JP5970196B2

JP5970196B2 - Breeding method of high acid type yeast and method for producing alcoholic beverage using the high acid type yeast

Info

Publication number: JP5970196B2
Application number: JP2012023117A
Authority: JP
Inventors: 敦史小高; 幸宏中村; 舞子榊原
Original assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd
Current assignee: Gekkeikan Sake Co Ltd
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-02-06
Also published as: JP2013158301A

Description

本発明は、高酸型酵母の育種方法、該育種方法で育種された高酸型酵母、及び該高酸型酵母を用いたアルコール飲料の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for breeding a high acid type yeast, a high acid type yeast bred by the breeding method, and a method for producing an alcoholic beverage using the high acid type yeast.

清酒は、麹の糖化と、酵母によるアルコール発酵とを同時に行う並行複発酵を行っている。これにより、清酒は、醸造酒としては非常に珍しい２０％以上という高いアルコール度数を実現している。しかし、最近の消費者の低アルコール飲料への嗜好の変化により、清酒の生産量は減少傾向にある。そこで、消費者の嗜好に適した低アルコールで、飲みやすい清酒の開発が必要とされている。 Sake performs parallel double fermentation in which saccharification of koji and alcohol fermentation with yeast are performed simultaneously. As a result, sake achieves a high alcohol content of 20% or more, which is very rare as a brew. However, due to recent changes in consumers' preference for low-alcohol beverages, the production of sake has been declining. Therefore, there is a need for the development of sake that is low in alcohol and easy to drink, suitable for consumers' preference.

低アルコールの清酒としては、例えば、醸造した原酒を割水して低アルコール飲料としたものが挙げられる。しかし、原酒を割水して製造した清酒は、清酒独特の風味や、旨みが薄れてしまう。そこで、原酒を割水したとしても、清酒独特の風味が薄れることなく、濃厚芳醇な清酒（原酒）が必要となる。低アルコールの清酒に用いる原酒としては、特に爽やかな酸味を与えるリンゴ酸や、コクのある酸味を与えるコハク酸の含有量が高く、酸味と旨みとのバランスに優れていることが要求される。この目標を達成するために、これまで有機酸を多量に生産する清酒酵母の育種が行われてきた。 Examples of the low-alcohol refined sake include a low-alcohol beverage obtained by splitting the brewed raw alcohol. However, sake produced by splitting the original sake loses its unique flavor and taste. Therefore, even if the raw sake is split, a rich and refined sake (raw sake) is required without losing the unique flavor of sake. The raw alcohol used for low-alcohol sake is required to have a high content of malic acid that gives a refreshing acidity and succinic acid that gives a rich acidity, and has an excellent balance between sourness and umami. In order to achieve this goal, breeding of sake yeast producing a large amount of organic acid has been conducted so far.

特許文献１においては、ＴＣＡサイクルの中間物質である２−オキソグルタル酸に耐性を示す酵母を分離し、有機酸を高生産する酵母を取得している。 In Patent Document 1, a yeast that exhibits resistance to 2-oxoglutaric acid, which is an intermediate substance in the TCA cycle, is isolated to obtain a yeast that produces a high amount of organic acid.

特許文献２においては、ＴＣＡサイクルに関与する酵素群の発現を促進する制御遺伝子であるＨＡＰ４遺伝子を高発現させて、有機酸を高生産する遺伝子組み換え酵母を構築している。 In Patent Document 2, a genetically modified yeast that highly produces an organic acid is constructed by highly expressing the HAP4 gene, which is a control gene that promotes the expression of enzymes involved in the TCA cycle.

特許文献３においては、酵母にプロリン細胞内蓄積量を増加させることを目的として、遺伝子組換えによりプロリン合成系の酵素に変異導入を行い、プロリンだけでなく、有機酸の含量も増加させることができる遺伝子組み換え酵母を構築している。 In Patent Document 3, in order to increase the amount of proline intracellular accumulation in yeast, a mutation is introduced into an enzyme in a proline synthesis system by genetic recombination to increase not only proline but also an organic acid content. A genetically modified yeast that can be used.

特許文献４においては、変異処理することなく、従来の清酒酵母よりもリンゴ酸、コハク酸、及び乳酸を多く生産し、酢酸の生産能の低い酵母を見出している。 In Patent Document 4, a yeast that produces a greater amount of malic acid, succinic acid, and lactic acid than conventional sake yeast without mutation treatment and has a low acetic acid production ability is found.

特許文献５においては、コハク酸デヒドロゲナーゼ阻害剤であるジメチルサクシネートに感受性を示す酵母を分離し、有機酸を高生産する酵母を取得している。 In Patent Document 5, a yeast that is sensitive to dimethyl succinate, which is a succinate dehydrogenase inhibitor, is isolated to obtain a yeast that produces a high amount of organic acid.

非特許文献１においては、シクロヘキシミド耐性株を分離し、リンゴ酸を高生産する酵母を取得している。 In Non-Patent Document 1, a cycloheximide-resistant strain is isolated and a yeast that produces malic acid at a high level is obtained.

特開２００１−１０３９５８号公報JP 2001-103958 A 特開２００４−１１３００４号公報JP 2004-113004 A 特開２００７−０６０９０２号公報JP 2007-060902 A 特開２００８−０９９６２７号公報JP 2008-099627 A 特開平０３−１７５９７５号公報Japanese Patent Laid-Open No. 03-175975

吉田清、稲橋正明、中村欽一、野白喜久雄：日本醸造協会誌、第８８巻、第８号、第６４５頁（１９９３）Kiyoshi Yoshida, Masaaki Inahashi, Junichi Nakamura, Kikuo Noshiro: Journal of the Japan Brewing Association, Vol.88, No.8, p.645 (1993)

特許文献１に記載されるように、ＴＣＡサイクルの中間物質でもある２−オキソグルタル酸に耐性を示す変異株を取得する場合、または、特許文献５に記載されるように、コハク酸デヒドロゲナーゼ阻害剤であるジメチルサクシネートに感受性を示す変異株を取得する場合、メタンスルホン酸エチル（以下、ＥＭＳと称す）等の変異処理を行うのが一般的である。このような変異処理は、親株のアルコール耐性等の形質に影響を及ぼす可能性がある。また、当該文献で得られた有機酸生産株は、親株と比較して有機酸生産量は高くなっているが、低アルコールの清酒製造に使用するには十分な有機酸量ではない。従って、原酒を割水して低アルコール飲料を製造した場合、清酒独特の風味や、旨みが薄くなるといった問題がある。 As described in Patent Document 1, when obtaining a mutant strain resistant to 2-oxoglutarate, which is also an intermediate substance of the TCA cycle, or as described in Patent Document 5, a succinate dehydrogenase inhibitor is used. When obtaining a mutant strain sensitive to a certain dimethyl succinate, a mutation treatment such as ethyl methanesulfonate (hereinafter referred to as EMS) is generally performed. Such mutation treatment may affect traits such as alcohol tolerance of the parent strain. Moreover, although the organic acid production strain obtained by the said literature has high organic acid production compared with a parent strain, it is not sufficient organic acid amount to use for sake production of low alcohol. Therefore, when the low-alcohol beverage is produced by splitting the raw alcohol, there is a problem that the flavor and taste unique to sake are reduced.

特許文献２及び３は、遺伝子組換えにより有機酸の生産量を高めた酵母を構築している。しかしながら、消費者は、遺伝子組換えによる飲食物に関して非常に敏感であり、遺伝子組換え酵母を用いたアルコール飲料が、消費者に受け入れられない場合が多いといった問題がある。また、当該文献で取得された菌株もまた、低アルコールの清酒製造に使用するには有機酸の生産量が十分ではなく、原酒を割水して低アルコール飲料を製造した場合、清酒独特の風味や、旨みが薄くなるといった問題がある。 Patent Documents 2 and 3 construct a yeast in which the production amount of an organic acid is increased by gene recombination. However, consumers are very sensitive to food and drink by genetic modification, and there is a problem that alcoholic beverages using genetically modified yeast are often unacceptable to consumers. In addition, the strain obtained in this document is also not sufficient in organic acid production to be used in the production of low-alcohol sake. There is also a problem that the umami becomes thin.

特許文献４は、変異処理することなく、有機酸の生産量を高めた酵母を取得している。しかしながら、当該文献で取得された菌株もまた、低アルコールの清酒製造に使用するには有機酸の生産量が十分ではなく、原酒を割水して低アルコール飲料を製造した場合、清酒独特の風味や、旨みが薄くなるといった問題がある。 Patent Document 4 acquires yeast that has increased the production amount of organic acid without performing mutation treatment. However, the strain obtained in this document is also not sufficient in organic acid production to be used in the production of low-alcohol sake. There is also a problem that the umami becomes thin.

非特許文献１は、抗生物質であるシクロヘキシミドに耐性を備える酵母から、リンゴ酸の生産量を高めた菌株を取得している。しかしながら、当該文献で取得された菌株もまた、低アルコールの清酒製造に使用するには有機酸の生産量が十分ではなく、原酒を割水して低アルコール飲料を製造した場合、清酒独特の風味や、旨みが薄くなるといった問題がある。 Non-Patent Document 1 obtains a strain having an increased production amount of malic acid from a yeast having resistance to cycloheximide, which is an antibiotic. However, the strain obtained in this document is also not sufficient in organic acid production to be used in the production of low-alcohol sake. There is also a problem that the umami becomes thin.

このように、現状では、低アルコールの清酒製造に最適な酵母が見つかっていないため、原酒を割水しても、清酒独特の風味や旨みが薄まらない清酒（原酒）、及びその製造方法は確立されていない。本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、親株のアルコール発酵及びアルコール耐性に与える影響を低減するとともに、有機酸をさらに高生産することができる高酸型酵母、及びその育種方法を提供することを目的とする。さらに、当該高酸型酵母を用いて、清酒独特の風味や、旨みが薄まることのない低アルコール飲料及び低アルコールの清酒の製造方法を提供することを目的とする。 Thus, at present, since the optimal yeast for the production of low-alcohol sake has not been found, sake that does not diminish the flavor and taste unique to sake even when water is split, and a method for producing the same Is not established. The present invention has been made in view of the above-described problems, and reduces the influence of the parent strain on alcohol fermentation and alcohol resistance, and is capable of producing an organic acid at a higher level, and a method for breeding the same. The purpose is to provide. It is another object of the present invention to provide a low-alcohol beverage and a method for producing low-alcohol sake that do not diminish the flavor and taste unique to sake using the high acid yeast.

上記課題を解決するための本発明に係る高酸型酵母の育種方法の特徴構成は、
シクロヘキシミド耐性である清酒酵母を親株として、変異処理することなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸（以下、ＡＺＣと称す）を含有する選択培地で生育した菌株から、前記親株より多く有機酸を生産することができる酵母を選択分離することである。 The characteristic configuration of the method for breeding a high acid type yeast according to the present invention for solving the above problems is as follows.
Sake yeast that is resistant to cycloheximide is used as a parent strain, and more organic acids are produced from the strain grown on a selective medium containing L-azetidine-2-carboxylic acid (hereinafter referred to as AZC) without mutation treatment. Is to selectively isolate yeast that can.

上記説明したように、従来の有機酸を高生産する酵母は、低アルコール飲料を製造するには十分な有機酸量を生産することができなかった。この点、本構成の高酸型酵母の育種方法では、シクロヘキシミド耐性である清酒酵母を親株として、ＡＺＣを含有する選択培地で生育する菌株を選択することから、より多くの有機酸を生産することができる清酒酵母を取得することが可能となる。さらに、本構成の高酸型酵母の育種方法では、ＡＺＣを含有する選択培地で生育する菌株に対して変異処理をしていないので、親株が備えているアルコール耐性等の形質に与える影響を低減することが可能となる。 As described above, conventional yeasts that produce a high amount of organic acid were unable to produce a sufficient amount of organic acid to produce a low alcohol beverage. In this respect, in the breeding method of the high acid type yeast of this configuration, the sake yeast that is resistant to cycloheximide is used as a parent strain, and a strain that grows in a selective medium containing AZC is selected, so that more organic acids can be produced. It becomes possible to obtain sake yeast that can be used. Furthermore, in the breeding method of the high acid type yeast of this configuration, since the mutation treatment is not performed on the strain that grows on the selective medium containing AZC, the influence on the traits such as alcohol resistance of the parent strain is reduced. It becomes possible to do.

上記課題を解決するための本発明に係る高酸型酵母の育種方法の特徴構成は、
シクロヘキシミド耐性である清酒酵母を親株として、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を施した菌株から、前記親株より多く有機酸を生産することができる酵母を選択分離することである。
（ａ）ウレア非生産形質を付与する工程、
（ｂ）変異処理することなく、ＡＺＣを含有する選択培地で生育する菌株を選択する工程。 The characteristic configuration of the method for breeding a high acid type yeast according to the present invention for solving the above problems is as follows.
This is to selectively isolate yeast that can produce more organic acid than the parent strain from the strains subjected to the following steps (a) and (b), using sake yeast that is resistant to cycloheximide as the parent strain.
(A) a step of imparting a non-urea production trait,
(B) A step of selecting a strain that grows on a selective medium containing AZC without performing a mutation treatment.

本構成の高酸型酵母の育種方法によれば、さらにより多くの有機酸を生産することが可能な清酒酵母を取得することができる。なお、（ａ）の工程、及び（ｂ）の工程の順序は、どちらを先に実行しても構わない。 According to the high acid yeast breeding method of this configuration, sake yeast capable of producing even more organic acid can be obtained. In addition, whichever of the order of the process of (a) and the process of (b) may be performed first.

本発明に係る高酸型酵母の育種方法において、前記清酒酵母が協会酵母Ｎｏ．７７株であることが好ましい。 In the method for breeding a high acid type yeast according to the present invention, the sake yeast is an association yeast no. 77 strains are preferred.

本構成の高酸型酵母の育種方法では、育種に用いる親株として協会酵母Ｎｏ．７７株を用いることから、より多くの有機酸を生産することができる清酒酵母を容易に取得し得る。また、変異処理することなく、ＡＺＣを含有する選択培地で生育する菌株を選択することから、協会酵母Ｎｏ．７７株が備えているアルコール耐性等の形質に与える影響を低減することが可能となり、アルコール飲料及び清酒の製造への適応が容易となる。 In the breeding method of the high acid type yeast of this configuration, the association yeast No. 1 is used as a parent strain used for breeding. Since 77 strains are used, sake yeast capable of producing more organic acid can be easily obtained. In addition, since a strain that grows on a selective medium containing AZC is selected without being subjected to a mutation treatment, the association yeast No. 1 is selected. It becomes possible to reduce the influence on the traits such as alcohol tolerance of the 77 strain, and it becomes easy to adapt to the production of alcoholic beverages and sake.

上記課題を解決するための本発明に係る高酸型酵母の特徴構成は、上記何れかの育種方法を用いて育種された高酸型酵母である。 The characteristic configuration of the high acid type yeast according to the present invention for solving the above-mentioned problems is a high acid type yeast bred using any one of the above breeding methods.

上記説明したように、従来の有機酸を高生産する酵母は、低アルコール飲料を製造するための十分な有機酸量を生産することができなかった。この点、本構成の高酸型酵母は、上記何れかの育種方法を用いて育種された高酸型酵母であることから、より多くの有機酸を生産することができる。また、本構成の高酸型酵母は、親株を変異処理することなく、ＡＺＣを含有する選択培地で生育する菌株を選択することから、親株に由来するアルコール耐性等の形質の変化を低減することが可能である。 As explained above, conventional yeasts that produce a high amount of organic acids could not produce a sufficient amount of organic acid for producing a low alcoholic beverage. In this regard, the high acid type yeast of this configuration is a high acid type yeast bred using any one of the above breeding methods, and therefore can produce more organic acid. Moreover, since the high acid yeast of this structure selects the strain which grows in the selective medium containing AZC, without carrying out the mutation process of a parent strain, it can reduce the change of characteristics, such as alcohol tolerance derived from a parent strain. Is possible.

上記課題を解決するための本発明に係るアルコール飲料の製造方法の特徴構成は、
上記高酸型酵母を用いてアルコール飲料を製造することである。また、アルコール飲料は清酒であることが好ましい。 The characteristic configuration of the method for producing an alcoholic beverage according to the present invention for solving the above problems is as follows.
An alcoholic beverage is produced using the high acid type yeast. Moreover, it is preferable that an alcoholic beverage is sake.

上記説明したように、従来の有機酸を高生産する酵母は、低アルコール飲料（低アルコールの清酒）を製造するための十分な有機酸量を生産することができなかった。この点、本構成のアルコール飲料の製造方法は、上記高酸型酵母を用いることから、原酒を割水して低アルコール飲料を製造する場合においても、清酒独特の風味や、旨みが薄まることのないアルコール飲料を製造することが可能となる。 As explained above, conventional yeasts that produce a high amount of organic acid have not been able to produce a sufficient amount of organic acid for producing a low-alcoholic beverage (low-alcohol sake). In this respect, since the method for producing an alcoholic beverage of this configuration uses the above high acid yeast, even when producing a low alcoholic beverage by splitting the raw sake, the flavor and taste unique to sake may be diminished. It becomes possible to produce no alcoholic beverages.

図１は、本発明に係る育種に用いる親株の生育不可能なＡＺＣの濃度を示したプレート試験の写真である。FIG. 1 is a photograph of a plate test showing the concentration of non-growing AZC of a parent strain used for breeding according to the present invention. 図２は、本発明に係る高酸型酵母の発酵経過に伴う炭酸ガス減量を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the carbon dioxide loss associated with the fermentation process of the high acid yeast according to the present invention. 図３は、本発明に係る高酸型酵母の発酵試験及び官能試験に用いる試料の調製方法を説明するフローチャートである。FIG. 3 is a flowchart for explaining a method for preparing a sample used in a fermentation test and a sensory test for a high acid yeast according to the present invention.

以下、本発明に係る高酸型酵母の育種方法、該育種方法で育種された高酸型酵母、及び該高酸型酵母を用いたアルコール飲料の製造方法に関する実施形態について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施形態や図面に記載される構成に限定されることを意図しない。 Hereinafter, embodiments of a method for breeding a high acid type yeast according to the present invention, a high acid type yeast bred by the breeding method, and a method for producing an alcoholic beverage using the high acid type yeast will be specifically described below. explain. However, the present invention is not intended to be limited to the configurations described in the embodiments and drawings described below.

［高酸型酵母の育種方法］
（育種方法に用いる親株）
初めに、本明細書中に記載される「高酸型酵母」とは、本発明で用いられる親株よりも有機酸を多く生産することができる酵母を意味する。本発明の高酸型酵母の育種方法に用いる親株としては、シクロヘキシミド耐性であるサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母を好適に利用することができる。シクロヘキシミド耐性を備える清酒酵母は、公益財団法人日本醸造協会より頒布されている協会酵母Ｎｏ．７７株等を購入することにより取得することができ、清酒酵母に対して細胞融合、形質転換、及び変異処理等を行うことによりシクロヘキシミド耐性株を分離することができる。清酒酵母を変異処理する方法としては、紫外線、放射線、Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニン（ＮＴＧ）、又はＥＭＳ等を用いて清酒酵母に対して適宜変異処理を行えばよいが、好ましくはＥＭＳを用いた変異処理である。これにより、清酒酵母のシクロヘキシミド耐性株を容易に選択分離することができる。 [Breeding method of high acid yeast]
(Parent strain used for breeding method)
First, the “high acid type yeast” described in the present specification means a yeast that can produce more organic acid than the parent strain used in the present invention. As a parent strain used in the method for breeding a high acid yeast of the present invention, sake yeast belonging to Saccharomyces cerevisiae which is resistant to cycloheximide can be preferably used. Sake yeast having cycloheximide resistance is an association yeast No. distributed by the Japan Brewing Association. 77 strains and the like can be purchased, and cycloheximide-resistant strains can be isolated by subjecting sake yeast to cell fusion, transformation, mutation treatment, and the like. As a method for mutating sake yeast, a mutation treatment may be appropriately performed on sake yeast using ultraviolet rays, radiation, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), EMS, or the like. Is preferably a mutation treatment using EMS. Thereby, the cycloheximide resistant strain of sake yeast can be easily selected and separated.

シクロヘキシミド耐性株の取得方法の例としては、非特許文献１に記載されている方法に従い、親株である清酒酵母をＹＭ培地（２％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス）にて２８℃、２日間培養後、菌体を遠心分離にて集菌する。１０ｍｌの２％グルコース−０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、０．６ｍｌのＥＭＳを加えて、３０℃で、１５〜３０分変異処理した後、集菌洗浄したものを選択培地（２％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５〜１ｍｇ／Ｌシクロヘキシミド、２％寒天）に塗布し、３０℃で静置培養して生育したコロニーを選択する方法が挙げられる。 As an example of a method for obtaining a cycloheximide-resistant strain, according to the method described in Non-Patent Document 1, a sake yeast as a parent strain is treated with YM medium (2% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0 .3% malt extract) after culturing at 28 ° C. for 2 days, the cells are collected by centrifugation. After suspension in 10 ml of 2% glucose-0.2 M phosphate buffer (pH 8.0), 0.6 ml of EMS was added, and after 15-30 minutes of mutation treatment at 30 ° C., the cells were collected and washed Is applied to a selective medium (2% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5-1 mg / L cycloheximide, 2% agar) and allowed to stand at 30 ° C. A method of selecting a colony grown in culture is mentioned.

（ウレア非生産株の取得）
ウレア非生産形質を備える清酒酵母は、公益財団法人日本醸造協会より頒布されている協会酵母ＫＡｒｇ−７０１号等を購入することにより取得することができ、清酒酵母に対して細胞融合、形質転換、変異処理、及び選択培地によるポジティブセレクション等を行うことによりウレア非生産株を分離することができる。清酒酵母を変異処理する方法としては、紫外線、放射線、ＮＴＧ、又はＥＭＳ等を用いて清酒酵母に対して適宜変異処理を行えばよいが、好ましくはＥＭＳを用いた変異処理である。これにより、清酒酵母のウレア非生産株を容易に選択分離することができる。 (Acquisition of non-urea producing strain)
Sake yeast with non-urea-producing traits can be obtained by purchasing association yeast KArg-701 etc. distributed from the Japan Brewing Association, cell fusion, transformation, A non-urea-producing strain can be isolated by performing mutation treatment, positive selection using a selective medium, and the like. As a method for mutation treatment of sake yeast, the mutation treatment may be appropriately performed on sake yeast using ultraviolet rays, radiation, NTG, EMS, or the like, and mutation treatment using EMS is preferable. Thereby, the urea non-producing strain of sake yeast can be easily selected and separated.

ウレア非生産株の取得方法の例としては、日本醸造協会誌第８７巻第８号第５９８頁（１９９２）に記載されている方法に従い、親株である清酒酵母をＹＰＤ（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）培地にて３０℃で振とう培養し、対数増殖期の細胞を集菌洗浄したものをＣＡＯ培地（０．１７％イーストナイトロジェンベース（Ｎ源を含まないもの）、１０ｍｇ／Ｌカナバニン、５ｍＭオルニチン、１ｍＭアルギニン、２％グルコース、２％寒天）に４〜１０×１０^６個／プレートになるように塗布し、３０℃で培養し、生育してきたシングルコロニーのうち、Ａｒｇ培地（０．１７％イーストナイトロジェンベース（Ｎ源を含まないもの）（Ｄｉｆｃｏ社）、５ｍＭアルギニン、２％グルコース、２％寒天）に生育できず、Ｏｒｎ培地（０．１７％イーストナイトロジェンベース（Ｎ源を含まないもの）、５ｍＭオルニチン、２％グルコース、２％寒天）で生育するウレア非生産株を選択する方法が挙げられる。 As an example of a method for obtaining a non-urea-producing strain, according to the method described in Journal of the Japan Brewing Society, Vol. Polypeptone, 1% yeast extract) medium cultured at 30 ° C. with shaking, collected and washed logarithmic growth phase cells in CAO medium (0.17% yeast nitrogen base (without N source), 10 mg / L canavanine, 5 mM ornithine, 1 mM arginine, 2% glucose, 2% agar), 4-10 × 10 ⁶ cells / plate, and cultured at 30 ° C. Can grow on Arg medium (0.17% yeast nitrogen base (without N source) (Difco), 5 mM arginine, 2% glucose, 2% agar) , Orn medium (0.17% yeast nitrogen base (containing no N source), 5 mM ornithine, 2% glucose, 2% agar) method of selecting a urea unproductive grown strains are exemplified by.

（ＧＨ−１Ｒ株の取得）
協会酵母Ｎｏ．７７株（以下、ＧＨ−１株と称す）をＹＰＤ培地にて３０℃で振とう培養し、対数増殖機の細胞を集菌洗浄したものをＣＡＯ培地（０．１７％イーストナイトロジェンベース（Ｎ源を含まないもの）、１０ｍｇ／Ｌカナバニン、５ｍＭオルニチン、１ｍＭアルギニン、２％グルコース、２％寒天）に４〜１０×１０^６個／プレートになるように塗布した。当該プレートを３０℃で１０日間培養し、生育してきたシングルコロニー１０株をＡｒｇ培地及びＯｒｎ培地にレプリカし、Ａｒｇ培地で生育できずにＯｒｎ培地で生育した株のうち１株をＧＨ−１ウレア非生産株（以下、ＧＨ−１Ｒ株と称す）とした。 (Acquisition of GH-1R stock)
Association yeast no. 77 strains (hereinafter referred to as GH-1 strain) were cultured with shaking in YPD medium at 30 ° C., and cells obtained by collecting and washing the logarithmic proliferator cells were washed with CAO medium (0.17% yeast nitrogen base (N 1 mg / L canavanine, 5 mM ornithine, 1 mM arginine, 2% glucose, 2% agar) was applied at 4 to 10 × 10 ⁶ cells / plate. The plate was cultured at 30 ° C. for 10 days, 10 grown single colonies were replicated in Arg medium and Orn medium, and one of the strains that could not grow on Arg medium and grew on Orn medium was GH-1 urea. A non-producing strain (hereinafter referred to as GH-1R strain) was used.

（ＡＺＣ耐性株の取得）
以下、シクロヘキシミド耐性である清酒酵母からＡＺＣ耐性株を取得する方法について説明する。ＡＺＣ耐性株の取得に使用する親株としては、ＧＨ−１株、及びＧＨ−１Ｒ株を使用した。図１は、育種に用いる親株の生育不可能なＡＺＣの濃度を示したプレート試験の写真であり、耐性株の取得に用いる親株の生育に不可能なＡＺＣの最低濃度を検討した結果を示している。０、１００、５００、１０００ｍｇ／ＬのＡＺＣを含むＳＤプレート（２％グルコース、０．６７％イーストナイトロジェンベース（アミノ酸を含まないもの）、２％寒天）に、ＧＨ−１株、ＧＨ−１Ｒ株、協会酵母Ｋ７０１号（以下、Ｋ−７０１と称す）、及びＫ−７０１のウレア非生産株であるＫ−７０１Ｒ株をスポットした。各菌株は、段階希釈（１０倍希釈を四段）して其々のＡＺＣ濃度のＳＤプレートにスポットした。 (Acquisition of AZC resistant strain)
Hereinafter, a method for obtaining an AZC resistant strain from sake yeast that is resistant to cycloheximide will be described. As parent strains used for obtaining AZC resistant strains, GH-1 strain and GH-1R strain were used. FIG. 1 is a photograph of a plate test showing the concentration of a non-growing AZC of a parent strain used for breeding, and shows the result of examining the minimum concentration of AZC impossible for the growth of a parent strain used for obtaining a resistant strain. Yes. SD plate (2% glucose, 0.67% yeast nitrogen base (without amino acid), 2% agar) containing AZC of 0, 100, 500, 1000 mg / L was added to GH-1 strain, GH-1R. Strain, association yeast K701 (hereinafter referred to as K-701) and K-701R strain, which is a non-urea producing strain of K-701, were spotted. Each strain was serially diluted (four times 10-fold dilution) and spotted on an SD plate with each AZC concentration.

図１に示されるように、ＡＺＣ濃度５００ｍｇ／Ｌ以上で各菌株ともＡＺＣに対して感受性を示した。従って、親株の生育不可能なＡＺＣの最低濃度を５００ｍｇ／Ｌとし、以下のＡＺＣ耐性変異株の取得試験に用いた。 As shown in FIG. 1, each strain showed sensitivity to AZC at an AZC concentration of 500 mg / L or more. Therefore, the minimum concentration of AZC incapable of growing the parent strain was set to 500 mg / L, and used for the following AZC resistant mutant acquisition test.

ＡＺＣ耐性株の取得は、以下の方法による。先ず、ＧＨ−１株及びＧＨ−１Ｒ株を５ｍｌのＹＰＤ培地（２％グルコース、２％ポリペプトン、１％酵母エキス）で３日間培養後、菌体を遠心分離にて集菌し、洗浄した。１０倍に濃縮した１０^９細胞／ｍｌの酵母懸濁液１００μｌを、５００ｍｇ／ＬのＡＺＣ含有ＳＤプレートに塗布した。３０℃で約２週間インキュベーションした後、生育したコロニーをＡＺＣ耐性株として釣菌した。ＧＨ−１株より２株（ＡＺＣ０１株及びＡＺＣ０２株）、及びＧＨ−１Ｒ株より２株（ＡＺＣ０３株及びＡＺＣ０４株）の合計４株のＡＺＣ耐性株を取得した。ＡＺＣ耐性株の取得には、変異処理を行うことなく、自然誘発による方法を採用した。当該ＡＺＣ０４株は、受託番号ＦＥＲＭＰ−２２２０９として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託している。 Acquisition of an AZC resistant strain is performed by the following method. First, GH-1 strain and GH-1R strain were cultured in 5 ml of YPD medium (2% glucose, 2% polypeptone, 1% yeast extract) for 3 days, and then the cells were collected by centrifugation and washed. 100 μl of 10 ⁹ cells / ml yeast suspension concentrated 10-fold was applied to an SD plate containing 500 mg / L AZC. After incubation at 30 ° C. for about 2 weeks, the grown colonies were fished as AZC resistant strains. A total of 4 AZC-resistant strains were obtained, 2 strains from the GH-1 strain (AZC01 strain and AZC02 strain) and 2 strains from the GH-1R strain (AZC03 strain and AZC04 strain). For obtaining AZC-resistant strains, a method of natural induction was employed without performing a mutation treatment. The AZC04 strain has been deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM P-22209.

［小仕込み試験］
得られたＡＺＣ耐性株の４菌株（ＡＺＣ０１株、ＡＺＣ０２株、ＡＺＣ０３株、ＡＺＣ０４株）と、親株であるＧＨ−１株及びＧＨ−１Ｒ株とを用いて総米約２００ｇの小仕込み試験を行い、製成酒の成分、及び有機酸組成について検討した。小仕込み試験の配合量としては、掛米にはα化米（精米歩合７０％）１６０ｇ、麹米には乾燥麹４０ｇ、汲水３７０ｍｌ、乳酸５０μｌ、及び酵母添加量５×１０^９細胞で実施した。発酵温度は、１５℃の一定で行い、２２日後に上槽した。上槽液の成分の分析結果を以下の表１に示す。 [Small preparation test]
Using the obtained 4 strains of AZC resistant strains (AZC01 strain, AZC02 strain, AZC03 strain, AZC04 strain) and the parent strains GH-1 strain and GH-1R strain, a small preparation test of about 200 g of total rice was conducted. The ingredients of the sake and the organic acid composition were examined. The blending amount for the small preparation test was 160g for rice and 70% for rice, 70% dry rice for glutinous rice, 370ml pumped water, 50μl lactic acid, and 5 × 10 ⁹ yeast added. did. The fermentation temperature was constant at 15 ° C., and the upper tank was added after 22 days. The analysis results of the components of the upper tank liquid are shown in Table 1 below.

表１の結果をみると、ＡＺＣ耐性株であるＡＺＣ０１株及びＡＺＣ０２株と、当該親株であるＧＨ−１株とを比較すると、日本酒度に関してＡＺＣ耐性株は親株より何れも高い値を示し、さらに酸度に関しては親株より１．３倍〜１．４倍の高い値を示した。また、ＡＺＣ耐性株であるＡＺＣ０３株及びＡＺＣ０４株と、親株であるＧＨ−１Ｒ株とを比較すると、日本酒度に関してＡＺＣ耐性株は親株より何れも低い値を示し、さらに酸度に関しては親株より１．６倍以上の高い値を示した。各菌株の上槽液の有機酸組成の分析結果を以下の表２に示す。 Looking at the results in Table 1, when comparing the AZC01 and AZC02 strains, which are AZC resistant strains, and the GH-1 strain, which is the parent strain, the AZC resistant strains show a higher value than the parent strain in terms of the degree of sake. The acidity was 1.3 to 1.4 times higher than the parent strain. Further, when comparing the AZC03 and AZC04 strains, which are AZC resistant strains, and the GH-1R strain, which is the parent strain, the AZC resistant strains show a lower value than the parent strain in terms of sake, and the acidity is 1. It was 6 times higher. The analysis results of the organic acid composition of the upper tank solution of each strain are shown in Table 2 below.

表２に示されているように、有機酸組成に関しては、何れのＡＺＣ耐性株も親株と比較して、リンゴ酸及びコハク酸の高い生産性が確認された。ＧＨ−１株を親株とするＡＺＣ０１株及びＡＺＣ０２株の場合、リンゴ酸の生産量は、何れも２０００ｍｇ／Ｌを超え、親株であるＧＨ−１株と比較して、ＡＺＣ０１株が約１．４倍、ＡＺＣ０２株が約１．３倍のリンゴ酸を生産した。また、コハク酸の生産量においても、何れの菌株も５００ｍｇ／Ｌの生産量を超え、親株であるＧＨ−１株と比較して、ＡＺＣ０１株が約１．６倍、ＡＺＣ０２株が約１．３倍のコハク酸を生産した。 As shown in Table 2, regarding the organic acid composition, any AZC-resistant strain was confirmed to have higher productivity of malic acid and succinic acid than the parent strain. In the case of the AZC01 strain and the AZC02 strain having the GH-1 strain as a parent strain, the production amount of malic acid exceeds 2000 mg / L, and the AZC01 strain is about 1.4 in comparison with the parent strain GH-1. The AZC02 strain produced about 1.3 times as much malic acid. Moreover, also in the production amount of succinic acid, all strains exceeded the production amount of 500 mg / L, compared with the parent strain GH-1 strain, the AZC01 strain was about 1.6 times, and the AZC02 strain was about 1. Three times as much succinic acid was produced.

ウレア非生産株であるＧＨ−１Ｒ株を親株とするＡＺＣ０３株及びＡＺＣ０４株の場合は、リンゴ酸の生産量は、何れも４５００ｍｇ／Ｌを超えており、親株であるＧＨ−１Ｒ株と比較して、ＡＺＣ０３株が約１．８倍、ＡＺＣ０２株が約１．７倍のリンゴ酸を生産した。また、コハク酸の生産量においても、何れの菌株も１４００ｍｇ／Ｌを超え、親株であるＧＨ−１Ｒ株と比較して、ＡＺＣ０３株が約１．３倍、ＡＺＣ０４株が約１．４倍のコハク酸を生産した。清酒の中に含まれる有機酸の中で、リンゴ酸は爽やかな酸味を、コハク酸はコクのある酸味を与えるものとして非常に重要な有機酸である。つまり、ＧＨ−１株及びＧＨ−１Ｒ株の親株から得られたＡＺＣ０１株〜ＡＺＣ０４株の全ての菌株は、高酸型酵母であるだけでなく、その有機酸組成に関しても清酒に独特な風味を与えることができることが示された。 In the case of the AZC03 and AZC04 strains whose parent strain is the GH-1R strain, which is a non-urea-producing strain, the amount of malic acid produced exceeds 4500 mg / L, compared with the parent strain GH-1R. Thus, the AZC03 strain produced about 1.8 times the malic acid, and the AZC02 strain produced about 1.7 times the malic acid. In addition, in the production amount of succinic acid, all strains exceeded 1400 mg / L, and the AZC03 strain was about 1.3 times and the AZC04 strain was about 1.4 times compared with the parental GH-1R strain. Succinic acid was produced. Among organic acids contained in sake, malic acid is a very important organic acid that gives a refreshing acidity and succinic acid gives a rich acidity. In other words, all the strains AZC01 to AZC04 obtained from the parent strains of the GH-1 and GH-1R strains are not only high acid type yeasts, but also have a unique flavor to sake with respect to their organic acid composition. It was shown that you can give.

ここで、ＡＺＣ耐性の４菌株の発酵能力を検証する。図２は、高酸型酵母の発酵経過に伴う炭酸ガス減量を示すグラフであり、得られたＡＺＣ耐性の４菌株及び当該菌株の親株であるＧＨ−１株及びＧＨ−１Ｒ株の発酵経過に伴う炭酸ガス減量が示されている。図２からも明らかなように、ＧＨ−１株を親株とするＡＺＣ耐性であるＡＺＣ０１株及びＡＺＣ０２株の炭酸ガス減量の経過は、親株と比較して、炭酸ガス減量における差異は認められなかった。従って、ＡＺＣ０１株及びＡＺＣ０２株は、清酒の製造に十分利用できる酵母であることが認められた。しかし、ＧＨ−１Ｒ株を親株とするＡＺＣ耐性を備えるＡＺＣ０３株及びＡＺＣ０４株の炭酸ガス減量の経過は、親株と比較して発酵速度が遅いことが分かった。 Here, the fermentation ability of four strains resistant to AZC is verified. FIG. 2 is a graph showing the carbon dioxide loss associated with the fermentation process of high acid yeast. The fermentation process of the obtained AZC-resistant 4 strains and the parental strains GH-1 and GH-1R of the strains. The accompanying carbon dioxide loss is shown. As is clear from FIG. 2, the AZC-resistant AZC01 and AZC02 strains with GH-1 as the parent strain did not show any difference in carbon dioxide loss compared to the parent strain. . Therefore, it was confirmed that the AZC01 strain and the AZC02 strain are yeasts that can be sufficiently used for the production of sake. However, it was found that the fermentation rate of the AZC03 strain and the AZC04 strain having AZC resistance with the GH-1R strain as the parent strain was slower than that of the parent strain.

［シクロヘキシミド耐性を有さない親株から取得したＡＺＣ耐性株による有機酸生産］
シクロヘキシミド耐性を有さない清酒酵母から取得されるＡＺＣ耐性株と、シクロヘキシミド耐性を備えるＧＨ−１株及びＧＨ−１Ｒ株から得られたＡＺＣ耐性であるＡＺＣ０１株〜ＡＺＣ０４株の菌株との有機酸の生産量について検討した。 [Organic acid production by AZC-resistant strains obtained from parent strains that do not have cycloheximide resistance]
AZC resistant strain obtained from sake yeast not having cycloheximide resistance and AZC01 strain to AZC04 strain having AZC resistance obtained from GH-1 strain and GH-1R strain having cycloheximide resistance The production volume was examined.

（Ｋ−９０１ＨＲ株の取得）
協会酵母Ｋ９０１を親株として、特許文献５記載の方法に従い、Ｋ９０１株をＹＭ培地で一日培養した後、菌体を集菌、洗浄した。この洗浄菌体に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）５ｍｌ、４０％グルコース液０．２５ｍｌ、ＥＭＳ０．２５ｍｌを加え、３０℃で１時間ゆっくり撹拌した後、菌体を滅菌水で洗浄し、ＹＭ寒天培地に塗布して３０℃、３日間培養してコロニーを形成させた。このコロニーをＹＭ寒天培地及び１．５％ジメチルサクシネートを含むＹＭ寒天培地に移して、３０℃で培養し、ジメチルサクシネートを含むＹＭ寒天培地で生育できなかった株を選択し、Ｋ−９０１Ｈ株とした。Ｋ−９０１Ｈ株をＹＰＤ培地にて３０℃で振とう培養し、対数増殖期の細胞を集菌洗浄したものをＣＡＯ培地（０．１７％イーストナイトロジェンベース（Ｎ源を含まないもの）、１０ｍｇ／Ｌカナバニン、５ｍＭオルニチン、１ｍＭアルギニン、２％グルコース、２％寒天）に４〜１０×１０^６個／プレートになるように塗布した。当該プレートを３０℃で１０日間培養し、生育してきたシングルコロニー１０株をＡｒｇ培地及びＯｒｎ培地にレプリカし、Ａｒｇ培地で生育できずにＯｒｎ培地で生育した株のうち１株をＫ−９０１Ｈウレア非生産株（以下、Ｋ−９０１ＨＲ株と称す）とした。
シクロヘキシミド耐性を有さないＫ−７０１株及びＫ−９０１ＨＲ株を用いて上記と同様の操作を行い、其々のＡＺＣ耐性株を取得した。これにより、Ｋ−７０１株より１３株、及びＫ−９０１ＨＲ株より１１株の合計２４株のＡＺＣ耐性株を取得した。 (Acquisition of K-901HR stock)
According to the method described in Patent Document 5, with the association yeast K901 as a parent strain, the K901 strain was cultured in a YM medium for one day, and then the cells were collected and washed. To this washed cell, 5 ml of 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0), 0.25 ml of 40% glucose solution, and 0.25 ml of EMS were added, and after slowly stirring at 30 ° C. for 1 hour, the cell was washed with sterile water. Then, it was applied to a YM agar medium and cultured at 30 ° C. for 3 days to form colonies. This colony was transferred to a YM agar medium containing YM agar medium and 1.5% dimethyl succinate, cultured at 30 ° C., and a strain that could not grow on the YM agar medium containing dimethyl succinate was selected, and K-901H It was a stock. K-901H strain was cultured with shaking in YPD medium at 30 ° C., and logarithmically growing cells were collected and washed with CAO medium (0.17% yeast nitrogen base (without N source), 10 mg / L canavanine, 5 mM ornithine, 1 mM arginine, 2% glucose, 2% agar) to 4 to 10 × 10 ⁶ cells / plate. The plate was cultured at 30 ° C. for 10 days, 10 grown single colonies were replicated in Arg medium and Orn medium, and one of the strains that could not grow on Arg medium and grew on Orn medium was K-901H urea. A non-producing strain (hereinafter referred to as K-901HR strain) was used.
Using the K-701 strain and K-901HR strain that do not have cycloheximide resistance, the same operation as described above was performed to obtain respective AZC resistant strains. Thereby, a total of 24 AZC resistant strains, 13 strains from the K-701 strain and 11 strains from the K-901HR strain, were obtained.

シクロヘキシミド耐性を有さない清酒酵母であるＫ−７０１株及びＫ−９０１ＨＲ株から得られたＡＺＣ耐性を備える２４菌株と、其々の親株とを用いて総米約１００ｇの小仕込み試験を行い、製成酒の成分について分析した。 Perform a small preparation test of about 100 g of total rice using 24 strains with AZC resistance obtained from K-701 strain and K-901HR strain, which are sake yeasts not having cycloheximide resistance, and their parent strains, The ingredients of the sake were analyzed.

小仕込み試験の配合量としては、掛米にはα化米（精米歩合７０％）７２ｇ、麹米には乾燥麹１８ｇ、汲水１８２ｍｌ、乳酸１５μｌ、及び酵母添加量２×１０^９細胞で実施した。発酵温度は、１５℃の一定で行い、１５日後に上槽して、上槽液の成分を分析した。この結果、シクロヘキシミド耐性を有さない親株であるＫ−７０１株及びＫ−９０１ＨＲ株から得られたＡＺＣ耐性の全ての菌株が、其々の親株より酸度の値が低いか、あるいは同等の値しか示さなかった（データ示さず）。上記結果からは、高酸型酵母の育種としては、親株である清酒酵母にＡＺＣ耐性を付与するだけでは、高酸型酵母を取得するには十分ではなく、親株がシクロヘキシミド耐性を備えていることが必要であることが明確となった。 As for the compounding amount of the small preparation test, 72 g of starched rice (70% polished rice ratio) is used for rice, 18 g of dried rice, 182 ml of pumped water, 15 μl of lactic acid, and 2 × 10 ⁹ cells added to yeast. did. The fermentation temperature was kept constant at 15 ° C., and the upper tank was added after 15 days to analyze the components of the upper tank liquid. As a result, all of the AZC resistant strains obtained from the K-701 and K-901HR strains, which are parent strains not having cycloheximide resistance, have lower acidity values than their parent strains, or only equivalent values. Not shown (data not shown). From the above results, for breeding of high acid type yeast, it is not sufficient to obtain high acid type yeast simply by conferring AZC resistance to sake yeast, which is the parent strain, and that the parent strain has cycloheximide resistance. It became clear that is necessary.

［試験醸造］
得られた高酸型酵母であるＡＺＣ０４株を用いて清酒の試験醸造を行い、製造された原酒を低アルコールの清酒に調整し、官能試験を実施した。試験醸造には、高酸型酵母であるＡＺＣ０４株と比較するために、ＡＺＣ０４株の親株であるＧＨ−１Ｒ株及びジメチルサクシネート感受性、ウレア非生産株であるＫ−９０１ＨＲ株を用いて行った。 [Test brewing]
Using the obtained high acid type yeast AZC04 strain, sake brewing was conducted, and the raw alcohol produced was adjusted to low alcohol sake, and a sensory test was conducted. The test brewing was performed using the GH-1R strain, which is the parent strain of the AZC04 strain, and the K-901HR strain, which is a dimethyl succinate sensitive, non-urea producing strain, for comparison with the AZC04 strain, which is a high acid type yeast. .

試験醸造の配合量は、以下の表３及び表４に示すとおりである。表３はＡＺＣ０４株の醸造の仕込み配合量であり、表４はＧＨ−１Ｒ株及びＫ−９０１ＨＲ株の仕込み配合量である。 The blending amounts of test brewing are as shown in Tables 3 and 4 below. Table 3 shows the amount of AZC04 strain brewed, and Table 4 shows the amount of GH-1R and K-901HR.

この試験醸造では、掛米には精米歩合７８％の米を使用し、麹米には乾燥麹（精米歩合７２％）を用いた。酒母には乳酸０．１ｍｌを添加し、酵母の添加量としては、酵母密度が約１×１０^７細胞／ｍｌとなるように添加した。発酵温度は、酒母が２０℃で、主発酵を１５℃の一定で行った。留添後、１５日目で上槽した。ＡＺＣ０４株による醸造は、発酵終了時点でグルコース濃度が高かったため、四段添加を行わなかった。 In this test brewing, rice with a rice polishing rate of 78% was used for the rice and dried rice (72% with the rice polishing rate) was used for the rice. To the liquor, 0.1 ml of lactic acid was added, and the yeast was added so that the yeast density was about 1 × 10 ⁷ cells / ml. The fermentation temperature was 20 ° C. for the sake mother and 15 ° C. for the main fermentation. After the distillation, the tank was placed on the 15th day. In the brewing using the AZC04 strain, the glucose concentration was high at the end of the fermentation, and thus the four-stage addition was not performed.

この試験醸造では、掛米には精米歩合７８％の米を使用し、麹米には乾燥麹（精米歩合７２％）を用いた。酒母には乳酸０．１ｍｌを添加し、酵母の添加量としては、酵母密度が約１×１０^７細胞／ｍｌとなるように添加した。発酵温度は、酒母が２０℃で、主発酵を１５℃の一定で行った。ＧＨ−１Ｒ株及びＫ−９０１ＨＲ株による醸造においては、蒸米糖化四段を添加している。留添後、１５日目で四段添加し、四段添加後、５日目で上槽した。 In this test brewing, rice with a rice polishing rate of 78% was used for the rice and dried rice (72% with the rice polishing rate) was used for the rice. To the liquor, 0.1 ml of lactic acid was added, and the yeast was added so that the yeast density was about 1 × 10 ⁷ cells / ml. The fermentation temperature was 20 ° C. for the sake mother and 15 ° C. for the main fermentation. In brewing with the GH-1R strain and the K-901HR strain, four stages of steamed rice saccharification are added. After the distillation, four stages were added on the 15th day, and the upper tank was added on the fifth day after the fourth stage addition.

［原酒の成分分析］
図３は、高酸型酵母の発酵試験及び官能試験に用いる試料の調製方法を説明するフローチャートであり、試験醸造後の原酒製造の流れと、官能試験に用いる低アルコール清酒を原酒から調製する流れとを示している。先ず、原酒製造の流れを以下に説明する。試験醸造した其々の醪を上槽し（ステップ１）、１５℃の一定で３〜４日間、後発酵を行う（ステップ２）。後発酵による熟成後、生酒を濾過し（ステップ３）、６７℃を最高温度とするビン燗殺菌による火入れを行い（ステップ４）、１５℃で原酒（アルコール度数：約１５％）として貯蔵した（ステップ５）。原酒は、成分分析及び低アルコール清酒の試験に使用した。其々の菌株を用いた原酒の成分分析結果を表５に、其々の菌株の有機酸組成を表６に示した。さらに、表７には、ＡＺＣ０４株、ＧＨ−１Ｒ株、及びＫ−９０１ＨＲ株を用いて醸造した清酒の生産性を示した。 [Component analysis of raw sake]
FIG. 3 is a flowchart for explaining a method for preparing a sample used for a fermentation test and a sensory test of a high acid type yeast, and a flow of raw alcohol production after test brewing and a flow of preparing low alcohol sake used for a sensory test from the raw sake. It shows. First, the flow of raw alcohol production will be described below. Each test-brewed koji is placed in an upper tank (step 1), and post-fermentation is performed at a constant 15 ° C. for 3 to 4 days (step 2). After aging by post-fermentation, fresh sake was filtered (step 3), fired by bottled rice paste sterilization with a maximum temperature of 67 ° C. (step 4), and stored at 15 ° C. as raw sake (alcohol content: about 15%) ( Step 5). The raw sake was used for the component analysis and the low alcohol sake test. Table 5 shows the component analysis results of the original sake using each strain, and Table 6 shows the organic acid composition of each strain. Further, Table 7 shows the productivity of sake brewed using the AZC04 strain, the GH-1R strain, and the K-901HR strain.

表５に示されるように、ＡＺＣ０４株、ＧＨ−１Ｒ株、及びＫ−９０１ＨＲ株の何れで仕込んだ清酒においても日本酒度と、アルコール度数に関しては略同等の値であったが、酸度に関しては、ＡＺＣ０４株が、ＧＨ−１Ｒ株の約１．９倍、Ｋ−９０１ＨＲ株の約２．７倍の値を示した。 As shown in Table 5, the sake content and the alcohol content in the sake prepared with any of the AZC04 strain, the GH-1R strain, and the K-901HR strain were substantially equivalent values. The AZC04 strain showed a value about 1.9 times that of the GH-1R strain and about 2.7 times that of the K-901HR strain.

表６に示されるように、ＡＺＣ０４株で仕込んだ清酒はリンゴ酸の濃度が非常に高く、ＧＨ−１Ｒ株の約１．９倍のリンゴ酸を生産し、Ｋ−９０１ＨＲ株との比較に至っては、約４．５倍ものリンゴ酸の生産量となった。ＡＺＣ０４株は、コハク酸の生産量も多く、ＧＨ−１Ｒ株の約１．４倍のコハク酸を生産した。 As shown in Table 6, the sake prepared with the AZC04 strain has a very high malic acid concentration, producing about 1.9 times the malic acid of the GH-1R strain, leading to a comparison with the K-901HR strain. Produced approximately 4.5 times the production of malic acid. The AZC04 strain produced a large amount of succinic acid and produced about 1.4 times as much succinic acid as the GH-1R strain.

表７に示されるように、ＡＺＣ０４株、ＧＨ−１Ｒ株、及びＫ−９０１ＨＲ株の何れで仕込んだ清酒においても、使用した白米に対する製成清酒の割合である酒化率は、略同等の値を示した。従って、ＡＺＣ０４株は、一般の醸造に用いても十分に実用性のある酵母であることが示された。また、他の高酸型酵母であるＡＺＣ０１株〜ＡＺＣ０３株に関しても、親株に対して略同等の生産性を示した（データ示さず）。 As shown in Table 7, in the sake prepared with any of the AZC04 strain, the GH-1R strain, and the K-901HR strain, the liquefaction rate, which is the ratio of the produced sake to the white rice used, is an approximately equivalent value. showed that. Therefore, the AZC04 strain was shown to be a sufficiently practical yeast even when used for general brewing. Further, other high acid type yeasts AZC01 to AZC03 also showed substantially the same productivity as the parent strain (data not shown).

［低アルコール清酒の官能試験］
図３に示されるように、ＡＺＣ０４株、ＧＨ−１Ｒ株、及びＫ−９０１ＨＲ株で醸造したアルコール度数約１５％の原酒を、割水（ステップ６）によりアルコール度数を１０．９％に調整して、低アルコール清酒として官能試験に供した。アルコール度数７．５％の試験では、活性炭処理（ステップ７）、濾過（ステップ８）、割水（ステップ９）を行ったものについて低アルコール清酒として官能試験を実施した。 [Sensory test of low alcohol sake]
As shown in FIG. 3, the alcohol content of about 15% alcohol brewed with the AZC04, GH-1R, and K-901HR strains was adjusted to 10.9% by split water (step 6). Then, it was subjected to a sensory test as a low alcohol sake. In the test with an alcohol content of 7.5%, a sensory test was carried out as a low alcohol sake for those subjected to activated carbon treatment (step 7), filtration (step 8), and water splitting (step 9).

アルコール度数１０．９％の試験では、ＡＺＣ０４株、ＧＨ−１Ｒ株、及びＫ−９０１ＨＲ株を割水してアルコール度数を１０．９％としたサンプルの他に、月桂冠社製純米原酒、Ａ社製純米酒、Ｂ社製全麹清酒を割水してアルコール度数を約１０．９％としたサンプルも使用した。官能試験は、３点法で嗜好（好い：３点、普通：２点、嫌い：１点）及びアルコール度数（高い：３点、適度：２点、低い：１点）について実施し、６人のパネラーの平均値を示した。以下の表８に、各試験清酒の成分分析結果及び官能試験結果を示す。 In the test with an alcohol content of 10.9%, AZC04 strain, GH-1R strain, and K-901HR strain were watered and the alcohol content was 10.9%. A sample was also used in which pure rice sake manufactured by company B and all-boiled sake manufactured by company B were split to give an alcohol content of about 10.9%. The sensory test was conducted on taste (preferred: 3 points, normal: 2 points, disliked: 1 point) and alcohol content (high: 3 points, moderate: 2 points, low: 1 point) by a 3 point method, 6 people The average value of the panelists was shown. Table 8 below shows the component analysis results and sensory test results of each test sake.

表８に示されるように、各サンプルをアルコール度数が１０．９％となるように割水した。酸度は、ＡＺＣ０４株が高く、他のサンプルと比較すると、ＡＺＣ０４株の親株であるＧＨ−１Ｒ株に対して約１．８倍の値を示し、それ以外のサンプルに対しては、２．８〜４．１倍の値を示した。
官能試験に関しては、ＡＺＣ０４株の嗜好の数値は１．８であり、月桂冠社製純米原酒、及びＢ社製全麹清酒より高い値となった。一方、アルコール度数の数値は２．５であり、他の全てのサンプルと比較して高い値を示した。当該試験におけるパネラーのＡＺＣ０４株の評価としては、薄さを感じさせず、強い酸味と、味に力強さが感じられたとの評価が得られた。ＡＺＣ０４株は酸味が強いため、パネラーの嗜好に若干の違いが出たが、全体的には、味に力強さが感じられ、アルコール度数が１０．９％の清酒は低アルコール清酒として十分に利用できる結果となった。 As shown in Table 8, each sample was split with water so that the alcohol content was 10.9%. The acidity is high in the AZC04 strain, which is about 1.8 times the value of the GH-1R strain, which is the parent strain of the AZC04 strain, compared to the other samples, and 2.8 for the other samples. A value of ˜4.1 times was shown.
Regarding the sensory test, the preference value of the AZC04 strain was 1.8, which was higher than that of pure rice original sake manufactured by Laurel Wreath Company and all-boiled sake manufactured by Company B. On the other hand, the numerical value of alcohol content is 2.5, which is higher than all other samples. As an evaluation of the panel AZC04 strain in the test, evaluation was made that a strong acidity and a strong taste were felt without feeling thinness. Since the AZC04 strain has a strong acidity, there was a slight difference in the taste of the panelists. On the whole, sake with a strong alcohol content of 10.9% is sufficiently used as a low-alcohol sake. Results were available.

アルコール度数１０．９％での官能試験の結果から、ＡＺＣ０４株で醸造した清酒は、さらに低アルコールであっても十分清酒として製造できる可能性が示唆された。従って、アルコール度数を７．５％に調整して、再度評価を行った。
アルコール度数７．５％の調整は、ＡＺＣ０４株、ＧＨ−１Ｒ株、及びＫ−９０１ＨＲ株を割水してアルコール度数を７．５％とした。ここで、ＡＺＣ０４株を用いたサンプルについては、清酒タイプ及びにごりタイプの２種類を使用した。にごりタイプのサンプルは、醪の一部を遠心分離せず、ミキサーで粉砕後、荒濾しして火入れを行った。官能試験では、７人のパネラーが低アルコール清酒として最適なものを各自選択し、投票した。以下の表９に、各試験清酒の成分分析結果及び官能試験結果を示す。 From the results of the sensory test at an alcohol content of 10.9%, it was suggested that the sake brewed with the AZC04 strain could be produced as a sufficiently refined sake even if it had a lower alcohol content. Therefore, the alcohol content was adjusted to 7.5% and evaluated again.
The adjustment of the alcohol content of 7.5% was performed by splitting the AZC04 strain, the GH-1R strain, and the K-901HR strain so that the alcohol content was 7.5%. Here, about the sample using AZC04 stock, two kinds, sake type and nigari type, were used. In the nigari type sample, a part of the cocoon was not centrifuged, pulverized with a mixer, then roughly filtered and fired. In the sensory test, seven panelists selected and voted for the best low-alcohol sake. Table 9 below shows the component analysis results and sensory test results of each test sake.

表９に示されるように、各サンプルをアルコール度数が７．５％となるように割水した。酸度は、清酒タイプ及びにごりタイプの何れのＡＺＣ０４株も高い値を示した。他のサンプルと比較すると、ＡＺＣ０４株の親株であるＧＨ−１Ｒ株に対して約１．８倍の値を示し、Ｋ−９０１ＨＲ株に対しては約２．８倍の値を示した。
官能試験では、７人のパネラーの内４人がＡＺＣ０４株を用いて醸造した清酒タイプのサンプルを選択した。当該パネラーの評価としては、ＡＺＣ０４株の清酒タイプは、酸味及びコクが強く、どっしりとした感じがあるとの評価を得た。この結果から、ＡＺＣ０４株で醸造した清酒は、割水によりさらに低アルコール化しても、清酒としての商品価値は十分にあると判断し、アルコール度数５％と、アルコール度数３％においても同様の官能試験を行った。この結果、アルコール度数５％では、低アルコール清酒として十分に利用できる結果となり、アルコール度数３％においても、若干味が薄まる傾向が見られたが、低アルコール清酒として利用できる結果となった（データ示さず）。 As shown in Table 9, each sample was split with water so that the alcohol content was 7.5%. The acidity showed a high value for both sake type and nigari type AZC04 strains. Compared to other samples, the value was about 1.8 times that of the GH-1R strain, which is the parent strain of the AZC04 strain, and about 2.8 times that of the K-901HR strain.
In the sensory test, a sample of sake type brewed by 4 out of 7 panelists using AZC04 strain was selected. As the panelist's evaluation, the sake type of the AZC04 strain had a strong acidity and richness and was evaluated as having a solid feeling. From these results, it was determined that the sake brewed with AZC04 strain had sufficient commercial value as a sake even if the alcohol was further reduced by split water, and the same functionality was obtained even at 5% alcohol content and 3% alcohol content. A test was conducted. As a result, when the alcohol content was 5%, the alcohol was sufficiently used as a low alcohol sake, and even when the alcohol content was 3%, the taste tended to be slightly reduced, but the alcohol was used as a low alcohol sake (data). Not shown).

本発明に係る高酸型酵母の育種方法、該育種方法で育種された高酸型酵母、及び該高酸型酵母を用いたアルコール飲料の製造方法は、有機酸を大量に生成する酵母の育種、並びに該酵母を用いた低アルコールの飲料及び低アルコールの清酒の製造に利用することができる。 The method for breeding a high acid type yeast according to the present invention, the high acid type yeast bred by the breeding method, and the method for producing an alcoholic beverage using the high acid type yeast include the breeding of a yeast that produces a large amount of an organic acid. , And a low alcohol beverage and a low alcohol sake using the yeast.

Claims

シクロヘキシミド耐性である清酒酵母を親株として、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を施した菌株から、前記親株より多く有機酸を生産することができる酵母を選択分離し、
前記清酒酵母が協会酵母Ｎｏ．７７であることを特徴とする高酸型酵母の育種方法。
（ａ）ウレア非生産形質を付与する工程、
（ｂ）変異処理することなく、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含有する選択培地で生育する菌株を選択する工程。 Sake yeast that is resistant to cycloheximide is used as the parent strain, and the yeast that can produce more organic acid than the parent strain is selectively separated from the strain subjected to the following steps (a) and (b) .
The sake yeast is an association yeast No. 77. A method for breeding a high acid type yeast, wherein the method is 77 .
(A) a step of imparting a non-urea production trait,
(B) A step of selecting a strain that grows on a selective medium containing L-azetidine-2-carboxylic acid without performing a mutation treatment.

請求項１に記載の高酸型酵母の育種方法で育種した高酸型酵母を用いてアルコール発酵させることを特徴とするアルコール飲料の製造方法。 A method for producing an alcoholic beverage, comprising subjecting an alcoholic fermentation to a high acid type yeast bred by the high acid type yeast breeding method according to claim 1 .

前記アルコール飲料が清酒であることを特徴とする請求項２に記載のアルコール飲料の製造方法。
The method for producing an alcoholic beverage according to claim 2 , wherein the alcoholic beverage is sake.