JPH0271153A - 肝臓癌疾患の診断法 - Google Patents
肝臓癌疾患の診断法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明はコラゲナーゼインヒビターを定量することによ
り肝臓癌疾患を診断する方法に関するものである。さら
に詳しくは、本発明はウシコラゲナーゼインヒビター(
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ:
TIMP)に対するモノクローナル抗体を用いるサンド
イッチ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒトコラゲ
ナーゼインヒビターの測定法を手段とし、肝臓癌疾患患
者の血清中、血漿中あるいは関節液中のコラゲナーゼイ
ンヒビター量がそれぞれ健常人の血清中、血漿中あるい
は関節液中のコラゲナーゼインヒビター量に比べて明ら
かに高い値を示すことに基づいて肝臓癌疾患の診断を行
う方法に関するものである。
り肝臓癌疾患を診断する方法に関するものである。さら
に詳しくは、本発明はウシコラゲナーゼインヒビター(
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテアーゼ:
TIMP)に対するモノクローナル抗体を用いるサンド
イッチ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒトコラゲ
ナーゼインヒビターの測定法を手段とし、肝臓癌疾患患
者の血清中、血漿中あるいは関節液中のコラゲナーゼイ
ンヒビター量がそれぞれ健常人の血清中、血漿中あるい
は関節液中のコラゲナーゼインヒビター量に比べて明ら
かに高い値を示すことに基づいて肝臓癌疾患の診断を行
う方法に関するものである。
コラゲナーゼインヒビターは、ヒトおよびその他の動物
の骨、皮膚、歯髄、羊水、血液、関節液中および関節軟
骨細胞、滑液細胞、各種組織由来線維芽細胞、線維肉腫
細胞培養液中に存在することが知られている。コラゲナ
ーゼインヒビター量を測定する手段としては、従来、そ
の生物活性を測定することによる方法が知られている。
の骨、皮膚、歯髄、羊水、血液、関節液中および関節軟
骨細胞、滑液細胞、各種組織由来線維芽細胞、線維肉腫
細胞培養液中に存在することが知られている。コラゲナ
ーゼインヒビター量を測定する手段としては、従来、そ
の生物活性を測定することによる方法が知られている。
しかし、J、 Lab、 C11n、 Mad、 75
.258〜263 (1973)にEisenらが、ま
た、Arthritisand Rheumatism
27.285〜290(1984)にCaws to
nらが記載しているように、血清中、血漿中あるいは関
節液中のコラゲナーゼインヒビター活性を測定するには
、それらの液中に、その測定を妨害する蛋白質、たとえ
ば、α2−マクログロブリンが存在するため、従来知ら
れている創意方法によっては、その測定は不可能である
。半周、岩田らは、先に、ウシコラゲナーゼインヒビタ
ーに対する七ツクローナル抗体を用い、サンドイッチ法
に基づく酵素免疫学的測定法(EIA)を行うことによ
り微量の試料で精度良く、簡便かつ迅速にコラゲナーゼ
インヒビターを特異的に定量する方法を開発したが(特
願昭62−42781号)、本発明者らは、ヒト血清中
、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量が、肝臓癌疾患にかかることにより明らかに
増加することを発見し、血清中、血漿中あるいは関節液
中に存在するコラゲナーゼインヒビターの量を上記の酵
素免疫学的測定法により測定することによって、肝臓癌
疾患の診断を行い得ることを見出した。
.258〜263 (1973)にEisenらが、ま
た、Arthritisand Rheumatism
27.285〜290(1984)にCaws to
nらが記載しているように、血清中、血漿中あるいは関
節液中のコラゲナーゼインヒビター活性を測定するには
、それらの液中に、その測定を妨害する蛋白質、たとえ
ば、α2−マクログロブリンが存在するため、従来知ら
れている創意方法によっては、その測定は不可能である
。半周、岩田らは、先に、ウシコラゲナーゼインヒビタ
ーに対する七ツクローナル抗体を用い、サンドイッチ法
に基づく酵素免疫学的測定法(EIA)を行うことによ
り微量の試料で精度良く、簡便かつ迅速にコラゲナーゼ
インヒビターを特異的に定量する方法を開発したが(特
願昭62−42781号)、本発明者らは、ヒト血清中
、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量が、肝臓癌疾患にかかることにより明らかに
増加することを発見し、血清中、血漿中あるいは関節液
中に存在するコラゲナーゼインヒビターの量を上記の酵
素免疫学的測定法により測定することによって、肝臓癌
疾患の診断を行い得ることを見出した。
本発明は、上述の如き知見に基づいてなされたものであ
って固相単体に結合させる抗体および酵素標識を付与す
る抗体としてウシコラゲナーゼインヒビターの異なる抗
原決定基に対し特異的に結合する2種類のモノクローナ
ル抗体の組み合わせを用いて、サンドイツチ法により酵
素抗体免疫学的測定法を行うことにより、血清中、血漿
中めるいは関節液中に存在するヒトコラゲナーゼインヒ
ビターを定量し、その定量値を健常人の示す値と比較す
ることにより、被測定者が肝臓癌疾患にかかっているか
否かを診断する方法を提供するものである。
って固相単体に結合させる抗体および酵素標識を付与す
る抗体としてウシコラゲナーゼインヒビターの異なる抗
原決定基に対し特異的に結合する2種類のモノクローナ
ル抗体の組み合わせを用いて、サンドイツチ法により酵
素抗体免疫学的測定法を行うことにより、血清中、血漿
中めるいは関節液中に存在するヒトコラゲナーゼインヒ
ビターを定量し、その定量値を健常人の示す値と比較す
ることにより、被測定者が肝臓癌疾患にかかっているか
否かを診断する方法を提供するものである。
本発明者らは、ウシ歯髄の培養外液から精製したコラゲ
ナーゼインヒビターを含む溶液をBa1b/cマウスの
腹腔内に投与することにより免疫した後、そのマウスの
び臓細胞を分離した。
ナーゼインヒビターを含む溶液をBa1b/cマウスの
腹腔内に投与することにより免疫した後、そのマウスの
び臓細胞を分離した。
そのひ臓細胞と8−アザグアニン耐性ミエローマ細胞N
5−1とを5=1の割合で混合し、50%ポリエチレン
グリコール4000中で融合させることによりハイブリ
ドーマを得た。ポリスチレン製96六マイクロウエルに
各ウェル当たり6.OX 10’個となるように得られ
たハイブリドーマを分散した後、HAT培地中で培養し
た。各ウェルの培養液中にウシ歯髄コラゲナーゼインヒ
ビターに対する抗体が産生されているか否かを固相−抗
体結合テスト法(ELISA)によりチエツクし、それ
が陽性であるウェル中のハイブリドーマを限界希釈法に
よりクローニングした。その結果、ウシ歯髄コラゲナー
ゼインヒビターに対するモノクローナル抗体を産生ずる
17種類のモノクローンを得、その各モノクローンをB
a1b/cマウスの腹腔内に投与することにより、モノ
クローナル抗体を含む腹水を得た。その腹水から硫酸ア
ンモニウムによる塩析分別、DEAE −5ephac
e lによるイオン交換クロマトグラフィーおよび5e
phacryl S−3005uperfineによる
ゲルろ過クロマトグラフィーなどによってモノクローナ
ル抗体を精製しI;。上記の如く精製した17種類のモ
ノクローナル抗体いずれもウシコラゲナーゼインヒビタ
ーと特異的に交叉したが、それらのなかの4種類のモノ
クローナル抗体、すなわち、IgG(クローン7−6C
1) 、IgG(クローン7−19F6)、[gG (
クローン7−21812)およびIgG(クローン72
3G9)がヒトコラゲナーゼインヒビターとも反応する
ことをウェスタンブロッティングによって明らかにした
。これら4種類のモノクローナル抗体のうち2種類のモ
ノクローナル抗体、すなわち、IgG(クローン7−2
3G9)を固相用抗体とし、IgG(クローン7−6C
I)から調製したFab’(クローン7−6C1) −
POD複合体を標識抗体として用いたサンドイツチ法に
基づ<EIAを行うことにより、ヒトコラゲナーゼイン
ヒビターを微量(1,51)9)で、特異的に、精度良
く、定量することができた。このサンドイツチ法を用い
て、健常人血清50検体中のコラゲナーゼインヒビター
を定量したところ、血清1mO,当たり184±30n
gのコラゲナーゼインヒビターが存在することがわかっ
た。一方、原発性肝臓癌患者血清lOO検体検討中び転
移性肝臓癌患者血清3検体中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビター量は血清1n(2当たりそれぞれ平均486
±316ngおよび1172±712ngであり、これ
らの値は健常人血清中に存在するその値に比べて明らか
に高い。一方、肝硬変患者血清46検体、慢性活動性肝
炎患者血清45検体および慢性非活動性肝炎患者血清2
6検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は血
清1mQ当たりそれぞれ平均228±163ng、23
3±88ngおよび166±73ngであり、健常人血
清中に存在するその量と比べて有意の差は認められなか
った。従って、種々の肝臓病患者中でも肝臓癌患者にお
ける血清中での特異的に高いコラゲナーゼインヒビター
の量に着目して、患者血清中のコラゲナーゼインヒビタ
ー量を測定することにより、その患者が、肝臓癌患者で
あるか否かを診断することができることになることが判
った。また・、健常人血漿26検体中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの量は血漿1 mQ当たり64±lOngで
あるのに対し、厘発性肝臓癌患者8検体中に存在するコ
ラゲナーゼインヒビター量は血漿’1mQ当たり583
±447ngであり、健常人血漿中に存在するその値に
比べて明らかに高いことか認められた。
5−1とを5=1の割合で混合し、50%ポリエチレン
グリコール4000中で融合させることによりハイブリ
ドーマを得た。ポリスチレン製96六マイクロウエルに
各ウェル当たり6.OX 10’個となるように得られ
たハイブリドーマを分散した後、HAT培地中で培養し
た。各ウェルの培養液中にウシ歯髄コラゲナーゼインヒ
ビターに対する抗体が産生されているか否かを固相−抗
体結合テスト法(ELISA)によりチエツクし、それ
が陽性であるウェル中のハイブリドーマを限界希釈法に
よりクローニングした。その結果、ウシ歯髄コラゲナー
ゼインヒビターに対するモノクローナル抗体を産生ずる
17種類のモノクローンを得、その各モノクローンをB
a1b/cマウスの腹腔内に投与することにより、モノ
クローナル抗体を含む腹水を得た。その腹水から硫酸ア
ンモニウムによる塩析分別、DEAE −5ephac
e lによるイオン交換クロマトグラフィーおよび5e
phacryl S−3005uperfineによる
ゲルろ過クロマトグラフィーなどによってモノクローナ
ル抗体を精製しI;。上記の如く精製した17種類のモ
ノクローナル抗体いずれもウシコラゲナーゼインヒビタ
ーと特異的に交叉したが、それらのなかの4種類のモノ
クローナル抗体、すなわち、IgG(クローン7−6C
1) 、IgG(クローン7−19F6)、[gG (
クローン7−21812)およびIgG(クローン72
3G9)がヒトコラゲナーゼインヒビターとも反応する
ことをウェスタンブロッティングによって明らかにした
。これら4種類のモノクローナル抗体のうち2種類のモ
ノクローナル抗体、すなわち、IgG(クローン7−2
3G9)を固相用抗体とし、IgG(クローン7−6C
I)から調製したFab’(クローン7−6C1) −
POD複合体を標識抗体として用いたサンドイツチ法に
基づ<EIAを行うことにより、ヒトコラゲナーゼイン
ヒビターを微量(1,51)9)で、特異的に、精度良
く、定量することができた。このサンドイツチ法を用い
て、健常人血清50検体中のコラゲナーゼインヒビター
を定量したところ、血清1mO,当たり184±30n
gのコラゲナーゼインヒビターが存在することがわかっ
た。一方、原発性肝臓癌患者血清lOO検体検討中び転
移性肝臓癌患者血清3検体中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビター量は血清1n(2当たりそれぞれ平均486
±316ngおよび1172±712ngであり、これ
らの値は健常人血清中に存在するその値に比べて明らか
に高い。一方、肝硬変患者血清46検体、慢性活動性肝
炎患者血清45検体および慢性非活動性肝炎患者血清2
6検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は血
清1mQ当たりそれぞれ平均228±163ng、23
3±88ngおよび166±73ngであり、健常人血
清中に存在するその量と比べて有意の差は認められなか
った。従って、種々の肝臓病患者中でも肝臓癌患者にお
ける血清中での特異的に高いコラゲナーゼインヒビター
の量に着目して、患者血清中のコラゲナーゼインヒビタ
ー量を測定することにより、その患者が、肝臓癌患者で
あるか否かを診断することができることになることが判
った。また・、健常人血漿26検体中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの量は血漿1 mQ当たり64±lOngで
あるのに対し、厘発性肝臓癌患者8検体中に存在するコ
ラゲナーゼインヒビター量は血漿’1mQ当たり583
±447ngであり、健常人血漿中に存在するその値に
比べて明らかに高いことか認められた。
ただし、血清中あるいは血漿中に存在するコラゲナーゼ
インヒビター量増加の現象は、肝臓癌患者以外に慢性関
節リウマチ疾患患者についても認められるので、この血
清中のコラゲナーゼインヒビターの測定を、肝機能判定
法であるZTT (硫酸亜鉛混濁反応) 、GOT (
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、GPT
(グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、ALP
(アルカリ性フォスファターゼ)、LDH(乳酸脱水素
酵素)、γ−GPT (γ−グルタミルトランスペフチ
ダーゼ)、PH(プロリルハイドロキシラーゼ)および
AFP(α−フェトプロティン)などの測定と併用する
ことにより、被測定者の肝臓筋の罹患の有無を診断する
ことができるのである。
インヒビター量増加の現象は、肝臓癌患者以外に慢性関
節リウマチ疾患患者についても認められるので、この血
清中のコラゲナーゼインヒビターの測定を、肝機能判定
法であるZTT (硫酸亜鉛混濁反応) 、GOT (
グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、GPT
(グルタミンピルビン酸トランスアミナーゼ)、ALP
(アルカリ性フォスファターゼ)、LDH(乳酸脱水素
酵素)、γ−GPT (γ−グルタミルトランスペフチ
ダーゼ)、PH(プロリルハイドロキシラーゼ)および
AFP(α−フェトプロティン)などの測定と併用する
ことにより、被測定者の肝臓筋の罹患の有無を診断する
ことができるのである。
本発明方法においては上記の酵素免疫学的測定法が用い
られるが、固相単体として抗原や抗体を受動的に良く吸
着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロ
ピレン類、あるいはポリビニール製のポール、マイクロ
プレート、スティック、試験管などの種々の材料および
使用形態が任意に選択、使用できる。一方、酵素漂識を
付与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、DE
AE −5ephacelの如き陰イオン交換ゲルによ
り精製したIgG画分、さらにはペプシン消化後、還元
して得られる特異的結合部分Fab’を用いることもで
きる。
られるが、固相単体として抗原や抗体を受動的に良く吸
着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロ
ピレン類、あるいはポリビニール製のポール、マイクロ
プレート、スティック、試験管などの種々の材料および
使用形態が任意に選択、使用できる。一方、酵素漂識を
付与する抗体としては、抗体含有物を硫安分画後、DE
AE −5ephacelの如き陰イオン交換ゲルによ
り精製したIgG画分、さらにはペプシン消化後、還元
して得られる特異的結合部分Fab’を用いることもで
きる。
前述のとおり、本発明方法は、固相単体に結合させる抗
体および酵素標識を付与する抗体として、コラゲナーゼ
インヒビターの異なる抗原決定基に対し、特異的に結合
する2種類のモノクローナル抗体の組み合わせを用いた
固相抗体酵素免疫学的測定法に基づいたヒトコラゲナー
ゼインヒビターの定量を行い、その結果を、健常人の値
と比較することによって、被測定者が、肝臓癌疾患にか
かっているか否かを診断するものである。
体および酵素標識を付与する抗体として、コラゲナーゼ
インヒビターの異なる抗原決定基に対し、特異的に結合
する2種類のモノクローナル抗体の組み合わせを用いた
固相抗体酵素免疫学的測定法に基づいたヒトコラゲナー
ゼインヒビターの定量を行い、その結果を、健常人の値
と比較することによって、被測定者が、肝臓癌疾患にか
かっているか否かを診断するものである。
以下実施例により本発明を具体的に説明する。
ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 l
抗ウシコラゲナーゼインヒビターモノクローナル抗体の
作製 (a)抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 J、 、Biochem、 96.395−404(1
984)に記載の本発明者らの方法に従いウシ未萌出知
歯の根部歯髄をイーグルMEM培地(日本製薬製)で培
養した培養外液からCon A−セファロース、ウシト
ロゲルAcA 44およびDE−52セルロースの各カ
ラムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精製した。
作製 (a)抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 J、 、Biochem、 96.395−404(1
984)に記載の本発明者らの方法に従いウシ未萌出知
歯の根部歯髄をイーグルMEM培地(日本製薬製)で培
養した培養外液からCon A−セファロース、ウシト
ロゲルAcA 44およびDE−52セルロースの各カ
ラムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精製した。
精製インヒビターはJ、 Mat、 Biol、
随、579〜599(1973)に記載のLaemm
l iらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(5DS−PAGE)で調
べたところ分子量約32.000ダルトン(D)の単一
バンドを示した。
随、579〜599(1973)に記載のLaemm
l iらの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(5DS−PAGE)で調
べたところ分子量約32.000ダルトン(D)の単一
バンドを示した。
(b)抗体産生細胞の調製
6週令のBa1b/c雌マウス2匹をまず70インド完
全アジユバント中で、前記(a)で記述した精製ウシコ
ラゲナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそれ
ぞれ48μ9のウシコラゲナーゼインヒビターを0.4
mαの溶液として腹腔的投与する。さらに30日目に生
理食塩水に溶解した84μりのウシコラゲナーゼインヒ
ビターを追加免疫する。最終免疫として58日目に腹腔
的投与(95μg/ 500μQ生理食塩水)により補
助免疫し、3日後にマウス膵臓を取り出し、肺細胞を調
製する。
全アジユバント中で、前記(a)で記述した精製ウシコ
ラゲナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそれ
ぞれ48μ9のウシコラゲナーゼインヒビターを0.4
mαの溶液として腹腔的投与する。さらに30日目に生
理食塩水に溶解した84μりのウシコラゲナーゼインヒ
ビターを追加免疫する。最終免疫として58日目に腹腔
的投与(95μg/ 500μQ生理食塩水)により補
助免疫し、3日後にマウス膵臓を取り出し、肺細胞を調
製する。
(c)細胞融合
(1)以下の材料および方法を用いる。
RP!Jl 1640培地: RPMI No、 16
40(Difco Labo−ratories)に重
炭酸ナトリウム(12mM)、ピルビン酸ナトリウム(
l mM)、L−グルタミン(2mM)、ペニシリンG
カリウム(50U/ mQ)、tilt 酸ストレプト
マイシン(50μg/m(2)、および硫酸アミカシン
(100μg/ m+2)を加え、ドライアイスでpH
ヲ7.2にし、0.2μm東洋メンブレンフィルターで
除菌濾過する。
40(Difco Labo−ratories)に重
炭酸ナトリウム(12mM)、ピルビン酸ナトリウム(
l mM)、L−グルタミン(2mM)、ペニシリンG
カリウム(50U/ mQ)、tilt 酸ストレプト
マイシン(50μg/m(2)、および硫酸アミカシン
(100μg/ m+2)を加え、ドライアイスでpH
ヲ7.2にし、0.2μm東洋メンブレンフィルターで
除菌濾過する。
N5−1培地:上記RPIJI 1640培地に除菌濾
過した仔牛脂児血清(M、 A、 Bioprod
ucts)を15%(V/ V)の濃度に加える。
過した仔牛脂児血清(M、 A、 Bioprod
ucts)を15%(V/ V)の濃度に加える。
PEG 4,000溶液: RPMI 1640培地の
ポリエチレングリコール4,000 (PEG 4.0
00、Merck & Co、。
ポリエチレングリコール4,000 (PEG 4.0
00、Merck & Co、。
Inc、) 50%(w/w)無血清溶液を調製する。
8−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS−1(P3−
NSI−1)との融合は5elected Metho
d 1nCellular Immunology(e
d、 B、 B、 Mishell andS、M、
Shiigi) 、W、 H,Freeman and
Company(1980)、351−372+:記
載ノoIラノ方法ヲ若干改変して行った。
NSI−1)との融合は5elected Metho
d 1nCellular Immunology(e
d、 B、 B、 Mishell andS、M、
Shiigi) 、W、 H,Freeman and
Company(1980)、351−372+:記
載ノoIラノ方法ヲ若干改変して行った。
(2)前記(b)で調製した有核膵臓細胞(生細胞率1
00%)とミエローマ細胞(生細胞率100%)とを5
=1の割合で融合する。膵臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のRPMI 1640培地で洗浄する。次に
同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合
する。容量50mQの円錐形スチロール膚脂製試験管(
Iwaki Glass)を用い、40mQのRPM[
1640培地中400X9.10分間遠心し、上溝を完
全に吸出する。沈澱細胞に37°C加温PEG 4,0
00溶液[,3mαを穏やかに撹拌しながら1分間で滴
下し、さらに1分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる
。次に37°C加温RPMI 1640培地1.3mQ
を1分間で滴下する。この操作をさらに1回繰返した後
、同培地9mαを2〜3分間で常に撹拌しながら滴下し
細胞を分散させる。これを400Xy、10分間遠心分
離し、上溝を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細胞に
37°C加温MS−1培地12.9m12をすみやかに
加え、細胞の大きい塊りをlOmQのピペットを用いて
注意深くピペッティングして分散する。さらに同培地2
6++IQを加えて希釈し、ポリスチレン製96穴マイ
クロウエル(Iwaki Glass)にウェル当り6
.OX 10’個10.1mQの細胞を加える。なお、
この時使用する96六マイクロウエルは前旭理として0
.2mQのMS−1培地を加え、炭酸ガス培養器中(3
7℃)で−晩保温し、使用時に培地を吸引除去しておく
。細胞を加えた上記のマイクロウェルを7%炭酸ガス/
93%空気中で温度37°C1湿度100%下に培養に
付する。
00%)とミエローマ細胞(生細胞率100%)とを5
=1の割合で融合する。膵臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のRPMI 1640培地で洗浄する。次に
同じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合
する。容量50mQの円錐形スチロール膚脂製試験管(
Iwaki Glass)を用い、40mQのRPM[
1640培地中400X9.10分間遠心し、上溝を完
全に吸出する。沈澱細胞に37°C加温PEG 4,0
00溶液[,3mαを穏やかに撹拌しながら1分間で滴
下し、さらに1分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる
。次に37°C加温RPMI 1640培地1.3mQ
を1分間で滴下する。この操作をさらに1回繰返した後
、同培地9mαを2〜3分間で常に撹拌しながら滴下し
細胞を分散させる。これを400Xy、10分間遠心分
離し、上溝を完全に吸引除去する。次にこの沈澱細胞に
37°C加温MS−1培地12.9m12をすみやかに
加え、細胞の大きい塊りをlOmQのピペットを用いて
注意深くピペッティングして分散する。さらに同培地2
6++IQを加えて希釈し、ポリスチレン製96穴マイ
クロウエル(Iwaki Glass)にウェル当り6
.OX 10’個10.1mQの細胞を加える。なお、
この時使用する96六マイクロウエルは前旭理として0
.2mQのMS−1培地を加え、炭酸ガス培養器中(3
7℃)で−晩保温し、使用時に培地を吸引除去しておく
。細胞を加えた上記のマイクロウェルを7%炭酸ガス/
93%空気中で温度37°C1湿度100%下に培養に
付する。
(d)選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖
(1)使用する培地は以下のとおりである。
HAT培地:前記(C)で述べたN5−1培地にさらに
ヒポキサンチン(100μM)、アミノプテリン(0,
4μM)、およびチミジン(16μM)を加える。
ヒポキサンチン(100μM)、アミノプテリン(0,
4μM)、およびチミジン(16μM)を加える。
HT培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記HAT
培地と同一組成のものである。
培地と同一組成のものである。
(2)前記(c)の培養開始後翌日(18目)、細胞に
パスツールピペットでHAT培地2滴(約0.1rnα
)を加える。2.3.5.8.11日目に培地の半分(
0,1m+2)を新しいHAT培地で置き換え、14日
目に培地の半分を新しいHT培地で置き換える。
パスツールピペットでHAT培地2滴(約0.1rnα
)を加える。2.3.5.8.11日目に培地の半分(
0,1m+2)を新しいHAT培地で置き換え、14日
目に培地の半分を新しいHT培地で置き換える。
以降3〜4日毎に培地の半分を新しいHT培地で置き換
える。通常2〜3週間で充分なハイブリドーマの生育が
観察される。ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項
(e)記載の固相−抗体結合テスト法(ELISA)に
より陽性ウェルをチエツクする。次にフィーダーとして
10’個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1mffをポ
リスチレン製24穴セルウエル(Ivaki Glas
s)に加えたものを用い、上記で検出された各陽性ハイ
ブリドーマの全内容物を移す。これを前記(c)におけ
ると同様に7%炭酸ガス存在下、37°Cで約1週間培
養に付する。その間1〜2回各ウェルの上清0.5mα
を新しいHT培地0.5mQと交換する。ハイブリドー
マの充分生育した時点でELISA法により陽性を再確
認し、それぞれについて次項(f)記載の限界希釈法に
よるクローニングを行う。なお、クローニングに使用後
の残液をポリスチレン製25cm2組織培養フラスコ(
Iwaki Glass)に移し、凍結保存用試料を調
製する。
える。通常2〜3週間で充分なハイブリドーマの生育が
観察される。ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項
(e)記載の固相−抗体結合テスト法(ELISA)に
より陽性ウェルをチエツクする。次にフィーダーとして
10’個のマウス胸腺細胞を含むHT培地1mffをポ
リスチレン製24穴セルウエル(Ivaki Glas
s)に加えたものを用い、上記で検出された各陽性ハイ
ブリドーマの全内容物を移す。これを前記(c)におけ
ると同様に7%炭酸ガス存在下、37°Cで約1週間培
養に付する。その間1〜2回各ウェルの上清0.5mα
を新しいHT培地0.5mQと交換する。ハイブリドー
マの充分生育した時点でELISA法により陽性を再確
認し、それぞれについて次項(f)記載の限界希釈法に
よるクローニングを行う。なお、クローニングに使用後
の残液をポリスチレン製25cm2組織培養フラスコ(
Iwaki Glass)に移し、凍結保存用試料を調
製する。
(e)固相−抗体結合テスト(ELISA)による抗つ
ンコラゲナーゼインヒビター抗体産生ハイブリドーマの
検索 Anal、 Biochem、 104.205〜21
4(1980)に記載のRennardらの方法を若干
改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に適している。96穴ミクロタイトレー/ヨン
プレ−) (FIOW Laboratories、
Inc、)を0.5−1.0μ9のウシコラゲナーゼ
インヒビターでコートし、次に、未コート部分を1%牛
血清アルブミン(BSA)でブロックする。これに前記
(d)で得られたハイブリドーマ生育ウェルの上清の一
部を加えて室温で約1時間インキュベートする。2次抗
体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン(cappel Lab、)を加え、
さらに室温で約1時間インキュベートする。次に過酸化
水素と基質であるo−フェニレンジアミンを加え生成し
た褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコ
ロナ2波長マイクロプレート光度計(MTP−22、コ
ロナ電気社)を用いて500nmの吸光度を測定する。
ンコラゲナーゼインヒビター抗体産生ハイブリドーマの
検索 Anal、 Biochem、 104.205〜21
4(1980)に記載のRennardらの方法を若干
改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリドーマ抗
体の検出に適している。96穴ミクロタイトレー/ヨン
プレ−) (FIOW Laboratories、
Inc、)を0.5−1.0μ9のウシコラゲナーゼ
インヒビターでコートし、次に、未コート部分を1%牛
血清アルブミン(BSA)でブロックする。これに前記
(d)で得られたハイブリドーマ生育ウェルの上清の一
部を加えて室温で約1時間インキュベートする。2次抗
体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン(cappel Lab、)を加え、
さらに室温で約1時間インキュベートする。次に過酸化
水素と基質であるo−フェニレンジアミンを加え生成し
た褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるいはコ
ロナ2波長マイクロプレート光度計(MTP−22、コ
ロナ電気社)を用いて500nmの吸光度を測定する。
(f)クローニング
前記(d)の操作後、各ウェル中には2種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。N5−1培地mα当りフィー
ダーとして10′@のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、96六マイクロウエルの36ウエル、
36ウエルおよび24ウエルにウェル当り5個、1個お
よび0.5個のハイブリドーマをカロえる。5日目、1
22日目全ウェルに各約0.1m+2のN5−1培地を
追加する。クローニング開始後14〜15E3で充分な
ハイブリドーマの生育が認められ、コロニ形成陰性ウェ
ルが50%以上である群についてELISA法を行う。
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを取得する。N5−1培地mα当りフィー
ダーとして10′@のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、96六マイクロウエルの36ウエル、
36ウエルおよび24ウエルにウェル当り5個、1個お
よび0.5個のハイブリドーマをカロえる。5日目、1
22日目全ウェルに各約0.1m+2のN5−1培地を
追加する。クローニング開始後14〜15E3で充分な
ハイブリドーマの生育が認められ、コロニ形成陰性ウェ
ルが50%以上である群についてELISA法を行う。
テストした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル
中のコロニー数を確認し、ウェル中に1コロニーが確認
されたウェルを4〜6個選び再クローニングする。最終
的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドー11フ株が得られた。
中のコロニー数を確認し、ウェル中に1コロニーが確認
されたウェルを4〜6個選び再クローニングする。最終
的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体産生ハイブリドー11フ株が得られた。
(g)モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをN5
−1培地などの適当な培養液で培養(生体外増殖)し、
その培養上清から得ることができる(モノクローナル抗
体たん白質濃度は10〜100μg/mQである)。一
方、大量に抗体を得るためには肺細胞とミエローマ細胞
の由来動物と同系の動物(Balb/c、マウス)に腫
瘍形成促進剤ブリスタン(2,6,10,14−テトラ
メチルペンタデカン、Aldrich Chemica
1社)をマウス−匹当たりQ、5m12腹腔内投与し、
1〜3週間後に、各ハイブリドーマlXl0’個を同じ
く腹腔内投与することにより生体内で、さらに、1〜2
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度4〜7mg/
mQの腹水を得ることができる。
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをN5
−1培地などの適当な培養液で培養(生体外増殖)し、
その培養上清から得ることができる(モノクローナル抗
体たん白質濃度は10〜100μg/mQである)。一
方、大量に抗体を得るためには肺細胞とミエローマ細胞
の由来動物と同系の動物(Balb/c、マウス)に腫
瘍形成促進剤ブリスタン(2,6,10,14−テトラ
メチルペンタデカン、Aldrich Chemica
1社)をマウス−匹当たりQ、5m12腹腔内投与し、
1〜3週間後に、各ハイブリドーマlXl0’個を同じ
く腹腔内投与することにより生体内で、さらに、1〜2
週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度4〜7mg/
mQの腹水を得ることができる。
(h)モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖及びアイソタイ
プ 前記(g)で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナー
ゼインヒビターをコートしたミクロタイトレージョンプ
レートに前述したELISA法に従って結合させる。P
BSによる洗浄後火に、アイソタイプ特異的ウサギ抗マ
ウスIg抗体(ZymedLaborator 1es
)を加える。PBSによる洗浄後、西洋わさびペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG(H+L )抗体を加
え、基質として2.2′−アジノージ(3−エチルベン
ゾチアゾリン硫酸−6)および過酸化水素を用いて検出
した。その結果をまとめて後掲の第1表に示した。得ら
れたウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体の内15個が免疫グロブリン鎖γ1/にを、1
個が12a/にを、そして、IWAがγ2b/にを有し
ていた。
プ 前記(g)で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナー
ゼインヒビターをコートしたミクロタイトレージョンプ
レートに前述したELISA法に従って結合させる。P
BSによる洗浄後火に、アイソタイプ特異的ウサギ抗マ
ウスIg抗体(ZymedLaborator 1es
)を加える。PBSによる洗浄後、西洋わさびペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG(H+L )抗体を加
え、基質として2.2′−アジノージ(3−エチルベン
ゾチアゾリン硫酸−6)および過酸化水素を用いて検出
した。その結果をまとめて後掲の第1表に示した。得ら
れたウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体の内15個が免疫グロブリン鎖γ1/にを、1
個が12a/にを、そして、IWAがγ2b/にを有し
ていた。
(i)モノクローナル抗体の精製
前記(g)で得られた各腹水を硫安分画(40%飽和)
後、塩化ナトリウム0.06Mを含む40mMリン酸緩
衝液、pH8,0で平衡化したDEAE−5ephac
e 1(pharmac ia社)の非吸着画分を分取
し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリウムを
含む50mMリン酸緩衝液、pH7,4で平衡化した5
ephacryl S −300Superf ine
(Pharmacia社)カラムでゲルが過し、培地中
のFe2およびマウス由来のたん白質を分離、除去した
。
後、塩化ナトリウム0.06Mを含む40mMリン酸緩
衝液、pH8,0で平衡化したDEAE−5ephac
e 1(pharmac ia社)の非吸着画分を分取
し、このIgG画分を更に0.42M塩化ナトリウムを
含む50mMリン酸緩衝液、pH7,4で平衡化した5
ephacryl S −300Superf ine
(Pharmacia社)カラムでゲルが過し、培地中
のFe2およびマウス由来のたん白質を分離、除去した
。
実施例 2
ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターとモノクローナル抗
体との交叉性 (a)酵素標識モノクローナル抗体(Fab’−POD
複合体)の調製法 (1) Fab’画分の調製 実施例1(i)で得られたIgG画分を0.1M塩化ナ
トリウム含有0.1M酢酸緩衝液(pH4,2)に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、前記画分中の[gGに対して2%(w/
w)のペプシンを加え、37°C124時間消化した。
体との交叉性 (a)酵素標識モノクローナル抗体(Fab’−POD
複合体)の調製法 (1) Fab’画分の調製 実施例1(i)で得られたIgG画分を0.1M塩化ナ
トリウム含有0.1M酢酸緩衝液(pH4,2)に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、前記画分中の[gGに対して2%(w/
w)のペプシンを加え、37°C124時間消化した。
更にその消化物に2Mトリス溶液を加えてpuを7.0
に調整することにより消化反応を停止させ、O,1Mす
〉゛酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したウシトロゲル
AcA 44カラム(LKB製)を用いたゲル濾過によ
りF(ab’)2画分を分取しlこ 。
に調整することにより消化反応を停止させ、O,1Mす
〉゛酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したウシトロゲル
AcA 44カラム(LKB製)を用いたゲル濾過によ
りF(ab’)2画分を分取しlこ 。
次に、このF(ab’)2両分をエチレンジアミン四酢
酸(EDTA)含有0.1Mリン酸緩衝液(pH6,0
)中で透析し、終濃度10mMとなるようにアミノエタ
ンチオール(M E A )を加え37°Cで1.5時
間還元した後、5 mM EDTA含冑0.1Mリン酸
緩衝液(pH6,0)で平衡化したウシトロゲルAcA
44カラムを用いてゲル濾過し、Fab’画分を分取
した。
酸(EDTA)含有0.1Mリン酸緩衝液(pH6,0
)中で透析し、終濃度10mMとなるようにアミノエタ
ンチオール(M E A )を加え37°Cで1.5時
間還元した後、5 mM EDTA含冑0.1Mリン酸
緩衝液(pH6,0)で平衡化したウシトロゲルAcA
44カラムを用いてゲル濾過し、Fab’画分を分取
した。
(2)マレイミド標識POD画分の調製上記(1)の操
作とは別に、以下述へるようにして西洋わさび由来ペル
オキシダーゼ(POD)にマレイミドを標識した。すな
わち、PODをlomg/mQの量で0,1Mリン酸緩
衝液(pH7,0)に溶解し、そのPODに対して、2
5倍モル量のN−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)
コハク酸イミド(EIJC5)をジメチルホルムアミド
溶液として加え、30°C130分間反応させた。これ
を0.1Mリン酸緩衝液(pH6,0)で平衡化したセ
ファデックスG−50カラムでゲル濾過し、マレイミド
標識POD画分を分取した。
作とは別に、以下述へるようにして西洋わさび由来ペル
オキシダーゼ(POD)にマレイミドを標識した。すな
わち、PODをlomg/mQの量で0,1Mリン酸緩
衝液(pH7,0)に溶解し、そのPODに対して、2
5倍モル量のN−(ε−マレイミドカプロイルオキシ)
コハク酸イミド(EIJC5)をジメチルホルムアミド
溶液として加え、30°C130分間反応させた。これ
を0.1Mリン酸緩衝液(pH6,0)で平衡化したセ
ファデックスG−50カラムでゲル濾過し、マレイミド
標識POD画分を分取した。
(3) Fab’−POD複合体画分の調製上記(1)
の如くして調製した画分中のFab’に対して上記(2
)で得られた画分中のマレイミド標識PODとして等モ
ルになるようにして、両画分を混合し、更にFab’お
よびマレイミド標識PODの終濃度が100μMとなる
ように5 mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液(
pH6,0)で希釈した。この混合液を4℃、20時間
反応後、Fab’の10倍モル量のN−エチルマレイミ
ドで未反応のチオール基をブロックした。これを0 、
1 Mリン酸緩衝液(pH6,5)で平衡化したウシト
ロゲルAcA 44カラムでゲルが過し、Fab’−P
OD複合体画分を分取後、0.1%牛血清アルブミン(
BSA)及び0.005%チメロサールを添加し、4°
Cで釆存した。
の如くして調製した画分中のFab’に対して上記(2
)で得られた画分中のマレイミド標識PODとして等モ
ルになるようにして、両画分を混合し、更にFab’お
よびマレイミド標識PODの終濃度が100μMとなる
ように5 mM EDTA含有0.1Mリン酸緩衝液(
pH6,0)で希釈した。この混合液を4℃、20時間
反応後、Fab’の10倍モル量のN−エチルマレイミ
ドで未反応のチオール基をブロックした。これを0 、
1 Mリン酸緩衝液(pH6,5)で平衡化したウシト
ロゲルAcA 44カラムでゲルが過し、Fab’−P
OD複合体画分を分取後、0.1%牛血清アルブミン(
BSA)及び0.005%チメロサールを添加し、4°
Cで釆存した。
(b)ウェスタンブロッティング
実施例1 (a)項で精製したウシ歯髄コラゲナーゼイ
ンヒビターを5DS−PAGEに供した後、市販のPO
D標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンおよび上記実施例2
(a)で得られたFab’−POD複合体を用いて細胞
工学1&2.1061〜1068(1983)に記載の
口部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、
酵素抗体染色のパターンを得た。
ンヒビターを5DS−PAGEに供した後、市販のPO
D標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンおよび上記実施例2
(a)で得られたFab’−POD複合体を用いて細胞
工学1&2.1061〜1068(1983)に記載の
口部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、
酵素抗体染色のパターンを得た。
これを第1図に示す。第1図において、A及びBはウェ
スタンブロッティング後のニトロセルロース膜をそれぞ
れ実施例2(a)で得られたFab’(クローン7−3
F1) −POD複合体及びFab’(りローン7−2
1B12)−POD複合体で免疫染色した結果を示すも
のである。
スタンブロッティング後のニトロセルロース膜をそれぞ
れ実施例2(a)で得られたFab’(クローン7−3
F1) −POD複合体及びFab’(りローン7−2
1B12)−POD複合体で免疫染色した結果を示すも
のである。
また、1〜16は下記の各モノクローナル抗体(いずれ
もIgGタイプ)の溶液にウェスタンブロッティング後
のニトロセルロース膜を浸した後、あらためて各ニトロ
セルロース膜をPOD標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
(Cappel Laborato−r ies製)で
免疫染色した結果を示すものである。
もIgGタイプ)の溶液にウェスタンブロッティング後
のニトロセルロース膜を浸した後、あらためて各ニトロ
セルロース膜をPOD標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
(Cappel Laborato−r ies製)で
免疫染色した結果を示すものである。
1:クローン7−3Fl、 2:クローン7−4F2.
3:クローン7−5Al、 4:クローン7−6C1,
5:クローン7−7F11.6:クローン7−882.
7:クローン7−9B4.8:クローン7−10EII
、 9 :クローン7−11A5、lO:クローン7−
12B6、ll:クローン7−15E8.12:クロー
ン7−18F3.13:クローン7−19F6.14:
クローン7−20C2,15:クローン7−21B12
.16:クローン7−23G9゜第1図に示されるとこ
ろから明らかなように、上記のモノクローナル抗体は、
いずれもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターと交叉する
ことがわかっj二。
3:クローン7−5Al、 4:クローン7−6C1,
5:クローン7−7F11.6:クローン7−882.
7:クローン7−9B4.8:クローン7−10EII
、 9 :クローン7−11A5、lO:クローン7−
12B6、ll:クローン7−15E8.12:クロー
ン7−18F3.13:クローン7−19F6.14:
クローン7−20C2,15:クローン7−21B12
.16:クローン7−23G9゜第1図に示されるとこ
ろから明らかなように、上記のモノクローナル抗体は、
いずれもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターと交叉する
ことがわかっj二。
実施例 3
サンドイッチ酵素免疫測定法
(a)モノクローナル抗体結合ポールの調製法J、 I
mmunoassay 4.209〜327(1983
)に記載の石川らの方法に従って実施例1(i)で得ら
れt;モノクローナル抗体を0.1%アジ化ナトリウム
含有0.1MIJン酸緩衝液(pH7,5)に溶解し、
それを100μg/ m!2(Azao−0−15)の
濃度に調整した後、そのモノクローナル抗体溶液にポリ
スチレンポール(径6.5im、 Precision
Plastic Ba1l製)を浸漬し、4°Cに2
4時間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去し
た後、0.1%BSA。
mmunoassay 4.209〜327(1983
)に記載の石川らの方法に従って実施例1(i)で得ら
れt;モノクローナル抗体を0.1%アジ化ナトリウム
含有0.1MIJン酸緩衝液(pH7,5)に溶解し、
それを100μg/ m!2(Azao−0−15)の
濃度に調整した後、そのモノクローナル抗体溶液にポリ
スチレンポール(径6.5im、 Precision
Plastic Ba1l製)を浸漬し、4°Cに2
4時間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を除去し
た後、0.1%BSA。
0.1%塩化ナトリウム及び0.1%アジ化ナトリウム
含何10mM !Jン酸緩衝液(pH7,0) (、以
下緩衝液Aと略記する)で5回洗浄した後、緩衝液Aに
浸し、4℃で保存した。
含何10mM !Jン酸緩衝液(pH7,0) (、以
下緩衝液Aと略記する)で5回洗浄した後、緩衝液Aに
浸し、4℃で保存した。
(b)サンドイッチ測定法
精製したコラゲナーゼインヒビター溶液、あるいはコラ
ゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を1%BSAを含
む緩衝液Aで希釈し、各試験管に300μαを加えた。
ゲナーゼインヒビターを含む試料溶液を1%BSAを含
む緩衝液Aで希釈し、各試験管に300μαを加えた。
次に前記(a)項で調製した抗体結合ポールを加え、3
7°Cで1時間振とう加温後(第1反応) 、0.1M
塩化ナトリウム含有10mMリン酸緩員液(pH7,0
) 3 mQで各試験管を3回洗浄した。次に実施例2
(a)項で調製したFab’−POD複合体を20ng
/試験管となるように0.1%BSA及びO,1M塩化
ナトリウム含有10mM ’)ン酸緩衝液(pH7,0
)で希釈し30°Cで1時間振とう加温した(第2反応
)。反応終了後、第1反応終了時と同様に洗浄した。次
に0.1M酢酸緩衝液(pH5,5)に溶解したPOD
基質、すなわち0.0134%テトラメチルベンチジン
(TMBZ)を0.3mα加工、更に0.01%過酸化
水素0.1mQを加えて30℃で1時間振とう加温(第
3反応)後、1.33N硫酸0.6mQを添加すること
により反応を停止させた。その反応混液のA45゜値を
分光光度計で測定し、標準直線より試料中のコラゲナー
ゼインヒビター量を求めた。
7°Cで1時間振とう加温後(第1反応) 、0.1M
塩化ナトリウム含有10mMリン酸緩員液(pH7,0
) 3 mQで各試験管を3回洗浄した。次に実施例2
(a)項で調製したFab’−POD複合体を20ng
/試験管となるように0.1%BSA及びO,1M塩化
ナトリウム含有10mM ’)ン酸緩衝液(pH7,0
)で希釈し30°Cで1時間振とう加温した(第2反応
)。反応終了後、第1反応終了時と同様に洗浄した。次
に0.1M酢酸緩衝液(pH5,5)に溶解したPOD
基質、すなわち0.0134%テトラメチルベンチジン
(TMBZ)を0.3mα加工、更に0.01%過酸化
水素0.1mQを加えて30℃で1時間振とう加温(第
3反応)後、1.33N硫酸0.6mQを添加すること
により反応を停止させた。その反応混液のA45゜値を
分光光度計で測定し、標準直線より試料中のコラゲナー
ゼインヒビター量を求めた。
(C)サンドイッチ測定用モノクローナル抗体の選択
コラゲナーゼインヒビターを定量することが可能なモノ
クローナル抗体の組み合わせを探す目的で実施例1(i
)項の方法で精製したクローン7−3Fl、 7−6C
1,7−19F6、および7−21B12の各モノクロ
ーナル抗体からFab’−POD複合体を調製した。一
方、クローン7−3Fl、7−4F2.7−5A1.7
−6CL 7−7Fll、 7−8B2.7−9B4.
7− l0EII、 7−11A5.7−12B6.7
−15E8.7−18F3.7−19F6.7−20C
2,7−21B12、および7−23G9の各モノクロ
ーナル抗体を固相として、試験管当たりlogの精製し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを用いて実施例3
(b)項の方法によりサンドイッチ定量を行った。得ら
れたA45a値を後掲の第2表に示す。なお、第2表中
のA45Q値は試料1ng添加の値からコラゲナーゼイ
ンヒビターを添加しない時の値を差し引いた数値である
。上記4種類のいずれのFab’−POD複合体を用い
た場合においても、固相として7−4F2.7−1lA
5.7−12B6.7−18F3.7−20C2、およ
び723G9の6種類の抗体を用いた時のAIS。が2
以上の値を示した。次にこれら24通りの組み合わせに
ついて、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの添加量を
変えてサンドイッチ定量を行った。
クローナル抗体の組み合わせを探す目的で実施例1(i
)項の方法で精製したクローン7−3Fl、 7−6C
1,7−19F6、および7−21B12の各モノクロ
ーナル抗体からFab’−POD複合体を調製した。一
方、クローン7−3Fl、7−4F2.7−5A1.7
−6CL 7−7Fll、 7−8B2.7−9B4.
7− l0EII、 7−11A5.7−12B6.7
−15E8.7−18F3.7−19F6.7−20C
2,7−21B12、および7−23G9の各モノクロ
ーナル抗体を固相として、試験管当たりlogの精製し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを用いて実施例3
(b)項の方法によりサンドイッチ定量を行った。得ら
れたA45a値を後掲の第2表に示す。なお、第2表中
のA45Q値は試料1ng添加の値からコラゲナーゼイ
ンヒビターを添加しない時の値を差し引いた数値である
。上記4種類のいずれのFab’−POD複合体を用い
た場合においても、固相として7−4F2.7−1lA
5.7−12B6.7−18F3.7−20C2、およ
び723G9の6種類の抗体を用いた時のAIS。が2
以上の値を示した。次にこれら24通りの組み合わせに
ついて、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの添加量を
変えてサンドイッチ定量を行った。
Fab’(クローン7−6C1)−PODを複合体とし
て、クローン7−23C9抗体を固相とした場合に得ら
れた結果を第2図に示す。第2図に示すように、添加し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター量とAtS。の間
に直線関係が成立し、定量感度は試験背当たり約111
)g(32a moQ)であった。上記以外の組み合わ
せについても上記の直線関係がみられ、いずれの組み合
わせについてもサンドイッチ定量が可能であることがわ
かった。
て、クローン7−23C9抗体を固相とした場合に得ら
れた結果を第2図に示す。第2図に示すように、添加し
たウシ歯髄コラゲナーゼインヒビター量とAtS。の間
に直線関係が成立し、定量感度は試験背当たり約111
)g(32a moQ)であった。上記以外の組み合わ
せについても上記の直線関係がみられ、いずれの組み合
わせについてもサンドイッチ定量が可能であることがわ
かった。
実施例 4
ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの同定(a)ア
フイニテイ力ラムの調製 Nature 214.1302−1304(1967
)に記載のAx6nらおよびProc、 Natl、
Acad、 Sci、 USA+ 61636−643
(1968)に記載のCuatrecasasらの方法
に従って臭化シアンを介して担体のセファロース4Bに
リガンドとして実施例1(i)項で得られた精製モノク
ローナル抗体を固定化した。次に抗体結合セファロース
4Bゲル0.3mQをガラス管に充填し、0.1M塩化
ナトリウムおよび5+n)J塩化カルシウム含有30m
Mト!Jスー塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化し使用
した。
フイニテイ力ラムの調製 Nature 214.1302−1304(1967
)に記載のAx6nらおよびProc、 Natl、
Acad、 Sci、 USA+ 61636−643
(1968)に記載のCuatrecasasらの方法
に従って臭化シアンを介して担体のセファロース4Bに
リガンドとして実施例1(i)項で得られた精製モノク
ローナル抗体を固定化した。次に抗体結合セファロース
4Bゲル0.3mQをガラス管に充填し、0.1M塩化
ナトリウムおよび5+n)J塩化カルシウム含有30m
Mト!Jスー塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化し使用
した。
(b)ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの7フイニテ
イ力ラムクロマトグラフイー ヒト血清1mQを0.1M塩化ナトリウムおよび5mM
塩化カルシウム含有30mM トリス−塩酸緩衝液(p
H8,0)に対して透析した後、上記(a)項記載の方
法に従って調製したクローン7−21B12抗体結合セ
ファロース4Bカラムに供し、上記緩衝液で洗浄しく非
吸着画分)、次にカラムを2M塩化ナトリウム含有30
mM トリス−塩酸緩衝液(pH7,5)および0.5
M塩化ナトリウム含有0.2Mグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液(pH10,5)で順次洗浄しく洗浄画分)
、最後にカラムに吸着した蛋白質を0.2Mグリシン−
塩酸緩衝液(pH2,0)で溶出した(溶出画分)。得
られた溶出画分を0.1M塩化ナトリウムおよび5m1
J塩化力ルシウム含有30mM トリス−塩酸緩衝液(
pH8,0)中で透析した後、もう−度クローン7−2
1B12抗体結合セファロース4Bカラムを用いた再ア
フイニテイクロマトグラフイーに供し、上記と同様の操
作により溶出画分にコラゲナーゼインヒビターを得た。
イ力ラムクロマトグラフイー ヒト血清1mQを0.1M塩化ナトリウムおよび5mM
塩化カルシウム含有30mM トリス−塩酸緩衝液(p
H8,0)に対して透析した後、上記(a)項記載の方
法に従って調製したクローン7−21B12抗体結合セ
ファロース4Bカラムに供し、上記緩衝液で洗浄しく非
吸着画分)、次にカラムを2M塩化ナトリウム含有30
mM トリス−塩酸緩衝液(pH7,5)および0.5
M塩化ナトリウム含有0.2Mグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液(pH10,5)で順次洗浄しく洗浄画分)
、最後にカラムに吸着した蛋白質を0.2Mグリシン−
塩酸緩衝液(pH2,0)で溶出した(溶出画分)。得
られた溶出画分を0.1M塩化ナトリウムおよび5m1
J塩化力ルシウム含有30mM トリス−塩酸緩衝液(
pH8,0)中で透析した後、もう−度クローン7−2
1B12抗体結合セファロース4Bカラムを用いた再ア
フイニテイクロマトグラフイーに供し、上記と同様の操
作により溶出画分にコラゲナーゼインヒビターを得た。
そこで、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体がヒト血清コラゲナーゼインヒビター
と交叉するのか否かを検討するため、上記の溶出画分を
5OS−PAGEに供した後、ウェスタンブロッティン
グを行った。
ノクローナル抗体がヒト血清コラゲナーゼインヒビター
と交叉するのか否かを検討するため、上記の溶出画分を
5OS−PAGEに供した後、ウェスタンブロッティン
グを行った。
第3図はウェスタンブロッティング後のニトロセルロー
ス膜を1:クローン7−3F1.2:クローン7−6C
1,3: 7−19F6.4:クローン7−21B12
および5:クローン7−23G9の各モノクローナル抗
体から調製したFab’−PODI合体で免疫染色を行
った結果を示すものである。第3図に示されるように、
ヒト血清中にもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在することがわかった。しかも、それらの分
子量はいずれも実施例1(a)項で得られたウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターのそれと同じ32.000Dで
あることがわかった。
ス膜を1:クローン7−3F1.2:クローン7−6C
1,3: 7−19F6.4:クローン7−21B12
および5:クローン7−23G9の各モノクローナル抗
体から調製したFab’−PODI合体で免疫染色を行
った結果を示すものである。第3図に示されるように、
ヒト血清中にもウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在することがわかった。しかも、それらの分
子量はいずれも実施例1(a)項で得られたウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターのそれと同じ32.000Dで
あることがわかった。
実施例 5
サンドイッチ測定法によるヒト血清中のコラゲナーゼイ
ンヒビターの定量 (a)標準直線の作成 ヒトコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量する
のに最も適したモノクローナル抗体の組み合わせについ
て検討した。実施例3(c)項に示したように、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターを感度良く定量できる4種
類のFab’POD複合体、すなわち、Fab’(73
F1)−POD、Fab’(7−6C1)−POD%F
ab’(7−19F6)−PODおよびFab’(7−
21B12)−PODと6種類の固相用抗体、すなわち
、クローン7−4F2.7−11A5.7−12B6.
7−18F3.7−20C2および7−23G9のモノ
クローナル抗体を用いた24通りの組み合わせのうち、
実施例4(b)項に記載したとおりにカラムクロマトグ
ラフィー鬼理したヒト血清コラゲナーゼインヒビターを
定量できる組み合わせを調べた。その結果、ヒト血清コ
ラゲナーゼインヒビターを抗原とした場合、用いたほと
んどの組み合わせでA4S。のシグナルは全く検出され
なかったが、固相用抗体としてクローン7−23G9抗
体、複合体としてFab’ (クローン7−6C1)
−PODを用いた場合、サンドイッチ定量可能であるこ
とがわかった。次に、上記の組み合わせを用いて、実施
例3(c)項に示した方法により、ヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターの添加量を変えてサンドイッチ定量を行
うことによって標準直線を作成し、得られた結果を第4
図に示す。第4図にみられるように、添加したヒト血清
コラゲナーゼインヒビター量とA45゜の間に直線関係
が成立し、ヒトコラゲナーゼインヒビターの定量が可能
であることがわかった。しかし、その定量感度は試験管
当たり約10pg(320a moQ)であり、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターの場合の定量感度(試験管
当たり1111g)に比べて10倍低いことがわかった
。
ンヒビターの定量 (a)標準直線の作成 ヒトコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量する
のに最も適したモノクローナル抗体の組み合わせについ
て検討した。実施例3(c)項に示したように、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターを感度良く定量できる4種
類のFab’POD複合体、すなわち、Fab’(73
F1)−POD、Fab’(7−6C1)−POD%F
ab’(7−19F6)−PODおよびFab’(7−
21B12)−PODと6種類の固相用抗体、すなわち
、クローン7−4F2.7−11A5.7−12B6.
7−18F3.7−20C2および7−23G9のモノ
クローナル抗体を用いた24通りの組み合わせのうち、
実施例4(b)項に記載したとおりにカラムクロマトグ
ラフィー鬼理したヒト血清コラゲナーゼインヒビターを
定量できる組み合わせを調べた。その結果、ヒト血清コ
ラゲナーゼインヒビターを抗原とした場合、用いたほと
んどの組み合わせでA4S。のシグナルは全く検出され
なかったが、固相用抗体としてクローン7−23G9抗
体、複合体としてFab’ (クローン7−6C1)
−PODを用いた場合、サンドイッチ定量可能であるこ
とがわかった。次に、上記の組み合わせを用いて、実施
例3(c)項に示した方法により、ヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターの添加量を変えてサンドイッチ定量を行
うことによって標準直線を作成し、得られた結果を第4
図に示す。第4図にみられるように、添加したヒト血清
コラゲナーゼインヒビター量とA45゜の間に直線関係
が成立し、ヒトコラゲナーゼインヒビターの定量が可能
であることがわかった。しかし、その定量感度は試験管
当たり約10pg(320a moQ)であり、ウシ歯
髄コラゲナーゼインヒビターの場合の定量感度(試験管
当たり1111g)に比べて10倍低いことがわかった
。
(b)患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの定量
上記(a)において示したモノクローナル抗体の組み合
わせを用いて健常人血清95検体、原発性肝臓癌患者血
清100検体および転移性肝臓癌患者血清3検体の中に
存在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量
し、その結果を第3表の1および2に示した。なお、こ
のサンドイッチ定量において、標準直線の作成には抗原
として実施例4(b)項で精製したヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターを用いた。また、この定量は検体血清を
1% BSAを含む緩衝液Aで1.600倍に希釈して
行った。第3表の1および2に示した数値は同一の実験
系を2回行った結果の平均値である。第3表の1にみら
れるように、健常人血’aLmO,中に存在するコラゲ
ナーゼインヒビター量は平均1.59±0.37μ9で
あるのに対し、原発性肝臓癌患者血清および転移性肝臓
癌患者血清1mQ中に存在するコラゲナーゼインヒビタ
ー量は第3表の2に見られるようにそれぞれ平均3.2
2±2.1Oμ9および7.81±3.87μgと高い
値を示した。一方、肝硬変患者血清46検体、慢性活動
性肝炎患者血a45検体および慢性非活動性肝炎患者血
清26検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビターを
サンドイッチ定量した値を第4表に示した。その結果、
肝硬変患者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢
性非活動性肝炎患者血清中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量はそれぞれ平均1.52±1.08μ9.1
.55±0.58μ9および1.10±0.48μ9で
あり、これらの値はいずれも健常人血清中に存在するコ
ラゲナーゼインヒビター量と有意の差は認められなかっ
た。
わせを用いて健常人血清95検体、原発性肝臓癌患者血
清100検体および転移性肝臓癌患者血清3検体の中に
存在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量
し、その結果を第3表の1および2に示した。なお、こ
のサンドイッチ定量において、標準直線の作成には抗原
として実施例4(b)項で精製したヒト血清コラゲナー
ゼインヒビターを用いた。また、この定量は検体血清を
1% BSAを含む緩衝液Aで1.600倍に希釈して
行った。第3表の1および2に示した数値は同一の実験
系を2回行った結果の平均値である。第3表の1にみら
れるように、健常人血’aLmO,中に存在するコラゲ
ナーゼインヒビター量は平均1.59±0.37μ9で
あるのに対し、原発性肝臓癌患者血清および転移性肝臓
癌患者血清1mQ中に存在するコラゲナーゼインヒビタ
ー量は第3表の2に見られるようにそれぞれ平均3.2
2±2.1Oμ9および7.81±3.87μgと高い
値を示した。一方、肝硬変患者血清46検体、慢性活動
性肝炎患者血a45検体および慢性非活動性肝炎患者血
清26検体の中に存在するコラゲナーゼインヒビターを
サンドイッチ定量した値を第4表に示した。その結果、
肝硬変患者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢
性非活動性肝炎患者血清中に存在するコラゲナーゼイン
ヒビター量はそれぞれ平均1.52±1.08μ9.1
.55±0.58μ9および1.10±0.48μ9で
あり、これらの値はいずれも健常人血清中に存在するコ
ラゲナーゼインヒビター量と有意の差は認められなかっ
た。
実施例 6
ヒト血清中のコラゲナーゼインヒビターの精製
実施例4の(b)で最終的に得られた溶出画分中には前
述したとおり、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在する(第3図参照)。しかし、この溶出画
分中には、コラゲナーゼインヒビター以外にも、上記モ
ノクローナル抗体とは反応しない蛋白質が多種存在する
ことが認められた。そこで、この溶出画分をO,1MI
Jン酸緩衝液(pH7,5)で平衡化したAcA 44
カラムを用いてゲルが過を行い、コラゲナーゼインヒビ
ターと他の蛋白質とを分離することによりヒト血清コラ
ゲナーゼインヒビターを精製した。第5図は得られた血
清コラゲナーゼインヒビター(1)、対照としてのウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビター(2)および分子量マー
カー(3)の各5OS−PAGEパターンを示している
。
述したとおり、ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対
するモノクローナル抗体と反応するコラゲナーゼインヒ
ビターが存在する(第3図参照)。しかし、この溶出画
分中には、コラゲナーゼインヒビター以外にも、上記モ
ノクローナル抗体とは反応しない蛋白質が多種存在する
ことが認められた。そこで、この溶出画分をO,1MI
Jン酸緩衝液(pH7,5)で平衡化したAcA 44
カラムを用いてゲルが過を行い、コラゲナーゼインヒビ
ターと他の蛋白質とを分離することによりヒト血清コラ
ゲナーゼインヒビターを精製した。第5図は得られた血
清コラゲナーゼインヒビター(1)、対照としてのウシ
歯髄コラゲナーゼインヒビター(2)および分子量マー
カー(3)の各5OS−PAGEパターンを示している
。
第5図にみられるように、ヒト血清コラゲナーゼインヒ
ビターの分子量はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの
それと同様、32,0OODであることがわかった。
ビターの分子量はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの
それと同様、32,0OODであることがわかった。
−イー
実施例 7
サンドイッチ測定法における精製ヒト血清コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線の作成実施例6において得られ
た精製ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの添加量を変
えて、実施例5の(a)項記載のモノクローナル抗体の
組ミ合わせを用いてサンドイッチ定量を行うことによっ
て標準直線を作成した。得られた結果は第6図に示すと
おりである。第6図にみられるように、添加したヒト血
清コラゲナーゼインヒビター量とA45Oの間に直線関
係が成立し、この時の定量感度は試験背当たり1.5p
g(48a moQ)であった。この定量感度は、実施
例5の(a)項で作成した標準直線の場合に比べて6.
7倍高く、また、実施例3の(c)項記載のウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターの場合に比へて1.5倍低いこ
とがわかった。
インヒビターの標準直線の作成実施例6において得られ
た精製ヒト血清コラゲナーゼインヒビターの添加量を変
えて、実施例5の(a)項記載のモノクローナル抗体の
組ミ合わせを用いてサンドイッチ定量を行うことによっ
て標準直線を作成した。得られた結果は第6図に示すと
おりである。第6図にみられるように、添加したヒト血
清コラゲナーゼインヒビター量とA45Oの間に直線関
係が成立し、この時の定量感度は試験背当たり1.5p
g(48a moQ)であった。この定量感度は、実施
例5の(a)項で作成した標準直線の場合に比べて6.
7倍高く、また、実施例3の(c)項記載のウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターの場合に比へて1.5倍低いこ
とがわかった。
実施例 8
サンドイッチ測定法によるヒト血清中あるいはヒト血清
中のコラゲナーゼインヒビターの定量に基づく肝臓癌疾
患の診断 (a)肝疾患患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの
定量 実施例7において示したモノクローナル抗体の組み合わ
せを用いて健常人血清50検体、原発性肝臓癌患者血清
100検体および転移性肝臓癌患者血清3検体の中に存
在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量し
、その結果を第5表の1および2に示した。なお、この
サンドイッチ定量において、標準直線の作成には抗原と
して実施例6で精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いた。また、この定量は検体血清を1% BS
Aを含む緩衝液Aで1.600倍に希釈して行った。第
5表の18よび2に示した数値は同一の実験系を2回行
った結果の平均値である。第5表の1にみられるよ、う
に、健常人血a1mQ中に存在するコラゲナーゼインヒ
ビター量は平均184±31ngであるのに対し、原発
性肝臓癌患者血清および転移性肝臓癌患者血清l mQ
中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は第5表の2
に見られるようにそれぞれ平均484±316ngおよ
び1171±712ngと高い値を示した。一方、肝硬
変患者血清46検体、慢性活動性肝炎患者血a45検体
および慢性非活動性肝炎患者血清26検体の中に存在す
るコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量した値
を第6表に示した。第6表に見られるように、肝硬変患
者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢性非活動
性肝炎患者血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター
量はそれぞれ平均228±163ng、233±88n
gおよび166±73ngであり、これらの値はいずれ
も健常人血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター量
と有意の差は認められなかつIこ 。
中のコラゲナーゼインヒビターの定量に基づく肝臓癌疾
患の診断 (a)肝疾患患者血清中のコラゲナーゼインヒビターの
定量 実施例7において示したモノクローナル抗体の組み合わ
せを用いて健常人血清50検体、原発性肝臓癌患者血清
100検体および転移性肝臓癌患者血清3検体の中に存
在するコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量し
、その結果を第5表の1および2に示した。なお、この
サンドイッチ定量において、標準直線の作成には抗原と
して実施例6で精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いた。また、この定量は検体血清を1% BS
Aを含む緩衝液Aで1.600倍に希釈して行った。第
5表の18よび2に示した数値は同一の実験系を2回行
った結果の平均値である。第5表の1にみられるよ、う
に、健常人血a1mQ中に存在するコラゲナーゼインヒ
ビター量は平均184±31ngであるのに対し、原発
性肝臓癌患者血清および転移性肝臓癌患者血清l mQ
中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は第5表の2
に見られるようにそれぞれ平均484±316ngおよ
び1171±712ngと高い値を示した。一方、肝硬
変患者血清46検体、慢性活動性肝炎患者血a45検体
および慢性非活動性肝炎患者血清26検体の中に存在す
るコラゲナーゼインヒビターをサンドイッチ定量した値
を第6表に示した。第6表に見られるように、肝硬変患
者血清中、慢性活動性肝炎患者血清中および慢性非活動
性肝炎患者血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター
量はそれぞれ平均228±163ng、233±88n
gおよび166±73ngであり、これらの値はいずれ
も健常人血清中に存在するコラゲナーゼインヒビター量
と有意の差は認められなかつIこ 。
(b)肝疾患患者血漿中のコラゲナーゼインヒビターの
定量 Br、 J、 HaemaLol、 33.239−2
47 (1976)に記載のLudlamとCa5hの
方法に従って、健常人血液および原発性肝臓癌疾患患者
血液からそれぞれの血漿を採取した。なお、ここで採取
した血漿は、血液にEDTAl プロスタグランジンE
いおよびテオフィリンを加え冷却した後、4℃で190
0×960分間遠心分離して得られた上澄であり、血液
中の血小板は、分解されずに沈澱画分にとどまっている
。
定量 Br、 J、 HaemaLol、 33.239−2
47 (1976)に記載のLudlamとCa5hの
方法に従って、健常人血液および原発性肝臓癌疾患患者
血液からそれぞれの血漿を採取した。なお、ここで採取
した血漿は、血液にEDTAl プロスタグランジンE
いおよびテオフィリンを加え冷却した後、4℃で190
0×960分間遠心分離して得られた上澄であり、血液
中の血小板は、分解されずに沈澱画分にとどまっている
。
上記の如くして得られた健常人血漿26検体および原発
性肝臓癌患者血漿8検体の中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビターを上記(a)項に示したのと同じ方法を用い
てサンドイッチ定量した。その結果は後掲の第7表に示
されるとおりである。第7表にみられるように、健常人
血漿1ma中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は
平均64±10ngであるのに対し、原発性肝臓癌疾患
患者血漿中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平
均583±447ngと高い値を示した。
性肝臓癌患者血漿8検体の中に存在するコラゲナーゼイ
ンヒビターを上記(a)項に示したのと同じ方法を用い
てサンドイッチ定量した。その結果は後掲の第7表に示
されるとおりである。第7表にみられるように、健常人
血漿1ma中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は
平均64±10ngであるのに対し、原発性肝臓癌疾患
患者血漿中に存在するコラゲナーゼインヒビター量は平
均583±447ngと高い値を示した。
(C)モノクローナル抗体とコラゲナーゼインヒビター
との特異的反応の確認 実施例4、(b)項に示したように、サンドイッチ測定
法に用いる2種類のモノクローナル抗体(クローン7−
6C1とクローン7−23G9)はヒトコラゲナーゼイ
ンヒビターと反応するが、血清あるいは血漿などのよう
に、種々の蛋白質が高濃度で溶解している系でも、この
モノクローナル抗体がコラゲナーゼインヒビターと特異
的に反応していることを確認するための試験を行っjこ
。
との特異的反応の確認 実施例4、(b)項に示したように、サンドイッチ測定
法に用いる2種類のモノクローナル抗体(クローン7−
6C1とクローン7−23G9)はヒトコラゲナーゼイ
ンヒビターと反応するが、血清あるいは血漿などのよう
に、種々の蛋白質が高濃度で溶解している系でも、この
モノクローナル抗体がコラゲナーゼインヒビターと特異
的に反応していることを確認するための試験を行っjこ
。
健常人血清あるいは肝臓癌患者血清を0.1M塩化ナト
リウムおよび5mM塩化力ルンウム含有3QmM トリ
ス−塩酸緩衝液(pH8,0)で5@に希釈した後、実
施例4の(a)項記載の方法に従って調製したクローン
7−23G9 (サンドイッチ測定法の固相用抗体)結
合セファロース4Bカラムに供し、実施例4の(b)項
記載の方法に従って溶出画分を得た。この溶出画分を5
DS−PAGEに供した後、ウェスタンブロッティング
を行い、サンドイッチ測定法の標識抗体であるFab’
(クローン7−6C1)−POD複合体で免疫染色を
行った。その結果は第7図に示すとおりである。1:精
製ヒト血清コラゲナーゼインヒビター 2=健常人血清
、3:肝臓癌患者血清のいずれを用いた場合ニモ、単一
バンドを示すことから、本発明の診断法におけるサンド
イッチ測定法では、極めて特異的にコラゲナーゼインヒ
ビターだけが定量されていることが示された。
リウムおよび5mM塩化力ルンウム含有3QmM トリ
ス−塩酸緩衝液(pH8,0)で5@に希釈した後、実
施例4の(a)項記載の方法に従って調製したクローン
7−23G9 (サンドイッチ測定法の固相用抗体)結
合セファロース4Bカラムに供し、実施例4の(b)項
記載の方法に従って溶出画分を得た。この溶出画分を5
DS−PAGEに供した後、ウェスタンブロッティング
を行い、サンドイッチ測定法の標識抗体であるFab’
(クローン7−6C1)−POD複合体で免疫染色を
行った。その結果は第7図に示すとおりである。1:精
製ヒト血清コラゲナーゼインヒビター 2=健常人血清
、3:肝臓癌患者血清のいずれを用いた場合ニモ、単一
バンドを示すことから、本発明の診断法におけるサンド
イッチ測定法では、極めて特異的にコラゲナーゼインヒ
ビターだけが定量されていることが示された。
以上述べたことから明らかなように、本発明方法を用い
ることにより、肝臓癌疾患の診断を、箇更に、短時間内
にさらに感度良く行うことかできる。
ることにより、肝臓癌疾患の診断を、箇更に、短時間内
にさらに感度良く行うことかできる。
第
クローン番号
−3F1
−4F2
−5A1
−6C1
−7Fl1
−9B4
7−10EII
−11A5
−12B6
7−14E9
−15E8
7−18F3
−19F6
−20C2
7−21B12
−23G9
■
表
サブクラス/鎖
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
[gG2a/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG2b/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
IgG1/に
第1図はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターを5DS−
PAGEに供した後、種々のモノクローナル抗体を用い
た時のウェスタンブロッティングパターンを示す図であ
り、第2図は固相7−23G9抗体−複合体Fab’(
7−6CL)−POD測定系でのウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線を示す図であり、第3図はヒト
血清コラゲナーゼインヒビターを5DS−PAGEに供
した後、ウェスタンブロッティングを行った時の免疫染
色のパターンを示す図であり、第4図は固相7−23G
9抗体−複合体Fab’(7−6C1)−POD測定系
でのヒト血清コラゲナーゼインヒビターの標準直線を示
す図であり、第5図はヒト血清から精製したコラゲナー
ゼインヒビターの5DS−PAGEパターンを示す図で
あり、第6図は精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いて、サンドイッチ測定した時の標準直線を示
す図であり、第7図はヒト血清をIgG(7−23G9
)抗体結合アフイニテイ力ラムに供して得られた溶出画
分を5DS−PAGEに供した後、Fab’(7−6C
1)−POD複合体を用イf:nノウニスタンブロッテ
ィングパターンを示す図である。 第 図
PAGEに供した後、種々のモノクローナル抗体を用い
た時のウェスタンブロッティングパターンを示す図であ
り、第2図は固相7−23G9抗体−複合体Fab’(
7−6CL)−POD測定系でのウシ歯髄コラゲナーゼ
インヒビターの標準直線を示す図であり、第3図はヒト
血清コラゲナーゼインヒビターを5DS−PAGEに供
した後、ウェスタンブロッティングを行った時の免疫染
色のパターンを示す図であり、第4図は固相7−23G
9抗体−複合体Fab’(7−6C1)−POD測定系
でのヒト血清コラゲナーゼインヒビターの標準直線を示
す図であり、第5図はヒト血清から精製したコラゲナー
ゼインヒビターの5DS−PAGEパターンを示す図で
あり、第6図は精製したヒト血清コラゲナーゼインヒビ
ターを用いて、サンドイッチ測定した時の標準直線を示
す図であり、第7図はヒト血清をIgG(7−23G9
)抗体結合アフイニテイ力ラムに供して得られた溶出画
分を5DS−PAGEに供した後、Fab’(7−6C
1)−POD複合体を用イf:nノウニスタンブロッテ
ィングパターンを示す図である。 第 図
Claims (1)
- コラゲナーゼインヒビターの異なる抗原決定基に対し、
特異的に結合する2種類のモノクローナル抗体の組み合
わせを用いたサンドイッチ法により、酵素免疫学的に血
清中、血漿中あるいは関節液中に存在するコラゲナーゼ
インヒビターを定量し、その定量値を健常人の値と比較
することにより診断を行うことを特徴とする肝臓癌疾患
の診断法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27079788A JP2617783B2 (ja) | 1987-10-30 | 1988-10-28 | 肝臓癌疾患の診断用試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27326587 | 1987-10-30 | ||
JP62-273265 | 1987-10-30 | ||
JP27079788A JP2617783B2 (ja) | 1987-10-30 | 1988-10-28 | 肝臓癌疾患の診断用試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0271153A true JPH0271153A (ja) | 1990-03-09 |
JP2617783B2 JP2617783B2 (ja) | 1997-06-04 |
Family
ID=26549375
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27079788A Expired - Lifetime JP2617783B2 (ja) | 1987-10-30 | 1988-10-28 | 肝臓癌疾患の診断用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2617783B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5439419A (en) * | 1993-01-27 | 1995-08-08 | Nissan Motor Co., Ltd. | Pulley device for continuously variable transmission |
-
1988
- 1988-10-28 JP JP27079788A patent/JP2617783B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5439419A (en) * | 1993-01-27 | 1995-08-08 | Nissan Motor Co., Ltd. | Pulley device for continuously variable transmission |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2617783B2 (ja) | 1997-06-04 |
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