JPH1042861A - Killer yeast unassimilable to lactic acid - Google Patents
Killer yeast unassimilable to lactic acidInfo
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- JPH1042861A JPH1042861A JP8205092A JP20509296A JPH1042861A JP H1042861 A JPH1042861 A JP H1042861A JP 8205092 A JP8205092 A JP 8205092A JP 20509296 A JP20509296 A JP 20509296A JP H1042861 A JPH1042861 A JP H1042861A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、サイレージの好気
的変敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母、その
酵母の作出のために用いられるプラスミド、およびその
酵母を用いるサイレージの変敗防止方法に関する。[0001] The present invention relates to a killer yeast that does not assimilate lactic acid for preventing aerobic deterioration of silage, a plasmid used for producing the yeast, and a silage modification using the yeast. Regarding loss prevention methods.
【０００２】[0002]
【従来の技術】サイレージは、草を乳酸発酵して保存性
を高めた反芻家畜の飼料である。サイレージの保存性の
ためには「酸性」および「嫌気」の両条件が必要であ
る。この一方が崩れた場合、サイレージは変質する。2. Description of the Related Art Silage is a feed for ruminant livestock in which the lactic acid fermentation of grass has been enhanced in preservation. Both "acidic" and "anaerobic" conditions are required for silage storage. If one of them collapses, the silage will change.
【０００３】サイロが開封されると、サイレージは好気
的条件に曝される。この好気条件により、好気性微生物
が乳酸および水溶性炭水化物をＣＯ2ガスに分解し、タ
ンパク質およびアミノ酸をアミン、アミド、およびアン
モニアに分解し、そして呼吸熱を発生し、その結果、温
度およびｐＨが上昇する。酵母およびカビ（糸状菌）は
サイレージ中の乳酸を資化することによりｐＨを上昇さ
せる。その結果腐敗の原因となる細菌類が急増し、サイ
レージを腐敗させる。変敗飼料は栄養価および家畜の嗜
好性が低下するため、家畜飼養上大きな問題となってい
る。[0003] When the silo is opened, the silage is exposed to aerobic conditions. The aerobic conditions, aerobic microorganisms to decompose lactic acid and water soluble carbohydrates to CO 2 gas, the protein and amino acids decompose amines, amides, and ammonia, and respiration heat generated, as a result, the temperature and pH Rises. Yeasts and molds (filamentous fungi) increase the pH by assimilating lactic acid in silage. As a result, spoilage of bacteria causing spoilage causes spoilage of silage. Decayed feed is a major problem in raising livestock because of its reduced nutritional value and palatability of livestock.
【０００４】このようなサイレージの好気的変敗は、酵
母の乳酸代謝が第一の原因であると考えられる。サイロ
開封時にサイレージ中に乳酸資化性酵母が１０5細胞／
ｇ（乾燥重量）以上存在すると好気的変敗が急速に進む
が、乳酸資化性酵母が存在しない場合、乳酸非資化性酵
母の数がそれ以上存在しても好気的変敗は起こらないこ
とが報告されている（Jonsson, A.およびG. Pahlow, An
im. Res. Dev. 20(1984)7）。The first cause of such aerobic deterioration of silage is considered to be lactate metabolism of yeast. At the time of opening the silo, 10 5 cells /
g (dry weight) or more, aerobic spoilage proceeds rapidly, but in the absence of lactic acid-assimilating yeast, aerobic spoilage occurs even if the number of non-lactic acid-assimilating yeasts is larger. Has been reported not to occur (Jonsson, A. and G. Pahlow, An
im. Res. Dev. 20 (1984) 7).
【０００５】本発明者は、キラー酵母を用いて、変敗の
原因となる乳酸資化性の野生酵母類の増殖を抑制するこ
とによりサイレージの好気的変敗を防止することを提案
した。キラー酵母には、それ自身が生産するタンパク性
物質により他の酵母の生育を抑制する作用がある。この
キラー酵母をサイレージに用いた場合の模式図を図１に
示す。しかし、このキラー酵母自体もまた乳酸資化性で
あり、サイレージのｐＨを上昇させ得ることが分かった
（J. Dairy Sci., 76(1993)803-811）。従って、サイレ
ージの好気的変敗を防ぐための具体的な方法がないのが
現状である。The present inventors have proposed using a killer yeast to prevent aerobic spoilage of silage by suppressing the growth of lactic acid-assimilating wild yeasts that cause spoilage. Killer yeast has an action of suppressing the growth of other yeasts by a proteinaceous substance produced by itself. FIG. 1 shows a schematic diagram when this killer yeast is used for silage. However, it has been found that this killer yeast itself is also lactic assimilating and can increase the pH of silage (J. Dairy Sci., 76 (1993) 803-811). Therefore, at present, there is no specific method for preventing aerobic deterioration of silage.
【０００６】好気条件下における酵母の糖代謝の略図を
図２に示す。酵母の乳酸代謝系では、乳酸が乳酸デヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨ）によってピルビン酸に変換され、
ＴＣＡサイクルを通って炭酸ガスと水に分解される。従
って、ＬＤＨ活性を失った酵母は乳酸を炭素源として利
用できない。しかし、ＬＤＨには複数のアイソザイムが
存在しており、ＬＤＨの欠損株を作製することは困難で
ある。A schematic diagram of yeast sugar metabolism under aerobic conditions is shown in FIG. In the yeast lactate metabolism system, lactate is converted to pyruvate by lactate dehydrogenase (LDH),
Decomposed into carbon dioxide and water through TCA cycle. Therefore, yeast that has lost LDH activity cannot use lactic acid as a carbon source. However, LDH has a plurality of isozymes, and it is difficult to prepare an LDH-deficient strain.
【０００７】他方、酵母は、グルコースを炭素源とした
場合は、解糖系、ＴＣＡサイクルを経てエネルギーを得
る。乳酸を炭素源とした場合、菌体が生育するにはグル
コースを再合成して細胞骨格を合成する必要がある。こ
のグルコースの再合成は解糖系の逆行であり、糖新生系
として知られている。糖新生系は、オキサロ酢酸からホ
スホエノールピルビン酸を生成するホスホエノールピル
ビン酸カルボキシキナーゼ（以下、ＰＥＰＣＫと称す
る）によって制御される。[0007] On the other hand, when glucose is used as a carbon source, yeast obtains energy through a glycolysis system and a TCA cycle. When lactic acid is used as a carbon source, it is necessary to resynthesize glucose to synthesize a cytoskeleton in order for the cells to grow. This resynthesis of glucose is the reverse of glycolysis and is known as gluconeogenesis. The gluconeogenesis system is controlled by phosphoenolpyruvate carboxykinase (hereinafter referred to as PEPCK), which generates phosphoenolpyruvate from oxaloacetate.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このＰＥＰ
ＣＫに注目し、ＰＥＰＣＫの作用を破壊させることによ
り糖新生系をブロックし、乳酸を炭素源として生育しな
いキラー酵母を得、サイレージの好気的変敗を防止する
ことを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to this PEP
Focusing on CK, the purpose is to obtain a killer yeast that blocks the gluconeogenic system by destroying the action of PEPCK, does not grow using lactic acid as a carbon source, and prevents aerobic deterioration of silage.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明は、ＰＥＰＣＫ遺
伝子を欠損する乳酸非資化性キラー酵母を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a lactate non-assimilating killer yeast deficient in the PEPCK gene.
【００１０】好ましい実施態様では、上記キラー酵母
は、K. lactisである。[0010] In a preferred embodiment, the killer yeast is K. lactis.
【００１１】好ましい実施態様では、上記乳酸非資化性
キラー酵母は遺伝子工学的に得られる。[0011] In a preferred embodiment, the above-mentioned killer yeast that does not assimilate lactic acid is obtained by genetic engineering.
【００１２】本発明はまた、乳酸非資化性キラー酵母を
作製する方法を提供する。この方法は、ＰＥＰＣＫ遺伝
子をクローニングする工程；ＰＥＰＣＫ遺伝子を改変す
る工程；および上記改変ＰＥＰＣＫ遺伝子をキラー酵母
に導入する工程を包含する。[0012] The present invention also provides a method for producing a lactic acid-assimilating killer yeast. This method includes the steps of cloning the PEPCK gene; modifying the PEPCK gene; and introducing the modified PEPCK gene into killer yeast.
【００１３】本発明はまた、宿主に乳酸非資化性を与え
るプラスミドを提供する。このプラスミドは改変された
ＰＥＰＣＫ遺伝子を有する。The present invention also provides a plasmid that confers lactate assimilation to a host. This plasmid has a modified PEPCK gene.
【００１４】好ましい実施態様では、上記改変されたＰ
ＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部
位にマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる。In a preferred embodiment, the modified P
The EPCK gene is obtained by inserting a marker gene into the BamHI site of the PEPCK gene.
【００１５】別の好ましい実施態様では、上記改変され
たＰＥＰＣＫ遺伝子は、該ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩ
Ｉ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入さ
れることにより得られる。[0015] In another preferred embodiment, the modified PEPCK gene is BglI of the PEPCK gene.
It is obtained by deleting the I fragment and inserting a marker gene instead.
【００１６】本発明はまた、サイレージの好気的変敗を
防止する方法を提供する。この方法は、上記乳酸非資化
性キラー酵母をサイレージに添加する工程を包含する。The present invention also provides a method for preventing aerobic spoilage of silage. This method includes a step of adding the above-mentioned lactic acid non-assimilar killer yeast to silage.
【００１７】好ましい実施態様では、上記方法は、サイ
レージにさらにラクトースを添加する工程を包含する。In a preferred embodiment, the method comprises the step of further adding lactose to the silage.
【００１８】[0018]
【発明の実施の形態】本発明は、サイレージの好気的変
敗を防止するための乳酸非資化性キラー酵母を提供す
る。本発明における「乳酸非資化性」酵母とは、厳密に
言うと乳酸を炭素源として生育できない酵母である。こ
の酵母は、糖新生系がブロックされているが乳酸→ＴＣ
Ａ回路は働くので自らは乳酸を資化し得るが、乳酸を炭
素源として生育することができない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention provides a killer yeast that does not assimilate lactic acid for preventing aerobic deterioration of silage. Strictly speaking, the "lactic acid non-assimilar" yeast in the present invention is a yeast that cannot grow using lactic acid as a carbon source. In this yeast, gluconeogenesis is blocked, but lactic acid → TC
Since the A circuit works, it can assimilate lactic acid by itself, but cannot grow using lactic acid as a carbon source.
【００１９】キラー酵母とは、他の酵母の生育を選択的
に抑制するタンパク性（糖タンパク質もまた包含する）
のキラートキシンを生産する酵母をいう。本発明で用い
られるキラー酵母は、サイレージの好気的変敗に関わる
野生酵母類の増殖を抑制する菌株であればいずれでも用
いられ得る。例えば、Ｋ1タイプキラー酵母菌株、Kluyv
elomyces lactis IFO1267株、Hansenula mrakii IFO089
5株、Hansenula mrakii IFO0897株などが挙げられる。
好ましくは、K. lactis IFO1267株およびHansenula mra
kii IFO0897株が用いられ、この２株は、野生酵母類に
関して幅広いスペクトルを有し、そしてキラー活性が共
に酸性側で強く働く。最も好ましくは、K.lactis IFO12
67株が用いられる。その理由は以下の通りである。この
K. lactisIFO1267株は、キラースペクトルの幅が広いだ
けでなく、即効性である。さらに、このK. lactis IFO
1267株は、ラクトースを資化および発酵する。K. lacti
sIFO 1267株は、炭素源としてラクトースを用いること
により、ラクトース非資化性酵母に対するキラー活性が
増大することが知られている（J. Dairy Sci. 76(1993)
803-811）。他方、酵母の多くはラクトースを炭素源と
して利用できない。サイレージの詰め込み時にラクトー
スとラクトース資化性キラー酵母を添加すれば、ラクト
ースによる乳酸菌の活性化が期待され、同時に野生酵母
の増殖を選択的に抑制することが可能であると考えられ
る。A killer yeast is a protein that selectively inhibits the growth of other yeasts (including glycoproteins).
Refers to a yeast that produces chelate toxin. The killer yeast used in the present invention may be any strain that suppresses the growth of wild yeasts involved in aerobic degradation of silage. For example, K 1 type killer yeast strains, Kluyv
elomyces lactis IFO1267 strain, Hansenula mrakii IFO089
5 strains and Hansenula mrakii IFO0897 strain.
Preferably, K. lactis IFO1267 strain and Hansenula mra
The kii IFO0897 strain is used, which has a broad spectrum with respect to wild yeasts, and both killer activity is strong on the acidic side. Most preferably, K. lactis IFO12
67 strains are used. The reason is as follows. this
The K. lactisIFO1267 strain not only has a broad killer spectrum but also has an immediate effect. Furthermore, this K. lactis IFO
The 1267 strain assimilates and ferments lactose. K. lacti
It is known that the use of lactose as a carbon source in sIFO 1267 strain increases killer activity against lactose non-assimilating yeast (J. Dairy Sci. 76 (1993)).
803-811). On the other hand, many yeasts cannot use lactose as a carbon source. If lactose and lactose assimilating killer yeast are added at the time of filling the silage, it is expected that lactic acid bacteria are activated by lactose, and at the same time, it is possible to selectively suppress the growth of wild yeast.
【００２０】以下、本発明をK. lactis IFO1267株を例
にして説明する。まずＰＥＰＣＫ遺伝子のクローニング
を行う。Saccharomyces cerevisiaeのＰＥＰＣＫ遺伝子
ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic Acids Re
s. 16(1988)10926）に基づいてＰＣＲで拡大したプロー
ブを用い、K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハ
イブリダイゼーションを行う。得られたバンドを切り出
して、これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミ
ドをＰＣＫ１欠損S. cerevisiaeに形質転換する。これ
により、乳酸を唯一の炭素源とする培地に生育する形質
転換体が得られる。この形質転換体はＰＥＰＣＫ活性を
回復する。S. cerevisiaeで相補したことにより、このD
NA断片はK. lactis IFO1267株のＰＥＰＣＫ遺伝子Ｋｌ
ＰＣＫ１を含むことが確認される。Hereinafter, the present invention will be described by taking K. lactis IFO1267 as an example. First, the PEPCK gene is cloned. The base sequence of the PEPCK gene PCK1 of Saccharomyces cerevisiae (R. Stucka et al., Nucleic Acids Re
s. 16 (1988) 10926), and using the probe expanded by PCR, genomic Southern hybridization of K. lactis IFO1267 strain is performed. The obtained band is cut out, and the plasmid inserted into the yeast pYC type vector is transformed into PCK1-deficient S. cerevisiae. Thus, a transformant that grows on a medium using lactic acid as the sole carbon source is obtained. This transformant restores PEPCK activity. By complementing with S. cerevisiae, this D
The NA fragment is the K. lactis IFO1267 strain PEPCK gene Kl.
It is confirmed that PCK1 is included.
【００２１】次に、ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊を行う。ＰＥ
ＰＣＫ遺伝子破壊は、以下のようにして行われ得る。上
記のようにクローニングしたＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣ
Ｋ１を、挿入、欠失などの変異を生じさせて遺伝子とし
て働き得ないように改変する。この改変遺伝子を保有す
るプラスミド（ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミド）を
作製し、これをK. lactisに遺伝子導入する。この遺伝
子の導入は、例えば、スフェロプラスト法、酢酸リチウ
ム法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン
法などのいずれの公知の方法によっても行われ得る。改
変遺伝子を導入すると、ＰＥＰＣＫ遺伝子の部分で染色
体相同組換えが起こり、その結果遺伝子破壊を生じる。
得られた形質転換酵母は乳酸を炭素源として利用し得な
い。Next, the PEPCK gene is disrupted. PE
PCK gene disruption can be performed as follows. PEPCK gene KIPC cloned as described above
K1 is modified so that mutations such as insertion and deletion are caused so that it cannot function as a gene. A plasmid (a plasmid for disrupting the PEPCK gene) having the modified gene is prepared, and the gene is introduced into K. lactis. This gene can be introduced by any known method such as a spheroplast method, a lithium acetate method, an electroporation method, and a particle gun method. When the modified gene is introduced, chromosomal homologous recombination occurs in the portion of the PEPCK gene, resulting in gene disruption.
The resulting transformed yeast cannot use lactic acid as a carbon source.
【００２２】ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドとして
は、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２の２つのプラスミドが挙げ
られる。この両プラスミドは、K. lactisのＰＥＰＣＫ
遺伝子の内部にマーカー遺伝子が挿入されているプラス
ミドである。ｐＫＰ１は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨ
Ｉ部位にマーカー遺伝子が挿入されている挿入型プラス
ミドである。ｐＫＰ２は、ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩ
Ｉ断片が欠失されて、代わりにマーカー遺伝子が挿入さ
れている欠失型プラスミドである。本発明で用いられ得
るマーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質Ｇ４１８
耐性、セルレニン耐性、シクロヘキシミド耐性、または
エチオニン耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらのＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを
用いることにより、安定した遺伝子破壊が得られ得る。The plasmid for disrupting the PEPCK gene includes two plasmids, pKP1 and pKP2. Both plasmids are K. lactis PEPCK.
This is a plasmid in which a marker gene is inserted inside the gene. pKP1 is the BamH of the PEPCK gene.
This is an insertion type plasmid in which a marker gene has been inserted into the I site. pKP2 is the BglI of the PEPCK gene.
This is a deletion type plasmid in which the I fragment has been deleted and a marker gene has been inserted instead. Examples of marker genes that can be used in the present invention include antibiotic G418
Genes include, but are not limited to, resistance, cerulenin resistance, cycloheximide resistance, or ethionine resistance genes. By using these PEPCK gene disruption plasmids, stable gene disruption can be obtained.
【００２３】上記のようにして得られたＰＥＰＣＫ欠損
キラー酵母は、乳酸を炭素源として生育しないが、キラ
ー活性および糖を炭素源とした生育は元のキラー酵母と
変わりがない。従って、このキラー酵母を用いることに
より、サイレージの好気的変敗は十分に防止され得る。The PEPCK-deficient killer yeast obtained as described above does not grow using lactic acid as a carbon source, but the killer activity and growth using sugar as a carbon source are the same as those of the original killer yeast. Therefore, aerobic deterioration of silage can be sufficiently prevented by using this killer yeast.
【００２４】本発明によるサイレージの好気的変敗を防
止する方法は、上記の乳酸非資化性キラー酵母をサイレ
ージに添加する工程を包含する。サイレージは、酸性お
よび嫌気条件下で調製され得るので、乳酸非資化性キラ
ー酵母は、サイレージの調製開始時に添加され得る。好
ましくは、上記サイレージに、乳酸非資化性キラー酵母
とラクトースとを添加する工程を包含する。サイレージ
の酸性および嫌気条件を維持するために、ラクトースお
よびラクトース資化性キラー酵母は、サイレージの調製
開始時に同時に添加され得る。多くの野生酵母はラクト
ース非資化性である。従って、サイレージの詰め込み時
にラクトースとラクトース資化性キラー酵母とを添加す
れば、ラクトースによる乳酸菌の活性化が期待され、同
時に野生酵母の増殖を選択的に抑制し得る。[0024] The method for preventing aerobic deterioration of silage according to the present invention includes a step of adding the above-mentioned killer yeast assimilating lactic acid assimilation to silage. Since silage can be prepared under acidic and anaerobic conditions, non-lactic assimilating killer yeast can be added at the beginning of silage preparation. Preferably, the method includes a step of adding a lactic acid non-assimilating killer yeast and lactose to the silage. To maintain the acidic and anaerobic conditions of the silage, lactose and lactose assimilating killer yeast can be added simultaneously at the start of silage preparation. Many wild yeasts are lactose non-utilizable. Therefore, if lactose and lactose assimilating killer yeast are added at the time of filling the silage, activation of lactic acid bacteria by lactose is expected, and at the same time, growth of wild yeast can be selectively suppressed.
【００２５】本発明に従えば、サイレージの好気的変敗
が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑制
されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増殖
は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され得
る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添加
することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、そ
して乳酸菌の活動が活性化され得る。According to the invention, aerobic spoilage of the silage can be advantageously prevented. Since the lactic acid fermentation of the killer yeast is suppressed, the growth of wild yeasts that causes aerobic deterioration can be appropriately suppressed by the killer yeast that cannot assimilate lactic acid. By adding lactose to the silage in addition to the killer yeast, the killer activity of the killer yeast can be enhanced and the activity of the lactic acid bacteria can be activated.
【００２６】以下、本発明を実施例によって説明する
が、本発明は実施例に限定されない。Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
【００２７】[0027]
（実施例１ K. lactis IFO1267株ＰＥＰＣＫ遺伝子の
クローニング）プローブは、S. cerevisiaeのＰＥＰＣ
Ｋ遺伝子ＰＣＫ１の塩基配列（R. Stuckaら、Nucleic A
cids Res. 16(1988)10926）に基づいて、S. cerevisia
e YNN27株ゲノムDNAをテンプレートとし、プライマー１
5' ATAGGGCCCATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTA 3'およびプ
ライマー２ 5' CGCAAGCTTCTAACATGTTTCGTTTACTCGAATT
3'を用いてＰＣＲにより作製した。作製したプローブを
用い、常法に従って（Sambrook et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) ColdSpring
Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic aci
d labelling anddetection system (Amersham) により
K. lactis IFO1267株のゲノミックサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。得られたバンドを切り出して、プ
ラスミドベクターBluescriptII KS+（ストラタジーン社
製）にライゲーションした。ＰＣＫ１をプローブとし
て、コロニーハイブリダイゼーション（DIG標識核酸検
出キット；ベーリンガーマンハイム製：Colliquium 2(1
992)8）でＰＣＫ１と相同性の高い遺伝子断片ＫｌＰＣ
Ｋ１がサブクローニングされたプラスミドを含むコロニ
ーをスクリーニングした。ＫｌＰＣＫ１を切り出して、
これを酵母ｐＹＣ型ベクターに挿入したプラスミドをＰ
ＣＫ１欠損S. cerevisiaeに酢酸リチウム法（Ito, H.,
Fukuda, Y., Murata, K.およびKimura, A., Journal of
Bacteriology 153(1983)163）で形質転換した。形質転
換株を乳酸カルシウム（０．５ｇ／Ｌ）を炭素源として
含有する最少培地に接種して増殖させたところ、この株
は、乳酸を唯一の炭素源とする培地で生育した。さら
に、得られた形質転換株の酵素活性を測定した。この形
質転換株を、グルコースを炭素源とした培地（イースト
ナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ）に
おいて３０℃で二夜振盪培養し、次いで滅菌水で洗浄し
た。この菌体を、ＰＥＰＣＫ遺伝子の発現を誘導する条
件である、エタノール（２％ｗ／ｖ）を炭素源とした培
地（イーストナイトロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．
７ｇ／Ｌ）中で培養し、次に菌体をガラスビーズで破砕
した後遠心分離して、細胞抽出液を得た。コントロール
として、エタノールの代わりにグルコースを用いた培地
中での培養もまた行った。得られた細胞抽出液中のタン
パク質量をプロテインアッセイキット（BioRad）を用い
て定量した。細胞抽出液中のＰＥＰＣＫ活性はJavier P
ereaおよびCarlos Gancedo, Arch Microbiol 132(1982)
141-143に記載の方法の改法に従い、以下のように測定
した。イミダゾール溶液（ｐＨ７．０）（１００ｍＭ
イミダゾール、１００ｍＭＮａＨＣＯ3、４ｍＭ Ｍｎ
Ｃｌ2、および４ｍＭ グルコースを含有する）２８３
８μＬ、還元グルタチオン溶液（１μmol還元グルタチ
オン、１μmolＡＤＰ、０．５μmolＮＡＤＨ、および0.
1μmolＰＥＰを含有する）１００μＬ、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ（ベーリンガー１２７２４８）４μＬ（４．
８ｕ）、およびヘキソキナーゼ（ベーリンガー１２７１
７５）８μＬ（２．４ｕ）を３０℃で３分間混合した。
次いで、この混合液に５０μＬの細胞抽出液を添加し、
ＰＥＰＣＫ活性を、３４０ｎｍでの吸光度を３０℃で３
０分間経時的に測定することにより得た。この形質転換
体はＰＥＰＣＫ活性を回復した。S. cerevisiaeで相補
したことにより、このDNA断片はK. lactis IFO1267株の
ＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１を含むことが分かった。(Example 1 Cloning of K. lactis IFO1267 strain PEPCK gene) The probe was a S. cerevisiae PEPC
The nucleotide sequence of the K gene PCK1 (R. Stucka et al., Nucleic A
cids Res. 16 (1988) 10926) based on S. cerevisia.
e Primer 1 using genomic DNA of YNN27 strain as template
5 'ATAGGGCCCATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCTA 3' and primer 2 5 'CGCAAGCTTCTAACATGTTTCGTTTACTCGAATT
It was prepared by PCR using 3 '. Using the prepared probe, according to a conventional method (Sambrook et al., Molecular Clo
ning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989) ColdSpring
Harbor Laboratory Press), ECL direct nucleic aci
by d labelling and detection system (Amersham)
Genomic Southern hybridization of K. lactis IFO1267 strain was performed. The obtained band was cut out and ligated to a plasmid vector BluescriptII KS + (Stratagene). Colony hybridization (DIG-labeled nucleic acid detection kit; Boehringer Mannheim: Colliquium 2 (1
992) The gene fragment KlPC highly homologous to PCK1 in 8)
Colonies containing the plasmid in which K1 was subcloned were screened. Cut out KlPCK1,
This plasmid was inserted into a yeast pYC type vector and
CK1-deficient S. cerevisiae was treated with the lithium acetate method (Ito, H.,
Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A., Journal of
Bacteriology 153 (1983) 163). When the transformed strain was inoculated and grown on a minimal medium containing calcium lactate (0.5 g / L) as a carbon source, the strain grew on a medium containing lactic acid as a sole carbon source. Further, the enzymatic activity of the obtained transformant was measured. This transformant was cultured in a medium containing glucose as a carbon source (yeast nitrogen base w / o amino acid: 6.7 g / L) at 30 ° C. with shaking for two nights, and then washed with sterile water. The cells were cultured in a medium containing yeast (2% w / v) as a carbon source (yeast nitrogen-based w / o amino acid 6.), which is a condition for inducing expression of the PEPCK gene.
(7 g / L), and the cells were crushed with glass beads and centrifuged to obtain a cell extract. As a control, culturing in a medium using glucose instead of ethanol was also performed. The amount of protein in the obtained cell extract was quantified using a protein assay kit (BioRad). PEPCK activity in cell extracts was determined by Javier P
erea and Carlos Gancedo, Arch Microbiol 132 (1982)
According to a modification of the method described in 141-143, measurement was performed as follows. Imidazole solution (pH 7.0) (100 mM
Imidazole, 100 mM NaHCO 3 , 4 mM Mn
283 containing Cl 2 and 4 mM glucose)
8 μL, reduced glutathione solution (1 μmol reduced glutathione, 1 μmol ADP, 0.5 μmol NADH, and 0.
100 μL containing 1 μmol PEP), 4 μL malate dehydrogenase (Boehringer 127248) (4.
8u), and hexokinase (Boehringer 1271)
75) 8 μL (2.4 u) was mixed at 30 ° C. for 3 minutes.
Then, 50 μL of the cell extract was added to this mixture,
The PEPCK activity was determined by measuring the absorbance at 340 nm at 30 ° C.
Obtained by measuring over time for 0 minutes. This transformant restored PEPCK activity. By complementation with S. cerevisiae, this DNA fragment was found to contain the PEPCK gene KlPCK1 of K. lactis IFO1267 strain.
【００２８】（実施例２ ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラ
スミドの構築）ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊用プラスミドを以
下のように構築した。実施例１により得られたK. lacti
s IFO1267株由来のＰＥＰＣＫ遺伝子ＫｌＰＣＫ１をコ
ードする約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩゲノムフラグメント
を、あらかじめマルチクローニング部位内のＢａｍＨＩ
部位を欠失させた、またはもとのままのプラスミドベク
ターBluescript II KS+（ストラタジーン社製）のＥｃ
ｏＲＩ部位にサブクローン化した。次に、これらの組換
えプラスミドを挿入断片内のＢａｍＨＩ部位（上記Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント内に１ヶ所存在する）またはＢｇｌ
ＩＩ部位（同フラグメント内に２ヶ所存在する）で切断
し、そこにプラスミドｐＹＣＤＥ−ΔＧ１１（T. Ogata
ら, J. Gen. Appl. Microbiol., 39(1993)285-294）中
の、Saccharomyces cerevisiae由来のＡＤＨ１プロモー
ターおよびEscerichia coli由来のカナマイシン耐性遺
伝子（ＡＰＴ２）を含む３．４ＫｂのＢａｍＨＩ断片を
挿入することにより、ｐＫＰ１およびｐＫＰ２を得た。
図３に示すように、前者はマーカー遺伝子としてのＡＰ
Ｔ２フラグメントがK. lactis由来のフラグメントに挿
入された形になっており、また後者はK. lactis由来の
フラグメントの一部が欠失してＡＰＴ２フラグメントで
置換された形となっている。Example 2 Construction of a plasmid for disrupting the PEPCK gene A plasmid for disrupting the PEPCK gene was constructed as follows. K. lacti obtained according to Example 1
s An approximately 4.8 Kb EcoRI genomic fragment encoding the PEPCK gene KlPCK1 from the IFO1267 strain was previously ligated to BamHI in the multiple cloning site.
Ec of plasmid vector Bluescript II KS + (Stratagene) with or without the site deleted
Subcloned at the oRI site. Next, these recombinant plasmids were inserted into the BamHI site (Ec
one in the oRI fragment) or Bgl
The fragment was cleaved at the II site (at two sites in the same fragment), and the plasmid pYCDE-ΔG11 (T. Ogata
Et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 39 (1993) 285-294), a 3.4 Kb BamHI fragment containing the ADH1 promoter from Saccharomyces cerevisiae and the kanamycin resistance gene (APT2) from Escerichia coli is inserted. Thereby, pKP1 and pKP2 were obtained.
As shown in FIG. 3, the former is AP as a marker gene.
The T2 fragment has a form inserted into a fragment derived from K. lactis, and the latter has a form in which a part of the fragment derived from K. lactis has been deleted and replaced with an APT2 fragment.
【００２９】（実施例３ 遺伝子破壊用プラスミドをキ
ラー酵母K. lactisへの導入）実施例２で構築したプラ
スミドＤＮＡを、エレクトロポーレーション法は、Manu
el Sanchezら, Appl. Environ. Microbiol., 59(1993)2
087-2092に記載の方法の改法に従い、K. lactis IFO126
7株に形質転換した。すなわち、試験管内で菌体をＹＥ
Ｄ培地５ｍＬにおいて３０℃で一夜振盪培養し、次いで
この菌体を３００ｍＬ容三角フラスコ中でＹＥＤ培地３
０ｍＬにおいて３０℃で３．５時間振盪培養した。次い
でこの菌体を冷水で２回洗浄した後、ＹＥＤ、２５ｍＭ
ＤＴＴ（ＹＥＤ７８０ｍＬ、１Ｍ ＤＴＴ ２０μＬ）
を含む培地で３０℃で３０分間、１００ｒｐｍで振盪し
た。得られた菌体を冷水で２回、次いでエレクトロポー
レーション緩衝液（１ｍＭ Tris ＨＣｌ(ｐＨ７．
５）、２７０ｍＭスクロース、および１ｍＭ ＬｉＯＡ
ｃを含有する）で洗浄し、そしてこのエレクトロポーレ
ーション緩衝液２００μＬに懸濁した。この懸濁液に実
施例１で構築したプラスミドＤＮＡ１μＬを添加し、氷
上で１５分間静置した。細胞／ＤＮＡ混合液を、４ＫＶ
／ｃｍ（２００Ｖ／０．５ｍｍ）、１６ｍＳの条件でエ
レクトロポーレーションにかけた。処理した菌体を１ｍ
ＬのＹＰＤ培地中に懸濁して氷上で１５分間静置し、次
いで３０℃で６時間インキュベートした後、Ｇ４１８
（０．１ｍｇ／ｍＬ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を含む
ＹＰＤ培地上に広げ、３０℃で７２時間インキュベート
した。出現したＧ４１８耐性コロニーを、乳酸カルシウ
ム（５ｇ／Ｌ）を含有する最少寒天培地（イーストナイ
トロジェンベースｗ／ｏアミノ酸６．７ｇ／Ｌ、寒天２
０ｇ／Ｌ）にレプリカし、そこで生育しない形質転換株
を選択した。形質転換実験の結果を表１に示す。(Example 3 Introduction of plasmid for gene disruption into killer yeast K. lactis) The plasmid DNA constructed in Example 2 was electroporated by Manu
el Sanchez et al., Appl.Environ.Microbiol., 59 (1993) 2
K. lactis IFO126 according to a modification of the method described in 087-2092.
7 strains were transformed. That is, the cells are subjected to YE in a test tube.
The culture was shake-cultured at 30 ° C. overnight in 5 mL of D medium, and then the cells were cultured in a 300 mL Erlenmeyer flask.
Shaking culture was carried out at 0 ° C. for 3.5 hours at 30 ° C. Next, after washing the cells twice with cold water, YED, 25 mM
DTT (780 mL of YED, 20 μL of 1M DTT)
Was shaken at 100 rpm for 30 minutes at 30 ° C. The obtained cells were washed twice with cold water, and then electroporation buffer (1 mM Tris HCl (pH 7.0)).
5) 270 mM sucrose, and 1 mM LiOA
c) and suspended in 200 μL of the electroporation buffer. 1 μL of the plasmid DNA constructed in Example 1 was added to this suspension, and the suspension was allowed to stand on ice for 15 minutes. The cell / DNA mixture was added to 4KV
/ Cm (200 V / 0.5 mm) and 16 mS for electroporation. 1m of treated cells
L, suspended in YPD medium for 15 minutes on ice, and then incubated at 30 ° C. for 6 hours.
(0.1 mg / mL) and agar (20 g / L) on YPD medium and incubated at 30 ° C. for 72 hours. The emerged G418-resistant colonies were cultured on a minimal agar medium containing calcium lactate (5 g / L) (6.7 g / L amino acid w / o yeast nitrogen, agar 2).
(0 g / L), and a transformant which did not grow there was selected. Table 1 shows the results of the transformation experiment.
【００３０】[0030]
【表１】 [Table 1]
【００３１】これらの形質転換体の中から各シリーズに
ついて１株ずつ選択し、それらを遺伝子破壊が導入され
た候補株として、以下でより詳細な検討を実施した。From these transformants, one strain was selected for each series, and these were used as candidate strains into which gene disruption had been introduced, and a more detailed study was performed below.
【００３２】（実施例４ 形質転換体の特徴付け） １）ゲノムサザン解析：実施例３で導入された改変ＰＥ
ＰＣＫ遺伝子の存在様式を調べる目的で下記のようにサ
ザン解析を実施した。２種の形質転換体および野生株K.
lactis IFO1267株から抽出したゲノムＤＮＡ各１０μｇ
ならびに形質転換に使用した２種のプラスミドＤＮＡ各
１０ｎｇを、ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気泳
動し、ペルオキシダーゼで標識したＰＥＰＣＫ遺伝子を
含む約４．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントをプローブ
として、常法に従って（Sambrooket al., Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual 第２版 (1989) Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press）、ECL direct nucleic a
cid labelling and detection system (Amersham) によ
りサザン解析を実施した。図４に示すように、形質転換
体由来のゲノムＤＮＡは、それぞれ遺伝子破壊に使用し
たプラスミドＤＮＡと同じハイブリダイゼーションパタ
ーンを示し、このことから、遺伝子破壊用プラスミド内
の挿入フラグメントがK. lactisゲノムに導入前の形態
を維持して導入されていることが確認された。Example 4 Characterization of Transformant 1) Genome Southern Analysis: Modified PE introduced in Example 3
Southern analysis was performed as described below for the purpose of examining the existence mode of the PCK gene. The two transformants and the wild type K.
10 μg of genomic DNA extracted from lactis IFO1267 strain
In addition, 10 ng of each of the two plasmid DNAs used for the transformation was digested with EcoRI, then subjected to agarose gel electrophoresis, and an approximately 4.8 Kb EcoRI fragment containing the PEPCK gene labeled with peroxidase was used as a probe according to a conventional method (Sambrook et al. , Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989) Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press), ECL direct nucleic acid
Southern analysis was performed using cid labelling and detection system (Amersham). As shown in FIG. 4, the genomic DNA derived from the transformant showed the same hybridization pattern as the plasmid DNA used for gene disruption, indicating that the inserted fragment in the plasmid for gene disruption was transformed into the K. lactis genome. It was confirmed that the product was introduced while maintaining the form before the introduction.
【００３３】２）染色体解析：導入された改変遺伝子の
染色体上の位置を、以下の手順で検討した。野生株およ
び２種の形質転換体について、２×１０9細胞／ｍＬの
プロトプラストを含むアガロースプラグを、１％低融点
ゲル（BioRad 162-0102）、１５ｃｍのウエルに充填
し、パルスフィールド電気泳動装置（BioRad社製、CHEF
-DRII）を用いて、９〜１０℃、１３０Ｖで、パルス時
間１００秒で１６時間、次いでイニシャルパルス時間１
８０秒およびファイナルパルス時間３６０秒で５１時
間、そしてパルス時間３６０秒で６時間電気泳動した。
電気泳動後、ＰＥＰＣＫ遺伝子を含む４．８Ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントまたはＡＰＴ２遺伝子を含む３．４
Ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして上記
１）のようにサザン解析した。図５に示すように、ＡＰ
Ｔ２遺伝子を含むフラグメントは、形質転換体由来のゲ
ノムＤＮＡではＰＥＰＣＫ遺伝子を含むフラグメントと
同じ１番染色体にハイブリダイズしたが、野生株由来の
ＤＮＡにはハイブリダイズしなかった。この結果および
上記１）の結果から、ＡＰＴ２遺伝子フラグメントによ
る挿入または欠失（置換）がK.lactisゲノムのＰＥＰＣ
Ｋ遺伝子内に導入されていることが確認された。2) Chromosome analysis: The location of the introduced modified gene on the chromosome was examined by the following procedure. Agarose plugs containing 2 × 10 9 cells / mL protoplasts were loaded into 15% wells of a 1% low-melting point gel (BioRad 162-0102) for the wild-type strain and the two transformants. (BioRad, CHEF
-DRII), at 9 to 10 ° C. and 130 V, a pulse time of 100 seconds for 16 hours, and then an initial pulse time of 1
Electrophoresis was performed at 80 seconds and a final pulse time of 360 seconds for 51 hours, and a pulse time of 360 seconds for 6 hours.
After electrophoresis, 4.8 Kb Ec containing PEPCK gene
3.4 containing the oRI fragment or APT2 gene
Southern analysis was performed as in 1) above using the Kb BamHI fragment as a probe. As shown in FIG.
The fragment containing the T2 gene hybridized to the same chromosome 1 as the fragment containing the PEPCK gene in the genomic DNA derived from the transformant, but did not hybridize to the DNA derived from the wild-type strain. From these results and the result of 1) above, the insertion or deletion (substitution) by the APT2 gene fragment was
It was confirmed that the gene was introduced into the K gene.
【００３４】３）ＰＥＰＣＫ活性の測定：試験管内での
ＰＥＰＣＫ遺伝子フラグメント中の挿入または欠失（置
換）の、キラー酵母K.lactis宿主のＰＥＰＣＫ遺伝子の
発現に及ぼす影響を、形質転換体の産生するＰＥＰＣＫ
活性を測定することにより検討した。ＰＥＰＣＫ活性
は、上述の実施例１と同様にして測定した。以下の表２
に示すように、野生株に比較して形質転換株ではＰＥＰ
ＣＫ活性はほとんど発現されなかった。3) Measurement of PEPCK activity: The effect of the insertion or deletion (substitution) in the PEPCK gene fragment in vitro on the expression of the PEPCK gene in the killer yeast K. lactis host is determined by producing a transformant. PEPCK
It was examined by measuring the activity. PEPCK activity was measured in the same manner as in Example 1 described above. Table 2 below
As shown in the figure, PEP was higher in the transformed strain than in the wild strain.
Little CK activity was expressed.
【００３５】[0035]
【表２】 [Table 2]
【００３６】４）炭素源資化性：ＰＥＰＣＫ遺伝子破壊
の乳酸資化性に及ぼす影響を下記のように調べた。２種
の形質転換体および野生株を乳酸またはラクトース（そ
れぞれ２０ｇ／Ｌ）を炭素源として含有する最少培地に
接種して、増殖させた。この結果を図６に示す。図中、
▲は野生株の乳酸培地培養、●は野生株のラクトース培
地培養、△は形質転換体の乳酸培地培養、そして○は形
質転換体のラクトース培地培養を表す。図６に示すよう
に、糖であるラクトースを含有する培地中では、形質転
換体は野生株と同様に増殖した。一方、乳酸を炭素源と
して含有する培地中では、野生株は良好な増殖を示すの
に対して、形質転換体は増殖しなかった。また形質転換
体をＹＰＤ培地中で非選択条件下で約２０世代培養した
後、乳酸非資化性およびＧ４１８耐性の形質について調
べたところ、それぞれの株は両形質を安定に１００％維
持していた。これらの結果は、形質転換体ゲノム中のＰ
ＥＰＣＫ遺伝子破壊によりこれらの株の乳酸資化性が失
われ、また遺伝子破壊が安定に維持されていることを示
唆した。4) Utilization of carbon source: The effect of PEPCK gene disruption on lactic acid utilization was examined as follows. The two transformants and the wild strain were inoculated into a minimal medium containing lactic acid or lactose (20 g / L each) as a carbon source and grown. The result is shown in FIG. In the figure,
▲ indicates cultivation of a wild-type lactic acid medium, ● indicates cultivation of a lactose medium of a wild-type strain, △ indicates cultivation of a lactic acid medium of a transformant, and ○ indicates culturing of a lactose medium of the transformant. As shown in FIG. 6, in the medium containing lactose, which is a sugar, the transformant grew in the same manner as the wild type. On the other hand, in a medium containing lactic acid as a carbon source, the wild-type strain showed good growth, whereas the transformant did not grow. After culturing the transformants for about 20 generations in a YPD medium under non-selective conditions, the traits of non-assimidate lactic acid and resistance to G418 were examined. Each strain stably maintained both traits at 100%. Was. These results indicate that P in the transformant genome
EPCK gene disruption lost the lactate utilization of these strains, suggesting that the gene disruption was stably maintained.
【００３７】５）キラー活性の確認：形質転換体および
野生株のキラー活性を、検定菌としてSaccharomyces ce
revisiae IFO0304株を使用して、緩衝化メチレンブルー
培地（ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グ
ルコース２０ｇ／Ｌ、メチレンブルー０．３ｇ／Ｌ、寒
天２０ｇ／Ｌ、１／１０McIlvaine緩衝液（McIlvaine,
T.C., J. Biol. Chem. 49(1921)183））上で２５℃２日
間好気的に培養した後観察することにより確認した。図
７に示すように、形質転換体のキラー活性は宿主である
野生株と同程度に維持されていることが確認された。5) Confirmation of killer activity: The killer activity of the transformant and the wild-type strain was determined by using Saccharomyces ce
Using a revisiae IFO0304 strain, a buffered methylene blue medium (peptone 20 g / L, yeast extract 10 g / L, glucose 20 g / L, methylene blue 0.3 g / L, agar 20 g / L, 1/10 McIlvaine buffer (McIlvaine,
TC, J. Biol. Chem. 49 (1921) 183)), aerobically cultured at 25 ° C. for 2 days, and confirmed by observation. As shown in FIG. 7, it was confirmed that the killer activity of the transformant was maintained at the same level as that of the wild strain as the host.
【００３８】[0038]
【発明の効果】本発明に従えば、サイレージの好気的変
敗が好都合に防止され得る。キラー酵母の乳酸発酵が抑
制されるため、好気的変敗の原因となる野生酵母類の増
殖は、乳酸非資化性キラー酵母によって適切に抑制され
得る。キラー酵母に加えてラクトースをサイレージに添
加することにより、キラー酵母のキラー活性が強まり、
そして乳酸菌の活動が活性化され得る。According to the present invention, aerobic deterioration of silage can be advantageously prevented. Since the lactic acid fermentation of the killer yeast is suppressed, the growth of wild yeasts that causes aerobic deterioration can be appropriately suppressed by the killer yeast that cannot assimilate lactic acid. By adding lactose to silage in addition to killer yeast, the killer activity of killer yeast is enhanced,
And the activity of the lactic acid bacteria can be activated.
【図１】図１は、サイレージの好気的変敗およびキラー
酵母による防止を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing aerobic spoilage of silage and prevention by killer yeast.
【図２】図２は、好気条件における酵母の糖代謝を示す
模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing sugar metabolism of yeast under aerobic conditions.
【図３】図３は、遺伝子破壊用プラスミド中の挿入フラ
グメントの構造を示す模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram showing the structure of an inserted fragment in a plasmid for gene disruption.
【図４】図４は、形質転換体および野生株ゲノムＤＮＡ
内での改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在状態を調べるための
サザン解析を示す電気泳動写真である。FIG. 4 shows transformants and wild-type genomic DNA.
4 is an electrophoretic photograph showing Southern analysis for examining the presence of a modified PEPCK gene in a cell.
【図５】図５は、形質転換体および野生株染色体におけ
る改変ＰＥＰＣＫ遺伝子の存在位置を調べるためのサザ
ン解析を示す電気泳動写真である。FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing Southern analysis for examining the location of a modified PEPCK gene in a transformant and a wild-type chromosome.
【図６】図６は、形質転換体および野生株のラクトース
および乳酸を炭素源とした場合の増殖を示すグラフであ
る。FIG. 6 is a graph showing the growth of a transformant and a wild-type strain when lactose and lactic acid were used as carbon sources.
【図７】図７は、形質転換体および野生株の検定菌に対
するキラー活性を示す生物形態写真である。FIG. 7 is a photograph of a biological morphology showing killer activity of a transformant and a wild-type strain against a test bacterium.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical display location C12R 1: 645)
Claims (9)
ナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子を欠損する乳酸非資化性キ
ラー酵母。1. A lactate non-assimilating killer yeast deficient in a phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) gene.
請求項１に記載の乳酸非資化性キラー酵母。2. The killer yeast is K. lactis,
The killer yeast assimilating to lactic acid as claimed in claim 1.
学的に得られる、請求項１に記載の乳酸非資化性キラー
酵母。3. The non-utilizable killer yeast according to claim 1, wherein the non-utilizable killer yeast is obtained by genetic engineering.
であって、以下の工程を包含する、方法：ＰＥＰＣＫ遺
伝子をクローニングする工程；ＰＥＰＣＫ遺伝子を改変
する工程；および該改変ＰＥＰＣＫ遺伝子をキラー酵母
に導入する工程。4. A method for producing a lactic acid-assimilating killer yeast, comprising the following steps: a method of cloning a PEPCK gene; a step of modifying a PEPCK gene; Step of introducing into yeast.
であって、改変されたＰＥＰＣＫ遺伝子を有する、プラ
スミド。5. A plasmid that confers lactate assimilation to a host, the plasmid having a modified PEPCK gene.
ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢａｍＨＩ部位にマーカー遺伝子が
挿入されることにより得られる、請求項５に記載のプラ
スミド。6. The plasmid according to claim 5, wherein the modified PEPCK gene is obtained by inserting a marker gene into a BamHI site of the PEPCK gene.
ＰＥＰＣＫ遺伝子のＢｇｌＩＩ断片が欠失されて、代わ
りにマーカー遺伝子が挿入されることにより得られる、
請求項５に記載のプラスミド。7. The modified PEPCK gene is obtained by deleting a BglII fragment of the PEPCK gene and inserting a marker gene instead.
A plasmid according to claim 5.
ジに添加する工程を包含する、サイレージの好気的変敗
を防止する方法。8. A method for preventing aerobic deterioration of silage, comprising a step of adding the killer yeast according to claim 1 to silage.
加する工程を包含する、請求項８に記載の方法。9. The method of claim 8, further comprising the step of adding lactose to the silage.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20509296A JP3870248B2 (en) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | Lactic acid non-utilizing killer yeast |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042861A true JPH1042861A (en) | 1998-02-17 |
| JP3870248B2 JP3870248B2 (en) | 2007-01-17 |
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ID=16501302
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20509296A Expired - Lifetime JP3870248B2 (en) | 1996-08-02 | 1996-08-02 | Lactic acid non-utilizing killer yeast |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3870248B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001004291A1 (en) * | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Non-lactate-assimilating yeast for improving aerobic stability of silage |
| WO2003067997A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Sa Majesté La Reine Du Chef Du Canada | Mixed starter culture and uses thereof |
| JP2017537980A (en) * | 2014-11-24 | 2017-12-21 | ダンスター フェルマン アーゲー | Hay preservative and hay preservation method |
-
1996
- 1996-08-02 JP JP20509296A patent/JP3870248B2/en not_active Expired - Lifetime
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| WO2001004291A1 (en) * | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Non-lactate-assimilating yeast for improving aerobic stability of silage |
| WO2003067997A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Sa Majesté La Reine Du Chef Du Canada | Mixed starter culture and uses thereof |
| JP2017537980A (en) * | 2014-11-24 | 2017-12-21 | ダンスター フェルマン アーゲー | Hay preservative and hay preservation method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3870248B2 (en) | 2007-01-17 |
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