JPH0271153A - 肝臓癌疾患の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はコラゲナーゼインヒビターを定量することによ
り肝臓癌疾患を診断する方法に関するものである。さら
に詳しくは、本発明はウシコラゲナーゼインヒビター（
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ：
ＴＩＭＰ）に対するモノクローナル抗体を用いるサンド
イッチ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒトコラゲ
ナーゼインヒビターの測定法を手段とし、肝臓癌疾患患
者の血清中、血漿中あるいは関節液中のコラゲナーゼイ
ンヒビター量がそれぞれ健常人の血清中、血漿中あるい
は関節液中のコラゲナーゼインヒビター量に比べて明ら
かに高い値を示すことに基づいて肝臓癌疾患の診断を行
う方法に関するものである。

〔背景技術〕

コラゲナーゼインヒビターは、ヒトおよびその他の動物
の骨、皮膚、歯髄、羊水、血液、関節液中および関節軟
骨細胞、滑液細胞、各種組織由来線維芽細胞、線維肉腫
細胞培養液中に存在することが知られている。コラゲナ
ーゼインヒビター量を測定する手段としては、従来、そ
の生物活性を測定することによる方法が知られている。

しかし、Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍａｄ、　７５
．２５８〜２６３　（１９７３）にＥｉｓｅｎらが、ま
た、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ
　２７．２８５〜２９０（１９８４）にＣａｗｓ　ｔｏ
ｎらが記載しているように、血清中、血漿中あるいは関
節液中のコラゲナーゼインヒビター活性を測定するには
、それらの液中に、その測定を妨害する蛋白質、たとえ
ば、α２−マクログロブリンが存在するため、従来知ら
れている創意方法によっては、その測定は不可能である
。半周、岩田らは、先に、ウシコラゲナーゼインヒビタ
ーに対する七ツクローナル抗体を用い、サンドイッチ法
に基づく酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）を行うことによ
り微量の試料で精度良く、簡便かつ迅速にコラゲナーゼ
インヒビターを特異的に定量する方法を開発したが（特
願昭６２−４２７８１号）、本発明者らは、ヒト血清中
、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量が、肝臓癌疾患にかかることにより明らかに
増加することを発見し、血清中、血漿中あるいは関節液
中に存在するコラゲナーゼインヒビターの量を上記の酵
素免疫学的測定法により測定することによって、肝臓癌
疾患の診断を行い得ることを見出した。

〔発明の闘示〕

本発明は、上述の如き知見に基づいてなされたものであ
って固相単体に結合させる抗体および酵素標識を付与す
る抗体としてウシコラゲナーゼインヒビターの異なる抗
原決定基に対し特異的に結合する２種類のモノクローナ
ル抗体の組み合わせを用いて、サンドイツチ法により酵
素抗体免疫学的測定法を行うことにより、血清中、血漿
中めるいは関節液中に存在するヒトコラゲナーゼインヒ
ビターを定量し、その定量値を健常人の示す値と比較す
ることにより、被測定者が肝臓癌疾患にかかっているか
否かを診断する方法を提供するものである。

本発明者らは、ウシ歯髄の培養外液から精製したコラゲ
ナーゼインヒビターを含む溶液をＢａ１ｂ／ｃマウスの
腹腔内に投与することにより免疫した後、そのマウスの
び臓細胞を分離した。

そのひ臓細胞と８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞Ｎ
５−１とを５＝１の割合で混合し、５０％ポリエチレン
グリコール４０００中で融合させることによりハイブリ
ドーマを得た。ポリスチレン製９６六マイクロウエルに
各ウェル当たり６．ＯＸ　１０’個となるように得られ
たハイブリドーマを分散した後、ＨＡＴ培地中で培養し
た。各ウェルの培養液中にウシ歯髄コラゲナーゼインヒ
ビターに対する抗体が産生されているか否かを固相−抗
体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）によりチエツクし、それ
が陽性であるウェル中のハイブリドーマを限界希釈法に
よりクローニングした。その結果、ウシ歯髄コラゲナー
ゼインヒビターに対するモノクローナル抗体を産生ずる
１７種類のモノクローンを得、その各モノクローンをＢ
ａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内に投与することにより、モノ
クローナル抗体を含む腹水を得た。その腹水から硫酸ア
ンモニウムによる塩析分別、ＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｃ
ｅ　ｌによるイオン交換クロマトグラフィーおよび５ｅ
ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００５ｕｐｅｒｆｉｎｅによる
ゲルろ過クロマトグラフィーなどによってモノクローナ
ル抗体を精製しＩ；。上記の如く精製した１７種類のモ
ノクローナル抗体いずれもウシコラゲナーゼインヒビタ
ーと特異的に交叉したが、それらのなかの４種類のモノ
クローナル抗体、すなわち、ＩｇＧ（クローン７−６Ｃ
１）　、ＩｇＧ（クローン７−１９Ｆ６）、［ｇＧ　（
クローン７−２１８１２）およびＩｇＧ（クローン７２
３Ｇ９）がヒトコラゲナーゼインヒビターとも反応する
ことをウェスタンブロッティングによって明らかにした
。これら４種類のモノクローナル抗体のうち２種類のモ
ノクローナル抗体、すなわち、ＩｇＧ（クローン７−２
３Ｇ９）を固相用抗体とし、ＩｇＧ（クローン７−６Ｃ
Ｉ）から調製したＦａｂ’（クローン７−６Ｃ１）　−
ＰＯＤ複合体を標識抗体として用いたサンドイツチ法に
基づ＜ＥＩＡを行うことにより、ヒトコラゲナーゼイン
ヒビターを微量（１，５１）９）で、特異的に、精度良
く、定量することができた。このサンドイツチ法を用い
て、健常人血清５０検体中のコラゲナーゼインヒビター
を定量したところ、血清１ｍＯ，当たり１８４±３０ｎ
ｇのコラゲナーゼインヒビターが存在することがわかっ
た。一方、原発性肝臓癌患者血清ｌＯＯ検体検討中び転
移性肝臓癌患者血清３検体中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビター量は血清１ｎ（２当たりそれぞれ平均４８６
±３１６ｎｇおよび１１７２±７１２ｎｇであり、これ
らの値は健常人血清中に存在するその値に比べて明らか
に高い。一方、肝硬変患者血清４６検体、慢性活動性肝
炎患者血清４５検体および慢性非活動性肝炎患者血清２
６検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は血
清１ｍＱ当たりそれぞれ平均２２８±１６３ｎｇ、２３
３±８８ｎｇおよび１６６±７３ｎｇであり、健常人血
清中に存在するその量と比べて有意の差は認められなか
った。従って、種々の肝臓病患者中でも肝臓癌患者にお
ける血清中での特異的に高いコラゲナーゼインヒビター
の量に着目して、患者血清中のコラゲナーゼインヒビタ
ー量を測定することにより、その患者が、肝臓癌患者で
あるか否かを診断することができることになることが判
った。また・、健常人血漿２６検体中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの量は血漿１　ｍＱ当たり６４±ｌＯｎｇで
あるのに対し、厘発性肝臓癌患者８検体中に存在するコ
ラゲナーゼインヒビター量は血漿’１ｍＱ当たり５８３
±４４７ｎｇであり、健常人血漿中に存在するその値に
比べて明らかに高いことか認められた。

ただし、血清中あるいは血漿中に存在するコラゲナーゼ
インヒビター量増加の現象は、肝臓癌患者以外に慢性関
節リウマチ疾患患者についても認められるので、この血
清中のコラゲナーゼインヒビターの測定を、肝機能判定
法であるＺＴＴ　（硫酸亜鉛混濁反応）　、ＧＯＴ　（
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ　
（グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ）、ＡＬＰ
（アルカリ性フォスファターゼ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素
酵素）、γ−ＧＰＴ　（γ−グルタミルトランスペフチ
ダーゼ）、ＰＨ（プロリルハイドロキシラーゼ）および
ＡＦＰ（α−フェトプロティン）などの測定と併用する
ことにより、被測定者の肝臓筋の罹患の有無を診断する
ことができるのである。

本発明方法においては上記の酵素免疫学的測定法が用い
られるが、固相単体として抗原や抗体を受動的に良く吸
着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロ
ピレン類、あるいはポリビニール製のポール、マイクロ
プレート、スティック、試験管などの種々の材料および
使用形態が任意に選択、使用できる。一方、酵素漂識を
付与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、ＤＥ
ＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌの如き陰イオン交換ゲルによ
り精製したＩｇＧ画分、さらにはペプシン消化後、還元
して得られる特異的結合部分Ｆａｂ’を用いることもで
きる。

前述のとおり、本発明方法は、固相単体に結合させる抗
体および酵素標識を付与する抗体として、コラゲナーゼ
インヒビターの異なる抗原決定基に対し、特異的に結合
する２種類のモノクローナル抗体の組み合わせを用いた
固相抗体酵素免疫学的測定法に基づいたヒトコラゲナー
ゼインヒビターの定量を行い、その結果を、健常人の値
と比較することによって、被測定者が、肝臓癌疾患にか
かっているか否かを診断するものである。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例　ｌ 抗ウシコラゲナーゼインヒビターモノクローナル抗体の
作製 （ａ）抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 Ｊ、　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９６．３９５−４０４（１
９８４）に記載の本発明者らの方法に従いウシ未萌出知
歯の根部歯髄をイーグルＭＥＭ培地（日本製薬製）で培
養した培養外液からＣｏｎ　Ａ−セファロース、ウシト
ロゲルＡｃＡ　４４およびＤＥ−５２セルロースの各カ
ラムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精製した。

精製インヒビターはＪ、　　Ｍａｔ、　　Ｂｉｏｌ、　
　随、５７９〜５９９（１９７３）に記載のＬａｅｍｍ
　ｌ　ｉらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）で調
べたところ分子量約３２．０００ダルトン（Ｄ）の単一
バンドを示した。

（ｂ）抗体産生細胞の調製 ６週令のＢａ１ｂ／ｃ雌マウス２匹をまず７０インド完
全アジユバント中で、前記（ａ）で記述した精製ウシコ
ラゲナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそれ
ぞれ４８μ９のウシコラゲナーゼインヒビターを０．４
ｍαの溶液として腹腔的投与する。さらに３０日目に生
理食塩水に溶解した８４μりのウシコラゲナーゼインヒ
ビターを追加免疫する。最終免疫として５８日目に腹腔
的投与（９５μｇ／　５００μＱ生理食塩水）により補
助免疫し、３日後にマウス膵臓を取り出し、肺細胞を調
製する。

（ｃ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。

ＲＰ！Ｊｌ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ｎｏ、　１６
４０（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）に重
炭酸ナトリウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（
ｌ　ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧ
カリウム（５０Ｕ／　ｍＱ）、ｔｉｌｔ　酸ストレプト
マイシン（５０μｇ／ｍ（２）、および硫酸アミカシン
（１００μｇ／　ｍ＋２）を加え、ドライアイスでｐＨ
ヲ７．２にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで
除菌濾過する。

Ｎ５−１培地：上記ＲＰＩＪＩ　１６４０培地に除菌濾
過した仔牛脂児血清（Ｍ、　　Ａ、　　Ｂｉｏｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ）を１５％（Ｖ／　Ｖ）の濃度に加える。

ＰＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４，０００　（ＰＥＧ　４．０
００、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、。

Ｉｎｃ、）　５０％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＮＳ−１（Ｐ３−
ＮＳＩ−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏ
ｄ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅ
ｄ、　Ｂ、　Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄＳ、Ｍ、　
Ｓｈｉｉｇｉ）　、Ｗ、　Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ
　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１−３７２＋：記
載ノｏＩラノ方法ヲ若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核膵臓細胞（生細胞率１
００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５
＝１の割合で融合する。膵臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のＲＰＭＩ　　１６４０培地で洗浄する。次に
同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合
する。容量５０ｍＱの円錐形スチロール膚脂製試験管（
Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）を用い、４０ｍＱのＲＰＭ［
１６４０培地中４００Ｘ９．１０分間遠心し、上溝を完
全に吸出する。沈澱細胞に３７°Ｃ加温ＰＥＧ　４，０
００溶液［，３ｍαを穏やかに撹拌しながら１分間で滴
下し、さらに１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる
。次に３７°Ｃ加温ＲＰＭＩ　１６４０培地１．３ｍＱ
を１分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返した後
、同培地９ｍαを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し
細胞を分散させる。これを４００Ｘｙ、１０分間遠心分
離し、上溝を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細胞に
３７°Ｃ加温ＭＳ−１培地１２．９ｍ１２をすみやかに
加え、細胞の大きい塊りをｌＯｍＱのピペットを用いて
注意深くピペッティングして分散する。さらに同培地２
６＋＋ＩＱを加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイ
クロウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）にウェル当り６
．ＯＸ　１０’個１０．１ｍＱの細胞を加える。なお、
この時使用する９６六マイクロウエルは前旭理として０
．２ｍＱのＭＳ−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（３
７℃）で−晩保温し、使用時に培地を吸引除去しておく
。細胞を加えた上記のマイクロウェルを７％炭酸ガス／
９３％空気中で温度３７°Ｃ１湿度１００％下に培養に
付する。

（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。

ＨＡＴ培地：前記（Ｃ）で述べたＮ５−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０，
４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

（２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１８目）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｒｎα
）を加える。２．３．５．８．１１日目に培地の半分（
０，１ｍ＋２）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日
目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。

以降３〜４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換
える。通常２〜３週間で充分なハイブリドーマの生育が
観察される。ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項
（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウェルをチエツクする。次にフィーダーとして
１０’個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｆｆをポ
リスチレン製２４穴セルウエル（Ｉｖａｋｉ　Ｇｌａｓ
ｓ）に加えたものを用い、上記で検出された各陽性ハイ
ブリドーマの全内容物を移す。これを前記（ｃ）におけ
ると同様に７％炭酸ガス存在下、３７°Ｃで約１週間培
養に付する。その間１〜２回各ウェルの上清０．５ｍα
を新しいＨＴ培地０．５ｍＱと交換する。ハイブリドー
マの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確
認し、それぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法に
よるクローニングを行う。なお、クローニングに使用後
の残液をポリスチレン製２５ｃｍ２組織培養フラスコ（
Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ）に移し、凍結保存用試料を調
製する。

（ｅ）固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）による抗つ
ンコラゲナーゼインヒビター抗体産生ハイブリドーマの
検索 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５〜２１
４（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干
改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレー／ヨン
プレ−）　（ＦＩＯＷ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　
　Ｉｎｃ、）を０．５−１．０μ９のウシコラゲナーゼ
インヒビターでコートし、次に、未コート部分を１％牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックする。これに前記
（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウェルの上清の一
部を加えて室温で約１時間インキュベートする。２次抗
体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン（ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加え、
さらに室温で約１時間インキュベートする。次に過酸化
水素と基質であるｏ−フェニレンジアミンを加え生成し
た褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコ
ロナ２波長マイクロプレート光度計（ＭＴＰ−２２、コ
ロナ電気社）を用いて５００ｎｍの吸光度を測定する。

（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。Ｎ５−１培地ｍα当りフィー
ダーとして１０′＠のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、９６六マイクロウエルの３６ウエル、
３６ウエルおよび２４ウエルにウェル当り５個、１個お
よび０．５個のハイブリドーマをカロえる。５日目、１
２２日目全ウェルに各約０．１ｍ＋２のＮ５−１培地を
追加する。クローニング開始後１４〜１５Ｅ３で充分な
ハイブリドーマの生育が認められ、コロニ形成陰性ウェ
ルが５０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行う。

テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル
中のコロニー数を確認し、ウェル中に１コロニーが確認
されたウェルを４〜６個選び再クローニングする。最終
的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドー１１フ株が得られた。

（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをＮ５
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白質濃度は１０〜１００μｇ／ｍＱである）。一
方、大量に抗体を得るためには肺細胞とミエローマ細胞
の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ、マウス）に腫
瘍形成促進剤ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ
１社）をマウス−匹当たりＱ、５ｍ１２腹腔内投与し、
１〜３週間後に、各ハイブリドーマｌＸｌ０’個を同じ
く腹腔内投与することにより生体内で、さらに、１〜２
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７ｍｇ／
ｍＱの腹水を得ることができる。

（ｈ）モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖及びアイソタイ
プ 前記（ｇ）で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナー
ゼインヒビターをコートしたミクロタイトレージョンプ
レートに前述したＥＬＩＳＡ法に従って結合させる。Ｐ
ＢＳによる洗浄後火に、アイソタイプ特異的ウサギ抗マ
ウスＩｇ抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒ　１ｅｓ
）を加える。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ　）抗体を加
え、基質として２．２′−アジノージ（３−エチルベン
ゾチアゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出
した。その結果をまとめて後掲の第１表に示した。得ら
れたウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体の内１５個が免疫グロブリン鎖γ１／にを、１
個が１２ａ／にを、そして、ＩＷＡがγ２ｂ／にを有し
ていた。

（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後、塩化ナトリウム０．０６Ｍを含む４０ｍＭリン酸緩
衝液、ｐＨ８，０で平衡化したＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｃ
ｅ　１（ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ社）の非吸着画分を分取
し、このＩｇＧ画分を更に０．４２Ｍ塩化ナトリウムを
含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化した５
ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００Ｓｕｐｅｒｆ　ｉｎｅ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムでゲルが過し、培地中
のＦｅ２およびマウス由来のたん白質を分離、除去した
。

実施例　２ ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターとモノクローナル抗
体との交叉性 （ａ）酵素標識モノクローナル抗体（Ｆａｂ’−ＰＯＤ
複合体）の調製法 （１）　Ｆａｂ’画分の調製 実施例１（ｉ）で得られたＩｇＧ画分を０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、前記画分中の［ｇＧに対して２％（ｗ／
ｗ）のペプシンを加え、３７°Ｃ１２４時間消化した。

更にその消化物に２Ｍトリス溶液を加えてｐｕを７．０
に調整することにより消化反応を停止させ、Ｏ，１Ｍす
〉゛酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したウシトロゲル
ＡｃＡ　４４カラム（ＬＫＢ製）を用いたゲル濾過によ
りＦ（ａｂ’）２画分を分取しｌこ　。

次に、このＦ（ａｂ’）２両分をエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）中で透析し、終濃度１０ｍＭとなるようにアミノエタ
ンチオール（Ｍ　Ｅ　Ａ　）を加え３７°Ｃで１．５時
間還元した後、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含冑０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したウシトロゲルＡｃＡ
　４４カラムを用いてゲル濾過し、Ｆａｂ’画分を分取
した。

（２）マレイミド標識ＰＯＤ画分の調製上記（１）の操
作とは別に、以下述へるようにして西洋わさび由来ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）にマレイミドを標識した。すな
わち、ＰＯＤをｌｏｍｇ／ｍＱの量で０，１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、そのＰＯＤに対して、２
５倍モル量のＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）
コハク酸イミド（ＥＩＪＣ５）をジメチルホルムアミド
溶液として加え、３０°Ｃ１３０分間反応させた。これ
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−５０カラムでゲル濾過し、マレイミド
標識ＰＯＤ画分を分取した。

（３）　Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体画分の調製上記（１）
の如くして調製した画分中のＦａｂ’に対して上記（２
）で得られた画分中のマレイミド標識ＰＯＤとして等モ
ルになるようにして、両画分を混合し、更にＦａｂ’お
よびマレイミド標識ＰＯＤの終濃度が１００μＭとなる
ように５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）で希釈した。この混合液を４℃、２０時間
反応後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミ
ドで未反応のチオール基をブロックした。これを０　、
１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したウシト
ロゲルＡｃＡ　４４カラムでゲルが過し、Ｆａｂ’−Ｐ
ＯＤ複合体画分を分取後、０．１％牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）及び０．００５％チメロサールを添加し、４°
Ｃで釆存した。

（ｂ）ウェスタンブロッティング 実施例１　（ａ）項で精製したウシ歯髄コラゲナーゼイ
ンヒビターを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、市販のＰＯ
Ｄ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンおよび上記実施例２
（ａ）で得られたＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用いて細胞
工学１＆２．１０６１〜１０６８（１９８３）に記載の
口部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、
酵素抗体染色のパターンを得た。

これを第１図に示す。第１図において、Ａ及びＢはウェ
スタンブロッティング後のニトロセルロース膜をそれぞ
れ実施例２（ａ）で得られたＦａｂ’（クローン７−３
Ｆ１）　−ＰＯＤ複合体及びＦａｂ’（りローン７−２
１Ｂ１２）−ＰＯＤ複合体で免疫染色した結果を示すも
のである。

また、１〜１６は下記の各モノクローナル抗体（いずれ
もＩｇＧタイプ）の溶液にウェスタンブロッティング後
のニトロセルロース膜を浸した後、あらためて各ニトロ
セルロース膜をＰＯＤ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒ　ｉｅｓ製）で
免疫染色した結果を示すものである。

１：クローン７−３Ｆｌ、　２：クローン７−４Ｆ２．
３：クローン７−５Ａｌ、　４：クローン７−６Ｃ１，
５：クローン７−７Ｆ１１．６：クローン７−８８２．
７：クローン７−９Ｂ４．８：クローン７−１０ＥＩＩ
、　９　：クローン７−１１Ａ５、ｌＯ：クローン７−
１２Ｂ６、ｌｌ：クローン７−１５Ｅ８．１２：クロー
ン７−１８Ｆ３．１３：クローン７−１９Ｆ６．１４：
クローン７−２０Ｃ２，１５：クローン７−２１Ｂ１２
．１６：クローン７−２３Ｇ９゜第１図に示されるとこ
ろから明らかなように、上記のモノクローナル抗体は、
いずれもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターと交叉する
ことがわかっｊ二。

実施例　３ サンドイッチ酵素免疫測定法 （ａ）モノクローナル抗体結合ポールの調製法Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４．２０９〜３２７（１９８３
）に記載の石川らの方法に従って実施例１（ｉ）で得ら
れｔ；モノクローナル抗体を０．１％アジ化ナトリウム
含有０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、
それを１００μｇ／　ｍ！２（Ａｚａｏ−０−１５）の
濃度に調整した後、そのモノクローナル抗体溶液にポリ
スチレンポール（径６．５ｉｍ、　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ製）を浸漬し、４°Ｃに２
４時間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去し
た後、０．１％ＢＳＡ。

０．１％塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウム
含何１０ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　（、以
下緩衝液Ａと略記する）で５回洗浄した後、緩衝液Ａに
浸し、４℃で保存した。

（ｂ）サンドイッチ測定法 精製したコラゲナーゼインヒビター溶液、あるいはコラ
ゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を１％ＢＳＡを含
む緩衝液Ａで希釈し、各試験管に３００μαを加えた。

次に前記（ａ）項で調製した抗体結合ポールを加え、３
７°Ｃで１時間振とう加温後（第１反応）　、０．１Ｍ
塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩員液（ｐＨ７，０
）　３　ｍＱで各試験管を３回洗浄した。次に実施例２
（ａ）項で調製したＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を２０ｎｇ
／試験管となるように０．１％ＢＳＡ及びＯ，１Ｍ塩化
ナトリウム含有１０ｍＭ　’）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で希釈し３０°Ｃで１時間振とう加温した（第２反応
）。反応終了後、第１反応終了時と同様に洗浄した。次
に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解したＰＯＤ
基質、すなわち０．０１３４％テトラメチルベンチジン
（ＴＭＢＺ）を０．３ｍα加工、更に０．０１％過酸化
水素０．１ｍＱを加えて３０℃で１時間振とう加温（第
３反応）後、１．３３Ｎ硫酸０．６ｍＱを添加すること
により反応を停止させた。その反応混液のＡ４５゜値を
分光光度計で測定し、標準直線より試料中のコラゲナー
ゼインヒビター量を求めた。

（Ｃ）サンドイッチ測定用モノクローナル抗体の選択 コラゲナーゼインヒビターを定量することが可能なモノ
クローナル抗体の組み合わせを探す目的で実施例１（ｉ
）項の方法で精製したクローン７−３Ｆｌ、　７−６Ｃ
１，７−１９Ｆ６、および７−２１Ｂ１２の各モノクロ
ーナル抗体からＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を調製した。一
方、クローン７−３Ｆｌ、７−４Ｆ２．７−５Ａ１．７
−６ＣＬ　７−７Ｆｌｌ、　７−８Ｂ２．７−９Ｂ４．
７−　ｌ０ＥＩＩ、　７−１１Ａ５．７−１２Ｂ６．７
−１５Ｅ８．７−１８Ｆ３．７−１９Ｆ６．７−２０Ｃ
２，７−２１Ｂ１２、および７−２３Ｇ９の各モノクロ
ーナル抗体を固相として、試験管当たりｌｏｇの精製し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを用いて実施例３
（ｂ）項の方法によりサンドイッチ定量を行った。得ら
れたＡ４５ａ値を後掲の第２表に示す。なお、第２表中
のＡ４５Ｑ値は試料１ｎｇ添加の値からコラゲナーゼイ
ンヒビターを添加しない時の値を差し引いた数値である
。上記４種類のいずれのＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用い
た場合においても、固相として７−４Ｆ２．７−１ｌＡ
５．７−１２Ｂ６．７−１８Ｆ３．７−２０Ｃ２、およ
び７２３Ｇ９の６種類の抗体を用いた時のＡＩＳ。が２
以上の値を示した。次にこれら２４通りの組み合わせに
ついて、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの添加量を
変えてサンドイッチ定量を行った。

Ｆａｂ’（クローン７−６Ｃ１）−ＰＯＤを複合体とし
て、クローン７−２３Ｃ９抗体を固相とした場合に得ら
れた結果を第２図に示す。第２図に示すように、添加し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター量とＡｔＳ。の間
に直線関係が成立し、定量感度は試験背当たり約１１１
）ｇ（３２ａ　ｍｏＱ）であった。上記以外の組み合わ
せについても上記の直線関係がみられ、いずれの組み合
わせについてもサンドイッチ定量が可能であることがわ
かった。

実施例　４ ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの同定（ａ）ア
フイニテイ力ラムの調製 Ｎａｔｕｒｅ　２１４．１３０２−１３０４（１９６７
）に記載のＡｘ６ｎらおよびＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　６１６３６−６４３
（１９６８）に記載のＣｕａｔｒｅｃａｓａｓらの方法
に従って臭化シアンを介して担体のセファロース４Ｂに
リガンドとして実施例１（ｉ）項で得られた精製モノク
ローナル抗体を固定化した。次に抗体結合セファロース
４Ｂゲル０．３ｍＱをガラス管に充填し、０．１Ｍ塩化
ナトリウムおよび５＋ｎ）Ｊ塩化カルシウム含有３０ｍ
Ｍト！Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化し使用
した。

（ｂ）ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの７フイニテ
イ力ラムクロマトグラフイー ヒト血清１ｍＱを０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭ
塩化カルシウム含有３０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に対して透析した後、上記（ａ）項記載の方
法に従って調製したクローン７−２１Ｂ１２抗体結合セ
ファロース４Ｂカラムに供し、上記緩衝液で洗浄しく非
吸着画分）、次にカラムを２Ｍ塩化ナトリウム含有３０
ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）および０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有０．２Ｍグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１０，５）で順次洗浄しく洗浄画分）
、最後にカラムに吸着した蛋白質を０．２Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）で溶出した（溶出画分）。得
られた溶出画分を０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍ１
Ｊ塩化力ルシウム含有３０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）中で透析した後、もう−度クローン７−２
１Ｂ１２抗体結合セファロース４Ｂカラムを用いた再ア
フイニテイクロマトグラフイーに供し、上記と同様の操
作により溶出画分にコラゲナーゼインヒビターを得た。

そこで、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体がヒト血清コラゲナーゼインヒビター
と交叉するのか否かを検討するため、上記の溶出画分を
５ＯＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブロッティン
グを行った。

第３図はウェスタンブロッティング後のニトロセルロー
ス膜を１：クローン７−３Ｆ１．２：クローン７−６Ｃ
１，３：　７−１９Ｆ６．４：クローン７−２１Ｂ１２
および５：クローン７−２３Ｇ９の各モノクローナル抗
体から調製したＦａｂ’−ＰＯＤＩ合体で免疫染色を行
った結果を示すものである。第３図に示されるように、
ヒト血清中にもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在することがわかった。しかも、それらの分
子量はいずれも実施例１（ａ）項で得られたウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターのそれと同じ３２．０００Ｄで
あることがわかった。

実施例　５ サンドイッチ測定法によるヒト血清中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量 （ａ）標準直線の作成 ヒトコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量する
のに最も適したモノクローナル抗体の組み合わせについ
て検討した。実施例３（ｃ）項に示したように、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターを感度良く定量できる４種
類のＦａｂ’ＰＯＤ複合体、すなわち、Ｆａｂ’（７３
Ｆ１）−ＰＯＤ、Ｆａｂ’（７−６Ｃ１）−ＰＯＤ％Ｆ
ａｂ’（７−１９Ｆ６）−ＰＯＤおよびＦａｂ’（７−
２１Ｂ１２）−ＰＯＤと６種類の固相用抗体、すなわち
、クローン７−４Ｆ２．７−１１Ａ５．７−１２Ｂ６．
７−１８Ｆ３．７−２０Ｃ２および７−２３Ｇ９のモノ
クローナル抗体を用いた２４通りの組み合わせのうち、
実施例４（ｂ）項に記載したとおりにカラムクロマトグ
ラフィー鬼理したヒト血清コラゲナーゼインヒビターを
定量できる組み合わせを調べた。その結果、ヒト血清コ
ラゲナーゼインヒビターを抗原とした場合、用いたほと
んどの組み合わせでＡ４Ｓ。のシグナルは全く検出され
なかったが、固相用抗体としてクローン７−２３Ｇ９抗
体、複合体としてＦａｂ’　（クローン７−６Ｃ１）　
−ＰＯＤを用いた場合、サンドイッチ定量可能であるこ
とがわかった。次に、上記の組み合わせを用いて、実施
例３（ｃ）項に示した方法により、ヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターの添加量を変えてサンドイッチ定量を行
うことによって標準直線を作成し、得られた結果を第４
図に示す。第４図にみられるように、添加したヒト血清
コラゲナーゼインヒビター量とＡ４５゜の間に直線関係
が成立し、ヒトコラゲナーゼインヒビターの定量が可能
であることがわかった。しかし、その定量感度は試験管
当たり約１０ｐｇ（３２０ａ　ｍｏＱ）であり、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターの場合の定量感度（試験管
当たり１１１１ｇ）に比べて１０倍低いことがわかった
。

（ｂ）患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの定量 上記（ａ）において示したモノクローナル抗体の組み合
わせを用いて健常人血清９５検体、原発性肝臓癌患者血
清１００検体および転移性肝臓癌患者血清３検体の中に
存在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量
し、その結果を第３表の１および２に示した。なお、こ
のサンドイッチ定量において、標準直線の作成には抗原
として実施例４（ｂ）項で精製したヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターを用いた。また、この定量は検体血清を
１％　ＢＳＡを含む緩衝液Ａで１．６００倍に希釈して
行った。第３表の１および２に示した数値は同一の実験
系を２回行った結果の平均値である。第３表の１にみら
れるように、健常人血’ａＬｍＯ，中に存在するコラゲ
ナーゼインヒビター量は平均１．５９±０．３７μ９で
あるのに対し、原発性肝臓癌患者血清および転移性肝臓
癌患者血清１ｍＱ中に存在するコラゲナーゼインヒビタ
ー量は第３表の２に見られるようにそれぞれ平均３．２
２±２．１Ｏμ９および７．８１±３．８７μｇと高い
値を示した。一方、肝硬変患者血清４６検体、慢性活動
性肝炎患者血ａ４５検体および慢性非活動性肝炎患者血
清２６検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビターを
サンドイッチ定量した値を第４表に示した。その結果、
肝硬変患者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢
性非活動性肝炎患者血清中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量はそれぞれ平均１．５２±１．０８μ９．１
．５５±０．５８μ９および１．１０±０．４８μ９で
あり、これらの値はいずれも健常人血清中に存在するコ
ラゲナーゼインヒビター量と有意の差は認められなかっ
た。

実施例　６ ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの精製 実施例４の（ｂ）で最終的に得られた溶出画分中には前
述したとおり、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在する（第３図参照）。しかし、この溶出画
分中には、コラゲナーゼインヒビター以外にも、上記モ
ノクローナル抗体とは反応しない蛋白質が多種存在する
ことが認められた。そこで、この溶出画分をＯ，１ＭＩ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したＡｃＡ　４４
カラムを用いてゲルが過を行い、コラゲナーゼインヒビ
ターと他の蛋白質とを分離することによりヒト血清コラ
ゲナーゼインヒビターを精製した。第５図は得られた血
清コラゲナーゼインヒビター（１）、対照としてのウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビター（２）および分子量マー
カー（３）の各５ＯＳ−ＰＡＧＥパターンを示している
。

第５図にみられるように、ヒト血清コラゲナーゼインヒ
ビターの分子量はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの
それと同様、３２，０ＯＯＤであることがわかった。

−イー 実施例　７ サンドイッチ測定法における精製ヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線の作成実施例６において得られ
た精製ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの添加量を変
えて、実施例５の（ａ）項記載のモノクローナル抗体の
組ミ合わせを用いてサンドイッチ定量を行うことによっ
て標準直線を作成した。得られた結果は第６図に示すと
おりである。第６図にみられるように、添加したヒト血
清コラゲナーゼインヒビター量とＡ４５Ｏの間に直線関
係が成立し、この時の定量感度は試験背当たり１．５ｐ
ｇ（４８ａ　ｍｏＱ）であった。この定量感度は、実施
例５の（ａ）項で作成した標準直線の場合に比べて６．
７倍高く、また、実施例３の（ｃ）項記載のウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターの場合に比へて１．５倍低いこ
とがわかった。

実施例　８ サンドイッチ測定法によるヒト血清中あるいはヒト血清
中のコラゲナーゼインヒビターの定量に基づく肝臓癌疾
患の診断 （ａ）肝疾患患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの
定量 実施例７において示したモノクローナル抗体の組み合わ
せを用いて健常人血清５０検体、原発性肝臓癌患者血清
１００検体および転移性肝臓癌患者血清３検体の中に存
在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量し
、その結果を第５表の１および２に示した。なお、この
サンドイッチ定量において、標準直線の作成には抗原と
して実施例６で精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いた。また、この定量は検体血清を１％　ＢＳ
Ａを含む緩衝液Ａで１．６００倍に希釈して行った。第
５表の１８よび２に示した数値は同一の実験系を２回行
った結果の平均値である。第５表の１にみられるよ、う
に、健常人血ａ１ｍＱ中に存在するコラゲナーゼインヒ
ビター量は平均１８４±３１ｎｇであるのに対し、原発
性肝臓癌患者血清および転移性肝臓癌患者血清ｌ　ｍＱ
中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は第５表の２
に見られるようにそれぞれ平均４８４±３１６ｎｇおよ
び１１７１±７１２ｎｇと高い値を示した。一方、肝硬
変患者血清４６検体、慢性活動性肝炎患者血ａ４５検体
および慢性非活動性肝炎患者血清２６検体の中に存在す
るコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量した値
を第６表に示した。第６表に見られるように、肝硬変患
者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢性非活動
性肝炎患者血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター
量はそれぞれ平均２２８±１６３ｎｇ、２３３±８８ｎ
ｇおよび１６６±７３ｎｇであり、これらの値はいずれ
も健常人血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター量
と有意の差は認められなかつＩこ　。

（ｂ）肝疾患患者血漿中のコラゲナーゼインヒビターの
定量 Ｂｒ、　Ｊ、　ＨａｅｍａＬｏｌ、　３３．２３９−２
４７　（１９７６）に記載のＬｕｄｌａｍとＣａ５ｈの
方法に従って、健常人血液および原発性肝臓癌疾患患者
血液からそれぞれの血漿を採取した。なお、ここで採取
した血漿は、血液にＥＤＴＡｌ　プロスタグランジンＥ
いおよびテオフィリンを加え冷却した後、４℃で１９０
０×９６０分間遠心分離して得られた上澄であり、血液
中の血小板は、分解されずに沈澱画分にとどまっている
。

上記の如くして得られた健常人血漿２６検体および原発
性肝臓癌患者血漿８検体の中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビターを上記（ａ）項に示したのと同じ方法を用い
てサンドイッチ定量した。その結果は後掲の第７表に示
されるとおりである。第７表にみられるように、健常人
血漿１ｍａ中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は
平均６４±１０ｎｇであるのに対し、原発性肝臓癌疾患
患者血漿中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平
均５８３±４４７ｎｇと高い値を示した。

（Ｃ）モノクローナル抗体とコラゲナーゼインヒビター
との特異的反応の確認 実施例４、（ｂ）項に示したように、サンドイッチ測定
法に用いる２種類のモノクローナル抗体（クローン７−
６Ｃ１とクローン７−２３Ｇ９）はヒトコラゲナーゼイ
ンヒビターと反応するが、血清あるいは血漿などのよう
に、種々の蛋白質が高濃度で溶解している系でも、この
モノクローナル抗体がコラゲナーゼインヒビターと特異
的に反応していることを確認するための試験を行っｊこ
　。

健常人血清あるいは肝臓癌患者血清を０．１Ｍ塩化ナト
リウムおよび５ｍＭ塩化力ルンウム含有３ＱｍＭ　トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で５＠に希釈した後、実
施例４の（ａ）項記載の方法に従って調製したクローン
７−２３Ｇ９　（サンドイッチ測定法の固相用抗体）結
合セファロース４Ｂカラムに供し、実施例４の（ｂ）項
記載の方法に従って溶出画分を得た。この溶出画分を５
ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ウェスタンブロッティング
を行い、サンドイッチ測定法の標識抗体であるＦａｂ’
　（クローン７−６Ｃ１）−ＰＯＤ複合体で免疫染色を
行った。その結果は第７図に示すとおりである。１：精
製ヒト血清コラゲナーゼインヒビター　２＝健常人血清
、３：肝臓癌患者血清のいずれを用いた場合ニモ、単一
バンドを示すことから、本発明の診断法におけるサンド
イッチ測定法では、極めて特異的にコラゲナーゼインヒ
ビターだけが定量されていることが示された。

以上述べたことから明らかなように、本発明方法を用い
ることにより、肝臓癌疾患の診断を、箇更に、短時間内
にさらに感度良く行うことかできる。

第 クローン番号 −３Ｆ１ −４Ｆ２ −５Ａ１ −６Ｃ１ −７Ｆｌ１ −９Ｂ４ ７−１０ＥＩＩ −１１Ａ５ −１２Ｂ６ ７−１４Ｅ９ −１５Ｅ８ ７−１８Ｆ３ −１９Ｆ６ −２０Ｃ２ ７−２１Ｂ１２ −２３Ｇ９ ■ 表 サブクラス／鎖 ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ［ｇＧ２ａ／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ２ｂ／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に ＩｇＧ１／に

【図面の簡単な説明】

第１図はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを５ＤＳ−
ＰＡＧＥに供した後、種々のモノクローナル抗体を用い
た時のウェスタンブロッティングパターンを示す図であ
り、第２図は固相７−２３Ｇ９抗体−複合体Ｆａｂ’（
７−６ＣＬ）−ＰＯＤ測定系でのウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線を示す図であり、第３図はヒト
血清コラゲナーゼインヒビターを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供
した後、ウェスタンブロッティングを行った時の免疫染
色のパターンを示す図であり、第４図は固相７−２３Ｇ
９抗体−複合体Ｆａｂ’（７−６Ｃ１）−ＰＯＤ測定系
でのヒト血清コラゲナーゼインヒビターの標準直線を示
す図であり、第５図はヒト血清から精製したコラゲナー
ゼインヒビターの５ＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図で
あり、第６図は精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いて、サンドイッチ測定した時の標準直線を示
す図であり、第７図はヒト血清をＩｇＧ（７−２３Ｇ９
）抗体結合アフイニテイ力ラムに供して得られた溶出画
分を５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｆａｂ’（７−６Ｃ
１）−ＰＯＤ複合体を用イｆ：ｎノウニスタンブロッテ
ィングパターンを示す図である。 第 図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コラゲナーゼインヒビターの異なる抗原決定基に対し、
   特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体の組み合
   わせを用いたサンドイッチ法により、酵素免疫学的に血
   清中、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼ
   インヒビターを定量し、その定量値を健常人の値と比較
   することにより診断を行うことを特徴とする肝臓癌疾患
   の診断法。