되는 것은 탄수화물에 단백질이 직접 콘쥬게이션한 결과임을 증명하는 것 및 (2)특정한 조건에서 단백질을 콘쥬게이트하는데 필요한 시아닐레이팅 시약의 최소량을 결정하는 것이다.
백일해 톡소이드(PT)(Mass. Public Health Biol. Labs, Boston, MA 출처)를 0.5 M의 NaCl 및 pH 8.8의 0.02 M 나트륨포스페이트(NaPhosphate)에 용해하여 0.289 mg/㎖로 제조하였다. PT 1 ㎖에 대하여 0.1 M, pH 9.1의 소디움 보레이트 또는 0.75 M, pH 7.5의 HEPES 0.1 ㎖를 첨가하였다. Pneumococcal-type 14(Pn14)(ATTC lot 83909)를 0.15 M의 식염수 및 0.02 %의 아지드에 용해하여 5 mg/㎖로 제조하였다. 트리에틸아민(TEA)을 물에 용해하여 0.2 M이 되게 제조하였다. CDAP 아세토니트릴에 용해하여 100 mg/㎖ 또는 10 mg/㎖로 제조하였다(제조하여 -20 ℃의 온도에서 저장함). 1.0 M, pH 5.0의 글리신을 제조하였다. 아미노 에탄올 또는 기타의 아미노 시약으로 글리신/HCl을 대체할 수 있다.
실험 1 -백일해 톡소이드 및 Pn14의 콘쥬게이션
각 튜브는 250 ㎍(50 ㎕)의 Pn14를 냉동 상태로 보관하고 있다. 최초에 하기한 표에서와 같이 다양한 양의 CDAP를 첨가하고, 30 초가 지난 후 25 ㎕의 TEA를 첨가하였다. 2분이 경과한 후 1 ㎖의 PT를 첨가하였다. 약 1 시간이 경과한 후, 100 ㎕의 글리신 용액을 첨가하였다.
시료를 4 ℃의 온도에서 하룻밤 동안 보관하였다. 다음날, 상기 시료를 Costar 0.45 미크론 스핀 필터(spin filter)를 사용하여 여과하고, 0.2 M KCl의 HPLC TSK-겔 여과 칼럼에 적용하였다. % HMW는 콘쥬게이트되지 않은 모이어티를 가리키는 OD280 피크(peak)에 대하여 거대분자 OD280 콘쥬게이트 피크의 영역을 나타낸다. 이것은 공극 부피(void volume) 피크의 면적 백분율/(공극 부피 피크의 면적 백분율 + 콘쥬게이트되지 않은 모이어티 피크의 면적 백분율)로써 정의된다. 면적 백분율은 HPLC를 통과시킴으로써 얻어지며,다음과 같다.
표 6
PT 조절은 22 %의 % HMW를 가지므로, 반응 조건에서 야기되는 PT의 응집은 아주 소량일 수도 있다. 또한, 이러한 일련의 데이터는 CDAP에 대한 단백질의 비를 조절함으로써 최종 콘쥬게이트에서 탄수화물에 대한 단백질의 비를 조절할 수도 있다는 것을 가리킨다.
실험 2 -다당류 A 및 PT의 콘쥬게이션
본 실험에서는 Pn14 다당류를 대신하여 모노머인 10 mg/㎖의 글루코오스 용액 150 ㎕를 사용하였다. 보레이트를 대신하여 PT가 pH 7.5, 0.075 M의 HEPES 버퍼(buffer)에서 제조된 것을 제외하고는 실험 1과 유사한 조건이 사용되었다. 또한 TEA는 25 ㎕가 아니라 20 ㎕를 사용하였다. 이러한 조건은 다음과 같은 수율을 나타내었다.
제2번 및 제3번은 CDAP는 백일해 톡소이드 자체를 고분자화하는 것이 아님을 나타내며, PT가 거대분자 형태로 전환되는 것은 단백질의 고분자화에 기인한 것이 아니라 거대분자 다당류에 커플링하기 때문임을 보여준다. HLPC 실험에 의하면 PT 분자량의 미약한 변화 때문에 글루코오스가 PT에 콘쥬게이션됨이 명백하다.
실험 3-스페이서 A를 사용한 유용한 백신 구조의 합성:백일해 톡소이드-Pn14
헥산 디아민에 의하여 유도되는 Pn14는 다음과 같이 제조된다. 아세토니트릴에 대하여 100 mg/㎖로 용해된 CDAP 10 ㎕를 첨가하였다(100 kDa의 다당류에 대하여 193 몰의 CDAP). 30 초가 경과한 후 20 ㎕의 TEA(0.2 M)를 첨가하였다. 전체적으로 2.5 분이 경과한 후 0.1 M의 소디움 보레이트(pH 9.1)에 0.5 M, 300 ㎕의 헥산 디아민을 첨가하였다. 한시간이 경과한 후 상기 용액을 물을 사용하여 투석하고, 여과한 후 P6DG(BioRad) 칼럼을 사용하여 식염수로 탈염하였다. 공극 부피를 제거한 후 센트리콘 30 장치(Centricon 30 device)(Amicon)로써 고농도화 하였다. 이것은 100 kDa의 Pn14 다당류에 대하여 33 개의 아미노기를 가진 것으로 판명되었다.
백일해 톡소이드는 헤테로리게이션 화학(Brunswick 등)을 사용하여 아미노-Pn14에 콘쥬게이션되었다. 0.44 ㎖의 아미노-Pn14에 0.75 M, 50 ㎕의 HEPES 버퍼(pH 7.5)를 첨가하였다. 0.1 M, 10 ㎕의 STAP(iodoacetyl propionate N-hydroxy-succinimide)를 사용하여 상기를 요오드아세틸화하였다. 백일해 톡소이드를 20 배 과량 몰수의 SATA를 사용하여 티오화(thiolated)하였다. (Calbiochem, La Jolla, CA). 각각 식염수로 투석하여, 혼합한 후 0.75 M의 HEPES를 포함하는 1/9 부피의 버퍼, 10 mM의 EDTA 및 0.5 M의 히드록실아민을 첨가하였다. 최종 부피는 1.1 ㎖이었다. 상기 용액을 하룻밤 동안 방치한 후 0.2 mM의 머캅토에탄올(mercaptoethanol)에 1 시간 동안 처리하고, 10 mM의 요오드아세트아미드(iodoacetamide)에 10 분 동안 처리한 후 S400F 겔 여과 칼럼(Pharmacia)(제6도 참조)를 사용하여 분별하였다. 공극 부피 피크를 제거하고 PM10 멤버레인(Amicon)의 압력 필터를 이용하여 고농도화하였다. 약 50 %의 백일해 톡소이드가 콘쥬게이션의 형태로 회수되었다. 최종 콘쥬게이션은 Pn14 다당류 100 kDa에 대하여 0.7 몰의 PT를 함유하였다. 상기 콘쥬게이트에서의 단백질의 농도는 PR을 표준으로 사용한 Bradford 분석법(BioRad)으로 결정하였다. 다당류의 농도는 Pn14를 표준으로 사용한 Monsigny 등의 방법으로 결정하였다.
CTEA는 CDAP를 사용하는 경우에 비하여 부반응을 억제하는 장점이 있으며, 보다 고순도의 제품 생산이 가능한 장점이 있다(Kohn 등, Anal. Biochem, 115:375 (1981)). CTEA의 결점은 습기에 취약하기 때문에 밀폐된 용기에서 칭량하여야 하며, 저장 용액으로서 용이하게 제조될 수 없다는 것이다.
CTEA를 이용한 단백질 A 및 Pn14의 직접 콘쥬게이션
식염수에 대하여 5 mg/㎖로 용해된 Pneumococcal-type 14 다당류(Pn14) 1 ㎖를 0 ℃의 온도에서 저장한다. CTEA(Aldrich Chemical, Milwaukee, WI의 방법)을 건조 질소에 저장한다. 2 mg의 CTEA를 밀폐된 칭량 용기를 사용하여 칭랑한 후 격렬하게 혼합하면서 냉각시킨 Pn14에 첨가한다. 물을 사용하여 0.2 M로 맞춘 20 ㎕의 TEA를 혼합과 동시에 첨가한다. 60 초가 경과하면 상기의 교반된 용액에 5 mg의 백일해 톡소이드(1.5 mg/㎖)를 첨가한다. 1 시간 30 분이 경과한 후 pH 5.0, 1 M, 200 ㎕의 글리신을 첨가하여 반응을 종결한다. 1 시간이 경과한 후 상기 용액을 여과하고, S400SF 겔 여과 칼럼을 통과시키고, 식염수로 평형을 유지한다. 공극 부피 피크를 측정하고, 무균 여과한다. 1:1의 콘쥬게이트가 제조한다.
CTEA를 이용한
Pneumococcal
Type 14 다당류에 스페이서 시약의 첨가
식염수에 대하여 5 mg/㎖로 용해된 Pn14 1 ㎖를 0 ℃의 온도에서 저장한다.
CTEA(Aldrich Chemical, Milwaukee, WI의 방법)을 건조 질소에 저장한다. 1 mg의 CTEA를 밀폐된 칭량 용기를 사용하여 칭량한 후 격렬하게 혼합하면서 냉각시킨 Pn14에 첨가한다. 물을 사용하여 0.2 M로 맞춘 20 ㎕의 TEA를 혼합과 동시에 첨가한다. 60 초가 경과하면, 교반을 행하면서 pH 9, 0.1 M의 보레이트에 0.5 M로 맞춘 헥산 디아민 300 ㎕를 첨가한다. 1 시간이 경과한 후 상기 용액을 식염수로 완전히 투석하고, 무균 여과한다. 100 kDa의 Pn14에 대하여 187몰의 CTEA의 비로서 사용되었기 때문에 100 kDa의 Pn14에 대하여 약 18 개의 아민을 가진 콘쥬게이트가 생성되었다.
실시예 3
백일해 톡소이드 및 Haemophilus Influenzae 다당류(PRP)의 직접 콘쥬게이션
Massachusetts Public Health Biological Laboratory로부터 평균 분자량(MW)이 350 kDa인 PRP를 얻었다. 백일해 톡소이드도 상기 연구소에서 얻어졌다. 15 ㎕의 CDAP(100 mg/㎖)를 100 ㎕(2 mg)의 PRP에 냉동 상태로 첨가하였다. 30 초가 경과한 후, 30 ㎕의 TEA를 첨가하였다. 이것은 100 kDa의 PRP에 대하여 CDAP가 319 몰임을 의미한다. 2 분이 경과한 후에 0.75 ㎖의 백일해 톡소이드(1.1 mg)를 첨가하였다. 40분이 경과한 후 1 M의 글리신(pH 5.0)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 1 시간이 경과한 후 상기 용액을 식염수로 균형을 맞춘(제7도 참조) S400SF 겔 여과 칼럼을 통과시켰다. 공극 부피를 제거하고, 무균 여과하였다. 제조된 제품은 100 kDa의 PRP에 대하여 1.1의 PT를 가지고 있었으며, 전체 수율은 68 %인 것으로 밝혀졌다.
100 kDa의 PRP에 대하여 377 몰의 시아노겐 브로마이드가 사용된 Chu 등, Inf. & Imm., 40:245 (1983)에 의하여 제조된 백신은 100 kDa의 PRP에 대하여 1.4 내지 2.1 의 PT 비를 가지며, 수율은 50 % 미만이었다. 그러므로, 본 발명에 의한 직접 콘쥬게이션 방법은 거의 유사한 콘쥬게이트를 생성하지만, 보다 적은 노력으로 보다 큰 수율을 얻을 수 있으며, 독성이 있는 시약을 사용하지 않는다.
종래 기술들 중에서 PRP 콘쥬게이트를 제조하기 위한 전형적인 방법은 스페이서로부터 유도된 PRP로부터 시작하는 것인데(Chu 등, Schneerson 등, J. Exp. Med., 152:361 (1980): Dick & Beurret, "Glycoconjugates of BacterialCarbohydrate Antigens," Conjugate Vaccines, J.M. Cruse & R.E. Lewis (eds.), Vol. 10, pp. 48-114 (1989)), 스페이서를 PRP에 첨가하기 위하여 CDAP도 사용되었다.
사용된 조건은 상기에서 기술하였지만, 백일해 톡소이드 대신에 0.1 M의 보레이트에 대하여 0.1 M의 헥산 디아민 100 ㎕를 첨가하였다. 제조된 제품은 식염수로 투석하였다. 100 kDa의 PRP에 대하여 102 개의 아미노기를 가진 것으로 밝혀졌다. 이것은 현재까지 밝혀진 방법보다 향상된 비이므로 때문에 적은 양의 CDAP가 사용될 수도 있다
실시예 4
CDAP 화학을 사용하여 제조되는 백신으로서의 유용성을 갖는 면역원성 구조제의 제조
A. CDAP 및 A 이관능성 시약을 사용한 콘쥬게이션
간단히 말하면, 말라리아에서 추출된 펩티드 P28, 생식세초 특이(gamete-specific) 단백질 pfs25로부터 얻어지는 CNIGKPNVQDDQNK를 파상풍 톡소이드(TT)에 콘쥬게이트하였다. P28은 말라리아 전달 차단 항원을 유도하는 것으로 알려져 왔다. 그리고 CDAP는 p28-TT와Pneumococcal-type 14 (Pn14) 다당류를 커플링하는데 사용되어 왔다.
FDA의 승인을 받은 파상풍 톡소이드는 하룻밤 동안 HEPES 버퍼로 투석되고, 30배 과량 몰수의 요오드아세틸레이팅 시약(iodoacetylating agent : SIAP)과 반응시켰다. 3 시간이 경과한 후 Macrosep 30 (Filtron Technology)을 사용한 한외여과를 통하여 시약을 제거한 후 0.15 M, pH 7.5의 신선한 HEPES 버퍼를 사용하여 세척하였다. 부드럽게 교반을 실시하면서. 삼중수소(tritium)로 방사능 처리된 P28을 유도된 TT에 고체 상태로 첨가하였다. 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 반응을 실시한 후 혼합물을 0.2 mM의 머캅토에탄올로 처리하여 잔유 활성기(remaining group)를 차단하였다. 그리고 HEPES 버퍼로써 평형이 유지된 P6DR 칼럼으로 탈염하였다. 펩티드의 비활동도로부터 상기 제품은 TT 단위몰에 대하여 20 몰의 P28 펩티드를 함유하고 있는 것을 알 수 있었다. 상기 콘쥬게이트를 식염수로 탈염하여, 무균 여과하였다.
B. CDAP를 사용한 직접 콘쥬게이션
Pn14(American Tissue Type Collection에 의하여 얻어짐)는 거대분자량(약 106dalton)을 가진다. 다음과 같은 방법으로 P28-TT는 Pn14에 직접 콘쥬게이션된다. CDAP(100 mg/㎖의 아세토니트릴 저장 용액으로부터 10 ㎕를 취함)를 Pn14(150 ㎕의 식염수에 대하여 1.1 mg)에 첨가한다. 30 초가 경과한 후 20 ㎕의 트리에틸아민(0.2 M)을 첨가하였다. 2분이 경과한 후 0.55 mg의 P28-TT(0.8 ㎖의 식염수에 대하여)를 첨가하고, 1 시간이 경과하면 1.0 M의 글리신(pH 5) 200 ㎕를 첨가하여 1 시간 동안 방치함으로써 반응을 종결시켰다. 상기의 콘쥬게이트는 식염수에 의하여 평형이 유지된 S400SF 겔 여과 칼럼을 통과시키고, 콘쥬게이트를 함유하는 공극 부피를 제거하였다.
제9도는 실제적으로 모든 P28-TT가 콘쥬게이트 형태로 공극 부피에서 발견되는 것을 나타낸다.
C. 면역원성 구조체의 면역활성
DBA/2 쥐 다섯 마리로 이루어진 군을 10 ㎍의 P28-TT 또는 (P28-TT)-Pn14 콘쥬게이트를 사용하여 정맥 주사하여 면역시켰다. 3주가 경과한 후 혈액을 채취하고, ELISA를 이용하여 혈청을 분석함으로써 재조합된 pfs25 단백질에 대한 반응성을 조사하였다. 펩티드 P28은 pfs25 단백질로부터 유도된다. 다른 군의 쥐들을 애쥬번트인 알럼(Imject, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)이 침전된 동일한 항원을 사용하여 면역시켰다.
기타의 관련되는 출원과 일관성을 유지하기 위하여, 표 7에는 바람직한 항단백질 수치를 나타내는 거대분자량 콘쥬게이트만을 나타내었다.
표 7
상기에 의하여 CDAP 방법이 유용한 백신 구조를 제조할 수 있음을 알 수 있다. 또한 유용한 콘쥬게이트가 용이하게 제조될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5
CDAP를 사용하여 생물학적 활성을 지는 다원자가 단백질 구조체의 제조
다당류에 단백질을 직접 커플링하기 위하여 CDAP를 사용하여 제조된 콘쥬게이트는 다원자가(multivalent)의 제품(관련 출원에서는 이러한 제품은 향상된 면역원성을 가진다고 함)을 제조할 수 있다는 것과 이러한 공정은 생물학적인 활성을 보전할 수 있을 만큼의 가혹하지 않은 조건에서 수행될 수 있다는 것을 증명하기 위하여 덱스트란과 함께 단클론성(monoclonal) 항체의 다양한 형태의 콘쥬게이트를 제조하였다. 이러한 실험은 B 림프구(lymphocytes)상에 멤브레인 IgD를 가교결합하는 항-IgD 항체와 단클론성 항체 Hδa/1을 사용하며, 과증식을 유도한다(Brunswick 등,journal of Immunol.,140:3364 (1988)). Brunswick 등이 기술하였듯이, Hδa/1의 다중 복제체(multiple copy)가 2000 kDa의 덱스트란과 같이 거대분자량의 폴리머에 콘쥬게이션되는 것은 1000 배 낮은 농도에서의 B 세포 과증식을 일으키며, 콘쥬게이트되지 않은 Hδa/1에 비하여 높은 수준의 과증식을 유발하였다. Brunswick 등의 기술에서는 콘쥬게이트를 제조하기 위하여 간단하고, 직접적이지만 여러 단계를 며칠 동안에 걸쳐서 수행할 것이 요구된다. 우선, 아미노에틸 카르복시메틸 덱스트란(AECM dextran)은 Brunswick 등이 기술한 바와 동일한 방법으로 제조되며, Hδa/1을 탄수화물에 커플링하기 위해서는 헤테로리게이션 화학이 사용되었다.
CDAP를 사용한 직접 콘쥬게이션의 방법과 스페이서 및 CDAP를 사용한 간접 콘쥬게이션 방법으로 Hδa/1-덱스트란을 다음과 같이 제조하였다.
직접 콘쥬게이션: 15 ㎕의 CDAP(아세토니트릴 1 ㎖에 대하여 100 mg 존재하는 저장 용액에서 취함)를 0.3 ㎖ 식염수에 3.2 mg 존재하는 T2000덱스트란(Pharmacia)에 첨가하였다. 30초가 경과한 후 교반을 실시하면서 0.2 M, 15 ㎕의 TEA를 첨가하였다. 2 분이 추가로 경과한 후 부드럽게 교반을 실시하면서 6 mg의 Hδa/1(0.05 M, 362 ㎕의 소디움 보레이트 및 0.075 M의 NaCl에 용해되어 있음)을 첨가하였다. 15분이 경과한 후,상기의 반응 혼합물에 1.0 M, 100 ㎕의 글리세린(pH 5.0)을 첨가함으로써 반응을 종결하고, 상기 혼합물을 식염수로 평형이 유지된 S400SF 겔 여과 칼럼(1 × 59 cm)을 통과시켰다. 제9도에 이러한 칼럼 용출을 나타내었다. 공극 부피 피크를 제거하고 Millex GV 여과 장치를 사용하여 무균 여과하였다. 이렇게 제조된 것을 Hδa/1-(CDAP)-덱스트란이라 칭한다. 상기와 같은 공정은 약 3시간이 소요된다.
스페이서: 상기와 같은 방법으로 CDAP로써 덱스트란을 활성화하였다(3 ㎖의 식염수에 존재하는 31.5 mg의 T2000 덱스트란 및 25 ㎕의 CDAP, 25 ㎕의 TEA, 0.05 몰의 글루코오스 모노머에 대하여 1 몰의 CDAP). 0.1 M의 소디움 보레이트에 존재하는 0.5 M의 1,6-디아미노헥산 3㎖를 첨가하였다. 상기 용액을 물로써 완전히 투석한 후 S400HR 겔 여과 칼럼으로 분별하였다. 공극 부피를 제거하고 고농도화하였다. 아미노-덱스트란은 2000 kDa의 덱스트란에 대하여 147개의 아미노기를 가진 것으로 밝혀졌다. 이와 같이 제조된 것을 NH2-(CDAP)-덱스트란이라 칭한다. 분석하는 절차를 포함하여, 상기와 같은 공정에는 2 일이 소요된다. 반대로, Brunswick등의 방법에 의한 AECM-덱스트란을 제조하기 위해서는 약 1 주일이 소요된다.
Brunswick 등이 기술한 바 있는 헤테로리게이션 기술을 사용하여 Hδa/1를 AECM-덱스트란 및 NH2-(CDAP)-덱스트란에 콘쥬게이션하였다. 이러한 콘쥬게이트를 각각 Hδa/1-AECM-덱스트란 및 Hδa/1-NH2-(CDAP)-덱스트란이라 칭한다. AECM-덱스트란을 사용한 콘쥬게이션은 2 일이 소요된다.
Brunswick 등이 기술한 바와 마찬가지로, 웰(well)당 10,000개의 세포를 사용하여 B 세포 증식 분석을 실시하였다. 이러한 분석 결과를 표 8에 나타내었으며, 특별히 삼중수소로 처리된 티미딘(thymidine)을 B 세포로 도입 결과(min/well)를 나타내었다.
표 8
나타나지 않은 것: Brunswick 등이 보고한 바와 마찬가지로 Hδa/1 독자적으로는 상기와 같은 농도에서 도입이 이루어지지 않는다. 10-100 ㎍/㎖ Hδa/1에서 최대의 도입이 이루어졌는데 약 3000 cpm이다.
이러한 데이터에서 스페이서의 사용 유무에 관계없이 CDAP를 사용하여 제조된 콘쥬게이트는 증식을 유도하는 능력에 있어서 Hδa/1-AECM과 본질적으로 동일하다는 것을 보여준다. 단지 다원자가의 항체가 낮은 사용량으로도 높은 증식을 유도하므로, 모든 콘쥬게이트는 다원자가를 가져야만 한다. 그러므로 CDAP를 사용한 직접 콘쥬게이션은 항체의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다. 직접 콘쥬게이션 과정은 스페이서를 사용한 콘쥬게이션의 제조 과정에 비하여 현저하게 빠르게 진행되었다. 게다가, 스페이서의 첨가 및 CDAP를 사용한 콘쥬게이션은 AECM 덱스트란의 제조와 비교해 볼 경우에 아주 빠른 속도로 진행되었다.
그러므로,본 실험은 (1) CDAP를 이용한 다원자가 구조를 제조하는 높은 수율 (2) 용이하고 신속한 콘쥬게이트, 특히 직접 콘쥬게이트의 제조를 보여준다. CDAP 및 이관능성 시약을 사용한 콘쥬게이션은 48 시간 이하의 시간이 소요되었으며, 직접 콘쥬게이션은 3 시간 이하의 시간이 소요되었다.
당해 분야에서 숙련된 자라면 본 발명의 기술적 범위를 벗어나지 않고서도 본 발명의 면역원성 구조의 제조 방법을 다양하게 변경할 수 있을 것이다.
당해 분야에서 숙련된 자라면 본 발명의 명세서 및 실시예를 참고하여 본 발명에서 기술한 실시예 이외의 실시예를 구성할 수도 있을 것이다. 본 발명의 명세서 및 각 예들은 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 범위와 기술적 사상은 하기한 특허 청구의 범위에서 나타내었다.
Claims (11)
- 면역원성 구조체 및 약제학적으로 허용가능한 매체 또는 담체를 포함하는 백신의 제조 방법에 있어서,상기 면역원성 구조체는a) 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리디늄 테트라플루오로보레이트 및 N-시아노트리에틸-암모늄 테트라플루오로보레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 시아닐레이팅 시약을 사용하여 최소한 하나의 제1 탄수화물 함유 모이어티를 활성화하는 단계; 및b) 상기 활성화된 탄수화물 함유 모이어티를 제2 모이어티에 공유적으로 결합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 백신의 제조 방법.
- 면역원성 구조체 및 약제학적으로 허용가능한 매체 또는 담체를 포함하는 백신의 제조 방법에 있어서,상기 면역원성 구조체는a) 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리디늄 테트라플루오로보레이트 및 N-시아노트리에틸-암모늄 테트라플루오로보레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 시아닐레이팅 시약을 사용하여 최소한 하나의 제1 탄수화물 함유 모이어티를 활성화하는 단계;b) 상기 제1 모이어티를 이관능성 스페이서 시약에 공유적으로 결합하는 단계; 및c) 제2 모이어티를 상기 단계 b)의 상기 이관능성 스페이서 시약과 공유적으로 결합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 백신의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유기 시아닐레이팅 시약이 CDAP, CTEA 및 pNPC로 이루어진 군에서 선택되는 백신의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 면역원성 구조체가 이중 담체 구조체인 백신의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이관능성 시약이 에틸렌디아민, 1,6-헥산 디아민, 아디픽 디히드라지드, 시스타민, 글리신 및 리신으로 이루어진 군에서 선택되는 백신의 제조 방법.
- 면역원성 구조체가 이중 담체 면역원성 구조체인 제1항 또는 제2항의 제조방법으로 제조되는 백신.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 모이어티가 덱스트란,Pneumococcal다당류, Haemophilus influenzae 다당류, 바이러스성 다당류 및 박테리아성 다당류로 이루어진 군에서 선택되는 백신의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 모이어티가 BSA, 백일해 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 말라리아 유도 펩티드 P28, 항체, 톡소이드 및 독소로 이루어진 군에서 선택되는 백신의 제조 방법.
- 면역원성 구조체가 PT-Pn14, PT-PRP20, TT-Pn14, Hδa/1-덱스트란 및 P28-TT-Pn14로 이루어진 군에서 선택되는, 제1항 또는 제2항의 제조방법으로 제조되는 백신.
- 면역 반응의 생성방법에 있어서,(a) 면역원성 구조체 및 약제학적으로 허용가능한 매체 또는 담체를 포함하는 백신을 제조하는 단계-여기서 면역원성 구조체는i) 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리디늄 테트라플루오로보레이트 및 N-시아노트리에틸-암모늄 테트라플루오로보레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 시아닐레이팅 시약을 사용하여 최소한 하나의 제1 탄수화물 함유 모이어티를 활성화하는 단계, 및ii) 상기 활성화된 탄수화물 함유 모이어티를 제2 모이어티에 공유적으로 결합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조됨-; 및(b) 상기 백신을 인간을 제외한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 생성 방법.
- 면역 반응의 생성방법에 있어서,(a) 면역원성 구조체 및 약제학적으로 허용가능한 매체 또는 담체를 포함하는 백신을 제조하는 단계-여기서 면역원성 구조체는i) 1-시아노-4-(디메틸아미노)피리디늄 테트라플루오로보레이트 및 N-시아노트리에틸-암모늄 테트라플루오로보레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 시아닐레이팅 시약을 사용하여 최소한 하나의 제1 탄수화물 함유 모이어티를 활성화하는 단계;ii) 상기 제1 모이어티를 이관능성 스페이서 시약에 공유적으로 결합하는 단계; 및iii) 상기 단계 ii)의 상기 이관능성 스페이서 시약에 제2 모이어티를 공유적으로 결합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조됨-; 및(b) 상기 백신을 인간을 제외한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 생성 방법.
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