JPH0697993B2 - Arginase gene-deficient strain selection medium, breeding of urea-non-producing yeast using it, and method for producing alcoholic beverages using the same - Google Patents
Arginase gene-deficient strain selection medium, breeding of urea-non-producing yeast using it, and method for producing alcoholic beverages using the sameInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、実験室株酵母(1倍体)ではなく、実際の飲
食品の醸造に用いられている酵母(実用醸造酵母:2倍
体、もしくはそれ以上の高次倍数体)のアルギナーゼ遺
伝子(CAR1)の突然変異処理による欠損、あるいは、異
種遺伝子を含まないDNAを用いた形質転換による破壊、
のいずれかによる尿素非生産性酵母、その選択用培地、
それを用いる育種法及び当該酵母の利用に関するもので
ある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Use) The present invention is not a laboratory strain yeast (haploid) but a yeast used for actual brewing of food and drink (practical brewing yeast: diploid). , Or higher polyploidy) arginase gene (CAR1) by mutation treatment, or by transformation using DNA containing no heterologous gene,
Urea-non-producing yeast by any of the,
The present invention relates to a breeding method using the yeast and utilization of the yeast.
本発明による変異処理あるいは形質転換法により育種さ
れる尿素非生産性実用醸造酵母は、アルギニンをオルニ
チンと尿素に分解する酵素であるアルギナーゼ(EC3.5.
3.1)を欠失しているため尿素を生成しない。従って、
尿素から誘導される発癌物質カルバミン酸エチルの生成
を抑えることが可能である。Urea non-producing practical brewer's yeast bred by the mutation treatment or transformation method according to the present invention is arginase (EC3.5.) Which is an enzyme that decomposes arginine into ornithine and urea.
Urea is not produced due to deletion of 3.1). Therefore,
It is possible to suppress the production of the carcinogen ethyl carbamate derived from urea.
つまり、本発明の突然変異株あるいは遺伝子破壊株を用
いることによって、アルコール発酵速度及び品質は親株
と変らず、しかも、アルバミン酸エチルを全く含まない
安全な酒類等を製造することができる。従って、本発明
に酒類、アルコール、その他の醸造食品の製造に大きく
貢献するものである。That is, by using the mutant strain or the gene-disrupted strain of the present invention, alcoholic fermentation rate and quality are the same as those of the parent strain, and moreover, safe alcoholic beverages containing no ethyl albamate can be produced. Therefore, the present invention greatly contributes to the production of alcoholic beverages, alcohol and other brewed foods.
(発明の背景及び従来技術とその問題点) 一般に、各種醸造飲食品(清酒、焼酎、果実種、ビー
ル、ウィスキー、ブランデー、醤油、味噌、老酒等)の
製造醪中には、含量にはかなり差があるが、尿素が存在
し、それがエタノールと反応して発癌性物質であるカル
バミン酸エチル(ウレタン)を生成させるため世界中で
問題になっている。(Background of the Invention and Prior Art and Problems Thereof) Generally, the content of brewed foods and drinks (sake, shochu, fruit seeds, beer, whiskey, brandy, soy sauce, miso, old sake, etc.) is considerably high. Despite differences, urea is a problem worldwide because it reacts with ethanol to produce the carcinogen ethyl carbamate (urethane).
従来、尿素を減少させる方法としては、アルギニンの酵
母菌体への取り込みに関与するアルギニン透過酵素の欠
失した変異株を用いる方法、または、尿素をアンモニア
と炭酸ガスに分解するウレアアミドリアーゼ作用の脱抑
制変異株を用いる方法がとられてきたが、これらの菌株
を用いても従来の約半量までしか尿素量を減らすことは
できない。しかも、これらの変異株は親株に比べ一般に
発酵が鋭いため、他の酵母に汚染され易く確実な効果が
得られにくいという問題があった。Conventionally, as a method for reducing urea, a method using a mutant strain lacking arginine permease involved in the uptake of arginine into yeast cells, or a urea amide lyase action that decomposes urea into ammonia and carbon dioxide Although a method using a desuppression mutant strain has been adopted, even if these strains are used, the amount of urea can be reduced only to about half of the conventional amount. Moreover, since these mutants generally have a sharper fermentation than the parent strain, there is a problem that they are easily contaminated by other yeasts and it is difficult to obtain a reliable effect.
本発明者らは、特願平1-207874で、アルギナーゼ遺伝子
破壊により尿素非生産性実用醸造酵母を育種したが、酒
種についての組換え体利用ガイドラインが未制定のため
当該遺伝子破壊株は現在のところ酒造場で使用できない
状況にある。また、当該遺伝子破壊株は酵母以外の異種
遺伝子、つまり、大腸菌のDNA配列を有しており、飲食
品の実際の製造における面からはそのような異種生物の
また、本発明者らは、先に、特願昭63−268097(特開平
2−117385)で、アルギナーゼ遺伝子破壊又は置換によ
り尿素非生産性酵母を育種したが、宿主の酵母には、形
質転換体を選択するためのマーカーを付与し易い実験室
株(1培体)を用いており、かつ、1倍体のため、実用
的には発酵速度が遅いなどの問題がある。In Japanese Patent Application No. 1-207874, the inventors bred urea-non-producing practical brewer's yeast by disrupting the arginase gene. However, it is in a situation where it cannot be used in the brewery. Further, the gene-disrupted strain has a heterologous gene other than yeast, that is, it has a DNA sequence of Escherichia coli. In Japanese Patent Application No. 63-268097 (JP-A-2-117385), a urea non-producing yeast was bred by disruption or substitution of the arginase gene. The host yeast was provided with a marker for selecting transformants. Since it uses a laboratory strain (1 culture) that is easy to do and is a haploid, there is a problem in that the fermentation rate is practically slow.
通常、清酒、焼酎、果実酒、ビール、ウイスキー、ブラ
ンデー、老酒等の製造に用いられている実用醸造酵母
(サッカロマイセス・セレビシアエ)は倍数性が2倍体
(もしくはそれ以上の高次倍数体)である他、各酒類の
製造で要求される性質、例えば、清酒や焼酎でのアルコ
ール耐性、果実酒での亜硫酸耐性、ビールでの低温発酵
性等を備えており、実験室株とは大きく異なっている。Practical brewer's yeast (Saccharomyces cerevisiae), which is usually used for the production of sake, shochu, fruit wine, beer, whiskey, brandy, old sake, etc., has a diploid (or higher polyploid) Besides, it has properties required for the production of each liquor, for example, alcohol resistance in sake and shochu, sulfite resistance in fruit liquor, low temperature fermentability in beer, etc. There is.
また、形質転換体の選択のためのマーカーを付与するに
当り、1倍体である実験室株に対しては、人工突然変異
による栄養要求性マーカーを付与することができる。In addition, in imparting a marker for transformant selection, an auxotrophic marker by artificial mutation can be imparted to a haploid laboratory strain.
しかしながら、実用醸造酵母は、倍数性が2倍体(もし
くはそれ以上の高次倍数体)であるので、その醸造特性
を損なうことなく劣性変異であるこのような栄養要求性
を取得することはできなかった。However, since the practical brewer's yeast is diploid (or higher polyploid), it is not possible to obtain such an auxotrophy which is a recessive mutation without impairing its brewing characteristics. There wasn't.
更にまた、実用醸造酵母においては、その倍数性が2倍
体(もしくはそれ以上の高次倍数体)であるため、目的
とする遺伝子を破壊又は置換するには、2本(又はそれ
以上)の染色体上の同一遺伝子を破壊又は置換する必要
があり、上記選択マーカーの遺伝子を連結した複数個の
破壊又は置換用プラスミドの構築が必要となる。Furthermore, in the practical brewer's yeast, its ploidy is diploid (or higher polyploid), and therefore, in order to destroy or replace the target gene, 2 (or more) It is necessary to destroy or replace the same gene on the chromosome, and it is necessary to construct a plurality of disrupting or replacing plasmids in which the genes of the above selection markers are linked.
(問題点を解決するための手段) 本発明者らは、上記したように各種の点において実験室
株とは全く異なる実用醸造酵母において、尿素非生産性
を有するすぐれた実用醸造酵母を創製する総合的システ
ムを開発するためになされたものである。(Means for Solving the Problems) As described above, the present inventors create an excellent practical brewing yeast having urea non-productivity in the practical brewing yeast which is completely different from the laboratory strain in various points as described above. This was done to develop a comprehensive system.
以上の観点から、現時点において酒造場で実用可能な尿
素非生産性醸造酵母である人工突然変異によるアルギナ
ーゼ遺伝子欠損変異株の開発を目的として研究を行っ
た。また、酒類についての組換え体利用ガイドライン制
定次第、即時、酒造場での実用化が可能と思われる、酵
母以外の異種遺伝子を含まないアルギナーゼ遺伝子破壊
株の開発を目的として鋭意研究を行った。From the above viewpoints, the present study was conducted for the purpose of developing an arginase gene-deficient mutant strain by artificial mutation, which is a urea non-producing brewer's yeast that can be practically used at the brewery at the present time. In addition, as soon as the guidelines for recombinant use of alcoholic beverages were established, we conducted an earnest study for the purpose of developing an arginase gene-disrupted strain that does not contain a heterologous gene other than yeast, and that could be put into practical use in a brewery immediately.
そこで目的とする変異株を検索するために、常法にした
がってスクリーニングを鋭意実行した。すなわち、アル
ギナーゼ遺伝子欠損株はアルギナーゼを持たないため窒
素源としてアルギニンのみを含む培地では生育できない
ので、このような欠損株を選択するときの常法であるレ
プリカ法と呼ばれる方法を用いた。しかし、このレプリ
カ法では1枚のプレートで約100株しか調べることがで
きない。すなわち108に1株の割合で起こる変異株の取
得頻度では100万枚ものプレートを使用しなければなら
ず、現実には不可能であった。Therefore, in order to search for the desired mutant strain, screening was eagerly performed according to a conventional method. That is, since the arginase gene-deficient strain does not have arginase and cannot grow in a medium containing only arginine as a nitrogen source, a method called a replica method, which is a conventional method for selecting such a deficient strain, was used. However, this replica method can examine only about 100 strains on one plate. In other words, it was impossible in reality that 1 million plates had to be used in order to obtain a mutant strain at a rate of 1 in 10 8 .
このように、目的とする変異株を選択するのに偶然性に
期待しなければならない点に鑑み、目的とする変異株を
取得するためには従来の発想を転換する必要があり、む
しろスクリーニングの手法を変えて新しい手法を開発す
ることの方が重要であるとの着想を得た。そして、目的
とする変異株を選択するのに好適な培地を作製すること
とした。In this way, in view of the fact that one has to expect the chance to select the target mutant strain, it is necessary to change the conventional idea in order to obtain the target mutant strain. I got the idea that it is more important to change the method and develop a new method. Then, it was decided to prepare a medium suitable for selecting the target mutant strain.
そこで、本発明者が特願平1-207874により育種したアル
ギナーゼ遺伝子破壊株FERM P-10903及び親株である清酒
酵母協会9号(サッカロマイセス・セレビシアエ)を用
いて、遺伝子破壊株のみ生育可能で、親株は生育できな
い培地を種々検討した。Therefore, using the arginase gene-disrupted strain FERM P-10903 and the parent strain, Sake Yeast Society No. 9 (Saccharomyces cerevisiae) bred by the present inventor in Japanese Patent Application No. 1-207874, only the gene-disrupted strain can grow, and the parent strain Examined various media that could not grow.
その結果、このアルギナーゼ遺伝子破壊株のみをポジテ
ィブに選択するのに特に適した培地、アルギナーゼ遺伝
子欠損株のみが選択的に生育可能な培地(以下、CAO培
地ともいう)を作成するのにはじめて成功し、しかもこ
の培地を使用すれば1枚のプレートで500万株もの調査
が可能である点をも確認した。As a result, we succeeded for the first time in creating a medium particularly suitable for positively selecting only this arginase gene-disrupted strain, and a medium in which only the arginase gene-deficient strain can selectively grow (hereinafter also referred to as CAO medium). Moreover, it was also confirmed that if this medium is used, it is possible to investigate 5 million strains with one plate.
次に、当該培地を使用することにより、実用醸造酵母に
人工突然変異処理を施したアルギナーゼ遺伝子欠損変異
株が得られることを見いだした。Next, it was found that an arginase gene-deficient mutant strain obtained by subjecting a practical brewing yeast to an artificial mutation treatment can be obtained by using the medium.
また、サッカロイマイセス・セレビシアエのアルギナー
ゼ遺伝子をコードするDNA断片をクローン化し、コーデ
ィングリージョンの一部を欠失させたプラスミドAある
いはプラスミドBを構築した。これらのプラスミドのい
ずれかを用い、さらに、CAO培地を使用すれば酵母以外
の異種遺伝子を含まないアルギナーゼ遺伝子欠損形質転
換株が得られることも見いだした。In addition, a DNA fragment encoding the arginase gene of Saccharomyces cerevisiae was cloned to construct plasmid A or plasmid B in which a part of the coding region was deleted. It was also found that an arginase gene-deficient transformant strain containing no heterologous gene other than yeast can be obtained by using any of these plasmids and further using CAO medium.
そして、得られた突然変異変株及び形質転換株を用いて
酒類の製造を行つたところ、尿素の生成は全く認めず、
従って、有害なカルバミン酸エチルの生成がなく、か
つ、アルコール発酵速度及び酒質も親株と変らないこと
を認め、本発明を完成するに至った。Then, when using the obtained mutant strain and transformed strain to produce alcoholic beverages, urea production was not observed at all,
Therefore, it was confirmed that harmful ethyl carbamate was not produced, and that the alcohol fermentation rate and the quality of sake were the same as those of the parent strain, and the present invention was completed.
(詳細な説明) 本発明者らは、特に特願平1-207874でアルギナーゼ遺伝
子破壊により尿素非生産性醸造酵母AL-1株(FERM P-109
03)を育種しているが、当該酵母を用いて種々の条件検
討を行った結果、アルギナーゼ遺伝子欠損株のみが選択
的に生育可能な培地の作製に成功した。(Detailed Description) In particular, in the Japanese Patent Application No. 1-207874, the present inventors have developed a urea-non-producing brewer's yeast AL-1 strain (FERM P-109) by disrupting the arginase gene.
As a result of conducting various conditions using the yeast, we succeeded in producing a medium in which only the arginase gene-deficient strain could grow selectively.
本発明に係る変異株選択用培地は、少なくともカナバニ
ン、アルギニン、オルニチンを含有するものであり、好
適な例としては、これらの成分に更にイーストナイトロ
ジェンベース(アミノ酸フリー)及び糖類(グルコー
ス、フラクトース、マルトース、ラクトース、オリゴ
糖、澱粉、デキストリン等)等を配合すればよい。また
更に必要あれば、常用される選択培地用成分を配合して
もよい。The mutant strain selection medium according to the present invention contains at least canavanine, arginine, ornithine, and as a preferred example, yeast nitrogen base (amino acid-free) and sugars (glucose, fructose, Maltose, lactose, oligosaccharides, starch, dextrin, etc.) may be added. Further, if necessary, a commonly used selective medium component may be added.
これらの配合量としては、カナバニン0.1〜20ppm、アル
ギニン0.05〜50mM、オルニチン0.25〜250mMであり、イ
ーストナイトロジェンベース及び糖としてグルコースを
使用する場合には、前者を0.05〜0.7%、後者を5.5〜10
%の範囲内で培地中に含有させればよい。These compounding amounts are 0.1 to 20 ppm canavanine, 0.05 to 50 mM arginine, and 0.25 to 250 mM ornithine.When glucose is used as the yeast nitrogen base and sugar, the former is 0.05 to 0.7% and the latter is 5.5 to Ten
It may be contained in the medium within the range of%.
このようにして調製した選択培地(CAO培地)は、1枚
のプレートで約500万株もの調査が可能であるので、き
わめて低頻度で出現する目的変異株を見逃すことなく正
確に且つ短時間で検出することができる。したがって、
本CAO培地を使用することによって、アルギナーゼ遺伝
子欠損変異株及び形質転換による酵母以外の異種遺伝子
を含まないアルギナーゼ遺伝子破壊株を効率よく得るこ
とができる。The selective medium (CAO medium) prepared in this way can be used to investigate about 5 million strains on a single plate, so it is possible to accurately and in a short time without overlooking the target mutant strain that appears at an extremely low frequency. Can be detected. Therefore,
By using this CAO medium, it is possible to efficiently obtain an arginase gene-deficient mutant strain and an arginase gene-disrupted strain containing no heterologous gene other than yeast by transformation.
突然変異株については、例えば小田ら(日本醸造協会誌
83、614(1988))に準じた方法で行われる。すなわ
ち、実用醸造酵母にエチルメタンスルフォネイトを用い
て変異処理を施し、当該CAO培地上に塗布する。生育し
た変異株のうち、アルギニン単一窒素源培地では生育で
きず、オルニチン単一窒素源培地で生育可能な株を目的
とするアルギナーゼ欠損変異株として得る。Regarding the mutant strain, for example, Oda et al.
83, 614 (1988)). That is, the practically brewed yeast is subjected to a mutation treatment using ethyl methane sulfonate and applied on the CAO medium. Among the mutants that have grown, a strain that cannot grow in an arginine single nitrogen source medium but can grow in an ornithine single nitrogen source medium is obtained as an intended arginase-deficient mutant strain.
形質転換による酵母以外の異種遺伝子を含まない遺伝子
破壊株については、用いたゲノムDNA供与体は、サッカ
ロマイセス・セレビシアエであり、具体的には協会酵母
7号(市販品)である。For the gene-disrupted strain containing no heterologous gene other than yeast by transformation, the genomic DNA donor used was Saccharomyces cerevisiae, specifically, Association Yeast No. 7 (commercially available).
本菌体からの染色体DNAの抽出法及び染色体ジーンライ
ブラリーの作製法は、例えばAgric.Biol.Chem.,Vol.53,
431〜436(1989)に記載された方法に準じて行われる。The method for extracting the chromosomal DNA from the bacterium and the method for preparing the chromosomal gene library are, for example, Agric.Biol.Chem., Vol.53,
It is performed according to the method described in 431-436 (1989).
上記で得られた染色体ジーンライブラリーからの当該遺
伝子の単離にあたってはサッカロマイセス・セレビシア
エのアルギナーゼ遺伝子のDNA配列(J.Bacteriol.,Vol.
160,1078〜1087(1984))に基づいて合成したDNAオリ
ゴマーを作製し、それをプローブに用いてプラークハイ
ブリダイゼイションを行い、サッカロマイセス・セレビ
シアエのアルギナーゼ遺伝子のDNAをクローニングす
る。For the isolation of the gene from the chromosomal gene library obtained above, the DNA sequence of the Saccharomyces cerevisiae arginase gene (J. Bacteriol., Vol.
160, 1078 to 1087 (1984)), prepare a DNA oligomer, and use it as a probe for plaque hybridization to clone the DNA of the Saccharomyces cerevisiae arginase gene.
遺伝子破壊のためのプラスミドAあるいはプラスミドB
の作製は次のようにして行う。Plasmid A or plasmid B for gene disruption
Is manufactured as follows.
プラスミドAの作製は、アルギナーゼ遺伝子由来の0.87
KbpのHind III−Pst IフラグメントをpUC119に組み込ん
だプラスミドpHP-1をSal Iで切断し、クレナウフラグメ
ント処理しセルフライゲーションしたプラスミドpHP−1
SからHinc II-Hinc II(0.15Kbp)断片を除いたプラス
ミドA(pHP-1SH)を作製する(第1図)。The plasmid A was prepared from 0.87 derived from the arginase gene.
The plasmid pHP-1 in which the HindIII-PstI fragment of Kbp was inserted into pUC119 was cut with Sal I, treated with Klenow fragment and self-ligated.
A plasmid A (pHP-1SH) is prepared by removing the Hinc II-Hinc II (0.15 Kbp) fragment from S (Fig. 1).
また、プラスミドBの作製は、アルギナーゼ遺伝子を含
む約5.5KbpのBamH I-BamH IフラグメントをpUC119に組
み込んだプラスミドpCAR112からBgl II-Bgl II(0.74Kp
b)断片を除いたプラスミドB(pCAR112-GG)を作製す
る(第2図)。Further, the construction of plasmid B was carried out by using plasmid pCAR112 in which a BamHI-BamHI fragment of about 5.5 Kbp containing the arginase gene was incorporated into pUC119 to BglII-BglII (0.74Kp).
b) A plasmid B (pCAR112-GG) excluding the fragment is prepared (Fig. 2).
形質転換においては、実用醸造酵母は2倍体(もしくは
高次倍数体)であるが、アルギナーゼ遺伝子欠損株選択
倍地(CAO倍地)を使用するので、2本の染色体上の2
つの当該遺伝子を同時に破壊した株が本CAO培地により
選択することができる。また、染色体上の当該遺伝子の
うち1つだけが破壊され、破壊されたアルギナーゼ遺伝
子が残りの健全なアルギナーゼ遺伝子とジーンコンバー
ジョンを起こすことによって生ずる2つのアルギナーゼ
遺伝子がともに破壊されたアルギナーゼ遺伝子欠損株も
取得することができる。従って、これまでの実用醸造酵
母における遺伝子破壊では遺伝子破壊用プラスミドは少
なくとも2種類必要であったのに対し、本CAO培地を使
用すれば遺伝子破壊用プラスミドは1種類で良いことに
なる。すなわち、上記により作製したプラスミドAある
いはBのいずれか1つを使用して遺伝子破壊を行うこと
により効率良く目的とする遺伝子破壊株を取得すること
ができる。In the transformation, the practical brewer's yeast is diploid (or higher polyploid), but since an arginase gene-deficient strain selection medium (CAO medium) is used, 2 strains on two chromosomes are used.
A strain in which one gene of interest is disrupted at the same time can be selected by this CAO medium. Also, an arginase gene-deficient strain in which only one of the genes on the chromosome is destroyed, and the two arginase genes, which are generated by causing the gene conversion with the remaining healthy arginase gene, are also destroyed. Can be obtained. Therefore, at least two types of gene disruption plasmids have been required for gene disruption in conventional brewer's yeasts, whereas one type of gene disruption plasmid is sufficient when the present CAO medium is used. That is, the desired gene-disrupted strain can be efficiently obtained by performing gene disruption using either one of the plasmids A and B produced as described above.
つまり、Hind III及びPst Iサイトで切断したプラスミ
ドAもしくはBamH Iサイトで切断したプラスミドBを用
いて形質転換し、CAO培地上に塗布し目的とする形質転
換体を得る。なお、親株のアルギナーゼ遺伝子とリアレ
ンジメントするプラスミドAのHind III-Pst Iフラグメ
ント(0.72Kbp)あるいはプラスミドBのBamH I-BamH I
フラグメント(4.8Kbp)は、大腸菌等の異種遺伝子の配
列は含まず、酵母由来の配列のみからなる。That is, transformation is carried out using the plasmid A cleaved at the Hind III and Pst I sites or the plasmid B cleaved at the BamH I site and applied on a CAO medium to obtain the desired transformant. The Hind III-Pst I fragment (0.72 Kbp) of plasmid A or the BamHI-BamHI of plasmid B that rearranges with the arginase gene of the parent strain.
The fragment (4.8 Kbp) does not include the sequences of heterologous genes such as Escherichia coli, but consists only of yeast-derived sequences.
なお、アルギナーゼ遺伝子が突然変異処理により欠損を
受けたかどうか、もしくは、形質転換により破壊された
かどうかの判定は次の方法でアルギナーゼ活性を測定
し、活性の有無を調べるとともに、形質転換体について
サザンブロッティングにより遺伝子の破壊を確認する。In addition, to determine whether the arginase gene was deficient by mutation treatment or destroyed by transformation, the arginase activity was measured by the following method, and the presence or absence of the activity was examined. Confirm gene disruption by.
なお、アルギナーゼ遺伝子欠損のキイとなるアルギナー
ゼ活性の測定は次のようにして行う。The arginase activity, which is a key factor for deficiency of the arginase gene, is measured as follows.
すなわち、変異株、形質転換株及び親株をアルギナーゼ
誘導培地(イーストナイトロジェンベース(窒素源フリ
ー)0.17%、アルギニン塩酸塩10mM、グルコース2%、
硫酸アンモニウム5mM)に4×104セル/mlとなるように
植菌し、30℃、1晩振とう培養後集菌洗浄する。この菌
体を10mMトリス・塩酸バッファー(pH7.0)にけん濁し
ガラスビースで破壊する。このホモジネートの15,000rp
m、10分間の遠心上清を酵素液とし、アルギニンを基質
として反応させ生成する尿素を東洋醸造(株)製尿素キ
ットで定量し、アルギナーゼ活性とする。That is, a mutant strain, a transformant strain and a parent strain were treated with an arginase induction medium (yeast nitrogen base (nitrogen source free) 0.17%, arginine hydrochloride 10 mM, glucose 2%,
The cells are inoculated into ammonium sulfate (5 mM) at 4 × 10 4 cells / ml, shake-cultured at 30 ° C. overnight, and then the cells are collected and washed. Suspend the cells in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) and destroy with glass beads. 15,000 rp of this homogenate
Urea produced by reacting arginine as a substrate with a supernatant obtained by centrifugation for 10 minutes at m for 10 minutes is quantified with a urea kit manufactured by Toyo Brewing Co., Ltd. to obtain arginase activity.
次に、この変異株及び形質転換株を用いて常法どおり、
清酒や果実酒、ビール、焼酎、ウィスキー、ブランデ
ー、老酒等の酒類を製造することにより、尿素を全く含
まない酒類の製造ができ、ひいてはアルバミン酸エチル
の生成しない発ガン性の心配のない安全な酒類、しかも
風味は全く従来法によるものと変らない美味な酒類の製
造がはじめて可能となるのである。Next, using this mutant strain and transformant strain in the usual manner,
By producing alcoholic beverages such as sake, fruit wine, beer, shochu, whiskey, brandy, and old sake, it is possible to produce alcoholic beverages that do not contain urea at all, and it is safe without carcinogenicity that does not produce ethyl albamate. For the first time, it is possible to produce alcoholic beverages and delicious alcoholic beverages whose flavors are exactly the same as those produced by conventional methods.
次に、本発明の実施例を示す。Next, examples of the present invention will be described.
実施例1 アルギナーゼ遺伝子欠損株選択倍地の検索; アルギナーゼ遺伝子欠損株はアルギナーゼを持たないた
め窒素源としてアルギニンのみを含む培地では生育でき
ない。このような欠損株を選択するときには、通常レプ
リカ法と呼ばれる方法が用いられる。しかし、このレプ
リカ法では1枚のプレートで約100株しか調べることが
できない。すなわち108に1株の割合で起こる変異株の
取得頻度では100万枚ものプレートを使用しなければな
らず、現実には不可能である。Example 1 Search of selective medium for arginase gene-deficient strain; since arginase gene-deficient strain does not have arginase, it cannot grow in a medium containing only arginine as a nitrogen source. When selecting such a defective strain, a method usually called a replica method is used. However, this replica method can examine only about 100 strains on one plate. In other words, it is impossible in reality that one million plates have to be used for the acquisition frequency of mutant strains occurring at a rate of 1 in 10 8 .
そこで、本発明者が特願平1-207874により育種したアル
ギナーゼ遺伝子破壊株FERM P-10903及び親株である清酒
酵母協会9号(サッカロマイセス・セレビシアエ)を用
いて、遺伝子破壊株のみ生育可能で、親株は生育できな
い培地を種々検討した。Therefore, using the arginase gene-disrupted strain FERM P-10903 and the parent strain, Sake Yeast Society No. 9 (Saccharomyces cerevisiae) bred by the present inventor in Japanese Patent Application No. 1-207874, only the gene-disrupted strain can grow, and the parent strain Examined various media that could not grow.
その結果、このアルギナーゼ遺伝子破壊株のみをポジテ
ィブに選択するためにはイーストナイトロジェンベース
(アミノ酸フリー)0.17%、カナバニン10ppm、アルギ
ニン1mM、オルニチン5mM、グルコース2%の培地が最適
であることを発見し、この組成を含む選択用培地をCAO
培地と命名した。As a result, it was found that the yeast nitrogen base (amino acid-free) 0.17%, canavanine 10 ppm, arginine 1 mM, ornithine 5 mM, glucose 2% was the best medium for positively selecting only this arginase gene-disrupted strain. , CAO selection medium containing this composition
It was named the medium.
CAO培地の配合例は、第1表に示される。An example of the CAO medium formulation is shown in Table 1.
本CAO培地を使用することにより、1枚のプレートで約5
00万株を調べることが可能であり、低頻度に含まれる目
的とする株を効率よく選択することが可能である。 By using this CAO medium, one plate can be used for about 5
It is possible to examine 0,000,000 strains, and it is possible to efficiently select target strains that are included in low frequencies.
実施例2 突然変異によるアルギナーゼを生産しないサッカロマイ
セス・セレビシアエの育種; 清酒酵母(協会9号・10号)、ワイン酵母(ガイゼンハ
イム74・エパーネイ)をYEPD培地(イーストエクストラ
クト1%、ポリペプトン2%、グルコース2%)10mlに
4×104セル/mlとなるよう植菌し、30℃で1晩振とう培
養後集菌洗浄した。この菌体を0.1mMリン酸バッファー
(pH7.0)10mlにけん濁、エチルメタンスルフォネイト
0.3mlを添加し、30℃、45分間ゆるやかに振とうして変
異処理を施した。遠心により集菌した菌体を5%チオ硫
酸ナトリウム溶液10mlで1回、殺菌水10mlで2回洗浄
後、殺菌水10mlにけん濁し、その40μをCAO培地上に
塗布した。Example 2 Breeding of Saccharomyces cerevisiae that does not produce arginase by mutation; Sake yeast (Association No. 9 and No. 10), wine yeast (Geisenheim 74. Eppanay) in YEPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, Glucose (2%) was inoculated into 10 ml at 4 × 10 4 cells / ml, shake-cultured at 30 ° C. overnight, and the cells were collected and washed. Suspend the cells in 10 ml of 0.1 mM phosphate buffer (pH 7.0), ethyl methane sulfonate
0.3 ml was added, and the mixture was subjected to mutation treatment by gently shaking at 30 ° C. for 45 minutes. The cells collected by centrifugation were washed once with 10 ml of a 5% sodium thiosulfate solution and twice with 10 ml of sterilized water, suspended in 10 ml of sterilized water, and 40 μ of the suspension was applied on a CAO medium.
30℃で1週間培養後、出現したコロニーをCAO培地上で
シングルコロニーとして単離し、アルギニン単一窒素源
培地では生育できず、オルニチン単一窒素源培地で生育
可能な株を目的とするアルギナーゼ遺伝子欠損株として
取得した(第2表)。このようにして協会9号から得た
ALM-9はFERM P-11169として微工研に寄託されている。After culturing at 30 ℃ for 1 week, the emerged colony was isolated as a single colony on CAO medium, and the arginase gene aimed at a strain that could not grow on arginine single nitrogen source medium but could grow on ornithine single nitrogen source medium Obtained as a defective strain (Table 2). In this way I got from Association No. 9
ALM-9 has been deposited with the Institute of Mechanical Engineering as FERM P-11169.
実施例3 アルギナーゼ遺伝子破壊のためのプラスミドの作製; プラスミドAの作製法:第2図記載のpCAR112(特願平1
-207874)から制限酵素Hind IIIとPst Iで切り出される
アルギナーゼ遺伝子由来の0.87KbpのDNA断片をpUC119に
T4DNAリガーゼを用いて連結し、プラスミドpHP-1を作製
した。これをSal Iで切断し、クレナウフラグメント処
理した後、T4DNAリガーゼを用いてセルフライゲージョ
ンを行い、得られたプラスミドpHP-1SのHinc II-Hinc I
Iフラグメント(0.15Kbp)を制限酵素で切り出した後に
T4DNAリガーゼを用いて再連結し、アルギナーゼ遺伝子
破壊用プラスミド(pHP-1SH)を作製した(第1図)。 Example 3 Construction of plasmid for disruption of arginase gene; Method for constructing plasmid A: pCAR112 described in FIG.
-207874) and a 0.87 Kbp DNA fragment derived from the arginase gene excised with the restriction enzymes Hind III and Pst I into pUC119.
Ligation was performed using T4 DNA ligase to prepare plasmid pHP-1. This was cleaved with Sal I, treated with Klenow fragment, and self-ligated using T4 DNA ligase to obtain Hinc II-Hinc I of the obtained plasmid pHP-1S.
After cutting out the I fragment (0.15 Kbp) with a restriction enzyme
Re-ligation was performed using T4 DNA ligase to prepare an arginase gene disruption plasmid (pHP-1SH) (Fig. 1).
プラスミドBの作製法:pCAR112からBgl II-Bgl IIフラ
グメント(0.74Kbp)を制限酵素で切り出した後、T4DNA
リガーゼを用いて再連結し、アルギナーゼ遺伝子破壊用
プラスミドB(pCAR112-GG)を作製した(第2図)。Construction method of plasmid B: Bgl II-Bgl II fragment (0.74 Kbp) was cut out from pCAR112 with a restriction enzyme, and then T4DNA
Religation was performed using ligase to prepare a plasmid B (pCAR112-GG) for disrupting the arginase gene (Fig. 2).
実施例4 形質転換によるアルギナーゼを生産しないサッカロマイ
セス・セレビシアエの作製; アルギナーゼ遺伝子破壊用プラスミドAあるいはBを用
い、サッカロマイセス・セレビシアエ清酒酵母協会9号
(2培体、市販品)の形質転換をItoらの方法(J.Bacte
riol.,Vol.153,163(1983))に準じて行った。Example 4 Preparation of Saccharomyces cerevisiae that does not produce arginase by transformation; using plasmids A or B for disrupting the arginase gene, transformation of Saccharomyces cerevisiae sake yeast association No. 9 (2 culture, commercial product) was performed by Ito et al. Method (J. Bacte
riol., Vol.153,163 (1983)).
すなわち、清酒酵母(協会9号)をYEPD培地10mlに4×
104セル/mlとなるように植菌し、30℃で1晩振とう培養
後、対数増殖期の細胞を遠心により集菌した。TEバッフ
ァーで洗浄後、TEバッファー0.5mlにけん濁し、等容量
の0.2M酢酸リチウム溶液を添加し、1時間、30℃で振と
うした。この中から0.1mlを1.5ml容のエッペンドルフチ
ューブに移し、DNA溶液(0.5μg/μ)0μを加え、
30℃、30分間静置した。That is, Sake yeast (Association No. 9) was added to 4 x 10 ml of YEPD medium.
The cells were inoculated at a rate of 10 4 cells / ml, and after shaking culture at 30 ° C. overnight, cells in the logarithmic growth phase were collected by centrifugation. After washing with TE buffer, the suspension was suspended in 0.5 ml of TE buffer, an equal volume of 0.2 M lithium acetate solution was added, and the mixture was shaken at 30 ° C. for 1 hour. Transfer 0.1 ml from this to a 1.5 ml Eppendorf tube, add 0 μ of DNA solution (0.5 μg / μ),
It was allowed to stand at 30 ° C for 30 minutes.
なお、ここで使用したDNA溶液は次のようにして調製し
た。The DNA solution used here was prepared as follows.
プラスミドAを用いて形質転換を行う場合:プラスミド
A(pHP-1SH)を制限酵素Hind III及びPst Iで処理し、
生じた2つの断片(0.72Kbp、3.2Kbp)のうち、0.72Kbp
のフラグメントをジーンクリーン法により精製した後、
TEバッファーに溶解し、DNA溶液を調製した。なお、0.7
2KbpのHind III-Pst I断片は酵母由来の遺伝子のみから
なり、大腸菌等の異種遺伝子は含まない。When transformation is performed using plasmid A: Plasmid A (pHP-1SH) is treated with restriction enzymes Hind III and Pst I,
Of the two generated fragments (0.72Kbp, 3.2Kbp), 0.72Kbp
After purifying the fragment of
It was dissolved in TE buffer to prepare a DNA solution. In addition, 0.7
The 2 Kbp Hind III-Pst I fragment consists of yeast-derived genes only and does not contain heterologous genes such as Escherichia coli.
プラスミドBを用いて形質転換を行う場合:プラスミド
B(pCAR112-GG)を制限酵素BamH Iで処理し、生じた2
つの断片(4.8Kbp、3.2Kbp)のうち4.8Kbpのフラグメン
トをジーンクリーン法により精製した後、TEバッファー
に溶解し、DNA溶液を調製した。なお、4.8KbpのBamH I-
BamH I断片は酵母由来の遺伝子のみからなる。When transformation is carried out using plasmid B: Plasmid B (pCAR112-GG) was treated with the restriction enzyme BamH I to generate 2
Of the two fragments (4.8 Kbp and 3.2 Kbp), the 4.8 Kbp fragment was purified by the Geneclean method and then dissolved in TE buffer to prepare a DNA solution. In addition, 4.8 Kbp BamHI-
The BamHI fragment consists only of yeast-derived genes.
次に、殺菌した70%PEG-4000 150μを加えよく混合
し、30℃で1時間静置した後、エッペンドルフチューブ
を42℃の恒温槽中に10分間静置し、菌体を直ちに室温ま
で冷却してから、殺菌水で洗浄、CAO培地上に塗布し
た。30℃で1週間培養し、プラスミドA(pHP-1SH)で
9菌体(9個/100μg DNA)、プラスミドB(pCAR112-G
G)で16菌株(16個/100μg DNA)の目的とする酵母以外
の異種遺伝子を含まない形質転換体を得た。Next, add 150μ of sterilized 70% PEG-4000, mix well, leave at 30 ° C for 1 hour, then leave the Eppendorf tube in a constant temperature bath at 42 ° C for 10 minutes, and immediately cool the cells to room temperature. Then, it was washed with sterilized water and applied on the CAO medium. Incubate at 30 ℃ for 1 week, and use plasmid A (pHP-1SH) for 9 cells (9 cells / 100 μg DNA), plasmid B (pCAR112-G).
In G), 16 strains (16 cells / 100 μg DNA) were obtained, which were transformants containing no target heterologous gene other than yeast.
プラスミドAで作成したALK-9株は FERM p-11168として微工研に寄託されている。The ALK-9 strain prepared with plasmid A has been deposited with MIC as FERM p-11168.
実施例5 アルギナーゼ遺伝子の変異による損傷、あるいは、形質
転換による破壊の確認; こうようにして得られたアルギナーゼ欠損株と親株とア
ルギナーゼ活性を第3表に示したが、アルギニンによる
誘導培養においても変異株及び形質転換株はアルギナー
ゼ活性が認められないことから、2本の染色体上のアル
ギナーゼ遺伝子が共に欠損を起こした、あるいは、破壊
された株であることが確認された。Example 5 Confirmation of damage due to mutation of arginase gene or destruction by transformation; Table 3 shows the arginase-deficient strain, parent strain and arginase activity thus obtained, which were also mutated in arginine-induced culture. Since no arginase activity was observed in the strain and the transformant strain, it was confirmed that the arginase genes on the two chromosomes were both defective or destroyed.
さらに、形質転換株についてはサザンブロッティングで
もアルギナーゼ遺伝子が破壊されていることを確認し
た。Furthermore, regarding the transformed strain, it was confirmed by Southern blotting that the arginase gene was disrupted.
実施例7 突然変異株及び遺伝子破壊株による酒類の醸造; 親株(協会9号)、突然変異株、遺伝子破壊株を麹エキ
ス培地で30℃、3日間静置培養後集菌洗浄し、第4表に
示す仕込配合及び製造条件で総米200gの清酒仕込を行っ
た。 Example 7 Brewing of alcoholic beverages with mutant strains and gene-disrupted strains; parent strain (association No. 9), mutant strains and gene-disrupted strains were statically cultivated in a koji extract medium at 30 ° C. for 3 days, and then collected and washed, 200 g of total rice was charged with sake under the mixing formulation and manufacturing conditions shown in the table.
アルコール発酵経過をCO2の発生による重量の減少で測
定し、第3図に示した。また、製成酒の尿素含量及び各
種成分を第5表に示した。この結果、変異株及び形質転
換株の使用によりアルコール発酵速度、一般成分及び官
能評価は親株とほとんど変わらず、しかも尿素及びアル
バミン酸エチルを全く含まない清酒の製造が可能であっ
た。 The progress of alcohol fermentation was measured by the weight loss due to the generation of CO 2 , and is shown in FIG. In addition, Table 5 shows the urea content and various components of the sake. As a result, by using the mutant strain and the transformant strain, alcohol fermentation rate, general components and sensory evaluation were almost the same as those of the parent strain, and it was possible to produce sake containing no urea and ethyl albamate.
(発明の効果) 本発明によれば、アルギナーゼ遺伝子欠損株を効率よく
選択しうる選択培地が提供され、この培地を用いること
によって、アルギナーゼを産生せずしたがって尿素を産
生することのない尿素非生産性酵母を育種することがで
きる。このようにして得た酵母を利用すれば、発ガン性
を有するエチルカーバメートを含まない安全な酒類を醸
造することができる。 (Effect of the invention) According to the present invention, a selective medium capable of efficiently selecting an arginase gene-deficient strain is provided, and by using this medium, urea non-production that does not produce arginase and therefore does not produce urea. Sex yeast can be bred. By using the yeast thus obtained, it is possible to brew safe alcoholic beverages containing no carcinogenic ethyl carbamate.
第1図はアルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラ
スミドAの作製説明図、第2図は同様のプラスミドBの
作製説明図、第3図は親株と変異株及び形質転換株のア
ルコール発酵の経過図である。Fig. 1 is an explanatory diagram of the production of a plasmid A for gene disruption of the arginase gene, Fig. 2 is an explanatory diagram of the production of a similar plasmid B, and Fig. 3 is a progress diagram of alcohol fermentation of a parent strain, a mutant strain and a transformant strain. Is.
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/81 //(C12N 1/16 C12R 1:865) (C12N 1/19 C12R 1:865) (72)発明者 五味 勝也 東京都北区滝野川2丁目6番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 熊谷 知栄子 東京都北区滝野川2丁目6番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 原 昌道 東京都北区滝野川2丁目6番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 田村 學造 東京都北区滝野川1丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (56)参考文献 特開 平2−117385(JP,A)Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12N 15/81 // (C12N 1/16 C12R 1: 865) (C12N 1/19 C12R 1: 865) (72 ) Inventor Katsuya Gomi 2-6-30 Takinogawa, Kita-ku, Tokyo Inside the National Brewing Agency's brewing laboratory (72) Inventor Chieko Kumagai 2-6-30 Takinogawa, Kita-ku, Tokyo Inside the National Brewery's brewing laboratory (72) Inventor Hara Masamichi Tokyo 2-6-30 Takinogawa, Kita-ku, National Institute of Taxation Brewing Laboratory (72) Inventor, Gakuzo Tamura 1-54-18, Takinogawa, Kita-ku, Tokyo (56) References 117385 (JP, A)
Claims (8)
ルニチンを含有することを特徴とするアルギナーゼ遺伝
子欠損株選択培地。1. An arginase gene-deficient strain selection medium containing at least canavanine, arginine and ornithine.
ン含有量が0.05〜50mM、オルニチン含有量が0.25〜250m
Mであることを特徴とする請求項1に記載の選択培地。2. Canavanine content is 0.1 to 20 ppm, arginine content is 0.05 to 50 mM, ornithine content is 0.25 to 250 m.
The selection medium according to claim 1, which is M.
醸造酵母から、請求項1又は2に記載の選択培地を用い
て取得したことを特徴とする突然変異処理によりアルギ
ナーゼ遺伝子が欠損をおこしたサツカロミセス セレビ
シエに属する尿素非生産性酵母。3. The arginase gene is deficient by a mutation treatment, which is obtained from a diploid or a practical brewer's yeast having a ploidy of 2 or more by using the selective medium according to claim 1 or 2. Urea non-producing yeast belonging to Satsucaromyces cerevisiae.
醸造酵母から、請求項1又は2に記載の選択培地を用い
て取得したことを特徴とする、下記に示す、プラスミド
pHP−1SHもしくはpCAR112−GGを使用して遺伝子破壊す
ることによりアルギナーゼ遺伝子が破壊され且つ酵母以
外の異種遺伝子を含まない尿素非生産性酵母。 4. A plasmid shown below, which is obtained from a diploid or a practical brewer's yeast having a polyploidy of 2 or more using the selective medium according to claim 1 or 2.
A urea non-producing yeast in which the arginase gene is disrupted by gene disruption using pHP-1SH or pCAR112-GG and which does not contain a heterologous gene other than yeast.
ギナーゼ遺伝子の全てについて突然変異により欠損をお
こさせた株を、請求項1又は2に記載の選択培地を利用
して取得することを特徴とする尿素非生産性酵母の育種
法。5. A strain deficient in all of two or more arginase genes of practical brewer's yeast by mutation is obtained by using the selective medium according to claim 1 or 2. Method for breeding urea-non-producing yeast.
ギナーゼ遺伝子の全てについて異種遺伝子を含まないDN
Aを用いた形質転換により当該遺伝子の全てを破壊した
株を、請求項1又は2に記載の選択培地を利用して取得
することを特徴とする尿素非生産性酵母の育種法。6. A DN containing no heterologous gene for all of two or more arginase genes of practical brewer's yeast.
A method for breeding a urea non-producing yeast, which comprises obtaining a strain in which all of the gene has been disrupted by transformation with A, using the selective medium according to claim 1 or 2.
ることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法。7. A method for producing alcoholic beverages, alcohols and the like, which comprises using the urea-non-producing yeast according to claim 3.
ることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法。8. A method for producing alcoholic beverages, alcohols, etc., which comprises using the urea-non-producing yeast according to claim 4.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12303590A JPH0697993B2 (en) | 1990-05-15 | 1990-05-15 | Arginase gene-deficient strain selection medium, breeding of urea-non-producing yeast using it, and method for producing alcoholic beverages using the same |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0420282A JPH0420282A (en) | 1992-01-23 |
JPH0697993B2 true JPH0697993B2 (en) | 1994-12-07 |
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ID=14850598
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Country | Link |
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JP2013158301A (en) * | 2012-02-06 | 2013-08-19 | Gekkeikan Sake Co Ltd | Breeding method for high acid type yeast, high acid type yeast bred by the breeding method, and method for producing alcohol beverage by using the high acid type yeast |
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JPH0771493B2 (en) * | 1988-10-26 | 1995-08-02 | 国税庁長官 | Gene disruption or gene replacement plasmid vector, transformant and use thereof |
-
1990
- 1990-05-15 JP JP12303590A patent/JPH0697993B2/en not_active Expired - Lifetime
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