KR100543470B1 - 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주및 그 제조방법 - Google Patents

사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 외래 유전자의 발현 숙주 균주로써 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(B. polyfermenticus) SCD를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 형질전환체를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 외래 유전자 발현 시스템을 사용하여 저가의 생산비용으로도 재조합 단백질을 대량생산할 수 있고 순도 및 균질성이 뛰어난 재조합 단백질을 얻는 뛰어난 효과가 있다.
사이클로덱스트리나아제, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD, 바실러스 서브틸리스 BD 170, 플라스미드

Description

사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주 및 그 제조방법{Recombinant Bacillus expressing cyclodextrinase and method for preparation thereof}
도 1은 카나마이신을 포함한 LB 아가 배지에서 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에 대한 최소세균농도(MBC)의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에서 플라스미드 존재 여부를 동정한 결과를 나타낸 젤 사진도이다.
도 3은 카나마이신을 포함하는 LB 아가 배지에서 pRB373 및 pKY1를 포함하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 형질전환체의 콜로니를 나타낸 것이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 BD 170 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에서 pRB373 및 pXyl373의 발현 패턴을 나타낸 젤 사진도이다.
도 5는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에서 pKY1의 발현 패턴을 나타낸 젤 사진도이다.
도 6은 본 발명 바실러스 발현 플라스미드 및 사이클로덱스트리나아제 발현 플라스미드의 구조를 도식화한 것이다.
도 7은 바실러스 서브틸리스 BD 170 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에서 pKYCD1 및 pKYCD2의 발현 패턴을 나타낸 젤 사진도이다.
도 8은 본 발명 바실러스 형질전환체의 사이클로덱스트리나아제 활성을 나타내는 I2-KI 염색 방법에 따른 투명환 형성 검사 결과이다.
본 발명은 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주 및 그제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 비피도박테리움 아돌레센티스 Int 57 유래의 사이클로덱스트라나아제 코딩 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 바실러스 균주와 그 제조방법에 관한 것이다.
프로바이오틱(Probiotics)이란 건강에 유용한 살아있는 미생물 식품으로써, 보통 상품으로 판매되는 건강한 인간의 장내 균총이다. 일반적으로, 비피도박테리움속(Bifidobacterium), 락토바실러스속(Lactobacillus), 엔테로코커스속(Enterococcus), 클로스트리디움 부트리컴(Clostridium butricum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 등이 인간에게 프로바이오틱으로 사용되어 왔다. 이들 프로바이오틱 박테리아는 장내 균총과 위장관 관련 기능장애를 정상화 시킬 수 있다.
한편, 녹말은 자연에서 가장 풍부한 저장 다당류 중 하나이다. 결론적으로, 많은 생물에서 녹말분해효소는 탄소원으로부터 에너지를 얻는데 중요한 역할을 담당하고 있다. 게다가, 녹말분해효소는 많은 산업공정, 주로 식품, 섬유산업 및 세 제산업에서 매우 유용하다. 사이클로말토덱스트린(Cyclomaltodextrins, CDs)은 사이클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제에 의해 녹말에서 얻은 α-1→4 결합으로 된 고리형의 비환원성 D-글루코우즈 올리고당에 속한다. CDs 가수분해효소인 사이클로덱스트리나아제(CDase), 사이클로말토덱스트리나아제, 사이클로말토덱스트린 하이드롤라아제(cyclomaltodextrin hydrolase)는 녹말보다 더 빠르게 사이클로덱스트린을 가수분해하는 효소이다. CDs 가수분해효소는 13개의 글리코사이드 하이드롤라아제 과에 속하는 효소로써 단지 녹말만을 가수분해하는 일반 α-아밀라아제와는 달리 CDs와 수용성 녹말을 가수분해할 수 있다.
또한, 비피도박테리움속(Bifidobacterium)은 숙주의 건강에 유익한 효과를 미칠 뿐만 아니라 비병원성이며, 그람양성균이고 혐기성 세균이며 인간과 동물의 장관에 서식하므로 "프로바이오틱"으로 불리곤 한다. 이들 중 바실러스 아돌레센티스(B. adolescentis)와 같은 종은 인간의 배변에서 발견되는 반면, 바실러스 서모필럼(B. thermophilum)같은 종은 동물을 제외하고 생물에서 발견된다.
바실러스속(Bacillus)은 산업상 주요한 종들을 포함하고 있으며 보통 생물산업에서 숙주로써 이용된다. 특히, 바실러스 서브틸리스는 높은 분비능, 잘 알려진 유전자 시스템, 비병원성 및 광범위한 발효기술 때문에 단백질 생산에 유용한 숙주 로 사용되어 왔다. 즉, 바실러스 서브틸리스는 외래 단백질 생산에 매우 매력적인 숙주라는 것이다. 바실러스 서브틸리스의 분비 메커니즘이 명백히 알려지지는 않았지만, 많은 연구자들은 원형생물 유래의 외래 단백질을 분비하는 데 있어 바실러스 종의 시그널 펩티드를 이용하는 데 성공했다. 또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(B. polyfermenticus SCD)는 한국과 일본에서 비피도박테리움과 더불어 프로바이오틱 세균으로 사용되어 왔는데, 이는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 인간의 내장에 위험한 발효에 대항할 수 있고 억제할 수 있을 뿐만 아니라 스스로 건강에 유익한 효과를 만들어 내기 때문이다. 상기 미생물은 보통 "비스루트" 균주로 불리며, 내생포자를 형성하는 간균으로써, 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 와 같은 몇몇 균주를 불활성화 시키는 폴리퍼멘티신 SCD로 알려진 박테리오신을 생성한다. 몇몇 연구에서, 비스루트 균주는 형태적 생화학적 특징면에서 바실러스 서브틸리스와 유사하다고 제안하였다. 그러나, 락토우즈를 대사할 수 있고 바실러스 서브틸리스와 비교하여 글루코우즈와 락토우즈로부터 각각 보다 많은 양의 아세트산과 젖산을 생산한다는 점에서 비스루트 균주는 바실러스 서브틸리스와는 엄연히 다르다. 비록 바실러스 종의 미생물생태학, 분류학 및 미생물생리학과 관련하여 특별한 정보들이 축적되어 있다 할 지라도, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(B. polyfermenticus) SCD에 대한 유전적 분석에 대해서는 상대적으로 연구가 거의 이루어지지 않았다. 현재까지, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD로부터 클로닝하였다는 보고는 없었다. 이는 적절한 유전자 전달시스템이 없었기 때문이다.
따라서, 본 발명의 목적은 프로바이오틱인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 외래 유전자의 발현 숙주로서의 가능성을 조사하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) Int 57 유래의 사이클로덱스트리나아제 코딩 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 바실러스 균주에 도입시켜 형질전환체를 제조하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체로부터 사이클로덱스트리나아제를 대량생산하고자 한다.
본 발명의 상기 목적은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 발현 숙주 균주로서의 가능성을 확인하고 비피도박테리움 아돌레센티스 Int 57의 염색체 DNA로부터 사이클로덱스트리나아제 코딩 유전자를 분리한 다음 이를 포함하는 재조합 플라스미드를 제작하여 바실러스 균주에 상기 플라스미드를 도입시켜 형질전환시키고 이로부터 사이클로덱스트리나아제를 발현시킴으로써 달성하였다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 발현 숙주 균주로서의 가능성을 확인단계; 비피도박테리움 아돌레센티스 Int 57의 염색체 DNA로부터 사이클로덱스트리나아제 코딩 유전자의 분리단계; 상기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터의 제작단계; 상기 벡터를 포함하는 재조합 바실러스 균주의 제조단계; 상기 재조합 균주로부터 사이클로덱스트리나아제를 발현시키는 단계로 구성된다.
본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드는 표 1과 같다.
균주 유전자형 참고문헌
비피도박테리움 아돌레센티스 Int 57 야생형 Park et al.,J. Microbiol.Biotechnol. 11, 106-111
바실러스 서브틸리스 BD 170 BGSC c1a42:trpC2,thr-5 Vyas et al.Enzyme Microbial. Technol. 16, 240-246
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 야생형 Park et al.,J. Microbial. Biotechnol. 12, 657-663
플라스미드 종류
p8A1 pUC18-amyR2 (B. subtilis var.natto의 프로모터 및 시그널 시퀀스 포함), Ammpr Yuuki et al.,J. Biochem. 98, 1147-1156
pRB373 B. subtilis / E.coli 셔틀벡터, Ampr, bler, neor Lam et al.,J. Biotechnol. 63, 167-177
pKY1 pRB373-((B. subtilis var.natto의 프로모터 및 시그널 시퀀스 포함), Ampr, neor
pBB702K pUC19-CD1, Ampr, Lacz'
pKYCD1 pKY1-CD1, Ampr, neor, bler
pKYCD2 pKY1-CD2, Ampr, neor, bler
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 통해 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 외래 유전자 발현 시스템에서 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 외래 유전자 발현 숙주로서의 가능성 조사
외래 유전자 발현 시스템에서 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(B. polyfermenticus) SCD의 외래 유전자의 발현 숙주로서의 가능성을 다음의 과정을 통해 조사하였다.
일반적으로 재조합 미생물을 선별하기 위해서는 특정 항생물질을 사용한다. 따라서, 이러한 항생물질 하에서 야생형 숙주 균주의 생장을 완전히 억제할 수 있는 최소세균농도(minimal bactericidal concentration, MBC)를 측정하여 재조합 미 생물을 선별하는데 필요한 항생물질의 농도를 결정하였다. 본 발명에서는 항생물질로써 카나마이신을 사용하였다.
최소세균농도를 측정하기 위해서, 카나마이신(kanamycin)을 아가를 포함한 LB 배지로 순차적으로 희석하여 제조하고(0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/mL) 이들을 페트리 디쉬에 분주하였다. 그 후, 배지 표면에 1 x 105의 생존세포수를 포함하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 배양액을 접종하였다. 16시간 동안 배양한 후, 형성된 콜로니로써 MBC를 측정하고 이를 관찰하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에 대한 카나마이신의 활성은 상기 물질의 미생물 생장 억제능으로 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 6.25 ㎍/mL 이하(e ~ i)의 카나마이신에서 내성을 나타냈지만, 그 이상의 고 농도(a ~ d)에서는 민감하였다. 상기 결과로부터 본 발명에서는 50 ㎍/mL의 카나마이신을 LB 배지에 첨가하여 재조합 미생물을 선별하는 데 사용하였다.
다음으로, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 자체 플라스미드를 포함하고 있는 지를 확인하기 위해, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 5 mL의 LB 배지에서 16시간 동안 배양한 후 원심분리한 다음, 미니프렙방법에 따라 알칼리 용해법을 약간 변형하여 플라스미드를 분리하였다. 정제한 용액을 8%의 아가로우즈 젤에서 전기영동하였다. 이때, 표준균주로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BD 170를 사용하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 표준균주로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BD 170(레인 2)과 비교하여 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(레인 3)에서는 플라스미드가 나타나지 않았다. 따라서, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 세포 내에 어떠한 플라스미드도 갖지 않음을 확인하였으며 외래 유전자의 발현 숙주로서의 사용 가능성을 확인하였다. M은 Hind III를 처리한 λDNA 사이즈 마커를, 레인 1은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 염색체 DNA를 나타낸 것이다.
다음으로, DNA 분자는 유전자 클로닝을 위한 도구로써 작용할 수 있는 몇몇 특징들을 가지고 있어야 한다. 즉, 숙주세포 내에서 복제할 수 있어서 재조합 DNA의 복제품들을 많이 생산할 수 있고 딸세포에게 전달할 수 있어야 한다. 바실러스를 포함하여 대부분의 세균 종들은 정상 환경 하에서 제한된 양의 DNA 만을 탑재할 수 있다. 이들 종들을 효과적으로 형질전환하기 위해서, 바실러스 균주들은 DNA 탑재능을 향상시키기 위해 물리 화학적 처리를 하여야 한다. 이러한 처리를 한 세포들을 컴피턴트 세포라고 부른다. 바실러스 서브틸리스 컴피턴트 세포를 얻는 방법은 이미 공지되어 있으며 다양한 변형 방법들이 공개되어 있다. 본 발명자는 Sadiae 및 Kada의 방법을 약간 변형하여 바실러스 컴피턴트 세포를 제작하고, 플라스미드 DNA(pRB373, pXy1373, pKY1)를 포함하는 바실러스 균주(바실러스 서브틸리스 BD 170 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD)의 형질전환을 실시하였다.
바실러스 균주를 형질전환하기 위해, SPMM I (0.2% 암모늄 설페이트, 1.4% 인산제2칼륨, 0.6% 인산제1칼륨, 0.1% 소듐 시트레이트, 0.02% 마그네슘 설페이트, 0.5% 글루코우즈, 0.2% 카사미노산) 및 SPMM II (0.5 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2이 첨가된 SPMM I)를 이용하였다. 수용체 세포를 5 mL의 0.5 x LB 브로스에 접종한 다음, 24 시간동안 배양하고, 상기 배양액 2 mL를 18 mL의 SPMM I 배지에 접종한 후, 배양액이 정지기 초기에 도달할 때까지 37℃ 에서 300 rpm으로 약 150분 간 격렬하게 진탕배양하였다. 다시, 상기 배양액에 미리 따뜻하게 해 둔 20 mL의 SPMM II 배지를 첨가하고 37℃ 에서 90분 간 180 rpm으로 약하게 진탕배양하였다. 1 mL의 세포 현탁액과 10 ㎍의 플라스미드 DNA와 혼합하였다. 상기 혼합액을 37℃ 에서 40분 간 180 rpm으로 진탕배양한 다음, 2 mL의 LB 배지를 첨가하고 37℃ 에서 1시간 동안 상기의 속도로 진탕배양하였다. 현탁액은 3,000 rpm에서 10분 간 원심분리하고 상등액은 버리고 펠렛은 100 ㎕의 멸균수로 현탁하였다. 그 후 50 ㎍/mL 의 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트에 이를 도말하고 그 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, kanamycinr 유전자를 포함한 플라스미드(pRB373(a) 및 pKY1(b))로 형질전환된 재조합 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 카나마이신 50 ㎍/mL을 포함한 LB 아가 플레이트 상에서 콜로니를 형성하였다.
도 4는 플라스미드 pRB373 및 pXy1373을 포함하고 있는 바실러스 형질전환체들을 제한효소 Pst I 를 처리하여 절단한 결과를 나타낸 젤 사진도이다. 도 4(a)에서, M은 사이즈 마커를, 레인 1은 pRB373을 포함하는 바실러스 서브틸리스 BD 170을, 레인 2는 레인 1의 DNA를 Pst I으로 절단한 결과를, 레인 3은 pXy1373을 포함하는 바실러스 서브틸리스 BD 170을, 레인 4는 레인 3의 DNA를 Pst I으로 절단한 결과를 나타낸 것이다. 또한, 도 4(b)에서, M은 사이즈 마커를, 레인 1은 pRB373을 포함하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를, 레인 2는 레인 1의 DNA를 Pst I으로 절단한 결과를, 레인 3은 pXy1373을 포함하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를, 레인 4는 레인 3의 DNA를 Pst I으로 절단한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 pXY1를 포함하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 제한효소 EcoR I/Xba I(레인 1), Kpn I/Xba I(레인 2) 및 BamH I/Xba I(레인 3)을 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 4와 도 5에 나타난 바와 같이, 벡터 pRB373, pXy1373 및 pKY1는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에 성공적으로 형질전환되었다.
상기 결과들로부터, 본 발명자는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 외래 유전자의 발현을 위한 숙주로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 사이클로덱스트라나아제 코딩 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 및 형질전환체의 제조
상기 실시예 1을 통해 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 외래 유전자를 발현하기 위한 숙주로 사용될 수 있음을 확인하였다. 외래 유전자를 발현하는 재조합 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 제조하기 위해서는 우선 외래 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제작하여야 한다. 본 발명에서는 외래 유전자로써, 비피도박테 리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) Int 57 유래의 사이클로덱스트리나아제의 코딩 유전자를 사용하였다.
우선, Demuyter의 방법에 따라 페놀추출방법을 변형하여 비피도박테리움 아돌레센티스 Int 57로부터 염색체 DNA를 분리하였다.
두 번째로, 바실러스 균주에서 외래 유전자의 분비를 위한 프로모터 및 시그널 시퀀스를 분리하기 위해 플라스미드 p8A1를 사용하였다. 상기 플라스미드는 바실러스 서브틸리스 베리에이션 나토(B. subtilis var. natto)에서 α-아밀라아제의 과다발현 프로모터로써 알려져 있는 아밀라아제 프로모터 부위(P)와 시그널 시퀀스(S.S)를 포함하고 있다. 또한, 바실러스 분비 플라스미드를 제작하기 위해, 바실러스 서브틸리스-이 콜라이 셔틀 벡터(pRB373)를 이용하였다. pRB373 셔틀 벡터는 2개의 복제 오리진, 이 콜라이 및 바실러스 서브틸리스에서 작용할 수 있는 항생물질 내성 유전자 (Ampr, Bler 및 Kmr), 외래 유전자의 발현을 위한 T1 및 T0 전사 종결인자 및 복수 클로닝 사이트(multiple cloning site)를 포함하고 있다. 상기 두 플라스미드에 제한효소 Xba I/BamH 1 을 처리한 다음 라이게이션 시켜 pKY1을 제작하여 복수 클로닝 사이트에 바실러스 서브틸리스 베리에이션 나토(B. subtilis var. natto)의 아밀라아제 프로모터 및 시그널 시퀀스를 포함하도록 하였다. 상기로부터, 바실러스 균주에서 외래 유전자의 분비를 위한 발현 플라스미드 시스템을 제작하기 위해 상기로부터 얻은 pKY1 벡터를 사용하였다.
세 번째로, 외래 유전자로써 비피도박테리움 아돌레센티스 Int 57 유래의 사 이클로덱스트리나아제 코딩 유전자를 사용하였으며, 이를 포함하는 플라스미드 pBB702K를 제작하였다.
네 번째로, 플라스미드 pKY1과 pBB702K에 EcoR I/Sac I을 처리한 다음, 라이게이션 시켜 pKYCD1을 제작하고, Sma I/EcoR V 제한효소로 절단한 후 셀프라이게이션에 의해 pKYCD2 플라스미드를 제작하였다. 발현 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자를 포함하고 있어 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 선별에 이용하였다.
상기 사이클로덱스트리나아제 발현 플라스미드(pKYCD1 및 pKYCD2)의 제작 과정은 도 6에 도식화 하였다.
상기에서 제작된 사이클로덱스트리나아제 코딩 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 실시예 1의 방법에 따라 바실러스 균주들에게 도입시켜 형질전환시킨 다음, 16시간 동안 배양한 후 37℃ 에서 50 ㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 형질전환체를 선별하였다. 상기 형질전환체로부터 분리한 플라스미드 pKYCD1 및 pKYCD2를 몇몇 제한효소로 절단한 다음, 0.8% 아가로우즈 젤 DNA 전기영동으로 분석하였다.
실험예 1: 본 발명 재조합 바실러스 균주에서 형질전환 여부 조사
상기 실시예 2에서 얻은 재조합 바실러스 서브틸리스 BD 170 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 지를 조사하였다.
상기 형질전환체로부터 분리한 플라스미드 pKYCD1 및 pKYCD2를 EcoR V 및 BamH I으로 절단한 다음, 0.8% 아가로우즈 젤 DNA 전기영동으로 분석하였다. 플라 스미드는 상기 실시예 1의 방법에 따라 분리하고 도 7에 젤 사진도로 그 결과를 나타내었다. 도 7에서 M은 사이즈 마커를, 레인 1은 재조합 바실러스 서브틸리스 BD 170에서 분리한 플라스미드 pKYCD1을, 레인 2는 레인 1의 플라스미드를 EcoR V로 절단한 결과를, 레인 3은 레인 1의 플라스미드를 BamH I로 절단한 결과를, 레인 4는 재조합 바실러스 서브틸리스 BD 170에서 분리한 플라스미드 pKYCD2을, 레인 5는 레인 4의 플라스미드를 EcoR V로 절단한 결과를, 레인 6은 레인 4의 플라스미드를 BamH I로 절단한 결과를 나타낸 것이다. 또한, M'는 사이즈 마커를, 레인 1'은 재조합 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에서 분리한 플라스미드 pKYCD1을, 레인 2'는 레인 1'의 플라스미드를 EcoR V로 절단한 결과를, 레인 3'은 레인 1'의 플라스미드를 BamH I로 절단한 결과를, 레인 4'는 재조합 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD에서 분리한 플라스미드 pKYCD2를, 레인 5'는 레인 4'의 플라스미드를 EcoR V로 절단한 결과를, 레인 6'은 레인 4'의 플라스미드를 BamH I로 절단한 결과를 나타낸 것이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 2개의 플라스미드 pKYCD1 및 pKYCD2의 패턴을 조사한 결과 사이클로덱스트리나아제 재조합 유전자가 올바르게 제작되었음을 확인하였다.
실험예 2: 본 발명 재조합 바실러스 균주에서 사이클로덱스트리나아제의 효소 활성 조사
상기 실시예 2에서 얻은 재조합 바실러스 균주들에서 발현되는 사이클로덱스트리나아제의 효소 활성을 측정하였다.
사이클로덱스트리나아제의 효소 활성은 I2-KI 염색방법에 따라 사이클로덱스트리나아제를 분비하는 형질전환체의 투명환 형성으로써 측정하였다.
도 8에서 a1은 음성대조군(바실러스 서브틸리스 BD 170, 1% 전분); a2 바실러스 서브틸리스 BD 170 (pXyl373, 1% 전분); a3, 바실러스 서브틸리스 BD 170 (pKYCD1, 1% 전분); a4, 바실러스 서브틸리스 BD 170 (pKYCD2, 1% 전분); b1, 음성대조군(바실러스 서브틸리스 BD 170, 1% 사이클로덱스트린); b2, 바실러스 서브틸리스 BD 170 (pXyl373, 1% 사이클로덱스트린); b3, 바실러스 서브틸리스 BD 170 (pKYCD1, 1% 사이클로덱스트린); b4, 바실러스 서브틸리스 BD 170 (pKYCD2, 1% 사이클로덱스트린); c1, 음성대조군(바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD, 1% 전분); c2, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (pXyl373, 1% 전분); c3, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (pKYCD1, 1% 전분); c4, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (pKYCD2, 1% 전분); d1, 음성대조군(바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD, 1% 사이클로덱스트린); d2, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (pXyl373, 1% 사이클로덱스트린); d3, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (pKYCD1, 1% 사이틀로덱스트린); d4, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD (pKYCD2, 1% 사이클로덱스트린)를 나타낸 것이다.
도 8에 나타난 바와 같이, pKYCD2 플라스미드를 포함하는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) BD 170 및 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(B. polyfermenticus) SCD 에서 높은 사이클로덱스트리나아제 활성을 나타냈다. 상기 발현시스템은 다른 것들 보다 더 높은 효소 활성을 가짐을 입증하는 것이다.
이에 따라, 본 발명자는 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) Int 57 유래의 사이클로덱스트리나아제 코딩 유전자를 포함하는 pKYCD2으로 형질전환된 재조합 균주를 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) SCD pKYCD2 이라 명명한 다음, 이를 2003년 4월 16일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM-10488 로 기탁하였다.
본 발명은 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 외래 유전자의 발현 숙주 균주로써 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 사이클로덱스트리나아제를 발현하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 형질전환체를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 pKYCD2를 포함하는 재조합 바실러스 균주에서 발현되는 사이클로덱스트리나아제는 높은 효소 활성을 갖는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 외래 유전자 발현 시스템을 사용하여 저가의 생산비용으로도 재조합 단백질을 대량생산할 수 있고 순도 및 균질성이 뛰어나므로 본 발명은 유전공학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

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  3. 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) Int 57 유래의 사이클로덱스트리나아제 코딩 유전자를 포함하고 제6도에 기재된 개열지도를 갖는 사이클로덱스트리나아제 발현 벡터 pKYCD2으로 형질전환된 재조합 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) SCD pKYCD2 KCCM-10488.
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