JP3098640B2 - ヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼの免疫学的定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、医学的生理学的分野に用いられ
るヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ
（ヒトプロＭＭＰ−２）の免疫学的定量法に関する。さ
らに詳しく言えば、本発明はヒト７２−ｋＤａゼラチナ
ーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ（以下ヒトプロＭＭＰ−２と
記す）の特定のアミノ酸配列に対し、あるいは精製ヒト
プロＭＭＰ−２に対し特異的に結合するモノクローナル
抗体を用いてヒトプロＭＭＰ−２を免疫学的に定量する
方法に関する。

【０００２】

【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラ
ミニンなとの接着性糖蛋白質から構成されている（下岡
ら，臨床検査，３４，１７１９−１７２４）。これらマ
トリックス成分の分解には、マトリックスメタロプロテ
アーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果たしている。そ
の中でプロＭＭＰ−２と称される７２−ｋＤａ（キロダ
ルトン）ゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼは、ヒトリ
ウマチ滑膜細胞（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１９４：７２１−７３０，１９９０）や中島
ら（実験医学，７，３２−４０（５４２−５５０），１
９８９）によって報告されているように、ヒトＡ２０５
８メラノーマ細胞、ラット乳癌細胞、ヒト大腸癌細胞、
Ｈ−ｒａｓでトランスフォームされたヒト気管支上皮細
胞などにより産生され、酵素的限定分解または、４−ア
ミノフェニル酢酸水銀（ＡＰＭＡ）なとのチオール基反
応性有機水銀化合物により活性化され、ゼラチン、ＩＶ
型コラーゲンおよびＶ型コラーゲン、更にプロテオグリ
カンコアたん白質やフィブロネクチン、不溶性エラスチ
ンを分解する活性を有していることが認められている
（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９
４：７２１−７３０，１９９０）。

【０００３】このように、ヒトプロＭＭＰ−２は、ゼラ
チンやＩＶ型コラーゲンを分解する酵素（ＩＶ型コラゲ
ナーゼ）として知られているが、Ｗａｃｈｅｒら（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．， １２６：２３９−２４
５，１９９０）は、ヒトＭＭＰ−２のＮ末端の合成ペプ
チドに対するウサギポリクローナル抗体を用いて、サブ
ストレイトキャプチャーイムノアッセイ法により、ヒト
ＭＭＰ−２を定量している。この方法では、ＩＶ型コラ
ゲナーゼの基質（ゼラチン）を固相に吸着させ、検体中
の抗原と反応させ、さらにその抗原に２種類のポリクロ
ーナル抗体を用いて反応を行わせる方法が用いられてい
る。またＺｕｃｋｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．，１４８：１８９−１９８，１９９２）は、ヒトＭ
ＭＰ−２に対するウサギポリクローナル抗体と、ヒトＭ
ＭＰ−２に対するマウスモノクローナル抗体を用いて、
サンドイッチタイプＥＩＡ法によりヒトＭＭＰ−２量を
定量している。この方法では、ウサギポリクローナル抗
体を固相抗体とし、その抗体に検体を加え、検体中の抗
原と反応させ、次にマウスモノクローナル抗体を加えた
後、ビオチン化やぎ抗マウスイムノグロブリンと、アル
カリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを用いて反
応を完了させている。しかしながら、これら、従来報告
されている方法ではポリクローナル抗体を使用している
ため精度の点で極めて劣り、反応時間が長く（例えば７
時間あるいは５時間を要する）、また、いずれも２種類
のポリクローナル抗体を使うため定量操作は繁雑とな
り、得られる感度も低い。

【０００４】本発明者らは、先にヒトＭＭＰ−２ポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体を提供することに成
功した（特開平４−１８３３９７）。しかしながら、得
られたこのモノクローナル抗体は、免疫原がペプチドで
あるがために、ＭＭＰ−２に対する親和性が低く、ＭＭ
Ｐ−２以外のＭＭＰｓと交差反応を示すものが多く、ま
た、これらモノクローナル抗体を使用して行ったサンド
イッチアッセイ系の定量法は、いずれも測定感度の低い
ものであった。

【０００５】本発明の目的は、ヒトプロＭＭＰ−２に対
し、特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体を用
いて、被検試料中のヒトプロＭＭＰ−２を感度ならびに
精度において優れ、また迅速に定量し得る方法を提供す
ることにある。更に、上記定量法を用い、関節症、甲状
腺機能亢進症、各種癌および転移性癌等の疾患を診断し
得る診断剤を提供することにある。

【０００６】

【発明の開示】本発明は、ヒト７２−ｋＤａゼラチナー
ゼ／ＩＶ型コラゲナーゼに対し、特異的に結合する２種
類のモノクローナル抗体において、固相担体に結合させ
る抗体、あるいは標識物を付与する抗体として、いずれ
か一方にヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲ
ナーゼのＮ末領域を認識する抗体を用いて、サンドイッ
チ法により、免疫学的にヒトプロＭＭＰ−２の測定を行
なうことを特徴とするヒトプロＭＭＰ−２の定量法を提
供するものである。

【０００７】本発明の方法は、固相担体に結合させる抗
体あるいは標識物を付与する抗体として、それぞれ、ヒ
トＭＭＰ−２の異なる抗原決定基に対し特異的に結合す
るモノクローナル抗体を、使用することを特徴とするも
のである。

【０００８】本発明の定量方法においては、免疫学的測
定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体
等タンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカー
ボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製の
ボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるい
は試験管等の種々の材料および形態を任意に選択し、使
用することができる。一方、標識物を付与する抗体とし
ては、抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌの如き、陰イオン交換ゲルおよびＩｇＧ画
分、さらにはペプシン消化後還元して得られる特異的結
合部Ｆａｂ′を用いることができる。これらの場合の標
識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
等）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素等が
ある。以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明す
る。

【０００９】実施例１ 抗原の調製 １） ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドの調製 ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６３，６５７９−６５８７，１９８８に記載の
Ｗｉｌｈｅｌｍらのアミノ酸配列を用いた。表１に示し
たヒトＭＭＰ−２ポリペプチド（Ｐ−１〜Ｐ−５）を各
々ペプチドシンセサイザー９６００（ミリジエン／バイ
オサーチ）で合成した。なお、各ペプチドＣ末端にシス
テインを導入した。合成ペプチドの純度が約７０％以下
のものは、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ（５μ、Ｃ１８−
１００Å，ウォーターズ）カラムを用いて高速液体クロ
マトグラフィーにより精製した。

【００１０】２） 免疫原の調製 ２ｍｇ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｌの０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものと１．８５
ｍｇＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸
イミドを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解した
ものとを混合し、３０℃、３０分間インキュベーション
した。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（セファデック
スＧ−２５Ｍ、ファルマシア）に供し、マレイミドが結
合されたＢＳＡを分取し、１．５ｍｌ以下に濃縮した。
マレイミドが結合されたＢＳＡに対し５０倍モル量の前
記（ａ）で合成した各ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドを１
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した
ものと混合した。４℃、２０時間インキュベーション
し、ＭＭＰ−２ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を調製し
た。

【００１１】３） ヒト皮膚線維芽細胞由来プロＭＭＰ
−２の調製 （ａ） 細胞培養 ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎ
ｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ）ｗｉｔｈ Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）を加え、
１Ｎ水酸化ナトリウムあるいは１Ｎ塩酸でｐＨを７．２
にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾過
した。使用時に、さらに、非必須アミノ酸を添加し、Ｍ
ＥＭ Ｅａｇｌｅ培地とした。

【００１２】ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１ＳＫ（ア
メリカンタイプカルチャーコレクション）を、１０％仔
牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地で３
７℃、５％炭酸ガス存在下、３〜４日間培養した。培養
上清を捨て、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ．４）（ＰＢＳ）を適量加え緩やかに振
とう洗浄した。次に、０．１２５％トリプシンおよび
０．０１％エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）を含むＰＢＳを加え、軽くゆすって細胞を培養フラ
スコから剥した後、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ Ｅａｇｌ
ｅ培地を適量加えた。遠心後、上清を捨て、１０％ＦＣ
Ｓ含有ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地を適量加え、細胞を懸濁
した。次に、新しい培養フラスコに約２×１０^５個／ｍ
ｌの細胞を添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下、３〜
４日間培養した。

【００１３】（ｂ） 細胞刺激 （ａ）で得られた培養細胞にインターロイキン１α（Ｉ
Ｌ−１α）を作用させることにより細胞刺激を行う。前
項（ａ）で培養した培養液をデカントし、次に約１００
ｍｌのＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地を加え、ラクトアルブミ
ン水解物（ＧＩＢＣＯ）およびＩＬ−１α（Ｇｅｎｚｙ
ｍｅ）を、各々終濃度０．２％および１０Ｕ／ｍｌにな
るように加えた。３７℃、５％炭酸ガス存在下、７〜１
０日間静置したのち、その培養上清を回収し、ヒトプロ
ＭＭＰ−２調製用材料とした。

【００１４】（ｃ） ヒトプロＭＭＰ−２の精製 前項（ｂ）で調製した培養上清に、終濃度８０％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを加え、撹拌、遠心し、そ
の沈殿に適量の０．５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化
カルシウム、０．０５％ポリオキシエチレンラウリルア
ルコールエーテル（ブリッジ−３５）含有５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０，Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆ
ｆｅｒ）を添加、溶解し、Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅ
ｒに対し透析した。透析後の溶液を、Ｇｅｌａｔｉｎ−
ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）に供し、その吸着たん白
質を５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有Ｔｒｉ
ｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒで溶出した。溶出画分はＴｒｉ
ｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒに対し透析した。次に、混在す
るＴＩＭＰ−２を除去するため、抗ヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体（クローンＮｏ．６８−６Ｈ４，微工
研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１２６９１）結合Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂカラムに供し、その素通り画分を採取し
た。ここで用いた抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体
は、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチド（ＤＳＧＮＤＩＹＧ
ＮＰＩＫＲＩＱ）に対する抗体で、免疫原のキャリヤー
たん白質としてキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）を用いた以外は、後述する抗ヒトＭＭＰ−２ポリ
ペプチドモノクローナル抗体の調製法に従って調製し
た。得られたモノクローナル抗体のうち、クローンＮ
ｏ．６８−６Ｈ４からの抗体を抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ４Ｂカラムに使用した。

【００１５】更に、フィブロネクチンを除去するため、
抗フィブロネクチン抗体（ＣａｐｐｅＩ Ｌａｂ．）結
合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムに供し、その素通り
画分を採取した。この画分にはプロＭＭＰ−２が含まれ
ており、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上、ほぼ単一に精
製されていることが認められた。一方、抗ヒトＴＩＭＰ
−２抗体（クローンＮｏ．６８−６Ｈ４）結合Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの０．１５Ｍ塩化ナトリウムお
よび１０ｍＭ塩化カルシウム含有０．２Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２．５）による溶出画分には、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上、プロＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２が存在して
おり、プロＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２の複合体が含まれ
ていたと考察される。モノクローナル抗体作製用ヒトプ
ロＭＭＰ−２は、ｇｅｌａｔｉｎ−ａｇａｒｏｓｅの溶
出画分を使用し、後述の実施例６（ｂ）項記載の１ステ
ップサンドイッチ酵素免疫学的定量（ＥＩＡ）には、抗
ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体結合Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂカラムおよび抗フィブロネクチン抗体結合
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの素通り画分のプロＭ
ＭＰ−２を標準抗原として使用した。

【００１６】実施例２ 抗ヒトＭＭＰ−２ポリペプチド
モノクローナル抗体の作製 （ａ） 免疫方法および脾臓細胞の調製法 実施例１，２）に記載の方法により調製したポリペプチ
ド−ＢＳＡ複合体２５０μｇを、完全フロイントアジュ
バンドと共に、８週令Ｂａ１ｂ／ｃ雌マウスの腹腔内に
投与し、初回免疫とした。１５日後に、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したポリペプチド−ＢＳＡ
複合体２００μｇ、初回免疫したマウスに腹腔内投与
し、追加免疫した。更に３８日後に追加免疫時と同様に
ポリペプチド−ＢＳＡ複合体７０μｇを静脈内および１
３０μｇを腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後
に、脾臓を摘出し、脾臓胞懸濁液を調製した。

【００１７】（ｂ） 細胞融合 （１） 材料 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）および硫酸アカシン（１０μｇ／ｍｌ）を加
え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東洋
メンブレンイルターで除菌濾過した。 ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培地に除菌濾過
したＦＣＳを１５％ｖ／ｖ）の濃度になるように加え
た。

【００１８】ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６
４０培地にポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ
４，０００、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／
ｗ）になるように加え、無血清溶液を調製した。

【００１９】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ
２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔ
ｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａ
ｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１−
３７２に記載の０ｉらの方法を若干改変して行った。

【００２０】（２） 細胞融合法 前記（ａ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率１００
％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１
の割合で融合した。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に
前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄し、次に同じ培地
に懸濁し、融合させるため上記の割合で混合した。容量
２５０ｍｌのポリプロピレン製遠沈管（岩城硝子）を用
い、４０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中４００×ｇ、
１０分間遠心分離し、上清を完全に吸出した。沈殿細胞
に３７℃加温ＰＥＧ ４，０００溶液６．０ｍｌを穏や
かに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し
細胞を再懸濁、分散させた。次に３７℃加温ＲＰＭＩ
１６４０培地６．０ｍｌを１分間で滴下した。この操作
をさらに１回繰り返した後、同培地４２．０ｍｌを２〜
３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させた。こ
れを４００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を完全に吸
引除去した。次にこの沈殿細胞に３７℃加温ＮＳ−１培
地６０ｍｌを速やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌ
のピペットを用いて注意深くピペッティングして分散し
た。さらに同培地１２０ｍｌを加えて希釈し、ポリスチ
レン製９６穴マイクロウエル（岩城硝子）にウエル当り
６．０×１０^５個／０．１ｍｌＮＣ細胞を加えた。細胞
を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％
空気中で温度３７℃、湿度１００％下に培養に付した。

【００２１】（ｃ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 （１） 使用培地 ＨＡＴ培地：前記（ｂ）で述べたＮＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．
４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

【００２２】（２） ハイブリドーマの選択 前記（ｂ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツ
ールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加え
た。２、３、５、８、１１日目に培地の半分（０．１ｍ
Ｉ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日目に培地の
半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。以降３〜４日毎に
培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。通常約２週
間で充分なハイブリドーマの生育が観察される。ハイブ
リドーマ生育全ウエルについて次項（ｄ）記載の固相−
抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウエルをチ
ェックした。次にフィーダーとして１０^７個のマウス胸
腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セ
ルウエル（岩城硝子）に加えたものを用い、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの全内容物を移した。これ
を前記（ｂ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３
７℃で約１週間培養に付した。その間１〜２回各ウエル
の上清０．５ｍｌを新しいＨＴ培地０．５ｍｌと交換し
た。ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法
により陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｅ）記
載の限界希釈法によるクローニングを行った。なお、ク
ローニングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ^２
組織培養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存用試料
を調製した。

【００２３】（ｄ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ
−２ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改
変した方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体
の検出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプ
レート（ＦｌｏｗＬａｂ．）を１００ｎｇの各ヒトＭＭ
Ｐ−２ポリペプチドでコートし、次に、未コート部分を
１％ＢＳＡでブロックした。これに前記（ｃ）で得られ
たハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温
で約１時間インキュベートした。２次抗体として西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を加え、さらに室温で約１
時間インキュベートした。次に基質である過酸化水素と
ｏ−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度をマ
イクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソーダ）
を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し判定した。

【００２４】（ｅ） クローニング 前記（ｃ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエル当り５個、１個および
０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目、１２日目
に全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加し
た。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハイブリ
ドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウエルが５
０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行った。テス
トした全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中の
コロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認され
たウエルを４〜６個選び再クローニングする。最終的に
表２に示したようにヒトＭＭＰ−２ポリペプチドに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。

【００２５】（ｆ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．）を腹腔内投与し
た。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０^７個を
同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に生体内
で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を
含む腹水を得ることができた。

【００２６】（ｇ） モノクローナル抗体の重鎖および
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトＭＭＰ−２ポリペ
プチドをコートしたミクロタイトレーションプレート
に、前記（ｅ）で得られた各モノクローンの培養上清を
加えた。次にＰＢＳにより洗浄した後、アイソタイプ特
異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）
を加えた。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、
基質として過酸化水素および２，２′−アジノ−ジ（３
−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重
鎖および軽鎖を判定した。その結果をまとめて表２に示
す。

【００２７】（ｈ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｆ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、ＩｇＧ１クラスの抗体について０．
５Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したプロテインＡアフィゲ
ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに吸着させ、上記洗浄液で
洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出
することにより精製した。

【００２８】実施例３ 抗ヒトプロＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体の作製 （ａ） 免疫方法および脾臓細胞の調製法 実施例１，３）に記載の方法により精製したＣＣＤ−４
１ＳＫ細胞由来ヒトプロＭＭＰ−２，３１μｇを用いて
実施例２，（ａ）の方法に従い調製した。なお、この方
法においては、初回免疫後、１５日後に０．１５Ｍ塩化
ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解したヒトプロＭＭＰ−２，３５μｇを腹腔内投与
し、追加免疫した。また、最終免疫として、ヒトプロＭ
ＭＰ−２，４０μｇを静脈内投与した。

【００２９】（ｂ） 細胞融合 前記（ａ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率１００
％）を用いて、前記実施例２，（ｂ）と同様に行った。

【００３０】（ｃ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 前記（ｂ）の培養開始翌日（１日目）、細胞に対し、前
記実施例２，（ｃ）に記載した方法で行った。

【００３１】（ｄ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ
−２抗体産生ハイブリドーマの検索 前記実施例２，（ｄ）に記載した方法と同様に行った。
この方法においては、９６穴ミクロタイトレーションプ
レートを５０ｎｇのヒトプロＭＭＰ−２でコートした。

【００３２】（ｅ） クローニング 前記実施例２，（ｅ）に記載した方法と同様に行った。
最終的に表３に示したＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ヒトプ
ロＭＭＰ−２に対するモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを得た。

【００３３】（ｆ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 前記実施例２，（ｆ）に記載した方法と同様に行った。 （ｇ） モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトプロＭＭＰ−２を
コートしたミクロタイトレーションプレートに前記
（ｅ）で得られた各モノクローンの培養上清を加え、前
記実施例２，（ｇ）に記載した方法と同様に行った。結
果は表３に示されている。 （ｈ） モノクローナル抗体の精製 前記実施例２，（ｈ）に記載した方法と同様に行った。

【００３４】実施例４ 抗ヒトＭＭＰ−２ポリペプチド
モノクローナル抗体および抗ヒトプロＭＭＰ−２モノク
ローナル抗体の選択 （ａ） 材料の調製 ＤＭＥＭ培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ“Ｎｉｓｓｕｉ”（日水
製薬）に重炭酸ナトリウム（３１ｍＭ）およびＬ−グル
タミン（５ｍＭ）を加え、ドライアイスでｐＨ７．２に
調整し、０．２μｍ東洋メンブレンで除菌濾過した。

【００３５】ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体を選択するため、ヒト慢性関節リウマチ
（ＲＡ）滑膜細胞を、１５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で
５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃、６〜７日間培
養し、遠心後の細胞を０．２％ラクトアルブミン水解物
および２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏ
ｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦα．Ｇｅｎｚｙｍｅ）を
含むＤＭＥＭ培地で懸濁し、同様に６〜８日間培養し
た。遠心後上清を限外濾過あるいは３％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）により濃縮し、イムノブロッティング用試料
とした。

【００３６】また、前述の実施例１，３）に記載した方
法により調製したＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ヒトプロＭ
ＭＰ−２をヒトプロＭＭＰ−２に対するモノクローナル
抗体を選択するためのイムノブロッティング用試料とし
た。

【００３７】また、他のＭＭＰｓあるいは他のたん白質
との交差反応を調べるために、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ−
１０８０（アメリカンタイプカルチャーコレクション）
を前記ＮＳ−１培地で５％ＣＯ_２インキュベーター中、
３７℃、２〜３日間培養し、遠心後の細胞を２％ラクト
アルブミン水解物および１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＴＮ
Ｆαを含むＲＰＭＩ １６４０培地で懸濁し、同様に７
〜１０日間培養した。７００〜８００ｒｐｍ、３分間の
遠心上清を集め、限外濾過あるいは３％ＴＣＡにより濃
縮し、イムノブロッティング用試料とした。

【００３８】（ｂ） イムノブロッティング 実施例４，（ａ）で調製した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供した後、細胞工学１＆２，１０６１−１０６８（１９
８３）に記載の田部の方法に従ってウエスタンブロッテ
ィングを行い、各モノクローンの培養上清と反応後、ペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａ
ｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を用い、間接法によりイムノブロ
ッティングを行った。

【００３９】その結果、第２表に掲げた抗ヒトＭＭＰ−
２ポリペプチドモノクローナル抗体のうち、３４−２Ｈ
１１，３４−２７Ａ５，３５−３Ｆ２，３９−１Ｈ９，
３９−４Ｅ４，３９−１１Ｄ１１，３９−１２Ｂ７，３
９−１８Ｆ３，４２−２Ｈ２，４２−５Ｄ１１，４２−
１４Ｈ５，４３−３Ｆ９，４５−２Ｈ８，４５−６Ｆ１
２，４５−１４Ａ８，４５−１５Ｆ９および４５−１７
Ｄ８の１７個のモノクローナル抗体がヒトＲＡ滑膜細胞
由来プロＭＭＰ−２と反応した。また第３表に掲げた抗
ヒトプロＭＭＰ−２モノクローナル抗体のうち、７５−
７Ｆ７のみがＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ヒトプロＭＭＰ
−２と反応した。

【００４０】ヒトプロＭＭＰ−２の分子量は、ＴＮＦα
で刺激されたヒトＲＡ滑膜細胞培養液から調製した試料
を用いたイムノブロッティングの結果から、プロＭＭＰ
−２が７２ｋＤａ、ＡＰＭＡにより活性化された活性型
ＭＭＰ−２が６７ｋＤａであった。

【００４１】（ｃ） 特異性 各陽性の前記（ｂ）の免疫染色で陽性となった抗ヒトＭ
ＭＰ−２ポリペプチドモノクローナル抗体および抗ヒト
プロＭＭＰ−２モノクローナル抗体が各々他のＭＭＰｓ
または他のたん白質と交差反応するかどうかをみるため
に、ＴＮＦαで刺激したヒトＲＡ滑膜細胞およびＨＴ１
０８０細胞のそれぞれの培養液から調製した試料を用い
てイムノブロッティングにより各モノクローナル抗体の
特異性を調べた（表４）。

【００４２】前記（ｂ）の陽性モノクローナル抗体のう
ち、３４−２Ｈ１１，３９−１Ｈ９および４２−１４Ｈ
５の各モノクローナル抗体は９２ｋＤａゼラチナーゼ
（ヒトプロＭＭＰ−９）と交差反応を示し、４２−２Ｈ
２および４２−１４Ｈ５の各モノクローナル抗体は、ヒ
トプロ間質型コラゲナーゼ（ヒトプロＭＭＰ−１）およ
びヒトプロストロムライシン−１（ヒトプロＭＭＰ−
３）と交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗
体については、他のヒトプロＭＭＰｓまたは細胞培養液
中の他のたん白質と反応せず、ヒトプロＭＭＰ−２に対
して特異的に反応することが示された。

【００４３】更に、特異的に反応することが確認された
もののうち、ＩｇＧ１抗体で、ヒトプロＭＭＰ−２との
反応性の高いものは、４３−３Ｆ９，４２−５Ｄ１１お
よび７５−７Ｆ７の３クローンの抗体であることが認め
られた。

【００４４】実施例５ 酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＰＯＤ
複合体）の調製 １） ＳＨ基標識ＩｇＧの調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９〜３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、マ
ウス抗ヒトプロＭＭＰ−２ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を調製
した。ヒトプロＭＭＰ−２に対し、反応性が認められた
モノクローナル抗体（ＩｇＧ：クローンＮｏｓ．４３−
３Ｆ９，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３４，４
２−５Ｄ１１，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１４
６）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透析
し、その溶液に含有するＩｇＧに対して１００倍モルの
Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸をジメチルホルム
アミド溶液として加え、３０℃、３０分間インキュベー
ションした。次に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１００μｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
６．０）１０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ
７．０）１００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、５
ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５でゲル濾
過し、ＳＨ基標識マウス抗ヒトプロＭＭＰ−２ＩｇＧを
得た。

【００４５】２） マレイミド標識ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）の調製 ＰＯＤを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ．７．０）に溶解し、そのＰＯＤ量に
対して２５倍モル量のＮ−（ε−マレイミドカプロイル
オキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）をジメチルホルム
アミド溶液として加え、３０℃、３０分間反応させた。
この反応液を０．１Ｍリ酸緩衝液（ｐＨ．６．０）で平
衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでゲル濾過
し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分取した。

【００４６】３） ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調整 上記１）で調製したＳＨ基標識ＩｇＧ １モル、上記
２）で得られたマイミド標識ＰＯＤ約５モルを加え、４
℃、２０時間静置した。この混合液を０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＵ１ｔｒｏｇｅｌ Ａ
ｃＡ ４４カラムでゲル濾過し、マウス抗ヒトプロＭＭ
Ｐ−２ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体画分を分取した。ＢＳＡ
およびクロルヘキシジンを各々０．１％および０．００
１％になるように添加し、４℃で保存した。

【００４７】実施例６ ヒトプロＭＭＰ−２の定量法 （ａ） モノクローナル抗体結合担体の調製法 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９〜３２７（１
９８３）に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、
マウス抗ヒトプロＭＭＰ−２ ＩｇＧ（クローンＮｏ．
７５−７Ｆ７，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３
５）を各々０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１００μｇ／ｍｌ
（Ａ_２８０＝０．１５）の濃度に調整した。そのモノク
ローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル当
り１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。次に
モノクローナル抗体溶液を除去し、各々生理食塩液で２
回洗浄後、１％ＢＳＡ−０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬し、４℃で保
存した。

【００４８】（ｂ） １ステップサンドイッチＥＩＡ法 １％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ
ＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝
液Ａ）で希釈した精製ヒトプロＭＭＰ−２あるいはヒト
ＭＭＰ−２を含む検体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ）に各々１０μｌ加えた。次に実施例５で調製し
た酵素標識抗体を１０００ｎｇ／ｍｌとなるように、緩
衝液Ａで希釈し、上記ビニルプレートに各々１１０μｌ
ずつ加え混和した。この混合液を前項（ａ）で調製した
抗体結合プレートに１００μｌ加え、室温で１時間反応
させ、生理食塩液で４回洗浄した。次に０．０２％過酸
化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．
９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン
をウエル当たり１００μｌ加え、室温で３０分間反応
後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し、反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ_４９２をマイクロプレートリーダー（Ｍ
ＰＲ−Ａ４ 東洋ソーダ）を用いて測定し、検量線より
検体中のヒトＭＭＰ−２量を求めた。

【００４９】以上の操作法を表５に示す。表５に記載し
たプレート法により、クローンＮｏｓ． ４３−３Ｆ
９，４２−５Ｄ１１からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体および
前記（ａ）項で調製した抗体結合担体を用い、１ステッ
プサンドイッチＥＩＡを行った（表６および図１参
照）。どちらの場合も、標準抗原の濃度に依存した吸光
度が得られたが、固相抗体として７５−７Ｆ７からのＩ
ｇＧ、４３−３Ｆ９からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体（−・
−）の系の方が、固相抗体として７５−７Ｆ７からのＩ
ｇＧ、４２−５Ｄ１１からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体（−
×−）の系より高い吸光度を示すことが認められた。こ
の時、前者のＩｇＧ−ＰＯＤ複合体にクローンＮｏ．４
３−３Ｆ９からの抗体を用いた系では、標準抗原１−５
００ｎｇ／ｍｌ（１０−５，０００ｐｇ／ｗｅｌｌ）の
濃度まで直線が認められた。その結果、固相および酵素
標識抗体用モノクローナル抗体として、クローンＮｏ
ｓ．７５−７Ｆ７および４３−３ Ｆ９からの抗体を以
下の免疫学的定量法に使用することとした。クローンＮ
ｏ．４３−３Ｆ９からの抗体は、ヒトＭＭＰ−２ポリペ
プチドのＮ末端側のペプチドに対するモノクローナル抗
体であるため、ここでは、プロＭＭＰ−２の測定系とい
うことができる。

【００５０】（ｃ） 緩衝液の選択 １ステップサンドイッチＥＩＡ法で用いる緩衝液の検討
を行った。緩衝液として、緩衝液Ａと、１％ＢＳＡ、
０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ
含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝液
Ｂ）を用いた。

【００５１】実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂで希釈した標準抗原を９６穴ビ
ニルプレートに２０μｌ加えた。次に実施例５で調製し
た酵素標識抗体、ＩｇＧ（クローンＮｏ．４３−３Ｆ
９）−ＰＯＤ複合体を１０００ｎｇ／ｍｌになるように
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレート
に１００μｌずつ加え、混合した。この混合液を実施例
６，（ａ）で調整した抗体結合プレートに１００μｌ加
え、室温で１時間反応させた。以下の操作は実施例６，
（ｂ）に記載した操作と同様に行った。検量線の結果を
表７および図２に示す。緩衝液Ａ（−・−），Ｂ（−×
−）どちらの場合も標準抗原の濃度に依存した吸光度が
得られたが、緩衝液Ａの方がより高い吸光度を示した。
その結果、以下において緩衝液Ａを用いることにした。

【００５２】（ｄ） 希釈試験 実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、希釈試験を行
った。緩衝液Ａで希釈した標準抗原あるいは１／１〜１
／２５６倍に倍数希釈した３種類の検体（健常人血清）
を９６穴ビニルプレートに１０μｌ加えた。以下の操作
は実施例６，（ｂ）に記載した操作と同様に行い、各々
希釈血清を測定した（表８Ａおよび図３参照）。希釈試
験に用いたいずれの血清も充分な直線を示し、回帰直線
もほぼ０点を通った（表８Ｂおよび図３参照）。

【００５３】（ｅ） 同時再現性試験および感度 実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、標準抗原液お
よび検体（健常人血清）について同時再現性試験を行っ
た（表９参照）。標準抗原液の吸光度、血清測定値いず
れのＣＶ値も１０％以下であることが認められた。

【００５４】標準抗原０ｎｇ／ｍｌの吸光度を８回測定
したときの平均（Ｍ）と標準偏差（ＳＤ）を算出し、Ｍ
＋２ＳＤに相当する標準抗原濃度を感度とするとき、そ
の感度は約０．２４ｎｇ／ｍｌ（２．４ｐｇ／ｗｅｌ
ｌ）であった。

【００５５】（ｆ） 添加回収試験 健常人血清１０μｌに標準抗原液（０、６３、２５０、
５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍｌ）各１０μｌを
添加したものを検体とし、１００μｌの酵素標識抗体液
（１１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ｏ−フェニレンジア
ミン濃度を０．２ｍｇ／ｍｌとした他は実施例６，
（ｂ）に記載した操作法と同様にしてプロＭＭＰ−２量
を測定し、回収された標準抗原量を算出した（表１０参
照）。標準抗原量の平均回収率は９９．５％であり、充
分な回収率が得られ、１０μｌ中の抗原量を正確な値と
して読みとり得ることが認められた。

【００５６】（ｇ） １ステップサンドイッチＥＩＡ法
による血清中ヒトプロＭＭＰ−２量の測定 前記（ｂ）に記載した１ステップサンドイッチＥＩＡ法
により、検体として各種疾患の血清プロＭＭＰ−２を測
定した（表１１および図４参照）。健常人血清（ｎ＝２
１３）のプロＭＭＰ−２値は、５７０ｎｇ／ｍｌ±１１
８ｎｇ／ｍｌ（Ｍ±ＳＤ）であった。甲状腺機能先進
症、原発性肝癌および胆汁性肝硬変患者血清プロＭＭＰ
−２濃度は各々７４９±１６６ｎｇ／ｍｌ、６８６±２
３６ｎｇ／ｍｌおよび７１６±１３５ｎｇ／ｍｌであ
り、健常人血清プロＭＭＰ−２濃度に比べ有意に高い値
を示した。一方、ＲＡ、変形性関節症、胃癌および膵癌
患者血清プロＭＭＰ−２濃度は、各々４０８±１３９ｎ
ｇ／ｍｌ、４４９±７２ｎｇ／ｍｌ、４２７±１０３ｎ
ｇ／ｍｌおよび４２２±１３０ｎｇ／ｍｌであり、健常
人血清プロＭＭＰ−２濃度に比べ有意に低い値を示し
た。なお、慢性膵炎患者血清プロＭＭＰ−２濃度は、健
常人のそれと比べて有意差は認められなかった。

【００５７】実施例７ 血清中抗原の解析 イムノブロッティングにより、検体（血清）中の抗原の
解析を行った。 （ａ） 材料の調製 検体（健常人血清）を、抗ヒトプロＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体（クローンＮｏ．７５−７Ｆ７）結合カラム
に供し、Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒで充分洗浄後、
その吸着たん白質を８Ｍ尿素含有Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕ
ｆｆｅｒで溶出した。溶出画分は、ＰＤ−１０カラムに
よりＴｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒに交換したのち、セ
ントリコン１０（アミコン）により濃縮し、イムノブロ
ッティング用試料とした。

【００５８】（ｂ） イムノブロッティング 前記（ａ）で調製した血清試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供した後、細胞工学１＆２，１０６１−１０６８（１９
８３）に記載の田部の方法に従ってウエスタンブロッテ
ィングを行った。次に、抗ヒトＭＭＰ−２ ＩｇＧ（ク
ロー）Ｎｏｓ．４３−３Ｆ９および７５−７Ｆ７）−Ｐ
ＯＤ複合体、抗ヒトＴＩＭＰ−２ １ｇＧ（クローンＮ
ｏ．６７−４Ｈ１１，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
２６９０）−ＰＯＤ複合体の３種を用いて免疫染色を行
った。ここで用いた抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（クローンＮｏ．６７−４Ｈ１１）は、ヒトＴＩＭ
Ｐ−２ポリペプチド（ＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥ
Ｄ）に対する抗体で、免疫原のキャリヤーたん白質とし
てＫＬＨを使用した以外は実施例２の記載方法に従い調
製した。こうして得られたモノクローナル抗体のうち、
クローンＮｏ．６７−４Ｈ１１の抗体を酵素標識抗体と
後述する実施例８，（ａ）に記載した抗体結合Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｂカラムに使用した。

【００５９】結果を図５に示す。４３−３Ｆ９および７
５−７Ｆ７ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体で染色した場合（各
々レーン１およびレーン２）、７２ｋＤａ付近に陽性バ
ンドが、また、６７−４Ｈ１１ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
で染色した場合（レーン３）、２４ｋＤａ付近に陽性バ
ンドが確認された。したがって血清中においては、ＭＭ
Ｐ−２はほとんど潜在（プロ）型として存在し、そのプ
ロＭＭＰ−２は単独あるいは、ＴＩＭＰ−２と複合体を
形成して存在することが示唆された。

【００６０】実施例８ ヒトＴＩＭＰ−２添加効果 一定量のプロＭＭＰ−２に種々の濃度のＴＩＭＰ−２を
加えたものを検体とし、１ステップサンドイッチＥＩＡ
系に対する影響を調べた。

【００６１】（ａ） ヒト胎盤由来ヒトＴＩＭＰ−２の
精製 胎盤を細切し、１ｍＭ塩化カルシウム、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、０．００５％ブリッジ−３５，１ｍＭ Ｎ−
エチルマレイミド、５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭ塩酸ベンズ
アミジン含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）を加え撹拌し、３０分間静置した。その後、高速冷
却遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ）により、１０，０００ｒｐ
ｍ、４℃、５０分間遠心分離を行い、上清を得た。同様
の操作をもう一度繰り返し、上清をプールした。次に、
この上清を抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体（ク
ローンＮｏ．６７−４Ｈ１１）結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂカラムに吸着させたのち、１ｍＭ塩化カルシウ
ム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．００５％ブリッジ−
３５含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４，緩
衝液Ｃ）により、その抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ樹脂をガラスフィルター上で洗浄した。更に、緩衝液
Ｃと１ｍＭ塩化カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
０．００５％ブリッジ−３５含有０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で交互に洗浄後、樹脂をカラムに詰め直
し、吸着たん白質を１ｍＭ塩化カルシウム、０．００５
％ブリッジ−３５含有０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液
（ｐＨ２．５）で溶出し、直ちに１ｍＭ塩化カルシウ
ム、０．００５％ブリッジ−３５含有３Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）により中和した。次にこの溶出画
分を限外濾過（東洋濾紙ＵＨＰ−４３）により濃縮し、
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ５４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｃｓ）によりゲル濾過した。各フラクションのＡ
_２８０を測定し、２つ目のピークを集めた。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上、得られたヒトＴＩＭＰ−２は、単一バンドに
精製された。

【００６２】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２添加効果 プロＭＭＰ−２量を一定とし、ヒトＴＩＭＰ−２をモル
比（ＴＩＭＰ−２／プロＭＭＰ−２）が１２５，２５，
１，０．２，０．０４，０となるように加えた。反応
後、プロＭＭＰ−２量を基準にＥＤＴＡを除いた緩衝液
Ａにより希釈し、実施例６，（ｂ）に記載した１ステッ
プサンドイッチＥＩＡ法によりプロＭＭＰ−２量を測定
した（表１２参照）。その結果、ヒトＴＩＭＰ−２添加
量を増やしてもプロＭＭＰ−２各濃度のＡ_４９２値に変
化は認められなかった。従って、このアッセイ系によ
り、プロＭＭＰ−２−ＴＩＭＰ−２複合体中のプロＭＭ
Ｐ−２もフリーのプロＭＭＰ−２と同程度の免疫反応性
で認識できることが判明した。

【００６３】

【表１】

【００６４】

【表２】

【００６５】

【表３】

【００６６】

【表４】

【００６７】

【表５】

【００６８】

【表６】

【００６９】

【表７】

【００７０】

【表８】

【００７１】

【表９】

【００７２】

【表１０】

【００７３】

【表１１】

【００７４】

【表１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトプロＭＭＰ−２の標準曲線を示すグラフで
あり、縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度、横軸はプロＭ
ＭＰ−２濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。

【図２】プロＭＭＰ−２の１ステップサンドイッチＥＩ
Ａ法に使用する緩衝液の影響を示すグラフであり、縦
軸、横軸はいずれも図１と同様である。

【図３】健常人血清の希釈試験の結果を示すグラフであ
り、縦軸はプロＭＭＰ−２量（ｎｇ／ｍｌ）、横軸は希
釈倍率（倍）を示す。

【図４】各種疾患血清のプロＭＭＰ−２測定結果を示す
グラフであり、縦軸はプロＭＭＰ−２量（ｎｇ／ｍ
ｌ）、横軸は表１１に示した各疾患番号を表わす。

【図５】血清中抗原のイムノブロッティングの結果を表
わす図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 東海 秀明 富山県高岡市横田本町11番１号 (72)発明者 早川 太郎 愛知県名古屋市天白区向が丘３丁目406 番地 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市五十里東町190番地 (56)参考文献 特開 平２−1553（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−2187（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−183397（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−1553（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−501423（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−505696（ＪＰ，Ａ) 実験医学第７巻第５号 Ｐ32−40 （1989) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/573 G01N 33/577

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型
   コラゲナーゼに対し、特異的に結合する２種類のモノク
   ローナル抗体において、固相担体に結合させる抗体、あ
   るいは標識物を付与する抗体として、いずれか一方にヒ
   ト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼのＮ
   末領域を認識する抗体を用いて、サンドイッチ法により
   免疫学的に測定を行なうことを特徴とするヒト７２−ｋ
   Ｄａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼの定量法。
2. 【請求項２】 血清中のヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ
   ／ＩＶ型コラゲナーゼを測定することを特徴とする請求
   項１に記載のヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コ
   ラゲナーゼの定量法。