JP4074658B2 - 自己構築ポリヌクレオチド送達システム - Google Patents
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Description
本発明は、オリゴヌクレオチド送達及び遺伝子治療の分野にある。特に、本発明は、自己構築(self-assembling)ポリヌクレオチド送達システムであって、これには、ポリヌクレオチドの所望のアドレス(所在地)への送達を補助し、該ポリヌクレオチドと非共役結合を介して結合される成分が含まれる。本システムの成分には、DNAマスキング(遮蔽)成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化(permeabilization)成分並びに、亜細胞(subcellular)局在性成分が含まれる。
背景技術
嚢胞性繊維症(CF)は、生命に危険な遺伝子疾患であり、塩素輸送における異常によって特徴付けられる(マクファーソン(McPherson)&ドーナー(Dorner)、1991年)。この疾患の遺伝子座は、嚢胞性繊維症膜通過コンダクタンス調節物質(CFTR)をコードする遺伝子における変異に対して追跡された。J.R.リオルダン(Riordan)ら、Science(1989)245:1066-1073;B.ケレン(Kerem)ら、Science(1989)245:1073-1080。欠陥CFTRの相補又は置換によって基本的な遺伝子の欠陥を修正することは、CFに対する究極の治療法である。遺伝子治療は、遺伝子のin vivo送達及び発現であり、欠陥遺伝子を置換するために用いることができる、急速に発達した科学である。
遺伝子治療は、既に実行可能である。T.フリードマン(Friedmann)、Science,(1989)244:1275-1281;M.ブルーストーン(Bluestone)、Biotechnol.,(1992)10:132-134。ポリヌクレオチドの送達のためのシステムとポリマーは、当該技術分野において既知である。P.L.フェルナー(Felgner)、Adv.Drug Delivery Rev.,(1990)5:163-187。アデノウィルスベクターは、in vivoでコットンラット(cotton rat)の肺へCFTRを輸送するために用いられた。M.A.ローゼンフェルド(Rosenfeld)ら、Cell,(1992)68:143-155。in vivoでの高いレベルのトランスフェクションがアデノウィルスベクターによって報告されている一方で、非ウィルス性の送達システムは多くの利点を有し、精力的に開発されるべきである。ローゼンフェルドら、前述;M.A.ローゼンフェルドら、Science,(1991)252:431-434。
過去10年の間に、in vitroにおける哺乳類細胞へ機能性遺伝子を導入するために、多くの方法が開発されてきた。これらの技術は、標的細胞を体内から摘出し処理して、トランスフェクトされた細胞を増幅し、その後、当該患者に戻すことができるならば、遺伝子治療に適用される。この選択は、CF患者には不可能である。現在、最高のin vivoトランスフェクション効率は、レトロウィルス(ブルーストーン、前述)及びアデノウィルス(ローゼンフェルドら、前述)によってもたらされる。しかし、この効率は変動し、ウィルスを基礎とする遺伝子送達がウィルス感染又は癌を引起し得ることが考えられる。最初のヒトに対する臨床的な試行は、レトロウィルスベクターの急性合併症を伴わなかったが、長期の合併症の可能性が、患者の十分なモニタリングを要求する。K.コルネッタ(Cornetta)ら、Human Gene Ther.,(1991)2:3-14。
遺伝子治療用のプラスミドDNAコンストラクトの使用におけるウィルス主体ベクターの使用の危険性及び概念的な利益(P.L.フェルナーら、Nature,(1991)349:351-352において論じられている)は、遺伝子輸送のための多くの生理学的及び化学的な方法の開発を平行して引き起こしている。最も熱心に研究されたシステムは、細胞をリン酸カルシウム又はカチオン性促進剤で処理することに関連している(フェルナーら、前述)。他の一般的な方法は、膜の生理的な穿孔中にDNAを注入すること(M.R.キャペッチ(Capecchi)、Cell,(1980)22:479-485)又は、細胞膜の透過化若しくは剥離の間の能動的な取込み(フェルナーら、前述)に関連している。それぞれの方法は、本質的に積極的でありin vitroにおいてのみ適用可能である。
本発明は、ウィルスビヒクルを使用せずに行う直接的な遺伝子送達の分野にある。遺伝子送達のための非ウィルスキャリアは、多くの障壁を克服することができなければならない。即ち、循環系において残らなければならず、選択された細胞を標的とすることができなければならず、DNAを細胞質へ導入することができなればならず、DNAを核へ輸送できなければならない。
マスキング in vivoで遺伝子を直接送達することについての懸念は、望ましい細胞の目的地に達するために十分長い、循環系におけるポリヌクレオチドの残存能である。“マスキング”、即ち、ポリヌクレオチドの保護は、この懸念を処理するひとつのやり方である。
微粒子状物質(例えば赤血球ゴースト、再構築ウィルスエンベロープ及びリポソーム)は、遺伝子輸送における保護として一部用いられている。C.ニコラウ(Nicolau)ら、Crit.Rev.Ther.Drug Carr.Sys.,(1989)6:239-271;R.J.マニオ(Mannio)ら、Biotechniques(1988)6:682-690。最も成果を挙げているリポソーム系は、カチオン性脂質試薬であるジオレオイルオキシトリメチルアンモニウム(DOTMA)を用いる。P.L.フェルナーら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,(1987)84:7413-7417。DOTMAは、ホスファチジルエタノールアミン(PE)と混合して、試薬、リポフェクチン(商品名)を形成する。リポフェクチン(商品名、以下省略)を用いることの利点は、カチオン性リポソームが簡単にDNAと混合して、細胞へ添加されることである。DNAをリポソームの内部へカチオン性試薬によって被包化する必要はない。リポフェクチンは、培養系においてリポーター遺伝子をヒト肺上皮細胞へ輸送すること(L.ルー(Lu)ら、Pfuhgers Arch.,(1989)415:198-203)、気管内経路によってラットへCAT遺伝子を導入すること(T.A.ハジンスキ(Hazinski)ら、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.,(1991)4:206-209)、並びに、気管内及び静脈内経路によってマウスへCAT遺伝子を導入すること(K.L.ブリガム(Brigham)ら、Am.J.Med.Sci.,(1989)298:278-281;A.ボウ(Bout)ら、“Abstracts of the 1991 Cystic Fibrosis Conference”、要約、第87、(1991))に用いられている。約50%の気道上皮細胞が、βガラクトシダーゼリポーター遺伝子を一時的に発現した(ハジンスキら、前述)が、発現レベルは、定量的でなかった。ステロイド感受性プロモーターに結合されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)は、ラット肺へトランスフェクトされた場合、発現を、デキサメタゾンによって正方向に制御できた。ハジンスキら、前述。細胞障害性は、高濃度のリポフェクチンによって問題となる。
DOTMAのための置換体には、リポポリアミン(J.レフラー(Loeffler)ら、J.Neurochem.(1990)54:1812-1815)、親脂性ポリリジン(X.ゾー(Zhou)ら、Biochim.Biophys.Acta.,(1991)1065:8-14)及び、カチオン性コレステロール(X.ガオ(Gao)ら、Biochem.Biophs.Res.Comm.,(1991)179:280-285)が含まれる。これらは、培養系において遺伝子輸送を仲介するために用いられている。リポフェクチンによってもたらされるトランスフェクション率に関していくつか改良された(約3倍)が、毒性が問題として残っている。カチオン性脂質を用いるトランスフェクションに寄与する機構の研究は、著しく欠落していた。過去の手段は、送達システムがDNAを細胞へどのように導入するかについて組織的に研究するよりは、異なるカチオン性脂質を合成して、トランスフェクションアッセイに試すことであった。DOTMA/PEリポソームは、アニオン性リポンソームによる二重層の融合を実行することができ(N.ダッツガンス(Duzgunes)ら、Biochem.(1989)28:9179-9184)、これは、形質膜を介したDNAの直接的なエントリーが、DOTMAの作用方式に関連していると示唆している。カチオン性脂質システムを用いる高い効率のトランスフェクションは、PEの取込みを必要とし、これはおそらく、PEが膜融合を促進する膜内脂質中間体を形成することができるためである。膜透過化及び膜融合におけるPEの役割は、広く研究されている。例えば、M.−Z.ライ(Lai)ら、Biochem.(1985)24:1646-1653;H.エレンズ(Ellens)ら、Biochem.(1986)25:285-294;J.ベンツ(Bentz)ら、Biochem.(1987)26:2105-2116)。
細胞のターゲティング 効率的な遺伝子輸送は、選択された細胞に対するDNAのターゲティングを必要とする。近年、リセプター仲介エンドサイトシスに基づく手法が遺伝子輸送のために説明されている。G.Y.ウー(Wu)ら、J.Biol.Chem.(1987)262:4429;G.Y.ウーら、J.Biol.Chem.(1988)263:14621-14624。細胞特異的リガンド−ポリリジン複合体は、核酸に電荷相互作用によって結合している。得られた複合体は、標的細胞によって取り込まれる。ウーら、前述は、リガンドとしてのアシアロオロソムコイドによる当該送達システムを用いて、in vivoにおけるヒト肝癌細胞株HepG2及びラット肝細胞の効率的なトランスフェクションを報告した。ハケット(Huckett)ら、Biochem.Pharmacol.(1990)40:253-263は、インシュリンに向けたターゲティング後のHepG2細胞における酵素活性の安定的な発現を報告した。結局、ワグナー(Wagner)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,(1990)87:3410-3414、及び(1991)88:4255-4259では、ヒト白血病細胞株K−562へのプラスミドのトランスフェリン−ポリカチオン仲介送達及びその後のコード化ルシフェラーゼ遺伝子の発現が観察された。しかし、記載された送達システムは、ポリリジンリンカーによってDNAに連結された高分子量のターゲティング(標的に向かって行く)タンパク質に基づいている。これらの巨大リガンド−ポリカチオン結合体は、サイズ及び組成において異種起源となり、化学的に十分定義されてなく、再生様式での調製が難しい(ウーら、前述;ワグナーら、前述)。しかも、多くのリセプター仲介システムにおいて、クロロキン又は他の細胞内運搬の崩壊剤が、高いレベルのトランスフェクションのために要求される。ある研究では、アデノウィルスがリセプター仲介システムの遺伝子送達を促進するために用いられている。D.T.クリエル(Curiel)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,(1991)88:8850-8854。
これらの研究をまとめると、遺伝子を、リセプター仲介エンドサイトシスによって哺乳類細胞の内部へ送達することができ、外因性DNAのフラクションが分解を免れて核へ入り、発現することが示される。発現レベルは低く、これは恐らく細胞質への外来DNAのエントリーが制限されるためである。
電荷中性化及び膜透過化 遺伝子の直接送達は、ポリヌクレオチドにおける大きな負の電荷の中性化能及び、標的細胞の膜の透過能(しばしば、付随的である)によって補助される。ポリヌクレオチド電荷を中性化して膜透過化及び輸送を補助するポリカチオンの使用は既知である。フェルナーら、前述。カチオン性脂質は、またこの目的のために用いられている。P.L.フェルナーら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,(1987)84:7413-7417;エプスタイン(Eppstein)らの米国特許第4,946,787号。特定のカチオン性脂質は、リポポリアミン及びリポインターカラント(lipointercalants)と呼ばれ、これらも既知である。J.−P.バール(Behr)、Tet.Lett.(1986)27:5861-5864。
亜細胞局在性 ポリヌクレオチドが、標的細胞へ一旦入ると、遺伝子の直接送達は、適当な亜細胞位置への遺伝子の指向能に補助され得る。デオキシリボヌクレオチドの送達のための自明な標的の1つは核である。このプロセスに補助することが知られているリガンドは、核局在性ペプチド又はこれらの核局在性配列を含むタンパク質である。C.ディングウォール(Dingwall)ら、TIBS(1991)16:478-481。
Y.カネダら、Science(1989)243:373-378は、再構築ウィルスエンベロープによってもたらされたトランスフェクション効率が、外来遺伝子が核タンパク質と共に標的細胞へ同時送達される場合に、増加することを示している。核タンパク質と混合したDNAは、アルブミンと混合されたDNAに関したトランスフェクションにおいて、控えめな増加を示す(カネダら)。DNAは、核局在性配列(NLS)、pro−lys−lys−lys−arg−lys−valを含むタンパク質(P.A.シルバー、Cell(1991)64:489-497)をプラスミドと結合した場合、より容易に核へ取り込まれるという仮定がある。タンパク質におけるNLSは、核膜孔を通って輸送するよう指示している。14アミノ酸の核局在性配列は、種々の巨大分子且つ更に黄金粒子(150Å直径)に結合しており、細胞質へ導入された際に、核へ迅速に取り込まれる(D.R.ファインドレイ(Findlay)ら、J.Cell.Sci.Supp.(1989)11:225-242;シルバー、前述)。核エントリーが、首尾よく安定したトランスフェクションについて、確率制限しているという考えは、細胞質へマイクロインジェクションされたプラスミドDNAが、細胞のトランスフェクションをもたらすことができない(1000以上の細胞質注入でトランスフェクションが認められない)が、核への直接的なプラスミドのマイクロインジェクションが、50%以上のマイクロインジェクションされた細胞でトランスフェクションをもたらしたという発見にも支持されている。キャペッチら、前述。プラスミドにおける核局在性シグナルの結合が、核へプラスミドDNAの輸送を誘発するならば、トランスフェクション効率は増加することができる。我々は、NLS及び他のリガンドを所望のポリヌクレオチドへ結合する新規な方法を提案する。
最後に、発明者らは、トランスフェクション効率が、DNAを種々のカチオン性タンパク質を用いて凝縮した場合に増加することを証明している。T.I.チクコネンコ(Tikchonenko)ら、Gene(1988)63:321-330;M.ボッガー(Bottger)ら、Biochim.Biophys.Acta.(1988)950:221-228;ワグナーら、前述。DNA凝縮がトランスフェクションを増加する理由は、すぐには明示されない。これはDNAの細胞取込みを増加し得る(ワグナーら、前述)が、細胞中のより大量の無傷(インタクト)なDNAをもたらし得るヌクレアーゼ活性に対するDNAの感受性を減少してしまう。
ポリヌクレオチド結合 上述したクラスの分子の1つと結合する遺伝子の直接輸送は、これらの成分のDNAの結合維持能によって更に補助される。ウーら、前述は、ポリカチオンポリリジンに対してリガンドを共有的に結合することによって、ポリヌクレオチドとそのリセプターリガンドを結合した。ワグナーら、前述は、ポリリジンに加えて、DNAインターカレーター、エチジウムホモダイマー(5,5′−ジアゾデカメチレン−ビス(3,8−ジアミノ−6−フェニルフェナントリジウム)ジクロライドハイドロクロライドに対して、該リガンドも共有的に結合した。P.E.ニールセン(Nielsen)、Eur.J.Biochem.(1982)122:283-289は、9−アミノアクリジンと特定のビス−アクリジンに対する共有的な結合によって、DNAに対する光親和性を結び付けた。
上記文献のどこにも、標的細胞の標的亜細胞位置へ循環性ポリヌクレオチドを運ぶことに関連した問題の複合的な側面に向けたポリヌクレオチド送達のためのシステムは、記述されていない。本発明は、ポリヌクレオチドを1以上の下記機能性成分の組み合わせと結合することによって、これらの問題を処理する。即ち、これらの成分とは、DNAマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、亜細胞局在性成分である。
発明の概要
前述の直接遺伝子送達の問題の観点では、本発明は、1以上の、好ましくは2以上の下記機能性成分、即ち、DNAマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、亜細胞局在性成分の組み合わせ物を用いる自己構築ポリヌクレオチド送達システムを意図している。本システムの各成分は、その指示された機能を実行することができ、また要求されたポリヌクレオチドにより構築又は分解することもできる。例えば、特定の成分は、それのために所望された機能を実行するために、ポリヌクレオチドから分離しなければならないであろう。
従って、本発明の主な目的は、ポリヌクレオチドを真核細胞の亜細胞成分にもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞の細胞質膜を通過してポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分に結合したポリヌクレオチドを含む。
本発明の他の目的は、ポリヌクレオチドを真核細胞の核へもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞を認識することができる細胞認識成分に結合したポリヌクレオチドを含む。
本発明の更に他の目的は、真核細胞の核へポリヌクレオチドをもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞を認識することができる細胞認識成分と、真核細胞の細胞質膜を通ってポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分との両方に結合したポリヌクレオチドを含む。
本発明の更なる目的は、真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドをもたらすための組成物を提供することであり、これは、真核細胞の細胞質から真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドを送達することができる亜細胞局在性成分を結合したポリヌクレオチドを含む。
本発明の更に他の目的は、真核細胞の亜細胞成分にポリヌクレオチドをもたらすための組成物を提供することであり、これは、ポリヌクレオチド、該真核細胞を認識することができる細胞認識成分、該真核細胞の細胞質膜を通ってポリヌクレオチドを輸送することができる膜透過化成分、該真核細胞の細胞質から該真核細胞の亜細胞成分へポリヌクレオチドを送達することができる亜細胞局在性成分並びに、ポリヌクレオチドの循環半減期を延ばすことができるマスキング成分を含む。
本発明の他の目的は、自己構築ポリヌクレオチド送達システムに有用な成分を提供することであり、これは、下記式、
を有し、ここで、n及びmは各々、独立して1〜20の整数であり、pは0〜20の整数であり、Ar1及びAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾールピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びにこれらの誘導体から成る群より独立して選択され、Xは反応性結合基であり、Yは細胞表面リセプターリガンド、亜細胞局在性配列及び膜透過化成分からなる群から選択される。
本発明の更に他の目的は、反応性インターカレート成分を提供することであり、これは、下記式、
を有し、ここで、n及びmは各々、独立して1〜20の整数であり、pは0〜20の整数であり、Ar1及びAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾールピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びにこれらの誘導体から成る群より独立して選択され、Xは反応性基である。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のポリヌクレオチド送達システムの具体例を示したものであり、ここで、NLSは核局在性配列であり、MDは膜透過化成分であり、リガンドは細胞認識成分である。
図2は、グラミシジンSの構造を示している。
図3は、リポフェクチンと、pH感受性リポソームと、グラミシジンS/DOPE/DNA複合体とを用いたルシフェラーゼトランスフェクション効率を比較している。
図4は、トランスフェクション効率に対するグラミシジンS対DNA比の影響を示している。
図5は、トランスフェクション効率に対するグラミシジンS対DOPE比の影響を示している。
図6は、トランスフェクション効率に対するグラミシジンS/脂質/DNA複合体の脂質の型の影響を示している。
図7は、トランスフェクション効率に対するグラミシジンS/脂質/DNA複合体におけるグラミシジンSの他のペプチドの置換の影響を示している。
図8は、ターゲティング糖質及び/又は反応性マレイミドをスペルミジンビス−アクリジンに結合するための合成スキームを示している。
図9は、ペプチドをマレイミド−スペルミジンビス−アクリジンに結合するための基本スキームを示している。
図10は、分解可能なLys−Lysペプチドビス−アクリジンに結合するための合成スキームを示している。
図11は、実施例3のゲル遅延アッセイの結果を示している。
図12は、幾つかのガラクトシルビス−アクリジンの、肝細胞へのプラスミドDNAを運ぶ能力を示している。
図13は、実施例6のトリガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンの合成スキームを示している。
発明の詳細な説明
定義:
“ポリヌクレオチド”という用語を本文において用いる場合、これには、1本鎖、2重又は多重鎖形態のいずれかで1以上のヌクレオチドのRNA又はDNA配列が含まれる。“ポリヌクレオチド”は、一般的にポリデオキシリボヌクレオチド(2′−デオキシ−D−リボース又はその修飾形態を含む)即ちDNA、ポリリボヌクレオチド(D−リボース又はその修飾形態)即ちRNA、並びに、プリン若しくはピリジミン塩基のN−グリコシド又はC−グリコシド、或いは修飾プリン若しくはピリジミン塩基、又は非塩基性(abasic)ヌクレオチドである全ての他のポリヌクレオチドの型を言う。ポリヌクレオチドは、プロモーター領域、オペレーター領域、構造領域、終結領域、及びこれらの結合又は遺伝的に関連した他の全ての物質をコードし得る。
本発明のポリヌクレオチドは、また当該技術分野において一般に理解されるように1以上の“置換”結合物(リンケージ)も含み得る。これらの置換結合物の幾つかは非極性であり、膜を横切るポリヌクレオチドの望ましい拡散能に寄与している。その他は、ポリヌクレオチドの生分解能の増加又は減少に寄与している。(生分解能は、例えば増加された又は減少されたヌクレアーゼ感受性に影響される。)これらの“置換”結合物は、慣用の他の結合物例えば、ホスホロチオエート又はホスホロアミデートが、一般的に有効な文献中で記述されたように合成されたものとして本文中で定義される。同様のポリヌクレオチドにおけるこのような全ての結合物が、同一である必要ない。
ポリヌクレオチドの糖部分における修飾、例えば1以上の水酸基がハロゲン、脂肪族基と置換、又はエステル、アミンとして官能化される等の場合、又は、リボース若しくはデオキシリボースが他の機能的に均等な構造物と置換する場合も含まれる。塩基部分の修飾には、アルキル化プリン若しくはピリミジン、アセチル化プリン若しくはピリミジン又は、他のヘテロ環が含まれる。このような“アナログプリン”及び“アナログピリミジン”は、当該技術分野において一般に知られているようなものであり、これらの多くは化学療法剤として用いられている。
特に、ポリヌクレオチドの糖−リン酸骨格は、非糖質骨格例えばペプチド又はP.E.ニールセンら、Science(1991)254:1497-1500に記述されているようなポリマー骨格の他の型と置換され得る。
用語“機能性成分”を本文において用いる場合、これには、DNAマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分並びに、亜細胞局在性成分が含まれる。
“DNAマスキング成分”という用語を本文において用いる場合、これは、ポリヌクレオチドの全部又は一部をマスクして、循環系内に存在する分解薬(例えばヌクレアーゼ)による攻撃を阻止することによって、その循環性半減期を延ばすことができる分子を言う。
“膜透過化成分”という用語を本文において用いる場合、膜を横切るポリヌクレオチドの通過を補助する全ての成分を言う。従って、この用語は、電荷中性化成分を一部含み、これは通常、ポリカチオンであって、ポリヌクレオチドの大きな負電荷を中性化し、ポリヌクレオチドが膜の疎水性内部を横断できるようにする。多くの電荷中性化成分は、膜透過化物(permeabilizer)として作用することができる。膜透過化は、また両親媒性分子によりもたらされる。
膜透過化物は、普通の不透過性の分子を細胞膜を横断するように援助し、細胞の細胞質への入口をもたらすことができる分子である。膜透過化剤は、ペプチド、胆汁酸塩、糖脂質、糖質、リン脂質又は界面活性剤分子としてもよい。膜透過化剤は、しばしば、ある部分が疎水性であり他の部分が親水性であるような両親媒特性を有し、膜とこれらとの相互作用を可能にする。
用語“リポソーム”を本文において用いる場合、球状の二重層に配列された両親媒性脂質から構成された小胞を言う。リポソームは、通常、小さい単ラメラ小胞(SUV)、大きな単ラメラ小胞(LUV)又は多重ラメラ小胞(MLV)に分類される。SUV及びLUVは、定義上では、1つの二重層を有し、一方、MLVは、多くの凝集された二重層を含む。リポソームは、水性の内部に又は二重膜の間に親水性分子を捕獲すること、又は二重層の内部に疎水性分子を捕獲することによって、種々の物質を被包するために用いられ得る。
リポソームは、その大きさ、組成及び電荷に依存して、広範な特性を示す。例えば、わずかなパーセントの不飽和脂質を有するリポソームは、極僅かに透過し易くなる傾向があるが、コレステロール又は他のステロールを取り込んだリポソームは、より堅固で透過性が劣る傾向にある。リポソームは、正、負又は中性に荷電することができ、これは親水性基に依存している。例えば、コリン主体の脂質は完全に中性の電荷を備え、リン酸塩及び硫酸塩主体脂質は負電荷を与え、グリセロール主体脂質は一般に負に帯電し、ステロールは、一般に溶液中で中性だが、帯電している基を有する。
“細胞認識成分”という用語を本文において用いる場合、これは、標的細胞の表面上の成分を認識することができる分子を言う。細胞認識成分には、細胞表面抗原に対する抗体、リセプター仲介エンドサイトシスに関連するようなものを含む細胞表面リセプターのためのリガンド、ペプチドホルモン等が含まれる。
“DNA結合部分”は、非共有様式で核酸と相互作用する分子又はその部分を言う。DNA結合部分には、主溝及び副溝バインダーが含まれ、これは、二重らせんDNAの主溝又は副溝と結合することによってDNAに相互作用すると考えられる分子である。DNA結合部分は、またDNAインターカレーターを含み、これは、ヌクレオチド塩基対の間に平行に挿入することによって、DNAへインターカレートすると思われる平面分子又は分子の平面部分である。DNA結合部分は更にポリカチオンを含み、これは、DNA骨格の負電荷に結合すると思われる。単一鎖DNA又はRNAは、治療的な鎖(ストランド)として用いられる場合、本文中で説明される相補的な“リンカー鎖”が、“DNA結合部分”として機能的に作用し得る。
DNA結合部分は、“反応性基”によって本発明の機能性成分に共有結合され得る。これらの反応性基は、該機能性成分上の求核基と容易に反応する。このような反応性基(それ自身の反応性求核基に相当する)には、N−ヒドロキシサクシンイミド(アミン)、マレイミド及びマレイミドフェニル(スルフヒドリル)、ピリジルジスルフィド(スルフヒドリル)、ヒドラジン(糖質)並びにフェニルグリオキサール(アルギニン)が含まれるが、これらに限定されない。
“亜細胞局在性成分”という用語を本文中で用いる場合、これは、標的細胞中の亜細胞成分を認識することができる分子を言う。認識される亜細胞成分には、核、リポソーム、ミトコンドリア及び葉緑体が含まれる。特別の亜細胞局在性成分には、“核局在性成分”が含まれ、これは、分子を核へ運ぶことを補助するもので、核局在性ペプチド及びアミノ酸配列が含まれると知られている。
組成物:
本発明の一部である組成物は、自己構築ポリヌクレオチド送達システムにあり、これは、1以上、好ましくは2以上の下記機能性成分、即ちDNAマスキング成分、細胞認識成分、電荷中性化及び膜透過化成分、並びに、亜細胞局在性成分と組み合わせたポリヌクレオチドを用いる。このシステム中の各要素は、指示された機能を実行することができ、また所望されるポリヌクレオチドにより構築又は分解することができる。本システムの個々の要素、並びにこれらの要素を作製するための方法及び中間体も本発明の一部として意図されている。本システムの具体例を図1に示している。
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドは、単一鎖DNA若しくはRNA、又は二本鎖DNA若しくはDNA−RNAハイブリッドとし得る。治療的価値を有する三本鎖又は四本鎖ポリヌクレオチドも、本発明の範囲内にあると意図されている。二本鎖DNAの例には、構造遺伝子、オペレータ制御及び終結領域を含む遺伝子、並びに、自己複製システム例えばプラスミドDNAが含まれる。
単一鎖ポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド(DNA及びRNA)、リボザイム並びに、三重形成オリゴヌクレオチドが含まれる。この“治療鎖”は、延長された活性を有するために、これは好ましくは、ヌクレオチド結合物の幾つか又は全部として、安定な、非ホスホジエステル結合物を有する。このような結合物には、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート又は、アルキル基がメチル又はエチルであるO−アルキルホスホトリエステル結合物が含まれる。
これらの単一鎖ポリヌクレオチドにとって、投与される組成物の一部として治療鎖に対して相補的な鎖を調製することが好ましい。この相補鎖は、“リンカー鎖”と呼ばれ、細胞に入った後に分解されるように、通常、ホスホジエステル結合を用いて合成される。この“リンカー鎖”は、独立した鎖とすることもでき、又は、治療鎖が本質的に折り畳まれて、それ自身にハイブリダイズするように、治療鎖に共有的に結合若しくはこれの単なる延長とすることもできる。
リンカー鎖は、またその3′若しくは5′末端上に、又はリンカーの糖若しくは骨格上で、機能性成分として作用し、治療鎖の活性を促進する官能性を有することもできる。例えば、ホスホジエステルリンカー鎖は、ターゲティングリガンド例えば葉酸誘導体を含むことができ、これは標的細胞を認識して内在化を可能にする。このリンカーが分解耐性結合物から構成される相補的治療鎖に結合している場合、この二重鎖は内在化され得る。一旦、細胞内部に入ると、リンカーは分解して治療鎖を放出することができる。このやり方では、治療鎖は、結合された更なる官能性を有することはなく、また、その機能は非必須部分によって妨害されない。この戦略を、全てのアンチセンス、リボザイム又は三重鎖形成ポリヌクレオチドに適用することができる。これは、抗ウィルス性、抗細菌性、抗新生物性、抗炎症性、抗増殖性、抗リセプター遮断性又は抗輸送性のポリヌクレオチド等を送達するために用いられる。
独立した“リンカー鎖”は、治療鎖に対して直接相補的な配列を有し、1対1の様式でハイブリダイズするように合成され得る。或いは、リンカー鎖は、該リンカー鎖の5′領域が治療鎖の5′領域とハイブリダイズし、リンカー鎖の3′領域が治療鎖の3′領域にハイブリダイズして、下記の連鎖状の構造を形成するように構築され得る。
この連鎖は、治療性核酸の見かけの分子量が増加し、その薬物動態特性及びターゲティングリガンド:治療リガンド比を最適な治療効果を達成するように調整することができるという利点を有する。
機能性成分
DNAマスキング成分 本システムのDNAマスキング要素は、ポリヌクレオチドの全部又は一部をマスキングすることができる分子であり、それゆえ、循環系において存在する分解剤による攻撃を阻止することによって循環性半減期を延ばす。
本発明では、ポリエチレングリコール(PEG)を、後述するように慣用の方法によってDNA結合部分と共有結合的に結合することができ、DNAマスキング成分として用いることができる。PEGは、約700〜約20000ダルトン、好ましくは約1800〜6000ダルトンの分子量を有し、好ましくは、約1:4〜1:100、より好ましくは約1:20の割合(PEG分子:DNA塩基対)で存在する。
或いは、DNAは脂質との結合によってマスクされ得る。ある具体例では、DNAは、例えば、スゾッカ(Szoka)らの米国特許第4,394,448号に記述されるような標準的なリポソーム中に包まれる。この特許の明細書を援用して本文の一部とする。他の具体例では、DNAを、エプスタインらの米国特許第4,897,355号に記述されるようなものに類似する合成カチオン性脂質と反応させる。これらのカチオン性脂質は、下記の一般式を有し、
式中、nは、1〜8の整数であり、R1及びR2は、同一又は異なる6〜24の炭素原子を有するアルキル若しくはアルケニルであり、R3は、水素原子、1〜10の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、R4は、正に帯電した1〜30の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンであり、ここで、炭素原子の少なくとも1つはNR′で置換されてもよく、R′は、水素、1〜10炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。−N−R′部分として機能することができる好ましい基は、トリス(アミノエチル)アミン(NH2CH2CH2)3N、アグマチン(デカルボキシアルギニン)H2N(CH2)4(=NH)NH2、3−アミノエチル−1,3−プロパンジアミンH2N(CH2)3NH(CH2)2NH2、3−ジメチルアミノプロピルアミン(CH3)2NH(CH2)3NH2、イミノビス(N,N′)ジメチルプロピルアミンNH((CH2)3N(CH3)2)2、イミノビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、1,4−ビス(3−アミノプロピル)ピペラジン、ビス(プロピルアミン)(NH2(CH2)3)2NH、スペルミジン及びスペルミンであり、ここで、これらの基は、その1つの窒素原子によって脂質分子に結合している。
特に好ましい具体例では、合成カチオン脂質は、合成カチオン尾部脂質であり、これは、下記式、
を有し、式中、nは6〜24の整数であり、Yは水素、エタノールアミン、コリン、グリセロール、セリン及びイノシトールから成る群より選択され、R1は、6〜24炭素原子を有するアルキル又はアルケニルであり、R3は水素、1〜10炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、R4は、正に帯電した1〜30の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンであり、ここで炭素原子の少なくとも1つは、NR′と置換してもよく、ここでR′は、水素、1〜10の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。−N−R′部分として機能することができる好ましい基は、トリス(アミノエチル)アミン(NH2CH2CH2)3N、アグマチン(デカルボキシアルギニン)H2N(CH2)4(=NH)NH2、3−アミノエチル−1,3−プロパンジアミンH2N(CH2)3NH(CH2)2NH2、3−ジメチルアミノプロピルアミン(CH3)2NH(CH2)3NH2、イミノビス(N,N′)ジメチルプロピルアミンNH((CH2)3N(CH3)2)2、イミノビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、1,4−ビス(3−アミノプロピル)ピペラジン、ビス(プロピルアミン)(NH2(CH2)3)2NH、スペルミジン及びスペルミンであり、ここで、これらの基は、その1つの窒素原子によって脂質分子に結合されている。
上述の合成カチオン性脂質が、DNAに結合している場合に、該DNAを効率よくマスクすることがわかっている。どの方法にも本発明を限定することなく、脂質は、ある様式でDNAを被包化する単層構造を形成すると考えられる。
細胞認識成分 本システムの細胞認識要素は、標的細胞の表面上の成分を認識することができる分子であり、後述するように慣用の方法によってDNA結合部分と共有結合的に結合する。細胞認識成分には、細胞表面抗原に対する抗体、リセプター仲介エンドサイトシスに関連するものを含む細胞表面リセプターのリガンド、ペプチドホルモン等が含まれる。本発明によって意図される特定リガンドには、糖質リガンド例えばガラクトース、マンノース、マンノシル−5−ホスフェート、フコース、シアル基、N−アセチルグルコサミン又はこれらの基の組み合わせが、例えば血液群の糖脂質若しくは種々の分泌性タンパク質に見出されるもののような複合糖質として含まれる。他のリガンドには、葉酸塩、ビオチン、細胞表面若しくは細胞内リセプターと相互作用することができる種々のペプチド、例えば、化学誘因性(chemoattractant)ペプチド、N−ホルミル−met−leu−phe、arg−asp−グリシン配列を含むペプチド若しくは、cys−ser−gly−arg−glu−asp−val−trpペプチド、シスチン残基を含むペプチド又は、ヒト免疫不全ウィルスのGP−120のような細胞表面タンパク質と相互作用するペプチド、並びに、CD4と相互作用するペプチドが含まれる。他のリガンドには、A.ハートラー(Hertler)とA.フランケル(Frankel)、J.Clin.Oncol. 7:1932-1942によって記述されるような抗体若しくは抗体フラグメントが含まれる。該抗体の特異性は、細胞表面上に発現され得る多種のエピトープに向けることができ、これには組織適合性巨大分子、自己免疫抗原、ウィルス性、寄生虫性若しくは細菌性タンパク質が含まれる。他のタンパク質リガンドには、ホルモン例えば成長ホルモン及びインシュリン、又はタンパク質成長因子例えば、GM−CSF、G−CSF、エリスロポイエチン、上皮増殖因子、塩基性及び酸性繊維芽細胞成長因子等が含まれる。他のタンパク質リガンドに、細胞表面リセプターを通して働く種々のサイトカインを含むことができ、これには、インターロイキン2、インターロイキン1、腫瘍壊死因子及び、このような巨大分子からの適当なペプチドフラグメントが含まれる。
膜透過化成分 本システムの膜透過化要素は、膜を横切ってポリヌクレオチドの通過を補助する分子である。DNAマスキング成分として上述したリポソーム及び合成カチオン性脂質が、また膜透過化成分として機能し得る。
本発明の膜透過化成分には、また、ポリヌクレオチド上の大きな負電荷を中性化するポリカチオンが含まれる。本発明のポリカチオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ(リジン−アルギニン)及び同様のポリペプチド並びにポリアミンが含まれる。ポリカチオンの他のクラスは、下記式、
を有するカチオン性胆汁酸塩であり、式中、X及びYは、独立して、H又はOHであり、R3は、水素、1〜10の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンであり、R4は、正に帯電した1〜30の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐のアルキル若しくはアルキルアミンであり、ここで炭素原子の少なくとも1つは、NR′と置換してもよく、ここでR′は、水素、1〜10の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルアミンである。−N−R′部分として機能することができる好ましい基は、トリス(アミノエチル)アミン(NH2CH2CH2)3N、アグマチン(デカルボキシアルギニン)H2N(CH2)4C(=NH)NH2、3−アミノエチル−1,3−プロパンジアミンH2N(CH2)3NH(CH2)2NH2、3−ジメチルアミノプロピルアミン(CH3)2NH(CH2)3NH2、イミノビス(N,N′)ジメチルプロピルアミンNH((CH2)3N(CH3)2)2、イミノビス(3−アミノプロピル)−1,3−プロパンジアミン、1,4−ビス(3−アミノプロピル)ピペラジン、ビス(プロピルアミン)(NH2(CH2)3)2NH、スペルミジン及びスペルミンであり、ここでこれらの基は、その1つの窒素原子によって胆汁酸塩に結合している。
他の具体例では、本発明の膜透過化成分は、両親媒性カチオン性ペプチドである。両親媒性カチオン性ペプチドは、ペプチドがカチオン性の面と中性、疎水性の面とを有すると思われるような天然の立体配位を有するペプチドである。好適具体例では、該ペプチドは環状ペプチドである。本発明の両親媒性カチオン性環状ペプチドの例は、グラミシジンS(この構造は図2に示されている)及びチロシジンである。該ペプチドは、また、幾つか又は全て、天然に生成するL立体配位に対して逆の、D立体配位にあるアミノ酸を含むことができる。
特に好ましい具体例では、膜透過化要素は、両親媒性カチオン性環状ペプチドに加えて、(1)脂質、又は(2)単純ポリアミンのいずれか、又はこの両方を含む。
本発明の脂質は、リポソームを形成することができる両親媒性分子であり、天然形態で又はリポソームとして、いずれも必要濃度で投与したときに、実質的に非毒性である。好適な脂質は、一般に、極性即ち、親水性末端と、非極性即ち疎水性末端を有する。好適な脂質には、タマゴのホスファチジルコリン(EPC)、ホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、コレステロール(Chol)、コレステリルホスホリルコリン、3,6,9−トリオキサオクタン−1−オル−コレステリル−3−オル、ジミリストイル−ホスファチジルコリン(DMPC)、並びに他のヒドロキシコレステロール若しくはアミノコレステロール誘導体(例えば、K.R.パテル(Patel)ら、Biochim.Biophys.Acta.(1985)814:256-64を参照のこと)が含まれるが、これに限定されない。脂質は、好ましくはリポソームの形態で添加される。
添加ポリアミンは、好ましくは、スペルミン又はスペルミジンである。
膜透過化要素は、環状ペプチド並びに任意的なリン脂質及びポリアミンであり、同時に又は逐次的に、該組成物へ添加され得る。好ましくは、環状ペプチドが最初に添加され、リン脂質又はポリアミンが、その後に添加される。添加環状ペプチド対添加ポリアミンのモル比は、好ましくは、約1:1〜約1:3である。添加環状ペプチド対添加リン脂質のモル比は、好ましくは、約1:1〜約1:20である。
亜細胞局在性成分 本システムの亜細胞局在性要素は、標的細胞中の亜細胞成分を認識することができる分子であり、これは後述するように慣用の方法によってDNA結合部分に共有結合される。特定の亜細胞成分には、核、リボソーム、ミトコンドリア及び葉緑体が含まれる。
本発明の好適具体例では、亜細胞局在性成分は、核局在性成分である。核局在性成分には、定義されたアミノ酸配列の既知のペプチド、及びこれらのペプチドを含む一層長い配列が含まれる。既知のペプチド配列の1つは、SV40ラージT抗原の7ペプチド、pro−lys−lys−lys−arg−lys−valである。他のペプチドには、インフルエンザウィルス核タンパク質の10ペプチド、ala−ala−phe−glu−asp−leu−arg−val−leu−ser、及びアデノウィルスElaタンパク質の配列、lys−arg−pro−arg−proが含まれる。他の配列は、C.ディングウォールら、TIBS(1991)16: 478-481に認めることができる。
他の具体例では、亜細胞局在性成分は、リソソーム局在性成分である。リソソームを標的とする既知の成分は、配列lys−phe−glu−arg−glnを含むペプチドである。更に他の具体例では、亜細胞局在性成分は、ミトコンドリア局在性成分である。ミトコンドリアを標的とする既知の成分は、配列met−leu−ser−leu−arg−gln−ser−ile−arg−phe−phe−lys−pro−ala−thr−argを含むペプチドである。
DNA結合部分
本システムのDNA結合部分とは、非共有様式で核酸と相互作用する機能性成分の部位を言う。この部分は、慣用手法によって又は後述するようにして機能性成分の残りと共有結合する。DNA結合部分は、好ましくは、主溝及び副溝バインダー、DNAインターカレーター又は一般的なDNAバインダーである。単一鎖ポリヌクレオチドの場合では、DNA結合部分は、前述したようにリンカー鎖とすることもできる。このような場合に、機能性部分例えば細胞認識又は亜細胞局在性成分は、リンカー鎖に共有結合する。
好適な具体例に1つでは、DNA結合部分は、主(major-)又は副溝(mainor-groove)バインダーである。主又は副溝バインダーは、DNAの該主又は副溝バインダーに結合する又は“入っている”と知られている部分である。これらのバインダーには、ジスタマイシンA及びヘキスト染料33258が含まれる。
他の具体例では、DNA結合部分は、非特異的DNAバインダー例えばポリカチオンである。本発明のポリカチオンには、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリ(リジン−アルギニン)並びに同様のポリペプチド及びポリアミンが含まれる。
他の好ましい具体例では、DNA結合部分は、DNAインターカレーターである。DNAインターカレーターは、平坦な多環式分子例えば、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体である。
特定の好適な具体例では、このインターカレーターは、2つの共有結合した平坦な多環式分子からなるダイマーである。本発明の平坦な多環式ダイマー部分は、下記の構造、
を有し、式中、
Zは結合であり、各n及びmは、独立して1〜20の整数であり、pは0〜20の整数であり;
Ar1及びAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択される。
n及びmの値は、DNA中のインターカレート化されたアクリジンモノマーの間隔を決定するので重要である。n及びmのより好ましい値は、各々3及び4である。ビス−アクリジンダイマーでは、Ar1及びAr2は共にアクリジンであり、これが好ましい。
この好ましいDNA結合部分は、機能性部分に共有結合的に結合され得、この部分は、前述したような細胞認識部分、亜細胞局在性部分又は膜透過化部分である。pの値は、機能性部分からのインターカレーターの分離を決定する。pの好ましい値は、0〜8である。
DNA結合部分は、多重コピーの、又は1以上の機能性部分に共有結合されることができる。例えば、ビス−アクリジンダイマーは、図13中に示されるように肝細胞のアシアロオロソムコイドリセプターに結合する3つのガラクトース残基と結合し得る(図13中の化合物26を参照のこと)。
DNA結合ダイマーを機能性部分へ結合する好適な方法は、下記式、を有する前駆体に関連している。
式中、n及びmは各々独立して1〜20の整数であり、pは0〜20の整数であり、
Ar1及びAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、Xは、N−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサルファイド、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールから成る群より選択される反応性基である。
好ましい具体例では、Ar1及びAr2は、アクリジンであり、pは4であり、Xはp−マレイミドフェニルである。その後、このインターカレート部分は、機能性部分のスルフヒドリル基によって機能性部分に結合(カップリング)し、例えば下記式を有する二価機能性成分が得られる。
式中、Yは機能性成分であり、n及びmは各々独立して1〜20の整数であり、pは0〜20の整数であり、
Ar1及びAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、Xは、N−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、マレイミドフェニル、ピリジルジサルファイド、ヒドラジン及びフェニルグリオキサールから成る群より選択される反応性基である。
生分解性リンカー例えば、配列−lys−lys−を有するペプチドは、インターカレーターに機能性成分を結合することに、また用いられ得る。
本発明の更に他の具体例では、平坦な多環式ダイマーは、下記の式、
を有し、式中、Ar1及びAr2は、エチジウムブロマイド、アクリジン、ミトザントロン、オキサゾロピリドカルバゾール、エリプチシン及びN−メチル−2,7−ジアザピレニウム並びに、これらの誘導体から成る群より独立して選択され、
各aaは独立してアミノ酸であり、
x及びzは、1〜100から独立して選択された整数であり、
yは0〜5の整数であり、
aa1及びaa2はリジン残基であり、
N1及びN2は、aa1及びaa2のリジンのε−アミノ基からの窒素である。
ポリヌクレオチド送達システムの有用性
本発明のポリヌクレオチド送達システムは、治療状況に有用である。治療用途では、本発明のシステムは、種々の様式の投与に配合されることができ、これには、全身性及び局所若しくは局在的な投与が含まれる。技術及び配合は、一般にRemington's Pharmaceutical Sciences、マック出版社(Mack Publishing Co.)、イーストン、ペンシルバニア州、最新版に見出すことができる。
全身性投与では、非経口投与例えば注射が好ましく、これには、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下が含まれる。肺の疾患の処理には、該ポリヌクレオチド送達システムの実施は、吸入によって又は、肺へ直接的に本システムを取り付けることによって行われる。
注射では、本発明のシステムは、液体溶液中、好ましくは、生理学的に適合した緩衝液例えばハンクス溶液又はリンゲル溶液中に配合される。更に、本システムを、固体形態で配合し、使用の直前に再溶解又は懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。
全身性投与は、また経粘膜又は経皮的なやり方によってもでき、また本システムを、経口又は鼻腔内若しくは吸入エアロゾルで投与することができる。経粘膜的又は経皮的投与では、透過すべき障壁に対して適当な浸透剤が配合に用いられる。このような浸透剤は、一般に、当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与には胆汁酸塩及びフコジン酸誘導体が含まれる。更に、界面活性剤も透過を促進するために用いられ得る。経粘膜投与は、例えば、鼻の噴霧によって、又は座薬を用いて行われ得る。経口投与には、本システムは、慣用の経口投与形態例えばカプセル、錠剤、強壮剤に配合される。
局所投与には、本発明のシステムは、軟膏(ointments,salves)、ゲル又はクリームに、当該技術分野では一般に知られているようにして配合される。
下記の実施例は、説明のみを意図するもので、本発明を限定するためのものではない。
実施例1
グラミシジンSのトランスフェクション
リポフェクチンは、合成カチオン性脂質であり、ジオレイロキシトリメチルアンモニウム(DOTMA)を、ホスファチジルエタノールアミンと組み合わせて、負に帯電したDNAと電荷複合体を形成している。この複合体は、細胞膜と融合して、DNAを細胞質へ送達すると考えられている。他の手段は、負帯電脂質及びホスファチジルエタノールアミンから構成されるpH感受性リポソームを用いる。C.Y.ワン(Wang)ら、Biochem.(1989)28:9508-9514。送達機構は、エンドソーム内のpHが酸性となる場合に、リポソームの二重層が不安定になり、エンドソームの膜と融合する、リポソームのエンドサイトシスに関連している。リポソームの内容物は、その後、細胞の細胞質へ導入される。C.−J.チュウ(Chu)ら、Pharmaceut.Res.(1990)7:824-834。
我々は、哺乳類細胞でのDNAの送達及び発現について、pH感受性コレステリルヘミサクシネート(Chems)/ホスファチジルエタノールアミン(PE)リポソーム組成物と、グラミシジンS/ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)/DNA複合体とに対してリポフェクチンを比較した。強いプロモーターとホタルのルシフェラーゼ又はβガラクトシダーゼとを含むプラスミドを、遺伝子輸送に指標として用いた。
細胞トランスフェクションプロトコール
CV−1、p388D1、HepG2及びHeLa細胞を、UCSF細胞培養施設から得た。リポフェクチン試薬を、製造物説明書に記述されているように用いた(ギブコ−BRL、ガイザースブルグ、メリーランド州)。KD83細胞をDNAX(パロアルト、カリフォルニア州)から入手した。細胞を60mmディッシュ当たり0.5〜1×106細胞の密度で植付け、37℃5%CO2下で、10%ウシ胎仔血清(FCS)を含有する適当な培地中で成育させた。リポソーム、リポフェクチン又はグラミシジンS/DOPE/DNA複合体のいずれかと共にインキュベーションする前に、細胞を、2mlのFCS非含有DME H−21培地で1度洗浄した。その後、トランスフェクションシステムを、2mlの同一培地中へ添加した。ある実験では、トランスフェクションは、10%FCS含有DME H−21中で行われた。5時間後に培地を取り除き、10%FCSを含む3mlの適当な培地に移した。ルシフェラーゼ活性を、記述されているように(A.R.ブラジール(Brasier)ら、Biotechniques(1989)7:1116-1122)48時間後に測定した。簡単に言えば、細胞を、Ca2+及びMg2+非含有氷冷リン酸緩衝液で2回洗浄し、溶解緩衝液(1%トライトン含有)中25mMグリシルグリシン(pH7.8)400μlで処理して、剥がした。遠心後、100μlの上清を最適量の50mM ATPと混合した。その後、D−ルシフェリン(シグマ、100μlの1mM溶液)を注入し、生物発光測定器(バイオルミネセンス・アナリティカル・ラボラトリーズ社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を用いて、最初の10秒間、放射光を集中した。上清中のタンパク質を、ブラッドフォルド(Bradford)の技術(バイオラドキット)を用いてアッセイした。結果は、細胞タンパク質のmg当たりの光単位量で表した。
ルシフェラーゼアッセイ
3つの異なるウィルスルシフェラーゼ遺伝子プロモーター、RSV、SV40及びCMVの効力を比較するために、我々は、幾つかの哺乳類細胞株を対応するリポフェクチン複合プラスミドによりトランスフェクトした。各々のディッシュの細胞は、上述のような10μlのリポフェクチンと組み合わされた2μlのプラスミドを受け取った。プロモーターの強度は、対応するプラスミドによって48時間でのルシフェラーゼ発現によって概算された。CMVプロモーター(pCluc4プラスミド)は、HeLa、HepG2及びp388D1細胞において最も高いルシフェラーゼ発現を引起し、一方SV40プロモーター(pSV2プラスミド)は、CV−1細胞において、より効力があった。それゆえ追加実験には、pSV2プラスミドをCV−1細胞に、及びpCluc4を他の細胞株に用いた。
リポソーム特徴付け
プラスミド被包化効率は、ファイコール密度勾配において被包化プラスミドと、非被包化のプラスミドとを分離した後に、測定された。添加された総DNA量の約22±3%が、被包化された。リポソームの直径は、動的光散乱によって測定し、DOPE/CHEMS、DOPC/CHEMS及びPS/Cholリポソームに対して、各々、372±38nm、295±65nm及び464±20nmであった(結果は、3つの独立した光散乱測定の平均±SDである)。
A.グラミシジンS及びホスファチジルエタノールアミン
典型的な複合体調製物を、20μgのプラスミドDNAを、ポリスチレン管において300μlの30mMトリスCl、pH9中に希釈することによって作製した。グラミシジンSを、DMSO中20mg/mlの保存溶液から、2mg/mlの濃度まで、30mM、pH9のトリスCl緩衝液に希釈した。20μlの希釈グラミシジンS(即ち、40μg)溶液を、DNAに添加して、素早く混合した。その後、170nmolのリポソームを、DNA/グラミシジンS混合物へ、1滴ずつゆっくりと添加した。リポソームを、4μmolの脂質をロータベーパーを用いて窒素下で乾燥し、4mlの30mM pH9のトリスCl緩衝液で、この薄膜を再水和して調製した。次いで、リポソームを浴音波処理器を用いてアルゴン下で30分間音波処理した。この複合体の直径を、動的光散乱によって測定した。他のペプチドには、チロシジン(U.S.バイオケミカルス)、ポリミキシンB(シグマ)及びポリリジン100(シグマ)が含まれ、これらもDNAと脂質を有する複合体を形成するために用いた。
トランスフェクション効率を、上述のようにCV−1細胞におけるルシフェラーゼの発現を測定することによってモニターした。これらの3つのトランスフェクションシステムにおいて添加されたDNAの量を比較する用量反応性を、図3に示す。細胞タンパク質mg当たりの光単位量を対数スケールでY軸にプロットし、添加されたDNAの量をX軸にプロットした。白い四角はグラミシジンS−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン−DNA複合体を用いた結果である。この複合体は、リポフェクチンを用いて得られたものよりも10倍大きいレベルの発現を誘導し、pH感受性リポソームを用いたものよりも1000〜10000倍大きいレベルの発現を誘導した。
B.グラミシジンS−DNA比の効果
グラミシジンS−DOPE−DNA複合体を、複合体に添加されるグラミシジンSの量を一定量のDNA(20μg)及びDOPE(170nmol)で変化させた以外は、実施例1Aで記述したように調製した。該複合体を、CV−1細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例1で記述したように測定した。結果は図4に示され、これは、DNAの電荷がグラミシジンにおける電荷によって中性化する場合に、グラミシジンS−DOPE−DNA複合体を用いた最大発現が起こることを説明している。
C.脂質濃度の効果
グラミシジンS−DOPE−DNA複合体を、複合体に添加されるDOPEの量を、一定量のDNA(20μg)及びグラミシジンS(40μg)で変化させた以外は、実施例1で記述したように調製した。該複合体を、CV−1細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例1で記述したように測定した。結果は図5に示され、これは、DOPEが無い場合では、発現が低いことを示している。グラミシジンS−DOPE−DNA複合体を用いた最大発現は、DOPE対グラミシジンSの比が5/1:モル/モルを越える場合に起こる。
D.脂質型の効果
グラミシジンS−脂質−DNA複合体を、複合体に添加されるリン脂質の型を一定量のDNA(20μg)及びグラミシジンS(40μg)で変化させた以外は、実施例1で記述したように調製した。用いられた脂質組成は、DOPE;DOPE:ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC):2/1、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、モノメチルDOPE(mmDOPE);ジメチルDOPE(dmDOPE);DOPC及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)であった。該複合体を、CV−1細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例1で記述したように測定した。結果は図6に示され、これは、ルシフェラーゼ活性の発現が、DOPE又は複合体中DOPE/DOPC:2/1の混合物を用いて最大となることを示している。ルシフェラーゼ活性は、DOPEのアミノ基が2(dmDOPE)又は3メチル基(DOPC)で置換される場合に、かなり減少する。コード化遺伝子の発現も、DPPEを用いた場合にかなり減少する。この後者の脂質は、飽和アシル鎖及び高い転移温度を有し、これは、DPPEのアシル鎖が一連の試験された他の脂質よりも一層流動性が低いことを意味する。
E.添加された非両親媒性の正帯電スペルミジンの効果
実施例2で示されるデータは、グラミシジンS−DOPE−DNA複合体による遺伝子発現が、DNAにおける負帯電がグラミシジンにおける正帯電によって中性化される場合に、最大になることを示す。電荷中性化又は膜透過化が、本システムを用いた遺伝子輸送において、より重要であるかを決定するために、グラミシジンSによって付与される正電荷が、正に帯電したポリアミド、スペルミジンによって、どんどん置換させた。グラミシジンS−脂質−DNA複合体を、複合体に添加されるグラミシジンSの量を一定量のDNA(20μg)で変化させた以外は、実施例1で記述したように調製した。DNAを中性化するために要求される必要な正電荷は、スペルミジンによって供給された。該複合体を、170nmolのDOPEによって、又は用いずに調製した。該複合体を、CV−1細胞へ添加し、ルシフェラーゼ活性を実施例1で記述したように測定した。結果は、細胞タンパク質mg当たりの光単位量で示されるルシフェラーゼ活性によって、下記表1に挙げられている。最初の活性は、常に、複合体中にDOPEが存在する場合に一層大きくなった。DOPEが存在しない場合では、スペルミジンによってグラミシジンSによる正電荷を連続的に置換することは、二相応答を引き起こす。ルシフェラーゼの発現は、DOPEの存在下で得られる最大応答よりも約100倍小さい値まで、最初に増加する。グラミシジンSによる電荷中性化のパーセントが25%より低い場合には、トランスフェクション活性は全くなくなった。従って、グラミシジンSの膜透過化機能は、電荷中性化機能よりも一層重要である。
F.他の正帯電ペプチドの使用
ペプチド−DOPE−DNA複合体を、複合体に添加されるペプチドの型を一定量のDNA(20μg)及びDOPE(170nmol)で変化させた以外は、実施例1で記述したように調製した。用いられたペプチドは、ポリミキシンB、環状カチオン性ペプチド即ちポリリジン、直鎖カチオン性ペプチド即ちチロシジン、グラミシジンSに類似した構造を有するが1つの正電荷のみを含む環状カチオン性ペプチド並びにグラミシジンSであった。ルシフェラーゼプラスミドも、リポフェクチンを用いて細胞へトランスフェクトされた。複合体をCV−1細胞へ添加し、実施例1で説明したようにルシフェラーゼ活性を測定した。図7は、グラミシジンSが最も大きい発現レベルであり、関連した環状ペプチド、チロシジンがそのすぐ後に続いていることを示している。両方の環状ペプチドは、細胞へのDNAの輸送の際にリポフェクチンよりも優れていた。活性は、他の2つのペプチド、ポリミキシンB及びポリリジンによっても認められたが、これら2つのカチオン性ペプチドにより仲介されるルシフェラーゼ発現のレベルは、グラミシジンS又はチロシジンにより誘導される場合よりも劣っていた。
G.DNA−デンドリマー複合体及びDNA−ポリリジン複合体仲介トランスフェクションの比較
ポリリジンのようなポリアミンポリマーに対するより良い化学的に定義された交換物を見出すために、我々、はスターバースト(Starburst)(商品名)デンドリマー(樹状体)微粒子、トマリア(Tomalia)ら、前述、としても知られている親水性分岐ポリカチオン高分子体を用いて、DNAによって、又はDNA及び透過化両親媒性ペプチド、GALAによって、複合体を形成した。R.パレンテ(Parente)ら、Biochemistry(1990)29:8720-8728。複合体を、ポリスチレン管において、12μgのpCluc4プラスミドを660μlのHBS(20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4)に希釈することによって調製した。ポリリジン(シグマ・ケミカル社)又は5世代スタートバースト(商品名、以下、省略)デンドリマー微粒子(1nmol)(ポリサイエンス社)を、340μlのHBSに溶解し、DNA溶液へゆっくりと(1滴ずつ)添加した。これらの条件下では、ポリリジンのエプシロン位アミノ基からの、又は該デンドリマーの末梢アミンからの正電荷は、プラスミドの負電荷よりも1.3倍過剰である。ペプチドGALAを添加する場合、GALAにおける負電荷が該デンドリマーにおける過剰な電荷を中性化するように添加した。この混合物を、室温での最終添加後に30分間静置して、その後500μlの該混合物をCV−1細胞へ添加した。トランスフェクションプロトコールを、上述のように実施した。この実験では、最もよいトランスフェクションプロトコールは、GALA−デンドリマー−DNA複合体で達せられ、次いで、デンドリマー−DNAそれから、ポリリジン−DNAで達せられた。結果は、下記表2に示してある。
実施例2
反応性及び機能性化スペルミジンビス−アクリジンの合成
スペルミジンビス−アクリジン誘導体(図8に合成が示されている)を、1×104(pH7.4;0.2M NaCl)より大きい親和定数を有する二重鎖核酸へインターカレートさせ、DNAに対する種々のターゲティング分子を結合するように用いることができる。糖質、ペプチド、ホルモン、ビタミン、補因子、タンパク質又は抗体を、ターゲティングリガンドとして全て用いることができる。
A.スペルミジンビス−アクリジン
体の所定の部位に核酸を向けるためのスキームは、二重鎖DNAへの細胞表面成分と相互作用するリガンドのインターカレーションに基づいている。スペルミジンの選択的N4−アシル化の手順は、N1,N8−ビス(t−ブトキシカルボニル)スペルミジンを出発物質として用いて、報告されている。R.J.バーゲロン(Bergeron)ら、Synthesis(1982)689-692。我々は、この方法を用いて(図8)酸機能性化ガラクトシル誘導体9(n=1)及び9′(n=4)をN1,N8−tBoc保護スペルミジン(15)の二級アミノ基に連結して、得られたガラクトシル化スペルミジン17及び17′を、脱保護の後に、標準的な化学手順により9−フェノキシアクリジンを用いて更にアルキル化し、ビスインターカレーター化合物21及び21′へそれを変換した。カルボン酸機能性化ガラクトシル誘導体の合成は、詳細に記述され(J.ヘスラー(Haensler)ら、Biochim.Biophys.Acta.(1988)946:95-105)、これらは広い範囲の糖質リガンドに簡単に適用可能である(M.M.ポンピポン(Ponpipom)ら、J.Med.Chem.(1981)24:1388-1395。表題の化合物を総収率30%で得て、NMR及び質量分析計のデータは、この提案された構造と矛盾しない。
B.活性化スペルミジンビス−アクリジン
上記スキームに基づいて、ペプチドをスペルミジンビス−アクリジン誘導体に結合するための色々な方法が開発されている。N1,N8−ビス(t−ブトキシカルボニル)スペルミジンは(15)、N−スクシンイミジル−4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)(4)によりN4−アシル化され、脱保護され、アクリジンとカップリングして、マレイミド基を有するビスインターカレーター(20)を作製した。単一化合物を、ケイ酸におけるクロマトグラフィー精製後に、25%総収率で得た。NMR及び質量分析計の結果は、定められた構造と矛盾しない。
C.NLSに連結したスペルミジンビス−アクリジン
NLSペプチド、PKKKRKV(カネダら、Science(1989)243:375-378)及び同一組成であるが異なる配列の対照ペプチドを、ABI自動ペプチド合成機において、N末端システイン残基を用いて合成した。その後、システインペプチドを、マレイミド基含有インターカレーター(図9)に結合して、二重鎖核酸へ固定(アンカー)することができる。
D.生分解性リンカー
lys−lysペプチド結合から成る生分解性リンカーを、図10に示されるようにして合成する。図では、ガラクトース残基を、未保護アミンに配置する。或いは、2つの隣接したリジン残基を含む保護ペプチドを、固相合成によって合成する。ペプチドは、膜透過化機能又はターゲティング機能をもたらし、アクリジン残基を、リジン上の2つのε−アミノ基に添加する。
実施例3
ガラクトシル化インターカレーター及びアグルチニンによるpCluc4プラスミドのゲル遅延アッセイ
実施例2のガラクトシル化ビス−アクリジン21及び21′(21′は、ガラクトースが3つの余分の炭素によってスペルミジンビス−アクリジンと区別されている21のホモログ(同属体))が、DNAに結合している間に可溶性リセプターと相互作用できるかを決定するために、我々は、ゲルシフトアッセイを用いた。このアッセイではガラクトース結合タンパク質、リシナス・コミュニス(Ricinus Communis)レクチンRCA120を、ガラクトシル−ビス−アクリジン−DNA複合体と共にインキュベートした。このタンパク質が該複合体と相互作用して、該複合体がDNAと結合したままの場合に、DNAは、電気泳動ゲルへ移動しない。プラスミドpCluc4の各試料(2μl;140ng)を、13.5pmolの21又は21′と混合し、次いで1μl(33.3pmol)のRCA120を加え、表示の際に、過剰のフリーなガラクトース(1.35nmol)を添加した。室温での30分のインキュベーションの後に、試料を0.04Mトリスアセテート緩衝液システム(pH7.6)を用いて0.8%アガロースゲルに電気泳動させ、エジチウムブロマイドで染色してDNAを可視化した(図11)。
ガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンのpCluc4プラスミドへのインターカレーションは、化合物21′(レーンB)又は21(レーンE)と複合化した場合にプラスミドに認められる遅延によって示される。ビス−アクリジンのDNAへのインターカレーションは、超らせん形態から弛緩環状形態への変化をもたらし、これはゆっくりと移動する。
プラスミド−ガラクトース複合体のガタクトースに対する可溶性リセプターへの結合可能性は、リシナス・コミュニスのレクチンRCA120の存在下で、複合体の殆ど完全な遅延によって示される(レーンC及びF)。RCA120はダイマーであり、末端のβ−D−ガラクトース残基に選択される2つの結合部位を有し、従って、プラスミド−ガラクトース複合体に架橋することもできる。化合物21又は21′と複合化した場合のプラスミドpCluc4とのRCA120の相互作用は、ゲルへ浸透しない巨大な凝集体の形成をもたらす。この相互作用は、プラスミドが21とよりも21′と複合化する場合に、より一層効果的であるようだ。プラスミドに架橋するために、RCA120は、隣接するプラスミド間に存在する静電反発を打開しなければならない。従って、化合物21′によってもたらされる複合体の場合のように、スペーサーアームによってガラクトースをプラスミドの表面から離すことは、レクチンの結合をより容易にする。多価の相互作用の結果として、RCA120により形成されるプラスミド凝集体は、かなり安定であり、100倍過剰な競合する1価のリガンド例えばガラクトースによって分解されない(レーンD及びG)。
実施例4
エチジウムブロマイド置換アッセイを用いたビス−アクリジンの二重鎖DNAへの結合
ウシ胸腺DNAに対するビス−アクリジンの親和性は、二重鎖核酸からのエチジウムブロマイドの置換によって概算された(ニールセン、前述)。エチジウム置換を、DNAから放出される際に起こるエチジウムブロマイド蛍光(ex.=540nm、em.=610nm)の減少によってモニターした。エチジウムブロマイドに相関するビス−アクリジンの結合定数は、IC50によって概算される。この研究では、記述されたように(ニールセン、前述)合成されたスペルミジンビス−アクリジントリヒドロクロライド(SBA・3HCl)を、参照化合物として用いた。3つの正電荷の1つを失った結果、スペルミジンビス−アクリジンのN4 アミノ基が、化合物21(Gal−bA・2HCl)のターゲティング糖質によってアミド結合に引き込まれる際に、親和性における僅かだが顕著な減少が認められる。しかし、我々は、スペルミジンビス−アクリジンが高く正に帯電したNLSペプチドPKKKRKVに連結される際に、親和性における増加を推測した。G.カラップ(Karup)ら、Int.J.Peptide Protein Res.(1988)32:331-343。
種々の実施例でDNAに対するターゲティングリガンドを攻撃するように合成された種々のビスアクリジン結合体の結合定数が、表3に示されている。
種々のビス−アクリジンにおける結合定数は、2−Merによる非共同競合結合を介した直線格子についての4−Merの結合親和性を測定する方法(A.ウォルフェ(Wolfe)及びT.メエハン(Meehan)、J.Mol.Biol.,223:1063-1087, 1992)及びエチジウムブロマイドに対する5.3×10-6Mの内因性解離定数を用いることによって、エチジウムブロマイド置換アッセイから算出された。
実施例5
ビス−アクリジンガラクトシルリガンドの細胞表面リセプターへのDNAターゲット能
ガラクトシルターゲティングリガンドを含有するビス−アクリジンインターカテーターのターゲティング能を制御する因子を証明するために、ラット肝細胞を、ラット肝臓から単離し、5%ウシ胎仔血清及び抗生物質を含有する最少必須培地3mlに、60mmペトリ皿中で106肝細胞の密度で培養した。肝細胞が、アシアロオロソムコイドを結合することによってガラクトースリセプターを有することが示されることが示された。37℃で18時間後に培地を取り除き、1mlのMEMで置換した。その後、100μlの水中、SBA・3HCl、Gal−3−bA、Gal−6−bA又はGal3−Lys2−bAと複合化された1μgの125I標識化プラスミドDNAを、培養皿に添加した。インターカレーター対プラスミド比は、500:1又は1000:1であった。細胞を、更に1時間37℃で培養し、その後にゆすぎ、タンパク質を1mlのNaOH(1N)中で消化した。細胞溶解物を、放射能活性についてカウントし、タンパク質を測定した。細胞結合プラスミドの量をngのプラスミド/mgの細胞タンパク質で表示し、複合化剤の機能としてグラフ化した(図12)。3つ全てのガラクトシルビス−アクリジン化合物が、DNAと結合し(表2)、可溶性ガラクトース結合タンパク質と相互作用することができる(実施例3)が、Gal3−Lys2−bAのみは、細胞表面リセプターと相互作用することができた。従って、細胞表面リセプターへの効果的なターゲティングは、細胞表面リセプターと相互作用することができるGal3−Lys2−bA(合成は、図13及び実施例6に示されている)によってもたらされる一層長いスペーサーアームを必要とする。
実施例6
3つのターゲティングリガンドを含む生分解性ビス−アクリジン:トリガラクトシル化スペルミジンビス−アクリジンの合成
この分子の完全な合成は、図13に示されている。
L−リジル−L−リジンビス−トリフルオロアセテート(22)の合成: N−ε−tBOC−L−リジン(603mg、2.45mmol)及びNα,Nε−ビス−tBOC−L−リジン−p−ニトロフェニルエステル(2.28g;4.9mmol)を、640μlのN,N−ジイソプロピルエチルアミン(3.7mmol)を含有する40mlのN−メチルモルホリン中で混合した。該混合物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌し、ろ過して不溶性の微量な未反応Nε−tBOC−L−リジンを取り除いて、高減圧下で乾燥状態まで蒸発させた。残渣をCHCl3/CH3OH/H2O 9:1:0.1系で溶出されるシリカゲルカラム中で精製して、1.22gの精製tBOC−保護化リジンダイマーを得た;収率は87%であった。
脱保護: 700mg(1.2mmol)のtBOC−保護化リジンダイマーを含有する冷フラスコ(ドライアイス)に、5mlのTFAを添加した。この混合物を室温まで温めて、アルゴン下で攪拌した。30分間の攪拌後、トリフルオロ酢酸を減圧下で蒸発させた。残渣をアセトン中に取り出し、蒸発させた(5回)。最終的に、該残渣を、14mlの水に再溶解し、8mlのクロロホルムで3回抽出して、凍結乾燥して、480mgの表題の化合物を得た;収率は80%であった。
保護化トリガラクトシルリジンダイマー: Nα−〔Nα−Nε−ビス(6−(1−チオ−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル))ヘキサノイル〕−L−リジル−Nε−(6−(1−チオ−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル))ヘキサノイル〕−L−リジン(23)の合成:
505μlのトリエチルアミン(3.6mmol)を含有する8mlの無水DMF中、L−リジル−L−リジンビス−トリフルオロアセテート(400mg;0.8mmol)の溶液に、p−ニトロフェニル−6−(1−チオ−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)ヘキサノエート(1.44g;2.4mmol)を添加した。この混合物を、アルゴン下で一晩攪拌して、乾燥状態まで蒸発させた。残渣を、シリカゲルカラム上のクロマトグラフィーにより精製し、CHC13/CH3OH/H2O 90:10:0.5で溶出して、463mgの表題の化合物を得た;収率は35%であった。
MS: 計算値:C73H112N4O32S3 m/z=1652、実測値:m/z=1653.6(M+H)+、m/z=1677.6(M+Na)+、m/z=1693.6(M+K)+.
選択的にブロックされたスペルミジンとの反応:
N4−〔Nα−〔Nα,Nε−ビス(6−(1−チオ−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル))ヘキサノイル〕−L−リジル−Nε−(6−(1−チオ−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル))ヘキサノイル〕−L−リジル〕−Nl,N8−ビスtBOC−スペルミジン(24)の合成:
化合物23(132mg;80μmol)を、5mlの無水塩化メチレン中、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミンダイド(DCC)(20mg;97μmol)の存在下、N−ヒドロキシサクシンイミド(11mg、96μmol)によるエステル化によって活性化した。アルゴン下、室温での4時間の攪拌後、ウレア沈殿物をろ過によって取り除き、ろ過物を減圧下で蒸発させた。乾燥残渣を、3mlのアセトニトリルに再溶解し、14μlのトリエチルアミン(100μl)を含有する3mlのアセトニトリル中のN1,N8−ビス(t−ブトキシカルボニルスペルミジン)塩酸(30mg;80μmol)の溶液へ、1滴ずつ添加した。該混合物をアルゴン下、室温で48時間更に攪拌し、減圧下で蒸発させて、残渣をシリカゲルカラム中で精製して、CHCl3/CH3OH/H2O 90:10:1で溶出して、71mgの表題の化合物を得た;収率は45%であった。
脱保護: N4−〔Nα−〔Nα,Nε−ビス(6−(1−チオ−β−D−ガラクトピラノシル)ヘキサノイル〕)−L−リジル−Nε−(6−(1−チオ−β−D−ガラクトピラノシル)ヘキサノイル〕−L−リジル〕スペルミジン(25)の合成:
化合物24(71mg;36μmol)を、化合物17(実施例2Aを参照のこと)について前述されたように脱保護した。tBOC保護基を、5mlのTFAで30分間処理してスペルミジンリンカーから取り除き、アセチル保護基をCH3OH/NEt3/H2O 5:4:1の混合物で一晩処理してガラクトシル頭部基から取り除いた。スペルミジン誘導体のビストリフルオロアセテート塩を、小型バイオラド AG 1X2(OH− )カラムに該塩の水溶液を通すことによって、フリーのアミンに変換した。糖質及びアミンについて陽性の分画を、一緒に集めて凍結乾燥して、36mgの化合物25を得た;収率は79%であった。
アクリジン結合: N4−〔Nα−〔Nα,Nε−ビス(6−(1−チオ−β−D−ガラクトピラノシル))ヘキサノイル〕−L−リジル−Nε−(6−(1−チオ−β−D−ガラクトピラノシル)ヘキサノイル〕−L−リジル〕−N1,N8−ビス−アクリジンスペルミジン(26)(“Gal3−Lys2−bA”)の合成:
化合物25(36mg;28.5μmol)及び18mgの9−フェノキシアクリジンを、3gのフェノールに80℃で溶解し、該溶液を、アルゴン下80℃で更に2時間攪拌した。その後、該混合物を約40℃まで冷やし、15mlのエーテルに注いで、アミノアクリジンを沈殿させた。黄色の沈殿物を、濾紙上にろ過によって回収し、4mlのブタノール/エタノール混合物3:1中に再溶解した。その後、この溶液を約1mlまでの蒸発により濃縮し、ビス−アクリジン誘導体をシリカゲルカラムにおけるクロマトグラフィーによって単離して、n−ブタノール/ピリジン/酢酸/水6:2:1:2で抽出して、34mgの表題の化合物を得た;収率21%であった。
MS: 計算値:C81H117N9O20S3 m/z=1631、実測値:m/z=1632.8(M+H)+、m/z=1654.8(M+Na)+.
実施例7
核局在性配列を用いたトランスフェクションアッセイ
微量の5kbの放射性ヨウ素化プラスミド(CMV−βGal)を含む5μlのトリス−EDTA(TE)と、実施例2−Cの核局在性ペプチド−ビス−アクリジン結合物8nmolを含む50μlの水とを、45μlのTE緩衝液(pH8)中で、溶液中80μgのpCluc4(123neq.bp)に添加した。プラスミド対ペプチド結合物の比は、1:300であった。室温での1時間の静置後に、100μlのトリス−Cl緩衝液(pH9)を該複合体へ添加して、得られた溶液を、pH感受性リポソームの調製のために、600μlのエーテル中に溶解した12μmolの脂質(DOPE/CHEMS 2:1、モル比)と混合した。
DNA−ペプチド複合体を含有する小胞を、ファイコール密度勾配にリポソームを浮かせることによって、未被包化物質から分離した。被包化効率(20%±4%)を、動的光散乱(コルターN4、コルトロニクス)によって測定した。
細胞を4μlのリポソーム−被包化プラスミド(100μlのリポソーム溶液)を用いて、37℃5時間でトランスフェクトして、リシフェラーゼ活性を生物発光計において48時間後にカウントした。表4は、測定された光単位量/mg細胞タンパク質を、リポソーム内容物の機能として示している。値は、3回の測定の平均である。
pH感受性リポソームが、宿主細胞の細胞質へその内容物を送達するならば、裸のプラスミドは、核を透過することができなければならない。
ペプチド−ビス−アクリジン結合物が分解からDNAを保護しないならば、観察されたトランスフェクション促進は、増加された核エントリーの結果でなければならない。4〜5倍増加したトランスフェクションは、公開された結果と一致しており(カネダら、Science(1989)243:375-378)、これは、DNAに結合して、核へのDNAエントリーを促進するタンパク質を用いている。SNLペプチドとWTcysペプチドの両方が発現を増加し、核へDNAを向ける便利な技術である。
実施例8
カチオン性胆汁酸塩の合成
A.Nα−ベニズルエステルのα−コール酸アミド、Nε−tBOC−アミノリジンの調製
合成は、S.ベルグストロン(Bergstrom)ら、Acta.Chem.Scand.,(1953)7:1126に基づいている。204mg(0.500ミリモル)のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に計り、2.5mlのジオキサン及び70μl(0.500ミリモル)のトリエチルアミンを、このチューブへ添加した。この混合物を、氷浴中で、溶液が固体化するまで(約12℃)冷やした。65μl(0.500ミリモル)のイソブチルクロロホルメートを添加して、反応チューブを振り、氷浴へ戻した。或いは、このチューブを取り出して、浴に移し、初期の固体化の時点の温度に30分間、維持した。
Nα−ベニズルエステル Nε−tBOCリジン(0.500ミリモル)及び70μl(0.500ミリモル)のトリエチルアミンを0.6mlの水に懸濁した。該混合物を氷浴中で冷し、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を他の0.5mlの氷水を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、氷浴中に1/2時間置き、その後、室温まで温めた。
有機溶媒の殆どを、アルゴンガスの気流下で蒸発させ、残渣を3mlまでの水に解かした。5%水性炭酸ナトリウムを、pHが9になるまで1滴ずつ添加した。該混合物を3mlのエチルエーテルで3回、抽出して、水相を保持した。
水相残渣に、0.5Nの塩酸をpHが4になるまで添加した。該混合物を3mlのエチルエーテルで3回、抽出して、水相を保持した。
水相残渣のpHを、0.5Nの塩酸で4までに調整し、3mlのエチルアセテートへ5回抽出した。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧下で乾燥状態になるまで蒸発させ、284mgの無色の粉末溶融物を得た。ε−アミンのためのtBoc保護基を、標準方法で取り除き、コール酸の正に帯電したリジン誘導体を得た。同様の方法で、コール酸の他の正に帯電した誘導体を調製することができる。
B.トリス(2−アミノエチル)アミンのコール酸アミドの調製
多重アミン基が、活性化コール酸へカップリングすることに有効である場合、該アミノ酸を、実施例8Aで記述したように調製された6倍量の活性化胆汁酸塩に添加する。合成は、バルグストンら、前述、の方法に基づいている。204mg(0.500ミリモル)のコール酸を、回転式キャップで閉めたテストチューブ中に計る。2.5mlのジオキサン及び70μl(0.500ミリモル)のトリエチルアミンを添加する。氷浴中で、溶液が固体化するまで(約12℃)冷やす。65μl(0.500ミリモル)のイソブチルクロロホルメートを添加して、反応チューブを振った後に、氷浴へ戻した。或いは、このチューブを取り出して、浴に移し、初期の固体化の時点の温度に30分間、維持した。
(300ミリモル)のトリス(2−アミノエチル)アミン及び0.6mlの水中、70μl(0.500ミリモル)のトリエチルアミンを添加する。氷浴中で冷やし、ジオキサン反応混合物へ添加して、この内容物を他の0.5mlの氷水を用いて、反応混合物中へリンスした。チューブを、氷浴中に1/2時間置き、その後、室温まで温めさせた。
有機溶媒の殆どを、アルゴンガスの気流下で蒸発させる。残渣を3mlまでの水に解かす。5%水性炭酸ナトリウムを、pHが7になるまで1滴ずつ添加する。該混合物を3mlのエチルエーテルで3回、抽出して、水相を保持する。
水相残渣に、0.5Nの塩酸をpHが4になるまで添加する。3mlのエチルエーテルで3回抽出して、水相を保持する。
水相残渣のpHを、0.5Nの塩酸で4までに再調整し、3mlのエチルアセテートへ5回抽出する。これらのエチルアセテート抽出物を一緒にして、減圧下で乾燥状態になるまで蒸発させて、トリス(アミノエチル)アミンのコール酸アミドを得る。
実施例9
ポリエチレングリコール−ビス−アクリジンの合成
PEG結合ビス−アクリジンスペルミジンを下記の標準化学的に合成し、それは、下記の工程に関連する。
R′O−(CH2−CH2−O)n−H −−−−活性化剤−−−−→
R′O−(CH2−CH2−O)n−R* −−−−ビス−アクリジン−−→
R′O−(CH2−CH2−O)n−R−ビス−アクリジンは、R′=H又はCH3、及びR*=活性化する基及び、n=10−250、好ましくは、20〜60である。
活性化モノメトキシPEG分子又は活性化PEG分子を調製する方法は、沢山ある。好ましい方法は、D.ラーウッド(Larwood)とF.スゾッカ、J.LabelledComp.& Radiopharm.(1984)21:603-614に記述されている。ポリエチレングリコール 1900 カルボニルイミダゾールメチルエーテルを、2mlの乾燥塩化メチレン中、530mg(0.28mmol)の乾燥PEG 1900 モノエチルエステルを取り、78mg(0.46mmol)のカルボニルジイミダゾール及び10mg(0.11mmol)のイミダゾール(ナトリウム塩)に添加して調製した。一晩攪拌した後、6mlの乾燥塩化メチレンを添加し、該混合物を3.75mlの水で抽出し、それから無水ナトリウムサルフェートで乾燥した。ろ過後、溶媒と取り除き、定量的に得た。或いは、該溶媒を取り除いて、得られた油分を、−20℃でクロロホルム/ジエチルエーテルにより再結晶した。得られたイミダゾールカルバメート白色結晶を、よく冷やした漏斗を通してろ過し、少量のジエチルエーテルでゆすいで、すぐに使用した。
イミダゾールカルバメート(0.1mM)を、0.125mMのN,N′−ビス−(9−アクリジニル)−4−アザ−1,8−ジアミノオクタン(“ビス−アクリジン−スペルミジン”、これは、P.ニールセン、Eur.J.Biochem.122:283-289,1992に記述されているように調製した)に添加し、フェノールに溶解して、アルゴン下で2時間反応を進ませる。該混合物を乾燥状態にして、黄色の生産物を、まず冷エタノールで、次いでジエチルエーテルで洗浄する。PEGをカルバメート結合を介して、ビス−アクリジンスペルミジンの二級アミンに結合し、モノメトキシPEG−ビス−アクリジンスペルミオジンを形成する。これは水に可溶性である。
同様の方法で、非ブロック化PGE(分子量6000)を、上述のように活性化してビスイミダゾールカルバメートPEGを形成する。このビスイミダゾールカルバメートPEGは、2.5倍量のビス−アクリジンスペルミジンと反応させて、ビス(ビス−アクリジンスペルミジン)−PEG 6000を形成する。
PEG及びモノメトキシPEGのための種々の型の活性化剤が、ウッドル(Woodle)らの米国特許第5,013,556号に記載されている。これらの方法を、種々の化学を介してビス−アクリジン分子に結合することができる反応性PEGを生成するために、用いることができる。例えば、モノメトキシ−PEGを含むスルフヒドリルは、実施例2Bのマレイミド含有ビス−アクリジンに結合することができる。
実施例10
PEG−ビス−アクリジンによるDNAマスキング
PEG分子を用いてDNAの表面をマスクすることができ、DNAを、長期間にわたって循環させることができる。放射性ヨウ素化プラスミドDNAを、実施例9で合成されたようなモノメトキシ−PEG 1900−ビス−アクリジンスペルミジンと、20bp−DNA対1PEG分子の比で、30分間室温で混合する。少量の複合体、PBS0.2ml中の5μgのDNAを、12匹のマウス群の各々へ、尾静脈を介して注入する。マウスを、注入後の種々の期間で犠牲死させる。血液及び他の器官を取り出して、各器官に結合した放射能活性を測定する。モノメトキシPEG−ビス−アクリジンスペルミジンに複合化してないDNAを、マウスの第2群へ注射する(対照マウス)。10分後に、15%の放射能活性プラスミドDNAが、対照マウスの血液中に残存するが、モノメトキシPEG−ビス−アクリジンスペルミジンDNA群では、顕著に大きいレベルの放射能標識化プラスミド−PEG複合体が循環系に残存することは、PEG−ビス−アクリジンスペルミジンによるDNA分子の明確なマスキング効果を示している。
実施例11
レシチンアシルアミンマスキング剤の合成
ポリヌクレオチドマスキング脂質の合成は、標準的な化学によって達成され、例えばC.ピジョン(Pidgeon)ら、Anal.Biochem.(1989)176:36-47に記載されている。
1. 1,12−ドデカンジカルボン酸+DCC
−−−−THF,25℃−−−−−−→
無水ドデンカンカルボン酸(環状無水物)
2. モノアシルリゾレシチン + 環状無水物
−−−−−CHCl3、DMAP、25℃、48時間−−−−→
レシチン − COOH
3. レシチン−COOH + カルボニルジイミダゾール
−−−−−CHCl3、25℃、2時間−−−−−−→
レシチンイミダゾリド
4. レシチンイミダゾリド + アミン反応剤
−−−−CHCl3、25℃、24時間−−−−−→
カチオン性レシチン
レシチンイミダゾリドとアミン反応剤との最終反応は、レシチンイミダゾリドの形成後すぐに行われる。レシチンイミダゾリド(0.1mM)を、クロロホルム中のアミン(0.7mM)の溶液へ添加する。このカップリングに好適なアミンは、明細書中に挙げられている。
室温での2時間後に、反応混合物を、2倍量の水/メタノールに添加し、そしてpHを10に調整する。レシチン結合アミンを、有機相へ抽出する。その後、有機相を0.1Mの塩化ナトリウムで洗浄し、有機相を乾燥状態にする。得られたアシルアミンレシチンを、ポリヌクレオチドの表面をマスクするために用いる。種々のリゾレシチン分子を、レシチン−COOHを調製するために用いることができ、これには、ドデシル、ミリストイル、パルミトイル、オレイル若しくはフィタニル又はステアリルが含まれる。他の頭部基例えばエタノールアミン又はホスファチジン酸を、活性化工程で好適に保護され、反応の最後に脱保護されるならば、レシチンに換えることができる。
実施例12
レシチンアシルアミンによるDNAマスキング
実施例11のレシチンアシルアミンを、エタノール溶液からのDNAへ、DNA上の各リン酸基に対して1の正電荷の割合で、添加することができる。該分子を、DNAの表面をマスクするために用いて、DNAを長期にわたって循環可能にすることができる。少量の複合体、PBS0.2ml中、5μgのDNAを、12匹のマウス群の各々へ尾静脈を介して注入する。マウスを、注射後の種々の時期で犠牲死させる。血液及び他の器官を取り出し、各器官に結合した放射能活性を測定する。レシチンアシルアミンに複合化していないDNAを、第2の群のマウスへ注射する(対照マウス)。10分後に、15%の放射活性プラスミドDNAが対照群のマウスにおける血液中に残存しているが、モノメトキシPEG−ビス−アクリジンスペルミジンDNA群において顕著に大きいレベルの放射標識化プラスミドPEG複合体が循環系に残存することは、レシチンアシルアミンによるDNA分子の明確なマスキング効果を示している。
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