JP4551464B2 - インビボ送達に有効な、脂質−核酸複合体の安定な製剤の調製 - Google Patents

インビボ送達に有効な、脂質−核酸複合体の安定な製剤の調製 Download PDF

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Description

本発明はカチオン性脂質-ＤＮＡ複合体（"ＣＬＤＣ"）の分野に関する。より詳しくは、本発明は、（１）親水性ポリマー、（２）有機ポリカチオンと縮合した核酸、および（３）親水性ポリマーと有機ポリカチオンと縮合した核酸、を含む脂質-核酸複合体に関する。本発明の脂質核酸−複合体は静脈注射によりインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で高いトランスフェクション活性を示し、インビボ・トランスフェクション活性により決定されるように、予想外に高い保存安定性を示す。
両親媒性カチオン性分子から成るリポソームは、インビボおよびインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において有用な非ウイルス性遺伝子送達ベクターである（総説：Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）;ブレーズ（Ｂｌａｅｓｅ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）;バー（Ｂｅｈｒ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；レミー（Ｒｅｍｙ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；およびガオ（Ｇａｏ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５））。理論的には、正荷電したリポソームが負荷電した核酸に静電気的相互作用を介して結合し、脂質−核酸複合体を形成する。脂質−核酸複合体は遺伝子運搬ベクターとしていくつもの利点を有する。ウイルス・ベクターとは異なり、脂質−核酸複合体を用いて、本質的に質を欠いているので、免疫原性および炎症性応答の発現が僅かである。更に、それらは複製もしくは再結合して感染性作因を形成することができず、組込み頻度は低い。
インビトロでの培養細胞においてレポーター遺伝子の検出可能な発現を示すことにより、両親媒性カチオン性脂質がインビボおよびインビトロにおいて遺伝子送達を仲介することができることを多数の公表文献が納得のいく証明をしている（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−１７(１９８７）；レッフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）ら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５９９−６１８（１９９３）；フェルグナーら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１（１９９４））。脂質−核酸複合体は場合により成功裏に遺伝子運搬を達成するウイルス・ベクター程に有効ではないので、高いトランスフェクション効率をもつカチオン性脂質を見出す多くの努力がなされている（バー（Ｂｅｈｒ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；レミー（Ｒｅｍｙ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；およびガオ(Ｇａｏ)ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５））。脂質−核酸複合体は遺伝子治療の潜在的に有用な手段として嘱目されている。
幾つかのグループは、両親媒性カチオン性脂質−核酸複合体を動物およびヒト双方のインビボ・トランスフェクションのために使用することを報告している（総説：ガオ（Ｇａｏ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）;ズー（Ｚｈｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１(１９９３)；およびシエリー(Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４２−９７４６（１９９５））。しかし、安定した保存性を有する複合体製剤について技術上の問題は扱われていない。例えば、ウイルス・ベクター製剤とは違って、脂質−核酸複合体は粒子サイズによっては不安定である（バーら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；レミーら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；ガオら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５））。それ故、全身注射に適したサイズ分布をもつ均一な脂質-核酸複合体を得ることは困難である。殆どの脂質−核酸複合体製剤は準安定性である。従って、これらの複合体は一般に３０分から２〜３時間という短い時間内に使用しなければならない。ＤＮＡ送達用キャリアとしてカチオン性脂質を用いる最近の臨床試験では、２つの成分を臨床で混ぜ合わせて直ちに使用した（ガオら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５））。時間と共に脂質−核酸複合体のトランスフェクション活性を失わせる構造的不安定性は、将来の脳質介在遺伝子治療法開発にとっての挑戦対象となっている。
Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０(１９９５) Ｂｌａｅｓｅ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７(１９９５) Ｂｅｈｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９(１９９４) Ｒｅｍｙ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４(１９９４) Ｇａｏ他、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２(１９９５) Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−１７(１９８７) Ｌｏｅｆｆｌｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５９９−６１８(１９９３) Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１(１９９４) Ｂｅｈｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９(１９９４) Ｚｈｕ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１(１９９３) Ｔｈｉｅｒｒｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４２−９７４６(１９９５)
本発明は高い保存安定性を有するカチオン性脂質−核酸複合体の新規調製法を提供する。ある態様として、核酸を有機ポリカチオンと接触させ、縮合または一部縮合した核酸とすることにより、これらの複合体を調製する。縮合した核酸を、次いで、両親媒性カチオン性脂質＋コレステロールなどの中性ヘルパー脂質と約２：１〜約１：２のモル比で結合させ、脂質核酸複合体を産生させる。任意に、次いで親水性ポリマーを脂質-核酸複合体に加えてもよい。または、縮合していない核酸を有する脂質−核酸複合体に親水性ポリマーを加える。これらの脂質−核酸複合体は、例えば、２２℃またはそれ以下で貯蔵したとき、核酸成分が有機ポリカチオンと接触処理されていない同じ脂質−核酸複合体および／または脂質核酸複合体が親水性ポリマーと接触処理されていない同じ脂質-核酸複合体と比較して、高い保存安定性を有する。
特に好ましい態様において、ポリカチオンはポリアミンであり、より好ましくはスペルミジンまたはスペルミンなどのポリアミンである。
他の好ましい態様において、脂質−核酸複合体は、核酸を両親媒性カチオン性脂質と結合させ、次いで、このように形成した複合体を親水性ポリマーと結合させることにより調製する。この脂質−核酸複合体は、例えば、２２℃以下で貯蔵したとき、親水性ポリマーと結合していない同じ複合体と比較して、高い保存安定性を有する。
ある態様として、親水性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化脂質、ホスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、トゥイーンで誘導化したポリエチレングリコール、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ガングリオシドＧM1、および合成ポリマーから成る群より選択される。
ある態様として、該脂質−核酸複合体は凍結乾燥する。
本発明の方法および組成物のいずれにおいても、核酸とは実質的に如何なる核酸であってもよく、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、およびペプチド化核酸（ＰＮＡ）であり、最も好ましくはＤＮＡである。特に好ましい態様において、該ＤＮＡは該脂質−核酸複合体を移入した細胞中でポリペプチドを発現することのできる発現カセットである。
ある態様として、該脂質−核酸複合体は、先ずリポソームを形成し、次いで形成したリポソームを縮合又は一部縮合した核酸と結合させ、脂質−核酸複合体を形成させることにより形成される。任意に、次いで該脂質−核酸複合体を親水性ポリマーと接触させる。または、該リポソームを未縮合核酸と結合させて脂質-核酸複合体を形成させ、それに後で親水性ポリマー（例、ＰＥＧ−ＰＥ）を加えることもできる。核酸と親水性ポリマーに接触させたリポソームを結合させて調製した脂質-核酸複合体は、次いで、さらなる親水性ポリマーと結合させることができる。好ましい態様において、該脂質と核酸とを、脂質約１〜約２０ｎｍｏｌの範囲、より好ましくは約４〜約１６ｎｍｏｌの範囲、最も好ましくは約８〜約１２ｎｍｏｌの範囲：核酸μｇの比で結合させる。該脂質と親水性ポリマーとを、約０．１〜約１０％、より好ましくは約０．３〜約５％、最も好ましくは約０．５〜約２．０％の範囲のモル比で結合させる（該複合体の親水性ポリマー：カチオン性脂質のモル比）。
標的となる部分（例えば、抗体または抗体フラグメント）は、該脂質−核酸複合体を形成させる前または後に脂質および/またはリポソームに結合させることができる。好ましい態様において、標的となる部分を、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）に結合させ、標的となる部分／親水性ポリマーを脂質−核酸複合体に引き続き加える。これにより、他の異なる一般の脂質−核酸複合体の標的特異性を修飾する簡便な手段が提供される。
特に好ましい態様において、該脂質−核酸複合体の保存安定性を高める方法は、スペルミジンまたはスペルミンを有する発現カセットを両親媒性カチオン性脂質＋コレステロールなどの中性ヘルパー脂質、およびスペーサー（例、ポリエチレングリコール）に結合した抗体のＦａｂ'フラグメントと結合させる工程を含み、その結果、約４℃で貯蔵したときの該複合体の保存安定性が高められる。
特に好ましい態様において、該脂質−核酸複合体の保存安定性を高める方法は、スペルミジンまたはスペルミンを有する発現カセットを両親媒性カチオン性脂質およびポリエチレングリコール誘導体に結合した抗体のＦａｂ'フラグメントと結合させる工程を含む。他の特に好ましい態様においては、発現カセットを両親媒性カチオン性脂質およびポリエチレングリコール誘導体に結合した抗体のＦａｂ'フラグメントと結合させる工程を含み、その結果、約４℃で貯蔵したときの該複合体の保存安定性が高められる。
本発明はホ乳動物細胞に核酸をトランスフェクションする方法をも提供するが、該方法は上記のように調製した脂質-核酸複合体のいずれか１種と該細胞を接触させることを有する。ある態様として、該方法は脂質−核酸複合体をホ乳動物に全身投与することを利用する。好ましい態様として、トランスフェクションする方法は、該脂質−核酸複合体をホ乳動物に静脈投与する方法を利用する。特に好ましい態様において、該方法はＦａｂ'フラグメントを認識するリガンドを発現する特異細胞と接触させることから成る。
更に好ましい態様として、本発明は上記脂質−縮合核酸複合体を含む医薬組成物をも提供する。医薬組成物は治療上有効量の脂質−核酸複合体および医薬上許容可能なキャリアまたは賦形剤を有する。
更に他の態様として、本発明は脂質−核酸複合体を調製するためのキットをも提供し、該キットはリポソームを容れる容器、核酸を容れる容器、および親水性ポリマーを容れる容器を有し、該リポソームと核酸とを混合して脂質-核酸複合体を形成させ、該脂質−核酸複合体を親水性ポリマーと接触させる。好ましい態様において、親水性ポリマーは標的となる部分、好ましくはＦａｂ'フラグメントで誘導化する。さらに好ましい態様として、該核酸を縮合させる。
本発明はまた、上に要約したように、有機ポリカチオンと縮合させた核酸を用いて保存安定性を高める方法により調製した脂質−縮合核酸複合体をも提供する。
定義
本明細書において以下の略記を用いる。Ｃｈｏｌ＝コレステロール。ＰＡ＝ホスファチジン酸。ＰＣ＝ホスファチジルコリン。ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール。ＳＭ＝スフィンゴミエリン。Ｍ−ＤＰＥ＝マレイミド誘導化ジパルミトイルエタノールアミン。ＰＢＳ＝リン酸バッファー塩溶液。ＬＵＶ＝巨大単一膜小胞。ＭＬＶ＝多重膜小胞。ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン。ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール。ＰＥＧ−ＰＥ＝ポリエチレングリコール誘導化ホスファチジルエタノールアミン。ＤＣ−ｃｈｏｌ＝３β［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルボニル］−コレステロール。ＤＤＡＢ＝臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム。ＤＭＥＰＣ＝ジミリストイルグリセロ−３−エチルホスホコリン。ＤＯＤＡＰ＝ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン。ＤＯＥＰＣ＝ジオレオイルグリセロ−３−エチルホスホコリン。ＤＯＧＳ＝Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン。ＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン。ＤＯＴＡＰ＝ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン。ＤＯＴＭＡ＝臭化Ｎ−［２、３−(ジオレイルオキシ)プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム。ＤＳＰＥ＝ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン。ＰＥＧ−ＰＥ＝Ｎ−［ω−メトキシポリ（オキシエチレン）−α−オキシカルボニル］−ＤＳＰＥ。ＰＯＥＰＣ＝パルミトイルオレオイルグリセロ−３−エチルホスホコリン。
「両親媒性カチオン性脂質」という用語は、合成脂質および脂質類似体を含むすべての両親媒性脂質を包含し、疎水性および極性先端基部分、正味の正電荷を有し、リン脂質で例示されるように、それ自体で自発的に水中二層小胞またはミセルを形成し得るものである。該用語はまた、その疎水性部分が二層膜の内部疎水性領域と接触していて、かつ、その極性先端基部分が膜外部極性表面に向っているリン脂質と組み合わさって脂質二層に安定に取り込まれている両親媒性脂質をも包含する。
「特異的に結合」という用語は、酵素／基質、レセプター／アゴニスト、抗体／抗原、およびレクチン／炭水化物などの、共有結合もしくは非共有結合の相互作用により、または共有結合および非共有結合の相互作用の組み合わせにより仲介され得る対を形成する種間に起こる結合をいう。２つの種の相互作用が非共有結合の複合体を生じる場合、起こる結合は一般に静電気的結合、水素結合、または親油性相互作用である。従って、「特異的結合」は、抗体／抗原または酵素／基質相互作用の特徴をもつ結合複合体を生じる二者間に相互作用がある場合の対となる種間に起こる。特に、特異結合は、対の一方が結合膜の対応する膜が属する化合物群内の特定の種には結合するが、他の種には結合しないことによって特徴づけられる。このように、例えば、抗体は、好ましくは、単一エピトープに結合し、当該タンパク群内の他のエピトープには結合しない。
本明細書で用いる「リガンド」または「標的となる部分」という用語は一般に特定の標的分子に特異的に結合する、および上記の結合複合体を形成することのできるすべての分子をいう。このように、リガンドおよびその対応する標的分子は特異結合対を形成する。例示すると、これらに限定されるものではないが、抗体、リンホカイン、サイトカイン、ＣＤ４およびＣＤ８などのレセプタータンパク質、可溶性ＣＤ４などの可溶化レセプタータンパク質、ホルモン、増殖因子などが例示され、これらは所望の標的細胞、及び塩基対相補性を介して対応する核酸に結合する核酸に特異的に結合する。特に好ましい標的となる部分は抗体および抗体フラグメント（例、Ｆａｂ'フラグメント）を包含する。
「脂質−核酸複合体」という用語は、両親媒性カチオン性脂質またはリポソームを核酸と混合することにより作製される産物をいう。「ＣＬＤＣ」という用語は本明細書において使用される「カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体」を表わすが、ＤＮＡに限定されるものではなく、脂質−核酸複合体にとって便利な略記である。脂質−核酸複合体はまた、ヘルパー脂質をも含む。ヘルパー脂質は、多くはＤＯＰＥまたはコレステロールなどの中性脂質であり、コレステロールが最も好ましい。脂質−核酸複合体はまた、複合体の核酸と接触して、縮合核酸、及びＰＥＧまたは誘導化ＰＥＧなどの親氷性ポリマーを生じるポリカチオンなどの他の化合物をも含む。
「免疫リポソーム」および「免疫脂質−核酸複合体」という用語は、抗体または抗体フラグメントを担持するリポソームまたは脂質−核酸複合体をいい、これらは標的となる部分として作用して脂質−核酸複合体が特異的に特定の、溶液状のまたは細胞表面に結合した「標的」分子に結合するのを可能とする。標的分子が比較的過剰に（例えば、≧１０倍）典型的に見出されるものであり、特定の細胞型と関連しているか、または特定の生理条件を発現するすべての細胞型の多様な状態にある場合、標的分子はその細胞型のまたはその生理条件の「特徴的マーカー」であるといわれる。このように、例えば、癌は乳癌の場合、ＨＥＲに(ｃ−ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ)プロトオンコジーンのように特定マーカーの過剰発現により特徴づけることができる。
本明細書で用いる「親水性ポリマー」とは、脂質分子に結合した長鎖高次水和柔軟性の中性ポリマーをいう。例示としては、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化脂質、ホスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、トゥイーンで誘導化したポリエチレングリコール、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ガングリオシドＧM1および合成ポリマーなどである。かかるポリマーは典型的には１０００〜１０，０００の範囲の分子量を有する。ＰＥＧに対する分子量は約２０００であるのが好ましい。
「トランスフェクション」とは生きている細胞を、例えば、脂質−核酸複合体の一部としての核酸と接触させることをいう。
「トランスフェクション活性」とは核酸を生きている細胞に導入する効率をいう。トランスフェクション効率は、脂質−核酸複合体の一部として細胞に移入されるレポーター遺伝子の発現量を、例えば蛍光又は機能アッセイで定量することにより測定することができる。
「縮合した核酸」および「一部縮合した核酸」という用語は、有機カチオン、例えば、スペルミンおよびスペルミジンを含むポリアミン、ポリブレン(Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ)（臭化ヘキサジメトリン）などのポリアンモニウム分子、塩基性ポリアミノ酸、および塩基性タンパク質と接触させた核酸をいう。縮合した核酸は一般に、非縮合核酸よりも著しく小さな容積を占める。しかし、縮合の度合いは局部的環境により変わり得るということが認められている（例えば、脂質は水性環境に抵抗する）。
「保存安定性」という用語は、これを用いて本明細書に開示した脂質−核酸を言及する場合、脂質−核酸複合体がその生物活性を失うまで（所定の条件下、例えば、４℃で）貯蔵することのできる期間をいう。本発明において保存安定性の定量のためにアッセイした生物活性は、脂質−核酸複合体が静脈投与後インビボでホ乳動物細胞に移入する能力である。脂質−核酸複合体の「保存安定性」は、本明細書記載の脂質−核酸複合体のレポーター核酸からの遺伝子発現によるアッセイにより簡便に定量される。
「発現カセット」とはＤＮＡ分子に操作可能に結合したプロモーターをいい、これは生存細胞中の当該ＤＮＡ分子の発現に必要な要素のすべてを含んでいる。該発現カセットは発現ベクターを形成する付加的要素、例えば、エンハンサー、複製原などを含んでもよい。
「有機ポリカチオン」または「ポリカチオン」とは有機ポリマー構造をいい、１単位以上のポリマーが負電荷を担持し、ポリマーの実効電荷が正である。かかる有機カチオンの例として、スペルミンおよびスペルミジンを含むポリアミン、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）などのポリアンモニウム分子、塩基性ポリアミノ酸、または塩基性タンパク質を包含する。
「医薬上許容可能なキャリア」とは、生物学的にまたは他の意味でも不適当とはならない物質、即ち、該物質は脂質-核酸複合体と共に個体に投与し得るものであって、受け入れられない生物学的効果を伴わず、あるいは製剤組成物が含有する他の組成のいずれとも有害な様式で相互作用しないものである。
「核酸」という用語は、リン酸ジエステル結合（または関連する構造変異体またはその合成類似体）を介して連結したヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは関連する構造変異体またはその合成類似体）から構成されるポリマーまたはオリゴマーをいう。このように、当該用語はヌクレオチドポリマーをいい、そこでヌクレオチドとそれらの間の連結は天然に存在するもの（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、並びに種々の類似体、例えば、これらに制限はないものとして、ペプチド-核酸（ＰＮＡ）、ホスファーアミデート類、ホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、２−０−メチルリボ核酸などである。
「モルパーセント」という用語は、リポソーム中の親水性ポリマーのパーセントについていう場合、他に断わりのない限り、リポソーム中のカチオン性脂質に関して表される。このように、例えば、ＤＤＡＢ対コレステロール（Ｃｈｏｌ）比が１００：１００であるリポソームにおいて、親水性ポリマー（例、ＰＥＧ）４モルパーセントとはＤＤＡＢ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧの比が約１００：１００：４であることを表す。
「同一」という用語は他の組成物と同じ化合物を用いて形成される組成物をいい、該組成物は統計学的に著しい差を示さない。
「全身投与」という用語は化合物または組成物をホ乳動物に投与する方法をいい、その結果、該化合物または組成物は循環系を経て体内の多くの部位に送達される。
本発明は、カチオン性脂質-核酸複合体の保存性（ｓｈｅｌｌ ｌｉｆｅ）、並びにそれら複合体のインビボ及びインビトロでのトランスフェクション効率を増大させる方法を提供する。そのような複合体は、治療（たとえばアンチセンス）核酸それ自体を送達する手段としての種々の治療ポリペプチドを発現する核酸を送達する手段としてかなり興味をもたれてきた。不幸なことに、インビボ投与に適した均一な脂質−核酸複合体を保持し貯蔵することは困難であった。この複合体はすみやかに凝集するか、または比較的短時間のうちに分解する傾向がある。このような不安定性により、これら複合体の調製後、しばしば３０分〜数時間までというような短い期間内に使用することが必要とされてきた。よって、例えばＤＮＡ送達用のキャリアとしてカチオン性脂質を用いた最近の臨床試験では、ＤＮＡと脂質は臨床で混合してから直ちに使用していた（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：７１０−７２(１９５５)）。
この脂質−核酸複合体の不安定性は、治療薬としてのカチオン性脂質−核酸複合体がひろく受け入れられるための著しい障害となる。使用直前に複合体を調製せねばならぬという必要性は、医薬設備が使用区域と比較的接近していることを要求させる。あるいは、脂質と核酸を臨床で混合することは、実質的な労働負担をもたらし、適切な複合化を保証するための品質管理の問題を生じさせ、そして潜在的なミスの原因をつくることになる。
本発明は、脂質−核酸複合体の貯蔵（保存）寿命を著しく増大させる方法を提供することによりこれらの問題点を解消するものである。その方法は一般的に、(１）脂質−核酸複合体に取込む前に核酸を縮合させること、（２）脂質−核酸複合体を親水性ポリマー（たとえばＰＥＧ）と結合させること、及び（３）複合体の形成前に核酸を縮合させ、かつ複合体を親水性ポリマーと結合させること、を含んでいる。
核酸の縮合は、単離している核酸（たとえば水性緩衝液中）の安定性をもたらし得るけれども、縮合剤（たとえば有機ポリカチオン）の使用が、長期間の貯蔵（たとえば約２２℃以下、さらに好ましくは約０℃から約２２℃、そして最も好ましくは約４℃の温度での冷蔵）後であっても、インビボで細胞にトランスフェクション能力を残しているような脂質-核酸複合体を提供するというのが、本発明の驚くべき発見である。
さらには、両親媒性の脂質（たとえばＰＥＧ−ＰＥ）に付着する親水性ポリマーと結合した脂質−核酸複合体もまた、増大した保存性を示すことも驚くべき発見である。特定の理論によって拘束されることなく、カチオン性脂質-核酸複合体（ＣＬＤＣ）が親水性ポリマーと接触したとき、その親水性ポリマーは定着しその疎水性側鎖を経由して複合体の疎水性ポケットの中に取込まれる一方、外部表面で親水性部分を残しそれによって複合体全体が安定化すると考えられる。
これらの発見によって本発明は、カチオン性脂質−核酸複合体の保存性を増大させる方法を提供する。この方法は一般に、ポリカチオンを用いて核酸を縮合し及び／又は脂質−核酸複合体を親水性ポリマーと接触（たとえば被覆）することを含んでいる。本発明はまた、このようにして得られた脂質−核酸複合体をも含んでいる。
Ｉ．カチオン性脂質−核酸複合体
上述したように、本発明は、脂質−核酸複合体の貯蔵寿命（保存安定性）を増大させる方法を提供する。好ましい態様として、この複合体は、核酸をリポソームと結合することによって形成される。しかしながら、この脂質はリポソームとして提供される必要がないことが認められる。さらに、複合体化後、脂質−核酸複合体はもはや真の小胞としては存在せず、したがって一般にはリポソームとは見なされないことが認められる。脂質−核酸複合体の調製法は当業者にはよく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４０４−４１０（１９９５）の総説;Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；及びＧａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）を参照のこと）。本発明の安定化脂質−核酸複合体の種々の成分と構成を、以下に詳細に述べる。
Ａ．両親媒性カチオン性脂質
上に示したように本発明の方法は、カチオン性脂質を核酸と複合体化させることを含む。「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷をもつ多くの脂質類の如何なるものであってもよい。そのような脂質にはＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭＲＩＥが含まれるが、これらに限定されるものではない。これに加えて、本発明で用いることが出来る数多くのカチオン性脂質の市販の製剤が入手可能である。たとえばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを有するカチオン性リポソーム、アメリカ合衆国、ニューヨーク州、グランドアイランドのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販入手可能)、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＰＳＡ及びＤＯＰＥを有するカチオン性リポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販入手可能)、及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳのエタノール溶液を有するカチオン性脂質、アメリカ合衆国、ウイスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販入手可能)。
カチオン性脂質は単独で用いることもできるし、または「ヘルパー」脂質と共に用いることもできる。好ましいヘルパー脂質は、生理的ｐＨにおいて荷電していないか又は非イオン性のものである。特に好ましい非イオン性脂質として、コレステロールおよびＤＯＰＥが挙げられ、最も好ましくはコレステロールであるが、これらに限定されるものではない。
脂質：ヘルパーのモル比は、２：１から約１：２、さらに好ましくは約１．５：１から約１：１．５の範囲をとることができ、最も好ましくは約１：１である。
本発明の脂質−核酸複合体に用いるのに適したこれ以外のカチオン性および非イオン性の脂質は、当業者によく知られており、周知の種々の文献、たとえばＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’Ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ及びＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’Ｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ａｌｌｕｒｅｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎ．Ｊ．）に引用されている。好ましい脂質は、ＤＤＡＢ：コレステロールまたはＤＯＴＡＰ：コレステロールをモル比１：１で含む。
Ｂ．核酸
脂質−核酸複合体は、核酸、特に組換え技術を用いて構築された発現カセットを含んでいる。組換え核酸は、問題の核酸をまず単離することによって作製される。ついで単離された核酸は、遺伝子発現に適したカセットまたはベクターの中へ連結される。組換え核酸の調製法は当業者に知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版.，１９８９）を参照）。
問題の遺伝子、たとえば治療ポリペプチドをコードする遺伝子、即ちレポーター遺伝子は、「発現ベクター」、「クローニングベクター」、または「ベクター」の中へ挿入することができる。これらの用語は、選ばれた宿主細胞の中で複製可能でありかつ問題の遺伝子を発現可能なプラスミドまたはその他の核酸分子を通常意味する。発現ベクターは自律的に複製可能であるか、または宿主細胞のゲノムに挿入することにより複製可能である。ベクターにとって、クローニングや構築のためには一つまたはそれより多い宿主細胞、例えば大腸菌の中であって、発現のためにはホ乳類細胞の中で使用可能であることがしばしば望ましい。ベクターの付加的要素として、たとえば選択可能なマーカーやエンハンサーを含むことができる。選択可能なマーカー、例えばテトラサイクリン耐性やヒグロマイシン耐性は、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出及び／又は選択を許容する（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号を参照）。細胞に遺伝情報を輸送するのに用いる特定のベクターもまた、特に重要ではない。原核生物または真核生物細胞において組換えタンパク質の発現に用いる従来のベクターのいずれをも用いることができる。
発現ベクターは典型的には、宿主細胞における核酸の発現に要求されるすべての要素を含む発現カセットまたは転写単位をもっている。典型的な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列と作用可能に結合したプロモーターを含んでいる。このプロモーターは、その天然のセッティングにおける転写出発部位とおおむね同じ距離だけ、非相同な転写出発部位からの距離に位置しているのが好ましい。しかしながら、当業者には公知のように、この距離の若干の変動は、プロモーター機能を損なわずに、行なうことができる。
発現カセットにおいて、問題の核酸配列を、***可能なシグナルペプチド配列をコード化する配列と結合して、形質転換細胞によるコード化タンパク質の分泌を促進させることができる。発現カセットはまた、効率的な終止を提供するために構造遺伝子の下流に転写終止領域を含むべきである。この終止領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から、または異なる遺伝子から得ることができる。
構造遺伝子でコードしたｍＲＮＡのホ乳動物細胞におけるもっと効率的な翻訳のためには、ポリアデニル化配列もまた発現カセットに通常加えられる。本発明に適した終末およびポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０由来のもの、又は発現ベクター上に既に存在する遺伝子の部分的ゲノムコピー由来のものが含まれる。
発現カセットに加えて、多くの発現ベクターは、結合された相同な又は非相同なプロモーターから１，０００倍までもの転写を刺激できるエンハンサー要素を最適に含んでいる。ウイルス由来の多くのエンハンサー要素は、広範な宿主範囲をもっており、種々の組織において活性である。たとえば、ＳＶ４０の初期の遺伝子エンハンサーは、多くのタイプの細胞に適している。本発明に適したその他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせは、ポリオーマウイルス、ヒトまたはネズミのサイトメガロウイルス由来のもの、例えばネズミ白血病ウイルス、ネズミ又はラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶのような種々のレトロウイルス由来の末端反復配列を含む（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９８３）を参照のこと）。
上述の組換え核酸の他に、合成された核酸またはオリゴヌクレオチドもまた、本発明で用いることができる。本発明で用いる核酸についての一般的なポイントとして、当業者は、本発明で用いる核酸がＤＮＡとＲＮＡの双方の分子、さらにはその合成されたものや天然に存在しない類似体、ならびにデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれら何れかの類似体のヘテロポリマーを含むものと認めている。核酸または核酸類似体の特定の組成は、それらが使用される目的、およびそれらが置かれた環境に依存するであろう。修飾または合成された、天然に存在しないヌクレオチドは、当業者に周知のように、ヌクレアーゼが中に存在しているような種々の環境で安定であり、且つ種々の目的に利用できるようにデザインされてきた。天然に存在するリボ-またはデオキシリボヌクレオチドと比べ、修飾または合成された、天然に存在しないヌクレオチドは、そのヌクレオチドの炭水化物（糖）、リン酸塩結合、又は塩基部分に関して相違しているか、または非ヌクレオチド塩基をも含んでいる（もしくは塩基を全く含まない）こともあり得る（Ａｒｎｏｌｄ、ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ特許公報番号ＷＯ ８９／０２４３９号を参照のこと）。たとえば、本発明の修飾核酸又は天然に存在しない核酸は、ビオチン化核酸、Ｏ−メチル化核酸、メチルホスホネート主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）核酸、ホスホロチオエート主鎖核酸、またはポリアミド核酸を含むことができる。
以下に述べるアンチセンスＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓまたはその他の市販入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を用い製造業者の提供する説明書にしたがって合成される。オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステル法やホスホジエステル法のような如何なる適当な方法を用いても、またはそれらの自動化された態様を用いても調製される。そのような自動化された態様の一つにおいては、ジエチルホスホルアミダイトを出発物質として用い、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９（１９８１）及び米国特許第４，４５８，０６６号記載のように合成できる。
Ｃ．縮合核酸
小さなポリカチオン分子は、静電気的な荷電-荷電相互作用を介して核酸と縮合することが知られている（Ｐｌｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３０：６３１−６４３（１９９０））。したがってポリアミンによる核酸の前処理は、カチオン性リポソームとの複合体化のための荷電部位の数を減少させることができる。しかしながら、脂質複合体の形成前に核酸を縮合することにより、トランスフェクション効率での測定によれば、脂質−核酸複合体の保存性の増大という驚くべき結果を生じる。そのような前処理で形成された脂質−核酸複合体は、脂質：ＤＮＡが低い比率で凝集をともなうことなく安定であった。ポリアミン、ポリアンモニウム分子、および塩基性ポリアミノ酸、ならびにそれらの誘導体のような有機ポリカチオンを用いて、脂質複合体形成前に核酸を縮合する。好ましい態様において、スペルミジンやスペルミンのようなポリアミンを用いて核酸を縮合する（例えば、実施例１を参照のこと）。
Ｄ．親水性ポリマー
リポソームにＰＥＧ-ＰＥを取込むことにより、血中における長い循環回数をもたらす立体安定性を生じることが最近わかった（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６：２９−３６（１９９１）；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４６０−１１４６４（１９９１））。本発明においては、新しく作られた脂質−核酸複合体にＰＥＧ−ＰＥを挿入すること（たとえば全液体の１％）により、その複合体の貯蔵中における凝集を予防する。しかしながら、ＰＥＧ−ＰＥを取込むことは、インビボ・トランスフェクション活性を阻害せず、また阻害されていたインビトロ・トランスフェクション活性がＰＥＧ−ＰＥの末端で接合しているＦａｂ'の取込みによって再生されるということは驚くべき発見であった。脂質−核酸複合体に親水性ポリマーが存在すると、貯蔵後のトランスフェクション効率で測定したところ、増大した保存性がもたらされる。よって、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化脂質またはガングリオシドＧM1のような親水性ポリマーをリポソームに加えることが望ましい。ＰＥＧはまた、たとえば脂肪酸、スフィンゴリン脂質、糖脂質、およびコレステロールのような他の両親媒性分子で誘導体化することができる。そのような成分を添加することにより、標的部をリポソームにカップリングする際に、リポソームの凝集を予防する。これらの成分はまた脂質−核酸複合体の循環寿命を増大させる手段を提供する。
いろんな異なった方法が、リポソームに取込むためのＰＥＧの調製にも用いることができる。一つの好ましい態様において、ＰＥＧを、ＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）またはＰＥＧ誘導化ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）として取込む。ＰＥＧ−ＰＥの調製方法は周知であり、典型的には活性化したメトキシＰＥＧ（わずか１つの反応性末端をもつ）及びＰＥを用いることを含む。よって、ＰＥＧ−サクシニミジルサクシネートを塩基性有機溶媒中で反応させる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２６８：２３５−２３７（１９９０））．ＰＥＧ−ＰＥ調製の特に好ましい方法は、ＰＥＧをカルボニルジイミダゾールと反応させ、次いでＰＥを添加することに基づく（Ｗｏｏｄｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．１７：７７−７８（１９９０）；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４６０−１１４６４（１９９１）；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６６：２９−３６（１９９１）；Ｗｏｏｄｌｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１０５：１９３−２００（１９９２）；およびＷｏｏｄｌｅら、Ｐｅｒｉｏｄ．Ｂｉｏｌ．９３：３４９−３５２（１９９１）を参照のこと）。同様にして、塩基性有機溶媒中でのシアヌル酸クロライドで活性化したＰＥＧが、Ｂｌｕｍｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０２９：９１−９７（１９９０）および米国特許第５，２１３，８０４号に記載されている。まったく異なるアプローチは、トレシルクロライドで活性化したＰＥＧを使ってあらかじめ作製したリポソームとＰＥＧをカップリングさせ、ついで高ｐＨでＰＥ含有リポソームに加える方法に基づく（Ｓｅｎｉｏｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｊｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６２：７７−８２（１９９１））。誘導体化したＰＥＧも市販入手可能である。よって、例えばＰＥＧ-ＰＥはＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｍａ州、Ａｌａｂａｓｔｅｒ）から入手できる。たとえば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）のようなＰＥＧ結合した洗剤や、形成した脂質−核酸複合体にＰＥＧ誘導体化脂質を挿入する、といったような多くの他の結合があることを当業者は認めるであろう。
Ｅ．Ｆａｂ'抗体フラグメント
好ましい態様において、本発明の脂質−核酸複合体は、抗体のＦａｂ'フラグメントに接合する。それは、Ｆａｂ'抗体フラグメントが示す標的分子（例えば特徴的マーカー）をもつ標的細胞と特異的に脂質−核酸複合体を結合することができる標的部として作用する。超可変領域からの小さなペプチド、又は特定の細胞表面リガンドと相互作用するその他のペプチドからの小さなペプチドもまた、この複合体と接合することができる。一般的にいって、抗体のＦａｂ'フラグメントは、抗体の一つのアームのＣH１領域および可変領域を有するモノマーを表す。そのような好ましい態様の一つを実施例２に述べる。
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子フラグメントで実質的にコード化された１つまたはそれより多いポリペプチドから成るタンパク質を表わす。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、それらはまた各々ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンを表す。
基本的な免疫グロブリン(抗体)の構造単位は、テトラマーを有することが知られている。各々のテトラマーは、２つの同一のペアのポリペプチド鎖から成り、各々のペアは、１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重い」鎖(約５０〜７０ｋＤ)をもっている。各々の鎖のＮ末端は、一次的に抗原認識のための約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を決める。可変の軽鎖（ＶL）および可変の重鎖（ＶH）という用語は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ意味する。
抗体は、完全な免疫グロブリンとして存在するか、または種々のペプチダーゼで消化されて作られた、多くの良く特徴づけられたフラグメントとして存在し得る。特に、ペプシンはヒンジ領域中のジスルフィド結合の下での抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合でＶH−ＣH１と結合した軽鎖であるところのＦａｂ'のダイマーであるＦ(ａｂ)'2を生成する。このＦ(ａｂ)'2は、温和な条件下で還元されヒンジ領域のジスルフィド結合を分解し、それによってＦ(ａｂ)'2ダイマーをＦａｂ'モノマーに変換する。このＦａｂ'モノマーは、ヒンジ領域の部分と共に本質的にＦａｂである(より多くの抗体フラグメント用語については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、ｅｄ．、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと)。Ｆａｂ'フラグメントは完全な抗体の消化によって定義されるが、そのようなＦａｂ'フラグメントを化学的に、または組換えＤＮＡ方法を利用して、新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成することができることを当業者は理解するであろう。
本発明で使用するＦａｂ'フラグメントは、動物（とくにマウスまたはラット）又はヒトを起源とする抗体由来とすることができるか、またはキメラであるか（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））もしくはヒト化する(Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）および英国特許出願公報第８７０７２５２号)ことができる。
Ｆａｂ'フラグメントは、カチオン性脂質−核酸複合体の内容物を送達させようとする細胞の表面に特徴的な分子またはマーカーと特異的に結合するように選択される。分子は、その分子がその細胞型と関連して見出されるか、又はすべて特定の生理的条件（たとえば形質転換）を発現する多数の細胞型において典型的に見出されるとき、細胞、組織または生理的状態に特徴がある。特定の特徴的マーカーは、特定の組織もしくは細胞型の細胞表面、または特定の生理的条件を発現する組織もしくは細胞の表面に見出されるのが好ましく、生体内のそれ以外の組織や細胞型には見出されない。しかしながら当業者は、マーカーの特異性のそのようなレベルはしばしば必要ではないことを認めるであろう。たとえば特徴的な細胞表面マーカーは、もしも非標的組織のみが脂質-核酸複合体にアクセス可能でないならば、充分な組織特異性を示すであろう。あるいは効果的な特異性は、その他の組織に比べて標的組織でのマーカーの過剰発現によって得られるであろう。このことは、効果的な組織特異性をもたらす標的組織による好ましい捕捉という結果を招くであろう。よって、例えば多くのガンは、乳癌の場合におけるレセプターでコード化されたＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｎｅｕ）のような細胞表面マーカーの過剰発現で特徴づけられる。
標的として望まれる特定の組織に依存する、良好な特徴的マーカーを提供する多くの細胞表面マーカーがあることを、当業者は認めるであろう。これらの細胞表面マーカーとして、炭水化物、タンパク質、糖タンパク質、ＭＨＣ複合体、インターロイキン、ならびにＨＥＲ、ＣＤ４、およびＣＤ８レセプタータンパク質のようなレセプタータンパク質、さらにはその他の増殖因子やホルモンレセプタータンパク質を含むが、それらに限定されるものではない。
増殖因子レセプターは、特に好ましい特徴的な細胞表面マーカーである。増殖因子レセプターは、増殖因子と特異的に結合し、それによって特定の増殖因子に特徴的な細胞応答を仲介する細胞表面レセプターである。ここで用いた「増殖因子」という用語は、細胞***もしくは分化を活性化もしくは刺激するか、またはタンパク質の運動性もしくは分泌性のような生物学的応答を刺激するタンパク質もしくはポリペプチドリガンドを表わす。増殖因子は当業者によく知られており、次のようなものを含むがそれに限定されるものではない。すなわち、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、表皮増殖因子(ＥＧＦ)、インスリン様増殖因子(ＩＧＦ)、変成増殖因子β（ＴＧＦ-β）、繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、インターロイキン２(ＩＬ２)、神経増殖因子(ＮＧＦ)、インターロイキン３(ＩＬ３)、インターロイキン４(ＩＬ４)、インターロイキン１(ＩＬ１)、インターロイキン６(ＩＬ６)、インターロイキン７(ＩＬ７)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)、エリスロポイエチン、インターロイキン１３レセプター(ＩＬ１３Ｒ)などである。ここで使用した増殖因子という用語は一般にサイトカインやコロニー刺激因子を含むことを当業者は認めるであろう。
特に好ましいマーカーは、増殖因子レセプターのＨＥＲ系統群の中に見出される。特にＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４はさらに好ましく、ＨＥＲ２はもっとも好ましい。これらのＨＥＲレセプターは、高度に特異的な抗体標的をそれ自体が提供するタンパク質チロシンキナーゼを有する。よって、ある態様において、ＨＥＲ２のＰ１８５チロシンキナーゼは、本発明の免疫脂質−核酸複合体で用いるＦａｂ'フラグメントのためのもっとも好ましい標的を提供する。
特徴的なマーカーは、天然に存在するマーカーである必要はなく、むしろ特定の標的細胞へ導入されてもよいことは認められであろう。これは、細胞や組織を特定のマーカーで直接にラベルする（例えば特定の標的組織にマーカーを直接注入するか、または標的組織で選択的に取り込まれたマーカーを全生体に投与する）ことにより達成することができる。ある態様において、マーカーは、発現カセットの核酸によりコードした遺伝子生産物とすることができる。このマーカー遺伝子は、特定の標的細胞においてのみ活性であるプロモーターの管理下にあリ得る。よって、発現カセットを含むベクターを導入することにより、特定の標的細胞においてのみマーカーの発現をもたらすであろう。標的細胞の中へ特徴的マーカーを導入するための組換えＤＮＡ手法を用いる多くのアプローチのあることを、当業者は認めるであろう。
好ましい態様において、標的部は、増殖因子レセプターの成分または産物、特にＨＥＲ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｎｅｕ）プロトオンコジーンの産物と特異的に結合するであろう。標的部が、ＨＥＲ２、ｐ１８５HER2タンパク質でコードした増殖因子レセプターチロシンキナーゼと結合することが特に好ましく、このＨＥＲ２、ｐ１８５HER2タンパク質は、乳癌で通常過剰発現する（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７−１８２（１９８７））。標的部のためのこれ以外の適当な標的として、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１)、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４、これらレセプターの組合せ、並びにガンに関連するその他のマーカーが挙げられるが、それに限定さるものではない。これ以外の問題の抗体として、ＢＲ９６（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５３：３３４−３３９（１９９３）、ｅ２３〜ｅｒｂＢ２まで（Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５８６７−５８７１（１９９２））、前立腺ガンにおけるＰＲ１（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５４７−５５１（１９９３））並びに卵巣ガンにおけるＫ１（Ｃｈａｎｇ、ｅｔａｌ。、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０：３７３−３８１（１９９２）が挙げられるが、それに限定されるものではない。
本発明の免疫脂質−核酸複合体は、当業者に周知の種々の技術により、Ｆａｂ'フラグメントをリポソームまたは脂質に取込むことによって調製することができる。このＦａｂ'を、脂質−核酸複合体の形成前又は形成後に複合体へ加える。例えば、ビオチン接合Ｆａｂ'を、ストレプトアビジンを含むリポソームに結合してもよい。または、ビオチン化Ｆａｂ'を、アビジンもしくはストレプトアビジンリンカーにより、ビオチン誘導化リポソームに接合してもよい。よって、例えばビオチン化モノクローナル抗体をビオチン化し、アビジンリンカーを用いてビオチン化ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームに付加した（例えば、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）を参照のこと）。脂質−核酸複合体あたりＦａｂ'フラグメントを、典型的には約３０〜１２５、さらに典型的には約５０〜１００用いられる。
好ましい態様において、標的部を、リポソームと直接接合してもよい。そのような直接接合のための手法は当業者に周知である（例えば、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３）を参照のこと）。特に好ましいのは、チオエーテル結合による接合である。抗体を、例えばマレイミド誘導化ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）またはジパルミトイルエタノールアミン（Ｍ−ＤＥＰ）のようなマレイミド誘導化した脂質と反応させることによって、これを達成することができる。このアプローチはＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に詳細に記載されている。
ＩＩ．リポソームの作製
以下に記載のように、リポソームの調製のためには種々の方法がある。たとえば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号;ＰＣＴ公報第ＷＯ９１／１７４２４号；Ｓｚｏｋａ ＆ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８（１９７８）；Ｄｅａｍｅｒ ＆ Ｂａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９−６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８−３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８１２：５５−６５（１９８５）；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１−１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４２−２４６（１９８８），Ｌｊｐｏｓｏｍｅｓ、ｃｈ．ｌ（Ｏｓｔｒｏ、ｅｄ．、１９８３）；およびＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）である。適切な方法として、例えば超音波処理、押出、高圧／均質化、微流動化、洗剤透析、小リポソーム小胞のカルシウム誘発融合、およびエーテル融合方法などが挙げられ、これらのすべては当業界で周知である。１つの方法では不均一なサイズの多重膜小胞を産生する。この方法では、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶かし、そして減圧下または不活性ガス下で乾燥させて脂質薄膜とする。所望であれば、この膜を例えば三級ブタノールのような適切な溶媒に再溶解し、凍結乾燥し、さらに容易に水和可能な粉末状の形態である、さらに均一な脂質混合物とする。この膜を水性緩衝液で覆い、典型的には１５〜６０分間攪拌しながら放置して水和させる。得られた多重膜小胞のサイズ分布は、さらに激しい攪拌条件下で脂質を水和させるか、またはデオキシコール酸塩のような溶解性洗剤を添加することによって、より小さいサイズにすることができる。
好ましい態様として、ほとんど単一膜リポソームをＳｚｏｋａ ＆ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８（１９７８）の逆相蒸発法によって産生する。
単一膜小胞は一般に、超音波処理または押出によって調製する。超音波処理は、脂質の融点で決められるコントロール温度で例えばブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）チップ超音波処理装置のような浴タイプの超音波処理装置を用いて一般的に行われる。押出は、リペックス（Ｌｉｐｅｘ）の生体膜押出装置（Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）のような生体膜押出装置によって行うことができる。押出フィルターにおける決められた細孔径により、特定サイズの単一膜リポソーム小胞を生成することができる。このリポソームはまた、Ｎｏｒｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡから市販入手可能なＣｅｒａｆｌｏｗ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒのような非対称的なセラミックフィルターを通して押し出すことにより調製することができる。
リポソームの調製に続いて、形成中にサイズ分けしてないリポソームを、押出によりサイズ分けして、所望のサイズ範囲とし且つリポソームのサイズ分布を比較的狭くする。従来のフィルター約０．２〜０．４ミクロンのサイズ範囲、典型的には０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することによりリポソーム懸濁液を殺菌することができる。このフィルター殺菌法は、リポソームが約０．２〜０．４ミクロンのサイズまで小さくなっておれば、高い処理量で行なうことができる。
所望のサイズにリポソームをサイズ分けするのにいくつかの技術がある。サイズ分け法の１つが、米国特許第４，５２９，５６１号または第４，７３７，３２３号に記載されている。浴またはプローブ音波処理によりリポソーム懸濁液を超音波処理すると、約０．０５ミクロンのサイズ未満の小さな単一膜小胞まで著しくサイズが減少する。均質化は、大きなリポソームを小さなものにフラグメント化するためのせん断エネルギーによる別方法である。典型的な均質化法において、多重膜小胞を、典型的には約０．１〜０．５ミクロンの選択されたリポソームサイズとなるまで、標準的な乳濁液ホモジナイザーで再循環する。リポソーム小胞のサイズは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０：４２１−４５０（１９８１）に記載されているように、疑似電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。リポソームの平均直径は、形成したリポソームを超音波処理することによって小さくすることができる。間欠的な超音波処理サイクルは、効率的なリポソーム合成へと導くために、ＱＥＬＳアセスメントで変えることができる。
小孔ポリカーボネート膜または非対称的セラミック膜でリポソームを押出することもまた、リポソームのサイズを比較的よく決められたサイズ分布まで減少させるのに効果的な方法である。典型的には、懸濁液を、所望のサイズ分布のリポソームが得られるまで、膜を１回以上通過させるサイクルを行なう。リポソームは次々と、より小さい孔の膜を通って押出され、リポソームのサイズは次第に小さくなる。本発明での使用のためには、リポソームは約０．０５ミクロン〜約０．５ミクロンのサイズをもっており、約０．０５〜０．２ミクロンのサイズのリポソームがさらに好ましい。
ＩＩＩ．脂質-核酸複合体の生成
安定化脂質−核酸複合体（例えば縮合核酸および／親水性ポリマーを有する）は、目に見える大きな凝集物を生成しない傾向にあり且つ増大したトランスフェクション効率及び保存性を有する、というのが本発明における発見である。目に見えるような大きな凝集物を生成しない脂質−核酸複合体を調製するための核酸／リポソームの比率は、当業者によって決めることができる。典型的にはその比率は、一定量の核酸、例えばプラスミドを種々の量のリポソームと混合して決定する（実施例１を参照のこと）。一般に、脂質-核酸複合体を、核酸（例えばプラスミドＤＮＡ）を等容量のリポソーム懸濁液の中へピペットで入れ、迅速に混合することにより形成する。定常的には、ＤＤＡＢまたはＤＯＰＥ（上述）のような脂質を５〜１５ｎｍｏｌ含むリポソームは、目に見えるような大きな凝集物を生じることなく、プラスミド１μgと複合体を形成する。目に見えるような大きな凝集物の検査は、典型的には顕微鏡を使わずに行われる。脂質と核酸の量の滴定の終末点はまた、(以下に述べるような)非安定化コントロールと比較して、インビトロおよびインビボでのトランスフェクション効率の増大をアッセイすることにより達成される。
脂質−核酸複合体が大きな凝集物を形成せずかつ時間と共にトランスフェクション活性を喪失しないために、２つのアプローチがとられる。すなわち、（１）ＰＥＧ-ＰＥのような親水性ポリマーを少量（約１％モル比）、脂質-核酸複合体の生成後数分間以内に該複合体に取り込ませること、及び／又は（２）リポソームとの混合前に、ポリアミン（たとえばＤＮＡ１μｇあたりスペルミジン約０．０５〜５．０ｎｍｏｌｅ）のようなポリカチオンで核酸を縮合させること、である。ポリアミンと親水性ポリマーの最適量は、生成した複合体が大きな、例えば目に見えるような凝集物を生じないように、ポリアミンまたは親水性ポリマーを核酸で滴定することにより当業者が決めることができる。これら脂質−核酸複合体のサイズは、動的光散乱により４１０±１５０ｎｍの範囲内にあると推定できる。この滴定の終末点はまた、(以下に述べる)非安定化コントロールと比較して、インビトロまたはインビボでのトランスフェクション効率の増大をアッセイすることにより達成される。
ＩＶ．脂質-核酸複合体でのトランスフェクションおよび遺伝子治療
本発明は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でのホ乳動物細胞の形質転換のための、増大した保存性を有する脂質−核酸複合体、ならびにこのような複合体を精製およびトランスフェクションする方法を提供する。特に、本発明は、有機ポリカチオンとの接触によって縮合した核酸を有する脂質−核酸複合体が、増大した保存性を示すという予想外の発見に、一部よるものである。さらに、本発明は、脂質−核酸複合体の形成後、親水性ポリマーとともに混合した脂質−核酸複合体が、貯蔵後のトランスフェクション活性によって測定されるように、高い形質転換活性および増大した保存性を示すという予想外の発見による。増大した保存性を有するこのような脂質-核酸複合体は、例えば、インビトロおよびエクスビボで細胞をトランスフェクションするために、ならびに後のインビボでのホ乳動物の遺伝子治療について、細胞に核酸を送達するのに有用である。
異なるホ乳動物細胞型へ核酸を送達するのに脂質−核酸複合体を用いることは、安全な移入方法、および遺伝子移入の高い効率を生じる。インビボでの脂質-核酸複合体での細胞のトランスフェクションは、当業者に公知であり、実施例１に考察されるような標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５））を用いて行うことができる。
宿主細胞への導入に適切である任意の異種核酸が、当業者によって、本発明において使用することができる。遺伝子治療に有用な遺伝子は、本発明の方法およびベクターを用いてホ乳動物に導入することができる。血液タンパク質、酵素、ホルモン、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ウイルスインヒビター、およびイオンチャンネルタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子治療において有用な異種核酸の例である。機能的な異種核酸を用いて、遺伝子治療を用いるホ乳動物における変異された遺伝子を置換することができる。例えば、β−グロビンをコードする遺伝子を用いてβ−サラセミアを処置することができ、ＣＦＴＲをコードする遺伝子を用いて嚢胞性線維症を処置することができる。選択マーカーをコードする遺伝子、例えば抗生物質耐性を付与する遺伝子を用いて、脂質-核酸複合体でトランスフェクトされた細胞を検出および単離することができる。ルシフェラーゼ、β−がラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなレポーター遺伝子は、トランスフェクション効率を測定するためのアッセイに用いることができる遺伝子の好ましい例である。本発明のある態様において、トランスフェクション効率を測定するためのレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いることができる。
レポーター遺伝子のトランスフェクション効率は、使用するレポーター遺伝子について適切であるアッセイを用いて、測定することができる。このようなアッセイは、当業者に公知である。例えば、ＨＧＨレポーターアッセイは、免疫学に基づき、および市販の放射性イムノアッセイキットを用いる。本発明の好ましい態様において、ルシフェラーゼアッセイを用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のトランスフェクションおよび発現を検出する。ルシフェラーゼアッセイは、非常に感度が高く、そして放射能を使用しないので、好ましい。実施例１に記載されるように、蛍光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて、ルシフェラーゼ酵素活性を測定することができる。
遺伝子治療は、ＨＩＶ感染のような慢性の感染性疾患、ならびにガンおよび出生時欠損のような非感染性疾患と戦うための方法を提供する（一般にＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｙｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１３−２６（１９９４）を参照のこと）。遺伝子治療を用いて、エクスビボ手順またはインビボ手順のいずれかで細胞を形質導入することができる。遺伝子治療のためのエクスビボ方法は、ホ乳動物の外部で、細胞を本発明の脂質−核酸複合体で形質導入する工程、およびこの細胞を生物に導入して戻す工程を包含する。細胞は、骨髄から単離される造血幹細胞、または脂質−核酸複合体によってトランスフェクトされ得る他の細胞とすることができる。
ヒトにおいて、造血幹細胞は、臍帯血、骨髄、および不死化された抹消血を含む多様な供給源から得ることができる。ＣＤ３４細胞の精製は、抗体アフィニティー手順によって達成することができる（Ｈｏら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １３（増刊３）：１００−１０５（１９９５）を参照のこと；Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ２：７−１７（１９９３）もまた参照のこと）。細胞はまた、忠者から単離、培養することができる。あるいは、エクスビボ手順に用いる細胞は、細胞バンク（例えば、血液バンク）において保存される細胞とすることができる。幹細胞を使用する利点は、この細胞がインビトロで他の細胞型に分化し得ること、または、骨髄においてこの細胞が植え付けられるホ乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入され得ること、である。インビトロで、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−α）を用いて、臨床的に重要な免疫細胞型に骨髄を分化するための方法は、公知である（例えば、Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照のこと）。
核酸の送達はまた、インビボ遺伝子治療を用いて達成することができる。本発明の脂質−核酸複合体を、患者、好ましくはヒトに直接投与することができる。インビボおよびエクスビボの投与は、分子または細胞を、血液または組識の細胞に最終的に接触させるように導入するために通常使用される任意の経路による。本発明の脂質−核酸複合体を、任意の適切な様式において、好ましくは医薬上許容可能なキャリアとともに投与する。
本発明の情況におけるこのような非ウイルス性粒子を患者へ投与する適切な方法は、当業者に公知である。医薬組成物は、エアゾール投与を用いて（例えば、ネブライザーまたは他のエアゾール化装置を用いて）、および非経口的に（即ち関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内）で投与されるのが好ましい。より好ましくは、医薬組成物は、エアゾール投与を介して、またはボーラス注入によって静脈内にもしくは腹腔内に投与される。この使用について適切である特定の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版、１９８５）に見いだされる。典型的には、製剤は、許容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア中に懸濁された脂質−核酸複合体の溶液を含有する。
Ｖ．薬学的組成物
本発明の脂質−核酸複合体を含有する医薬組成物は、標準的な技術に従って調製され、そして医薬上許容可能なキャリアをさらに含有する。一般に、通常の生理食塩氷が、医薬上許容可能なキャリアとして用いられる。他の適切なキャリアとして、例えば水、緩衝化水、等張液（例えば、デキストロース）、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが挙げられ、増大した安定性のために糖タンパク質、例えばアルブミン、リポタンパク質及びグロブリンなどが含まれる。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌することができる。得られた水溶液は、使用のためにパッケージングされるか、または無菌条件下で濾過し且つ凍結乾燥し、この凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌水溶液とともに合わせることができる。生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬上許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、緊張調節剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含めることができる。さらに、脂質-核酸複合体懸濁液は、貯蔵の際の遊離ラジカルおよび脂質過酸化損傷に対して、脂質を保護する脂質保護剤を含めることができる。脂肪親和性の遊離ラジカルなクエンチ化剤（例えば、αトコフェノール）および水溶性のイオン特異的キレート化剤（例えば、フェリオキサミン）が適切である。
医薬製剤における脂質−核酸複合体の濃度は、広範囲に、即ち約０．０５重量％未満から、通常約２〜５重量％で、少なくとも約２〜５重量％で、多くとも１０〜３０重量％まで変化させることができ、選択される投与の特定の態様に従って、液体容量、粘度などによって主に選択される。例えば、濃度は、処置に関連する液体負荷を低減するために増加することができる。このことは、アテローム性動脈硬化症関連の欝血心不全または重篤な高血圧を有する患者において特に望ましい。あるいは、刺激化脂質で構成される免疫脂質−核酸複合体は、投与の部位での炎症を減じるために、低濃度に希釈することができる。投与される脂質−核酸複合体の量は、使用される特定のＦａｂ'、処置すべき疾患状態、および臨床医の判断に依存する。一般に、投与される脂質-核酸複合体の量は、核酸の治療上有効用量を送達するのに十分である。治療上有効用量を送達するために必要な脂質-核酸複合体の量は、当業者によって決定することができる。典型的な脂質−核酸複合体の投薬量は、一般に、体重１ｋｇ当たり核酸約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ、好ましくは核酸約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは核酸約２．０ｍｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇ体重である。マウスへの投与について、用量は典型的に、２０ｇマウス当たり５０〜１００μｇである。
ＶＩ．血液半減期のアッセイ
標的組識における脂質−核酸複合体の局在化のための１つの補助は、投与後の血流における、延長された脂質−核酸複合体の寿命である。脂質-核酸複合体の寿命の測定の１つとして、複合体投与後の選択された時間での、血液／ＲＥＳ比がある。典型的には、複合体の内部に、または複合体を含む脂質に結合してのいずれかで、標識（例えば、蛍光マーカー、電子密集試薬、または放射能マーカー）を含む脂質-核酸複合体を試験生物に注入する。一定期間後、生物を屠殺し、（例えば、ルミネセンスを測定することによって、またはシンチレーションをカウントすることによって）血中で検出される標識の量を、特定の組識（例えば、肝臓または脾臓）において局在化される量と比較する。
血液中の脂質−核酸複合体の保持の時間過程はまた、標識含有脂質−核酸複合体の投与後に一定間隔で血液をサンプリングし、循環に残存する標識の量を測定することによって、簡便に測定することができる。結果は、元の投与量の割合として表すことができる。
ＶＩＩ．脂質−核酸複合体による組識トランスフェクションのアッセイ
本発明の脂質−核酸複合体による標的細胞のトランスフェクションは、それ自身検出可能であるかまたは検出可能な産物をコードする核酸を含む脂質−核酸複合体を投与することによって、同様に測定することができる。次いで、生物学的サンプル（例えば、組識バイオプシーまたは液体サンプル）を回収し、トランスフェクトされた核酸自身の存在を検出するか、または核酸の発現された産物の存在を検出することによって、トランスフェクションについてアッセイする。
核酸自身は、例えば核酸増幅によって、容易に検出される配列を有するように選択することができる。この例において、問題の核酸の単独の増幅を許容し、トランスフェクションについてアッセイされるべき生物学的組識のサンプルにおける他のいかなる核酸の増幅をも許容しないように選択されるプライマー部位を有する核酸が選択される。
特定のＤＮＡ配列を検出するための方法は、当業者に周知である。例えば、領域を有する選択配列に相補的であるように選択されるオリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。あるいは、配列又はサブ配列は、多様なＤＮＡ増幅技術によって増幅することができる。ＤＮＡ増幅技術として、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)（Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｌｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ （１９９０））、ライゲース連鎖反応(ＬＣＲ)（Ｗｕ ＆ Ｗａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７（１９８８）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０）を参照のこと)、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３（１９８９））、および自己確認配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
特に好ましい態様において、トランスフェクションは、１つ以上の組識における遺伝子産物の存在もしくは不在を検出するか、またはこれを定量することによって評価される。容易にアッセイ可能な産物を発現する任意の遺伝子は、本アッセイについての適切な指標を提供する。適切なレポーター遺伝子は、当業者に周知である。これらには、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼ（例えば、Ａｌａｍら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８８：２４５−２５４（１９９０）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。１つの特に好ましいレポーター遺伝子は、実施例において説明されるようなＦｆｌｕｘ遺伝子である。
ＶＩＩＩ．保存性のアッセイ
上述のように、本明細書中で使用される用語「保存性」は、その生物学的活性が失われるまで、脂質−核酸複合体が（規定された条件下で、例えば緩衝液中４℃で）保存することができる期間をいう。本発明において保存性の測定のためにアッセイした生物学的活性は、静脈内投与後にインビボで、脂質-核酸複合体がホ乳動物細胞をトランスフェクトする能力である。
好ましい態様において、保存性は、上記のようにまたは実施例において説明されるように、種々の期間、脂質−核酸複合体を保存し、１つ以上の試験動物にこの複合体を注入し、トランスフェクション（例えば、レポーター遺伝子の発現）について動物において選択された組識をアッセイすることによって、測定する。
保存性は、絶対項、即ち組成物がその活性が失われるまでに保存することができる時間の長さで表すことができることを理解されよう。あるいは、保存性は、異なる組成物に関して相対的な語句として表現することができる。従って、例えば、問題の複合体が、貯蔵の一定期間後にトランスフェクション活性を示し、この活性が、同じ量の時間、同様に保存された異なる複合体の活性よりも大きい場合、問題の複合体は、異なる複合体に比べて、増大した保存性を有すると言われる。
ＩＸ．特定の組識への脂質−核酸複合体の標的化
特異的な標的化部を、特定の細胞または組識を標的するために、本発明の脂質−核酸複合体とともに使用することができる。ある態様として、標的化部（例えば、抗体または抗体フラグメント）を親水性ポリマーに付着し、複合体の形成後に脂質−核酸複合体と組合せる。従って、脂質−核酸複合体における一般的なエフェクターと組合わせて標的化部を使用することは、特定の細胞および組識への送達のために、複合体を簡便にあつらえる能力を提供する。
脂質−核酸複合体におけるエフェクターの例としては、サイトトキシン類(例えば、ジフテリアトキシン（ＤＴ）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエクソトキシンＡ（ＰＥ））、および百日咳トキシン（ＰＴ）、および百日咳アデニレートサイクラーゼ(ＣＹＡ))をコードする核酸、アンチセンス核酸、リポザイム、標識化核酸、及び腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ｐ１１０ＲＢ、およびｐ７２）をコードする核酸が挙げられる。これらのエフェクターは、ガン細胞、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）、及び標的化部を有する他の所望の細胞標的のような細胞に特異的に標的化することができる。例えば、上記のように、多くのガンが、ＨＥＲ２（これは、乳ガン細胞において発現される）、またはＩＬ１７Ｒ（これは、神経膠腫において発現される）のような細胞表現マーカーの過剰発現によって特徴づけられる。抗−ＨＥＲ２および抗−ＩＬ１７Ｒ抗体または抗体フラグメントのような標的化部を用いて、選択された細胞に脂質-核酸複合体を送達する。従って、エフェクターＢ分子は、特定の細胞型に送達され、有用なおよび特定の治療処置を提供する。
Ｘ．脂質-核酸複合体キット
本発明はまた、上記の脂質-核酸複合体を調製するためのキットを提供する。このようなキットは、上記のように、容易に利用可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、以下の材料のうちの任意の１つ以上を含有することができる。即ち、リポソーム、核酸（縮合または未縮合）、親水性ポリマー、Ｆａｂ'フラグメントのような標的化部で誘導体化した親水性ポリマー、および説明書である。広範に多様なキットおよび成分は、意図されるキットの使用者、および使用者の特定の要求に依存して、本発明に従って調製することができる。例えば、キットは、上記のように、特定の細胞型に複合体を標的化するための多くの標的化部のうちの任意の１つを含む。
キットは、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞をトランスフェクトするためのカチオン性脂質−核酸複合体の使用を提供する指示（すなわち、プロトコル）を含む指示的な材料を任意に含んでもよい。典型的には、指示材料は、上記のように、リポソームおよび核酸から脂質−核酸複合体を調製するための手順を記載する。指示材料はまた、親水性ポリマーを脂質−核酸複合体とどのように混合するのかを記載する。さらに、指示材料は、細胞を脂質−核酸複合体でトランスフェクトするための手順を記載する。
指示材料は典型的に、書かれたまたは印刷された材料を含むが、このようなものに限定されない。このような指示を保存し、および最終使用者に指示を伝達することができる任意の媒体が、本発明によって意図される。このような媒体として、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。このような媒体として、このような指示的な材料を提供するインターネットサイトに対するアドレスを挙げることもできる。
実施例 本発明を、以下の実施例で例示する。これらの実施例は、例示するために提供するものであって、本発明を限定するものではない。
実施例１：インビボ遺伝子送達のための安定な脂質-プラスミドＤＮＡ複合体の調製
Ａ．材料及び方法
１．脂質及びその他の試薬
ＤＯＰＥは、アバンティ（Ａｖａｎｔｉ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ））から購入した。高純度コレステロールをカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））から得た。ＤＤＡＢ及びデキストラン（Ｍ．Ｗ．４０，０００）をシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から購入した。ＤＤＡＢをアセトン−メタノール溶液で一度再結晶した。Ｄ−ルシフェリンをベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から得た。ＰＥＧ−ＰＥは、セキュース・ファーマシューティカルズ（Ｓｅｑｕｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ））からの贈呈物であった。ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＭＭＣＥ及びＤＯＧＳは、遺伝子治療センターのＵＣＳＦジーン・トランファー・ビヒクル・コア（ＵＣＳＦ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｃｏｒｅ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ）から得た。ＥＳＰＭ、ＤＯＴＡＰ、ＰＯＥＰＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ及びＤＯＤＡＰは、アバンティ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）からの贈呈物であった。各脂質のクロロホルム溶液を、−４０℃で密封したアンプル内で、アルゴン下、貯蔵した。可能な限り高純度のその他の試薬を購入し、さらに精製しないで用いた。
２．リポソームの調製
小さなカチオン性リポソームを、以下のように、５％（ｗ／ｖ）でキストロース内で調製した。ＤＤＡＢ又はその他のカチオン性試薬のクロロホルム溶液を、所望のモル比で、ＤＯＰＥ又は／及びコレステロールと混合し、溶媒を、ロータリーエバポレーターで５０℃、減圧下でゆっくりと除去した。乾燥脂質膜を５０℃に予熱しておいた５％デキストロース溶液で水和させて、容器をアルゴン下で密封した。水和脂質懸濁液を、５０℃で５〜１０分間、超音波処理器（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ （Ｌａｂ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｙ．））で超音波処理した。リポソームの最終濃度は、５ｍＭカチオン性脂質であり、リポソームの大きさを動的光散乱で測定し、１９５±６５ｎｍであった。超音波処理したリポソームを、使用するまで、４℃、アルゴン下で貯蔵した。
３．ルシフェラーゼ・レポーター系
プラスミド、ｐＣＭＶ／ＩＶＳ-ｌｕｃ+を以下のように構築した。ＣＭＶプロモーター及び合成ＩｇＥイントロンを含むフラグメントを、Ｓｐｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIを用いてｐＢＧｔ２．ＣＡＴから除去し、ｐＢＳＩＩＫＳ+にクローンした。ＳＶ４０後ポリ（Ａ）シグナルを含む修飾ホタル・ルシフェラーゼ（ｌｕｃ＋）をコードするｃＤＮＡを、ＨｉｎｄIII及びＳａｌ Ｉを有するｐＧＬ３−ベーシックベクター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）から切除し、スプライスのｐＢＳ-ＣＭＶ-ＩＶＳクローンの下流に置いた。キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ））により採用され且つ案出されたアルカリ性溶解手順を用いてプラスミドを精製した。プラスミド純度を、２６０ｎｍ対２８０ｎｍでの吸光度の比率により測定し、１０ｍＭトリス−Ｃｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で、濃度1〜２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．０で貯蔵した。
４．トランスフェクション複合体の調製
トランスフェクション実験の前に、固定量のプラスミドを種々の量のリポソームに混合することにより、大きな凝集体ではない複合体を形成するＤＮＡ／リポソームの最適比率を決定した。一般に、プラスミドを同体積のリポソーム懸濁液にピペットして迅速に混合することにより、トランスフェクション複合体を形成した。日常的には、ＤＤＡＢを８〜１２ｎｍｏｌ含むリポソームは、目に見える大きな凝集体を形成させずに、プラスミド１μｇと複合体化することができる。そのような複合体は、過剰な正電荷を有するが、４℃での貯蔵の間、時間と共に凝集しがちであり、４日間でトランスフェクション活性を失いがちである。大いに希釈した複合体を要する、インビトロ実験では、ＤＮＡ１μｇにつきＤＤＡＢ５ｎｍｏｌのカチオン性脂質−プラスミドＤＮＡ複合体（『ＣＬＤＣ』）を用いた。脂質−プラスミドＤＮＡ複合体が大きな凝集体を形成しないように且つ時間と共にトランスフェクション活性を失わないように、２つのアプローチを採用した。（１）その調製後、数分間で、少量のＰＥＧ−ＰＥ（約１％モル比）を脂質−プラスミドＤＮＡ複合体に組み込むか；及び／又は（２）リポソームと混合する前に、プラスミドをポリアミン（例えば、ＤＮＡ 1μｇ当たリスペルミジン０．０５〜５．０ｎｍｏｌ）で縮合させる。大きな凝集体を形成するまでポリアミン：ＤＮＡを定量することにより、ポリアミンの最適量を決定した。これらの複合体の大きさは、動的光散乱で概算して、４１０±１５０ｎｍの範囲であった。
５．レポーター遺伝子発現のアッセイ
精製ルシフェラーゼを、蛍光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を較正し且つルシフェラーゼの相対的特異的な活性のためのコントロール標準を構築する標準としてベーリンガー・マンハイムから購入した。組織抽出物内のレポーター遺伝子発現は、蛍光度計で測定した相対的光単位を標準曲線にしたがって重さ単位に変換することによって、ナノグラム単位の量で提供した。細胞又は組織内に発現したルシフェラーゼを、化学的細胞溶解物で抽出した。有効な溶解物緩衝液は、ｐＨ７．８での０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＤＴＴ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。
雌ＣＤ１マウス（４〜６週齢、体重約２５ｇ）を、チャールズ・リバー実験室（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から得た。マウスは、尾血液注射により脂質−プラスミドＤＮＡ複合体を受け、２４時間後、犠牲にした。麻酔をかけた動物を心臓穿刺を介して冷リン酸−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で灌流した。各組織を解剖して、ＰＢＳで洗浄し、その後、溶解液緩衝液５００μｌ含む６ｍｌ丸底培養管内で均質化した。サンプルを、時折混合して、室温で２０分間、放置した。均質化サンプルを、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｎｄｏｒｆ）遠心分離器で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。再構築ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｓｉｓｏｎ、ＷＩ）１００μｌを蛍光度計の注入系内の組織均質物の上澄み液２０μｌと混合して、各組織のルシフェラーゼ活性を測定した。ピークの発光を、２０℃で１０秒間測定した。各サンプルの相対的光単位を、実験の各セットで確立した標準曲線と比較することにより、組織抽出物内のルシフェラーゼ量に換算した。抽出物のタンパク質含量を、タンパク質アッセイキット（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ））を用いて測定した。バックグランドは、溶解緩衝液のみの計数であった。
ＳＫ−ＢＲ−３細胞（パク（Ｐａｒｋ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１３２７−１３３１（１９９５））を、１０％熱不活性化子ウシ血清を補充したマッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地及び５％ＣＯ2において培養した。単層培地のＳＫ−ＢＲ−３細胞を１２個のウェルプレートのウェル当たり５０，０００個の細胞を播種し、一晩インキュベートした。各ウェルは、複合体形成の２０分間以内で、ｐＣＭＶ／ＩＶＳ−ｌｕｃ+を０．５〜１μｇ受けた。３７℃での複合体とのインキュベーションを２４時間した後、細胞を収穫した。細胞のルシフェラーゼ活性を、上述のように測定した。
Ｂ．結果
１．"ヘルパー"脂質の最適化
インビトロ遺伝子移送のためにカチオン性リポソームを用いることは、フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）らがその研究（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−１７（１９８７））を発表してから広く行われている。ＤＯＰＥがインビトロ遺伝子トランスフェクションに対してはるかに有効な"ヘルパー"脂質であることが後に確立され（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０−２５６１（１９９４））、この結果はいくつかの実験室で確認されている（ファーフッド（Ｆａｒｈｏｏｄ）ら、Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ｐｐ ２３−５５（Ｈｕｂｅｒ ＆ Ｌａｚｏｅｄｓ．、１９９４）；ツゥオ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９：１９５−２０３（１９９４））．インビトロ研究を基に、正荷電した脂質-プラスミドＤＮＡ複合体が細胞膜に一旦結合すると、ＤＯＰＥが膜融合を介して細胞質送達を促進することが示唆されている（ツゥオら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９：１９５−２０３（１９９４））。フレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）らは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ脂質−プラスミドＤＮＡ複合体が原形質膜と直接融合するという形態学的な証拠を得ていなかったが、彼らは融合という事態の可能性を排除しなかった（フレンドら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７８：４１−５０（１９９６））。彼らは、この複合体がエンドサイトーシスされ、カチオン性脂質がエンドソーム／リソゾーム膜を分断し、その後、ＤＮＡ複合体が細胞質へ、結局は核へ逃避するのを促進することを示唆した。
たいていの予想に反して、インビトロ研究から確立されたＤＯＰＥの"ヘルパー"としての役割は、その複合体を静脈注射した後インビボ遺伝子送達することに対しては、明白ではない。ＤＯＰＥをＤＤＡＢカチオン性脂質に含めたとき、インビボ遺伝子トランスフェクションは阻害された。このＤＯＰＥ依存性阻害を図１に示す。ＤＯＰＥではなく、コレステロールが、インビボ遺伝子送達のための"ヘルパー"脂質として有効であることがわかった。コレステロールの半分をＤＯＰＥで置換したとき、マウスの肺でのルシフェラーゼ発現が１０倍減少した。ＤＤＡＢ及びその他のカチオン性リポソームのインビボ結果は、ＤＯＰＥが好適なヘルパー"脂質であるという一般的な仮定と一致しなかった。一方、カチオン性脂質-プラスミドＤＮＡ複合体内のＤＯＰＥは、ＤＯＰＥがインビボ遺伝子送達に対する配合物中で阻害剤としてみなされるというような非常に大きな程度で、インビボ・トランスフェクションを減衰させる。コレステロールが、最近発表された報告（リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８６４−７０（１９９５）；ソロジン（Ｓｏｌｏｄｉｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１３５３７−４４（１９９５））の中で、インビボ研究に対して、選択されている。その中で、著者らは、実験デザインに対して、彼らが異なる"ヘルパー"脂質を、即ちインビトロに対してはＤＯＰＥ、インビボに対してはコレステロールをどのようにして、またなぜ選んだのかを詳しく述べていない。コレステロールによって、血中のアニオン性及び中性リポソームが安定化することは、長い間知られている（メイヒュ（Ｍａｙｈｅｗ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６３：１９２３−１９２８（１９７９））。よって、全身遺伝子送達に対して、血中の脂質−プラスミドＤＮＡ複合体、巨大分子である複合体と反応すると思われる種々の成分の安定性を考慮しなければならないのは明白である。実際、凍結割断電子顕微鏡を用いた脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の種々の配合物の予備研究から、コレステロール含有複合体が血清存在下でＤＯＰＥ含有複合体より構造的に安定であったということが分かっている。
インビボ・トランスフェクション実験について、ＤＤＡＢ／コレステロール脂質-プラスミドＤＮＡ複合体（ＤＤＡＢ８ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇ）を用いて、マウス２５ｇの肺に検出可能なルシフェラーゼ発現を得るには、ＤＮＡ投与が３０μｇ〜６０μｇの範囲で必要であった。マウス当たリプラスミドＤＮＡ４０〜６０μｇを日常的に与えると、矛盾のない遺伝子発現を生じた。ＤＮＡ８０μｇ（又はそれ以上）を通常伴うＤＤＡＢの量は、動物にとってあまりに毒性が強いことがわかった。種々の組織でのルシフェラーゼ発現を図２に示す。以前に観察された（ツゥオら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３）；リウら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４８６４−７０（１９９５）；ソロジンら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１３５３７−４４（１９９５））ように、最大発現が肺の組織で観察された。ブラスミドを６０μｇ注射すると、組織タンパク質１ｍｇ当たりルシフェラーゼ１〜２ｎｇが日常的に得られた。図３は、肺組織でのレポーター遺伝子発現の持続時間を示す。ルシフェラーゼの発現はすぐに減少し、２週で検出不能なレベルになった。ツゥオらは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（１：１）−プラスミド複合体を成体マウスに静脈注射した後、レポーター遺伝子（ＣＡＴ）の発現が種々の組織間に広がり、最大の発現はプラスミド１１μｇ：全脂質８ｎｍｏｌの比率を有する複合体からであると報告した（ツゥオら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３））。しかしながら、この比率（プラスミド１μｇ：カチオン性脂質４ｎｍｏｌに相当する）で、ＤＤＡＢ／コレステロール 脂質−プラスミドＤＮＡ複合体は凝集しがちであり、この調査では測定可能な遺伝子発現はもたらされなかった。
違う研究室では異なるレポーター遺伝子が用いられているので、リポソームの配合物に変化を与えたことに対する、インビボ遺伝子送達の効率における変化を特定することは困難であった。文献の結果を直接比較すると、蛍光度計で測定したルシフェラーゼ活性の相対光単位を、精製ルシフェラーゼの標準に変換した。そうすることによって、ＤＤＡＢ／コレステロール配合物のトランスフェクション活性のピークは、比較可能な実験で最近報告された値よりも３のオーダーでより高かった（シエリー（Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４２−９７４６（１９９５））。実験デザインにおいて、同じプロモーターに伴って同じレポーター遺伝子であると、発現の違いは、リポソーム配合の選択に影響を受けるようである。実際、ＤＤＡＢ／コレステロールは、最近スクリーニングされた１８種の異なるカチオン性脂質からの多くの配合物中、最も有効な遺伝子送達ビヒクルの一つであった。静脈注射後のマウスの肺での発現の予備結果から、ＤＯＴＭＡ／コレステロール、ＤＯＴＡＰ／コレステロール、ＭＭＣＥ／コレステロール及びＥＳＰＭ／コレステロールは、ＤＤＡＢ／コレステロールのトランスフェクション活性の１０〜１００％であり、ＤＯＧＳ／コレステロール、ＰＯＥＰＣ／コレステロール、ＬＹＳＰＥ／ＤＯＰＥ及びＤＣ-コレステロール／ＤＯＰＥは、ＤＤＡＢ／コレステロールの１〜１０％であることがわかった。ＤＯＥＰＣ／コレステロール、ＤＭＥＰＣ／コレステロール、ＤＯＤＡＰ／コレステロール及びＤＤＡＢ／ＤＯＰＥは、測定可能な活性を示さなかった。
トランスフェクション研究と平行して、血清中及び細胞媒体中でのこれらの複合体の形態を、凍結割断電子顕微鏡で調べた。５０％マウス血清中で調べる（インキュベーション時間１０分）と、非安定化、１日後のＣＬＤＣは、イオン強度が低い緩衝液中にいるのと同じほど小さく（１００〜２５０ｎｍ）、突起物はほとんど示さない。５０％マウス血清中でインキュベートした、６日後の、非安定化ＣＬＤＣは、結合した粒子がたくさんある、球状粒子の稠密充填凝集体のように見えた。そのような配合物は、４日間以内にインビボ・トランスフェクション活性をすべて失った。残留原繊維状突起物は観察されない。
５０％マウス血清中でインキュベートした、ＰＥＧ−ＰＥ安定化ＣＬＤＣは、６日後でも小さかった（１００〜２００ｎｍ）。同様に、縮合したＤＮＡで調製したＣＬＤＣも、貯蔵後６日後であってもきわめて小さかった。特に、ＣＬＤＣは、血清存在下で構造的に安定な"地図ピン（ｍａｐ ｐｉｎｓ）"のような形状であった。
細胞培地（１０％ＦＣＳを有するＲＰＭＩ−１６４０）でインキュベーション後、非安定化、６日齢ＣＬＤＣは、上述のように、マウス血清中でインキュベートしたものと形態上類似していた。しかしながら、これらの複合体は、もっと緩く充填されており、原繊維状突起物を示さなかった。類似の形態がＰＥＧ−ＰＥ安定化ＣＬＤＣ及び細胞培地でインキュベートした縮合ＤＮＡ ＣＬＤＣで観察された。
２．トランスフェクション活性について保存性を増大させる
脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の構造上の安定性とトランスフェクション活性との関連性は、これまで公表された報告書には詳しく記載されていなかった。スクリーニング手順が確立されて、ＤＮＡ：脂質の比率を全体的に負荷電から正荷電にする比率に変えることにより、脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の大きな凝集体を避けている。ＤＮＡ／脂質を種々の比率とした特別のカチオン性脂質の各々からなる脂質−プラスミドＤＮＡを調製し、得られた安定且つ準安定な配合物をインビボ・トランスフェクションに用いた。ＤＮＡ１μｇ当たリカチオン性脂質８〜１２ｎｍｏｌを含んだ複合体は、最も高いインビボ・トランスフェクション活性を有することがわかった。しかしながら、これらの複合体のトランスフェクション活性は、時間と共に減少した。脂質−プラスミドＤＮＡ複合体を形成する手順を変更しない場合、２〜３日以内に目に見える凝集があり、トランスフェクション活性は、１０００倍より多く減少し、１ヶ月間４℃で貯蔵後、ほとんどバックグランドのレベルにまでとなった。よって、安定化脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の配合物を保証した。これは、貯蔵の間、高いインビボ・トランスフェクション活性を維持できた。
ｉ．トランスフェクション安定性の増大：ＰＥＧ-ＰＥ
形成したばかりの脂質−プラスミドＤＮＡ複合体にＰＥＧ-ＰＥ（全脂質の１％）を挿入することは、その複合体が貯蔵の間に凝集するのを予防するばかりでなく、ＰＥＧ−ＰＥなしの複合体と比較してほんの少し活性ば低いが、ＰＥＧ−ＰＥ含有複合体はインビボで合理的な高いトランスフェクション活性を示すことができる（図４）。ＰＥＧ−ＰＥが複合体に組込まれていることは、ＰＥＧ−ＰＥのパーセントを増大させるとトランスフェクション活性の投与関連阻害を参照することにより、明白である（結果は示さず）。予想外にも、ＰＥＧ−ＰＥを含む複合体を４℃で貯蔵すると、図４に示されるように、元の活性がゆっくりと復帰する。ＰＥＧ−ＰＥによるトランスフェクションの阻害効果の機構の面、並びに低温での貯蔵後に活性が回復することは、現時点では知られていない。
ｉｉ．トランスフェクション安定性の増大：ポリアミン
脂質−核酸複合体の保存性を増大させるＰＥＧ−ＰＥの役割に加えて、ポリアミンで縮合する核酸も同様に、複合体の保存性に予想外の増大を示した。縮合ＤＮＡで形成された脂質-プラスミドＤＮＡ複合体は、凝集せずに、脂質：ＤＮＡが低比率で安定であった。図４は、そのような調製物のインビボ・トランスフェクション活性のレベル、及び貯蔵中のその運命を示す。また、ポリアミンで前処理しておらず、複合体が形成されたらすぐ用いたサンプルと比較すると、トランスフェクション活性の予想外の増大が、熟成ポリアミン処理した脂質−プラスミドＤＮＡ複合体に見られた。プラスミドを脂質-洗剤ミセル内の脂質と複合体化することにより安定なカチオン性脂質／ＤＮＡを得る異なるアプローチが、最近公表されている（ホフランド（Ｈｏｆｌａｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７３０５−７３０９（１９９６））。しかしながら、インビトロについて１５％血清中そのような複合体を用いて、トランスフェクション効率がほんの３０％しか維持できなかった。また、インビボの結果は報告されていなかった。
ｉｉｉ．トランスフェクション安定性の増大：凍結乾燥
最後に、凍結乾燥による脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の安定化のための条件を確立した。超音波により水中５％（ｗ／ｖ）でキストランに懸濁させたＤＤＡＢ／コレステロールからなるリポソームを、方法で上述したようにＤＮＡと１：１０の比率（ＤＤＡＢ ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ μｇ）で混合したとき、活性を失うことなく、凍結乾燥できる。脂質−プラスミドＤＮＡ複合体が形成されているデキストランの最終濃度は、８％（ｗ／ｖ）であった。凍結乾燥した調製物を、蒸留水を加えることにより再構築し、静脈注射後のマウスの肺でのトランスフェクション活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現により測定した。再構築した調製物を凍結及び解凍することは、その活性に影響を与えなかった（組織タンパク質１ｍｇ当たり通常ルシフェラーゼタンパク質１〜２ｎｇ）。
本明細書で説明したカチオン性脂質−プラスミドＤＮＡ複合体のいくつかは安定であり、４℃又は凍結乾燥で長期貯蔵後であっても、矛盾しないインビボ・トランスフェクション活性（組織タンパク質１ｍｇ当たリルシフェラーゼ０．５〜２ｎｇ）を示すことができる。"ヘルパー"脂質としてコレステロールを含む配合物は、より高いインビボ・トランスフェクション効率を生じる。ＰＥＧ−ＰＥによって複合体構造を安定化させることにより、貯蔵中の複合体活性が維持され、特定の組織を標的とする血中での循環時間を長くすることができる。脂質複合体化前にポリアミンでＤＮＡを縮合させると、インビトロ貯蔵及びインビボでの活性のレベルが高められる。インビボで高いトランスフェクション活性を示す脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の安定な調製物を産生する方法論的アプローチは、医薬上許容可能な調製物を確立する利点をもたらし、ゆえにリポソームをベースとした遺伝子治療が促進される。
実施例２：標的リガンドを有する脂質-プラスミドＤＮＡ複合体のインビトロ・トランスフェクション
Ａ．Ｆａｂフラグメントの調製
重鎖及び軽鎖についてのクローンしたｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２配列を、既述のように（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））、Ｅ．ｃｏｌｉで共に発現させた。抗体フラグメント、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２−Ｆａｂ'を、Ｅ．ｃｏｌｉ発酵ペーストから親和性クロマトグラフィーにより連鎖球菌Ｇタンパク質（カーターら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））を用いて回収し、典型的には還元したフリー・チオール（Ｆａｂ'−ＳＨ）を含む６０〜９０％でＦａｂ'を得た。
Ｂ．リポソームの調製
縮合ＤＮＡを、実施例１で上述した方法を用いて（但し、以下を変更して）、異なる３種の脂質組成物と複合体化した。第１の複合体は、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１／１）を用いて作り、上述のように、ＤＮＡのみと複合体化したカチオン性リポソームを産生した。第２の複合体は、ＰＥＧの末端位置をマレイミドで誘導化した１％ＰＥＧ−ＰＥを有するＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１／１）を用いて作り、ＤＮＡと複合体化後、立体安定化成分を加えてＣＬＤＣを産生した。第３の複合体は、マレイミド残基にフリーのチオール基をを介してＰＥＧの末端位置に結合したヒト化抗Ｈｅｒ−２抗体のＦａｂ'フラグメントで誘導化した１％ＰＥＧ-ＰＥを有するＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１／１）を用いて作った。これは、ＤＮＡとの複合体化の後に加えた立体安定化成分に結合した標的リガンドを有するＣＬＤＣを産生した。
Ｃ．トランスフェクション及び結果
実施例１で上述したように、細胞をトランスフェクションした。但し、脂質−プラスミドＤＮＡ複合体の貯蔵をしなかった。２つの細胞系を本実施例で用いた。第１の細胞系は、ＨＥＲ−２レセプターを過発現しないＭＣＦ−７であった。この細胞を１０％子ウシ血清を有するＤＭＥ Ｈ-２１及び５％ＣＯ2内で培養した。第２の細胞系は、ＨＥＲ−２レセプターを過発現するＳＫ−ＢＲ３細胞であった。これを１０％子ウシ血清を有するマッコイ５Ａ培地及び５％ＣＯ2内で培養した。双方のケースにおいて、細胞（ウェル当たり〜５×１０4個の細胞）をトランスフェクトし、上述のように脂質（ＰＣＭＶ／ＩＶＳ−ｌｕｃ＋、上述のルシフェラーゼレポーター遺伝子）で複合体化したプラスミドＤＮＡ１２μｇと共に３７℃で４時間インキュベートした。その後、上澄み液を吸引し、新鮮な培地を加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇフリー）で洗浄して収穫し、その後、上述のように、ルシフェラーゼアッセイのために溶解緩衝液に懸濁した。
図５Ａは、末端のマレイミド残基を介してＰＥＧの先端に接合した標的リガンドの存在下であっても、ＨＥＲ−２レポーターを過発現しない非標的細胞のトランスフェクションがＰＥＧ−ＰＥを添加することによって阻害されたことを示している。図５Ｂは、ＨＥＲ−２レポーターを過発現する標的細胞のトランスフェクションもＰＥＧ−ＰＥを添加することによって阻害されたが、ＨＥＲ−２レポーターを認識する標的リガンドにＰＥＧ−ＰＥが接合した場合、トランスフェクション活性が復帰し、増大したことを示している。
図５Ａと図５Ｂとを比較すると、標的イムノＣＬＤＣは、非標的細胞よりもより効率的に標的細胞をトランスフェクションする際に有効であることがわかる。抗ＨＥＲ−２−Ｆａｂ'に接合したリガンド保持安定化剤（ＰＥＧ−ＰＥ）を添加することにより、非標的細胞のトランスフェクションが阻害される（図５Ａ）が、標的細胞のトランスフェクションが増大するということから、この結果は生じる。
上記実施例は、本発明を例示するために提供したものであり、その範囲を限定するものではない。本発明のその他の変更は、当業者にとって、即座に明白であろうし、添付の請求の範囲に含まれる。本明細書に引用した刊行物、特許、特許出願は、本明細書に参考として含まれる。
関連出願の相互参照
本願は１９９６年１１月１二日出願の米国特許出願第６０／０３０，５７８号の出願日の利益を請求する。
州政府助成研究または開発
非適用
１Ａおよび図１Ｂは遺伝子送達における中性脂質の役割を説明する。３種のリポソーム製剤につき、培養細胞（ＳＫＢＲ−３、ヒト乳癌細胞）およびマウス（ＣＤｌ、メス、２０〜２５ｇ）両方への遺伝子送達を試験した。サンプルは、（１）ＤＤＡＢ/Ｃｈｏｌ(１：１)、（２）ＤＤＡＢ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（１：０．５：０．５）、（３）ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：１）、および（４）ＤＤＡＢのみ、であった。図１Ａは細胞トランスフェクションを説明する。ＳＫＢＲ−３細胞を１２ウエル・プレートに１ウエル当たり５０，０００細胞ずつ入れ、一晩インキュベートした。各ウエルは、Ｐ−ＣＭＷＩＶＳＬｕｃ＋プラスミド１μｇを入れ、ＤＤＡＢ５ｎｍｏｌｅの割合でリポソームと混合した。３７℃で複合体と２４時間インキュベート後、細胞を収穫した。提示した値は２ウエルからの平均値である。値は平均１０〜３０％の範囲内にあった。図1Bはマウスにおけるインビボ・トランスフェクションを説明する。マウスにＰ−ＣＭＶＩＶＳ−Ｌｕｃ＋プラスミド４０μｇ（ＤＮＡ１μｇ当たりＤＤＡＢ ８ｎｍｏｌの比でリポソームと複合体形成）を尾部血管注射した。値はマウス２匹の平均値である。値は平均２０〜２５％の範囲内にあった。 図２はマウス組織抽出物におけるレポーター遺伝子の発現を説明する。マウスにＰ−ＣＭＶＩＶＳ−Ｌｕｃ＋プラスミド（ＤＮＡ１μｇ当たりＤＤＡＢ８ｎｍｏｌｅの比でＤＤＡＢ/Ｃｈｏｌ（１：１）リポソームと複合体形成(スペルミジンなし)）６０μｇを（尾部血管注射により）投与した。提示した値はマウス３匹の平均値である。 図３はマウス肺におけるレポーター遺伝子発現の持続時間を説明する。各動物にＰ−ＣＭＶＩＶＳ−Ｌｕｃ＋プラスミド（ＤＮＡ１μｇ当たりＤＤＡＢ８ｎｍｏｌｅの比でＤＤＡＢ/Ｃｈｏｌ（１：１）リポソームと複合体形成）４０μgを投与した。 図４は種々の安定化複合体によるマウス肺の遺伝子送達を説明する。各マウスにＰ−ＣＭＶＩＶＳ−Ｌｕｃ＋（８ｎｍｏｌｅ ＤＤＡＢ/μgＤＮＡの比でＤＤＡＢ/Ｃｈｏｌ（１：１）リポソームと複合体形成）６０μgを投与した。提示した値はマウス３匹の平均値である。点画棒グラフ：調製直後の複合体。塗りつぶし棒グラフ：１ヶ月経過サンプル。サンプルは以下の通りである。（１）安定化剤不添加。（２）形成した複合体に対し総脂質１％の割合でＰＥＧ−ＰＥを添加。（３）複合体形成に先立ちプラスミドにスペルミジン（ＤＮＡ１μg当たり０．５ｎｍｏｌｅ）添加。 図５Ａおよび図５Ｂは細胞株の免疫脂質−ＤＮＡ複合体でのインビトロ・トランスフェクションを説明する。サンプルは以下の通りである。（１）ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：１)であって、ＤＮＡのみで複合体化したカチオン性リポソームを産生する。（２）ＰＥＧの末端位置においてマレイミドで誘導化した１％ＰＥＧ−ＰＥを有するＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（１：１）であって、ＤＮＡとの複合体形成後添加した立体安定化成分をもつリポソームを産生する。（３）マレイミド残基の遊離チオール基を介してＰＥＧの末端位置に結合したヒト化抗−Ｈｅｒ−２抗体のＦａｂ'フラグメントで誘導化した１％ＰＥＧ−ＰＥを有するＤＤＡＢ/ＤＯＰＥ（１：１）

Claims (28)

  1. 脂質−核酸複合体の保存性を増大させる方法であって、該方法が、有機ポリカチオンで核酸を縮合して縮合核酸を産生する工程、両親媒性カチオン性脂質を有する脂質と該縮合核酸とを結合させて脂質−核酸複合体を産生する工程、及び、該脂質−核酸複合体内の脂質に対する親水性ポリマーのモル比が０．１〜１０％となるように、該脂質−核酸複合体を該親水性ポリマーと混合する工程を有し、前記親水性ポリマーが、脂質分子に結合した長鎖高次水和柔軟性の中性ポリマーであり、前記親水性ポリマーが前記脂質−核酸複合体に取り込まれ、前記脂質−核酸複合体が、前記親水性ポリマーを欠いている同一の脂質−核酸複合体と比較して、増大した保存性を有する、上記方法。
  2. 親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化脂質、フォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、トゥイーンで誘導化したポリエチレングリコール、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、及びガングリオシドＧM1からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
  3. 前記核酸がＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
  4. 前記核酸がＤＮＡである請求項１記載の方法。
  5. 前記核酸を前記脂質に結合させる工程が、前記両親媒性カチオン性脂質を有するリポソームをまず形成することを有する請求項１記載の方法。
  6. 前記核酸を前記脂質に結合させる工程が、脂質１〜２０ｎｍｏｌ：核酸１μｇの範囲の比率で前記脂質と前記核酸とを結合させることを有する請求項１記載の方法。
  7. 前記方法が、前記両親媒性カチオン性脂質を有する脂質と発現カセットとを結合させて脂質−発現カセット複合体を産生する工程、及び該脂質−発現カセット複合体をフォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）と混合する工程を有し、前記脂質−発現カセット複合体が、フォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）を欠いている同一の脂質−発現カセット複合体と比較して、４℃で増大した保存性を有する、請求項１記載の方法。
  8. 前記両親媒性カチオン性脂質を有する脂質が、抗体のＦａｂ’フラグメントに結合したポリエチレングリコール修飾化脂質を有する請求項７記載の方法。
  9. 前記脂質−核酸複合体を凍結乾燥させる請求項１記載の方法。
  10. 脂質−核酸複合体の保存性を増大させる方法であって、該方法が、有機ポリカチオンで核酸を縮合して縮合核酸を産生する工程、両親媒性カチオン性脂質を有する脂質と該縮合核酸とを、脂質１〜２０ｎｍｏｌ：核酸１μｇの範囲の比率で結合させて脂質−核酸複合体を産生する工程、及び、脂質−核酸複合体を該親水性ポリマーと混合する工程を有し、前記親水性ポリマーが、脂質分子に結合した長鎖高次水和柔軟性の中性ポリマーであり、前記親水性ポリマーが前記脂質−核酸複合体に取り込まれ、前記脂質−核酸複合体が、前記親水性ポリマーを欠いている同一の脂質−核酸複合体と比較して、増大した保存性を有する、上記方法。
  11. 親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化脂質、フォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、トゥイーンで誘導化したポリエチレングリコール、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、及びガングリオシドＧM1からなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。
  12. 前記核酸がＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。
  13. 前記核酸がＤＮＡである請求項１０記載の方法。
  14. 前記核酸を前記脂質に結合させる工程が、前記両親媒性カチオン性脂質を有するリポソームをまず形成することを有する請求項１０記載の方法。
  15. 前記脂質−核酸複合体を親水性ポリマーと混合する工程において、該脂質−核酸複合体内の脂質に対する親水性ポリマーのモル比が０．１〜１０％となるように脂質−核酸複合体を親水性ポリマーと混合する請求項１０記載の方法。
  16. 前記方法が、前記両親媒性カチオン性脂質を有する脂質と発現カセットとを結合させて脂質−発現カセット複合体を産生する工程、及び該脂質−発現カセット複合体をフォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）と混合する工程を有し、前記脂質−発現カセット複合体が、フォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）を欠いている同一の脂質−発現カセット複合体と比較して、４℃で増大した保存性を有する、請求項１０記載の方法。
  17. 前記両親媒性カチオン性脂質を有する脂質が、抗体のＦａｂ’フラグメントに結合したポリエチレングリコール修飾化脂質を有する請求項１０記載の方法。
  18. 前記脂質−核酸複合体を凍結乾燥させる請求項１０記載の方法。
  19. （ｉ）両親媒性カチオン性脂質を有するリポソームを含む容器；（ｉｉ）有機ポリカチオンで縮合した核酸を含む縮合核酸を含む容器；及び（ｉｉｉ）親水性ポリマーを含む容器、を含み、
    該リポソームと該縮合核酸とを混合して脂質−核酸複合体を形成し、前記親水性ポリマーが、脂質分子に結合した長鎖高次水和柔軟性の中性ポリマーであり、該脂質−核酸複合体を該親水性ポリマーと混合して脂質−核酸複合体内の脂質に対する親水性ポリマーのモル比が０．１〜１０％となるように該親水性ポリマーを該脂質−核酸複合体に取り込ませる、
    脂質−核酸複合体を調製するためのキット。
  20. 前記親水性ポリマーが、標的部で誘導化されている請求項１９記載のキット。
  21. 前記標的部が、Ｆａｂ’フラグメントである請求項２０記載のキット。
  22. 核酸が縮合核酸である請求項１９記載のキット。
  23. 親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化脂質、フォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、トゥイーンで誘導化したポリエチレングリコール、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミンで誘導化したポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、及びガングリオシドＧM1からなる群から選ばれる請求項１９記載のキット。
  24. 前記核酸がＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれる請求項１９記載のキット。
  25. 前記核酸がＤＮＡである請求項１９記載のキット。
  26. 前記親水性ポリマーが、抗体のＦａｂ’フラグメントに結合したポリエチレングリコール修飾化脂質を有する請求項１９記載のキット。
  27. 前記脂質−核酸複合体を凍結乾燥させる請求項１９記載のキット。
  28. リポソームと縮合核酸とを混合して脂質−核酸複合体を形成し、該脂質−核酸複合体を親水性ポリマーと混合して脂質−核酸複合体内の脂質に対する親水性ポリマーのモル比が０．１〜１０％となるように該親水性ポリマーを該脂質−核酸複合体に取り込ませる手順を記載する指示材料をさらに含む請求項１９記載のキット。
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Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
CA2271325A1 (en) * 1996-11-12 1998-05-22 The Regents Of The University Of California Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery
US6210707B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
WO1998046273A2 (en) * 1997-04-17 1998-10-22 Paola Leone Delivery system for gene therapy to the brain
US6749863B1 (en) 1997-11-19 2004-06-15 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
EP1096921B1 (en) * 1998-07-20 2003-04-16 Protiva Biotherapeutics Inc. Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
JP4799736B2 (ja) 1999-02-22 2011-10-26 ジョージタウン・ユニバーシティ 全身性遺伝子送達のための抗体フラグメント標的化イムノリポソーム
US9034329B2 (en) * 1999-02-22 2015-05-19 Georgetown University Preparation of antibody or an antibody fragment-targeted immunoliposomes for systemic administration of therapeutic or diagnostic agents and uses thereof
US7780882B2 (en) 1999-02-22 2010-08-24 Georgetown University Simplified and improved method for preparing an antibody or an antibody fragment targeted immunoliposome for systemic administration of a therapeutic or diagnostic agent
CA2362485A1 (en) * 1999-03-02 2000-09-08 The Liposome Company, Inc. Encapsulation of bioactive complexes in liposomes
EP1754488A1 (en) * 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
EP1180016B1 (en) * 1999-05-24 2006-09-27 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US7067111B1 (en) * 1999-10-25 2006-06-27 Board Of Regents, University Of Texas System Ethylenedicysteine (EC)-drug conjugates, compositions and methods for tissue specific disease imaging
US7189705B2 (en) * 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
EP1286704B1 (en) 2000-06-02 2014-07-23 Board of Regents, The University of Texas System ETHYLENEDICYSTEINE (EC)-glucose analog CONJUGATES
CA2422524A1 (en) * 2000-09-25 2002-03-28 Motoyuki Yamashita Pei: dna vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
US20020146829A1 (en) * 2000-11-29 2002-10-10 Aventis Pharmaceuticals Products Inc. Neutral and anionic colloidal particles for gene delivery
AU2002307035A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-15 Georgetown University A simplified and improved method for preparing an antibody or an antibody fragment targeted immunoliposome or polyplex for systemic administration of a therapeutic or diagnostic agent
US20020197261A1 (en) * 2001-04-26 2002-12-26 Chun Li Therapeutic agent/ligand conjugate compositions, their methods of synthesis and use
US20030203865A1 (en) * 2001-04-30 2003-10-30 Pierrot Harvie Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US20050261214A1 (en) * 2001-05-15 2005-11-24 Serge Braun Complexes for transferring substances of interest into a cell
FR2829136B1 (fr) * 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
US20030049203A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Elmaleh David R. Targeted nucleic acid constructs and uses related thereto
US7261875B2 (en) * 2001-12-21 2007-08-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Dendritic poly (amino acid) carriers and methods of use
KR100466254B1 (ko) * 2002-02-25 2005-01-14 한국과학기술원 세포내 전달을 위한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 유전자 전달용 접합체, 고분자 전해질 복합 미셀 및 그의 제조방법
CA2486007C (en) 2002-05-15 2011-11-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
US20040137064A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-15 Lewis David L. Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
EP1513538A4 (en) * 2002-06-14 2007-08-22 Mirus Bio Corp Novel methods for introducing polynucleotides into cells
US20040166058A1 (en) * 2002-11-07 2004-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Ethylenedicysteine (EC)-drug conjugates, compositions and methods for tissue specific disease imaging
ATE521701T1 (de) 2003-01-22 2011-09-15 Univ Duke Verbesserte konstrukte zur expression lysosomaler polypeptide
WO2005037858A2 (en) * 2003-10-16 2005-04-28 University Of Massachusetts Template-directed assembly of receptor signaling complexes
US9050378B2 (en) * 2003-12-10 2015-06-09 Board Of Regents, The University Of Texas System N2S2 chelate-targeting ligand conjugates
US20050261221A1 (en) * 2004-03-01 2005-11-24 Li Wang Compositions and methods for enhanced delivery of compounds via transfection complexes
AU2005244262A1 (en) * 2004-04-09 2005-11-24 Biodelivery Sciences International, Inc. Nucleotide-cochleate compositions and methods of use
MX2007008065A (es) * 2004-12-30 2008-03-04 Todd M Hauser Composiciones y metodos para modular la expresion genica usando oligonucleotidos autoprotegidos.
WO2006080118A1 (ja) * 2005-01-28 2006-08-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 標的遺伝子の発現を抑制する組成物
WO2007080902A1 (ja) * 2006-01-11 2007-07-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 眼球において標的遺伝子の発現を抑制する組成物および眼球における疾患の治療剤
JP2009531438A (ja) * 2006-03-24 2009-09-03 ジェンシア コーポレイション 合成脂質ラフトおよび使用方法
US8758723B2 (en) 2006-04-19 2014-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for cellular imaging and therapy
ES2618787T5 (es) 2006-04-25 2022-10-21 Univ California Administración de factores de crecimiento para el tratamiento de trastornos del SNC
WO2007127839A2 (en) * 2006-04-26 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics
JP2009537526A (ja) 2006-05-15 2009-10-29 ジョージタウン・ユニバーシティ 治療もしくは診断剤の全身投与のための抗体もしくは抗体断片標的化免疫リポソームの製造およびその使用
US8541190B2 (en) * 2006-06-28 2013-09-24 Robert M. Weis Methods and materials for in vitro analysis and/or use of membrane-associated proteins, portions thereof or variants thereof
US20080213349A1 (en) * 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
JP5407862B2 (ja) * 2006-10-04 2014-02-05 サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィーク（セーエヌエールエス） ｓｉＲＮＡおよび脂質性４，５−二置換２−デオキシストレプタミン環アミノグリコシド誘導体を含む組成物ならびにその用途
US10925977B2 (en) 2006-10-05 2021-02-23 Ceil>Point, LLC Efficient synthesis of chelators for nuclear imaging and radiotherapy: compositions and applications
CN101678082B (zh) 2007-03-26 2013-06-19 再生医药有限公司 使用cxcl9和抗cxcl9抗体促进骨髓保护和再生的方法
KR20150108948A (ko) * 2007-07-09 2015-09-30 조지타운 유니버시티 양이온성-리포솜 매개된 핵산 전달을 이용하여 면역 반응을 생성시키는 방법
CN102065901B (zh) * 2008-06-19 2013-03-06 日本新药株式会社 药物载体
JP5592897B2 (ja) * 2008-12-26 2014-09-17 サムヤン バイオファーマシューティカルズ コーポレイション アニオン性薬物含有薬剤学的組成物及びその製造方法
WO2011123479A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Academia Sinica Quantitative measurement of nano / micro particle endocytosis with cell mass spectrometry
JP5760562B2 (ja) * 2011-03-22 2015-08-12 セイコーエプソン株式会社 読取装置および読取方法
PL2760463T3 (pl) 2011-09-20 2019-05-31 Univ North Carolina Chapel Hill Regulacja kanałów sodowych przez białka PLUNC
US9238865B2 (en) 2012-02-06 2016-01-19 Asm Ip Holding B.V. Multiple vapor sources for vapor deposition
WO2017147128A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 The University Of North Carolina At Chapel Hill Peptide inhibitors of calcium channels
US11788190B2 (en) 2019-07-05 2023-10-17 Asm Ip Holding B.V. Liquid vaporizer
JP2022540819A (ja) * 2019-07-10 2022-09-20 ユニバーシティ オブ ワシントン 非ウイルス性免疫標的化
US11946136B2 (en) 2019-09-20 2024-04-02 Asm Ip Holding B.V. Semiconductor processing device
GB202004254D0 (en) 2020-03-24 2020-05-06 Puridify Ltd Characterization of gene therapy vectors
CA3234346A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Nof Corporation Lipid nanoparticles having cell directivity

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07505639A (ja) * 1992-04-03 1995-06-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 自己構築ポリヌクレオチド送達システム
WO1996002655A1 (fr) * 1994-07-13 1996-02-01 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
WO1996022765A1 (en) * 1995-01-23 1996-08-01 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
JP2001504093A (ja) * 1996-10-11 2001-03-27 アルザ コーポレイション 融合性リポソーム組成物および方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0293465B1 (en) * 1986-11-28 1992-03-18 The Liposome Company, Inc. Phospholipid composition
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6113946A (en) * 1992-04-03 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
US5820873A (en) * 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
WO1996014864A1 (en) * 1994-11-09 1996-05-23 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
EP0874910A4 (en) * 1995-06-07 1999-04-21 Life Technologies Inc ENHANCED CATIONIC LIPID TRANSFECTION BY PEPTIDES
US5851818A (en) 1996-05-31 1998-12-22 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Condensed plasmid-liposome complex for transfection
CA2271325A1 (en) 1996-11-12 1998-05-22 The Regents Of The University Of California Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07505639A (ja) * 1992-04-03 1995-06-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 自己構築ポリヌクレオチド送達システム
WO1996002655A1 (fr) * 1994-07-13 1996-02-01 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
WO1996022765A1 (en) * 1995-01-23 1996-08-01 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
JP2001504093A (ja) * 1996-10-11 2001-03-27 アルザ コーポレイション 融合性リポソーム組成物および方法

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