JPH0771493B2 - Gene disruption or gene replacement plasmid vector, transformant and use thereof - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）を破壊又は置換
することのできるプラスミドベクター、それらの形質転
換体及びその利用に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a plasmid vector capable of disrupting or substituting the arginase gene (CAR1), transformants thereof and use thereof.

本発明の形質転換体はアルギナーゼの欠失によって、尿
素の生成が抑制され、尿素から誘導されるカルバミン酸
エチルの生成をなくすことができるので、本発明の形質
転換体を用いることによって、カルバミン酸エチルを含
まない酒類等を製造することができるものである。In the transformant of the present invention, the production of urea is suppressed by the deletion of arginase, and the production of ethyl carbamate derived from urea can be eliminated. Therefore, by using the transformant of the present invention, carbamic acid It is possible to produce alcoholic beverages and the like that do not contain ethyl.

従って、本発明は酒類、アルコール、その他醸造食品の
製造に大きく貢献するものである。Therefore, the present invention greatly contributes to the production of alcoholic beverages, alcohol and other brewed foods.

（発明の背景及び従来技術とその問題点） 一般に、各種醸造食品（清酒、果実酒、ビール、ウイス
キー、ブランデー、醤油、味噌等）の製造醪中には、含
量にはかなりの差があるが、尿素が存在し、それがエタ
ノールと反応して発癌物質であるカルバミン酸エチル
（ウレタン、CAE）を生成させている。(Background of the Invention and Prior Art and Problems Thereof) In general, there is a considerable difference in the content among various brewed foods (sake, fruit wine, beer, whiskey, brandy, soy sauce, miso, etc.). , Urea is present, which reacts with ethanol to produce the carcinogen ethyl carbamate (urethane, CAE).

そして、尿素を減少させることにより、カルバミン酸エ
チルも同様に減少することから、尿素が最も主要な前駆
物質と考えられているのである。この尿素は、酵母のア
ルギナーゼ（EC 3.5.3.1）によりアルギニンがオルニチ
ンに分解される時に同時に生成される。And, as the amount of urea decreases, the amount of ethyl carbamate also decreases. Therefore, urea is considered to be the most major precursor. This urea is simultaneously produced when arginine is decomposed to ornithine by yeast arginase (EC 3.5.3.1).

従来、尿素を減少させる方法としてはアルギニンの酵母
菌体への取込みに関与するアルギニン透過酵素の欠失し
た変異株（アルギニンのアナログであるカナバニンに対
して耐性が生じる）を用いることにより、清酒中の尿素
量を約半量まで減少させる方法がとられてきた。Conventionally, as a method for reducing urea, a mutant strain lacking the arginine permease involved in the uptake of arginine into yeast cells (which causes resistance to canavanine, an analog of arginine) is used in sake. A method of reducing the amount of urea in the above to about half has been taken.

しかし、この変異株は、野生株に比較して発酵が鈍いた
めに、他の酵母に汚染されやすく、かつ、リンゴ酸の生
成量が多いためやや酸度の多い清酒になるという問題が
ある。However, this mutant strain is less fermentable than the wild type strain, so that it is easily contaminated by other yeasts, and since it produces a large amount of malic acid, it has the problem that it becomes sake with a slightly high acidity.

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、酒類中の尿素が、酵母のアルギナーゼの
作用で生成することから、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）
を破壊又は他の遺伝子で置換して尿素生成をなくし、か
つ、発酵速度及び酸生成能が親株と変らない形質転換体
を開発することを目的として、鋭意研究を行った。(Means for Solving Problems) Since the urea in liquor is produced by the action of yeast arginase, the present inventors have found that the arginase gene (CAR1)
The present invention was conducted intensively for the purpose of developing a transformant that destroys or replaces with other gene to eliminate urea production, and has the same fermentation rate and acid production ability as those of the parent strain.

まず、本発明者らは、アルギナーゼ遺伝子の破壊又は置
換に注目し、サッカロマイセス・セレビシアエのゲノム
DNA制限酵素断片から、アルギナーゼをコードするDNA断
片をクローン化し、サッカロマイセス・セレビシアエの
宿主・ベクター系に連結し、得られたプラスミドベクタ
ーを移入することにより、アルギナーゼ遺伝子（CAR1）
が破壊又は置換される形質転換体が得られることを見出
したのである。First, the present inventors focused on the disruption or replacement of the arginase gene, and found that the genome of Saccharomyces cerevisiae
From the DNA restriction enzyme fragment, a DNA fragment encoding arginase was cloned, ligated to the Saccharomyces cerevisiae host-vector system, and the resulting plasmid vector was transferred to obtain the arginase gene (CAR1).
It has been found that a transformant can be obtained in which is destroyed or replaced.

また、ここに得られた形質転換体を用いて、アルコール
発酵を行ったところ、尿素の生成は全くみられず、発酵
速度は親株と変らないことを認め、本発明を完成するに
至った。Further, when alcohol fermentation was carried out using the transformant obtained here, urea production was not observed at all, and it was confirmed that the fermentation rate was the same as that of the parent strain, and the present invention was completed.

本発明は、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプ
ラスミドベクターに関するものであり、また、アルギナ
ーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターに
関するものである。The present invention relates to a plasmid vector for gene disruption of the arginase gene, and also relates to a plasmid vector for gene replacement of the arginase gene.

また、本発明は、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のた
めのプラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、
サッカロマイセス・セレビシアエに移入することによっ
て得られる尿素生成のない形質転換体に関するものであ
り、また、アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターを作製し、これを直鎖状とし、サッカ
ロマイセス・セレビシアエに移入することによって得ら
れる尿素生成のない形質転換体に関するものである。The present invention also produces a plasmid vector for gene disruption of the arginase gene, which is linearized,
The present invention relates to a urea-free transformant obtained by transfer to Saccharomyces cerevisiae. Further, a plasmid vector for gene replacement of arginase gene was prepared, linearized, and transferred to Saccharomyces cerevisiae. The present invention relates to a transformant obtained by carrying out no urea production.

そして、本発明は、このようにして得られた形質転換体
を用いることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法
に関するものである。The present invention also relates to a method for producing alcoholic beverages, alcohols and the like, which uses the transformant thus obtained.

（詳細な説明） 本発明に用いたゲノムDNAの供与体は、サッカロマイセ
ス・セレビシアエであり具体的には協会７号酵母であ
る。(Detailed Description) The donor of the genomic DNA used in the present invention is Saccharomyces cerevisiae, and specifically, Association No. 7 yeast.

本菌体から染色体DNAを抽出するには、たとえばJ.R.Dil
lon・A.Nasin・E.R.Nestmann編「組換えDNA実験」190頁
記載された、サッカロマイセス・セレビシアエの全DNA
の抽出法に従って行った。For example, JRDil can be used to extract chromosomal DNA from the cells.
All DNA of Saccharomyces cerevisiae, described in "Recombinant DNA Experiment", edited by lon A. Nasin ERNestmann, page 190.
The extraction method of

次に得られたDNAをBamH Iで部分分解した後、細菌アル
カリフォスファターゼで処理しリン酸を除去する。Next, the obtained DNA is partially digested with BamHI and then treated with bacterial alkaline phosphatase to remove phosphate.

同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージ
DNAに上記で得られたDNA断片を挿入して染色体ジーンラ
イブラリーを作製する。当該ファージとしてはEMBL3
（J.Mol.Biol.Vol 170,827〜842（1983））が用いられ
る。上記で得られた染色体ジーンライブラリーからの当
該遺伝子の単離に当っては、サッカロマイセス・セレビ
シアエのアルギナーゼ遺伝子のDNA配列（J.Bacteriolog
y,Vol 160,1078〜1087（1984））に基づいて合成したDN
Aオリゴマーを作製し、それをプローブに用いてプラー
クハイブリダイゼーションを行い、サッカロマイセス・
セレビシアエのアルギナーゼ遺伝子（CAR1）のDNAをク
ローニングする。Phage treated with a restriction enzyme that produces the same sticky ends
The chromosomal gene library is prepared by inserting the DNA fragment obtained above into DNA. EMBL3 as the phage
(J. Mol. Biol. Vol 170,827-842 (1983)) is used. In isolating the gene from the chromosomal gene library obtained above, the DNA sequence of the S. cerevisiae arginase gene (J. Bacteriolog
y, Vol 160,1078-1087 (1984))
A-oligomer was prepared, and it was used as a probe for plaque hybridization.
Clone the DNA of the C. cerevisiae arginase gene (CAR1).

遺伝子破壊のためのプラスミドの作製は次にようにして
行う。The plasmid for gene disruption is prepared as follows.

即ち、第１図に示されるように、アルギナーゼ遺伝子由
来の大きさが0.9kbのHind III−Pst Iフラグメントを、
大きさが3.1KbpのE.coli用ベクターpUC119（Gene,Vol.3
3,103〜119（1985））のHind III−Pst I部位に連結し
てプラスミドpHP−１（大きさ4.0Kbp）を作製する。こ
のpHP−１のHind III部位に酵母用プラスミドベクターY
Rp7（Gene,Vol.10,157〜166（1980））由来の大きさが
0.8KbpのTRP1を含むEcoRI−Pst Iフラグメントを組み込
んでYIp型プラスミドpEPH−２（大きさ4.8Kbp）を作製
する。That is, as shown in FIG. 1, a 0.9 kb Hind III-Pst I fragment derived from the arginase gene was added to
Vector pUC119 (Gene, Vol.3) for E. coli with a size of 3.1 Kbp
3,103 to 119 (1985)) was ligated to the Hind III-Pst I site to generate plasmid pHP-1 (size 4.0 Kbp). Yeast plasmid vector Y was added to the Hind III site of pHP-1.
The size derived from Rp7 (Gene, Vol.10,157-166 (1980))
An EcoRI-PstI fragment containing 0.8 Kbp of TRP1 is incorporated to prepare a YIp type plasmid pEPH-2 (size: 4.8 Kbp).

この方法の特徴は、まず破壊される遺伝子（アルギナー
ゼ）と共通な配列を持ち、かつその遺伝子上に存在する
mRNAの開始コドンと終止コドンを除いたプラスミドを作
製する。このプラスミドは、共通配列上の特異な制限酵
素部位で切断したのち、直鎖状のDNAにして形質転換に
用いられる。通常このプラスミドには選択のためのマー
カーとしてサッカロマイセス・セレビシアエのトリプト
ファン要求性を相補する遺伝子TRP1がつないであり、形
質転換体、即ち遺伝子破壊体をトリプトファンを含まな
い平板培地上で選択できるようになっている。The feature of this method is that it has a common sequence with the gene to be destroyed (arginase) and exists on that gene.
Create a plasmid excluding the start and stop codons of mRNA. This plasmid is cleaved at a unique restriction enzyme site on the consensus sequence and then converted into linear DNA for use in transformation. Usually, this plasmid is ligated with a gene TRP1 which complements the tryptophan requirement of Saccharomyces cerevisiae as a marker for selection, so that transformants, that is, gene disruptants, can be selected on a plate medium containing no tryptophan. ing.

遺伝子置換のためのプラスミドの作製は次のようにして
行う。A plasmid for gene replacement is prepared as follows.

即ち、第２図に示されるように、pUC119のBamH I部位に
アルギナーゼ遺伝子を含む5.6Kbpのフラグメントを連結
して作製されたプラスミドベクターpCAR112を第２図で
示されるように、Sac IIで切断し、得られたSac II切断
部位を、ベクターYRp7のTRP1 geneをコードする0.8Kbp
のEcoRI−Pst Iフラグメントと連結してpREP−１を作製
する。That is, as shown in FIG. 2, a plasmid vector pCAR112 prepared by ligating a 5.6 Kbp fragment containing the arginase gene to the BamHI site of pUC119 was digested with Sac II as shown in FIG. The obtained Sac II cleavage site is 0.8 Kbp encoding the TRP1 gene of vector YRp7.
Ligated with the EcoRI-PstI fragment of pREP-1.

このプラスミドは共通配列上の特異な制限酵素部位で切
断し、直鎖状のDNAにして形質転換し、遺伝子置換を行
なわせるものである。This plasmid is one that is cut at a specific restriction enzyme site on the consensus sequence, transformed into linear DNA, and transformed to carry out gene replacement.

なお、アルギナーゼ遺伝子が破壊又は置換されたかどう
かの判定は、次の方法でアルギナーゼ活性を測定し、活
性の有無によって行う。The determination of whether or not the arginase gene has been destroyed or replaced is performed by measuring the arginase activity by the following method and determining whether or not the activity is present.

形質転換株及び親株をYEPD培地（１％酵母エキス、２％
ペプトン、２％グルコース）中で30℃、16時間培養後集
菌洗浄し、25mMグリシン−苛性ソーダ緩衝液（pH9.5）
に懸濁し、ガラスビーズで破壊する。Transformed strain and parent strain in YEPD medium (1% yeast extract, 2%
After culturing in peptone (2% glucose) at 30 ° C for 16 hours, the cells were collected and washed, and 25 mM glycine-caustic soda buffer (pH 9.5) was used.
Suspend in and disrupt with glass beads.

このホモジネートの15000rpm、10分間の遠心上清液を酵
素液とし、アルギニンを基質として反応させ、生成する
尿素を東洋醸造（株）製尿素キットで定量し、アルギナ
ーゼ活性とした。The supernatant of this homogenate centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes was used as an enzyme solution and reacted with arginine as a substrate, and the produced urea was quantified with a urea kit manufactured by Toyo Brewing Co., Ltd. to obtain arginase activity.

次に、この形質転換体を用いて、常法どおり、清酒や果
実酒、ビール、しょうちゅう、ウイスキー等の酒類を製
造することにより、尿素を含まない酒類を製造でき、ひ
いてはカルバミン酸エチルの生成しない酒類の製造が可
能となる。Next, using this transformant, alcohol such as sake, fruit alcohol, beer, shochu, and whiskey can be produced in the usual manner to produce urea-free alcohol, which in turn produces ethyl carbamate. It becomes possible to produce alcoholic beverages that do not.

実施例１ 染色体DNAのジーンライブラリーの作製； サッカロマイセス・セレビシアエ、協会７号のスラント
より１白金耳をYEPD培地5ml中で対数増殖期まで増殖さ
せ、遠心によって菌体を集菌した。1.0Mソルビトール1m
l中に懸濁後、小型遠心機で30〜60秒遠心してペレット
にし、50mMリン酸カリウム（pH7.5）、14mM ２−メル
カプトエタノール、1Mソルビトールの溶液0.5mlに再懸
濁した。これに、ザイモリアーゼ60000 500μｇを加え3
0℃、30分間培養し、プロトプラスト化した。プロトプ
ラストを遠心し、50mM EDTA（pH8.5）0.5mlに再懸濁
し、10％SDS 20μｌとジエチルオキシジホルメート１μ
ｌを加えた。冷却しながら5M酢酸カリウム溶液100μｌ
を加え、更に60分間氷水中につけた。得られた溶菌液を
15000rpm、10分間冷却遠心後上清を取得し、その上清を
等量のフェノールで２回、続いて等量のクロロホルムで
２回処理して夾雑するタンパク質を除去後、２容の冷エ
タノールを加え核酸分を沈澱させた。この沈澱を凍結乾
燥後、TE溶液に溶解し、DNA溶液とした。得られたDNAを
制限酵素BamH Iで部分分解し、アルカリフォスファター
ゼで処理後、λEMBL3−BamH Iアーム（東洋紡（株））
にT4リガーゼを用いて凍結し、得られたファージDNAをi
n virtoパッケージングキット（ギガパックゴールド
（東洋紡（株）販売））を用いてパッケージング後E.co
li P2392にトランスフェクションし、染色体DNAのジー
ンライブラリーとした。Example 1 Preparation of Gene Library of Chromosomal DNA: One platinum loop from a slant of Saccharomyces cerevisiae, Association No. 7 was grown to a logarithmic growth phase in 5 ml of YEPD medium, and cells were collected by centrifugation. 1.0M sorbitol 1m
After suspending in l, it was pelleted by centrifuging for 30 to 60 seconds with a small centrifuge and resuspended in 0.5 ml of a solution of 50 mM potassium phosphate (pH 7.5), 14 mM 2-mercaptoethanol and 1 M sorbitol. Add 500 μg of Zymolyase to this and add 3
It was incubated at 0 ° C. for 30 minutes to form protoplasts. Centrifuge protoplasts, resuspend in 0.5 ml of 50 mM EDTA (pH 8.5), 20 μl of 10% SDS and 1 μl of diethyloxydiformate.
1 was added. 100 μl of 5M potassium acetate solution while cooling
Was added and placed in ice water for a further 60 minutes. The lysate obtained
After cooling and centrifuging at 15000 rpm for 10 minutes, the supernatant was obtained, and the supernatant was treated twice with an equal amount of phenol and then twice with an equal amount of chloroform to remove contaminating proteins, and then 2 volumes of cold ethanol were added. The added nucleic acid was precipitated. This precipitate was freeze-dried and then dissolved in TE solution to obtain a DNA solution. The obtained DNA was partially digested with the restriction enzyme BamHI, treated with alkaline phosphatase, and then λEMBL3-BamHI arm (Toyobo Co., Ltd.)
Frozen using T4 ligase and
After packaging using n virto packaging kit (Gigapack Gold (sold by Toyobo Co., Ltd.))
li P2392 was transfected to obtain a gene library of chromosomal DNA.

実施例２ 染色体DNAジーンライブラリーからのサッカ
ロマイセス・セレビシアエのアルギネーゼ遺伝子（CAR
1）のクローニング； 実施例１に記載の染色体DNAのジーンライブラリーに保
存されたファージのプラーク形成後、プラークハイブリ
ダイゼーションによりアルギナーゼ遺伝子を含むクロー
ンの選択を行った。この一連の操作は常法（Molecular
Cloning,p63〜67,Cold Spring Harbor Laboratory（198
2））によった。プラークハイブリダイゼーションに用
いた２つのプローブは次の配列をもつ合成オリゴマー
（32〜35mer）を³²Pで放射能標識したものである。Example 2 Saccharomyces cerevisiae arginase gene (CAR from chromosomal DNA gene library
Cloning of 1); After plaque formation of the phage stored in the gene library of the chromosomal DNA described in Example 1, plaque hybridization was performed to select a clone containing the arginase gene. This series of operations is a conventional method (Molecular
Cloning, p63 ~ 67, Cold Spring Harbor Laboratory (198
2)) The two probes used for plaque hybridization are ³² P-radiolabeled synthetic oligomers (32-35 mer) having the following sequences.

NR−1 5′TGGACAAATACCCCGATGCTGGTCTTTTATGG3′ NR−2 5′ATGTAACCCTGATCTGGCTATTCATGATATCCATG3′ 約20,000個のプラークよりNR−１、NR−２プローブのど
ちらにもハイブリダイゼーションする１個のクローンを
選択できた。NR-1 5'TGGACAAATACCCCGATGCTGGTCTTTTATGG3 'NR-2 5'ATGTAACCCTGATCTGGCTATTCATGATATCCATG3' One clone that hybridized to both NR-1 and NR-2 probes could be selected from about 20,000 plaques.

これらのクローンの中に挿入されているサッカロマイセ
ス・セレビシアエ協会７号由来のDNA断片をBamH Iで完
全消化したところ、２つのプローブでハイブリダイゼー
ションする5.6kbのDNA断片を得た。このDNA断片をE.col
iのプラスミドベクターpUC119に連結し、サブクローンp
CAR 112を得て、これから当該挿入断片の制限酵素切断
地図を作製した。（第２図のpCAR 112）結果は、Sumrad
aら（J.Bacteriology,Vol 160,1078〜1087（1984））と
同じであった。The Saccharomyces cerevisiae Society No. 7-derived DNA fragment inserted into these clones was completely digested with BamHI, and a 5.6 kb DNA fragment that hybridized with two probes was obtained. E.col this DNA fragment
ligated into the plasmid vector pUC119 of i
CAR 112 was obtained from which a restriction enzyme digestion map of the insert was constructed. (PCAR 112 in Fig. 2) The result is Sumrad
a et al. (J. Bacteriology, Vol 160, 1078-1087 (1984)).

実施例３ アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプ
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターpCAR 112から制限
酵素Hind IIIとPst Iで切り出されるCAR1 gene由来の0.
9KbpのDNA断片をpUC119にT4DNAリガーゼを用いて連結
し、大きさが4.0KbpからなるpHP−１プラスミドベクタ
ーを作製した。Example 3 Construction of a plasmid vector for gene disruption of the arginase gene; 0 from the CAR1 gene cut out from the plasmid vector pCAR 112 described in Example 2 with the restriction enzymes Hind III and Pst I.
The 9 Kbp DNA fragment was ligated to pUC119 using T4 DNA ligase to prepare a pHP-1 plasmid vector having a size of 4.0 Kbp.

このpHP−１に選択マーカーを付与するため、Hind III
部位を常法（Molecular Cloning,p395,Cold Spring Har
bor Laboratory（1982））によって平滑末端にしたもの
へ、酵母用プラスミドベクターYRp7由来の大きさが0.8K
bpのEcoR I−Pst Iフラグメントを切り出して同様に平
滑末端としたものをT4DNAリガーゼを用いて連結して、Y
Ip型プラスミドpEPH−２（大きさ4.8Kbp）を作製した。
（第１図） 実施例４ アルギナーゼ遺伝子の遺伝子置換のためのプ
ラスミドベクターの作製； 実施例２に記載のプラスミドベクターpCAR 112をCAR1遺
伝子上の制限酵素Sac II切断部位で切断した。これに選
択マーカーを付与するために、ベクターYRp7よりTRP1 g
eneをコードする0.8KbpのEcoR I−Pst Iフラグメントを
制限酵素で切り出し、単離した。次に、上記のベクター
およびフラグメントに各々存在する接着末端をT4DNAポ
リメラーゼを用いる常法（Molecular Cloning,p395,Col
d Spring Harbor Laboratory（1982））により平滑末端
とした。後に、両者をT4DNAリガーゼを用いて連結し、
大きさが9.5Kbpからなるアルギナーゼ遺伝子置換用プラ
スミドベクターpREP−１を作製した。（第２図） 実施例５ アルギナーゼを生産しないサッカロマイセス
・セレビシアエの作製； アルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊用ベクターpEPH−２あ
るいは遺伝子置換用ベクターpREP−１を用い、サッカロ
マイセス・セレビシアエYNN27（α,trp1 ura3,gal1）及
び892（a,trp1,asp5,mak12）の２株の形質転換をItoら
の方法（J.Bacteriology,vol 153,163〜（1983））に準
じて行った。In order to add a selection marker to this pHP-1, Hind III
The site is standardized (Molecular Cloning, p395, Cold Spring Har
The size of the yeast plasmid vector YRp7 is 0.8K.
The EcoR I-Pst I fragment of bp was excised and blunt-ended in the same manner, and ligated using T4 DNA ligase.
Ip type plasmid pEPH-2 (size 4.8 Kbp) was prepared.
(FIG. 1) Example 4 Preparation of plasmid vector for gene replacement of arginase gene; The plasmid vector pCAR 112 described in Example 2 was cleaved at the restriction enzyme Sac II cleavage site on CAR1 gene. To give it a selectable marker, TRP1 g from vector YRp7
The 0.8 Kbp EcoR I-Pst I fragment encoding ene was cut out with a restriction enzyme and isolated. Next, the cohesive ends present in the above vector and fragment were each subjected to a conventional method using T4 DNA polymerase (Molecular Cloning, p395, Col
d Spring Harbor Laboratory (1982)) to make blunt ends. Later, both were ligated using T4 DNA ligase,
An arginase gene replacement plasmid vector pREP-1 having a size of 9.5 Kbp was prepared. (Fig. 2) Example 5 Construction of Saccharomyces cerevisiae that does not produce arginase; ) And 892 (a, trp1, asp5, mak12) were transformed according to the method of Ito et al. (J. Bacteriology, vol 153, 163- (1983)).

つまり、酵母YNN27及び892を各々を100mlのYPD培地（１
％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、pH
5.3）で30℃で振とう培養し、対数増殖期に遠心によっ
て集菌した。TE緩衝液で洗浄後同じ緩衝液に２×10⁸セ
ル/mlの濃度で懸濁した。この0.5mlを小試験管に移し、
等容量の0.2M酢酸リチウム溶液を添加し、１時間30℃で
振とうした。この中から0.1mlを1.8mlのエッペンドルフ
チューブに移し、プラスミドベクターpEPH−２あるいは
pREP−１を制限酵素Bgl IIで処理し直鎖状にしたDNA溶
液（670μg/ml）15μｌを加え30℃、30分間静置培養し
た。That is, yeast YNN27 and 892 were each added to 100 ml of YPD medium (1
% Yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose, pH
At 5.3), the cells were shake-cultured at 30 ° C, and the cells were collected by centrifugation during the logarithmic growth phase. After washing with TE buffer, the cells were suspended in the same buffer at a concentration of 2 × 10 ⁸ cells / ml. Transfer this 0.5 ml to a small test tube,
An equal volume of 0.2 M lithium acetate solution was added and shaken for 1 hour at 30 ° C. From this, 0.1 ml was transferred to a 1.8 ml Eppendorf tube and the plasmid vector pEPH-2 or
15 μl of a DNA solution (670 μg / ml) linearized by treating pREP-1 with a restriction enzyme Bgl II was added, followed by static culture at 30 ° C. for 30 minutes.

次に殺菌した70％PEG−4000 115μｌを加え、よく混合
した。30℃で１時間静置した後、エッペンドルフチュー
ブを42℃の恒温水中で５分間静置後、菌体を直ちに室温
迄冷却し、室温で殺菌水で洗浄し、形質転換株を得た。
これらの中からまず、Trp⁺形質転換体を選択した。YNB
−Ｔ培地（２％グルコース、0.67％ナイトロゲンベース
W/OAA、0.002％ウラシル、1.5％寒天）でTrpなしで生育
する株が各々50〜100株得られた。Next, 115 μl of sterilized 70% PEG-4000 was added and mixed well. After standing at 30 ° C. for 1 hour, the Eppendorf tube was left standing in constant temperature water at 42 ° C. for 5 minutes, the cells were immediately cooled to room temperature and washed with sterilized water at room temperature to obtain a transformant strain.
First of all, Trp ⁺ transformants were selected. YNB
-T medium (2% glucose, 0.67% nitrogen base)
W / OAA, 0.002% uracil, 1.5% agar) were used to obtain 50 to 100 strains each growing without Trp.

次に、Trp⁺菌株の中から、アルギナーゼ欠損株として、
アルギニンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコー
ス、0.67％ナイトロゲンフリーカーボンベース、0.002
％ウラシル、0.5％アルギニン、1.5％寒天）で生育でき
ず、オルニチンを唯一の窒素源とする培地（２％グルコ
ール、0.67％ナイトロゲンフリーカーボンベース、0.00
2％ウラシル、0.5％オルニチン、1.5％寒天）で生育で
きる株として、YNN27からの形質転換体３株（Ｕ−1,2,
3）を得た。Next, from the Trp ⁺ strain, as an arginase-deficient strain,
A medium containing arginine as the sole nitrogen source (2% glucose, 0.67% nitrogen-free carbon base, 0.002
% Uracil, 0.5% arginine, 1.5% agar) can not grow, ornithine is the only nitrogen source medium (2% glucose, 0.67% nitrogen-free carbon base, 0.00
As a strain that can grow in 2% uracil, 0.5% ornithine, and 1.5% agar, three transformants from UNN27 (U-1,2,
3) got.

アルギナーゼ欠損株Ｕ−３と親株のアルギナーゼ活性を
第３図に示したが、Ｕ−３株はアルギナーゼ活性が認め
られないことから、アルギナーゼ遺伝子の破壊株である
ことが確認された。The arginase activities of the arginase-deficient strain U-3 and the parent strain are shown in FIG. 3. Since the arginase activity of U-3 strain was not observed, it was confirmed that the strain was a disrupted strain of the arginase gene.

Ｕ−３株はFERM P−10357として微工研に寄託されてい
る。The U-3 strain has been deposited with RIETI as FERM P-10357.

実施例６ 形質転換株による酒類の醸造； 形質転換株Ｕ−3 FERM P−10357をYPAD培地5mlで30℃、
１夜振とう培養後、集菌洗浄し、α米16g、麹4g、水40m
lおよび加工水（KH₂PO₄ 1.3g、NaCl 0.25g及び醸造用乳
酸6mlを水で100mlとしたもの）0.25mlと混合し、100ml
容三角フラスコに入れ25℃でアルコール発酵を行った。Example 6 Brewing of alcoholic beverages with a transformant; transformant U-3 FERM P-10357 was added to 5 ml of YPAD medium at 30 ° C.
After culturing overnight with shaking, the bacteria were collected and washed, α rice 16g, koji 4g, water 40m
l and processed water (KH ₂ PO ₄ 1.3 g, NaCl 0.25 g and brewing lactic acid 6 ml made to 100 ml with water) 0.25 ml and mixed to 100 ml
The mixture was placed in an Erlenmeyer flask and subjected to alcohol fermentation at 25 ° C.

アルコール発酵経過をCO₂の発生による重量の減少で測
定し、アルギナーゼによるアルギニンからの尿素の生成
経過を東洋醸造（株）製尿素測定キットで測定し、結果
を第４図に示した。The progress of alcohol fermentation was measured by the reduction in weight due to the generation of CO _{2, and} the progress of urea production from arginine by arginase was measured by a urea measurement kit manufactured by Toyo Brewing Co., Ltd. The results are shown in FIG.

この結果、CO₂減少による発酵経過は親株とＵ−３の間
でほぼ同一であった。一方、尿素の生成は、親株が４日
目以後直線的に増加を示すのに対し、Ｕ−３株では、最
後まで尿素の生成はみられず、尿素を含まない酒類の製
造が可能であった。As a result, the fermentation process due to CO ₂ reduction was almost the same between the parent strain and U-3. On the other hand, the production of urea increased linearly after the 4th day in the parent strain, whereas in the U-3 strain, the production of urea was not observed until the end, and it was possible to produce alcohol containing no urea. It was

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図はアルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラ
スミドベクターの作成説明図で（図中、H;Hind III、G;
Bgl II、P;Pst I、E;EcoR I）、第２図はアルギナーゼ
遺伝子の遺伝子置換のためのプラスミドベクターの作成
説明図で（図中、H;Hind III、G;Bgl II、P;Pst I、E;E
coR I、S;Sal I、H/S;HindIII及びSal I部位を遺伝子工
学の慣用手段によって非接着末端とした後に連結した部
位、S/E;Sal I及びEcoR I部位を遺伝子工学の慣用手段
によって非接着末端とした後に連結した部位）、第３図
は親株と形質転換体のアルギナーゼ活性を示す図で、第
４図は親株と形質転換体のアルコール発酵の経過図であ
る。FIG. 1 is an explanatory diagram of the construction of a plasmid vector for gene disruption of the arginase gene (in the figure, H; Hind III, G;
Bgl II, P; Pst I, E; EcoR I), and FIG. 2 is an explanatory diagram of the construction of a plasmid vector for gene replacement of the arginase gene (in the figure, H; Hind III, G; Bgl II, P; Pst I, E; E
coR I, S; Sal I, H / S; Hind III and Sal I sites that have been made non-sticky ends by conventional means of genetic engineering, and then ligated, S / E; Sal I and EcoR I sites are conventional means of genetic engineering 3) is a diagram showing the arginase activity of the parent strain and the transformant, and FIG. 4 is a progress chart of alcohol fermentation of the parent strain and the transformant.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 五味 勝也 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 原 昌道 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 吉沢 淑 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 水津 哲義 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (72)発明者 田村 學造 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (56)参考文献 特開 昭63−164876（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開286303（ＥＰ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，1984〔160〕 Ｐ．1078−1087─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI technical display location C12R 1: 865) (72) Inventor Katsuya Gomi 2-6-30 Takinogawa, Kita-ku, Tokyo National Tax Agency Brewing (72) Inventor Masamichi Hara, 2-6-30, Takinogawa, Kita-ku, Tokyo Inside Brewing Institute, National Tax Agency (72) Inventor, Yoshinozawa 2-6-30, Takinogawa, Kita-ku, Tokyo Inside (72) Invention, National Tax Agency Tetsuyoshi Mizutsu 1-54-18 Takinogawa, Kita-ku, Tokyo Inside the Brewing Resources Research Institute, Inc. (72) Inventor Gazo Tamura 1-54-18 Takinogawa, Kita-ku, Tokyo Inside the Brewing Resources Research Institute (56) Reference: Japanese Patent Laid-Open No. 63-164876 (JP, A) European Patent Application Publication 286303 (EP, A) J. Bacteriol. , 1984 [160] P. 1078-1087

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】下記に示す、サッカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼ遺伝子を遺伝子破壊するための、大
きさが4.8KbpのプラスミドベクターpEPH−２。 1. A plasmid vector pEPH-2 having a size of 4.8 Kbp for gene disruption of the Saccharomyces cerevisiae arginase gene shown below. 【請求項２】下記に示す、サッカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼ遺伝子を遺伝子置換するための、大
きさが9.5KbpのプラスミドベクターpREP−１。 2. A plasmid vector pREP-1 having a size of 9.5 Kbp for gene replacement of the arginase gene of Saccharomyces cerevisiae shown below. 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベ
クターpEPH−２を直鎖状とし、サッカロマイセス・セレ
ビシアエに移入することによって得られる尿素生成のな
い形質転換体。3. A urea-free transformant obtained by linearizing the plasmid vector pEPH-2 according to claim 1 and transferring it into Saccharomyces cerevisiae. 【請求項４】特許請求の範囲第２項記載のプラスミドベ
クターpREP−１を直鎖状とし、サッカロマイセス・セレ
ビシアエに移入することによって得られる尿素生成のな
い形質転換体。4. A urea-free transformant obtained by linearizing the plasmid vector pREP-1 according to claim 2 and transferring it into Saccharomyces cerevisiae. 【請求項５】特許請求の範囲第３項又は第４項で得られ
た形質転換体を用いることを特徴とする酒類、アルコー
ル等の製造法。5. A method for producing alcoholic beverages, alcohols and the like, which comprises using the transformant obtained in claim 3 or 4.