JPH07505639A - 自己構築ポリヌクレオチド送達システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己構築ポリヌクレオチド送達システム技術分野 本発明は、オリゴヌクレオチド送達及び遺伝子治療の分野にある。特に、本発明 は、自己積築（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌ　ｉｎｇ）ポリヌクレオチド送達シス テムであって、これには、ポリヌクレオチドの所望のアドレス（所在地）への送 達を補助し、該ポリヌクレオチ！・と非共役結合を介して結合される成分が含ま れる。本システムの成分には、ＤＮＡマスキング（遮蔽）成分、細胞認識成分、 電荷中性化及び膜透過化部ｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）成分並びに、準細 胞（ｓｕｂｃｅｌ　１ｕｅｒ）局在性成分が含まれる。

背景技術 嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、生命に危険な遺伝子疾患であり、塩素輸送における異 花によって特ｉｆｌ！１１けられる（マクファーソン（λ１ｃＰｈｅｒｓｏｎ） 　＆トーナー（Ｄｏｒｎｅｒ）、１９９１Ｂ）。この疾患の遺伝子座は、嚢胞性 繊維症膜通過コンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）をコートする遺伝子における 変異に対して追跡された。Ｊ、　Ｒ，りオルダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）ら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　（１９８９）２４５：１０６６−１０７３　；　Ｂ、ケレン（Ｋｅｒ ｅｍ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４５：１０７３−１０８０．欠陥 ＣＦＴＲの相補又は置換によって基本的な遺伝子の欠陥を修正することは、ＣＦ に対する究極の治療法である。遺伝子治療は、遺伝子のｉｎ　ｖｉν０送達及び 発現であり、欠陥遺伝子を置換するために用いることかできる、急速に発達した 科学である。

遺伝子治療は、既に実行可能である。Ｔ、フリートマン（Ｆｒｉｅｄｍａ曲）　 、５ｃｉｅｎｃｅ、　（１９８９）　２４４：１２７５−１２８１　：　Ｍ、ブ ルースト−ン（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ）　、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、（１９X ２）　ＩＯ：ｌ３２−１３４゜ポリヌクレオチドの送達のためのシステムとポリ マーは、当該技術分野において既知である。ＰＬ、フエルナ−（Ｆｅｌｇｎｅｔ ）　、Ａｄｖ、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖ、、　（１９９０）　５： ｌ６３−１８７゜アデノウィルスベクターは、ｉｎ　ｖｉｖｏでコットンラソｈ （ｃｏｔｔｏｎ　ｒａｔ）の肺へＣＦＴＲを輸送するために用いられた。Ｍ、　 Ａ、　ローセンフェルト（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら、Ｃｅ１１．（１９９２）　 ６８：１４３−１５５゜ｉｎ　ｖｉｖｏでの高しルベルのトランスフェクション がアデノウィルスベクターによって報告されている一方で、非ウィルス性の送達 システムは多くの利点を有し、精力的に開発されるべきである。ローセンフェル トら、前述；Ｍ、Ａ、ローセンフェルトら、５ｃｉｅｎｃｅ。

（＋９９１）２５２：４３１−４３４゜過去１０年の間に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏに おける哺乳類細胞へ機能性遺伝子を導入するために、多くの方法が開発されてき た。これらの技術は、標的細胞を体内から摘出し処理して、トランスフェクトさ れた細胞を増幅し、その後、当該患者に戻すことかできるならば、遺伝子治療に 適用される。この選択は、ＣＦ患者には不可能である。現在、最高のｉｎ　ｖｉ ｖｏ　トランスフェクション効率は、レトロウィルス（ブルー刈・−ン、前述） 及びアデノウィルス（ローセンフェルトら、前述）によってもたらされる。しか し、この効率は変動し、ウィルスを基礎とする遺伝子送達がウィルス感染又は癌 を引起し得ることが考えられる。最初のヒトに対する臨床的な試行は、レトロウ ィルスベクターの急性合併症を伴わなかったが、長期の合併症の可能性が、患者 の十分なモニタリングを要求する。Ｋ、コルネッタ（Ｃｏｒｎｅｔｔａ）ら、　 Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ、、（１９９１）　２：３−１４゜遺伝子Ｔｏ 療用のプラスミドＤＮＡコンストラクトの使用におけるウィルス主体ヘクターの 使用の危険性及び概念的な利益（Ｐ、Ｌ、フェルナーら、Ｎａｔｕｒｅ、　（１ ９９１）３４９：３５１−３５２において論しられている）は、遺伝子輸送のた めの多くの生理学的及び化学的な方法の開発を平行して引き起こしている。最も 熱心に研究されたシステムは、細胞をリン酸カルシウム又はカチオン性促進剤で 処理することに関連している（フエルナーら、前述）。他の一般的な方法は、膜 の生理的な穿孔中ｉ：　Ｄ　Ｎ　Ａを注入すること（Ｍ、　Ｒ，キャベツチ（Ｃ ａｐｅｃｃｈｉ）、Ｃｅ１１．　（１９８０）　２２：４７９−４８５）又は、 細胞膜の透過化若しくは剥離の間の能動的な取込み（フエルナーら、前述）に関 連している。それぞれの方法は、本質的に積極的でありｉｎ　ｖｉけ０において のみ適用可能である。

本発明は、ウィルスビヒクルを使用せずに行う直接的な遺伝子送達の分野にある 。遺伝子送達のための非ウィルスキャリアは、多くの障壁を克服することができ なけ第１はならない。即ち、循環系において残らなければならず、選択された細 胞を標的とすることができなければならず、ＤＮＡを細胞質へ導入することがで きなれはならず、ＤＮＡを核へ輸送できなければならない。

マスキング　ｉｎ　ｖｉｖｏで遺伝子を直接送達することについての懸念は、望 ましい細胞の目的地に達するために十分長い、循環系におけるポリヌクレオチド の咬ａｈヒである。“マスキング、即ち、ポリヌクレオチドの保護は、この懸念 を処理するひとつのやり方である。

微粒子状物質（例えば赤血球ゴースト、再構築ウィルスエンベロープ及びリポソ ーム）は、遺伝子輸送における保護として一部用いられている。Ｃ，ニコラウ（ ＮｉＣＯｌａｕ）ら、Ｃｒ１ＬＲｅｖ、Ｔｈｅｒ、Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒ、Ｓｙｓ 、、（＋９８９）　６：２３９−２７１　；　Ｒ，Ｊ、　V 二オ（Ｍａｎｎｉｏ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（＋９８８）　６：６ ８２−６９００最も成果を挙げているリポノーム系は、カチオン性脂質試薬であ るジオレイルオキシトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を用いる。Ｐ、　Ｌ 、　フエルナーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。

（１９８７’）　８４ニア４１３−７４１７゜ＤＯＴＭＡは、ホスファチジルエ タノールアミン（ＰＥ）と混合して、試薬、リボフエクチン（商品名）を形成す る。リボフェクチン（商品名、以下省略）を用いることの利点は、カチオン性リ ポソームが簡単にＤＮＡと混合して、細胞へ添加されることである。ＤＮＡをリ ポソームの内部へカチオ７性試Ｊ５によって被包化する必要はない。リポフエク チンは、培養系においてリポータ−遺伝子をヒト肺上皮細胞へ輸送すること（Ｌ 、ルー（Ｌｕ）ら、Ｐｆｕｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ、、（１９８９’）　４１５：１ ９８−２０３）　、気管内経路によってラットへＣＡＴ遺伝子を導入すること（ Ｔ　Ａ　ハジンスキ（Ｈａｚｉｎｓｋｉ）ら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　 Ｃｅｌ　１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、　（１９X１） ４１２０６−２０９）、並びに、気管内及び静脈内経路によってマウスへＣＡＴ 遺伝子を導入すること（Ｋ、Ｌ　）′リガム（Ｂｒｉｇｈａｍ）ら、Ａｍ、Ｊ、 λｌｅｄ、　Ｓｃｉ、　、　（＋９８９）　２９８：２７８−２８］　：　Ａ　 ホウ（Ｂｏｕｔ’）ら、”Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１９９１　Ｃｙ ｓｔｉｃ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ　Ｃｏｎｆｅｒ■獅モ■h、 要約、第８７、（＋９９１））に用いられている。約５０％の気道上皮細胞が、 βガラクトノダーセリポーター遺伝子を一時的に発現した（ハジンスキら、前述 ）が、発現しヘルは、定量的でなかった。ステロイド感受性プロモーターに結合 されたクロ→ムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ（ＣＡＴ）は、ラット 肝へトランスフェクトされた場合、発現を、デキサメタシンによって正方向に制 御できた。

ハンレスギら、前述。細胞障害性は、高濃度のりボッエフチンによって問題とな る。

ＤＯＴＮＩＡのための置換体には、リボポリアミン（Ｊ、レフシー（Ｌｏｅｆｆ 　１ｅｒ）ら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　（１９９０）　５＝１：１８１２− １８１５）　、親脂性ポリリジン（Ｘ、　シー（Ｚｈｏｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、（１９９＋）　！０６５：８−１４）及び、カ チオン性コレステロール（Ｘ　ガ才（Ｇａｏ’）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ ｏｐｈｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　、　（１９９１）　１７９：２８０−２８ ５）が■■黷驕B これらは、培養系において遺伝子輸送を仲介するために用いられている。リボン 上りチンによってもたらされるトランスフェクション率に関していくつが改良さ 第１た（約３倍）が、毒性が問題として残っている。カチオン性脂質を用いるト ランスフエクシヨンに寄与する機構の研究は、著しく欠落していた。過去の手段 は、送達システムがＤＮＡを細胞へとのように導入するかについて組織的に研究 するよりは、異なるカチオン性脂質を合成して、トランスフェクションアッセイ に試すことてあった。ＤＯＴＭＡ／ＰＥリポソームは、アニオン性すボンソーム による二重行の融合を実行することができ（Ｎ、ダッッガンス（Ｄｕｚｇｕｎｅ ｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８９）２８：９１７９−９１８４）、これは 、形質膜を介したＤＮＡの直接的なエントリーか、ＤＯＴＭＡの作用方式に関連 していると示唆している。カチオン性脂質システムを用いる高い効率のトランス フェクションは、ＰＥの取込みを必要とし、これはおそらく、ＰＥか膜融合を促 進する膜内脂質中間体を形成することができるためである。膜透過化及び膜融合 におけるＰＥの役割は、広く研究されている。

例えは、Ｎｉ、−Ｚ　ライ化ａｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８５）　２４ ：１６４６−１６５３　；　Ｈ，エレンズ（Ｅ１１ｅｎｓ’）ら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、（１９８６）２５：２８５−２９４　；　Ｊ　ベンツ（Ｂｅｎｔｚ）ら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ。

（１９８７）２６：２１０５−２１１６）。

細胞のターゲティング　効率的な遺伝子輸送は、選択された細胞に対するＤＮＡ のターゲティングを必要とする。近年、リセブター仲介エンドサイトシスに基つ く手法か遺伝子輸送のために説明されている。Ｇ、　Ｙ、ロー（Ｗｕ）ら、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、（１９８７）　２６２：４４２９　：　Ｇ、Ｙ、ローら、Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８８）　２６３：＋４６２１−P４６ ２４゜細胞特異的リガント−ポリリジン複合体は、核酸に電荷相互作用によって 結合している。得られた複合体は、標的細胞によって取り込まれる。ローら、前 述は、リガントとしてのアノアロオロソムコイドによる当該送達システムを用い て、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びラット肝細胞の効率 的なトランス１エク、ノヨンを報告した。ハヶソト（Ｈｕｃｋｅｔｔ）ら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　（＋９９０）４０・２５３−２６３は、イ ンシュリンに向けたターゲティング後のＨｅｐＧ２細胞における酵素活性の安定 的な発現を報告した。結局、ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ 　ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　（１９９０）　８７：３４１０−３４１ ４　、及び（＋９９１）　８８：４２５５−４２５９では、qト白 面病細胞株に−５６２へのプラスミドのトランスフェリン−ポリカチオン仲介送 達及びその後のコート化ルンフェラーゼ遺伝子の発現が観察された。しかし、記 載された送達システムは、ポリリジンリンカ−によってＤＮＡに連結された高分 子量のターゲティング（標的に向かって行く）タンパク質に基づいている。これ らの巨大リガント−ポリカチオン結合体は、サイズ及び組成において異種起源と な頃化学的に十分定義されてなく、再生様式での調製が難しい（ウーら、前述、 ワグナ−ら、前述）。しかも、多くのりセブター仲介システムにおいて、クロロ キン又は他の細胞内運搬の崩壊剤が、高いレベルのトランスフェクションのため に要求さ第１る。ある研究では、アデノウィルスがリセブター仲介システムの遺 伝子送達を促進するために用いられている。Ｄ、　Ｔ、クリエル（Ｃｕｒｉｅｌ ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａ＋１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　（１９９１＞　８８：８８５０−８ ８５４゜これらの研究をまとめると、遺伝子を、リセブター仲介エンドサイトノ スによって哺乳類細胞の内部へ送達する二とがてき、外因性ＤＮＡのフラクショ ンが分解を免れて核へ入り、発現することが示される。発現レベルは低く、これ は恐らく細胞質・＼の外来ＤＮＡのエントリーが制限されるためである。

電荷中性化及び膜透過化　遺伝子の直接送達は、ポリヌクレオチドにおける大き な負の電荷の中性化能及び、標的細胞の膜の透過能（しばしば、付随的である） によって補助される。ポリヌクレオチド電荷を中性化して膜透過化及び輸送を補 助するポリカチオンの使用は既知である。フェノけ−ら、前述。カチオン性１１ ｆｆ　費は、また二の目的のために用いられている。Ｐ、Ｌ　フェルトナーら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵｓＡ、、（１９８７）　８４ニ ア４１３−７４１７　；　ｘブスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）らの米国特許第４ ．９４６．７８７号。特定のカチオン性脂質は、リポポリアミン及びリポインタ ーカラント（ｌｉｐｏｉｎｊｅｒｃａｌａｎｔｓ）と呼ばれ、これらも既知であ る。Ｊ、−Ｐ、バール（Ｂｅｔ＋ｒ’ｌ、Ｔｅｔ、Ｉ、ｅＨ，（１９８６）　２ ７：５８６１−５８６４゜ζ曽細胞局在性　ポリヌクレオチドが、標的細胞へ一 旦入ると、遺伝子の直接送Ｊ！は、適当な準細胞位置への遺伝子の指向能に補助 され得る。デオキシリボヌクしオチトの送達のための自明な標的の１つは核であ る。このプロセスに補助することか知られているリガンドは、核局在性ペプチド 又はこれらの核局在性配列を含むタンパク質である。Ｃ，ディングウオール（Ｄ ｉｎｇｗａｌ　ｌ）ら、ＴｌＢ５　（１９９１）　１６Ｙ　力量ダら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　（＋９８９）　２４３：３７３−３７８は、再構築ウィルスエンベロー プによってしたらされたトランスフェクション効率が、外来遺伝子が核タンパク 質と共に標的細胞へ同時送達される場合に、増加することを示している。核タン パク質と、見合したＤＮＡは、アルブミンと混合されたＤＮＡに関したトランス フェクションにおいて、控えめな増加を示す（カネダら、前述）。ＤＮＡは、核 局在性配列（ＮＬＳ）、ｐｒｏ−１ｙｓ−１ｙｓ−１ｙｓ−ａｒｇ−１ｙｓ−ｖ ａｌを含むタンパク質（Ｐ、　Ａ、　’、ｙルバー、Ｃｅ１ｌ　（＋９９１）　 ６４：４８９−４９７）をプラスミドと結合した場合、より容易に核へ取り込ま れるという仮定がある。タンパク質におけるＮＬＳは、核膜孔を通って輸送する よう指示している。１４アミノ酸の核局在性配列は、種々の巨大分子且つ更に黄 金粒子（１５０人直径）に結合しており、細胞質へ導入されｔこ際に、核へ迅速 に取り込まれる（Ｄ、　Ｒ，ファインドレイ（Ｆｉｎｄｌａｙ）ら、Ｊ、Ｃｅ１ １．Ｓｃｉ、５ｕｐｐ、　（１９８９）　ｌｌ＋２２５−２４２；シルバー、前 述）。核エントリーが、首尾よく安定したトランスフェクションについて、確率 制限しているという考えは、細胞質ヘマイクロインジェクションされたプラスミ ドＤＮＡか、細胞のトランスフェクションをもたらすことができない（１０００ 以上の細Ｉｌｌ注入でトランスフェクションが認められない）が、核への直接的 なプラスミドのマイクロインジェクションが、５０％以上のマイクロインジェク ションされた細胞でトランスフェクションをもたらしたという発見にも支持され ている。キヤペンチら、前述。プラスミドにおける核局在性シグナルの結合が、 核へプラスミドＤＮＡの輸送を誘発するならば、トランスフェクション効率は増 加することかできる。我々は、ＮＬＳ及び他のリガンドを所望のポリヌクレオチ ドへ結合する新規な方法を提案する。

最後に、発明者らは、ｌ・ランスフエクソヨン効率が、ＤＮＡを種々のカチオン 性タ、バク貿を用いて凝縮した場合に増加することを証明している。Ｔ、１．　 チクコｆ、ンＤ　（Ｔｉｋｃｈｏｎｅｎｋｏ）ら、Ｇｅｎｅ　（１９８８）　６ ３：３２１−３３０　；　Ｍ、ボッガー（Ｂｏｔ　ｔｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｉ ｍ、Ｂｉｏｐｂｙｓ、Ａｃｊａ、　（ｉ９８８’）　９５０：２２１−２２８　 ：ワグナーら、前述。ＤＮＡ凝縮かトランスフェクションを増加する理由は、す ぐには明示されない。これはＤＮＡの細胞取込みを増加し得る（ワグナ−ら、前 述）が、細胞中のより大量の無傷（イレタク］・）なりＮＡをもたらし１ｑるヌ クレアーゼ活性に対するＤＮＡの感受性を減少してしまう。

ボ１１ヌクレオチド結合　上述したクラスの分子の１つと結合する遺伝子の直接 輸送は、これらの成分のＤＮＡの結合維持能によって更に補助される。ウーら、 ｉ；ｆ述は、ポリ力升オンボリリノンに対してリガンドを共有的に結合すること によ−って、ポリヌクレオチドどそのリセブターリガンドを結合した。ワグナ− ら、前述は、ポリリシンに加えて、ＤＮＡインターカレーター、エチジウムホモ ダイマー（’、）、５’−ノアゾデカメヂレシーヒス（３，８−ジアミノ−６− フエニルフエナ〉トリシウム）ジクロライトハイドロクロライドに対して、該リ ガンドも共有的に結合した。Ｐ、Ｅ、　ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）、Ｅｕｒ 、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８２）　＋２２：２８３−２８９は、９−アミ ノアクリランと特定のビス−アクリジンに対する共有的な結合によ−って、ＤＮ Ａに対する光親和性を結び付けた。

十記文献のとこにも、（票的細胞の標的率細胞位置へ循環性ポリヌクレオチドを 運ぶことに関連した問題の複合的な側面に向けたポリヌクレオチド送達のための ノステｌ、は、記述されていない。本発明は、ポリヌクレオチドを１以上の下記 機１１ヒｔ’ＪＩ＆分の組み合わせと結合することによって、これらの問題を処 理する。即ち、二イ１らＧ）ｒ５．分とは、ＤＮＡマスキング成分、細胞認識成 分、電荷中性化及び膜透過化成分、並ひに、準細胞局在性成分である。

発明の（Ｑ要 １ｉｉｉ述の直接遺伝子送達の問題の観屯では、本発明は、１以上の、好ましく は２Ｉ−開−の下記機能性成分、即ち、ＤＮＡマスキング成分、細胞認識成分、 電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、準細胞局在性成分の組み合わせ物を用い る自己構築ポリヌクレオチド送達システムを意図している。本システムの各成分 は、その指示さ第１た機能を実行することかでき、また要求されたポリヌクレオ チドにより構築又は９航することもてきる。例えば、特定の成分は、それのため に所望されｔ：機能を実行するために、ポリヌクレオチドから分離しなければな らないであるう。

従って、本発明の主な目的は、ポリヌクレオチドを真核細胞の準細胞成分にもた らずだめの組成物を提供することてあり、これは、真核細胞の細胞質膜を通過し てポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分に結合したポリヌクレ オチドを含む。

本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドを真核細胞の核へもたらすための組成物 を提供することてあり、これは、真核細胞を認識することができる細胞認識成分 に結合したポリヌクレオチドを含む。

本発明の更に他の目的は、真核細胞の核へポリヌクレオチドをもたらすだめの組 成物を提供することてあり、これは、真核細胞を認識することができる細胞認識 成分と、真核細胞の細胞質膜を通ってポリヌクレオチドを輸送することができる 膜透過化成分どの両方に結合したポリヌクレオチドを含む。

本発明の更なる目的は、真核細胞の準細胞成分にポリヌクレオチドをもたらすた めの組成物を提供することてあり、これは、真核細胞の細胞質から真核細胞の準 細胞成分にポリヌクレオチドを送達することができる準細胞局在性成分を結合し 、たポリヌクレオチドを含む。

本発明の更に他の目的は、真核細胞の準細胞成分にポリヌクレオチドをもたらす ための組成物を提供することてあり、これは、ポリヌクレオチド、該真核細胞を 認識する二とかできる細胞認識成分、該真核細胞の細胞質膜を通ってポリヌクレ オチドを輸送することかできる膜透過化成分、該真核細胞の細胞質から該真核細 胞の準細胞成分へポリヌクレオチドを送達することができる準細胞局在性成分並 ひに、ポリヌクレオチドの循環半減期を延ばすことができるマスキング成分を含 む。

本発明の池の目的は、自己構築ポリヌクレオチド送達システムに育用な成分を提 供する二とてあり、これは、下記式、Ｍ、−！捌−（α、ｌ　、−Ｎ畳ＣＨ２＋ １ｌｌ−■−Ｍ。

を有し、ここで、ｎ及びｍは各々、独立して１〜２ｏの整数であり、ｐは０〜２ ０の整数てあり、Ａｒ、及びＡｒ２は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミ ドサントロン、オキサゾールピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル −２，７−ジアザビレニウム並びにこれらの誘導体から成る群より独立して選択 され、Ｘは反応性結合基であり、Ｙは細胞表面リセブターリガンド、準細胞局在 性配列及び膜透過化成分からなる群から選択される。

本発明の更に他の目的は、反応性インターカレート成分を提供することであり、 これは、下記式、 を有し、ここて、ｎ及びｍは各々、独立して１〜２ｏの整数であり、ｐは０〜２ ０の整数てあり、Ａｒ１及びＡ　ｒ　ｔは、エチジウムブロマイド、アクリジン 、ミドサントロン、オキサゾールピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メ チル−２，７−ジアザビレニウム並びにこれらの誘導体から成る群より独立して 選択され、Ｘは反応性基である。

図面の簡単な説明 ［１１は、本発明のポリヌクレオチド送達システムの具体例を示したものてあり 、ここて、ＮＬＳは核局在性配列であり、ＭＤは膜透過化成分てあり、リガント は細胞認識成分である。

図２は、グラミンジンＳの構造を示している。

図３は、リボフエクチンと、ｐＨ惑受性リポソームと、グラミシジンＳ／Ｄ。

ＰＥ／ＤＮＡ１合体とを用いたルンフェラーゼトランスフエクション効率を比較 している。

図４は、トランスフェクション効率に対するグラミンジンＳ対ＤＮＡ比の影響を 示している。

図５は、トランスフェクション効率に対するグラミシジンＳ対ＤＯＰＥ比の影響 を示している。

０６は、ｉ・ランスフェクンヨン効率に対するグラミソジンＳ／脂質／ＤＮＡ複 合体の脂質の型の影響を示している。

図７は、トランスフェクション効率に対するグラミシジンＳ／脂質／ＤＮＡｆｆ １合体におけるグラミシジンＳの他のペプチドの置換の影響を示している。

図８は、ターゲティング糖質及び／又は反応性マレイミドをスペルミジンビス− アクリジンに結合するための合成スキームを示している。

図９は、ペプチドをマレイミド−スペルミジンビス−アクリジンに結合するため の基本スキームを示している。

図１Ｏは、分解可能なＬｙｓ−Ｌｙｓペプチドビス−アクリジンに結合するだめ の合成スキームを示している。

図１１は、実施例３のゲル遅延アッセイの結果を示している。

図１２は、幾つかのガラクトシルビス−アクリジンの、肝細胞へのプラスミドＤ ＮＡを運ぶ能力を示している。

図１３は、実施例６のトリガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンの合成 スキームを示している。

発明の詳細な説明 定義。

゛ポリヌクレオチド”という用語を本文において用いる場合、これには、１本鎖 、２重又は多重鎮形態のいずれかで１以上のヌクレオチドのＲＮＡ又はＤＮＡ配 列か含まれる。”ポリヌクレオチド”は、一般的にポリデオキシリボヌクレオチ ド（２′−デオキシーＤ−リホース又はその修飾形態を含む）即ちＤＮＡ、ポリ ＋１ホヌクレオチド（Ｄ−リホース又はその修飾形態）即ちＲＮＡ、並びに、プ リン若しくはピリジミン塩基のＮ−グリコシド又はＣ−グリコシド、或いは修飾 ブリ〉若しくはピリジミン塩基、又は非塩基性（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオチドで ある全ての他のポリヌクレオチドの型を言う。ポリヌクレオチドは、プロモータ ー領域、オペレーター領域、構造領域、終結領域、及びこれらの結合又は遺伝的 に関連した池の全ての物質をツー１−シ得る。

本発明のポリヌクレオチドは、また当該技術分野において一般に理解されるよう に１以上の゛′置換゛結合物（リンケーン）も含み得る。これらの置換結合物の 幾つかは非極性であり、膜を横切るポリヌクレオチドの望ましい拡散能に寄与し ている。その他は、ポリヌクレオチドの生分解能の増加又は減少に寄与している 。

（生分解能は、例えば増加された又は減少されたヌクレアーゼ感受性に影響され る。）　これらの゛′置換”結合物は、慣用の他の結合物例えば、ホスホロチオ ニー１・又はホスホロアミデートか、一般的に有効な文献中で記述されたように 合成されたものとして本文中で定義される。同様のポリヌクレオチドにおけるこ のような全ての結合物か、同一である必要ない。

ポリヌクレオチドの糖部分における修飾、例えば１以上の水酸基がハロゲン、脂 肪族基と置換、又はエステル、アミンとして官能化される等の場合、又は、リホ ース若しくはデオキシリホースか他の機能的に均等な構造物と置換する場合も含 まイ］る。塩基部分の修飾には、アルキル化プリン若しくはピリミジン、アセチ ル化プリン若しくはピリミジン又は、他のへテロ環が含まれる。このような“ア ナロク゛プリン”及び゛アナログピリミジン”は、当該技術分野において一般に 知られているようなものであり、これらの多くは化学療法剤として用いられてい る。

特に、ポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格は、非糖質骨格例えばペプチド又はＰ 　Ｅ　ニールセンら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５４：１４９７−１５ ００に記述されているようなボｊ１７−骨格の他の型と置換され得る。

用語′°機能性成分“を本文において用いる場合、これには、ＤＮＡマスキング 成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分並びに、準細胞局在性成分が 含まれる。

”ＤＮＡマスキング成分”という用語を本文において用いる場合、これは、ボ１ ７クレオチトの全部又は一部をマスクして、循環系内に存在する分解薬（例えは ７７レアーセ）による攻撃を阻止することによって、その循環性半減期を延ばす 二と力＼てきる分子を言う。

’ｌｌＱｌｌ化成分”という用語を本文において用いる場合、膜を横切るポリヌ クレオチドの通過を補助する全ての成分を言う。従って、この用語は、電荷中性 化成分を一部含み、これは通常、ポリカチオンであって、ポリヌクレオチドの大 きな負電向を中性化し、ポリヌクレオチドか膜の疎水性内部を横断できるように する。多くの電荷中性化成分は、膜透過化物（ｐｅｒｍｅａｂｉ　１ｉｚｅｒ） として作用することかできる。膜透過化は、また両親媒性分子によりもたらされ る。

膜透過化物は、普通の不透過性の分子を細胞膜を横断するように援助し、細胞の 細胞質−＼の入口をもたらすことができる分子である。膜透過化剤は、ペプチド 、胆汁酸塩、糖脂質、糖質、リン脂質又は界面活性剤分子としてもよい。膜透過 化剤は、しばしば、ある部分が疎水性であり他の部分が親水性であるような両親 媒特性を存し、膜とこれらとの相互作用を可能にする。

用語“リポソーム”を本文において用いる場合、球状の二重層に配列された両親 媒性脂質から構成された小胞を言う。リポソームは、通常、小さい単ラメラ小胞 （ＳＵＶ）、大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）又は多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）に分 類さオ］る。ＳＵＶ及びＬＵＶは、定義上では、１つの二重層を有し、一方、Ｍ ＬＶは、多くの凝集された二重層を含む。リポソームは、水性の内部に又は二重 り・アの間に親水性分子を捕獲すること、又は二重層の内部に疎水性分子を捕獲 する二とによって、踵々の物質を被包するために用いられ得る。

リポソームは、その大きさ、組成及び電荷に依存して、広範な特性を示す。例え は、わずかなパーセントの不飽和脂質を有するリポソームは、極僅かに透過し易 くなる傾向かあるが、コレステロール又は他のステロールを取り込んだリポソー ムは、より堅固で透過性か劣る傾向にある。リポソームは、正、負又は中性に荷 電することかでき、これは親水性基に依存している。例えば、コリン主体の脂質 は完全に中性の電荷を備え、リン酸塩及び硫酸塩主体脂質は負電荷を与え、グリ セロール主体脂質は一般に負に帯電し、ステロールは、一般に溶液中で中性だか 、帯電している基を有する。

゛°細胞認識成分“という用語を本文において用いる場合、これは、標的細胞の 表面トの成分を認識することができる分子を言う。細胞認識成分には、細胞表面 抗原に対する抗体、リセブター仲介エンドサイトシスに関連するようなものを含 む細胞表面リセブター〇ためのりガント、ペプチドホルモン等が含まれる。

”ＤＮＡ結合部分”は、非共有様式で核酸と相互作用する分子又はその部分を言 う。ＤＮＡ結合部分には、主溝及び副溝バインダーが含まれ、これは、二重らせ んＤＮＡ〇主溝又は副溝と結合することによってＤＮＡに相互作用すると考えら オ］る分子である。ＤＮＡ結合部分は、またＤＮＡインターカレーターを含み、 これは、ヌクレオチド塩基対の間に平行に挿入することによって、ＤＮＡへイン ターカレートすると思われる平面分子又は分子の平面部分である。ＤＮＡ結合部 分は更にポリカチオンを含み、これは、ＤＮＡ骨格の負電荷に結合すると思われ る。単一鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、治療的な鎖（ストランド）として用いられる場 合、本文中で説明される相補的な“リンカ−鎖”が、“ＤＮＡ結合部分”として 機能的に作用し得る。

ＤＮＡ結合部分は、”反応性基“によって本発明の機能性成分に共有結合され得 る。これらの反応性基は、該機能性成分上の核基と容易に反応する。このような 反応性基（それ自身の反応性求核基に相当する）には、Ｎ−ヒドロキシサクノン イミト（アミン）、マレイミド及びマレイミドフェニル（スルフヒドリル）、ピ リノルンスルフィト（スルフヒドリル）、ヒドラジン（糖質）並びにフェニルゲ リオキサール（アルギニン）か含まれるが、これらに限定されない。

゛°準細胞局在性成分”という用語を本文中で用いる場合、これは、標的細胞中 の準細胞成分を認識することかできる分子を言う。認識される準細胞成分には、 核、リポソーム、ミトコンドリア及び葉緑体が含まれる。特別の準細胞局在性成 分には、　゛核局在性成分”か含まれ、これは、分子を核へ運ぶことを補助する もので、核局在性ペプチド及びアミノ酸配列が含まれると知られている。

組成物 本発明の一部である組成物は、自己構築ポリヌクレオチド送達システムにあり、 これは、１以上、好ましくは２以上の下記機能性成分、即ちＤＮＡマスキング成 分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、準細胞局在性成分と 組み合わせたポリヌクレオチドを用いる。このシステム中の各要素は、指示され た機１１ヒを実行することができ、また所望されるポリヌクレオチドにより構築 又は分角１する二とかてきる。本システムの個々の要素、並びにこれらの要素を 作製するだめの方法及び中間体も本発明の一部として意図されている。本システ ムの具体例を図１に示している。

ポリヌクレオチド ポリヌクレオチドは、単一鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡ若しくは ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとし得る。治療的価値を有する二重鎖又は四本鎖ポ リヌクレオチドも、本発明の範囲内にあると意図されている。二本鎖ＤＮＡの例 には、構造遺伝子、オペレータ制御及び終結領域を含む遺伝子、並びに、自己複 製システム例えばプラスミドＤＮＡが含まれる。

単一鎖ポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮ Ａ）　、リポザイム並びに、三重形成オリゴヌクレオチドが含まれる。この“治 療鎖”は、延長された活性を存するために、これは好ましくは、ヌクレオチド結 合物の幾つか又は全部として、安定な、非ホスホジエステル結合物を存する。こ のような結合物には、例えば、ボスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホ スホロセレネート又は、アルキル基がメチル又はエチルである０−アルキルホス ホトリエステル結合物か含まれる。

これらの単一鎖ポリヌクレオチドにとって、投与される組成物の一部として治療 鎖に対して相補的な鎖を調製することが好ましい。この相補鎖は、　”リンカ− 鎖”と呼ばれ、細胞に入った後に分解されるように、通常、ホスホジエステル結 合を用いて合成される。この“リンカ−鎖”は、独立した鎖とすることもでき、 又は、治療鎖が本質的に折り畳まれて、それ自身にハイブリダイズするように、 治療鎖に共有的に結合若しくはこれの単なる延長とすることもできる。

リンカ−鎖は、またその３′若しくは５′末端上に、又はリンカ−の糖若しくは 骨格上で、機能性成分として作用し、治療鎖の活性を促進する官能性を有するこ としてきる。例えば、ホスホジエステルリンカ−鎖は、ターケチイングリガント 例えは葉酸誘導体を含むことができ、これは標的細胞を認識して内在化を可能に する。このリンカ−か分解耐性結合物から構成される相補的治療類に結合してい る場合、この二重鎖は内在化され得る。一旦、細胞内部に入ると、リンカ−は分 角７して治療鎖を放出することができる。このやり方では、治療鎖は、結合され た更なる官能性を存することはなく、また、その機能は非必須部分によって妨害 されない。この戦略を、全てのアンチセンス、リポザイム又は三重組形成ポリヌ クレオチドに適用することかできる。これは、抗ウイルス性、抗細菌性、抗新生 物性、抗炎症性、抗増殖性、抗すセブター遮断性又は抗輸送性のポリヌクレオチ ド等を送達するために用いられる。

独立した“リンカ−鎖”は、治療鎖に対して直接相補的な配列を有し、１対１の 様式でハイブリダイズするように合成され得る。或いは、リンカ−鎖は、該リー 、カー鎖の５′領域が治療鎖の５′領域とハイブリダイズし、リンカ−鎖の３′ 領域か治療鎖の３′領域にハイブリダイズして、下記の連鎖状の構造を形成する ように構恣さね得る。

この連鎖は、治療性核酸の見かけの分子量が増加し、その薬物動態特性及びター ケチイングリガント　治療リガント比を最適な治療効果を達成するように調整す ることかできるという利点を有する。

機能性成分 ＤＮＡマスキング成分　本システムのＤＮＡマスキング要素は一ボリヌクレオチ Ｆ・の全部又は一部をマスキングすることができる分子であり、それしえ、循環 系において存在する分鼾剤による攻撃を阻止することによって循環性半減期を延 はす。

本発明では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、後述するように慣用の方法 によってＤＮＡ結合部分と共有結合的に結合することができ、ＤＮＡマスキン５ 成分として用いることかてきる。ＰＥＧは、約７００〜約２００００ダルトン、 好ましくは約１８００〜６０００ダルトンの分子量を有し、好ましくは、約１・ ４〜ｌ　１００、より好ましくは約１２０の割合（ＰＥ０分子・ＤＮＡ塩基対） て存在する。

或し・は、ＤＮＡは脂質との結合によってマスクされ得る。ある具体例では、Ｄ ＮＡは、例えば、スゾソカ（Ｓｚｏｋａ）らの米国特許第４．３９４．４４８号 に記述されるような標準的なリポソーム中に包まれる。この特許の明細書を援用 して本文の一部とする。他の具体例では、ＤＮＡを、エプスタインらの米国特許 第４．８９７．３５５号に記述されるようなものに類似する合成カチオン性脂質 と反応させる。これらのカチオン性脂質は、下記の一般式を有し、式中、ｎは、 １〜８の整数てあり、Ｒ１及びＲ２は、同−又は異なる６〜２４の炭素原子を有 するアルキル若しくはアルケニルであり、Ｒ３は、水素原子、１〜１０の炭素原 子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、Ｒ４は、正に帯電した１〜 ３０の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンで あり、ここで、炭素原子の少なくとも１つはＮＲ’で置換されてもよく、Ｒ′は 、水素、１〜１０炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。− Ｎ−Ｒ’部分として機能することができる好ましい基は、トリス（アミノエチル ）アミン（ＮＨ，ｃＨｔ　ＣＨ２）２　Ｎ、アグマチン（デカルボキシアルギニ ン）Ｈ，Ｎ　（ＣＨ，）、（＝ＮＨ）ＮＨ２，３−アミノエチル−１，３−プロ パンツアミンＨ２Ｎ　（ＣＨ，）、ＮＨ（ＣＨ２）ｔ　ＮＨｚ、３−ジメチルア ミノプロピルアミン（ＣＨ，）、ＮＨ（ＣＨ，）３　ＮＨｔ　、イミノビス（Ｎ 、　Ｎ’　）ジメチルプロピルアミンＮ　Ｈ（（ＣＨ２）　３　Ｎ　（ＣＨ３） 　！　）　ｔ　、イミノビス（３−アミノプロピル）ｉ、３−プロパンツアミン 、１．　４−ビス（３−アミノブロビルフビペラ／ン、ヒス（プロピルアミン） （ＮＨ２（ＣＨＩ）３）、ＮＨ、スペルミジン及びスペルミンであり、ここで、 これらの基は、その１つの窒素原子によって脂質分子に結合している。

特に好ましい具体例では、合成カチオン脂質は、合成カチオン尾部脂質であり、 これは、下記式、 を有し、式中、ｎは６〜２４の整数てあり、Ｙは水素、エタノールアミン、コリ ン、グリセロール、セリン及びイノシトールから成る群より這択され、Ｒ１は、 ６〜２４炭素原子を有するアルキル又はアルケニルであり、Ｒ８は水素、１−１ ０炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、Ｒ４は、正に帯電 した１〜３０の炭素原子を存する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキル アミノであり、ここで炭素原子の少なくとも１つは、ＮＲ’と置換してもよく、 ここでＲ′は、水素、１〜１ｏの炭素原子を存するアルキル若しくはアルキルア ミンである。−Ｎ−Ｒ’部分として機能することができる好ましい基は、トリス （アミノエチル）アミン（Ｎ　ｒ（２ＣＨＩ　ＣＨ２）　ｓ　Ｎ　、アグマチン （デカルボキンアルギニリＨ，Ｎ　（ＣＨ，）４（＝ＮＨ）ＮＨ，，３−アミノ エチル−１，３−プロパンノア　ミニ／Ｈ２Ｎ　（ＣＨＩ）３　ＮＨ（ＣＨｚ） ｔ　ＮＨ２，３−シメーＦ−ルア　ミ／プロピルＴミン（ＣＨＩ）２　ＮＨ（Ｃ Ｈ，）、ＮＨ！、　イミノビス（Ｎ、Ｎ”）ジメチルプロピ／Ｌ７　ミンＮＨ（ （ＣＨ２）３　Ｎ（ＣＨ２）り！　、　イミ／　ビス（３７ミ／’ｊ口ビル）− １，３−プロパンジアミン、１．４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、 ビス（プロピルアミン）（ＮＨ２（ＣＨ２）、）Ｉ　ＮＨ、スペルミジン及びス ペルミンであり、ここで、これらの基は、その１つの窒素原子によって脂質分子 に結合されている。

」二連の合成カチオン性脂質が、ＤＮＡに結合している場合に、該ＤＮＡを効率 よくマスクすることがわがっている。どの方法にも本発明を限定することなく、 脂質は、ある様式でＤＮＡを被包化する単層構造を形成すると考えられる。

細ｌｌ怨認識成分　本システムの細胞認識要素は、標的細胞の表面上の成分を認 識することがてきる分子てあり、後述するように慣用の方法によってＤＮＡ結合 部分と共有結合的に結合する。細胞認識成分には、細胞表面抗原に対する抗体、 リセブター仲介エントサイトンスに関連するものを含む細胞表面リセブターのリ ガント、ペプチドホルモン等が含まれる。本発明によって意図される特定リガン ドには、糖質リガンド例えばガラクトース、マンノース、マンノシル−５−ホス フェ−１−、フコース、ンアル基、Ｎ−アセチルグルコサミン又はこれらの基の 組み合わせか、例えば血液群の糖脂質若しくは種々の分泌性タンパク質に見出さ れるもののような複合糖質として含まれる。他のリガンドには、葉酸塩、ビオチ ン、細胞表面若しくは細胞内リセブターと相互作用することができる種々のペプ チド、例えば、化学誘因性（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）ペプチド、Ｎ− ホルミル−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｐｈｅ、ａｒｇ−ａｓｐ−グリシン配列を含むペプ チド若しくは、ｃｙｓ−ｓｅｔ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｇｌｕ−ａｓｐ−ｖａｌ−ｔ ｒｐペプチド、シスチン残基を含むペプチド又は、ヒト免疫不全ウィルスのＧＰ −１２０のような細胞表面タンパク質と相互作用するペプチド、並びに、ＣＤ４ と相互作用するペプチドか含まれる。他のリガンドには、Ａ、バートラ−（Ｈｅ ｒｔｌｅｒ）とＡ、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１ ．７：１９３２−１９４２によって記述されるような抗体若しくは（に体フラグ メントが含まれる。該抗体の特異性は、細胞表面上に発現され得る多種のエピト ープに向けることができ、これには組織適合性巨大分子、自己免疫抗原、ウィル ス性、寄生虫性若しくは細菌性タンパク質が含まれる。他のタンパク質リガント には、ホルモン例えは成長ホルモン及びインシュリン、又はタンパク質成長因子 例えば、ＣＡＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロボイエチン、上皮増殖因子、塩 基性及び酸性繊維芽細胞成長因子等が含まれる。他のタンパク質リガントに、細 胞表面リセプターを通して働く種々のサイトカインを含むことができ、これには 、インターロイギン２、インターロイキンｌＳＢ瘍壊死因子及び、このような巨 大分子からの適当なペプチドフラグメントが含まれる。

膜透過化成分　本システムの膜透過化要素は、膜を横切ってポリヌクレオチドの 通過を補助する分子である。ＤＮＡマスキング成分として上述したリポソーム及 び合成カチオン性脂質が、また膜透過化成分として機能し得る。

本発明の膜透過化成分には、また、ポリヌクレオチド上の大きな負電荷を中性化 するポリカチオンが含まれる。本発明のポリカチオンには、ポリリジン、ポリア ルギニン、ポリ（リジン−アルギニン）及び同様のポリペプチド並びにポリアミ ンか含まれる。ポリカチオンの他のクラスは、下記式、を有するカチオン性胆汁 酸塩であり、式中、Ｘ及びＹは、独立して、Ｈ又はＯＨてあり、Ｒ１は、水素、 ｌ−１０の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、Ｒ４は、 正に帯電した１〜３ｏの炭素原子を存する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくは アルキルアミンであり、ここで炭素原子の少なくとも１つは、ＮＲ’と置換して もよく、ここてＲ′は、水素、１〜１ｏの炭素原子を有するアルキル若しくはア ルキルアミンである。−Ｎ−Ｒ’部分として機能することができる好ましい基は 、トリス（アミノエチル）アミン（ＮＨ，ＣＨ，ＣＨ，）。

Ｎ、アグマチン（デカルポキンアルギニン）Ｈ，Ｎ　（ＣＨｌ）４Ｃ（＝ＮＨ） ＮＨ，，３−７ミ／エチル−１，３−プロパンシフ　ミニｚＨｔ　Ｎ　（ＣＨＩ ）ｓ　ＮＨ（ＣＨｔ）ｔＮＨ２，３−ジｉｆルアミノプロピルアミ：／　（ＣＨ ３）２　ＮＨ（ＣＨｉ）ｓ　ＮＨｚ、イミノヒス（Ｎ、Ｎ′）ジメチルプロピル −ｒ　ミニｚＮＨ（（ＣＨｔ）ｓ　Ｎ（ＣＨＩ）２）！、イミノビス（３−アミ ノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、１．　４−ビス（３−アミノプロピ ル）ピペラジン、ビス（プロピルアミン）（ＮＨ２（ＣＨ２）、）２ＮＨ、スペ ルミジン及びスペルミンであり、ここでこれらの基は、その１つの窒素原子によ って胆汁酸塩に結合している。

他の具体例では、本発明の膜透過化成分は、両親媒性カチオン性ペプチドである 。両親媒性カチオン性ペプチドは、ペプチドがカチオン性の面と中性、疎水性の 面とを有すると思われるような天然の立体配位を有するペプチドである。好適具 体例では、該ペプチドは環状ペプチドである。本発明の両親媒性カチオン性環状 ペプチドの例は、グラミンノンＳ（この構造は図２に示されている）及びチロノ ノンである。該ペプチドは、また、幾つか又は全て、天然に生成するし立体配位 に対して逆の、Ｄ立体配位にあるアミノ酸を含むことができる。

特に好ましい具体例では、膜透過化要素は、両親媒性カチオン性環状ペプチドに Ｉ］Ｉ＋えて、（１）脂質、又は（２）単純ポリアミンのいずれか、又はこの両 方を含む。

本発明の脂質は、リポソームを形成することができる両親媒性分子であり、天然 形態で又はリポソームとして、いずれも必要濃度で投与したときに、実質的に非 毒性である。好適な脂質は、一般に、極性即ち、親水性末端と、非極性即ち疎水 性末端を有する。好適な脂質には、タマゴのホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、 ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰ ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、コレステリルホスホリルコリン、３．６ ゜９−トリオキサオクタン−ｌ−オル−コレステリル−３−オル、ジミリストイ ルーホスフ７チンルコリン（ＤＭＰＣ）、並びに他のヒドロキシコレステロール 若しくはアミノコレステロール誘導体（例えば、Ｋ、　Ｒ，パテル（Ｐａｔｅｌ ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　（１９８５）　８１ ４：２５６−６４を参照のこと）が含まれるが、これに限定されない。脂質は、 好ましくはリポソームの形態て添加される。

添加ポリアミンは、好ましくは、スペルミン又はスペルミジンである。

膜透過化要素は、環状ペプチド並びに任意的なリン脂質及びポリアミンであり、 同時に又は逐次的に、該組成物へ添加され得る。好ましくは、環状ペプチドが最 初に添加され、リン脂質又はポリアミンが、その後に添加される。添加環状ペプ チド対添加ポリアミンのモル比は、好ましくは、約１．１〜約ｌ：３である。添 加環状ペプチド対添加リン脂質のモル比は、好ましくは、約ｌ、１〜約１＝２０ 成分を認識することがてきる分子てあり、これは後述するように慣用の方法によ ってＤＮＡ結合部分に共有結合される。特定の準細胞成分には、核、リポソーム 、ミトコンドリア 本発明の好適具体例では、準細胞局在性成分は、核局在性成分である。核局在性 成分には、定義されたアミノ酸配列の既知のペプチド、及びこれらのペプチドを 含む一層長い配列か含まれる。既知のペプチド配列の１つは、ＳＶ４０ラージＴ 抗原の７ペブチト、ｐｒｏ−１ｙｓ−１ｙｓ−１ｙｓ−ａｒｇ−Ｉｙｓ−ｖａｌ である。他のペプチドには、インフルエンザウィルス核タンパク質の１０ペブチ ト　ａ　ｌ　ａ−ａ　Ｉａ−ｐｈｅ−ｇｌｕ−ａｓｐ−１ｅｕ−ａｒｇ−ｖａ　 ｌ−１ｅｕ−ｓｅｒ、及びアデノウィルスＥｌａタンパク質の配列、Ｉｙｓ−ａ ｒｇ　−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏが含まれる。他の配列は、Ｃ，ディングウオー ルら、ＴｌＢ５　（１９９１）　１６：　４７８−４８１に認めることかできる 。

他の具体例では、準細胞局在性成分は、リソワーム局在性成分である。リソソー ムを標的とする既知の成分は、配列１ｙｓ−ｐｈｅ−ｇｌｕ−ａｒｇ−ｇｉｎを 含むペプチドである。更に他の具体例では、準細胞局在性成分は、ミトコンドリ ア局在性成分である。ミトコンドリアを標的とする既知の成分は、配列ｍｅｔ− Ｉ　ｅｕ−ｓｅｔ−１ｅｕ−ａｒｇ−ｇｉｎ−ｓｅｒ−ｉ　１ｅ−ａｒｇ−ｐｈ ｅ−ｐｈｅ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｔｈｒ−ａｒｇを含むペプチドである。

本システムのＤＮＡ結合部分とは、非共有様式で核酸と相互作用する機能性成分 の部位を言う。この部分は、慣用手法によって又は後述するようにして機能性成 分の残りと共有結合する。ＤＮＡ結合部分は、好ましくは、主溝及び副溝バイン ダー、ＤＮＡインターカレーター又は一般的なりＮＡバインダーである。単−ｊ ｌ’ｉポリヌクレオチドの場合では、ＤＮＡ結合部分は、前述したようにリンカ −鎖とすることもてきる。このような場合に、機能性部分例えば細胞認識又は準 細胞局在性成分は、リンカ−鎖に共有結合する。

好適な具体例の１つでは、ＤＮＡ結合部分は、主（ｍａｊｏｒ−）又は副溝（ｍ ａｉｎｏｒ−ｇｒＯＯＸ・ｅ）バインダーである。主又は副溝バインダーは、Ｄ ＮＡの該主又は副溝バインダーに結合する又は“入っている”と知られている部 分である。これらのバインダーには、シスタマイノンＡ及びヘキスト染料３３２ ５８が含まれる。

池の具体例では、ＤＮＡ結合部分は、非特異的ＤＮＡバインダー例えばポリカチ オンである。本発明のポリカチオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ（ リノシーアルギニン）並びに同様のポリペプチド及びポリアミンが含まれる。

池の好ましい具体例では、ＤＮＡ結合部分は、ＤＮＡインターカレーターである 。ＤＮＡインターカレーターは、平坦な多環式分子例えば、エチジウムブロマイ ド、アクリノン、ミドサントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチノ ン及びＮ−メチル−２，７−ジアザビレニウム並びに、これらの誘導体である。

特定の好適な具体例では、このインターカレーターは、２つの共有結合した平坦 な多環式分子からなるダイマーである。本発明の平坦な多環式ダイマ一部分は、 下記の構造、 を有し、式中、 Ｚは結合であり、各ｎ及びｍは、独立してｌ〜２ｏの整数であり、ｐは０〜２゜ の整数てあり： Ａ　ｒ　＋及びＡｒ２は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミドサシトロン 、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２，７−ジア ザビレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択される。

ｎ及びｍの値は、ＤＮＡ中のインターカレート化されたアクリジンモノマーの間 隔を決定するのて重要である。ｎ及びｍのより好ましい値は、各々３及び４であ る。ヒス−アクリジンダイマーでは、Ａｒｔ及びＡｒ、は共にアクリジンであり 、これが好ましい。

この好ましいＤＮＡ結合部分は、機能性部分に共有結合的に結合され得、この部 分は、前述したような細胞認識部分、準細胞局在性部分又は膜透過化部分である 。ｐの値は、機能性部分からのインターカレーターの分離を決定する。ｐの好ま しい値は、０〜８である。

ＤＮＡ結合部分は、多重コピーの、又は１以上の機能性部分に共有結合される二 とかできる。例えば、ビス−アクリジンダイマーは、図１３に示されるように肝 細胞のアノアロオロソムコイドリセブターに結合する３つのガラクトース残基と 結合し得る。

ＤＮＡ結合ダイマーを機能性部分へ結合する好適な方法は、下記式、を有するｉ ｉｒ駆体に関連している。

式中、ｎ及びｍは各々独立して１〜２０の整数であり、ｐはθ〜２ｏの整数であ り、 八ｒ１及びＡｒ、は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミドサントロン、オ キサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザビ レニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、Ｘは、Ｎ− ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルシサル ファイト、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールから成る群より選択される反 しち性基である。

好ましい具体例では、Ａｒ、及びＡｒ、は、アクリジンであり、ｐは４であり、 Ｘはｐ−マレイミドフェニルである。その後、このインターカレート部分は、機 能性部分のスルフヒドリル基によって機能性部分に結合（カップリング）し、例 えば下記式を有する二ｇｆＪ機能性成分っ１得られる。

式中、Ｙｌ！＠能性成分てあり、ｎ及びｍは各々独立して１〜２０の整数てあり 、ｐはＯ〜２０の整数てあり、 Ａｒ、及びＡｒ２は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミドサシトロン、オ キサゾロピリドカルバゾール、エリブチノン及びＮ−メチル−２，７−ジアザビ レニウム並ひに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、Ｘは、Ｎ− ヒトロキノスクノンイミ１−、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサ ルファイト、ヒドラノン及びフェニルグリオキサールから成る群より選択される 反応性基である。

生分解性リンカ−例えば、配列−１７ｓ−１７ｓ−を有するペプチドは、インタ ーカレーターに機能性成分を結合することに、また用いられ得る。

本発明の更に他の具体例では、平坦な多環式ダイマーは、下記の式、を有し、式 中、Ａｒ、及びＡｒｔは、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミドサシトロン 、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２゜７−ジア ザビレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、各ａａ は独立してアミノ酸であり、 Ｘ及び２は、１〜１００から独立して選択された整数であり、ｙはＯ〜５の整数 てあり、 ａａ＋及びａａ２はりシン残基であり、Ｎ１及びＮ２は、ａａ、及びａａｔのリ ジンのε−アミン基からの窒素である。

では、本発明のシステムは、種々の様式の投与に配合されることができ、これに は、全身性及び局所若しくは局在的な投与が含まれる。技術及び配合は、一般に Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ 　、　７ツク出版社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ潤A）、 イーストン、ペンソルバニア州、最新版に見出すことができる。

全身性投与では、非経口投与例えば注射が好ましく、これには、筋肉内、静脈内 、ＩＩＩ腔内及び皮下が含まれる。肺の疾患の処理には、該ポリヌクレオチド送 達システムの実施は、吸入によって又は、肺へ直接的に本システムを取り付ける ことによって行われる。

注射ては、本発明のシステムは、液体溶液中、好ましくは、生理学的に適合した 緩衝液例えばハンクス溶液又はリンゲル溶液中に配合される。更に、本システム を、固体形態で配合し、使用の直前に再溶解又は懸濁することができる。凍結乾 燥形態し含まれる。

全身性投与は、また経粘膜又は経皮的なやり方によってもでき、また本システム を、経口又は鼻腔内若しくは吸入エアロゾルで投与することができる。経粘膜的 叉は経皮的投与では、透過すべき障壁に対して適当な浸透剤が配合に用いられる 。このような浸透剤は、一般に、当該技術分野において既知であり、例えば、経 粘膜ｔｉｕｊには胆汁酸塩及びフコジン酸誘導体が含まれる。更に、界面活性剤 も透過を促進するために用いられ得る。経粘膜投与は、例えば、鼻の噴霧によっ て、又はｌｌｉを…いて行われ得る。経口投与には、本システムは、慣用の経口 投与形態例えはカプセル、錠剤、強壮剤に配合される。

局所投与には、本発明のシステムは、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎ４ｓ、　５ａｌｖｅ ｓ）、ゲル又はクリーノ、に、当該技術分野では一般に知られているようにして 配合される。

下記の実施例は、説明のみを意図するもので、本発明を限定するためのものでは ない。

リボフェクチンは、合成カチオン性脂質であり、ジオレイロキシトリメチルア／ ′ｃ−ニウム（Ｄ　ＯＴ　Ｍ　Ａ　）を、ホスフ？チジルエタノールアミンと組 み合わせて、負に帯電したＤＮＡと電荷複合体を形成している。この複合体は、 細胞膜と融合して、ＤＮＡを細胞質へ送達すると考えられている。他の手段は、 負帯電脂質及びホスファチノルエタノールアミンから構成されるｐＨ感受性リポ ソームを用いる。Ｃ，Ｙ　ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８９ ）　２８：９５０８−９５１４．送達機構は、エン１ヘノーム内のｐＨか酸性と なる場合に、リポソームの二重層が不安定になり、エンｌ−ワームの膜と融合す る、リポソームのエンドサイトソスに関連している。リポソームの内容物は、そ の後、細胞の細胞質へ導入される。Ｃ，−Ｊ、チュウ（Ｃｈｕ）ら、Ｐｂａｒｍ ａｃｅｕｔ、Ｒｅｓ、　（１９９０）７：８２４−８３４゜我々は、哺乳類細胞 てのＤＮＡの送達及び発現について、ｐＨ感受性コレステリルヘミサクン不−ト （Ｃｈｅｍｓ）／ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）リポソーム組成物と 、グラミンジンＳ／ジオレオイルホスフ了チジルエタノール了ミノ（ＤＯＰＥ） ／ＤＮＡ複合体とに対してリボフェクチンを比較した。強いプロモーターとホタ ルのルシフェラーゼ又はβガラクトシダーゼとを含むプラスミドを、遺伝子輸送 に指標として用いた。

細胞トランスフエクノヨンブロトコールＣＶ−Ｌ　ｐ３８８Ｄｌ、ＨｅｐＣ２及 びＨｅＬａ細胞を、ＵＣ３Ｆ細胞培養施設から得た。リボフェクチン試薬を、製 造部説明書に記述されているように用いた（ギブコーＢＲＬ、ガイサースブルグ 、メリーランド州）。ＫＤ８３細胞をＤＮＡＸ　（バロアルト、カリフォルニア 州）から入手した。細胞を６０ｍｍディ、ノ、当たり０．５〜ｌＸｌ０’細胞の 密度で植付け、３７℃５％ＣＯ！下で、１０９ｔウノ胎仔血清（Ｆｅ２）を含有 する適当な培地中で成育させた。リポソーｌ２、リボフエクチン又はグラミンジ ンＳ／ＤＯＰＥ／ＤＮＡ複合体のいずれかと共にインキユベーシヨンする前に、 細胞を、２ｍｌのＦＣ３非含有ＤＭＥ　Ｈ−２１培地て１度洗浄した。その後、 トランスフェクションシステムを、２ｍｌの同−培地中へ添加した。ある実験で は、）・ランスフエクションは、ｌＯ％ＦＣ３含ｎＤＭＥ　Ｈ−２１中で行われ た。５時間後に培地を取り除き、ｌＯ％ＦＣ３を含む３ｍｌの適当な培地に移し た。ルシフェラーゼ活性を、記述されているように（Ａ、Ｒブラジール（Ｂｒａ ｓｉｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８９）　７：１１１６−１ １２２）４８時間後に測定した。簡単に言えば、細胞を、Ｃａ”及びＭｇ１＋非 含有氷冷リー、酸緩衝液で２回洗浄し、溶解緩衝液（１％トライトンルグリノン （ｐＨ７．８）４００μｌて処理して、剥がした。遠心後、１００μｍのＬ清を 最適量の５０ｍＭ　ＡＴＰと混合した。その後、Ｄ−ルシフェリン（ツク′マ、 １００μｍの１ｍＭ溶液）を注入し、生物発光測定器（パイオルミネセレス・了 ナリティカル・ラホラトリーズ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて 、最初の１０秒間、放射光を集中した。上清中のタンパク質を、ブラットフ十ル ト（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の技術（バイオラドキット）を用いてアッセイした。結 果は、細胞タンパク質のｍｇ当たりの光単位量で表した。

ルノフェシーセアソセイ ３つの異なるウィルスルシフェラーゼ遺伝子プロモーター、ＲＳＶ，ＳＶ４　０ 及びＣＭＶの効力を比較するために、我々は、幾つかの哺乳類細胞株を対応する りポフエクチン複合プラスミドによりトランスフェクトした。各々のディツシュ の細胞は、上述のようなｌＯμｌのリボフエクチンと組み合わされた２μｌのグ ラスミ）・を受け取った。プロモーターの強度は、対応するプラスミドによって ４８時間でのルシフェラーゼ発現によって概算された。ＣＭＶプロモーター（ｐ Ｃｌｕｃ４プラスミド）は、ＨｅＬａ，ＨｅｐＣ；２及びｐ３８８Ｄｌ細胞にお いて最も高いルシフェラーゼ発現を引起し、一方ＳＶ４０プロモーター（ｐＳＶ ２ブ→スミト）は、ＣＶ−　１細胞において、より効力があった。それゆえ追加 実験には、ｐＳＶ２プラスミドをＣＶ−１細胞に、及びｐｃｌｕｃ４を他の細胞 株に用Ｌ）ｆこ。

リポソーム特徴付は プラスミド被包化効率は、ファイコール密度勾配において被包化プラスミドと、 非袖包化のプラスミドとを分離した後に、ｉｌｌ１１定された。添加された総Ｄ ＮΔ量の約２２±３９６か、被包化された。リポソームの直径は、動的光散乱に よって測定し、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ，ＤＯＰＣ／ＣＨＥＭＳ及びＰＳ／Ｃｈｏ ｌリポソームにン１して、各々、３７２±３８ｎｍ，２９５±６５ｎｍ及び４６ ４±２０ｎｍであった（結果は、３つの独立した光散乱測定の平均±ＳＤである ）。

Ａ　７：７ミンノンＳ及びホスフ了チシルエタノールアミン典型的な複合体調製 物を、２０μｇのプラスミドＤＮＡを、ポリスチレン管において３００μｌの３ ０ｍＭｔ・リスＣ１、ｐＨ９中に希釈することによって作製しこ。グラミシジン Ｓを、ＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍｌの保存溶液から、２ｍｇ／ｍｌの濃度まで、３ ０ｍＭ、ｐＨ９のトリスＣｌ緩衝液に希釈した。２０μｌの希釈グラミノノンＳ （即ち、４０μｇ）溶液を、ＤＮＡに添加して、素早く混合した。その後、Ｉ　 ７　０ｎｍｏｌのリポソームを、ＤＮＡ／グラミシジンＳ混合物へ、１滴ずつゆ っくりと添加した。リポソームを、４μｍｏｌの脂質をロータへ一ノ寸−を用い て窒素下で乾燥し、４ｍｌの３０ｍＭ　ｐＨ９のトリスＣ１緩衝液で、この薄ｌ ｌｑを再水和して調製した。次いて、リポソームを浴音波処理器を用いてアルコ −・下で３０分間音波処理した。この複合体の直径を、動的光散乱によって測定 した。池のペプチドには、チロソジン（Ｕ．　Ｓ．バイオケミカルス）、ボリミ キノンＢ（シグマ）及びポリリジン１００（シグマ）が含まれ、これらもＤＮＡ と脂質を有する複合体を形成するために用いた。

１−ランスフェクンヨン効率を、上述のようにＣＶ−１細胞におけるルシフェラ ーゼの発現を測定することによってモニターした。これらの３つのトランスフェ クションシステムにおいて添加されたＤＮＡの量を比較する用量反応性を、図３ に示す。細胞タンパク質ｍｇ当たりの光単位量を対数スケールでＹ軸にプロ・ノ ドし、ホカロされたＤＮＡの量をＸ軸にプロットした。白い四角はグラミシジン Ｓーノオしオイルホスファチジルエタノールアミン−ＤＮＡ複合体を用いた結果 である。二の複合体は、リボフエクチンを用いて得られたものよりも１０倍大き いレベルの発現を誘導し、ｐＨ感受性リポソームを用いたものよりも１０００〜 １００００倍大きしりヘルの発現を誘導した。

Ｂ　クラミノジンＳ−ＤＮΔ比の効果 グラミンシンＳーＤＯＰＥーＤＮＡＩ合体を、複合体に添加されるグラミシジン Ｓの敲を一定量のＤＮＡ（２０μｇ）及びＤＯＰＥ　（　１　７　０ｎｍｏｌ） で変化させた以外は、実施例１八で記述したように調製した。該複合体を、ＣＶ −１細胞へγＲ１１１１シ、ルシフェラーゼ活性を実施例１て記述したように測 定した。結果は図４に示さ第１、これは、ＤＮＡの電荷がグラミシジンにおける 電荷によって中性化する場合に、ダラミノジンＳーＤＯＰＥーＤＮＡ複合体を用 いた最大発現が起こることを説明している。

Ｃ　脂質濃度の効果 ゲラミノシンＳーＤＯＰＥーＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるＤＯＰＥの量 を、一定量のＤＮＡ（２０μｇ）及びグラミシジンＳ（４０μｇ）て変化させた 以外は、実施例１て記述したように調製した。該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添ｌ Ｊ［］し、ノじフェラーゼ活性を実施例１て記述したように測定した。結果は図 ５に示さ姐これは、ＤＯＰＥか無い場合では、発現が低いことを示゛している。

グラミノシンＳーＤＯＰＥーＤＮＡ複合体を用いた最大発現は、ＤＯＰＥ対グラ ミンノッＳの比か５／１　モル１モルを越える場合に起こる。

ゲラミノノンＳ−脂質−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるリン脂質の型を一 定温のＤＮＡ（２０μｇ）及びグラミシジン５（４０μｇ）で変化させた以外は 、実施例１て記述したように調製した。用いられた脂質組成は、ＤＯＰＥ　、Ｄ ＯＰＥ　ノ才しオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）：　２／Ｌバルミトイ ルオレオイルホスフアチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）　、モノメチルＤＯ ＰＥ　（ｍｍＤＯＰＥ）；ジメチルＤＯＰＥ　（ｄｍＤＯＰＥ）；ＤＯＰＣ及び ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｅ）であった。

該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例１で記述した ように測定した。結果は１２Ｉ６に示され、これは、ルシフェラーゼ活性の発現 が、ＤＯＰＥ又は覆合体中ＤＯＰＥ／ＤＯＰＣ：　２／ｌの混合物を用いて最大 となることを示している。ルシフェラーゼ活性は、ＤＯＰＥのアミノ基が２　（ ｄｍＤＯＰＥ）又は３メチル基（ＤＯＰＣ）で置換される場合に、かなり減少す る。コード化遺伝子の発現ら、ＤＰＰＥを用いた場合にかなり減少する。この後 者の脂質は、飽和アシル鎖及び高い転移温度を有し、これは、ＤＰＰＥのアシル 鎖が一連の試験された他の脂質よりも一層流動性が低いことを意味する。

Ｅ　添ＩＪｏさねた非両親媒性の正帯電スペルミジンの効果実施例２て示される データは、グラミノジン５−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体による遺伝子発現が、ＤＮ Ａにおける負帯電がグラミシジンにおける正帯電によって中性化される場合に、 最大になることを示す。電荷中性化又は膜透過化が、本システムを用いた遺伝子 輸送において、より重要であるかを決定するために、グラミノノンＳによって付 与される正電荷が、正に帯電したポリアミド、スペルミジンによって、とんとん 置換させた。グラミシジンＳ−脂質−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加さ第１るグ ラミンジンＳの量を一定量のＤＮＡ（２０μｇ）で変化させた以外は、実施例１ て記述したように調製した。ＤＮＡを中性化するために要求される必要な正電荷 は、スペルミジンによって供給された。該複合体を、！７０ｎｍｏｌのＤＯＰＥ によって、又は用いずに調製した。該複合体を、ＣＶ−１細胞へ添加し、ルシフ ェラーゼ活性を実施例１て記述したように測定した。結果は、細胞タンパク質ｍ ｇ当たりの先単位量で示されるルシフェラーゼ活性によって、下記表１に挙げら れている。最初の活性は、常に、複合体中にＤＯＰＥが存在する場合に一層大き くなった。ＤＯＰＥが存在しない場合では、スペルミジンによってグラミソジン Ｓによる正電荷を連続的に置換することは、二相応答を引き起こす。ルシフェラ ーゼの発現は、ＤＯＰＥの存在下で得られる最大応答よりも約１００倍小さい値 まで、最初に増加する。グラミシジンＳによる電荷中性化のパーセントか２５％ より低い場合には、トランスフェクション活性は全くなくなった。

従って、グラミンジンＳの膜透過化機能は、電荷中性化機能よりも一層重要であ ペプチド−ＤＯＰＥ−ＤＮＡ複合体を、複合体に添加されるペプチドの型を一定 量のＤＮＡ　（２０μｇ）及びＤＯＰＥ　（＋　７０ｎｍｏｌ）で変化させた以 外は、実施例１て記述したように調製した。用いられたペプチドは、ポリミキシ ンＢ、環状カチオン性ペプチド即ちポリリジン、直鎖カチオン性ペプチド即ちア クリジン、グラミノノンＳに類似した構造を有するが１つの正電荷のみを含む環 状カチオン性ペプチド並びにグラミンジンＳてあった。ルシフェラーゼプラスミ ドも、リボ７エクチンを用いて細胞・＼トランスフェクトされた。複合体をＣＶ −１細胞へ添ハロし、実施例！て説明したようにルシフェラーゼ活性を測定した 。図７は、グラミノノンＳか最も大きい発現レベルてあり、関連した環状ペプチ ド、アクリジンかぞのすぐ後に続いていることを示している。両方の環状ペプチ ドは、細胞へのＤＮＡの輸送の際にリボ７エクチンよりも優れていた。活性は、 他の２つのペプチド、ポリミキシンＢ及びポリリジンによっても認められたが、 こねら２つのカチオン性ペプチドにより仲介さオ］るルシフェラーゼ発現のレベ ルは、グラミンジ／Ｓ又はチロノソンにより誘導される場合よりも劣っていた。

ポリリジンのようなポリアミンポリマーに対するより良い化学的に定義された２ 換物を見出すために、我々は、スターバースト（Ｓｔ、ａｒｂｕｒｓｔＸ商品名 ）デンドリマー（園状体）微粒子、ｌ・マリア（Ｔｏｍａｌｉａ）ら、前述、と しても知られている親水性分岐ポリカ千オン高分子体を用いて、ＤＮＡによって 、又はＤＮＡ及び透過化両親媒性ペプチド、Ｇ　Ａ　Ｌ　Ａによって、複合体を 形成した。Ｒ，バレンテ（Ｐａｒｅｌｌｌｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 （１９９（１）　２９：８７２０−８７２８゜複合体を、ポリスチレン管におい て、１２１ノｇのｐｃｌｕｃ４プラスミドを６６０μｌのＨＢＳ（２０ｍＭ　Ｈ ｅｐｅｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣＬ　ｐＨ７，４）に希釈することによって調製し た。、ｒリリノン（シグマ・ケミカル社）又は５世代スタートバースト（商品名 、以「、前略）プントす７−？：ｊ１粒子（ｌ　ｎｍｏｌ）　（ポリサイエンス 社）を、３４０μｍ０ＨＢＳに溶角７し、ＤＮＡ溶液へゆっくりと（１滴ずつ） 添加した。これらの条件上−では、ポリリジンのエブンロン位アミノ基からの、 又は該デンドリマーの木（１１アミレからの正電荷は、プラスミドの負電荷より も１．　３倍過剰である。ぺづ千Ｆ　Ｇ　Ａ　Ｌ　Ａを添加する場合、ＧＡＬＡ における負電荷が該デンドリマーにおける過剰な電荷を中性化するように添加し た。この混合物を、室温での最終添加後に３０分間静置して、その後、５００μ ｍの該混合物をＣＶ−１細胞へ添加した。１−ランスフエクノヨンブロトコール を、上述のように実施した。この実験では、最もよいトランスフエクンヨンブロ トコールは、ＧＡＬＡ−デントリマーーＤＮＡ？ＩＪ合体て達せられ、次いで、 デントリマー−ＤＮＡそれから、ポリリジン−ＤＮＡで達せられた（表２）。

スペルミノンビスーアクリジン誘導体（図８に合成が示されている）を、ｌ×１ ０”　（ｐＨ７，４：　０．２Ｍ　ＮａＣＩ）より大きい親和定数を有する二重 鎖核酸−＼インターカレートさせ、ＤＮＡに対する種々のターゲティング分子を 結合するように用いることかできる。糖質、ペプチド、ホルモン、ビタミン、補 因子、タンパク質又は抗体を、ターゲティングリガンドとして全て用いることが できる。

Ａ　スペルミジンヒス−アクリジン 体の所定の部位に核酸を向けるためのスキームは、二重鎖ＤＮＡへの細胞表面成 分と相互作用するりガントのインターカレーションに基づいている。スペルミル の選択的Ｎ４−アンル化の手順は、Ｎ’、Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキソ力ルボニル ）スペルミジンを出発物質どして用いて、報告されている。Ｒ，Ｊ、バーゲロン （Ｂｅｒｇｅｒｏｎ）ら、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（１９８２）　６８９−６９２ ゜我々は、この方法を用いて（図８）酸機能性化ガラクトシル誘導体９及び９′ をＮ’　、Ｎ”　−Ｂｏｃ保護スペルミンンシン５）の二級アミノ基に連結して 、得られたガラクトモル化スベルミジ／１７及び１７′を、脱保護の後に、標準 的な化学手順により９−フェノキンアクリノンを用いて更にアルギル化し、ビス インターカレーター化合物２１及び２ビ　＼それを変換した。カルボン酸機能性 化ガラクトシル誘導体の合成は、詳細に記述さ第１（Ｊ、／＼スラシーＨａｅｎ ｓｌｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　（１９８８）　 ９４６：９５−１０５）、これらは広い範囲のｗ４質リガンドに簡単に適用可能 である（Ｍ、　Ｍ、　ボレビボ＞（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ）ら、Ｊ、ＬＩｅｄ、Ｃｈ ｅｍ、　（１９８１）　２４：１３８８−１３９５．表題の化合物を総数率３０ ９４で得て、ＮＭＲ及び質量分析５１のデータは、この提案された構造と矛↓、 記スキームに基ついて、ペプチドをスペルミジンビス−アクリジン誘導体に結合 するための色々な方法か開発されている。Ｎ’、Ｎ”−ビス（ｔ−ブトキン力ル ポニノリスペルミジンは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニ ル）ブチジー１−　（ＳＭＰＢ）（４）によりＮ４−アシル化され、脱保護され 、アクリツノ環とカップリングして、マレイミド基を有するヒスインターカレー ター（２０）を作製した。単一化合物を、ケイ酸におけるクロマトグラフィー精 製後に、２５９６総収率で得た。ＮＭＲ及び質量分析計の結果は、定められた構 造とＮＬＳペプチド、Ｐ　Ｋ　Ｋ　Ｋ　ＲＫ　Ｖ　（カネダら、前述）及び同一 組成であるが異なる配列の対照ペプチドを、ＡＢＩ自動ペプチド合成機において 、Ｎ末端システィン残基を用いて合成した。その後、システィンペプチドを、マ レイミド基含有イ〉ターカレーター（図９）に結合して、二重鎖核酸へ固定（ア ンカー）するこ１ｙｓ−Ｉｙｓペプチド結合から成る生分解性リンカ−を、図１ Ｏに示されるようにして合成する。図では、ガラクトース残基を、未保護アミン に配置する。

或いは、２つの隣接したりジン残基を含む保護ペプチドを、固相合成によって合 成する。ペプチドは、膜透過化機能又はターゲティング機能をもたらし、アクリ ノン残基を、リジン上の２つのと一アミノ基に添加する。

実施例２のガラクトシル化ヒスーアクリジン２１及び２１’　（２＋’は、ガラ クトースが３つの余分の炭素によってスペルミジンビス−アクリジンと区別され ている２１のホモログ（同属体））が、ＤＮＡに結合している間に可溶性リセブ ターと相互作用できるかを決定するために、我々は、ゲルシフトアッセイを用い た。このアッセイでは、ガラクトース結合タ：／バク質、リシナス・コミュニス （Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）レクチンＲＣＡ１２４を、ガラクトシル −ビス−アクリジン−ＤＮＡ１合体と共にインキュベートした。このタンパク質 が該複合体と相互作用して、該複合体かＤＮＡと結合したままの場合に、ＤＮＡ は、電気泳動ゲルへ移動しない。プラスミドｐｃ］ｕｃ４の各試料（２μＩ　； 　Ｉ　４０ｎｇ）を、１３゜５ｐｍｏｌの２１又は２１′と混合して、表示の際 に、１μｌ　（３３，３ｐｍ。

１）のＲＣＡ　１２゜を、過剰のフリーなガラクトース（１，３５０ｍｏｌ）と 添加した。

室温での３０分のインキュベーションの後に、試料を０．０４Ｍ１−リスアセテ ート緩衝液システム（ｐＨ７，６）を用いて０．　８％アガロースゲルに電気泳 動させ、エンチウムブロマイドで染色してＤＮＡを可視化した（図１１）。

ガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンのｐｃ１ｕｃ４プラスミドへのイ ンターカレーションは、化合物２１′　（レーンＢ）又は２１　（レーンＥ）と 複合化した場合にプラスミドに認められる遅延によって示される。ビス−アクリ ジンのＤＮＡへのインターカレーションは、超らせん形態から弛緩環状形態への 変化をもたらし、これはゆっくりと移動する。

プラスミド−ガラクトース複合体のガラクトースに対する可溶性リセブターへの 結合可能性は、リシナス・コミュニスのレクチンＲＣＡ　Ｉ　２゜の存在下で、 複合体の殆と完全な遅延によって示される（レーンＣ及びＦ）。ＲＣＡ　Ｉ　２ ゜はダイマーであり、末端のβ−Ｄ−ガラクトース残基に選択される２つの結合 部位を存し、従って、プラスミド−ガラクト−ス複合体に架橋することもてきる 。化合物２１又は２１′と複合化した場合のプラスミドｐ　ＣＩ　ｕ　Ｃ４との ＲＣＡ　Ｉ　２゜の相互作用は、ゲルー＼浸透しない巨大な凝集体の形成をもた らす。この相互作用は、プラスミドが２１とよりも２１′と複合化する場合に、 より一層効果的であるようだ。

プラスミドに架橋するために、ＲＣＡ　＋　ｚ　ｏは、隣接するプラスミド間に 存在する静電反発を打開しなけれはならない。従って、化合物２１’によっても たらされる複合体の場合のように、スペーサーアームによってガラクトースをプ ラスミドの表面から離すことは、レクチンの結合をより容易にする。多価の相互 作用の結果として、ＲＣＡ　ｌ　２゜により形成されるプラスミド凝集体は、か なり安定であり、＋ｎ０１ｎ過剰な競合する１ｆｉｌ［ｉのりガント例えばガラ クトースによって分解されない（レーンＤ及びＧ）。

ウシ胸腺ＤＮＡに対するビス−アクリジンの親和性は、二重鎖核酸からのエチジ ウムブロマイドの置換によって概算されたに−ルセン、前述）。エチジウム置換 を、ＤＮＡから放出される際に起こるエチジウムブロマイド蛍光（ｅｘ、＝５４ ０ｎｍ、ｅｍ　二６１０ｎｍ）の減少によってモニターした。エチジウムブロマ イドに相関するしスペルミジンの結合定数は、ＩＣ，。によって概算される。

この研究では、記述されたようにに−ルセン、前述）合成されたスペルミジンし スーアクリジントリヒトロクロライト（ＳＢＡ・３ＨＣ］）を、参照化合物とし て用いた。３つの正電荷の１つを失った結果、スペルミジンビス−アクリジンの Ｎ４アミノ基か、化合物２１　（Ｇａ　］−ｂＡ・２ＨＣ１）のターゲテイング 糖質によってアミド結合に引き込まれる際に、親和性における僅かだが顕著な減 少か認められる。しかし、我々は、スペルミジンビス−アクリジンが高く正に帯 電したＮＬＳペプチドＰ　Ｋ　Ｋ　Ｋ　ＲＫ　Ｖに連結される際に、親和性にお ける増加を推、則した。Ｇ　カラツブ（Ｋａｒｕｐ）ら、Ｉｎｔｊ、Ｐｅｐｔｉ ｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　（１９８Ｂ）　３２：３３１−３４３゜ 種々の実施例でＤＮＡに対するターゲティングリガンドを攻撃するように合成さ れた結合体は、表３に示されている。

ＳＢＡ・３ＨＣ１２，４Ｘ　１０’ Ｇａｌ−３−ｂＡ’　３．５　Ｘ　ＬＯ°７Ｇａｌ−６−ｂＡ”　７．９　Ｘ　 １０”ｃａｌ、Ｌｙｓ、−ｂＡ’　５．４　Ｘ　１０’マレイミド−ｂＡ’　６ ．５　Ｘ　１０°７ＷＴｃｙｓ−ｂＡ’　１４　Ｘ　１０°７ＳＮＬ−ｂＡ’　 １４　Ｘ　１０°７ １ｎ＝３の場合の化合物２１ ２ｎ＝６の場合の化合物２１ ３化合物２６（実施例６に示されている）４化合物２０ ’　ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧに連結したＳＢＡ’　ＣＧＹＫＰＫＶＲＧＫＧ ＫＧに連結した５ＢＡ一種々のビス−アクリジンにおける結合定数は、２−Ｍｅ ｒによる非共同競合結合を介した直線格子についての４−Ｍｅ　ｒの結合親和性 を測定する方法（Ａ、つオルフエ（Ｗｏｌｆｅ）及びＴ、メエハンＱｌｅｅｈａ ｎ）、Ｊ、λｌｏ１．８ｉｏ１．．２２３：１０６３−１０８７．１９９２）及 びエチジウムブロマイドに対する５、３ＸＩＯ−”Ｍの内因性解離定数を用いる ことによって、エチジウムブロマイト置換アッセイから算出された。

ガラクトノルターゲティングリガントを含有するビスーアクリジンインター力テ ーターのターゲティング能を制■する因子を証明するために、ラット肝細胞を、 ラット肝臓から単離し、５％ウウシ仔血清及び抗生物質を含有するＭＥＭ培地３ ｍｌに、６０ｍｍベトリ皿中で１０’肝細胞の密度で培養した。肝細胞が、アン アロオロソムコイドを結合することによってガラクトースリセブターを有するこ とが示されることによって、肝細胞は、ガラクトースリセプターを有することが 示される。３７°Ｃで１８時間後に培地を取り除き、１ｍｌのＭＥＭで置換した 。

その後、１００μｌの水中、５ＢＡ−３ＨＣＩＳＧａｌ−３−ｂＡ、Ｇａｌ　− ６−ｂＡ又はＧａ　Ｉｓ　−ＬＹＳ２−ｂＡと複合化されたｌｔｌｇの１１６１ 標識化プラスニドＤＮＡを、培養皿に添加した。インターカレータ一対プラスミ ド比は、５００１又は１０００：ｌてあった。細胞を、更に１時間３７℃で培養 し、その後にゆすぎ、タンパク質を１ｍｌのＮａ０Ｈ（ＩＮ）中で消化した。細 胞溶解物を、放射能活性についてカウントし、タンパク質を測定した。細胞結合 プラスミドの量をｎｇのプラスミド／ｍｇの細胞タンパク質で表示し、複合化剤 の機能としてグラフ化した（図１２）。３つ全てのガラクトシルビス−アクリジ ン化合物か、ＤＮＡと結合しく表２）、可溶性ガラクトース結合タンパク質と相 互作用する二とができる（実施例３）が、Ｇａ　ｌ２−Ｌｙｓｔ−ｂＡのみは、 細胞表面リセブターと相互作用することができた。従って、細胞表面リセブター への効果的なターゲティングは、細胞表面リセブターと相互作用することができ るにａｌ＊−Ｌｙｓ２−ｂ八（合成は、図１３及び実施例６に示されている）に よってもたらされる一層長いスペーサーアームを必要とする。

実施例６ ３つのターゲティングリガンドを含む生分解性ビス−アクリジンニトリガラクト シル化スペルミジンビス−アクリジンの合成この分子の完全な合成は、図１３に 示されている。

Ｌ−リジル−し−リジンビス−トリフルオロアセテート（２２）の合成・　Ｎ− ε−ＢＯＣ−Ｌ−リンン（６０シンｍｇ、　２．　４５ｍｍｏｌ）及びＮ−Ｎ− ε−ビス−ＢＯＣ−Ｌ−リジン−ｐ−＝トロフェニルエステル（２，２８ｇ　： 　４．　９ｍｍｏｌ）を、６４０μｍのＮ、　Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン （３，７ｍｍｏｌ）を含有する４０ｍ１のＮ−メチルモルホリン中で混合した。

該混合物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌し、ろ過して不溶性の微量な未反応Ｎ −ε−ＢＯＣ−Ｌ−リジンを取り除いて、高減圧下で乾燥状態まで蒸発させた。

残渣をＣＨＣｌ＠　／ＣＨｓ　ＯＨ／Ｈ，０９：ｌ：０．ｌ系て溶出されるシリ カゲルカラム中で精製して、１．２２ｇの精製ＢＯＣ−保護化リジンダイマーを 得た；収率は８７％であった。

脱保護：　７００ｍｇ（１，２ｍｍｏｌ）のＢＯＣ−保護化リジンダイマーを含 有する冷フラスコ（ドライアイス）に、５ｍｌのＴＦＡを添加した。この混合物 を室温まで温めて、アルゴン下で攪拌した。３０分間の攪拌後、トリフルオロ酢 酸を減圧下で蒸発させた。残渣をアセトン中に取り出し、蒸発させた（５回）。

最終的に、該残渣を、１４ｍ１の水に再溶解し、８ｍｌのクロロホルムで３回抽 出して、凍結乾燥して、４８０ｍｇの表題の化合物を得た；収率は８０％であっ た。

保護化トリガラクトシルリジンダイマー：　Ｎａ−（Ｎａ−Ｎａ−ビス（６−（ ｌ−チオ−２，３，４，６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノノ ル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−１−チオ−２，３，４，６−テ トラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジ ン（２３）の合成： ５０５μｍのトリエチルアミン（３，６ｍｍｏｌ）を含有する８ｍｌの無水ＤＭ Ｆ中、Ｌ−リンルーし一リジンビスートリフルオロアセテート（４００ｍｇ；０ ．８ｍｍｏ１）の溶液に、ｐ−ニトロフェニル−６−（ｌ−チオ−２，３，４， ６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノエート（１ ，４４ｇ；２、　４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、アルゴン下で一晩攪 拌して、乾燥状態まで蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム上のクロマトグラ フィーにより精製し、ＣＨＣｌ２／ＣＨｆｆＯＨ／Ｈ２０９０：１０：０．５で 溶出して、４６３ｍｇの表題の化合物を得た。収率は３５％であった。

Ｍ　Ｓ　計算値＋　ＣＩＨ１１２Ｎ４０２ｚＳｓ　ｍ／ｚ＝　１６５２、実測値 ＋ｍ／ｚ＝１６５３．６　（Ｍ＋Ｈ）＋、ｍ／ｚ＝　１６７７．６　（Ｍ十Ｎａ ）＋、ｍ／ｚ＝１６９３．６　（Ｍ＋Ｋ）＋ 選択的にブロックされたスペルミジンとの反応：Ｎ４−（Ｎａ−〔Ｎａ、Ｎａ− ビス（６−（１−チオ−２，３，４，６−テトラ−０−了セチルーβ−Ｄ−ガラ クトピラノツル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−１−チオ−２，３ ，４，６−チトシー〇−了セチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル ）−Ｌ−リジル）−Ｎｌ、Ｎａ−ビスＢＯＣ−スペルミノン（２４）の合成。

化合物２３　（１３２ｍｇ；８０μｍｏｌ）を、５ｍｌの無水塩化メチレン中、 ＤＣＣ（２０ｍｇ；　９７μｍｏｌ　）の存在下、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ ド（１１ｍｇ、９６μｍａｌ）によるエステル化によって活性化した。アルゴン 下、室温での４時間の攪拌後、ウレア沈殿物をろ過によって取り除き、ろ過物を 減圧下で蒸発させた。乾燥残渣を、３ｍｌのアセトニトリルに再溶解し、１４μ ｌのトリエチルアミン（１００μｍ）を含有する３ｍｌのアセトニトリル中のＮ １．Ｎａ−ヒス（ｔ−ブトキシカルボニルスペルミシン）塩酸（３０ｍｇ；８０ μｍｏｌ　）の溶液・′＼、１滴ずつ添加した。該混合物をアルゴン下、室温で ４８時間更に攪拌し、Ｉｌ＆、Ｉ−Ｅ下で蒸発させて、残ｊｌｊ、をシリカゲル カラム中で精製して、ＣＨＣｌ、／ＣＨ！ＯＨ／Ｈ２０９０：　ｌ　Ｏ：　ｌて 溶出して、７１ｍｇの表題の化合物を得た；収率は４５％であった。

脱保護　Ｎ４−（Ｎａ−〔Ｎａ、Ｎａ−ビス（６−（１−チオーβ−Ｄ−ガー） りトビラノンル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−（１−チオーβ− Ｄ−ガラクトピラノツル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル〕スペルミジン（２５） の合成 化合物２４　（７１ｍｇ＋３６μｍｏｌ　）を、化合物１１について前述された ように脱１！護した。ＢＯＣ保護基を、５ｍｌのＴＦＡで３０分間処理してスペ ルミジンリンカ−から取り除き、アセチル保護基をＣＨ，ＯＨ／ＮＥｔ、／Ｈ２ ０５＋４１の混合物で一晩処理してガラクトシル頭部基から取り除いた。スペル ミジン誘導体のヒストリフルオロアセテート塩を、小型バイオラド　ＡＧ　ｌＸ ２（ＯＨ−）カラムに該塩の水溶液を通すことによって、フリーのアミンに変換 した。

糖［７１）ひアミノについて陽性の分画を、−緒に集めて凍結乾燥して、３６ｍ ｇの化合物２５を冴た：収率は７９％であった。

アクリジン結合：Ｎ４−（Ｎａ−〔Ｎａ、Ｎａ−ビス（６−（１−チオーβ−Ｄ −ガラクトピラノシル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−（１−千オ ーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル）−Ｎｌ、Ｎａ− ヒス−アクリジンスペルミジン（２６）（”Ｇａ　ｉｓ　−Ｌｙｓｔ　−ｂＡ” 　）の合成 化合物２５　（３６ｍｇ　：　２８．　５μｍｏｌ　）及び１８ｍｇの９−フェ ノキシアクリジンを、３ｇのフェノールに８０°Ｃて溶角￥し、該溶液を、アル ゴン下８０°Ｃで更に２時間攪拌した。その後、該混合物を約４０°Ｃまで冷や し、１５ｍ１のエーテルに注いて、アミノアクリジンを沈殿させた。黄色の沈殿 物を、濾紙上にろ過によって回収し、４ｍｌのブタノール／エタノール混合物３ 二１中に再溶解した。

その後、二の溶液を約１ｍｌまての蒸発により濃縮し、ビス−アクリジン誘導体 をシリカゲルにおけるクロマトグラフィーによって単離した・６：２：１：２３ ４ｍｇの表題の化合物を得た。収率２１％であった。

ＭＳ　計算値　Ｃ＊＋Ｈｍ　Ｎ＊　０ｚｏＳｓ　ｍ／ｚ＝１６３１．実測値＋ｍ ／ｚ＝＋　６３２．８　（Ｍ＋Ｈ）＋、ｍ／ｚ＝　１６５４．　８　（Ｍ＋Ｎａ ）　＋。

？：ｉ量の５ｋｂの放射性ヨウ素化プラスミド（ＣＭＶ−βＧａ１）を含む５μ ｍのＴＥと、実施例２−Ｃの核局在性ペプチドービスーアクリジン結合物８ｎｍ ｏｌを含む５０μｌの水とを、４５μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８）中で、溶液中８ ０μｇのｐＣＩｕｃ４　（＋２３ｎｅｑ、ｂｐ）に添加した。プラスミド対ペプ チド結合物の比は、１　：　３　（ｌ　Ｏてあった。室温ての１時間の静置後に 、１００μｍのトリス−ＣＩ緩衝液（ｐＨ９）を該複合体へ添加して、得られた 溶液を、ｐＨ感受性リポソームの調製のために、６００μｍのエーテル中に溶解 した１２μｍｏｌの脂質（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ　２：Ｉ、モル比）と混合した 。

ＤＮＡ−ペプチド複合体を含有する小胞を、ファイコール密度勾配にリポソーム を１７かせることによって、未被包化物質から分離した。被包化効率（２０％± ４９６）を、動的光散乱（コルターＮ４、フルトロニクス）によって測定した。

細胞を４μｍのリポソーム−被包化プラスミド（１００μ］のリポソーム溶液） を用いて、３７°Ｃ５時間でトランスフェクトして、リンフエラーゼ活性を生物 発光計において４８時間後にカウントした。表４は、測定された光単位量／ｍｇ 細胞タンパク質を、リポソーム内容物の機能として示している。値は、３回の測 定の平均である。

人工 プラスミド　のみの複合１本　プラスミド　−ＷＴｃｙｓ　−ｂＡ複合体　プラ スミド−５ＮＬ　−ｂＡ（０，３２±０．０２）　１０’　（０，８２＋０．３ ６）　１０’　（１，３６＋０．２８）　１０＠ｐＨ感受性リポソームが、宿主 細胞の細胞質へその内容物を送達するならば、襟のプラスミドは、核を透過する ことができなければならない。

ペプチド−ビス−アクリジン結合物か分角〒がらＤＮＡを保護することを除くな らは、観察されたトランスフェクション促進は、増加された核エントリーの結果 てなけオ］はならない。４〜５倍増加したトランスフェクションは、公開された 結果と一致しており（カネダら、前述）、これは、ＤＮＡに結合して、核へのＤ ＮＡエントリーを促進するタンパク質を用いている。ＳＮＬペプチドとＷＴｃｙ ｓペプチドの両方が発現を増加し、核へＤＮＡを向ける便利な技術である。

合成は、Ｓ　ベルゲストロン（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ）ら、Ａｃｔａ、　Ｃｈｅｍ 、　５ｃａｎｄ、　、　（１９５３）　７：１１２６に基ついている。２０４ｍ ｇ　（０，５００ミリモル）のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチュ ーブ中に計り、２．５ｍｌのジオキサン及び７０μｍ（０，５００ミリモル）の トリエチルアミンを、このチューブへ添加した。この混合物を、水浴中で、溶液 が固体化するまで（約１２°Ｃ）冷やした。６５μｍ　（０，５００ミリモル） のイソブチルクロロホルメートを添加して、反応チューブを振り、水浴へ戻した 。或いは、このチューブを取り出して、浴に移し、初期の固体化の時点の温度に ３０分間、維持した。

α−ヘニズルエステル　Ｎ−ε−ＴＢＯＣリジン（０，５００ミリモル）及び７ ０μＩ　（０，５００ミリモル）のトリエチルアミンを０．６ｍｌの水に懸濁し た。該混合物を水浴中で冷し、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を 他の０．５ｍｌの氷水を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、水浴 中に１／２時間置き、その後、室温まで温めた。

有機溶媒の殆どを、アルゴンガスの気流下で蒸発させ、残渣を３ｍｌまでの水に 解かした。５％水性炭酸ナトリウムを、ｐＨが９になるまで１滴ずつ添加した。

該混合物を３ｍｌのエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持した。

水相残渣に、０．５Ｎの塩酸をｐＨが４になるまで添加した。該混合物を３ｍｌ のエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持した。

水相残渣のｐＨを、０．５Ｎの塩酸で４までに調整し、３ｍｌのエチルアセテー トへ５回抽出した。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧下で乾 燥状態になるまで蒸発させ、２８４ｍｇの無色の粉末溶融物を得た。ε−アミン のためのｔＢｏｃ保護基を、探準方法で取り除き、コール酸の正に帯電したりノ ン誘導体を得た。同様の方法で、コール酸の他の正に帯電した誘導体を調製する ことができる。

Ｂ、＋−リス（２−アミノエチル）アミンのコール酸アミドの調製多重アミン基 が、活性化コール酸へカップリングすることに有効である場合、該アミノ酸を、 実施例８Ａで記述したように調製された６倍量の活性化胆汁酸塩に添加する。合 成は、パルゲストンら、前述、の方法に基づいている。２０４ｍｇ（０，５００ ミリモル）のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に計る。２ ．５ｍｌのジオキサン及び７０μ＋　（０，５００ミリモル）のトリエチルアミ ンを添加する。水浴中で、溶液が固体化するまで（約１２°Ｃ）冷やす。６５μ ＋　（０，５００ミリモル）のイソブチルクロロホルメートを添加して、反応チ ューブを振った後に、水浴へ戻した。或いは、このチューブを取り出して、浴に 移し、初期の固体化の時点の温度に３０分間、維持した。

（３００ミリモル）のトリス（２−アミノエチル）アミン及び０．６ｍｌの水中 、７０μ＋　（０，５００ミリモル）のトリエチルアミンを添加する。水浴中で 冷やし、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を他の０．５ｍｌの氷水 を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、水浴中に１／２時間置き、 その後、室温まで温めさせた。

有機溶媒の殆とを、アルゴンガスの気流下で蒸発させる。残渣を３ｍｌまでの水 に解かす。５％水性炭酸ナトリウムを、ｐＨが７になるまで１滴ずつ添加する。

該混合物を３ｍｌのエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持する。

水相残渣に、０．５Ｎの塩酸をｐＨが４になるまで添加する。３ｍｌのエチルエ ーテルで３回抽出して、水相を保持する。

水相残渣のｐＨを、０．５Ｎの塩酸で４までに再調整し、３ｍｌのエチルアセテ ート＼５回抽出する。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧下で 乾燥状態になるまで蒸発させて、トリス（アミノエチル）アミンのコール酸アミ ）・を得る。

ＰＥＧ結合ヒス−アクリジンスペルミジンを下記の標準化学的に合成し、それは 、下記の工程に関連する。

Ｒ’　Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−０）、−Ｈ−−−一活性化剤−−−−→Ｒ’　Ｏ −（ＣＨ，−ＣＨ２−０）、−Ｒ”　−−−−ビスーアクリジンーー→Ｒ’　Ｏ −（ＣＨｔ　−ＣＨ２−０）い−Ｒ−ビス−アクリジンは、Ｒ’　＝Ｈ又はＣＨ ３、及びＲ”＝活性化する基及び、ｎ＝１ｏ−２５０、好ましくは、２０〜６０ である。

活性化モノメトキシＰＥ０分子又は活性化ＰＥ０分子を調製する方法は、沢山あ る。好ましい方法は、Ｄ、シーウッド（Ｌａｒｗｏｏｄ）とＦ、スジツカ、Ｊ、 　ＬａｂｅｌｌｅｄＣｏｍｐ、＆　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、　（１９８４）　２ １：６０３−６１４に記述されている。ポリエチレングリコール　１９００　カ ルボニルイミダゾールメチルエーテルを、２ｍｌの乾燥塩化メチレン中、５３０ ｍｇ　（０，２８ｍｍｏｌ）の乾燥ＰＥＧ　１９００　モノエチルエステルを取 り、７８ｍｇ　（０，４６ｍｍｏｌ）のカルボニルジイミダゾール及び１０ｍｇ 　（０，１１ｍｍｏｌ）のイミダゾール（ナトリウム塩）に添加して調製した。

−晩攪拌した後、６ｍｌの乾燥塩化メチレンを添加し、該混合物を３．７５ｍ１ の水で抽出し、それから無水ナトリウムサルフェートで乾燥した。ろ過後、溶媒 と取り除き、定量的に得た。或いは、該溶媒を取り除いて、得られた油分を、− ２０°Ｃてクロロホルム／ジエチルエーテルにより再結晶した。得られたイミダ ゾールカルバメート白色結晶を、よく冷やした漏斗を通してろ過し、少量のジエ チルエーテルてゆすいて、すぐに使用した。

イミダゾールカルバメート（０，１ｍＭ）を、０．１２５ｍＭのＮ、　Ｎ’−ビ ス−（９−アクリジニル）−４−アザ−１，８−ジアミノオクタン（″ビス−ア クリジンスペルミジン”、これは、Ｐ、ニールセン、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　１２２：２８３−２８９．１９９２に記述されているように調製した）に 添加し、フェノールに溶解して、アルゴン下で２時間反［Ｆ］を進ませる。該混 合物を乾燥状態にして、黄色の生産物を、まず冷エタノールで、次いでジエチル エーテルで洗浄する。ＰＥＧをカルバメ−１・結合を介して、ヒス−アクリジン スペルミジンの二級アミンに結合し、モノメトキノＰＥＧ−ビスーアクリジンス ペルミオシンを形成する。これは水に可溶性である。

同様の方法で、非ブロック化ＰＧＥ　（分子量６０００）を、上述のように活性 化してヒスイミダゾールカルバメートＰＥＧを形成する。このビスイミダゾール カルバメートＰＥＧは、２．５倍量のビス−アクリジンスペルミジンと反応させ て、ヒス（ビス−アクリジンスペルミジン）−ＰＥＧ　６０００を形成する。

ＰＥＧ及びモノメトキシＰＥＧのための種々の型の活性化剤が、ウラドル（Ｗｏ 。

ｄｌｅ）らの米国特許第５．０１３．５５６号に記載されている。これらの方法 を、種々の化学を介してヒス−アクリジン分子に結合することができる反応性Ｐ ＥＧを生成するために、用いることができる。例えば、モノメトキシ−ＰＥＧを 含むスルフヒドリルは、実施例２Ｂのマレイミド含有ビス−アクリジンに結合す ることができＰＥ０分子を用いてＤＮＡの表面をマスクすることができ、ＤＮＡ を、長期間にわたって循環させることができる。放射性ヨウ素化プラスミドＤＮ Ａを、実施例９て合成されたようなモノメトキシ−ＰＥＧ　１９００−ビス−ア クリジンスペルミジンと、２０ｂｐ−ＤＩ’ＪＡ対ＩＰＥｃ；分子の比で、３０ 分間室温で混合する。少量の複合体、ＰＢＳＯ，２ｍｌ中の５μｇのＤＮＡを、 １２匹のマウス群の各々へ、尾静脈を介して注入する。マウスを、注入後の種々 の期間で犠牲化させる。血液及び他の器官を取り出して、各器官に結合した放射 能活性を測定する。

モノメトキンＰＥＧ−ビスーアクリジンスペルミジンに複合化してないＤＮＡを 、マウスの第２群へ注射する。これを対照マウスとする。１０分後に、１５％の 放射能活性プラスミドＤＮＡが、対照マウスの血液中に残存するが、モノメトキ シＰＥＧ−ビスーアクリジンスペルミノンＤＮＡ群では、顕著に大きしルベルの 放射能標識化プラスミド−ＰＥＧ複合体が循環系に残存することは、ＰＥＧ−ビ ス−アクリノンスペルミジンによるＤＮＡ分子の明確なマスキング効果を示して いる。

実施例１ル −ツチンアシルアミンマスキング剤の合成ポリヌクレオチドマスキング脂質の合 成は、標準的な化学によって達成され、例えはＣ，ビジョン（Ｐｉｄｇｅｏｎ’ ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８９）　１７６＋３６−４７に記載さ れている。

１、１．１２−ドデカンジカルボン酸＋ＤＣＣ−−−−ＴＨＦ、２５°Ｃ−−− −−−→無水トデンカンカルボン酸（環状無水物）２　モノアノルリゾレンチン 　＋　環状無水物−−−−−ＣＨＣｌ、　、ＤＭＡＰ、２５°ｃ、４８時間−一 −−→レシチン　−　Ｃ００Ｈ ３しノチン−ＣＯＯＨ＋　カルポ二ルジイミダゾール−−−−−ＣＨＣＩ　、　 、２５°Ｃ１２時間−−−一−−→レシチンイミダゾリド ４　レノチンイミダゾリド　士　アミン反応剤−−−−ＣＨＣＩ、、２５℃、２ ４時間−ｍ−・−一一→カチオン性レシチン レシチンイミダゾリドとアミン反応剤との最終反応は、レシチンイミダゾリドの 形成後すぐに行われる。レシチンイミダゾリド（０，１ｍＭ）を、クロロホルム 中のアミン（０、７ｍＭ）の溶液へ添加する。このカップリングに好適なアミ看 よ、明細書中に挙げられている。

室温での２時間後に、反応混合物を、２倍量の水／メタノールに添加し、そして ｐＨを１０に調整する。レシチン結合アミンを、有機相へ抽出する。その後、ｆ 丁機相を０．１Ｍの塩化ナトリウムで洗浄し、有機相を乾燥状態にする。得られ たアシルアミンレシチンを、ポリヌクレオチドの表面をマスクするために用いる 。

神々のリゾレシチン分子を、レシチン−ＣＯＯＨを調製するために用いることが でき、これには、ドデシル、ミリストイル、バルミトイル、オレイル若しくはフ ィタニル又はステアリルが含まれる。他の頭部基例えばエタノールアミン又はホ スファチシン酸を、活性化工程で好適に保護され、反応の最後に脱保護されるな らは、レシチンに換えることができる。

実施例１１のレシチンアシルアミンを、エタノール溶液からのＤＮＡへ、ＤＮＡ 上の各リン酸基に対してｌの正電荷の割合で、添加することができる。該分子を 、ＤＮＡの表面をマスクするために用いて、ＤＮＡを長期にわたって循環可能に する二とができる。少量の複合体、ＰＢＳＯ，２ｍｌ中、５μｇのＤＮＡを、１ ２匹のマウス群の各々へ尾静脈を介して注入する。マウスを、注射後の種々の時 期で犠牲化させる。血液及び他の器官を取り出し、各器官に結合した放射能活性 を測定する。レシチンアシルアミンに複合化していないＤＮＡを、第２の群のマ ウス・＼注射する。これを対照マウスとする。１０分後に、１５％の放射活性プ ラスミドＤＮＡが対照群のマウスにおける血液中に残存しているが、モノメトキ ノＰＥＧ−ビスーアクリジンスペルミジンＤＮＡ群において顕著に大きいレベル の放射は脆化プラスミドＰＥＧ複合体か循環系に残存することは、レシチンアシ ルアミンによるＤＮＡ分子の明確なマスキング効果を示している。

ディシュあたりの添加ＤＮＡ　（μ９）０．０　０．２　０．４　０．６　０． ａ　１．０　１．２　１．４複合体におけるグラミシジン　Ｓ／　ＤＮＡ　電荷 比脂質 トランスフェクション系 ｆｉｇ、１１ ＦＩＧＵＲＥ１２ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年ｌθ月３日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３４０６ ２　発明の名称　自己慣築ポリヌクレオチド送達システム３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　９４６１２−３５５０　カリフォルニア州オーグラン ド　トウニンティーセカンド　フロアレイクサイド　ドライブ　３００ 氏　名　ザ　リージエンツ　オン　ザ　ユニバーシティ　オンカリフオルニア 国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　号１６０　東京都新宿区新宿４丁目３番１７号ＨＫ新宿ビル７Ｆ　ｒＬ 話３３５７−５１７１５、補正書の提出年月日 １９９３年１１月２日 ６　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１通 ヱ冬±Ｌｉ　！ｎＶｉＶｏで遺伝子を直接送達することについての懸念は、望ま しい細胞の目的地に達するために十分長い、循環系におけるポリヌクレオチドの ｆｊ［能である。　“マスキング、即ち、ポリヌクレオチドの保護は、この懸念 を処理するひとつのやり方である。

微粒子状物質（例えば赤血球ゴースト、再構築ウィルスエンベロープ及びリポソ ーム）は、遺伝子輸送における保護として一部用いられている。Ｃ，ニコラウ（ Ｎｉｃｏｌａｕ’）　ら、Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｔｈｅｒ、Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒ、 Ｓｙｓ、、（＋９８９）　６：２３９−２７１　；　Ｒ，i、マ ニオ０．Ｉａｎｎｉｏ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８８）　６： ６８２−６９０゜最も成果を挙げているリボノーム系は、カチオン性脂質試薬で あるジオレオイルオキシトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を用いる。Ｐ、 　Ｌ、　フエルナーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、 　ＵＳＡ、（＋９８７）８４ニア４１３−７４１７゜ＤＯＴＭＡは、ホスファチ ジルエタノールアミン（ＰＥ）と混合して、試薬、リポフエクチン（商品名）を 形成する。リボフエクチン（商品名、以下省部）を用いることの利点は、カチオ ン性リポソームが簡単にＤＮＡとｌ見合して、細胞へ添加されることである。Ｄ ＮＡをリポソームの内部へカチオン性試薬によって被包化する必要はない。リポ フエクチンは、培養系においてリポータ−遺伝子をヒト膝上皮細胞へ輸送するこ と（Ｌ、ルー（Ｌｕ）ら、Ｐｆｕｇｅｒｓ　Ａｒｃｈ、、（１９８９）　４１５ ：１９８−２０３）　、気管内経路によってラットへＣＡＴ遺伝子を導入するこ と（Ｔ、　Ａ、　ハジンスキ（ｌ（ａｚｉｎｓｋｉ）ら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｅ５ ｐｉｒ、　Ｃｅｌ　１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　A　（ ＋９９１）４：２０６−２０９）、並びに、気管内及び静脈内経路によってマウ スへＣＡＴ遺伝子を導入すること（Ｋ、　Ｌ、ブリガム（Ｂｒｉｇｈａｍ）ら、 Ａｍ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、　、　（１９８９＞　２９８：２７８−２８ １　：Ａ、ポウ（Ｂｏｕｔ）ら、”Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１９９ １　Ｃｙｓｔｉｃ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ　Ｃｏｎ■■ ｒｅｎｃｅ”、要約、第８７、（＋９９１））に用いられている。約５０％の気 道上皮細胞が、βガラクトシダーセリポーター遺伝子を一時的に発現した（ハジ ンスキら、前述）か、発現レベルは、定量的でなかった。ステロイド感受性プロ モーターに結合されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ Ｔ）は、ラット肺−＼トランスフェクトされた場合、発現を、デキサメタシンに よって正方向に制御できた。ハソンスキら、前述。細胞障害性は、高濃度のりボ ッエフチンによって問題となる。

ＤＯＴｌ’、・ＩＡのための置換体には、リボポリアミン（Ｊ、レフシー（Ｌｏ ｅｆｆ　１ｅｒ）ら、１、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　（１９９０）　５４：ｌ８１ ２−１８１５）　、親指性ポリリジン（Ｘ、シー（Ｚｈｏｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｉ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　。

デオキシリホヌクレオチドの送達のための自明な標的の１つは核である。このプ ロセスに補助することが知られているリガンドは、核局在性ペプチド又はこれら の核局在性配列を含むタンパク質である。Ｃ，ディングウオール（Ｄｉｎｇｗａ ｌ　ｌ）ら、ＴｌＢ５　（＋９９１）＋６・４７８−４８１０Ｙ　カ不ダら、５ ｃｉｅｎｃｅ　（＋９８９）　２４３：３７３−３７８は、再構築ウィルスエン ベロープによってもたらされたトランスフェクション効率が、外来遺伝子が核タ ンパク質と共に標的細胞へ同時送達される場合に、増加することを示している。

核タンパク質と混合したＤＮＡは、アルブミンと混合されたＤＮＡに関したトラ ンスフェクションにおいて、控えめな増加を示す（カネダら）。ＤＮＡは、核局 在性配列（ＮＬＳ）　、ｐｒｏ−１ｙｓ−１ｙｓ−１ｙｓ−ａｒｇ−１ｙｓ−ｖ ａ　ｌを含むタンパク質（Ｐ、　Ａ、シルバー、Ｃｅ１ｌ　（１９９１）　６４ ：４８９−４９７）をプラスミドと結合した場合、より容易に核へ取り込まれる という仮定がある。タンパク質におけるＮＬＳは、核膜孔を通って輸送するよう 指示している。１４アミノ酸の核局在性配列は、踵々の巨大分子且つ更に黄金粒 子（１５０人直径）に結合しており、細１−＼導入された際に、核へ迅速に取り 込まれる（Ｄ、　Ｒ，ファインドレイ（Ｆｉｎｄｌａｙ’）ら、Ｊ、Ｃｅ１１． Ｓｃｉ、５ｕｐｐ、　（＋９８９）　Ｉｌ：２２５−２４２ニジルバー、前述） 。核エントリーか、首尾よく安定したトランスフエクノヨンについて、確率制限 しているという考えは、細胞質へマイクロインジェクションされたプラスミドＤ ＮＡが、細胞のトランスフエクノヨンをもたらすことができない（１０００以上 の細胞質注入でトランスフェクションか認められない）が、核への直接的なプラ スミドのマイクロインジェクションが、５０％以上のマイクロインジェクション された細胞でトランスフェクションをもたらしたという発見にも支持されている 。キャペソチら、前述。プラスミドにおける核局在性シグナルの結合が、核へプ ラスミドＤＮＡの輸送を誘発するならば、トランスフェクション効率は増加する ことができる。我々は、ＮＬＳ及び他のリガントを所望のポリヌクレオチドへ結 合する新規な方法を提案する。

最後に、発明者らは、トランスフェクション効率が、ＤＮＡを種々のカチオン性 夕〉バク質を用いて凝縮した場合に増加することを証明している。Ｔ、１．チク コ不ン：ｌ　（Ｔｉｋｃｈｏｎｅｎｋｏ）ら、Ｇｅｎｅ　（１９８８）　６３： ３２１−３３０　；　Ｍ、ボッガー（ＢｏｔＬｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ。

２つの共有結合した平坦な多環式分子からなるダイマーである。本発明の平坦な 多環式ダイマ一部分は、下記の構造、 Ｚは結合であり、各ｎ及びｍは、独立して１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０ の整数てあり。

Ａｒ１及びＡｒ、は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オ キサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２，７−ジアザビ レニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択される。

ｎ及びｍの値は、ＤＮＡ中のインターカレート化されたアクリジンモノマーの間 隔を決定するのて重要である。ｎ及びｍのより好ましい値は、各々３及び４であ る。ビス−アクリジンダイマーでは、Ａｒ＋及びＡｒ、は共にアクリジンであり 、これが好ましい。

この好ましいＤＮＡ結合部分は、機能性部分に共有結合的に結合され得、この部 分は、前述したような細胞認識部分、単細胞局在性部分又は膜透過化部分である 。ｐの値は、機能性部分からのインターカレーターの分離を決定する。ｐの好ま しい値は、０〜８である。

ＤＮＡ結合部分は、多重コピーの、又は１以上の機能性部分に共有結合されるこ とかできる。例えば、ビス−アクリジンダイマーは、図１３に示されるように肝 細胞のアノアロオロソムコイドリセブターに結合する３つのガラクトース残基と 結合し得る（図１３中の化合物２６を参照のこと）。

ＤＮＡ結合ダイマーを機能性部分へ結合する好適な方法は、下記式、を有する＠ 躯体に関連している。

ボｌ　ミギノンＢ、環状カチオン性ペプチド即ちポリリジン、直鎖カチオン性ペ プチ１−即ちアクリジン、グラミシジンＳに類似した構造を有するが１つの正電 荷のみを含む環状カチオン性ペプチド並びにグラミシジンＳてあった。ルシフェ シーセブラスミドも、リポフエクチンを用いて細胞へトランスフェクトされた。

複合体をＣＶ−Ｉ細胞へ添加し、実施例１て説明したようにルシフェラーゼ活性 を測定した。図７は、グラミノシンＳか最も大きい発現レベルであり、関連した 環状ペプチド、アクリジンかそのすぐ後に続いていることを示している。両方の 環状ペプチドは、細胞へのＤＮＡの輸送の際にリポフエクチンよりも優れていた 。Ｉ−５性は、他の２つのペプチド、ポリミキシンＢ及びポリリジンによっても 認めらｔたか、これら２つのカチオン性ペプチドにより仲介されるルシフェラー ゼ発現のレベルは、グラミシジンＳ又はアクリジンにより誘導される場合よりも 劣ってしポリリジンのようなポリアミンポリマーに対するより良い化学的に定義 された交換物を見出すために、我々は、スターバースト（ＳｔａｒｂｕｒｓｔＸ 商品名）デントリマー（樹状体）微粒子、ｌ・マリア（Ｔｏｍａｌｉａ）ら、前 述、としても知られている親水性分岐ポリカチオン高分子体を用いて、ＤＮＡに よって、又はＤＮＡ及び透過化両親媒性ペプチド、ＧＡＬＡによって、複合体を 形成した。Ｒ，パレンテ（Ｐａｒｅｎｔｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（ １９９０’）　２９：８７２０−８７２８゜複合体を、ポリスチレン管において 、１２μｇのｐｃ］ｕｃ４プラスミドを６６０μｌのＨＢＳ　（２０ｍＭ　Ｈｅ ｐｅｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，４）に希釈することによって調製した 。１でエリ、７・ン（シグマ・ケミカル社）又は５世代スタートバースト（商品 名、以下、１！１３）デントリマー微粒子（Ｉ　ｎｍｏｌ）　（ポリサイエンス 社）を、３４０μｍの）ＴＢＳに溶解し、ＤＮＡ溶液へゆっくりと（１滴ずつ） 添加した。これらの条件下では、ポリリジンのニブシロン位アミノ基からの、又 は該デンドリマーの木手肖アミンからの正電荷は、プラスミドの負電荷よりもｌ 、３倍過剰である。ペプチドＧＡＬＡを添加する場合、ＧＡＬＡにおける負電荷 か該デントリマーにお１ブる過？Ｉな電荷を中性化するように添加した。この混 合物を、室温での最終添加後に３０分間静置して、その後、５００ｕ１の該混合 物をＣＶ−１細胞へ添加した。トランスフェクションプロトコールを、上述のよ うに実施した。この実験では、最もよいトランスフェクションプロトフールは、 ＧＡＬＡ−デンドリマーーーＤＮＡｍ合体て達せられ、次いて、デンドリマー− ＤＮＡそれから、ポリリジン−ＤＮＡで達せられた。結果は、下記表２に示しで ある。

！且 ＤＮＡ−デンドリマー仲介トランスフェクションスペルミジンビス−アクリジン 誘導体（ＩＩＩＢに合成が示されている）を、ｌ×１０’　（ｐＨ７，４＋０． ２Ｍ　ＮａＣ１）より大きい親和定数を有する二重鎖核酸−＼インターカレート させ、ＤＮＡに対する種々のターゲテイング分子を結合するように用いることか てきる。１１！ｉｖ！、ペプチド、ホルモン、ビタミン、補因子、タンパク質又 は抗体を、ターゲテイングリガンドとして全て用いることができる。

Ａ　スペルミジンビス−アクリジン 体の所定の部位に核酸を向けるためのスキームは、二重鎖ＤＮＡへの細胞表面成 分ど相互作用するりガントのインターカレーションに基づいている。スペルミジ ンの選択的Ｎ１−アシル化の手順は、Ｎ’　、Ｎ”−ビス（ｔ−ブトキシカルボ ニル）スペルミジンを出発物質として用いて、報告されている。Ｒ，Ｊ、　ｌ＜ −ゲロン（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ）ら、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（＋９８２）　６８９ −６９２゜我々は、この方法を用し１て（図８）酸機能性化ガラクトツル誘導体 ９（ｎ−１）及び９’　（ｎ＝４）をＮ’、Ｎ”−ｔＢｏｃ保護スペルミジン（ １５）の二級アミノ基に連結して、得られたガラクトシル化スペルミジン１７及 び＋７’を、脱保護の後に、標準的な化学手順（二よ１）９−フゴーノキソ了ク リジンを用いて更にアルキル化し、ビスインターカレーター化合物２１及び２１ ′へそれを変換した。カルボン酸機能性化がラクトンル講導体の合成は、詳細に 記述され（Ｊ、ヘスター（Ｈａｅｎｓ　１ｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　（１９８Ｂ’）　９４６：９５−１０５＞、これらは広 い範囲の＊’ｘリガンドに簡単に適用可能である（Ｍ、　Ｍ、　ボンビボン（Ｐ ｏｎｐｉｐｏｍ）ら、Ｊ、Ｕｅｄ、Ｃｈｅｍ、　（１９８１）　２４：ｌ３８８ −１３９５゜表題の化合物を総酸率３０％で得て、ＮＭＲ及び質量分析計のデー タは、この提案された構造と矛盾しない。

Ｂ、活性化スペルミジンビス−アクリジン」−記スキームに基づいて、ペプチド をスペルミジンビス−アクリジン誘導体に結合するための色々な方法が開発され ている。Ｎ’　、Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）スペルミジン（１５） は、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭ ＰＢ）（４）によりＮ４−アシル化され、脱保護され、アクリジンとカンブリン グして、７１／イミド基を存するビスインターカレーター（２０）を作製した。

単一化合物を、ケイ酸におけるクロマトグラフィー精製後に、２５％総収率で得 た。ＮＭＲ及び質量分析計の結果は、定められた構造と矛盾しない。

Ｃ，ＮＬＳに連結したスペルミンンビスーアクリジンＮＬＳペプチド、ＰＫＫＫ ＲＫＶ　（カネダら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４３：３７５−３７８ ）及び同一組成であるか異なる配列の対照ペプチドを、ＡＢ＋自動ペプチド合成 機において、Ｎ末端ンステイン残基を用いて合成した。その後、システインペプ チドを、マレイミド基含有インター力１ノーター（図９）に結合して、二重鎖核 酸へ固定（アンカー）することかできる。

Ｄ　小分角￥性りンカー ｌ　ｙ　ｓ　−１ｙ　ｓペプチド結合から成る生分解性リンカ−を、図１Ｏに示 されるようにして合成する。図では、ガラクトース残基を、未保護アミンに配置 する。

或いは、２つの隣接したりジン残基を含む保護ペプチドを、固相合成によって合 成する。ペプチドは、膜透過化機能又はターゲティング機能をもたらし、アクリ ノン残基を、リシン上の２つのと一アミノ基に添加する。

実施例３ ガラクトシル化インターカｌ／−ター及びアグルチニンによるｐｃＩｕｃ４プラ スミドのゲル遅延アッセイ実施例２のガラクトツル化ビスーアクリジン２１及び ２１’　（２１’は、ガラクトースか３つの余分の炭素によってスペルミジンビ ス−アクリジンと区別されている２１のホモログ（同属体））が、ＤＮＡに結合 している間に可溶性リセブターと相互作用できるかを決定するために、我々は、 ゲルシフトアッセイを用いた。このアッセイでは、ガラクトース結合タンパク質 、リシナス・コミュニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ）レクチンＲＣＡ ＋ｚａを、ガラクトシル−ビス−アクリジン−ＤＮＡｆｆ１合体と共にインキュ ベートした。このタンパク質が該複合体と相互作用して、該複合体がＤＮＡと結 合したままの場合に、ＤＮＡは、電気泳動ゲルへ移動しない。プラスミドｐｃｌ ｕｃ４の各試料（２μｌ　；　１４０ｎｇ）を、１３゜５ｐｍｏｌの２１又は２ １′と混合し、次いでＩμｌ　（３３，３ｐｍｏ＋）のＲＣＡ１２ｏを加え、表 示の際に、過剰のフリーなガラクトース（１，３５ｎｍｏｌ）を添加した。室温 での３０分のインキュベーションの後に、試料を０．０４Ｍ　トリスアセテート 緩衝液システム（ｐＨ７，６）を用いて０．８％アガロースゲルに電気泳動させ 、ニジチウムブロマイドで染色してＤＮＡを可視化した（図１１）。

ガラクトツル化スペルミジンビスーアクリジンのｐｃＩｕｃ４プラスミドへのイ ンターカレーションは、化合物２１′　（レーンＢ）又は２１（レーンＥ）と複 合化した場合にプラスミドに認められる遅延によって示される。ビス−アクリジ ンのＤＮＡへのインターカレーションは、超らせん形態から弛緩環状形態への変 化をもたらし、これはゆっくりと移動する。

プラスミド−ガラクト−ス複合体のガラクトースに対する可溶性リセブターへの 結合可能性は、リシナス・コミュニスのレクチンＲＣＡ１．。の存在下で、複合 体の殆と完全な遅延によって示される（レーンＣ及びＦ）。ＲＣＡ　＋　２゜は ダイマーであり、末端のβ−Ｄ−ガラクトース残基に選択される２つの結合部位 を存し、従って、プラスミド−ガラクトース複合体に架橋することもできる。化 合物２１又は２１′と複合化した場合のプラスミドｐｃＩｕｃ４どのＲＣＡ、、 。の相互作用は、ゲルへ浸透しない巨大な凝集体の形成をもたらす。この相互作 用は、プラスミドか２１とよりも２＋’　と複合化する場合に、より一層効果的 であるようだ。

プラスミドに架橋するために、ＲＣＡ　ｌ　２゜は、隣接するプラスミド間に存 在する静電反発を打開しなければならない。従って、化合物２１’によってもた らされる複合体の場合のように、スペーサー了−ムによってガラクトースをプラ スミドの表面から離すことは、レクチンの結合をより容易にする。多価の相互作 用の結果どして、ＲＣＡ、２．により形成されるプラスミド凝集体は、かなり安 定であり、１００倍過剰な競合する１価のりガン）・例えばガラクトースによっ て分解されない（レーンＤ及びＧ）。

つ、ノ胸腺ＤＮＡに対するヒス−アクリジンの親和性は、二重鎖核酸からのエチ ジウムブロマイドの置換によって概算されたに−ルセン、前述）。エチジウムＦ Ｌ換を、ＤＮＡから放出される際に起こるエチジウムブロマイド蛍光（ｅｘ、＝ ５４０ｎｍ、ｅｍ、＝６１０ｎｍ）の減少によってモニターした。エチジウムブ ロマイドに相関するヒス−アクリノンの結合定数は、ＩＣ，。によって概算され る。

二の研究では、記述されたようにに−ルセン、前述）合成されたスペルミジンヒ ス−アクリノントリヒドロクロライト（ＳＢＡ・３ＨＣＩ）を、参照化合物とし て用いた。３つの正電荷の１つを失った結果、スペルミジンビス−アクリジンの Ｎ’アミノ基か、化合物２１　（Ｇａ　１−ｂＡ・２ＨＣ１）のターゲテイング 糖質によってアミド結合に引き込まオ］る際に、親和性における僅かだが顕著な 減少か認めら第１る。しかし、我々は、スペルミジンビス−アクリジンが高く正 に帯電したＮＬＳペプチｌ”　Ｐ　Ｋ　Ｋ　Ｋ　ＲＫ　Ｖに連結される際に、親 和性における増加を推測した。Ｇ　カラノブ（にａｒｕｐ）ら、ＩｎＬＪ、Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、（１９８Ｂ）　３２：３３１−３４３゜ 神々の実施例でＤＮＡに対するターゲティングリガンドを攻撃するように合成さ れた種々のヒスアクリジン結合体の結合定数が、表３に示されている。

ＳＢＡ・コＨＣＩ　２．４　Ｘ　１０４Ｇａｌ−３−ｂＡ’　３．５　Ｘ　１０ −’Ｇａ１−６−ｂＡ”　７．９　Ｘ　１０°７Ｇａ１３Ｌｙｓ２−ｂ入’　５ ．４　Ｘ　１０’ｖレイミド−ｂＡ’　６．５ＸＩＯ’ ＷＴｃｙｓ−ｂＡ’　１．４　Ｘ　１０−’５ＮＬ−ｂＡ’　１４　Ｘ　１０’ ’　ｎ＝３の場合の化合物２１ ”　ｎ＝８の場合の化合物２１ ３化合物２６（実施例６に示されている）４化合物２０ ５ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＣ；に連結したＳＢＡ’　ＣＧＹＫＰＫＶＲＧＫＧ ＫＧに連結したＳＢＡ種々のヒス−アクリジンにおける結合定数は、２−Ｍａｒ による非共同競合結合を介した直線格子についての４−Ｍｅ　ｒの結合親和性を 測定する方法（Ａ、つすルフエ（Ｗｏｌ　ｆｅ）及びＴ、メエハンＱｌｅｅｈａ ｎ）、Ｊ、λＩｏ１．Ｂｉｏ１．．２２３：１０６３−１０８７．１９９２）及 びエチジウムブロマイドに対する５、３ＸＩＯ−’Ｍの内因性解離定数を用いる ことによって、エチジウムブロマイド置換アッセイから算出された。

ガラクトツルターケチイングリガントを含有するビスーアクリジンインター力テ ーターのターゲティング能を制御する因子を証明するために、ラット肝細胞を、 う、１へ肝臓から単離し、５％ウソ胎仔血清及び抗生物質を含有する最少必須培 地（ＭＥｈｉ）培地３ｍｌに、６０ｍｍペトリ皿中で１０＠肝細胞の密度で培養 しこ。

ｌｌｆ細胞が、アノアロオロソムコイトを結合することによってガラクトースリ セブターを仔することが示された。３７°Ｃで１８時間後に培地を取り除き、１ ｍｌのＭＥＭでｉ換した。その後、１００ｔｔｌ（７）水中、５ＢＡ−３ＨＣＩ 、Ｇａｌ−３−ｂＡ、Ｇａ　ｌ−６−ｂＡ又はＧａ１２　Ｌｙｓｔ　ｂＡと複合 化された１８ｇの１２５Ｉｌｔｉ識化プラスミドＤＮＡを、培養皿に添加した。

インターカレータ一対プラスミド比は、５００・１又は＋０００：ｌであった。

細胞を、更に１時間３７°Ｃて培養し、その後にゆすぎ、タンパク質を１ｍｌの Ｎａ０Ｈ（ＩＮ）中で消化した。細胞溶解物を、放射能活性についてカウントし 、タンパク質を測定した。

細胞結合プラスミドの量をｎｇのプラスミド／ｍｇの細胞タンパク質で表示し、 複合化剤の機能としてグラフ化した（図１２）。３つ全てのガラクトシルビス− アクリジン化合物が、ＤＮＡと結合しく表２）、可溶性ガラクトース結合タンパ ク質と相互作用することかてきる（実施例３）が、Ｇａ１ｎ　Ｌｙｓｚ　ｂＡの みは、細胞表面リセブターと相互作用することができた。従って、細胞表面リセ ブターへの効果的なターゲティングは、細胞表面リセブターと相互作用すること かできるＧａ　１３　Ｌｙ　Ｓ２　ｂＡ　（合成は、図１３及び実施例６に示さ れている）によってもたらされる一層長いスペーサーアームを必要とする。

二の分子の完全な合成は、図１３に示されている。

Ｌ−リンルーし一すノンヒスートリフルオロアセテート（２２）の合成：Ｎｚ− ｔＢＯｃ−Ｌ−リジン（６０３ｍｇ、２．　４５ｍｍｏｌ）及びＮ（１，Ｎａ− ヒス−ｔ　ＢＯＣ−Ｌ−リン〉’　ｐ−ニトロフェニルエステル（２，２８ｇ： ４．　９ｍｍｏ　ｌ　）を、６４０μｍのＮ、Ｎ−ンイソブロピルエチルアミン （３，７ｍｍｏｌ）を含有する４０ｍ１のＮ−メチルモルホリン中で混合した。

該混合物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌し、ろ過して不溶性の？：ｊｉ量な未 反応Ｎε−ｔＢＯＣ−Ｌ−リノンを取り除いて、高減圧下で乾燥状態まで蒸発さ せた。残渣をＣＨＣｌ５／ＣＨ，ＯＨ／Ｈ，０９：Ｉ：Ｏ，！系で溶出されるシ リカゲルカラム中で精製して、１．２２ｇの精製ｔＢＯＣ−保護化リジンダイマ ーを得た；収率は８７％であった。

脱保護：　７００ｍｇ（１，２ｍｍｏｌ）のｔＢＯＣ−保護化リジンダイマーを 含有する冷フラスコ（ドライアイス）に、５ｍｌのＴＦＡを添加した。この混合 物を室温まで温めて、アルゴン下で攪拌した。３０分間の攪拌後、トリフルオロ 酢酸を減圧下で蒸発させた。残渣をアセトン中に取り出し、蒸発させた（５回） 。

最終的に、該残渣を、１４ｍ１の水に再溶解し、８ｍｌのクロロホルムで３回抽 出して、凍結乾燥して、４８０ｍｇの表題の化合物を得た：収率は８０％であっ た。

保護化トリガラクトシルリジンダイマー：　Ｎａ−〔Ｎａ−Ｎａ−ビス（６−（ １−チオ−２，３，４，６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシ ル））ヘキサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−（１−チオ−２，３，４，６ −チトシーＯ−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル））ヘキサノイル〕−Ｌ −リジン（２３）の合成： ５０５μｌのトリエチルアミン（３，６ｍｍｏｌ）を含有する８ｍｌの無水ＤＭ Ｆ中、Ｌ−リンルーし一リジンビスートリフルオロアセテート（４００ｍｇ　： 　０．　８ｍｍｏｆ）の溶液に、ｐ−ニトロフェニル−６−（１−チオ−２，３ ，４，６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキサノエー ト（１，４４ｇ；２、　４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、アルゴン下で 一晩攪拌して、乾燥状態まで蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム上のクロマ トグラフィーにより精製し、ＣＨＣｌ２　／ＣＨａ　ＯＨ／Ｈ２０９０：　１０ 　：　Ｃ１５て溶出して、４６３ｍｇの表題の化合物を得た：収率は３５％であ った。

ＭＳ、　計算値：ＣｔｓＨ＋１ｚＮｓＯ２ｚＳｚ　ｍ／ｚ＝１６５２、実測値： ｍ／ｚ＝１６５３．６　（Ｍ十Ｈ）＋、ｍ／ｚ＝　１６７７．　６　（Ｍ＋Ｎａ ）　十、ｍ／ｚ＝１６９３、　６　（Ｍ十Ｋ）　＋。

選択的にブロックされたスペルミジンとの反応：Ｎ４−（Ｎａ−〔Ｎａ、Ｎａ− ビス（６−（１−チオ−２，３，４，６−チトシー〇−アセチル−β−Ｄ−がラ クトピラノノル））ヘキサノイノリーし一リジルーＮε−（６−（１−チオ−２ ，３，４，６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノノル））ヘキサ ノイル）−Ｌ−リジル）−Ｎｌ、Ｎａ−ビスｔ　ＢＯＣ−スペルミジン（２４） の合成。

化合物２３　（１３２ｍｇ：８０μｍｏｌ）を、５ｍｌの無水塩化メチレン中、 Ｎ。

Ｎ′−ンノクロヘキシルカルホニノイミンダイド（ＤＣＣ）（２０ｍｇ　；　９ ７μｍ。

１）の存在下、Ｎ−ヒトロキシサクノンイミド（ｌ　１ｍｇ、９６μｍｏｌ　） によるエステル化によって活性化した。アルゴン下、室温での４時間の攪拌後、 ウレア沈殿物をろ過によって取り除き、ろ過物を減圧下で蒸発させた。乾燥残渣 を、３ｍｌのアセトニトリルに再溶解し、１４μｍのトリエチルアミン（１（１ ０μｍ）を含打する３ｍｌのアセトニトリル中のＮ１．Ｎａ−ビス（ｔ−ブトキ シ力ルポニルスベルミノン）塩酸（３０ｍｇ；８０μｍｏｌ）の溶液へ、１滴ず つ添加した。

該混合物をアルゴン下、室温で４８時間更に攪拌し、減圧下で蒸発させて、残渣 をシリカゲルカラム中でｂｔ製して、ＣＨＣｌ、／ＣＨ３０Ｈ／Ｈ，０９０：　 １０　Ｉて溶出して、７１ｍｇの表題の化合物を得た。収率は４５％であった。

脱保護　Ｎ４−（Ｎａ−〔Ｎａ、Ｎａ−ビス（６−（１−チオーβ−Ｄ−ガ→り （・ビラノツル））へギサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−（１−チオーβ −Ｄ−ガラクトピラノシル））ヘキサノイル）−Ｌ−リジル〕スペルミジン（２ ５）の合成 化合物２４　（７１ｍｇ　；　３６μｍｏｌ　）を、化合物＋７（実施例２Ａを 参照のこと）に・ついて前述されたように脱保護した。ｔＢＯＣ保護基を、５ｍ ｌのＴＦＡで３０５ｒ間処理してスペルミジンリ〉カーから取り除き、アセチル 保護基をＣＨ，ＯＨ，、”ＮＥ　ｔ　、　／Ｈ２０５：　４　：　ｌの混合物で 一晩処理してガラクトシル頭部基う・ら取り除いた。スペルミジン誘導体のピス トリフルオロアセテート塩を、小望＼イオラト　ＡＧ　ｌＸ２（ＯＨ−）カラム に該塩の水溶液を通すこと（こよっＣ１−７１１−のアミンに変換した。部質及 びアミンについて陽性の分画を、−緒に集めて凍結乾燥して、３６ｍｇの化合物 ２５を得た。収率は７９％であった。

アクリノン結合　Ｎ４−（Ｎａ−〔Ｎａ、Ｎａ−ビス（６−（１−チオ−β−Ｄ −がラクトピラノツノい）ヘキサノイル）−Ｌ−リジル−Ｎａ−（６−（１−千 オーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル））ヘキサノイル）−Ｌ−リジノリーＮｌ、Ｎ ８−ヒスーアクリジンスベルミジ：／　（２６）（”Ｇａｌ、　Ｌｙｓｔ　ｂＡ ”）の合成 化合物２５　（３６ｍｇ　；　２８．　５μｍｏｌ　）及び１８ｍｇの９−フェ ノキンアクリノンを、３ｇのフェノールに８０℃で溶解し、該溶液を、アルゴン 下８０℃て更（二２時間攪拌した。その後、該混合物を約４０°Ｃまで冷やし、 １５ｍ１のエーテルに注いて、アミノアクリジンを沈殿させた。黄色の沈殿物を 、濾紙上にろ過によって回収し、４ｍｌのブタノール／エタノール混合物３：ｌ 中に再溶解した。

ぞの後、この溶液を約１ｍｌまでの蒸発により濃縮し、ビス−アクリジン誘導体 をノリ力ゲル力ラムにおけるクロマＩ・グラフィーによって単離して、ｎ−ブタ ノール／ピリジン／酢酸／水６：２：Ｉ：２て溶出して、３４ｍｇの表題の化合 物を得た。収率２１％てあった。

ＭＳ　計算値　Ｃ１１ｌ−（１１７ＮＩ０２０ｓＩ　ｍ／ｚ＝１６３１、実測値 ：ｍ／ｚ＝１６３２．８　（Ｍ十Ｈ）＋、ｍ、／ｚ＝　１６５４．８　（Ｍ＋Ｎ ａ）＋。

微量の５ｋｂの放射性ヨウ素化プラスミド（ＣＭＶ−βＧａ　ｌ）を含む５μｌ のトリス−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）と、実施例２−Ｃの核局在性ペプチドービスーア クリノン結合物８ｎｍｏｌを含む５０μｍの水とを、４５μｍのＴＥ緩衝液（ｐ Ｈ８）中で、溶液中８０μｇのｐｃｌｕｃ４　（１２３ｎｅＱ、ｂｐ）に添加し た。プラスミド対ペプチド結合物の比は、１３００であった。室温での１時間の 静置後に、１００μｍのトリス−Ｃ１緩衝液（ｐＨ９）を該複合体へ添加して、 得られた溶液を、ｐＨ感受性リポソームの調製のために、６００μｌのエーテル 中に溶解した１２μｍｏｌの脂質（ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ　２　：　Ｉ、モル比 ）と混合した。

ＤＮＡ−ペプチド複合体を含有する小胞を、ファイコール密度勾配にリポソーム を１７かせることによって、未被包化物質から分離した。被包化効率（２０％± ４’％）を、動的光散乱（コルターＮ４、コルトロニクス）によって測定した。

細胞を４μｍのリポソーム−被包化プラスミド（１００μｍのリポソーム溶液） を用いて、３７°Ｃ５時間でトランスフェクトして、リシフエラーゼ活性を生物 発光計において４８時間後にカウントした。表４は、測定された光単位量／ｍｇ 細胞タンパク質を、リポソーム内容物の機能として示している。値は、３回の測 定の平均である。

表４ ブラフ、ニド　のみの複合１本　プラスミド　−ＷＴｃｙｓ　−ｂＡｆｆ１合体 　プラスミド−５ＮＬ　−ｂＡ＜０．３２±０．０２）　１０“　（０，８２± ０．３６）　１０’　（１，３６±０．２８）　１０＠ポンチイブ対照物　リボ フエクチン＝（１，４±０．２）ｔｏ’ｐＨ感受性リポソームか、宿主細胞の細 胞質へその内容物を送達するならば、裸のプラスミドは、咳を透過することがで きなければならない。

ペプチド−ビス−アクリジン結合物が分解からＤＮＡを保護しないならば、観察 された１〜ランスフエクンヨン促進は、増ＩＩＯされた核エントリーの結果でな けれはならない。４〜５倍増加したトランスフェクションは、公開された結果と 一致しており（カネダら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２４３：３７５−３ ７８）　、これは、ＤＮＡ！、：結合して、核−＼のＤＮＡエントリーを促進す るタンパク質を用いている。ＳＮＬペプチドとＷＴｃｙｓペプチドの両方か発現 を増加し、核へＤＮＡを向ける便利な技術である。

合成は、Ｓ　ヘルグストロン（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ）ら、Ａｃｔａ、Ｃｈｅｍ、 ５ｃａｎｄ、、（＋９５３）　７：１１２６に基ついている。２０４ｍｇ　（０ ，５００ミリモル）のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に 計り、２．５ｍｌのジオキサン及び７０μｍ（０，５００ミリモル）のトリエチ ルアミンを、このチューブへ添加した。この混合物を、水浴中で、溶液か固体化 するまて（約１２°Ｃ）冷やした。６５μｌ　（０，５００ミリモル）のイソブ チルクロロホルメートを添加して、反応チューブを娠り、水浴へ戻した。或いは 、このチューブを取り出して、浴に移し、初期の固体化の時々の温度に３０分間 、維持した。

Ｎα−ヘニズルエステル　Ｎε−ｔＢＯＣリジン（０，５００ミリモル）及び７ ０μＩ　（０，５００ミリモル）のトリエチルアミンを０．６ｍｌの水に懸濁し た。該混合物を氷浴中て冷し、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を 池の０．５ｍｌの氷水を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、水浴 中に１７２時間置き、その後、室温まで温めた。

有機溶媒の殆どを、アルゴンガスの気流下で蒸発させ、残渣を３ｍｌまでの水に 肝かした。５％水性炭酸ナトリウムを、ｐＨが９になるまで１滴ずつ添加した。

該混合物を３ｍｌのエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持した。

水相残渣に、０．５Ｎの塩酸をｐＨが４になるまで添加した。該混合物を３ｍ１ のエチルエーテルで３回、抽出して、水相を保持した。

水相Ｆｊ［のｐＨを、０．５Ｎの塩酸で４までに調整し、３ｍｌのエチルアセテ −１−パ＼５回抽出した。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧 下で乾燥状懸になるまで蒸発させ、２８４ｍｇの無色の粉末溶融物を得た。ε− アミンのためのｔＢｏｃ保護基を、標準方法で取り除き、コール酸の正に帯電し たりノン誘導体を得た。同様の方法で、コール酸の他の正に帯電した誘導体を調 製することかできる。

Ｂ、トリス（２−アミノエチル）アミンのコール酸アミドの調製多重アミン基が 、活性化コール酸ヘカノブリングすることに有効である場合、該アミノ酸を、実 施例８Ａで記述したように調製された６倍量の活性化胆汁酸塩に添ＩＪｏする。

合成は、パルゲストンら、前述、の方法に基づいている。２０４ｍｇ（０，５０ ０ミリモル）のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に計る。

２．５ｍｌのジオキサン及び７０μ＋　（０，５００ミリモル）のトリエチルア ミンを添加する。

七ノメトキンーＰＥＧを含むスルフヒドリルは、実施例２Ｂのマレイミド含有ビ スーアクリシンに結合することができる。

ＰＥＧ分モを用いてＤＮＡの表面をマスクすることができ、ＤＮＡを、長期間に わたって循環させることかできる。放射性ヨウ素化プラスミドＤＮＡを、実施例 ９て合成されたようなモノメトキシ−ＰＥＧ　１９００−ビス−アクリジンスペ ルミジンと、２０ｂｐ−ＤＮＡ対ＩＰＥＧ分子の比で、３０分間室温で混合する 。少量の複合体、ＰＢＳｏ、２ｍｌ中の５μｇのＤＮＡを、１２匹のマウス群の 各々・＼、尾静脈を介して注入する。マウスを、注入後の種々の期間で犠牲孔さ せる。面沿及び他の器官を取り出して、各器官に結合した放射能活性を測定する 。

モノメトキノＰＥＧ−ビスーアクリジンスペルミジンに複合化してないＤＮＡを 、マウスの第２群へ注射する（対照マウス）。１０分後に、１５％の放射能活性 グラスミｌ’ＤＮＡが、対照マウスの血液中に残存するが、モノメトキシＰＥＧ −ビスーアクリシンスベルミジンＤ　Ｎ　Ａ　群ては、顕著に大きいレベルの放 射能標識化ブラフＥｌ”−ＰＥ０１１合体か循環系に残存することは、ＰＥＧ− ビス−アクリジンスペルミジンによるＤＮＡ分子の明確なマスキング効果を示し ている。

ポリヌクレオチドマスキング脂質の合成は、標準的な化学によって達成され、例 えはＣピノヨン（Ｐｉｄｇｅｏｒ＋’）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９ ８９）　＋７６：３６−４７に記載されている。

１、１．１２−トデカシンカルホン酸→−ＤＣＣ−−−−ＴＨＦ、２５°Ｃ−− −−−→無水トデンカンカルホン酸（環状無水物）ＤＮＡの表面をマスクするた めに用いて、ＤＮＡを長期にわたって循環可能にする二とかできる。少量の複合 体、ＰＢＳｏ、２ｍｌ中、５μｇのＤＮＡを、１２匹のマウス群の各々へ尾静脈 を介して注入する。マウスを、注射後の種々の時期て犠’ｌｉ、死させる。血液 及び他の器官を取り出し、各器官に結合した放射能活性をｉｌｌ、ｌ＋定する。

しノチンアツルアミンに複合化していないＤＮＡを、第２の群のマウス・＼注射 する（対照マウス）。１０分後に、１５％の放射活性プラスミドＤＮＡか対照群 のマウスにおける血液中に残存しているが、モノメトキシＰＥＧ−ビスーアクリ シンスペルミシンＤＮＡ群において顕著に大きしルベル→スミｌ”ＰＥＧｉ合体 か循環系に残存することは、レシチンアンルアミン（こよるＤＮＡ分子の明確な マスキング効果を示している。

く　の　（）　ＯＬＵ　Ｌ　（り ＦＩＧ、Ｊｌ ＦＩＧ、−１２ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、 ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、 ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ。

ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ ＦＩ （７２）発明者　ヘンスラー、シーン アメリカ合衆国　９４１１２　カリフォルニア州　サンフランシスコ　ナンバー 　２ジユーダ　ストリート１８０３

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリヌクレオチドを真核細胞の準細胞成分にもたらすための組成物であって 、ポリヌクレオチドを上記真核細胞の細胞質膜を横断して輸送することができる 膜透過化成分に結合したポリヌクレオチドを含む上記組成物。
2. ２．上記膜透過化成分が、両親媒性のカチオン性ペプチドである請求項１の組成 物。
3. ３．上記ペプチドか環状ペプチドである請求項２の組成物。
4. ４．上記環状ペプチドが、グラミシジンＳ及びチロシジンからなる群から選はれ る請求項３の組成物。
5. ５．上記環状ペプチドが、グラミシジンＳである請求項４組成物。
6. ６．更に、リン脂質を含む請求項１の組成物。
7. ７．上記リン脂質がホスファチジルエタノールアミンである請求項６の組成物。
8. ８．上記ホスファチジルエタノールアミンが、ジオレオイルホスファチジルエタ ノールアミンである請求項７の組成物。
9. ９．上記リン脂質がリボソーム形態である請求項６の組成物。
10. １０．更に、ポリカチオンを含む請求項１の組成物。
11. １１．上記ポリカチオンかポリアミンである請求項１０の組成物。
12. １２．上記ポリアミンが、スペルミン、スペルミジン、３，３′−ジアミノーヒ スプロピルアミン、イミノビス（Ｎ，Ｎ）−ジメチルプロピルアミン、イミノヒ ス（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミン、及びカチオン性デント リマーからなる群から選ばれる請求項１１の組成物。
13. １３．更に、ポリカチオンを含む請求項６の組成物。
14. １４．上記膜透過化成分が、下記式を有するカチオン性胆汁酸塩である請求項１ の組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｘ及びＹは、独立して、Ｈ又はＯＨであり；Ｒ３は、水素、１〜１０の炭 素原子を有するアルキル又はアルキルアミンであり： Ｒ４は、１〜３０の炭素原子を有する正に帯電した直鎖若しくは分岐のアルキル 又はアルキルアミンであり、ここで、炭素原子の少なくとも１つはＮＲ′で置換 されてもよく、Ｒ′は、水素、１〜１０の炭素原子を有するアルキル又はアルキ ルアミンである。
15. １５．ポリヌクレオチドを真核細胞の準細胞成分にもたらすための組成物であっ て、上記真核細胞を認識することができる細胞認識成分に結合したポリヌクレオ チドを含む上記組成物。
16. １６．上記細胞認識成分が、上記真核細胞上の細胞表面リセプターに対するリガ ンドを含み、上記リガンドがＤＮＡ結合部分と待合している請求項１５の組成物 。
17. １７．上記ＤＮＡ結合部分が、インターカレート剤である請求項１６の組成物。
18. １８．上記ＤＮＡ結合部分が、主溝又は副溝バインダーである請求項１６の組成 物。
19. １９．上記インターカレート剤が、下記式で表される請求項１７の組成物：▲数 式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｚは結合てあり； ｎ及びｍは、各々独立して、１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり 、 Ａｒ１及びＡｒ２は、独立して、エチジウムプロマイド、アクリジン、ミトザン トロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２，７ −ジアザピレニウム並びにそれらの誘導体からなる群から選ばれる。
20. ２０．上記インターカレート剤が、複数のリガンドに結合している請求項１９の 組成物。
21. ２１．図１３に示されるような、トリガラクトシル化スペルミジンビス−アクリ ジン化合物（２６）。
22. ２２．更に、膜透過化成分を含む請求項１５の組成物。
23. ２３．ポリヌクレオチドを真核細胞の準細胞成分にもたらすための組成物であっ て、ポリヌクレオチドを上記真核細胞の細胞質から上記真核細胞の準細胞成分に 送達することがてきる準細胞局在性成分に結合したポリヌクレオチドを含む上記 組成物。
24. ２４．上記準細胞成分が核であり、上記準細胞局在性成分が核局在性成分である 請求項２３の組成物。
25. ２５．上記核局在性成分か、ＤＮＡ結合部分に結合した核局在配列を含む請求項 ２４の組成物。
26. ２６．上記ＤＮＡ結合部分かインターカレート剤である請求項２５の組成物。
27. ２７．前記インターカレート剤が、下記式で表される請求項２６の組成物：▲数 式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｚは結合であり： ｎ及びｍは、各々独立して、１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数であり 、 Ａｒ１、及びＡｒ２は、独立して、エチジウムプロマイド、アクリジン、ミトザ ントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２， ７−ジアザピレニウム並びにそれらの誘導体からなる群から選ばれる。
28. ２８．下記式で表されるＤＮＡマスキング成分。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ｎは、６〜２４の整数であり、 Ｙは、水素、エタノールアミン、コリン、グリセロール、セリン及びイノシトー ルからなる群から選ばれ、 Ｒ１は６〜２４の炭素原子を有するアルキル又はアルケニルであり、Ｒ■は、水 素、１〜１０の炭素原子を有するアルキル又はアルキルアミンであり： Ｒ４は、１〜３０の炭素原子を有する正に帯電した直鎖若しくは分岐のアルキル 又はアルキルアミンであり、ここで、炭素原子の少なくとも１つはＮＲ′で置換 されてもよく、Ｒ′は、水素、１〜１０の炭素原子を有するアルキル又はアルキ ルアミンである。
29. ２９．真核細胞の準細胞成分ヘポリヌクレオチドをもたらすための組成物であっ て、 （ａ）該ポリヌクレオチド； （ｂ）該真核細胞を認識することができる細胞認識成分；（ｃ）該真核細胞の細 胞質膜を横断してポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分；及び 、 （ｄ）該真核細胞の細胞質から該真核細胞の準細胞成分ヘポリヌクレオチドを送 達することができる核局在性成分； を含む上記組成物。
30. ３０．更に、 （ｅ）上記ポリヌクレオチドの循環性半減期を延ばすことができるマスキング成 分： を含む請求項２９の組成物。
31. ３１．上記マスキング成分がＤＮＡ結合部分に共有結合したポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）である請求項３０の組成物。
32. ３２．上記細胞認識成分、上記膜透過化成分、上記準細胞局在性成分及び上記マ スキング成分の少なくとも１つが、上記ポリヌクレオチドから分離することがで きる請求項３０の組成物。
33. ３３．下記式で表されるインターカレート組成物：▲数式、化学式、表等があり ます▼ 式中、ｎ及びｍは、各々独立して、１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数 であり、 Ａｒ１及びＡｒ２は、独立して、エチジウムプロマイド、アクリジン、ミトザン トロン、オキサブゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２， ７−ジアザピレニウム並びにそれらの誘導体からなる群から選ばれ、Ｘは、Ｎ− ヒドロキシサクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサル ファイド、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールからなる群から選択される反 応性基である。
34. ３４．上記Ａｒ１及びＡｒ２がアクリジンである請求項３３のインターカレート 化合物。
35. ３５．前記式中、Ｘがマレイミドフェニルである請求項３４のインターカレート 化合物。
36. ３６．下記式で表される化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼
37. ３７．下記式で表される化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ｎ及びｍは、各々独立して、１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数 であり、 Ａｒ１及びＡｒ２は、独立して、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザン トロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２，７ −ジアザピレニウム並びにそれらの誘導体からなる群から選ばれ、Ｘは、Ｎ−ヒ ドロキシサクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサルフ ァイド、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールからなる群から選択される反応 性基であり、 Ｙは、細胞表面リセプターリガンド、核局在性配列及び膜透過化成分から成る群 から選択される。
38. ３８．上記式中、Ｘが下記、 ▲数式、化学式、表等があります▼ てある請求項３７の化合物。
39. ３９．下記式で表される化合物の作製方法であって、▲数式、化学式、表等があ ります▼ 式中、ｎ及びｍは、各々独立して、１〜２０の整数であり、ｐは０〜２０の整数 てあり、 Ｘは、マレイミドフェニルてあり、 Ａｒ１及びＡｒ２は、独立して、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザン トロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリブチシン及びＮ−メチル−２，７ −ジアザピレニウム並びにそれらの誘導体からなる群から選ばれ、Ｙは、細胞表 面リセプターりかンド、準細胞局在性配列及び膜透過化成分から成る群から選択 される； 化合物Ｙのフリーのスルフヒドリル基と下記式で表される成分を反応することを 含む当該作製方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼
40. ４０．上記細胞を請求項２９の組成物と接触すること含む、ｉｎｖｉｔｒｏで細 胞ヘポリヌクレオチドを導入する方法。
41. ４１．上記細胞を請求項２９の組成物と接触すること含む、ｉｎｖｉｖｏで細胞 ヘポリヌクレオチドを導入する方法。
42. ４２．上記細胞を請求項２９の組成物と接触すること含む、植物細胞ヘポリヌク レオチドを導入する方法。
43. ４３．上記細胞を請求項２９の組成物と接触すること含む、哺乳細胞ヘポリヌク レオチドを導入する方法。
44. ４４．請求項２９の組成物を含むエアロゾル組成物を哺乳類の肺へ投与すること を含む、哺乳類の肺ヘポリヌクレオチドを導入する方法。
45. ４５．請求項２９の組成物をヒト患者へ投与することを含む、ヒト患者における 遺伝子治療方法。
46. ４６．上記ＤＮＡ結合部分がリンカ−鎖である請求項１６の組成物。
47. ４７．上記ＤＮＡ結合部分がデンドリマーポリカチオンである請求項１６の組成 物。
48. ４８．上記膜透過化成分がＧＡＬＡのような両親媒性ペプチドである請求項１の 組成物。