WO2004027423A1 - コラーゲンの測定方法 - Google Patents

コラーゲンの測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004027423A1
WO2004027423A1 PCT/JP2003/011900 JP0311900W WO2004027423A1 WO 2004027423 A1 WO2004027423 A1 WO 2004027423A1 JP 0311900 W JP0311900 W JP 0311900W WO 2004027423 A1 WO2004027423 A1 WO 2004027423A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
measuring
antibody
type
urine
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011900
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuko Matsumoto
Original Assignee
Kudoh, Norio
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kudoh, Norio filed Critical Kudoh, Norio
Priority to EP03797662A priority Critical patent/EP1542011A1/en
Priority to CA002499692A priority patent/CA2499692A1/en
Priority to AU2003264491A priority patent/AU2003264491A1/en
Publication of WO2004027423A1 publication Critical patent/WO2004027423A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring collagen, and more particularly, to a method for measuring collagen with high sensitivity in a small amount of a sample, and a kit for measuring collagen.
  • Type IV collagen is one of the major components of the extracellular matrix of the kidney released from the glomeruli and tubules of kidney tissue (T. Iijima, et al., J. Clini. Lab. Anal., 1998, 12 , 378-382). Urine excretion of type IV collagen increases with the progression of various renal diseases as a result of increased production of type IV collagen in the diseased kidney.
  • urinary type IV collagen levels accurately reflect the rate of metabolism of the elevated extracellular matrix.
  • type IV collagen is a better index than urinary albumin in renal diseases such as diabetic nephropathy (T. Iijima, et al., J. Clini. Lab. Anal., 1998, 12, 378-382; III. P.
  • Type IV collagen is a large polymer with unique structural features including self-aggregation (R. Timpl, et al., Eur. J. Biochem., 1981, 120, 203-211; PD Yurchenco, et al. Biochem., 1984, 23, 1839-1850; PD Yurchenco, et al., J. Histochem. Cytochem., 1986, 34, 93-102; C. Johansson, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 24533- 24537; B.
  • Each type IV collagen molecule has three domains (7S, a small collagenous domain in the N-terminal region, a large collagenous domain in the middle region, and NC1, a non-collagenous globular domain in the C-terminal region).
  • the a-chain trimer is organized in a triple helix in the 7S and large collagenous domains, but in the NC1 domain each chain is folded into a globular structure and stabilized by intrachain disulfide bonds. I have.
  • the 7S and NC1 domains as cross-linking domains, four type IV collagen molecules bind in the 7S domain, two molecules bind in the NC1 domain, and the large type IV collagen molecule A simple polygonal network is generated (R. Timpl, et al., Eur. J. Biochem., 1981, 120, 203-211).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a new type of collagen that can measure a small amount of collagen in a small amount of sample even when only a small amount of sample such as mouse urine is obtained. It is to provide a measuring method.
  • TR-FIA time-resolved fluorescence immunoassay
  • the present invention provides a method for measuring collagen, which comprises treating a test sample with a reducing agent in a method for measuring collagen by immunoassay using an anti-collagen antibody.
  • the immunoassay is a fluorescence immunoassay using an anti-collagen antibody, more preferably a sandwich time-resolved fluorescence immunoassay (TR-FIA).
  • TR-FIA sandwich time-resolved fluorescence immunoassay
  • the collagen is type IV collagen.
  • the reducing agent is dithiothreitol.
  • the test sample is urine, and more preferably, urine of an experimental animal.
  • the concentration of the reducing agent in the test sample is from 0.1 mM to 1 OmM, more preferably from 0.1 mM to 5 ⁇ , and even more preferably from 0.5 ⁇ to 5 mM.
  • the method for measuring collagen of the present invention preferably comprises the following steps;
  • kits for performing a method for measuring collagen comprising at least a reducing agent and an anti-collagen antibody.
  • FIG. 1 shows a standard curve of mouse type IV collagen by TR-FIA (A) and competitive ELISA (B). Each point represents the average soil SD of four experiments.
  • FIG. 2 shows the correlation between the concentration of mouse urine containing type IV collagen and the fluorescence intensity of TR_FIA.
  • concentrations before (shown by white squares and circles) and after (shown by black squares and circles) the addition of DTT were measured using urine samples of KK / Ta and BALBZc. Each point represents the average soil SD of three experiments.
  • FIG. 3 shows the effect of DTT concentration on urine and standard samples.
  • Urine samples and standard solutions from KKZTa mice were incubated with 0, 2, and 5 mM equivalents of D-chome.
  • Figure 5 shows type IV collagen isolated from whole kidney of KKZT a and BALB / c.
  • a highly sensitive Imnoassay method for measuring a trace amount of collagen such as type IV collagen in mouse urine.
  • the test sample is pretreated using dithiothreitol (DTT) based on the structural characteristics of the type IV collagen molecule.
  • DTT dithiothreitol
  • the detection limit of the conventional competitive ELISA without DTT treatment was 2.4 ng / m1
  • the detection limit of 27 g / m1 in a 5 ⁇ 1 urine sample was It is possible to measure type IV collagen.
  • the amount of type IV collagen in urine derived from 12 samples of two mouse strains was measured. It was found that the amount of type collagen was clearly different. Compared to the case without DTT pretreatment, the method of the present invention can measure even a very small amount of sample, so it is particularly suitable for measuring type IV collagen in urine of mice with limited sample volume. .
  • the method for measuring collagen by immunoassay using an anti-collagen antibody of the present invention is characterized in that a test sample is treated with a reducing agent.
  • the test sample used in the present invention is not particularly limited as long as the amount of collagen needs to be measured.
  • examples include urine, blood, serum, plasma, tissue fluid, saliva, and the like of mammals such as humans or rats and mice. Any body fluid such as sweat is included.
  • the method for measuring collagen of the present invention can measure even a small amount of collagen in a very small amount of sample with high sensitivity, so that only a small amount is usually collected and it is difficult to collect a large amount of sample.
  • Urine of an experimental animal or the like can be used as a test sample.
  • the type of collagen measured in the present invention is not particularly limited. Vertebrate collagen can be classified from type I to type XXV, and in the present invention, any type of collagen may be measured. In the present invention, among these, particularly preferred is type IV collagen.
  • the reducing agent used in the present invention is not particularly limited as long as it can reduce disulfide bonds in collagen, and for example, dithiothreitol (DTT), i3-mercaptoethanol and the like can be used. Particularly preferably, dithiotrate Nil (DTT) can be used.
  • DTT dithiothreitol
  • i3-mercaptoethanol i3-mercaptoethanol
  • DTT dithiotrate Nil
  • the test sample is pre-treated with the reducing agent described above.
  • the concentration of the reducing agent in the test sample during the treatment with the reducing agent is preferably 0.1 mM to 10 mM, more preferably 0.1 mM to 5 lnM, and still more preferably 0.5 mM to 5 mM. Yes, for example, about 2 mM.
  • concentration of the reducing agent is less than 0.1 mM, the disulfide bond-reducing effect of the reducing agent is not sufficiently exerted, and when the concentration of the reducing agent is higher than 1 O mM, the steric structure of the epitope of the collagen molecule is reduced. It is not preferable because it may adversely affect the structure.
  • the immunoassay of the present invention is an immunoassay using an anti-collagen antibody.
  • the anti-collagen antibody used in the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and these antibodies can be obtained by a general antibody preparation method.
  • As the antibody not only IgG but also a fragment of the antibody (eg, F (ab ′) 2 fragment, Fab, fragment, etc.) may be used.
  • a polyclonal anti-collagen antibody can be obtained by immunizing a mammal with collagen as an antigen, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood.
  • mammals such as mice, hamsters, guinea pigs, birds, rats, rats, egrets, dogs, goats, sheep, and birds can be immunized.
  • the method of antigen administration is known to those skilled in the art, and the administration route is not particularly limited, and subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, and the like can be appropriately selected.
  • Adjuvants can also be used as needed.
  • the serum of the mammal is sampled in a small amount from the ear vein or the like, and the antibody titer is measured. If the antibody titer rises, booster immunization may be performed by administering an antigen depending on the situation.
  • blood is collected from the immunized animal by a usual method, and the blood is collected, for example, by centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene daricol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography. Separation and purification by ordinary methods such as chromatography, affinity chromatography, etc.
  • a polyclonal antiserum a polyclonal anti-collagen antibody can be obtained.
  • a monoclonal antibody can be obtained, for example, by preparing a hybridoma by cell fusion between an antibody-producing cell and a myeloma cell line.
  • the antibody-producing cells spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from the immunized animal can be used.
  • a hybridoma is prepared by obtaining spleen cells as antibody-producing cells from an immunized animal and fusing them with myeloma cells by a known method (G. Kohler et al., Nature, 256 495 (1975)). be able to.
  • myeloma cell lines used for cell fusion include P3X63Ag8, P3U1, and Sp2Z0 strains in mice.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus is used, and hypoxanthine 'aminopterin' thymidine (HAT) medium can be used according to a standard method for selection of hybridomas after cell fusion.
  • HAT hypoxanthine 'aminopterin' thymidine
  • the hybridoma obtained by cell fusion is cloned by a limiting dilution method or the like.
  • a cell line that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes a desired collagen can be obtained.
  • the hybridoma may be cultured by a usual cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody may be purified from the culture supernatant or ascites. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like can be used in an appropriate combination.
  • Examples of the method for measuring collagen according to the present invention include a fluorescent immunoassay, an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, and a luminescence immunoassay.
  • a fluorescent immunoassay for example, an anti-collagen antibody is bound to an insoluble carrier to prepare an antibody-bound insoluble carrier, and a sandwich immunoassay can be performed using this carrier.
  • a sandwich immunoassay for example, when performing a sandwich immunoassay, (1) treating the test sample with a reducing agent;
  • the anti-collagen antibody used as the labeling antibody is labeled with a labeling substance, preferably a non-radioactive labeling substance.
  • Labels such as enzyme labels, fluorescent labels, and luminescent labels can be used as the non-radioactive labels.
  • the enzyme label for example, alkaline phosphatase (ALP), ⁇ -D-galactosidase, horseradish peroxidase, or the like can be used as a labeling enzyme.
  • ALP alkaline phosphatase
  • ⁇ -D-galactosidase ⁇ -D-galactosidase
  • horseradish peroxidase or the like
  • each enzyme substrate 4-methylpumbellidurifurylphosphate (4-MUP), hydrogen peroxide, and 3,3,5,5,5-tetramethylbench were used.
  • a combination of gins such as 2-nitrophenyl-3-D-galactoside, can be used.
  • the following methods can be used to classify immunoassay measurement methods according to the measurement principle of the instrument. In the present invention, any of these methods may be used.
  • CLIA Chemical Luminescent Inimuno Assay
  • Fluorescent Enzyme Immuno Assay (FEIA) 2. Fluorescent Polarization Immuno Assay (FPIA)
  • the immunoassay of the present invention is preferably a fluorescence immunoassay, particularly preferably a sandwich time-resolved fluorescence immunoassay (TR-FIA).
  • TR-FIA sandwich time-resolved fluorescence immunoassay
  • the fluorescence of these complexes has the following characteristics: (1) The fluorescence lifetime is very long, and rare earth fluorescent complexes, especially complexes of Eu-Pb and Terbium, have a fluorescence lifetime of several hundred microseconds or more; (2 ) Extremely large strike shift.
  • Time-resolved fluorescence immunoassays using rare-earth fluorescent complexes as labeling substances have been developed. Time-resolved fluorescence immunoassays can eliminate various short-lived background fluorescence and enable highly sensitive measurements.
  • the present invention also provides a kit for measuring collagen.
  • the kit of the present invention contains at least a reducing agent and an anti-collagen antibody.
  • the anti-collagen antibody may include two types, an immobilized antibody and a labeled antibody.
  • the kit of the present invention can further include a reagent for detecting the above-mentioned labeling substance.
  • mice Animal experiments were performed according to the guidelines of the animal facility of Juntendo University. For this experiment, two inbred mice (KK / Ta and BALB / c) were purchased from Nippon Crea (Tokyo, Japan) at the age of 4 weeks. From the age of 6 weeks onward, mice were fed food (rodent pellet diet (CE-2; 342.2 kca 1/10 g, containing 4.4% crude fat)) and water throughout the experiment. Individuals were housed individually in plastic cages with free access.Only male mice were used in this study.All mice had a regular photoperiod of 12 hours light / 12 hours dark. The animals were housed in the same room under normal conditions, and the temperature was adjusted to 24 ⁇ 1 ° C.
  • Glucose tolerance was assessed using the intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) for mice.
  • IPGTT intraperitoneal glucose tolerance test
  • Glucose (2 g Z kg in 20% solution) was injected intraperitoneally into mice that had been fasted lately.
  • Egret polyclonal anti-mouse IV type V collagen antibody was purchased from N0V0TEC (StMartinLa Garenne, France). Photinated goat polyclonal anti-human type IV collagen antibody that cross-reacts with mouse type IV collagen was obtained from Abeam (Kemplice, UK). Type IV collagen (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0, USA) derived from Engelbreth- Holm- Swarm-grafted mouse tumor was used as a standard antigen.
  • Streptavidin was obtained from Chemicon International (Temecula, CA, USA). Streptavizy BSA conjugate (SA-BSA) was prepared as previously described (J. Yuan, G. Wang, et al., Anal. Biochem., 1997, 254, 283-287). The SA - BSA conjugate was labeled as previously described with chelate compound BHHCT (J. Yuan, G. Wang, others, Anal.
  • TR-FIA time-resolved fluorescence immunoassay
  • Urine samples were incubated with an equal volume of 2 mM dithiothreitol (Invitrogen, CA, USA) for 30 minutes at 37 ° C.
  • a standard type IV collagen solution (2000 ng / ml) was also incubated with 2 mM DTT. After diluting the sample with the dilution buffer, 50 ⁇ l of the urine or standard solution was applied to a microtiter plate for fluorescence measurement, which was pre-coated with a heron anti-mouse IV type V collagen antibody (1: 200 diluted antibody, 50 ⁇ l / ⁇ l).
  • the plate was washed three times with Tris-HC1 buffer (pH 9.1) containing Tween20, and the plate was subjected to solid-phase fluorescence measurement.
  • Time-resolved fluorescence measurements were performed using an Arvo SX multi-label counter (PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass., USA) with excitation at 340 nm, a delay time of 0.2 ms, and a window time of 0.4 ms. Fluorescence intensity was measured at 615 nm.
  • Urine type IV collagen was measured using a competitive enzyme immunoassay (ELISA) (Collagen IV M kit, Exocell, Philadelphia, PA, USA). The assay was performed according to the kit instructions, and a 240 ⁇ 1 urine sample was used.
  • ELISA competitive enzyme immunoassay
  • Urinary creatine was measured using a commercial kit for urine samples (Creatinine Companion, Exocell, Philadelphia, PA, USA).
  • RNA (10 g) was electrophoresed on 1.5% agarose and transferred to a nylon membrane.
  • the membranes were prehybridized for 4 hours and then hybridized overnight with a 32 ° -labeled cDNA probe for the ⁇ 1 chain of mouse type IV collagen and GAPDH. After washing, the membrane was exposed to an image plate (Fuji Photo Film Company, Tokyo, Japan). The intensity of the band on the Image 'plate was quantified using a densitometer scanning model of BAStation 2500 (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan). Finally, the intensity of the ⁇ chain band was measured using GAPDH band intensity.
  • Urine samples collected from 20-week-old diabetic KK / Ta and non-diabetic BALBZc mice were used to examine the correlation between urinary mouse type IV collagen concentration and fluorescence intensity ( Figure 2).
  • the low recovery of antigen in urine of KK / Ta mice may be caused by type IV collagen presenting macromolecules with multiple disulfide bonds. This suggests that the macromolecule blocks the immune response through non-specific attachment to the gel.
  • both types of collagen were also treated with 2 mM DT. No cross-reactivity with these types of collagen was observed, and pretreatment with DTT did not impart cross-reactivity to other collagen molecules such as type I and type II, while preserving the specificity to type IV collagen. It was confirmed that.
  • TR-FIA mouse type IV collagen was simultaneously measured by competitive ELISA using a commercially available kit.
  • Urine type IV collagen concentrations in 20-week-old diabetic KK / Ta and non-diabetic BALB / c mice were measured by both TR-F18 and competitive £ 1SA.
  • the concentration was higher in the KK / Ta mice than in the B ALBZ c mice (P ⁇ 0.01).
  • the concentration range in TR-FIA was higher than in competitive ELISA.
  • the difference in values between KK / Ta and BALBZc mice was stronger in TR-FIA than in competitive ELISA.
  • mRNA expression of type IV collagen was significantly increased in KKZTa mice compared to BALBZc mice. Densitometric scanning showed that the expression of a1 chain mRNA was 11.1 times higher in KK / Ta mice than in BALB / c mice.
  • Type IV collagen is a macromolecule with multiple structural features. According to gel chromatographic analysis, type IV collagen has a maximum peak of 340 kDa in urine samples. (H. Makino, et al., Res. Co. un. Mol. Pathol. Pharmacol., 1995, 88, 215-223). As described above, this macromolecule is composed of polymer units each having a large number of disulfide bonds as main bonds. It is generally said that the complexity of an imnoassy increases with the size of the molecule to be measured. In Atsey without DTT pretreatment, the fluorescence intensity in high-concentration urine samples was not proportional to the amount of type IV collagen, even though a large amount of collagen was excreted in urine of KK / Ta mice.
  • DTT is used to reduce the number of disulfide bridges, thereby reducing the size of type IV collagen molecules in urine so that antibodies can sufficiently recognize the surface epitope of collagen molecules. Tried.
  • pretreatment of urine samples with DTT restored the positive correlation between urinary type IV collagen concentration and TR-FIA signal intensity.
  • the disulfide bond is thought to be responsible for part of the intermolecular and intramolecular bonds involved in the three-dimensional structure of the type IV collagen molecule. Good results were not obtained even when 0-chome of 2 111] ⁇ or more was added to the standard solution. Excessive pretreatment also affected intramolecular disulfide bonds. There is a possibility that the three-dimensional structure will be changed.
  • TR-FIA concentration range of TR-FIA nearly 100-fold higher than in competitive ELISA? I got it. This is due to differences in the Atsey method, the antibody used, and the addition of DTT. Addition with DTT may contribute to further differences between KK / Ta and BALB / c mice in the case of TR-FIA than in the case of a competitive ELISA. Similar to the TR-FIA results, Northern blot analysis also showed that type IV collagen mRNA was significantly upregulated in KKZT a mice than in BALBZc mice. This difference in expression level supports the results of TR-FIA analysis. TR-FIA required only 5 ⁇ l of urine sample, while competitive ELISA required 240 ⁇ l. In TR-FI II, a small amount of sample was sufficient because of pretreatment with DTT. Industrial potential
  • the method of the present invention it is possible to measure a very small amount of collagen in a very small amount of a sample. Further, according to the method of the present invention, differences in the amount of collagen between mouse strains can be clarified without cross-reacting with other types of collagen. By using the method of the present invention, it is expected that earlier renal damage in an experimental model mouse can be more sensitively evaluated than when a conventional assay method using a protein such as anolebumin as an index is used. You.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

　本発明は、マウスの尿などの少量の試料しか得られない場合であっても、少量の試料中の微量のコラーゲンを測定することを可能にするコラーゲンの新規な測定方法を提供することである。本発明によれば、抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法において被験試料を還元剤で処理することを特徴とする、コラーゲンの測定方法が提供される。

Description

明細書
コラーゲンの測定方法 技術分野
本発明は、 コラーゲンの測定方法、 より詳細には、 少量の試料において高感度 でコラーゲンを測定する方法、 並びにコラーゲンの測定を行うためのキットに関 する。 背景技術
I V型コラーゲンは、 腎組織の腎糸球体及び尿細管から放出される腎細胞外基 質の主要成分の一つである （T. Iijima, 他、 J. Clini. Lab. Anal. , 1998, 12， 378-382)。 I V型コラーゲンの尿への排出は、 病的腎臓における I V型コラー ゲンの産生亢進の結果として各種腎疾患の進行に伴って増加する。
糖尿病性腎症の良好な指標を探索することを目的とした最近の臨床試験によれ ば、 尿中の I V型コラーゲン量は亢進している細胞外基質の代謝の速さを正確に 反映していると考えられている （H. Okonogi, 他、 Clin. Nephrol. , 2001, 55， 357-364； H. Makino, 他、 Res. Commmun. Mol. Pathol. Pharmacol. , 1995, 88， 215- 223；及び、 M. P. Cohen, 他、 Diabetes Care, 2001, 24, 914-918)。 また、 I V型コラーゲンは糖尿病性腎症などの腎疾患において尿アルブミンよりも優れ た指標である (T. Iijima, 他、 J. Clini. Lab. Anal. , 1998， 12， 378 - 382； Μ. P. Cohen,他、 Diabetes Care, 2001, 24, 914-918； N. Banu,他、 Diabetes Res. Clin. Pract. , 1995, 29, 57 - 67；及ぴ N. Kotajima, 他、 J. Diabetes Complications, 2000, 14, 13 - 17)。 ヒト I V型コラーゲンを測定するための各種の E L I S A及 びラジオィムノアッセィ （R I A) が臨床検査で使用されているが （ Risteli, 他、 Anal. Biochem. , 1981， 113， 372- 378；及ぴ K. Obata,他、 Clin. Clim. Acta. , 1989, 181, 293-304)'、 極少量の検体量で尿中の微量なコラーゲンを測定すること を可能にする実用的なマウス I V型コラーゲンの測定方法は存在しない。 I V型コラーゲンは、 自己凝集性を含む独特な構造的特徴を有する巨大なポリ マーである（R. Timpl,他、 Eur. J. Biochem. , 1981, 120, 203-211； P. D. Yurchenco, 他、 Biochem. , 1984， 23， 1839 - 1850； P. D. Yurchenco, 他、 J. Histochem. Cytochem. , 1986， 34, 93-102； C. Johansson, 他、 J. Biol. Chem.， 1992， 267, 24533-24537； B. Siebold, 他、 Eur. J. Biochem.， 1987, 168, 569-575； P. D. Yurchenco, 他、 J. Cell Biol.， 1987， 105, 2559 - 2568；及ぴ R. Dolz, 他、 Eur. J. Biochem. , 1988， 178, 357-366)。 I V型コラーゲン分子は各々、 3つのドメ イン （即ち、 N末端領域の小さなコラーゲン性ドメインである 7 S、 中間領域の 大きなコラーゲン性ドメイン、 及び C末端領域の非コラーゲン性球状ドメインで ある N C 1 ) に分けることができる 3本の α鎖から構成される。 a鎖の 3量体は 7 S及び大きなコラーゲン性ドメインでは 3重らせんに組織化されているが、 N C 1 ドメインでは各鎖は球構造に折り畳まれ、 鎖内のジスルフィド結合により安 定化されている。 架橋ドメインとして 7 S及び N C 1 ドメインを使用することに より、 4つの I V型コラーゲン分子が 7 Sドメイン中で結合し、 2個の分子が N C 1 ドメイン中で結合し、 I V型コラーゲン分子の巨大な多角形ネットワークが 生成する （R. Timpl, 他、 Eur. J. Biochem. , 1981, 120, 203-211)。 我々が特に 注目した重要な構造的特徴は、 ジスルフイド架橋が主要な結合として働き、 分子 内架橋の 8 8 %で使用され、 各ュニットを結合することにより多角形の巨大ネッ トワークを开成していることである （B. Sieboled, 他、 Eur. J. Biochem. , 1988， 176， 617-624) 0 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題は、 マウスの尿などの少量の試料しか得られな い場合であっても、 少量の試料中の微量のコラーゲンを測定することを可能にす るコラーゲンの新規な測定方法を提供することである。
本発明者らは、 実験モデルマウスにおける早期腎障害を正確に反映させること を目的として、 非常に少量の検体量で微量にしか存在しないマウス尿中 I V型コ ラーゲン量を測定するための高感度時間分解蛍光ィムノアッセィ（TR— F I A) を確立することを試みた。 本発明者らは先ず、 上記したような I V型コラーゲン の構造上の特徴に基づいて、 試料をジチオトレイトールで前処理し、 分子間ジス ルフィ ド架橋の数を減少させた。 ジチオトレイトールによる前処理により、 多量 の尿を必要とすることなく、 マウス尿中の. I V型コラーゲンをより正確に測定す ることが可能になった。 本発明の方法と DTTを使用しない通常の競合的 EL I S A法を用いて、 KKZT aマウス （自然発症 I I型糖尿病モデルマウス、 H. Ikeda, Diabetes Res. Clin. Pract. , 1994, 24 (Suppl.), 313-316) 及び糖尿病 を呈しないコントロールマウスとして B A LB/cマウスの両方を用いて尿中の I V型コラーゲンの量を比較した結果、 本発明の方法の有用性が確認された。 本 発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲン の測定方法において被験試料を還元剤で処理することを特徴とする、 コラーゲン の測定方法が提供される。
好ましくは、免疫分析は抗コラーゲン抗体を用いる蛍光ィムノアッセィであり、 さらに好ましくは、サンドィツチ式時間分解蛍光ィムノアッセィ （TR— F I A) である。
好ましくは、 コラーゲンは I V型コラーゲンである。
好ましくは、 還元剤はジチオトレイトールである。
好ましくは、 被験試料が尿であり、 さらに好ましくは、 実験動物の尿である。 好ましくは、 被験試料中の還元剤の濃度は 0. 1 mMから 1 OmMであり、 よ り好ましくは 0. 1 mMから 5πιΜであり、 さらに好ましくは 0. 5πιΜから 5 mMである。
本発明のコラーゲンの測定方法は、 好ましくは、 下記の工程；
(1) 被験試料を還元剤で処理する工程；
(2) 抗コラーゲン固相化抗体を固定化した固相担体に、 上記 （1) で処理した 被験試料を接触させる工程； (3) 上記固相担体に、 標識物質を有する抗コラーゲン標識抗体を接触させるェ 程；及び、
(4) 上記標識物質を利用して、 抗コラーゲン固相化抗体に結合したコラーゲン を検出又は測定する工程；
を含む。
本発明の別の側面によれば、 少なくとも還元剤と抗コラーゲン抗体とを含む、 コラーゲンの測定方法を行うためのキットが提供される。 ' 図面の簡単な説明
図 1は、 TR— F I A (A) 及ぴ競合的 EL I SA (B) によるマウス I V型 コラーゲンの標準曲線を示す。 各点は、 4回の実験の平均土 SDを示す。
図 2は、 I V型コラーゲンを含むマウス尿の濃度と TR_F I Aの蛍光強度と の相関関係を示す。 DTTの添加の前 （白の四角と丸で示す） と後 （黒の四角と 丸で示す） の濃度は、 KK/T a及び B ALBZcの尿試料を用いて測定した。 各点は、 3回の実験の平均土 SDを示す。
図 3は、 尿及び標準試料に対する DTT濃度の影響を示す。 KKZTaマウス からの尿試料及ぴ標準溶液を 0、 2及び 5 mMの等量の D丁丁と一緒にィンキュ ベートした。
図 4は、 20週齢の KK/Ta (n = 6) 及び BALB/c (n= 6) マウス におけるマウス尿 I V型コラーゲン量の比較を示す。測定は、 TR_F I A (A) 及び市販の競合的 EL I S A (B) を用いて行った。
* KK/T aは BALB/cよりも有意に高い （pく 0. 01)
図 5は、 KKZT a及び BALB/cの全腎臓から単離した I V型コラーゲン
(α ΐ鎖） の mRNA発現を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について説明する。 本発明によれば、 マウス尿中 I V型コラーゲンなどの微量のコラーゲンを測定 するための高感度のィムノアッセィ法が提供される。 本発明では、 I V型コラー ゲン分子の構造上の特徴に基づいて、 ジチオトレイトール （D T T) を用いて被 験試料の前処理を行う。 D T T処理を行わない従来の競合的 E L I S Aにおける 検出限界は 2 . 4 n g /m 1であるのに対し、 本発明の方法によれば、 5 μ 1の 尿試料中の 2 7 g /m 1の I V型コラーゲンを測定することが可能である。 本発明の方法により、 2種類のマウス系統 （KKZT a及ぴ B A L B Z c ) の 1 2試料に由来する尿中 I V型コラーゲン量を測定した結果、 糖尿病マウスと糖 尿病でないマウスでは尿中の I V型コラーゲン量が明らかに異なることが判明し た。 D T Tによる前処理を行わない場合と比較して、 本発明の方法は 極少量の 試料でも測定可能であることから、 検体量に限りのある特にマウスの尿中 I V型 コラーゲンの測定に適している。
本発明の抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法にお いては、 被験試料を還元剤で処理することを特徴とする。
本発明で用いる被験試料としては、 コラーゲン量を測定する必要のあるもので あれば特に限定されず、 例えば、 ヒト又はラットやマウスなどの哺乳動物の尿、 血液、 血清、 血漿、 組織液、 唾液、 汗等の任意の体液が挙げられる。 本発明のコ ラーゲンの測定方法は、 微量の試料中の少量のコラーゲンでも高感度に測定する ことができることから、 通常は少量しか採取されず、 多量の試料を集めることが 困難であるマウスなどの実験動物の尿などを被験試料として用いることができる。 本発明で測定するコラーゲンの種類は特に限定されない。 脊椎動物のコラーゲ ンは I型から X X V型に分類することができ、 本発明ではこのうちの何れの型の コラーゲンを測定してもよい。 本発明では、 これらの中でも特に好ましくは、 I V型コラーゲンを測定することができる。
本発明で用いる還元剤は、 コラーゲン中のジスルフィド結合を還元することが できる還元剤であれば特に限定されず、 例えば、 ジチオトレイトール （D T T)、 i3—メルカプトエタノールなどを使用できる。 特に好ましくは、 ジチオトレイト ニル （D T T) を使用することができる。
本発明の方法では、 被験試料を上記した還元剤で予め処理する。 還元剤による 処理の際における被験試料中の還元剤の濃度は、 好ましくは 0 . 1 mMから 1 0 mM、 より好ましくは 0 . l mMから5 lnM、 さらに好ましくは 0 . 5 mMから 5 mMであり、 例えば、 約 2 mMとすることができる。 還元剤の濃度が 0 . 1 m M未満であると、還元剤によるジスルフィド結合の還元作用が十分に発揮されず、 また還元剤の濃度を 1 O mMより高いと、 コラーゲン分子のェピトープの立体構 造に悪影響を与える可能性があるため、 好ましくない。
本発明の免疫分析は、 抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析である。
本発明で用いる抗コラーゲン抗体は、 モノクローナル抗体でもポリクローナル 抗体でもよく、 これらの抗体は、 通常の抗体の作成方法により取得することがで きる。 また、抗体としては、 I g Gだけでなく、抗体の断片 （例えば、 F ( a b ' ) 2フラグメント、 F a b， フラグメント等） を使用してもよい。
例えば、 ポリクローナル抗コラーゲン抗体は、 コラーゲンを抗原として哺乳動 物を免疫感作し、 該哺 ¾動物から血液を採取し、 採取した血液から抗体を分離 · 精製することにより得ることができる。 例えば、 マウス、 ハムスター、 モルモッ ト、 -ヮトリ、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ等の哺乳動物を免疫 することができる。 抗原投与の方法は当業者に公知であり、 投与経路も特に限定 されず、 皮下投与、 皮内投与、 腹膜腔内投与、 静脈内投与、 筋肉内投与等を適宜 選択することができる。 また、 必要に応じてアジュバントを使用することもでき る。 免疫感作した哺乳動物を適当な期間飼育した後、 該哺乳動物の血清を耳静脈 等から少量サンプリングし、 抗体価を測定する。 抗体価が上昇してきたら、 状況 に応じて抗原を投与して追加免疫を行なってもよい。 最後の投与から 1〜2ヶ月 後に免疫動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、 硫酸アンモニゥムまたはポリエチレンダリコールを用いた沈澱、 ゲルろ過クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二テイク口マトグラフィ 一等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離 ·精製することにより、 ポリクローナル抗血清として、 ポリクローナル抗コラーゲン抗体を得ることがで きる。
また、 モノクローナル抗体は、 例えば、 抗体産生細胞とミエローマ細胞株との 細胞融合によりハイプリ ドーマを作製することにより取得することができる。 抗 体産生細胞としては、 免疫された動物からの脾細胞、 リンパ節細胞、 Bリンパ球 等を使用することができる。 例えば、 免疫動物から抗体産生細胞として脾細胞を 取得し、 これとミエローマ細胞と公知の方法 （G. Kohler et al . , Nature, 256 495 (1975) )により融合することにより、ハイプリ ドーマを作製することができる。 細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、 例えばマウスでは P 3 X 6 3 A g 8、 P 3 U 1株、 S p 2 Z 0株などが挙げられる。 細胞融合を行なうに際して は、 ポリエチレングリコール、 センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、 細胞 融合後のハイプリ ドーマの選抜にはヒポキサンチン 'アミノプテリン 'チミジン (H A T) 培地を常法に従って使用することができる。 細胞融合により得られた ハイプリ ドーマは限界希釈法等によりクローニングする。 更に、 コラーゲンを用 いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことにより、 所望のコラーゲ ンを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。 ハイプリ ドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、 通常の細胞 培養法や腹水形成法により該ハイプリ ドーマを培養し、 培養上清あるいは腹水か ら該モノクローナル抗体を精製すればよい。 培養上清もしくは腹水からのモノク ローナル抗体の精製は、 常法により行なうことができる。 例えば、 硫安分画、 ゲ ルろ過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どを適宜組み合わせて使用できる。
本発明によるコラーゲンの測定方法としては、 例えば蛍光免疫測定法、 酵素免 疫測定法、 ラジオィムノアツセィ、 発光免疫測定法等を例示することができる。 例えば、 抗コラーゲン抗体を不溶性担体に結合させて抗体結合不溶性担体を調製 し、 この担体を用いてサンドイッチ式免疫測定法を行なうことができる。 本発明 の方法を、 例えば、 サンドイッチ式免疫分析を行う場合には、 ( 1 ) 被験試料を還元剤で処理する工程；
( 2 )抗コラーゲン固相化抗体を固定化した固相担体に、 （1 )で処理した被験試 料を接触させる工程；
( 3 ) 上記固相担体に、 標識物質を有する抗コラーゲン標識抗体を接触させるェ 程；及び、
( 4 ) 上記標識物質を利用して、 抗コラーゲン固相化抗体に結合したコラーゲン を検出又は測定する工程；
を含む工程により行うことができる。
標識抗体として使用する抗コラーゲン抗体には、 標識物質、 好ましくは非放射 性標識物質により標識する。 非放射性標識としては、 酵素標.識、 蛍光標識、 発光 標識等の標識を用いることができる。 酵素標識としては、 例えば標識用酵素とし てアルカリ性フォスファターゼ （A L P ) 、 β—D—ガラクトシダーゼ、 ホース ラディッシュパーォキシダーゼ等を用いることができる。 これらの酵素の検出に は、それぞれの酵素基質であるそれぞれ、 4—メチルゥンベリフヱリルリン酸（4 -MU P ) 、 過酸化水素と 3， 3， ， 5， 5， 一テトラメチルベンチジンの組合 せ、 2 _ニトロフヱニルー 3— D—ガラクトシド等を用いることができる。 これ らの酵素基質は、酵素の作用を受けて変化（例えば開裂）することにより発色し、 検出することができる。
免疫分析の測定方法をその機器の測定原理により分類すると下記を挙げること ができるが、 本発明ではこれらの何れの方法を使用してもよい。
(A) 化学発光免疫測定装置
1 . C L E I A (Chemical Luminescent Enzyme Immuno Assay) (酵茶を用いてィ匕 学発光を起こす）
2 . C L I A (Chemical Luminescent Inimuno Assay) (触媒を用いて化学発光を 起こす）
3 . E C L I A (Electro Chemical Luminescent Immuno Assay) (電気的変ィ匕に よって化学発光を起こす） (B) ラジオィムノアッセィ測定装置
1. ラジオィムノアッセィ （Radio Iramuno Assay; RIA) 競合法
2. ィムノラジオメ トリック法 (Immuno Radio Metric Assay; IRMA)
(C) 酵素免疫測定装置
1. ェンザィムィムノアツサイ (Enzyme Immuno Assay; EIA)
2. E L I S Afe (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
(D) 蛍光、 蛍光偏向免疫測定装置
1. 堂光ェンザィムィムノアッセィ (Fluorescent Enzyme Immuno Assay; FEIA) 2. 光偏向ィムノアッセィ (Fluorescent Polarization Immuno Assay; FPIA)
3. 時間分解蛍光測定装置 （TR— F)
(E) ラッテクス凝集免疫測定装置
(F) ネフエロメ トリック免疫測定装置
(G) ィムノセンサー
1. 電気化学免疫センサー
2. オプティカル免疫センサー
3. サーマル免疫センサー
4. ピエゾアコースティック免疫センサー
本発明の免疫分析は好ましくは蛍光ィムノアッセィであり、 特に好ましくは、 サンドイッチ式時間分解蛍光ィムノアッセィ （TR— F I A) である。
三価希土類イオンの中で， サマリウム（Sm)、 ユウ口ピウム（Eu)， テルビゥ ム（Tb)およびジスプロシウム（Dy)イオンは特定の配位子と錯生成をすると， 金属ィオン特有の蛍光を強く発することが知られている。 これらの錯体の蛍光は 以下のような特徴を有する： （1) 蛍光寿命が非常に長く、 希土類蛍光錯体、 特に ユウ口ピウムとテルビウムの錯体は数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を持つ； （2) スト一タスシフトが非常に大きい。 ほとんどの場合， これらの錯体は紫外光を吸 収して励起され， 500 nm以上の可視光を発する ； （3) 蛍光発光ピークの半値幅 が約 10から 20 nmであり， 非常にシャープである。 このような蛍光特性を利用す ることにより、 希土類蛍光錯体を標識物質として利用する時間分解蛍光ィムノア ッセィが開発されている。 時間分解蛍光ィムノアッセィでは、 様々な短寿命のバ ックグラウンド蛍光をなくすことができ、 高感度な測定が可能である。
本発明はまた、 コラーゲンの測定用キットを提供する。 本発明のキットには、 少なくとも還元剤と抗コラーゲン抗体とが含まれている。 抗コラーゲン抗体は、 固相化抗体及び標識抗体の 2種類を含めてもよい。本発明のキットには、さらに、 上記した標識物質を検出するための試薬を含めることもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 実施例
(A) 材料と方法
(1) 実験動物
動物実験は、 順天堂大学の動物施設のガイドラインに従って行った。 本実験の ために、 2種類の近交系のマウス (KK/T aおよび BALB/c) を日本クレ ァ（東京、 日本）から 4週齢で購入した。 6週齢以降から、 マウスは、 実験の全期 間を通じて、食物（げっ歯動物ペレツト食（CE— 2 ; 342. 2 k c a 1/10 0 g、 4. 4%粗脂肪を含有） および水を自由に摂取させながらプラスチックケ ージ中に個別に飼育した。 雄マウスのみを本実験では使用した。 マウスは全て、 1 2時間の明期 /1 2時間の暗期の規則的な光周期を伴う通常の条件下で同じ部 屋で飼育し、 温度は 24 ± 1 °Cに調節した。 20週齢で評価した糖負荷試験によ り、 KK/T aが完全に糖尿病であることを示した。 大量の尿が比較用に必要で あつたので、 尿試料を 10日間繰り返し採取した。 耐糖能は、 マウス用の腹腔内 糖負荷試験 （IPGTT)を使用して評価した。 IPGTT は、 一晩絶食したマウスにグル コース（ 20 %溶液で 2 g Z k g )を腹腔内注入することにより行った。 後眼窩か ら採取された血液中グルコース量を、 腹腔内へのグルコース注入後 0分 （空腹時 血糖値）および 120分に、 Glutest E (京都第一化学、 京都（日本））を使用して測 定した。 体重も同週令に測定した。
(2) 抗体及び抗原
ゥサギポリクローナル抗マウス I V型コラーゲン抗体は、 N0V0TEC(StMartinLa Garenne, フランス）から購入した。 マウス I V型コラーゲンと交差反応するピオ チン化ャギポリクローナル抗ヒ ト I V型コラーゲン抗体は Abeam社 (ケンプリッ ジ、 英国） から得た。 Engelbreth- Holm- Swarm移植マウス腫瘍由来の I V型コラ 一ゲン （Sigma- Aldrich社、 St. Louis, M0、 米国） を標準抗原として使用した。
( 3 ) BHHCTによるストレプトァビジンの標識
ストレプトアビジンは、 Chemicon International社 （Temecula、 CA、 米国） 力、 ら得た。ストレプトァビジー BSA結合体（SA- BSA)は既報の通り調製した（J. Yuan, G. Wang, 他、 Anal. Biochem.， 1997, 254, 283-287)。 SA- BSA結合体を、 キレー ト化合物 BHHCTで既報の通り標識した （J. Yuan, G. Wang, 他、 Anal. Biochem. , 1997, 254, 283-287) 溶液は、 1.0 X 10— 7 Μ EuCl3, 0.2% BSA, 0.1% NaN3及ぴ 0.9% NaClを含む 0.05 M Tris-HCl緩衝液 （pH 7.8) (希釈緩衝液） を添加することに よって希釈し、 ィムノアツセィに使用する前の 2時間 56 °Cで反応させた。
(4) 時間分解蛍光ィムノアッセィ （TR— F I A) を用いたマウス尿 I V型コ ラーゲンの測定
尿試料を等量の 2 mMジチオトレイトール （Invitrogen社、 CA、 米国）と共に 37°Cで 30分間ィンキュベートした。 標準 I V型コラーゲン溶液（2000ng/ml) も同様に 2mMの DTT とインキュベートした。試料を希釈緩衝液で希釈後、 5 0 μ 1の尿又は標準溶液を、 ゥサギ抗マウス I V型コラーゲン抗体（1 ： 200希 釈抗体 50 μ 1/ゥエル）を予め被覆した蛍光測定用マイクロタイタープレート
(Nalge Nunc International, N. Y. , 米国） のゥヱルに添加した。 5°Cでー晚ィ ンキュベーシヨンした後、 ゥエルを 0.05°/。の Tween20を含むトリス- HC1緩衝液で 3回洗浄し、 50 1のピオチン化抗 I V型コラーゲン抗体 （1 : 300に希釈） を添加した。 5°Cでー晚インキュベーションした後、 50 μ 1の BHHCT— E u3+標識 S A - B S A結合体 （S A— B S A— BHHCT— E u3+)溶液を添加 し、 3 7 °Cで 1時間インキュベートした。 最後に、 ゥエルを 0.05°/。Tween20を含 むトリス一 HC1 緩衝液 (pH9.1)で 3回洗浄し、 プレートを固相蛍光測定に供した。 時間分解蛍光測定を、 Arvo SX マルチラベルカウンター （PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA，米国） を用いて、 340 nmで励起、 0. 2msのディレ ィタイム、 及び 0. 4msのウィンドウタイムで行った。 蛍光強度は 6 1 5 nm で測定した。
(5) 競合的 EL I S Aを用いたマウス尿 I V型コラーゲンの測定
競合的酵素免疫測定法（EL I S A) (コラーゲン IV Mキット、 Exocell社、 フ イラデルフィァ、 PA、米国）を用いて尿 I V型コラーゲンを測定した。 アツセィは キットの指示に従って行い、 240 ^ 1の尿試料を使用した。
(6) クレアチニンアツセィ
尿中クレアチュンは、 尿試料用の巿販キット（Creatinine Companion, Exocell 社、 フィラデルフィア、 PA、 米国）を使用して測定した。
(7) I V型コラーゲンの mRNAのノーザンプロット分析
ノーザンブロット分析に使用するプローブは既報の通り調製した（E. P. Peten, 他、 Am. J. Physiol. , 1992, 263, 95卜 957)。 20週齢の KK/Ta および BALB/c マウスの全腎臓からの全 RN Aの単離は、 Trizol (Invitrogen社、 Carlsbad, CA, 米国） を用いて行った。 RNA(10 g)を 1. 5%ァガロース上で電気泳動し、 ナ ィロン膜に転写した。 膜は 4時間プレハイプリダイゼーシヨンを行い、 次いで、 マウス I V型コラーゲンの α 1鎖及び及ぴ GAP DHに対する32 Ρ標識 cDNAプ ローブで一晩ハイブリダィズさせた。 洗浄後、膜をイメージ ·プレート（富士写真 フィルム会社、東京、日本）に露出した。イメージ 'プレート上のバンドの強度は、 BAStation 2500 (富士写真フィルム会社、 東京、 日本）の濃度計走査モデルによつ て定量した。 最後に、 αΐ鎖のバンドの強度の捕正は、 GAPDHのパンド強 度で行った。
(8) 統計分析
データは平均土 SDとして表現した。 2種の異なるマウス系統間の統計的有意差 は、 Mann- Whitney U検定によって測定した。 EL I S A及ぴ TR— F I A間の回 帰相関分析は、 Spearmanの検定を用いて行った。 0. 05未満の P値を有意差あ りとみなした。
(B) 結果
(1) 競合的 EL I 3 ぉょぴ丁1 ー？ I Aシステム間の検出限界の比較 競合的 EL I SA及び TR— F I Aによるマウス I V型コラーゲンの標準曲線 は図 1に示す。 3 X SDのパックグラウンドを用いて特定した TR— F I Aの検 出限界は、既報の方法を用いると、 27 p g/m 1である（J. Yuan, G. Wang,他、 Anal. Biochem. , 1997， 254, 283-287)。同時に測定した際の、平均変動係数は 4. 2%であった （8種の異なる濃度で 0. 4〜7. 4%)。 TR— F IAの検出限界 (27 p g/m 1) は、 競合的 EL I S Aの検出限界より約 1 / 100小さかつ た。 尿試料への標準抗原の回収率を得るために、 1 ： 5に希釈したヒト尿を希釈 剤として使用した。 希釈したヒト尿中の 5種の異なる濃度の標準マウス I V型コ ラーゲン (2. 5、 10、 40、 160、 及び 320 n g/m 1 ) をアツセィし た。 ヒト尿試料に添加したマウス I V型コラーゲンの回収率は、 各濃度で 95% 以上であった。
(2) 希釈したマウス尿試料の分析
20週齢の糖尿病 KK/T aおよび糖尿病を呈していない BALBZcマウス から採取した尿試料を使用して、 尿のマウス I V型コラーゲンの濃度と蛍光強度 の相関関係を調べた（図 2)。各系統（n= 3)の尿試料を稀釈緩衝液で希釈した。 試料を前処理なしでアツセィした場合、 蛍光強度は希釈 1 ： 20から 1 ： 2まで 減少した （白四角で示す）。 この傾向は、 B ALB/cマウスより KK/T aマウ スにおいてより顕著であった。 KK/T aマウス尿中の抗原の低い回収率は、 I V型コラーゲンが多数のジスルフィド結合により巨大分子を呈していることによ つて引き起こされる可能性がある。 これは、 巨大分子のゥェルへの非特異的付着 を介した免疫反応の妨害が示唆している。 そこで、 マウス尿試料は、 分析前に D TTで処理した。 (3) DTT前処理による尿中 I V型コラーゲン測定のための至適条件の検討 測定用の至適条件を確立するために、. 尿試料の前処理における DTT濃度の効 果を検討した（図 3A)。 DTT濃度を変化させた（1、 2および 5mM)。 結果は 図 3に示す。 標準抗原も同様に処理した （図 3B)。 両方の分析で、 標準溶液は、 2mMの DTT濃度でほとんど影響を受けず、 尿試料中の I V型コラーゲンの最 良の分析は 2 mMで達成された。 希釈前に 2 mMの濃度の D T Tで前処理するこ とにより、 尿の I V型コラーゲン濃度と蛍光強度との間で正の相関関係が KK/ T aマウスで観察された （図 3 B中で黒四角で示す)。
マウス I型及び I I型コラーゲンなどの他の型のコラーゲンとの交差反応性を 確認するために、 両方の型のコラーゲンも 2 mMの DT丁で処理した。 これらの 型のコラーゲンとの交差反応は観察されず、 DTTによる前処理が I型及び I I 型等の他のコラーゲン分子に対して交差性を与えずに、 I V型コラーゲンへの特 異性が保たれることが確認された。
(4) KK/T aおよび BALBZcマウスの耐糖能おょぴ体重
表 1に示す通り、 20週齢の正常コントロール B A LB/cマウスでの知見と 比較して、 20週齢の KK/T aマウスは、 空腹時血糖の上昇および耐糖能の低 下並びに肥満を呈した （Pく 0· 01)。 表 1 ：実験動物データ
BALB/c KK/Ta 空腹時血糖値 (mg/dl) 76.4±9.5 110.2±25.3* 腹腔内グルコース注入後 1 20分における血糖 85.6±13.3 434.4 ±49.8* 値 (mg/dl)
体重 (g) 31.0±0.8 42.6 ±2.4*
' KK/Taにおける値 は BALB/cマウスにおける値より有意に高い （pく 0.05)。
(5) TR—F I Aおよび通常の競合ィムノアツセィを用いた、 2種のマウス系 銃の尿中 I V型コラーゲンの濃度の測定
TR— F I Aの有用性を検討するために、 マウス I V型コラーゲンを、 市販の キットを使用して競合的 EL I S Aによって同時に測定した。 図 4に示す通り、 2 0週齢の糖尿病の KK/Taおよび糖尿病でない BALB/ cマウスにおける尿の I V型コラーゲンの濃度を、 TR— F 1八ぉょび競合的£ 1 S Aの両方で測定 した。 各々の免疫測定において、 B ALBZ cマウスより KK/T aマウスの方 が濃度は高かった （Pく 0. 0 1)。 し力 し、 TR— F I Aでの濃度範囲は、 競合 的 E L I S Aでの濃度範囲より高かった。 さらに、 TR— F I Aでは、 KK/T aと B ALBZ cマウス間の値の相違が、 競合的 E L I S Aの場合よりも大き力 つた。 正の相関関係がこれらの分析間で見られた （相関係数 = 0. 6 0 7、 p値 = 0. 0 3 4)。
(6) ノーザンプロット分析
図 5に示す通り、 I V型コラーゲンの mRNA発現は、 BALBZcマウスと 比較して KKZT aマウスでより顕著に増加した。濃度測定スキャニングにより、 a 1鎖の mRNAの発現が BALB/ cマウスより KK/T aマウスにおいて 1 1. 1倍高いことが示された。
(C) 考察
病的腎臓では I V型コラーゲンの産生が亢進することが報告されている （M. S. Razzaque,他、 J. Pathol. , 1994, 174, 131— 138;及び T. A. Jacot,他、 Lab, Invest. , 1996， 75, 781-799)。 これらの報告に加えて尿中 I V型コラーゲン値について 検討した様々なクリニカルスタディ一の結果は、 尿中 I V型コラーゲンの増加が 早期腎障害の良好な指標であることを示唆しているが、 げっ歯動物から尿試料な どの極少量の尿試料で使用できる高感度のァッセィ法は存在しなかった。 現在使 用されている通常の E L I SAは多量（240μ 1)の試料が必要であるが、 マウス尿 は、 1回の***で極少量しか得られず、 多量の検体採取が困難である。 しカ し、 標識としてユウ口ピウムキレート化合物（BHHCT— E u 3+)を使用する TR 一 F I Aを利用して、 極少量の試料中の尿 I V型コラーゲンを測定できることが 判明した。
I V型コラーゲンは複数の構造上の特徴を有する巨大分子である。 ゲルクロマ トグラフィー分析によれば、 尿試料中で I V型コラーゲンは 340 kDaに最大ピー 1900 クを有する （H. Makino, 他、 Res. Co麵 un. Mol. Pathol. Pharmacol. , 1995, 88， 215-223)。 上記の通り、 この巨大分子は、 主な結合として多数のジスルフイ ド結 合を各々有するポリマー単位から構成されている。 一般にィムノアッセィは、 測 定すべき分子の大きさに伴いその複雑度が増すと言われている。 D T Tによる前 処理をしないアツセィでは、， 多量のコラーゲンが K K/T aマウスの尿に***さ れるにも拘わらず、 高濃度の尿試料での蛍光強度は I V型コラーゲンの量に比例 しなかった。 この正の相関関係の喪失は、 抗原抗体反応の妨害が原因であり、 自 己凝集性の巨大分子ネットワークにより立体的に遮蔽されるものと考えられた。 抗原抗体反応では、 抗体は、 抗原の表面上のペプチドのみを認識すると一般に 考えられている （G. S. Page, 他、 J. Virol. , 1988， 62， 1781-1794)。 2 mMの D T Tと 2 mMのグァニジンを使用して Engelbreth- Holm - Swarmマウス月重瘍から I V型コラーゲンを効率的に抽出したことが報告されている（H. K. Kleinman,他、 Biochemistry, 1982, 21, 6188-6193)。 本発明では、 D T Tで多数のジスルフィ ド架橋を還元することによって、 尿中の I V型コラーゲンの分子の大きさを小さ くして、 抗体がコラーゲン分子の表面ェピトープを十分に認識できるようにする ことを試みた。 その結果、 尿試料を D T Tで前処理することによって、 尿の I V 型コラーゲンの濃度と T R— F I Aのシグナル強度の間の正の相関関係を回復さ せた。 ジスルフイド結合は、 I V型コラーゲン分子の立体構造に関与する分子間 及ぴ分子内結合の一部を担っていると考えられる。 2 111]^以上の0丁丁を標準溶 液に添加しても良好な結果が得られなかったことから、 過剰な前処理は分子内ジ スルフィ ド結合にも影響を与える結果、 抗原のェピトープの立体構造に変化をも たらす可能性がある。
D T Tによる前処理を行った T R— F I Aと市販のキットを用いる競合的 E L I S Aは、 B A L B / cマウスよりも KKZT aマウスの方が尿 I V型コラーゲ ンの濃度が高いという同様の傾向を示したが、 これらのィムノアッセィでは以下 のような明白な相違が見られた。
T R - F I Aの濃度範囲は競合的 E L I S Aの場合よりほぼ 1 0 0倍近く高か つた。 これは、 アツセィ法、 使用した抗体、 DTTの添加などの相違に起因する ものである。 DTTによる添加は、 競合的 EL I S Aの場合より TR— F I Aの 場合における KK/T aと B ALB/ cマウスのさらなる相違の增加に寄与して いる可能性がある。 TR— F I Aの結果と同様に、 ノーザンプロット分析でも、 I V型コラーゲンの mRNAは BALBZcマウスの場合よりも KKZT aマウ スの場合の方が著明に発現が亢進していることが示された。 この発現量の相違は TR— F I A分析の結果を支持するものである。 TR— F IAでは 5 μ 1だけの 尿試料が必要であつたが競合的 EL I S Αでは 240 μ 1が必要であった。 TR — F I Αでは DTTによる前処理を行ったために少量の試料でも十分であった。 産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、 極少量の試料中の微量のコラーゲンを測定することが 可能になる。 また、 本発明の方法によれば、 他の型のコラーゲンと交差反応する ことなくマウス系統間のコラーゲン量の相違を明確化することができる。 本発明 の方法を利用することにより、 ァノレブミン等のタンパク質を指標とする従来のァ ッセィ法を使用する場合よりも、 実験用モデルマウスにおけるより早期の腎障害 をより感度よく評価することが期待される。

Claims

請求の範囲
1. 抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法におい て被験試料を還元剤で処理することを特徴とする、 コラーゲンの測定方法。
2. 免疫分析が抗コラーゲン抗体を用いる蛍光ィムノアッセィである、 請求 項 1に記載のコラーゲンの測定方法。
3. 免疫分析が、 サンドイッチ式時間分解蛍光ィムノアッセィ （TR— F I A) である、 請求項 1又は 2に記載のコラーゲンの測定方法。
4. コラーゲンが I V型コラーゲンである、 請求項 1から 3の何れかに記載 のコラーゲンの測定方法。
5. '還元剤がジチォトレイトールである、 請求項 1から 4の何れかに記載の コラーゲンの測定方法。
6. 被験試料が尿である、 請求項 1から 5の何れかに記載のコラーゲンの測 定方法。
7. 被験試料が実験動物の尿である、 請求項 1カゝら 6の何れかに記載のコラ 一ゲンの測定方法。
8. 被験試料中の還元剤の濃度が 0. ImMから 1 OmMである、 請求項 1 から 7の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
9. 被験試料中の還元剤の濃度が 0. ImMから 5 mMである、 請求項 8に 記載のコラーゲンの測定方法。
10. 被験試料中の還元剤の濃度が 0'. 5mMから 5mMである、 請求項 8 に記載のコラーゲンの測定方法。
11. 下記の工程；
(1) 被験試料を還元剤で処理する工程；
(2) 抗コラーゲン固相化抗体を固定化した固相担体に、 上記 （1) で処理した 被験試料を接触させる工程；
(3) 上記固相担体に、 標識物質を有する抗コラーゲン標識抗体を接触させるェ 程；及ぴ、
(4) 上記標識物質を利用して、 抗コラーゲン固相化抗体に結合したコラーゲン を検出又は測定する工程；
を含む、 請求項 1から 10の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
12, 少なくとも還元剤と抗コラーゲン抗体とを含む、 請求項 1から 11の 何れかに記載のコラーゲンの測定方法を行うためのキット。
PCT/JP2003/011900 2002-09-18 2003-09-18 コラーゲンの測定方法 WO2004027423A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03797662A EP1542011A1 (en) 2002-09-18 2003-09-18 Method of measuring collagen
CA002499692A CA2499692A1 (en) 2002-09-18 2003-09-18 Method for measuring collagen
AU2003264491A AU2003264491A1 (en) 2002-09-18 2003-09-18 Method of measuring collagen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002271200A JP2004108914A (ja) 2002-09-18 2002-09-18 コラーゲンの測定方法
JP2002-271200 2002-09-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004027423A1 true WO2004027423A1 (ja) 2004-04-01

Family

ID=32024872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/011900 WO2004027423A1 (ja) 2002-09-18 2003-09-18 コラーゲンの測定方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1542011A1 (ja)
JP (1) JP2004108914A (ja)
KR (1) KR20050062549A (ja)
CN (1) CN1735804A (ja)
AU (1) AU2003264491A1 (ja)
CA (1) CA2499692A1 (ja)
WO (1) WO2004027423A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4505800B2 (ja) * 2004-04-16 2010-07-21 司甫 横山 抗腎タイプｉｖモノクロ−ナル抗体
JPWO2006030985A1 (ja) * 2004-09-16 2008-05-15 独立行政法人科学技術振興機構 過酸化脂質の測定方法
WO2006119886A1 (en) * 2005-05-09 2006-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Collagen type iv as target/marker for insulin resistance
JP2013054029A (ja) * 2011-08-08 2013-03-21 Arkray Inc カルボキシメチルアルギニンの免疫測定方法
JP2018065765A (ja) * 2016-10-19 2018-04-26 テルモ株式会社 医療用タンパク質とポリアミノ酸の複合体、安定化方法およびその用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0772148A (ja) * 1988-02-19 1995-03-17 Fuji Yakuhin Kogyo Kk ヒトｉｖ型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量用試薬
JP2000146980A (ja) * 1998-09-04 2000-05-26 Japan Science & Technology Corp 腎疾患の検出および病態管理方法
JP2002512370A (ja) * 1998-04-17 2002-04-23 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 還元剤を用いる改良された免疫診断アッセイ

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE899664A (fr) * 1984-05-15 1984-08-31 Inst Internat De Pathologie Ce Procede de dosage immunologique d'une substance dans un echantillon liquide.
JPS63246396A (ja) * 1987-03-31 1988-10-13 Shiseido Co Ltd モノクロ−ナル抗体
JPH06242109A (ja) * 1991-03-18 1994-09-02 Shiseido Co Ltd コラーゲンの測定方法
JPH05209883A (ja) * 1991-08-24 1993-08-20 Shiseido Co Ltd コラーゲンの測定方法及び測定キット
DK0711415T3 (da) * 1993-07-28 1999-04-26 Roche Diagnostics Gmbh Immunoanalyse til påvisning af collagen eller collagenfragmenter
JPH10185916A (ja) * 1996-12-25 1998-07-14 Asahi Chem Ind Co Ltd 前駆型ペプチドの測定法
JP2000171467A (ja) * 1998-12-07 2000-06-23 Iatron Lab Inc 新規の分析方法
JP2001249131A (ja) * 2000-03-07 2001-09-14 Mitsubishi Chemicals Corp 標識微粒子およびその製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0772148A (ja) * 1988-02-19 1995-03-17 Fuji Yakuhin Kogyo Kk ヒトｉｖ型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量用試薬
JP2002512370A (ja) * 1998-04-17 2002-04-23 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 還元剤を用いる改良された免疫診断アッセイ
JP2000146980A (ja) * 1998-09-04 2000-05-26 Japan Science & Technology Corp 腎疾患の検出および病態管理方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROKO KIMURA: "Jikan bunkai keiko immuno assay ni yoru mouse nyochu IV-gata collagen no biryo sokutei", THE JAPAN SOCIETY FOR ANALYTICAL CHEMISTRY, DAI 51 NENKAI KOEN YOSHISHU, 5 September 2002 (2002-09-05), pages 264, XP002975834 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20050062549A (ko) 2005-06-23
JP2004108914A (ja) 2004-04-08
AU2003264491A1 (en) 2004-04-08
EP1542011A1 (en) 2005-06-15
CN1735804A (zh) 2006-02-15
CA2499692A1 (en) 2004-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4685034B2 (ja) 医療診断目的のためのエンドセリン形成の測定方法、ならびに、このような方法を実施するための抗体およびキット
CA2578341C (en) Determining feline and canine probnp
US9034592B2 (en) Immunoassay for quantification of an unstable antigen selected from BNP and proBNP
CA2886779C (en) A method for diagnosing or monitoring kidney function or diagnosing kidney dysfunction
US11719697B2 (en) Immunoassay and antibodies for the detection of chromogranin A
US20230147663A1 (en) Method for predicting the risk of getting cancer or diagnosing cancer in a female subject
KR20110022621A (ko) ＩｇＡ 신증의 검사 방법 및 검사 키트
WO2004027423A1 (ja) コラーゲンの測定方法
JP6606552B2 (ja) 特異的に精製された抗プレセプシン抗体
EP2541252A1 (en) Method of obtaining a binder to prepro-vasopressin or fragments thereof
EP3781600A1 (en) Novel anti-thymidine kinase antibodies
JP2011095014A (ja) 免疫学的測定方法及び免疫学的測定キット
US8039226B2 (en) Anti NC1 monoclonal antibody
Kobayashi et al. Measurement of mouse urinary type IV collagen using time-resolved fluoroimmunoassay
JP2010210408A (ja) ヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定方法、Ｃ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ検出用ポリペプチド、及びヒトＣ末端アルギニン欠損型Ｃ３ａ濃度測定キット
EP4092051A1 (en) Anti-soluble cd14 subtype antibody, kit and use thereof
JP2013096783A (ja) 肺腺癌を判定するためのデータ検出方法、診断薬、及び診断用キット
WO2020158856A1 (ja) 生物学的試料中の遊離ａｉｍの免疫学的分析方法
WO2013084504A1 (ja) 高血圧症の予知方法
CN115280146A (zh) 包含人iv型胶原7s结构域的片段的测定方法以及用于该测定方法的试剂盒
JPH0712811A (ja) ビタミンｂ１２を決定するためのイムノアッセイ、ならびにそのための試薬およびキット
WO2000024889A1 (fr) Anticorps monclonaux contre la proteine naip inhibitrice de l'apoptose chez l'humain et methode de dosage de la proteine naip

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003797662

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2499692

Country of ref document: CA

Ref document number: 1020057004684

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038252252

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003797662

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020057004684

Country of ref document: KR

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003797662

Country of ref document: EP