DE3650202T3

DE3650202T3 - Expression von heterologen Polypeptiden in filamentösen Pilzen, Verfahren zu deren Herstellung und Vektoren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE3650202T3
Application number: DE3650202T
Authority: DE
Inventors: Randy M. Berka; Daniel Madison Cullen; Gregory L. Gray; Kirk J. Hayenga; Virgil B. San Mateo Lawlis
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1985-08-29
Filing date: 1986-08-27
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2006-08-28
Also published as: ATE117020T1; AU6200886A; DK414486A; CA1341532C; EP0215594B2; AU607398B2; IE862310L; DK414486D0; DE3650202T2; EP0625577A1; EP0215594A2; DE3650202D1; NZ217373A; EP0215594A3; JPH08280388A; IE65794B1; DK175460B1; IE950656L; EP0215594B1; HK1003579A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft heterologe Polypeptide, welche durch Fadenpilze exprimiert und sezerniert werden und Vektoren und Verfahren zum Exprimieren und Sezernieren derartiger Polypeptide. Im spezielleren offenbart die Erfindung Transformationsvektoren und insbesondere Verfahren unter Verwendung derselben zum Exprimieren und Sezernieren von biologisch aktivem Rinderchymosin und heterologer Glucoamylase durch einen Fadenpilz.
Die Expression von heterologe Polypeptide exprimierenden DNA-Sequenzen (d.h. Polypeptide, welche normalerweise nicht durch einen Wirtsorganismus exprimiert und sezerniert werden) hat sich bis zu einem beachtlichen Entwicklungsstadium entwickelt. Zum Beispiel wurde berichtet, daß verschiedene DNA-Sequenzen, welche pharmakologisch wünschenswerte Polypeptide codieren (z.B. menschliches Wachstumshormon (1), menschlichen Gewebeplasminogenaktivator (2), verschiedene menschliche Interferone (6), Urokinase (5), Faktor VIII (4) und menschliches Serumalbumin (3)) und industriell wichtige Enzyme (z.B. Chymosin (7), Alpha-Amylasen (8) und alkalische Proteasen (9)) in einer Anzahl von verschiedenen Expressionswirten geklont und exprimiert wurden. Eine derartige Expression wurde erreicht durch Transformieren prokaryontischer Organismen [z.B. E.coli (10) oder B.subtilis (11)] oder eukaryontischer Organismen [z.B. Saccharomyces cerevisiae (7), Kluyveromyces lactis (12) oder China-Hamster-Ovarzellen (2) mit DNA-Sequenzen, welche das heterologe Polypeptid codieren.
Einige Polypeptide haben, wenn sie in heterologen Wirten exprimiert werden, nicht den gleichen Grad an biologischer Aktivität wie ihre natürlich erzeugten Gegenstücke, wenn sie in verschiedenen Wirtsorganismen exprimiert werden. Zum Beispiel hat Rinderchymosin eine sehr niedrige biologische Aktivität, wenn es in E.coli (13) oder S.cerevisiae (7) exprimiert wird. Diese verringerte biologische Aktivität in E.coli besteht nicht aufgrund der Natur-gegebenen Unfähigkeit von E.coli das Polypeptid zu glykosylieren, da Chymosin normalerweise nicht glykosyliert wird (14). Eine derartige relative Inaktivität sowohl in E.coli und S.cerevisiae scheint jedoch primär durch ungenaues Falten der Polypeptidkette bedingt zu sein, wie es durch die partielle Aktivierung nach der Expression derartiger exprimierter Polypeptide durch verschiedene Verfahren bewirkt wird. In derartigen Verfahren kann exprimiertes Chymosin sequentiell auf vielzählige Arten denaturiert und renaturiert werden, um biologische Aktivität zu erhöhen: z.B. Behandlung mit Harnstoff (13), Aussetzen denaturierendem/renaturierendem pH (13) und Denaturieren und Spaltung von Disulfidbindungen, gefolgt von einer Renaturierung und Regenerierung kovalenter Schwefelbindungen (15). Derartige Denaturierungs/Renaturierungsverfahren sind jedoch nicht sehr effizient [z.B. 30% oder weniger Rückgewinnung von biologischer Aktivität für Rennin (13)] und führen zu beachtlichem zusätzlichem Zeitaufwand und Kosten beim Herstellen eines biologisch aktiven Polypeptids.
Andere heterologe Polypeptide werden vorzugsweise in höheren eukaryontischen Wirten exprimiert (z.B. Säugerzellen). Derartige Polypeptide sind üblicherweise Glykopolypeptide, welche einen Expressionswirt erfordern, welcher bestimmte Aminosäuresequenzen in dem heterologen Polypeptid erkennen und glykosylieren kann. Derartige Säugerzellkultursysteme sezernieren jedoch häufig keine großen Mengen heterologer Polypeptide, verglichen mit mikrobiellen Systemen. Darüber hinaus sind derartige Systeme technisch schwierig aufrechtzuhalten und sind folglich teuer zu betreiben.
Transformation und Expression in einem Fadenpilz, umfassend Komplementation von aroD-Mutanten von N.crassa, welchen biosynthetische Dehydrogenase fehlt, wurde beschrieben (16). Seitdem wurde eine Transformation basierend auf Komplementation von Glutamatdehydrogenase defizienten N.crassa Mutanten ebenfalls entwickelt (17). In jedem Fall wurden die Dehydrogenase- (ga2) und Glutamatdehydrogenase- (am) Gene, welche für die Komplementation verwendet wurden, aus N.crassa erhalten und umfaßten daher eine homologe Expression. Andere Beispiele homologer Expression in Fadenpilzen umfassen die Komplementation von den auxotrophen Markern trpC (18) und argB (19) in A.nidulans und die Transformation von A.nidulans für eine Acetamid- oder Acrylamidverwertung durch Expression des Acetamidase (20) codierenden Gens von A.nidulans.
Expression von heterologen Polypeptiden in Fadenpilzen wurde auf die Transformation und Expression von Pilz- und Bakterienpolypeptiden begrenzt. Zum Beispiel wurde A.nidulans, welcher Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase defizient ist, mit einem Plasmid transformiert, welches aus N.crassa (21, 32) stammende, das pyr4-Gen codierende DNA-Sequenzen enthält. A.niger wurde ebenfalls transformiert, um Acetamid und Acrylamid durch Expression des aus A.nidulans (22) stammenden Acetamidase codierenden Gens zu verwerten.
Beispiele heterologer Expression bakterieller Polypeptide in Fadenpilzen umfassen die Expression einer bakteriellen Phosphotransferase in N.crassa (23) Dictyostelium discoideum (24) und Cephalosporium acremonium (25).
In jedem dieser Beispiele homologer und heterologer Expression in Pilzen wurden die Polypeptide intrazellulär im Fadenpilz gehalten.
Demgemäß ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Expression und Sekretion von heterologen Palypeptiden bereitzustellen durch und aus Fadenpilzen, umfassend Vektoren zum Transformieren derartiger Pilze und Verfahren zum Exprimieren und Sezernieren derartiger heterologer Polypeptide.
Die Erfindung ist ausführlicher in den anhängigen Ansprüchen definiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktionskarte der Aspergillus niger Glucomylase Insertionen in pGal und pGa5.
2 zeigt die Konstruktion von pDJB-gam-1.
3 zeigt die Konstruktion von mp19GAPR.
4, 5, 6 und 7 zeigen die Konstruktion von pGRG1, pGRG2, pGRG3 und pGRG4.
8 zeigt die zum Konstruieren von mp19 GAPR^⌂C1–^⌂C4 aus mp19 GAPR verwendete Strategie.
9 zeigt die Konstruktion von pCR160.
10 ist eine Partialrestriktionskarte des Mucor miehei Carboxylproteasegens, umfassend 5'- und 3'flankierende Sequenzen.
11A, 11B und 11C sind die DNA-Sequenz von Mucor miehei, Carboxylprotease, einschließlich der gesamten codierenden Sequenz und 5'- und 3'-flankierender Sequenzen.
12 zeigt die Konstruktion von pMeJBl-7.
13A und 13B sind eine Partial-Nukleotid- und eine Restriktionskarte von ANS-1.
14 zeigt die Konstruktion von pDJB-3.
15 zeigt die Konstruktion von Plasmid pCJ:GRG1 bis pCJ:GRG4.
16 zeigt eine Restriktionsendonuklease-Spaltkarte des 3,7Kb BamHI-Fragments von pRSH1.
17 zeigt die Konstruktion von pCJ:RSH1 und pCJ:RSH2.
18 zeigt die Expression von H. grisea Glucoamylase aus A. nidulans.
Ausführliche Beschreibung
Die Erfinder haben gezeigt, daß heterologe Polypeptide von stark divergierenden Quellen durch Fadenpilze exprimiert und sezerniert werden können. Im speziellen wurden Rinderchymosin, Glucoamylase von Aspergillus niger und Humicola grisea und die Carboxylprotease von Mucor miehei in A. nidulans exprimiert und aus A. nidulans sezerniert. Zusätzlich wurde Rinderchymosin exprimiert und sezerniert aus A.awamori und Trichoderma reesei. Biologisch aktives Chymosin wurde in dem Kulturmedium ohne weitere Behandlung nachgewiesen. Das Ergebnis war darin überraschend, daß die zum Transformieren von A. nidulans verwendeten Vektoren konstruiert waren, um Prochymosin zu sezernieren, welches ein Aussetzen an eine sauere Umgebung erfordert (ungefähr pH 2), um biologisch aktives Chymosin zu erzeugen.
Im allgemeinen ist ein Vektor, welcher funktionelle Promotor und Terminatorsequenzen codierende DNA-Sequenzen enthält (einschließlich Polyadenylierungssequenzen) operabel mit DNA-Sequenzen verbunden, welche verschiedene Signalsequenzen und heterologe Polypeptide codieren. Die derartig konstruierten Vektoren werden verwendet, um einen Fadenpilz zu transformieren. Lebensfähige Transformanten können hiernach identifiziert werden durch Screenen auf die Expression und Sekretion der heterologen Polypeptide.
Alternativ kann ein exprimierbares Selektionsmerkmal verwendet werden, um Transformanten zu isolieren durch Einführung von DNA-Sequenzen, welche das Selektionsmerkmal codieren, in den Transformationsvektor. Beispiele derartiger Selektionsmerkmale umfassen Resistenz gegen verschiedene Antibiotika (z.B. Aminoglykoside, Benomyl etc.) und Sequenzen, welche Gene codieren, die einen auxotrophen Defekt komplementieren (z.B. pyr4 Komplementation von pyr4 defizienten A.nidulans, A. awamori oder Trichoderma reesei oder ArgB Komplementation von ArgB defizienten A.nidulans oder A.awamori) oder Sequenzen, die Gene codieren, welche einen Ernährungs- (z.B. Acetamidase) oder morphologischen Marker im Expressionswirt vermitteln.
In den bevorzugten offenbarten Ausführungsformen ist eine, die aus A.nidulans stammende ANS-1 Sequenz codierende DNA-Sequenz in der Konstruktion des Transformationsvektors der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Diese Sequenz erhöht die Transformationseffizienz des Vektors. Derartige Sequenzen werden jedoch nicht als unbedingt notwendig angesehen, um die Erfindung durchzuführen.
Zusätzlich bilden bestimmte, aus dem Bakterienplasmid pBR325 stammende DNA-Sequenzen einen Teil der offenbarten Transformationsvektoren. Es wird ebenfalls angenommen, daß diese Sequenzen nicht notwendig sind zum Transformieren von Fadenpilzen. Stattdessen sorgen diese Sequenzen für bakterielle Replikation der Vektoren während der Vektorkonstruktion. Andere Plasmidsequenzen, welche ebenfalls durch die Vektorkonstruktion verwendet werden können, umfassen pBR322 (ATCC 37017), RK-2 (ATCC 37125), pMB9 (ATCC 37019) und pSC101 (ATCC 37032).
Die offenbarten bevorzugten Ausführungsformen sind als Beispiele dargestellt und sollen nicht den Bereich der Erfindung begrenzen.
Definitionen
"Exprimieren von Polypeptiden" bedeutet die Expression von Polypeptid codierenden DNA-Sequenzen.
"Polypeptide" sind Polymere von α-Aminosäuren, welche kovalent durch Peptidbindungen verbunden sind. Polypeptide umfassen Polymere mit niedrigem Molekulargewicht als auch Polymere mit hohem Molekulargewicht, welche herkömmlichererweise als Proteine bezeichnet werden. Zusätzlich kann ein Polypeptid ein Phosphopolypeptid, Glycopolypeptid oder Metallopolypeptid sein. Darüber hinaus können eine oder mehrere Polymerketten kombiniert werden, um ein Polypeptid zu bilden.
"Heterologes Polypeptid" bedeutet, wie es hier verwendet wird, ein Polypeptid, welches normalerweise von dem Fadenpilz, der verwendet wird, um das spezielle Polypeptid zu exprimieren, nicht exprimiert und sezerniert wird. Heterologe Polypeptide umfassen aus prokaryontischen Quellen stammende Polypeptide (z.B. α-Amylase von Bacillus species, alkalische Protease aus Bacillus species und verschiedene hydrolytische Enzyme von Pseudomonas, etc.), aus eukoryontischen Quellen stammende Polypeptide (z.B. Rinderchymosin, Gewebeplasminogenaktivator aus Mensch, Wachstumshormon aus Mensch, Interferon aus Mensch, Urokinase, Serumalbumin aus Mensch, Faktor VIII etc.) und aus anderen Pilzquellen als dem Expressionswirt stammende Polypeptide (z.B. Glucoamylase aus A. niger und Humicola grisea, exprimiert in A. nidulans, die Carboxylprotease aus Mucor miehei, exprimiert in A.nidulans, etc.).
Heterologe Polypeptide umfassen auch Hybridpolypeptide, welche eine Kombination von partiellen oder vollständigen Polypeptidsequenzen umfassen, welche aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden stammen von welchen jedes homolog oder heterolog im Hinblick auf den Pilzexpressionswirt sein kann. Beispiele derartiger Hybridpolypeptide umfassen:
DNA-Sequenzen, welche
Pilzglucoamylase oder eine Pilzcarboxyprotease, Gewebeplasminogenaktivator aus Mensch oder Wachstumshormon aus Mensch codieren, welche an DNA-Sequenzen fusioniert sind, die
die funktionelle Signalsequenz codieren, alleine oder in Verbindung mit verschiedenen Mengen Amino-terminaler Propeptidcodons oder reifer Codons, welche mit dem funktionellen Signal verbunden sind.
Darüber hinaus umfassen die heterologen Polypeptide der vorliegenden Erfindung weiterhin: 1) natürlich auftretende allelische Variationen, welche bestehen oder auftreten können in der Polypeptidsequenz, welche aus den vorstehenden prokaryontischen, eukaryontischen und Pilzquellen stammt, als auch als diejenigen, welche verwendet werden, um die vorstehenden Hybridpolypeptide zu bilden und 2) entwickelte Variationen der vorstehenden heterologen Polypeptide, welche hervorgebracht wurden z.B. durch stellenspezifische Mutagenese, worin verschiedene Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von einer oder mehreren der Aminosäuren in den heterologen Polypeptiden erzeugt werden.
Ein "biochemisch aktives heterologes Polypeptid" ist ein heterologes Polypeptid, welches in aktiver Form sezerniert wird, wie es durch seine Fähigkeit zum Vermitteln gezeigt wird von: 1) der, durch sein natürlich auftretendes Gegenstück vermittelten biochemischen Aktivität oder 2) im Fall von Hybridpolypeptiden, die biochemische Aktivität, welche durch mindestens eines der natürlich auftretenden Gegenstücke, umfassend die Hybridpolypeptide, vermittelt wird.
Jedes der vorstehend definierten heterologen Polypeptide wird durch eine heterologe DNA-Sequenz codiert, welche ein Stop-Signal enthält, welches durch den Fadenpilz erkannt wird, in welchem Expression und Sekretion auftritt. Wenn es vom Wirt erkannt wird, terminiert das Stop-Signal die Translation der, das heterologe Polypeptid codierenden mRNA.
Die "Fadenpilze" der vorliegenden Erfindung sind eukaryontische Mikroorganismen und umfassen alle filamentären Formen des Unterstammes Eumycotina (26). Diese Pilze sind gekennzeichnet durch ein vegetatives Mycel, welches zusammengesetzt ist aus Chitin, Cellulose und anderen komplexen Polysacchariden. Die Fadenpilze der vorliegenden Erfindung sind morphologisch, physiologisch und genetisch von Hefen verschieden. Vegetatives Wachstum von Fadenpilzen erfolgt durch hyphale Elongation und Kohlenstoffmetabolismus ist obligatorisch aerob. Im Gegensatz hierzu erfolgt vegetatives Wachstum bei Hefen, wie etwa S.cerevisiae durch Budding eines einzelligen Thallus und Kohlenstoffkatabolismus kann fermentativ sein. S.cerevisiae hat eine vorwiegende, sehr stabile diploide Phase, während Diploide nur kurz vor der Meiose in Fadenpilzen, wie etwa Aspergilli und Neurospora existieren. S.cerivisiae hat 17 Chromosomen, im Gegensatz zu 8 und 7 für A. nidulans bzw. N.crassa. Neuere Darstellungen von Unterschieden zwischen S.cerivisiae und Fadenpilzen umfassen die Unfähigkeit von S.cerivisiae, Aspergillus und Trichoderma Introns zu verarbeiten und die Unfähigkeit viele transkriptorische Regulatoren von Fadenpilzen (27) zu erkennen.
Verschiedene Spezies von Fadenpilzen können als Expressionswirte verwendet werden, einschließlich die folgenden Gattungen: Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia Mucor, Cochiobolus und Pyricularia. Spezifische Expressionswirte umfassen A. nidulans (18, 19, 20, 21, 61), A. niger (22), A.awamori, z.B. NRRL 3112, ATCC 22342 (NRRL 3112), ATCC 44733, ATCC 14331 und den Stamm UVK 143f. A. oryzae, z.B. ATCC 11490, N.crassa (16, 17, 23), Trichoderma reesei, z.B. NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767 und Trichoderma viride, z.B. ATCC 32098 und 32086.
Eine "Promotorsequenz" bedeutet, wie hier verwendet, eine DNA-Sequenz, welche von dem speziellen Fadenpilz für Expressionszwecke erkannt wird. Sie ist operabel mit einer DNA-Sequenz verbunden, welche die vorstehend definierten Polypeptide codiert. Eine derartige Verbindung umfaßt ein Positionieren des Promotors bezüglich des Initiationscodons der DNA-Sequenz, welche die Signalsequenz des offenbarten Transformationsvektors codiert. Die Promotorsequenz enthält Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, welche die Expression der Signalsequenz und des heterologen Polypeptids vermitteln. Beispiele umfassen den Promotor von A. niger Glukoamylase (39, 48) der hier genannte Mucor miehei Carboxylprotease und A. niger α-Glucosidase (28), Trichoderma reesei Cellobiohydrolase I (29), A. nidulans trpC (18) und höhere eukaryontische Promotoren, wie etwa den SV40early Promotor (24).
Gleichermaßen ist eine "Terminatorsequenz" eine DNA-Sequenz, welche von dem Expressionswirt erkannt wird, um die Transkription zu terminieren. Sie ist operabel mit dem 3'-Ende der, das zu exprimierende heterologe Polypeptid codierenden DNA gebunden. Beispiele umfassen den Terminator von A. nidulans trpC (18), A. niger Glucoamylase (39, 48), A. niger α-Glucosidase (28) und die hier genannte Mucor miehei Carboxylprotease, obwohl jeder aus Pilz stammende Terminator aller Wahrscheinlichkeit nach in der vorliegenden Erfindung funktionell ist.
Eine "Polyadenylierungssequenz" ist eine DNA-Sequenz, welche wenn sie transkripiert wird, durch den Expressionswirt erkannt wird, um Polyadenosinreste an transkripierte mRNA anzufügen. Sie ist operabel mit dem 3'-Ende der DNA verbunden, welche das zu exprimierende heterologe Polypeptid codiert. Beispiele umfassen Polyadenylierungssequenzen von A. nidulans trpC (18), A. niger Glucoamylase (39, 48), A. niger α-Glucosidase (28) und die hier genannte Mucor miehei Carboxylprotease. Jede Pilzpolyadenylierungssequenz ist jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach in der vorliegenden Erfindung funktionell.
Eine "Signalsequenz" ist eine Aminosäuresequenz, welche, wenn sie operabel mit dem Aminoterminus von einem heterologen Polypeptid verbunden ist, die Sekretion eines derartigen heterologen Polypeptids von dem Wirtsfadenpilz erlaubt.
Derartige Signalsequenzen können die Signalsequenz sein, welche normalerweise mit dem heterologen (Säuger) Polypeptid verbunden ist (d.h. eine native Signalsequenz) oder welche die Signalsequenz von Rinder-Präprochymosin (15) oder Mucor miehei-Präcarboxyprotease umfasst. Signalsequenzen sind operabel mit einem heterologen verbunden, entweder durch Verwendung einer nativen Signalsequenz oder durch Verbinden einer DNA-Sequenz, welche eine fremde Signalsequenz codiert, mit einer DNA-Sequenz, welche das heterologe Polypeptid in dem richtigen Leserahmen codiert, um eine Translation der Signalsequenz und des heterologen Polypeptids zu erlauben.
Ein "Propeptid" oder eine "Pro-Sequenz" ist eine Aminosäuresequenz, welche am Aminoterminus eines reifen biologisch aktiven Polypeptids angeordnet ist. Wenn sie derartig angeordnet ist, wird das resultierende Polypeptid ein Zymogen genannt. Zymogene sind im allgemeinen biologisch inaktiv und können zu reifen aktiven Polypeptiden umgewandelt werden durch katalytische oder auto-katalytische Abspaltung des Propeptids von dem Zymogen.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein "Transformationsvektor" eine DNA-Sequenz, welche ein heterologes Polypeptid codiert und eine DNA-Sequenz, welche eine heterologe oder homologe Signalsequenz codiert, die operabel daran gebunden ist. Zusätzlich kann ein Transformationsvektor DNA-Sequenzen umfassen, welche funktionelle Promotor- und Polyadenylierungssequenzen codieren. Jeder der vorstehenden Transformationsvektoren kann ebenfalls Sequenzen umfassen, welche ein exprimierbares Selektionsmerkmal codieren als auch Sequenzen, welche die Effizienz von Pilztransformation erhöhen.
"Transformation" ist ein Verfahren, worin ein Transformationsvektor in einen Fadenpilz eingeführt wird. Die Transformationsverfahren der vorliegenden Erfindung haben zu der stabilen Integration des gesamten oder eines Teils des Transformationsvektors in das Genom des Fadenpilzes geführt. Jedoch ist auch eine Transformation umfaßt, welche in dem Erhalt eines selbstrepliziernden extrachromosomalen Transformationsvektors resultiert.
Allgemeine Verfahren
"Verdau" von DNA betrifft katalytisches Spalten der DNA mit einem Enzym, welches nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Derartige Enzyme werden Restriktionsenzyme genannt und die Stellen für welche jedes spezifisch ist, werden eine Restriktionsstelle genannt. "Partieller" Verdau betrifft einen unvollständigen Verdau durch ein Restriktionsenzym, d.h. die Bedingungen werden derart gewählt, daß sie zu einer Spaltung von einigen, aber nicht allen Stellen für eine gegebene Restriktionsendonuklease in einem DNA-Substrat führen. Die verschiedenen hier verwendeten Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und andere Anforderungen, wie sie von den Enzymbereitstellern herausgegeben werden, wurden verwendet. Im allgemeinen wird etwa 1 Mikrogramm Plasmid oder DNA-Fragment verwendet mit etwa einer Einheit Enzym und etwa 20 Mikroliter Pufferlösung. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme sind vom Hersteller spezifiziert. Inkubationszeiten von etwa einer Stunde bei 37°C werden normalerweise verwendet, aber können gemäß den Instruktionen der Bereitsteller variieren. Nach Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die verdaute Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Verdau mit einem Restriktionsenzym kann gefolgt sein von bakterieller alkalischer Phosphatasehydrolyse der terminalen 5'-Phosphate, um zu verhindern, daß die beiden Enden eines DNA-Fragments eine geschlossene Schleife bilden, welche Insertion von einem anderen DNA-Fragment an der Restriktionsstelle bei Ligierung verhindern würde.
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragments von einem Restriktionsverdau bedeutet Auftrennung des Verdaus durch eine Polyacrylamidgelelektrophorese, Identifizierung des interessierenden Fragments, Entfernung des, das erwünschte Fragment enthaltenden Gelbereichs und Abtrennung der DNA von dem Gel, im allgemeinen durch Elektroelution (30).
"Ligation" betrifft das Verfahren zum Herstellen von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nukleinsäurefragmenten (30). Wenn es nicht anders angegeben ist, wurde Ligation verwirklicht unter Verwendung bekannter Puffer, bei Bedingungen mit einer Einheit T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 Mikrogramm von etwa gleichen molaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
"Oligonukleotide sind einzel- oder doppelsträngige Polydeoxynukleotide mit kurzer Länge, welche chemisch synthetisiert wurden durch das Verfahren von Crea et al., (31) und welche dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt wurden.
"Transformation" bedeutet Einführen von DNA in einen Organismus, so daß die DNA erhalten bleibt, entweder als ein extrachromosomales Element oder als chromosomaler Bestandteil. Wenn es nicht anders angegeben ist, war das hier zur Transformation von E.coli verwendete Verfahren das CaCl₂-Verfahren (30).
A. nidulans Strang G191 (University of Glasgow culture collection) wurde durch Inkubieren von A. nidulans Sphäroplasten mit dem Transformationsvektor transformiert. Der Genotyp von Strang G191 ist pabaA1 (benötigt p-Aminobenzoesäure), fwA1 (ein Farbmarker), mauA2 (kein Monoamin verwendend) und pyrG89 (Orotidinphosphatdecarboxylasedefizienz). Sphäroplasten wurden hergestellt durch das Cellophanverfahren von Ballance et al. (21) mit den folgenden Modifikationen. Um A. nidulans Zellwände aufzuschließen wurde zuerst Novozyme 234 (Novo Industries, Dänemark) partiell gereinigt. Eine 100 bis 500 mg Probe von Novozyme 234 wurde in 2,5 ml 0,6M KCl gelöst. Das 2,5 ml Aliquot wurde auf eine PD10-Säule (Pharmacia-Upsalla, Schweden) aufgebracht, äquilibriert mit 0,6M KCl. Die Enzyme wurden mit 3,5 ml des gleichen Puffers eluiert.
Cellophanscheiben wurden in Novozyme 234 (5 mg/ml) für 2 Stunden inkubiert, dann mit 0,6M KCl gewaschen. Der Aufschluß und die Waschlösungen wurden kombiniert, durch Miracloth filtriert (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA) und wie beschrieben gewaschen (21). Zentrifugationen wurden in konischen 50 oder 15 ml Röhrchen bei ca. 1000 × g für 10 min durchgeführt. Nachfolgend auf eine Inkubation auf Eis für 20 min wurden 2 ml der Polyethylenglykol-4000-Lösung (250 mg/ml) zugegeben, bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 4 ml 0,6M KCl, 50 mM CaCl2. Tranformierte Protoplasten wurden zentrifugiert, in 0,6M KCl, 50 mM CaCl2 resuspendiert und wie beschrieben (21) plattiert. Leer-Kontrollen umfaßten Protoplasten, welche mit 20 μl 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, ohne Plasmid-DNA inkubiert waren. Positive Kontrollen umfaßten Transformation mit 5 μm pDJB3, welches wie hier zuvor beschrieben konstruiert war. Regenerationsfrequenzen wurden bestimmt durch Plattierungsverdünnungen auf Minimalmedien, welche mit 5 bis 10 ppm paba und 500 ppm Uridin supplementiert waren. Die Regeneration lag im Bereich von 0,5 bis 5%.
Wegen der niedrigen, mit pDJB1 verbundenen Transformationsfrequenzen wurde erwartet, daß das, das Mucor Säureproteasegen (pMeJB1-7) enthaltende Derivat eine extrem niedrige Transformationsfrequenz ergibt. Folglich wurde Co- Transformation verwendet, um pmeJB11-7 Transformanten von A. nidulans zu erhalten. Dies wurde ausgeführt, indem zuerst ein nicht selektierbarer Vektor, welcher ANS-1 enthielt, konstruiert wurde und dann Transformieren von Sphäroplasten mit einem Gemisch von pmeJB1-7 und dem nicht selektierbaren Vektor, welcher das ANS-1 Fragment enthält. Der Grund für diesen Ansatz war, daß der ANS-1 tragende Vektor in mehreren Kopien integrieren würde und homologe Regionen für eine pMeJB1-7 Integration schaffen würde. Der ANS-1 Vektor wurde hergestellt durch Subklonieren des PstI-PvuII Fragments von ANS-1 (12A und 13B) aus pDJB-3 in pUC18 (33).
Die zwei Plasmide (pMeJB1-7 und der ANS-1 enthaltende Vektor) wurden gemischt (2,5 μg von jedem) und der vorstehend genannten Transformationsanleitung gefolgt.
Mit den Vektoren PGRG1–pGRG4 und pDJB-gam erhaltene Transformanten wurden nach 3 oder 4 Tagen Inkubation bei 37°C transferiert. Minimalemediumagarplatten, welche mit 5 ppm p-Aminonbenzoesäure supplementiert waren, wurden im Zentrum mit Myceltransfers (mycel transfers) von Transformanten inokuliert. Drei bis fünf Tage nach Inokulation von Minimalmediumplatten wurden Sporensuspensionen hergestellt durch Vortexen eines Mycelfragments in 1 ml destilliertem H₂O, 0,02% Tween-80. Ungefähr 5 × 10⁴ Sporen wurden in 250 ml Anzucht-Flaschen mit 50 ml des folgenden Mediums inokuliert: (g/l) Maltodextrin M-040 (Grain Processing Corp., Muscatine, Iowa) 50 g, NaNO₃ 6 g, MgSO₄·7H₂O 0,5 g, KCl 0,52 g, KH₂PO₄, 68 g, 1 ml Spurenelementlösung (34), 1 ml MAZU DF-60P Antischaummittel (Mazer Chemicals, Inc., Gurnee, IL), 10 ppm p-Aminobenzoesäure und 50 ppm Streptomycinsulfat. Alternativen zu MAZU, wie etwa Rinderserumalbumin oder andere geeignete oberflächenaktive Mittel können verwendet werden. Mucorsäureproteasesekretion wurde getestet in Aspergillus Vollmedium (20 g Dextrose, 1 g Pepton, 20 g Malzextrakt pro Liter). Kohlenstoffquellenregulierung von Chymosinsekretion durch Aspergillus, nidulans Transformanten wurde abgeschätzt durch Messen der Sekretion in dem vorstehend genannten Stärkemedium relativ zum gleichen Medium, welches mit 1 Fructose, Sucrose oder Dextrose anstelle von 5% Stärke supplementiert war. In allen Fällen wurden die Medien bei 37°C auf einem Kreisschüttler (150 UPM) inkubiert. Ein aus pDJB3 stammender Transformant wurde als eine Kontrolle eingeschlossen.
Western-Blots der verschiedenen sezernierten Chymosine und Mucor miehei Carboxylprotease wurden gemäß Towbin, et al., (35) durchgeführt. Aufgrund der hohen Salzkonzentration in Chymosinkulturnährlösungen und dem Effekt, welchen dieses Salz auf eine Gelelektrophorese hat, war ein Entsalzungsschritt erforderlich. Vorgegossene G-25 Säulen (Pharmacia, PD10) wurden mit 50 mM Na₂HPO₄, pH 6,0 äquilibriert. Ein 2,5 ml Aliquot von Kulturmedium wurde auf die Säule aufgebracht. Das Protein wurde mit 3,5 ml des gleichen Puffers eluiert. Die in den Blots vorhandenden heterologen Polypeptide wurden nachgewiesen, indem die Nitrocelluloseblots zuerst mit Anti-Chymosin aus Hase (36) oder Anti-Mucor miehei Carboxyproteaseserum aus Hase (36) kontaktiert wurden. Die Blots wurden danach mit Anti-Hase-Serum aus Ziege, welches mit Meerrettich-Peroxidase (Bio-Rad, Richmond, CA) konjugiert war, kontaktiert und entwickelt. Vor dem Beladen auf die Gele wurden 50 μl Medium (entsalzt im Falle von Chymosin) mit 25 μl SDS-Probenpuffer gemischt. β-Mercaptoethanol wurde auf eine Endkonzentration von 1% zugegeben. Die Probe wurde in einem 95°C Bad für 5 Minuten erhitzt, wonach 40 bis 50 μl Probe auf das Gel gegeben wurden. Jedes Gel wurde jeweils mit 20 μl eines 650, 65 und 6,5 μg/ml Chymosinstandards und Molekulargewichtsmarkern beladen. Western-Blots von pmeDJ1-7 Transformanten wurden ähnlich analysiert, mit der Ausnahme, daß Gelpermeation nicht durchgeführt wurde.
Proteaseaktivität wurde nachgewiesen wie von Sokol, et al., (37) beschrieben. Luria-Nährlösung wurde mit 1 bis 1,5 Magermilch (Difco) supplementiert und 30 bis 35 ml wurden in eine 150 mm Petrischale gegossen. Ein Aliquot von 2 bis 5 μl Kulturmedium wurde auf die Platte getüpfelt. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C in einer Feuchtekammer inkubiert. Die Aktivität wurde bestimmt, basierend auf der Menge an auftretendem Milch-koagulieren auf der Platte, gemessen in mm. Die Platten wurden zudem mit Verdünnungen von 100 CHU/ml oder 16,6 CHU/ml Rennin (CHU-Chr Hansen Unit, Chr Hansen's Laboratorium, A./S., Kopenhagen) betüpfelt. Die Beziehung zwischen dem Durchmesser der Koagulationszone (mm) und der Enzymkonzentration ist logarithmisch.
Um zwischen den Proteasetypen zu unterscheiden, wurde Pepstatin, ein Inhibitor des Chymosintyps von Carboxylprotease, verwendet, um auf Chymosin zurückführbare Proteaseaktivität zu inhibieren. Proben von Chymosin-Mutanten und Kontrollnährlösungen wurden präinkubiert mit einer 1:100 Verdünnung von 10 mM Pepstatin in DMSO für 5 Minuten vor dem Analysieren von Proteaseaktivität.
Glucoamylasesekretion durch pDJB-gam-1 Transformanten in 5%-igen Stärkemedien wurde eingeschätzt unter Verwendung eines Testverfahrens, welches auf der Fähigkeit von Glucoamylase zum Katalysieren der Umwandlung von p-Nitrophenol-α-Glucopyranosid (PNPAG) (38) zu freier Glucose und p-Nitrophenoxid basierte. Das Substrat, PNPAG, wurde in DMSO mit 150 mg/ml gelöst und 3 bis 15 μl Aliquote wurden mit 0,2 M Natriumacetat, 1 mM Calciumchlorid bei pH 4,3 auf 200 μl verdünnt. Eine 25 μl Probe wurde in einer Mikrotiterplattengrube angeordnet. Ein gleiches Volumen von Standards im Bereich von 0 bis 10 Sigma A. niger Einheiten/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde in separaten Gruben angeordnet. Zu jeder Grube wurden 200 μl PNPAG-Lösung mit 2,25 bis 11,25 mg/ml gegeben. Man ließ die Reaktion bei 60°C für 0,5 bis 1 Stunde ablaufen. Die Zeit hing von der Enzymkonzentration ab. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 2 M Trizmabase beendet. Die Platte wurde bei 405 nm gelesen. Die Enzymkonzentration wurde aus einer Standardkurve berechnet.
Wenn es nicht anders angegeben ist, wurde chromosomale DNA aus Fadenpilzen extrahiert durch das folgende Verfahren. Der Fadenpilz wurde in einem geeigneten Nährmedium für 3 bis 4 Tage gezüchtet. Mycelia wurden geerntet durch Filtern der Kultur durch feine Gaze. Die Mycelia wurden sorgfältig in einen Puffer von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA gespült. Überschüssige Flüssigkeit wurde durch Drücken der Mycelia in der Gaze entfernt. Etwa 3 bis 5 Gramm feuchter Mycelia wurden mit einer äquivalenten Menge sterilem, säuregewaschenem Sand in einem Mörser mit Pistil kombiniert. Das Gemisch wurde fünf Minuten zerrieben, um einen feinen Brei zu erhalten. Das Gemisch wurde für weitere 5 Minuten zerrieben nach Zugabe von 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA. Die Aufschlämmung wurde in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Deckel gegossen und mit 25 ml Phenol-Chloroform (äquilibriert mit einem gleichen Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA) extrahiert. Die Phasen wurden durch Niedergeschwindigkeitszentrifugation getrennt. Die wäßrige Phase wurde zurückbehalten und dreimal nachextrahiert. Die wäßrigen Phasen wurden kombiniert (etwa 20 ml Gesamtvolumen) und mit 2 ml 3 M Natriumacetat, pH 5,4, in sterilen Zentrifugenröhrchen gemischt. Eiskaltes Isopropanol (25 ml) wurde zugegeben und die Röhrchen wurden bei –20°C für eine Stunde belassen. Die Röhrchen wurden dann bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Nukleinsäuren zu pelletieren und das überstehende Fluid wurde verworfen. Man ließ die Pellets an Luft für 30 Minuten trocknen bevor sie in 400 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE-Puffer) resuspendiert wurden. Pankreas-Ribonuklease (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde auf eine Endkonzentration von 10 μg pro Milliliter zugegeben und die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur (30) inkubiert. Ribonuklease wurde dann durch Extraktion mit Phenol-Chloroform entfernt. Die wäßrige Schicht wurde vorsichtig entfernt und in ein Röhrchen gegeben, welches 40 μl 3 M Natriumacetat, pH 5,4, enthielt. Eiskaltes Ethanol wurde in die Lösung geschichtet. An der Grenzfläche präzipitierte DNA und wurde auf einen Glasstab gespult. Diese DNA wurde getrocknet und in einem kleinen Volumen (100 bis 200 μl) TE-Puffer resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch bei 260 nm (30) bestimmt.
Um die chromosomale Integration von Chymosin DNA-Sequenzen in ausgewählten Transformanten zu bestätigen, wurden Southern-Hybridisierungen durchgeführt (30). Sporensuspensionen von Transformanten wurden in Aspergillus Vollmedium inokuliert und bei 37°C auf einem Kreisschüttler für 24 bis 48 Stunden inkubiert. Das Medium war dahingehend nicht selektiv, da es mit 5 ppm p-Aminobenzoesäure supplementiert war und für das Wachstum des auxotrophen Stammes ausreichend Uracil enthielt. Tatsächlich wurden diese Southerns auch auf die Stabilität der Transformanten getestet. Das Mycelium wurde filtriert, in Sand zerrieben und die DNA wie vorstehend beschrieben gereinigt. DNA von Transformanten wurde dann mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und Fragmente durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Spuren umfaßten verdaute DNA aus pDJB3 Transformanten und unverdaute DNA. Gele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt, photographiert, auf Nitrocellulose oder Nytran (Schleicher und Schuell, Keen, NH) geblottet und mit radiomarkierten Plasmiden oder spezifischen Fragmenten getestet.
Einige der folgenden Beispiele veranschaulichen die beanspruchte Erfindung; andere liefern einen zweckmäßigen Hintergrund.
BEISPIEL 1
Expression und Sekretion von Aspergillus niger Glucoamylase durch Aspergillus nidulans
A. Konstruktion von pGA1
Aspergillus niger (Kultur #7, Culture Collection Genencor, Inc., South San Francisco, CA.) wurde in Kartoffel-Dextrose-Nährmedium (Difco, Detroit, MI) bei 30°C für 3 Tage unter kräftiger Belüftung gezüchtet. Chromosomale DNA wurde wie vorstehend extrahiert.
Ein synthetisches Oligonukleotid wurde als eine Hybridisierungssonde verwendet, um das Glucoamylasegen von Aspergillus niger nachzuweisen. Das Oligonukleotid war 28 Basen lang (28mer) und entsprach den ersten 9 1/3 Codons der veröffentlichten codierenden Glucoamylasesequenz (39):
Das Oligonukleotid wurde auf einem automatisierten Biosearch DNA-Synthesizer synthetisiert (Biosearch, San Rafael, CA), unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Reagentien und Verfahrensvorschriften.
Genomische DNA von Aspergillus niger wurde auf das Vorhandensein von Glucoamylasesequenzen durch das Verfahren von Southern (30) analysiert. Kurz gesagt wurden 10 μg von Aspergillus niger DNA mit EcoR1 Restriktionsendonuklease verdaut. Die verdaute DNA wurde einer Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel gemäß Standardverfahren (30) unterworfen. DNA wurde aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH) übertragen durch Blotten in 10 × SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M Trinatriumcitrat) (30). DNA wurde an der Nitrocellulose fixiert durch Backen in einem 80°C Vakuumofen, gefolgt von Hybridisierung bei niedriger Stringens (2,40) mit einer radioaktiv markierten Oligonukleotidsonde. Das radioaktive Markieren des synthetischen Oligonukleotids wurde bei 37°C in einer 50 μl Reaktion durchgeführt, welche 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiotreitol, 30 pMol synthetisches Oligonukleotid, 20 pMol Gamma-[32P]ATP (Amersham, Chicago, Il, spezifische Aktivität 5000 Ci/mmol) und 5 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (New England Biolabs) enthielt. Nach Hybridisierung wurden die Filter 15 Minuten in 2 × SSC, 0,1 Natriumdodecylsulfat (SDS) und zweimal in 2 × SSC bei 37°C gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet, in Seranwrap (Dow Chemical) verpackt und auf einen Kodak XOmat-AR Röntgenfilm bei –70°C angelegt, um ein autoradiographisches Bild zu erhalten. Nach dem Entwickeln des Autoradiogramms war eine Hybridisierungsbande klar sichtbar, welche einem 3,5 Kilobasenpaar EcoR1 Fragment entsprach.
Genomische DNA von Aspergillus niger wurde mit EcoR1 verdaut und durch Polyacrylgelelektrophorese gemäß Standardverfahren (30) nach der Größe fraktioniert. DNA-Fragmente mit den Größen 3 bis 4 kb wurden ausgeschnitten und von dem Gel eluiert (30). Diese DNA-Fraktion wurde verwendet, um eine Genbank in dem Escherichia coli Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017) zu generieren. Der Klonierungsvektor wurde mit EcoR1 gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase (Bethesda Research Labs) dephosphoryliert. Eine typische Dephosphorylierungsreaktion bestand aus 1 μg verdauter Vektor-DNA und 1 Einheit alkalischer Phosphatase in 50 μl 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl. Die Reaktion wurde bei 65°C inkubiert für 1 Stunde. Die Phosphatase wurde durch Extraktion mit Phenol-Chloroform entfernt. EcoR1 größenselektionierte Aspergillus niger DNA wurde dann mit EcoR1 gespaltenen und dephosphorylierten pBR322 ligiert. Eine typische Ligierungsreaktion enthielt das folgende: jeweils 100 ng Vektor- und Insert-DNA, 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Bethesda Research Labs), 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM Dithiotreitol und 1 mM ATP in 10 μl Volumen. Ligationsreaktionen wurden bei 16°C für 18 bis 24 Stunden inkubiert. Die ligierte DNA wurde verwendet, um kompetente E.coli 294 Zellen (ATCC 31446), hergestellt nach dem Verfahren von Morrison (41), zu transformieren. Transformanten wurden auf LB-Agarplatten (30) selektiert, welche Carbenecillin mit einer Endkonzentration von 50 μg pro ml enthielten. Transformanten, welche Glucoamylasegensequenzen enthielten wurden durch Kolonie-Hybridisierungsverfahren (30), unter Verwendung des Glucoamylase-spezifischen 28 mers als eine Sonde, identifiziert. Hybridisierende Kolonien wurden gereinigt und Plasmid-DNA wurde von jeder durch das alkalische SDS-Miniscreen-Verfahren (30) isoliert.
Alle auf diese Art und Weise ausgewählten Plasmide enthielten ein 3,5 kb EcoR1-Fragment, welches mit der synthetischen Glycoamylasesonde hybridisierte. Ein derartiges Plasmid, bezeichnet als pGal, wurde für weitere die Analytik ausgewählt. Ein 1,1 kb EcoR1-Ba1II-Fragment aus dem Insert in pGal wurde in M13 mp9 (42) subkloniert und durch das Dideoxykettenterminationsverfahren (43) partiell sequenziert, um sicherzustellen, daß die klonierte DNA das Glucoamylasegen codiert. Eine Restriktionsendonuklease-Spaltkarte des 3,5 kb EcoR1-Fragments, welches in pGal enthalten ist, ist in 1 dargestellt. Sie wurde entwickelt durch Einzel- und Doppelrestriktionsverdaue, gefolgt von einer Orientierung der DNA-Fragmente hinsichtlich bekannter Restriktionsstellen in pBR322 (44) .
B. Konstruktion von pGA5
Die Nukleotidsequenz und die Restriktionskarte von pGal zeigte an, daß pGal den vollständigen Glucoamylase codierenden Bereich und 221 Nukleotide 5'-flankierende DNA enthielt. Die Sequenzen in dieser 5'-Region waren erstaunlich ähnlich typischen eukaryontischen Promotorsequenzen mit stromaufwärts des ATG-Startcodons (48) gelegenen TATAAAT und CAAT Boxen.
Jedoch, um sicherzustellen, daß mögliche stromaufwärts gelegene Aktivierungsstellen des Aspergillus niger Glucoamylasegens in dem Endtransformationsvektor eingeschlossen waren, wurde ein größeres genomisches Fragment cloniert, welches mindestens 1000 bp 5'-flankierende DNA enthielt. Southern-Blot Experimente, ähnlich den bereits beschriebenen, identifizierten ein 6,5 kb ClaI-Fragment, welches mit einem radioaktiv markierten EcoR1-Glucoamylasefragment von pGal hybridisierte. Das EcoR1-Fragment wurde radioaktiv markiert durch Nick-Translation (30) mit alpha-[32P]dCTP (Amersham, spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol). Ein Nick-Translationskit (Bethesda Research Labs) wurde für die Markierungsreaktion verwendet unter Befolgung der vom Hersteller bereitgestellten Anleitungen. Filter wurden hybridisiert und unter stringenten Bedingungen gewaschen.
Das durch Hybridisierung identifizierte 6,5 kb ClaI-Fragment wurde auf eine ähnliche Art und Weise wie vorstehend beschrieben kloniert. Aspergillus niger DNA wurde mit ClaI verdaut und durch Polyacrylamidgelelektrophorese nach Größe fraktioniert. Wandernde DNA-Fragmente zwischen 5,5 und 8 kb wurden herausgeschnitten und von dem Gel eluiert. Diese Fraktion wurde mit ClaI gespaltenem und dephosphoryliertem pBR325 (45) ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde verwendet, um kompetente E.coli 294 Zellen zu transformieren. Transformanten wurden auf LB-Agarplatten, welche Carbenicillin (50 μg/ml) enthielten, selektiert. Glucoamylasegensequenzen enthaltende Kolonien wurden durch Koloniehybridisierung (30) identifiziert. Von hybridisierenden Kolonien extrahierte Plasmid-DNA enthielt ein 6,5 kb ClaI-Fragment, welches das zuvor in pGal klonierte 3,5 kb EcoR1-Fragment enthielt. Diese rekombinanten Plasmide codierten das Aspergillus niger Glucoamylasegen, wie bestätigt durch Supercoil-DNA-Sequenzieren (46) mit dem synthetischen Oligonukleotid (28 mer) als Sequenzierprimer. Eine Restriktionsendonuklease-Spaltkarte des 6,5 kb ClaI-Fragments wurde konstruiert unter Verwendung von Einzel- und Doppelverdauen der in pBR325 klonierten DNA. Restriktionsstellen in der Vektor-DNA wurden als Referenzpunkte verwendet, um das Fragment zu orientieren. Diese Restriktionskarte ist in 1 gezeigt. Die Lage des Glucoamylasegens wurde deduziert durch Vergleichen von Restriktionsstellen von pGa5 mit denjenigen der früher veröffentlichten Glucoamylasegene (39, 47, 48). Aus den Kartierungsdaten wurde geschätzt, daß etwa 3,3 kb der 5'-flankierenden DNA und etwa 1 kb 3'-flankierender DNA in dem klonierten Fragment enthalten waren.
Plasmid pGa5 wurde bei der ATCC hinterlegt am 28. August 1985 in E.coli 294 und wurde mit der Nummer 53249 zugeordnet.
C. Vektor zur Expression und Sekretion von Aspergillus niger Glucoamylase
Das 6,5 kb ClaI-Fragment von pGa5, welches das Glucoamylasegen enthält, wurde wie in 2 dargestellt in dem E.coli – Aspergillus nidulans Shuttlevektor pDJB3 kloniert. Der pDJB3 Shuttlevektor besitzt ein selektierbares Beta-Lactamasegen und den Replikationsursprung von E.coli Plamsid pBR325, das pyr4 Gen von Neuospora crassa, welches die auxotrophe Anforderung für Uridin im Aspergillus nidulans Strang G191 aufhebt, eine Sequenz, welche als ANS1 von Aspergillus nidulans bekannt ist, welche eine hohe Frequenz stabiler integrierender Transformanten in Aspergillus nidulans fördert, singuläre EcoR1 und ClaI Restriktionsstellen zum Klonieren.
pDJB ist konstruiert wie in 14 dargestellt. Plasmid pFB6 (32) wird vollständig verdaut mit BglII und partiell verdaut mit HindIII. Das pyr4 Gen (ca. 2 kb) enthaltende Fragment B wird durch Gelelektrophorese gereinigt und in mit HindIII/Bam HI verdautem pBR325 ligiert (Fragment A), was zu Plasmid pDJB1 führt. Die ANS-1 Sequenz wird durch Ligieren von EcoRI verdauter A. nidulans genomischer DNA (Strang G191 oder andere von FGSC#4 stammende Stränge) in EcoR1 gespaltenen pFB6 kloniert. Der resultierende Pool von EcoRI-Fragmenten in pFB6 wird verwendet, um eine ura3-S.cerevisiae (E.G. ETACC 44769, 44770 usw.) zu transformieren. Ein autonom replizierendes Plasmid, pIntA, wird aus dem S.cerivisiae Transformanten gereinigt. pIntA wird mit EcoRI verdaut, das ANS-1-Fragment durch Gelelektrophorese gereinigt und in EcoRI aufgeschlossenem pDJB1 ligiert, was zu Plasmid pDJB2 führt. pDJB2 wird partiell mit EcoRI verdaut, mit DNA-Polymerase I (Klenow) behandelt und wieder ligiert, um Plasmid pDJB3 zu ergeben. Die partielle Nukleotidsequenz und die Restriktionskarte des ANS-1-Fragments ist in 13A und 13B gezeigt.
Plasmid pGa5 wurde mit ClaI verdaut und das große Fragment (Fragment A) wurde von dem Vektor durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt. Dieses Fragment wurde ligiert mit pDJB3, welcher mit ClaI gespalten und dephosphoryliert worden war (Fragment B). Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um kompetente E.coli 294 Zellen zu transformieren. Transformanten wurden selektiertt auf LB-Agar, welcher mit Carbenicillin (50 μg/ml) supplementiert war. Analyse von Plasmid-DNA aus diesen Transformanten zeigte, daß das Glucoamylasefragment wie erwartet insertiert worden war. Beide Orientierungen des Glucoamylasefragments wurden erhalten durch Screenen verschiedener Transformanten. Ein, als pDJBgam1 bezeichnetes Plasmid wurde willkürlich zur Transformation von Aspergillus nidulans Protoplasten ausgewählt.
D. Expression und Sekretion von Glucoamylase
Aspergillus nidulans Stamm G191 wurde wie vorstehend beschrieben mit pDJB-gam-1 transformiert. Fünf, als pDJB-gam-1-4, 9, 10, 11 & 13 bezeichnete Transformanten wurden auf Glucoamylseaktivität wie vorstehend beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I
Wie gesehen werden kann, erzeugte jeder pDJB-gam-1 Transformant mehr Glucoamylaseaktivität als die Kontrolle, was anzeigt, daß biologisch aktive Glucoamylase aus dem transformierten Pilz exprimiert und sezerniert wurde.
BEISPIEL 2
Expression und Sekretion von Rinderchymosin aus Aspergillus nidulans
Es wurden Expressionsvektoren konstruiert, welche entweder eine neutrale Vorstufe von Rinderchymosin (Präprochymosin) oder eine Fusionsvorstufe, in welcher DNA-Sequenzen für Aspergillus niger Glucoamylase und Prochymosin exakt verbunden waren, codieren. Die Strategie zur Konstruktion dieser Vektoren umfaßte die folgenden Schritte. Zuerst wurde eine DNA-Sequenz, welche einen Teil des Glucoamylasepromotors und einen Teil des Glucoamylase 5'-codierenden Bereichs enthielt stromaufwärts von einer DNA-Sequenz cloniert, welche dem Amino-terminalen Teil von Präprochymosin entsprach. Anschließend wurden Nukleotide zwischen den DNA-Fragmenten durch M13 Stellen-spezifische Mutagenese (40) deletiert unter Verwendung spezifischer Primersequenzen. Schließlich wurde ein DNA-Segment, welches die verbundenen Sequenzen enthielt mit dem verbleibenden Teil der Prochymosinsequenz in einen Expressionsvektor eingeführt, welcher die 5'- und 3'-Regulationssequenzen des Aspergillus niger Glucoamylasegens verwendete. Diese Schritte sind in 3 bis 7 dargestellt.
A. Konstruktion von mp19 gApr
Plasmid pGA5 wird verwendet um ein 337 bp EcoR1-RsaI-DNA-Fragment (Fragment A) zu erhalten, welches einen Teil des Glucoamylasepromotors und ein Amino-terminales Segment des codierenden Bereichs trägt. Fragment A wurde mit EcoR1- und SmaI verdauter M13MP19RF-DNA (Fragment B) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet um E.coli JM101 (ATCC 33876) zu transformieren. Durchscheinende Plaques wurden auf das Vorliegen von Fragment A durch Restriktionsanalyse der entsprechenden RF-DNA analysiert. Ein Isolat, welches Fragment A enthält, bezeichnet als mp19R-Rsa wurde mit PstI und XbaI verdaut und das große Fragment (Fragment C) wurde isoliert. Eine kleine XbaI-PstI Sequenz (Fragment D), welche von pR3 (49) erhalten wurde, welches 5'-Preprochymosin-Sequenzen enthielt, wurde durch Elektorphorese gereinigt und an Fragment C ligiert, um das Phagentemplate mp1gGAPR, wie in 3 gezeigt, zu erzeugen.
B. Stellenspezifische Deletionsmutagenese
Wie in 8 gezeigt wurde mp19GAPR⌂Cl erhalten aus mp19GAPR durch Deletion der Nukleotide zwischen den Glucoamylasesignalpeptidcodons und den Codons für Prochymosin durch stellenspezifische Mutagenese. Somit sind in mp19GAPR⌂Cl die Glucoamylasesignalpeptidcodons exakt an das erste Codon von Prochymosin gebunden. Stellenspezifische Mutagense wurde wie vorstehend beschrieben (40) durchgeführt, ausgenommen, daß nur ein Oligonukleotid verwendet wurde um die Synthese des zweiten Strangs auf der einsträngigen M13-Matrize (4) (40) zu starten. Das zum Erhalten von mp19GAPR⌂Cl (Primer 1) verwendete Oligonukleotid war 5'-GCTCGGGGTTGGCAGCTGAGATCACCAG 3'. Die erwünschte Deletion enthaltende Plaques wurden identifiziert durch Hybridisieren mit dem wie vorstehend beschrieben radiomarkierten Primer.
In mp19GAPR⌂C3 wurden die Nukleotide zwischen denjenigen, welche unmittelbar dem Initiationscodon von Glucoamylase und dem ATG-Startcodon von Präprochymosin vorangehen verbunden durch stellenspezifische Mutagenese, unter Verwendung des synthetischen Oligonukleotids (Primer 3)
5' ACTCCCCCACCGCAATGAGGTGTCTCGT 3'.
Die resultierende Mutation verknüpfte die Glucoamylasepromotorregion exakt mit dem Initiationscodon von Präprochymosin wie in 8 dargestellt.
C. Konstruktion von Vektoren für die Expression und Sekretion von Rinderchymosin
Wie weiterhin in 4 gezeigt, war jede der Fusionen zwischen den Glucoamylasesequenzen und den 5'-Prochymosinsequenzen (mp19GAPR⌂CI und mp19GAPR⌂C3) kombiniert mit den 3'-Prochymosinsequenzen und dem Saccharomyces cerevisiae Phosphoglyceratkinase-(PGK)-Terminator in dem Aspergillis nidulans Transformationsvektor pDJB3. Die replikative Form von mp19GAPR⌂Cl und mp19GAPR⌂C3 wurde mit EcoR1 und PstI verdaut. Das kleinere Fragment (Fragment 1) wurde isoliert. Plasmid pBR322 wurde ebenfalls mit EcoR1 und PstI verdaut und das größere Vektorfragment (Fragment 2) wurde isoliert. Die Fragmente 1 und 2 wurden durch Ligation verbunden und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Eine Tetracyclin-resistente Kolonie, welche entweder Plasmid pBR322GAPR⌂Cl oder pBR322GAPR⌂C3 enthielt wurde isoliert. Fragment 2 wurde ebenfalls mit E.coli Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelt. Das resultierende Fragment mit glatten Enden wurde durch Ligation zirkularisiert und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Eine Tetracyclin-resistente Kolonie, welche Plasmid pBR322⌂RP enthielt, wurde isoliert und dann mit HindIII und SalI verdaut. Das größere Vektorfragment (Fragment 3) wurde isoliert. Das Plasmid pCR160 wurde mit HindIII und PstI verdaut und Fragment 5 (welches den an 3' Prochymosincodons fusionierten Hefe-PGK-Terminator enthielt) wurde isoliert. Die Fragmente 3, 4 und 5 wurden durch Ligation verbunden und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Ein Tetracyclin-resistenter Transformant, welcher Plasmid pBR322GAPR⌂Cl oder pBR322GAPR⌂C3 enthielt, wurde isoliert.
Plasmid pCR160 enthält den 2 μm Replikationsursprung, um sein Erhalt als Plasmid in Hefe zu erlauben, das Hefe TRP-1 Gen als einen Hefeselektionsmarker, einen E.coli Replikationsursprung und ein Ampicillinresistenzgen von dem Plasmid pBR322 und eine Prorenninexpressionseinheit. Die Prorenninexpressionseinheit enthält den Promotor des Hefe-PGK-Gens, den Prorennin codierenden Bereich und den Terminator von dem PGK-Gen. Die Konstruktion dieses Plasmids wurde wie in 9 gezeigt auf die folgende Art und Weise ausgeführt: Plasmid YEpIPT (50) wurde partiell mit HindIII verdaut, gefolgt von einem vollständigen EcoR1 Verdau und das Vektorfragment A wurde isoliert. Ein zweites Plasmid pPGK-1600 (51) wurde partiell sowohl mit EcoR1 als auch HindIII verdaut und das PGK-Promotorfragment B wurde isoliert. Die Fragmente A und B wurden ligiert, um das intermediäre pIntl zu ergeben, welches mit EcoR1 und dem HindIII wieder partiell verdaut wurde und das Vektorfragment C wurde isoliert. Das PGK-Terminatorfragment D wurde nach einem HindIII- und Sau3A-Verdau des Plasmids pB1 (52) isoliert. Das Prorenninfragment E wurde isoliert durch Spaltung von pR1 (49) DNA mit EcoR1 und BclI. Die Fragmente C, D und E wurden dann ligiert, um das Hefeexpressionsplasmid pCR160 zu erzeugen. Die Nukleotidsequenz des PGK-Protomotors, des Strukturgens und des Terminators wurden beschrieben (53).
Die Plasmide pBR322GAPR⌂Cl und pBR322GAPR⌂C3 enthalten eine vollständige Transkriptionseinheit für jede der Prochymosinformen. Diese Transkriptionseinheit enthält eine Prochymosinvorläufer codierende Sequenz, den Glucoamylasepromotor und den Hefe-PGK-Terminator. Jedoch erzeugten nachfolgend beschriebene Derivate dieser Plasmide und Plasmide pBR322GAPR⌂C2 und pBR322GAPR⌂4 [bezeichnet als pIntl (1–4) 5] kein nachweisbares Chymosin wenn sie verwendet wurden, um A. nidulans G191 zu transformieren. Es ist nicht bekannt, warum diese Plasmidderivate Chymosin nicht exprimieren und sezernieren konnten. Jedoch im Hinblick auf die nachfolgenden Ergebnisse erscheint es, daß der Hefe-PGK-Terminator und/oder die kurze Glucoamylasepromotorsequenz in diesen Plasmiden nicht von A. nidulans G191 erkannt wird.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die pBR322GAPR⌂C Plasmide weiter modifiziert.
In den folgenden Schritten wurde die Transkriptionseinheit in den Aspergillus nidulans Transformationsvektor pDJB3 versetzt. Zusätzliche Glucoamylase 5' flankierende Sequenzen wurden genau 5' von dem Promotor eingeführt, um das Vorliegen von möglichen stromaufwärts gelegenen Aktivierungsstellen sicherzustellen, welche in die Expressionsregulierung einbezogen werden könnten. Weiterhin wurde der PGK-Terminator durch den A. niger Glucoamylaseterminator von pGa5 ersetzt. Im speziellen wurde in 5 jedes Plasmid (pBR322GAPR⌂Cl oder pBR322GAPR⌂C2) mit ClaI verdaut und Fragment 6 wurde isoliert. Plasmid pDJB3 wurde ebenfalls mit ClaI verdaut und mit alkalischer Bakterienphosphatase behandelt, um Selbstligation zu minimieren. Dieses verdaute Plasmid (Fragment 7) wurde mit Fragment 6 verbunden und eine Ampicillin-resistende Kolonie, welche Plasmid pINTI-1 oder pIntI-3 enthielt, wurde isoliert. Diese Plasmide wurden mit XhoI und NsiI verdaut und das größere Vektorfragment (Fragment 8) wurde isoliert. Plasmid pGa5, welches das vollständige Glucoamylasegen als auch ausgedehnte 5'- und 3'-flankierende Sequenzen enthält, wurde mit XhoI und NsiI verdaut und das kleinere Fragment (Fragment 9) welches ungefähr 1700 bp dieser 5'-Sequenzen enthält, wurde isoliert. Fragmente 8 und 9 wurden durch Ligation verbunden und verwendet um E.coli 294 zu transformieren. Es wurde eine Ampicillin-resistente Kolonie isoliert, welche Plasmid pInt2-1 oder pInt2-3 enthielt. Diese Plasmide unterscheiden sich am deutlichsten von den Endvektoren (siehe 7) darin, daß sie anstelle des Glucoamylaseterminators den Hefe-PGK-Terminator enthalten.
Zusätzliche Schritte bei der Konstruktion von Chymosinexpressionsvektoren sind in 6 dargestellt. Plasmid pR1 (49) wurde verwendet, um ein kleines BclI-Asp718 DNA Fragment (Fragment A) zu isolieren, welches das 3'-Ende von Prochymosin cDNA umfaßte. Fragment A wurde nachfolgend in pUC18 (33) kloniert, welcher mit Asp718 und BamHI (Fragment B) verdaut worden war. Ähnlich wurde ein 1,2 kb ClaI-Asp718 DNA-Fragment (Fragment D) aus Plasmid pGA5 isoliert und in mit AccI und Asp718 verdautem pUC18 (Fragment C) kloniert. Die resultierenden intermediären Plasmide pUC-int1 und pUC-int2 wurden mit SalI und HindIII verdaut und Fragmente E und F wurden isoliert. Diese Fragmente wurden dann ligiert, um pUCint3 zu erzeugen, welches das 3'-Ende von Prochymosin enthielt, gefolgt von den Glucoamylaseterminatorsequenzen auf einem HindIII-Asp718 Fragment (Fragment H).
Ein neuer Klonierungsvektor, bezeichnet als pBR-Link, wurde erzeugt durch Insertieren eines synthetischen Oligonukleotidlinkers (welcher XhoI und ClaI Stellen) enthielt, in die einzige BamHI Stelle von pBR322. Dieser Linker umfaßte die folgende Sequenz:
5'-GATCCATCGATCTCGAGATCGATC 3'
3' GTAGCTAGAGCTCTAGCTACCTAG 5'.
Das größere HindIII-XhoI Fragment dieses Vektors (Fragment G) wurde durch Elektrophorese gereinigt. Ähnlich wurden die XhoI-Asp718 Restriktionsfragmente (Fragmente I) von den Plasmiden pInt2-1 und pInt2-3 elektrophoretisch isoliert. Die Fragmente G und H wurden mit jedem der verschiedenen I-Fragmente in einer Serie von Dreifach-Ligationen ligiert, um die Intermediate pInt3-1 und pInt3-3 zu erzeugen. Diese Schlüsselintermediate enthielten die Glucoamylasepromotorregionen, verschiedene Signal- und Propeptidfusionen an die Prochymosin- (oder Präprochymosin) Sequenzen, gefolgt von der Glucoamylaseterminatorregion, alles innerhalb günstiger ClaI Restriktionsstellen. Da bestimmte ClaI-Stellen, wie etwa diejenigen in dem Linker von pBR-Link durch E.coli DNA-Methylierung inhibiert werden, wurden die Plasmide pInt3-1 bis pInt3-4 in einem dam-Strang von E.coli transformiert, bezeichnet als GM48, (ATCC 39099) aus welchem die Plasmide wieder isoliert wurden. Die unmethylierte DNA wurde mit ClaI verdaut und Fragment J wurde durch Elektrophorese gereinigt. Fragment J aus jeder der Glucoamylase-prochymosinfusionen wurde nachfolgend in die einzige ClaI Stelle von pDJB3 (Fragment K) kloniert, um die fertigen Expressionsvektoren pGRGl und pGRG3 zu erzeugen.
D. Expression und Sekretion von Rinderchymosin
Aspergillus nidulans G191 wurde mit pGRGl und pGRG3 wie vorstehend beschrieben transformiert.
Fünf pGRGl und fünf pGRG3 Transformanten wurden analysiert. Western-Analysen (nicht gezeigt) zeigten an, daß jeder Transformant ein Protein sezernierte, welches mit Anti-Chymosin reagierte und welches beim gleichen oder etwas höheren Molekulargewicht von Rinderchymosin wanderte. Die Spezies mit höherem Molekulargewicht kann zurückzuführen sein auf eine ungenaue Prozessierung, Mediumeffekte oder Glycosylierung. Integration wurde sichergestellt für einen Transformanten von pGRG3 durch Southern Hybridisierung (Ergebnisse nicht gezeigt). Jeder Transformant wurde ebenfalls auf Chymosinaktivität untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle II gezeigt.
Tabelle II
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl pGRGl als auch pGRG3 mit unterschiedlichen Konzentrationen, welche über der pDJB3 Kontrolle liegen, eine Protease sezernieren. Zuweilen wurde proteolytische Hintergrundsaktivität in den pDJB3 Kontrollnährmedien nachgewiesen. Wie hier nachfolgend gezeigt wird, ist diese Proteaseaktivität von Transformanten mit der Asparginsäurefamilie von Carboxylproteasen, von welcher Chymosin ein Mitglied ist, verbunden.
BEISPIEL 3
Expression und Sekretion von Fusionspolypeptiden aus Aspergillus nidulans
Zwei Fusionspolypeptide wurden konstruiert zur Expression und Sekretion aus A. nidulans. Ein Fusionspolypeptid enthielt einen Amino-terminalen Anteil, welcher aus der Pro-Sequenz bestand und den ersten zehrt Aminosäuren von Aspergillus niger Glucoamylase und einem Carboxyl-terminalen Anteil, welcher aus Rinder-Prochymosin bestand. Das zweite Fusionspolypeptid enthielt einen Amino-terminalen Anteil, welcher nur aus der Pro-Sequenzaus Aspergillus niger Glucoamylase bestand und einen Carboxyl-terminalen Anteil, welcher aus Rinderprochymosin bestand.
A. Vektoren zum Exprimieren und Sezernieren von Fusionspolypeptiden
Die vorstehenden Fusionspolypeptide codierenden Vektoren wurden konstruiert durch Deletieren spezifischer Sequenzen aus mp19GAPR, gefolgt von den gleichen Manipulationen wie vorstehend zur Konstruktion von pGRGl und pGRG3 beschrieben. Wie in 8 gezeigt wurden in mp19GAPR⌂C2 die Nukleotide zwischen den Glucoamylasepropeptidcodons und die Codons von Prochymosin deletiert unter Verwendung des stellenspezifischen vorstehend beschriebenen Mutageneseverfahrens. Die Sequenz des für diese Mutagenese (Primer 2) synthetisierten Oligonukleotids war
5'-TGATTTCCAAGCGCGCTGAGATCACCAG 3'.
Diese Mutation sollte den Glucoamylasepromotor, das Signalpeptid und Propeptidcodons an den ersten Codon von Prochymosin binden. In mp19GAPR⌂C4 wurden die Nukleotidsequenzen zwischen dem zehnten Codon von reifer Glucoamylase und den Codons von Prochymosin deletiert durch M13 stellenspezifische Mutagenese mit dem synthetischen Oligonukleotid (Primer 4).
5'-TGAGCAACGAAGCGGCTGAGATCACCAG 3'.
Diese Deletion verband den Glucoamylasepromotorbereich, die Signalpeptidsequenz, die Propeptidsequenz und zehn Codons der reifen Glucoamylase mit den Codons von Prochyomosin wie in 8 gezeigt. Diese als pGRG2 und pGRG4 bezeichneten Expressions- und Sekretionsvektoren wurden verwendet, um A. nidulans zu transformieren.
B. Expression und Sekretion von Chymosin von mit PGRG2 und PGRG4 transformiertem Aspergillus nidulans
pGRG2 und pGRG4 Transformanten wurden wie vorstehend beschrieben kultiviert. Das Kulturmedium wurde auf Chymosinaktivät durch Wester-Blots untersucht und ergab ähnliche Ergebnisse wie sie für pGRG1 und pGRG3 erhalten wurden. Die Integration von einem pGRG2 Transformanten wurde durch Southern Analyse (Ergebnisse nicht gezeigt) sichergestellt. Die Ergebnisse des Chymosinversuchs sind in Tabelle III dargestellt.
Tabelle III
Wieder zeigte jeder der Transformanten eine Proteaseaktivität über derjenigen der pDJB3 Kontrolle, was anzeigte, daß eine Protease von den Transformanten exprimiert und sezerniert wird. Wie bei pGRG1 und pGRG3 gehören diese Proteasen zu der Asperaginsäurefamilie von Carboxylproteasen, wie es durch die Pepstatininhibition bewiesen wird. Im speziellen zeigen diese Ergebnisse, daß Hybridpolypeptide in einem Fadenpilz exprimiert wurden.
BEISPIEL 4
Pepstatininhibitionsuntersuchung
Drei der vorstehenden Vektoren, welche die verschiedenen Chymosin umfassenden Konstruktionen enthielten, wurden in dem wie vorstehend beschriebenen Pepstatininhibitionstest analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gegeben.
Tabelle IV
Die mit Pepstatin präinkubierten Proben zeigen einen deutlichen Abfall der Aktivität, was anzeigt, daß die durch die Transformanten erzeugte Protease aus der Asparaginsäurefamilie von Säureproteasen ist, von welcher Chymosin ein Mitglied ist. Diese Daten zeigen zusammen mit den Ergebnissen aus den Western-Analysen, daß biologisch aktives Chymosin von, mit pGRGl, pGRG2, pGRG3 und pGRG4 transformiertem A. nidulans G191 exprimiert und sezerniert wird.
Die Variation im Ausmaß der für verschiedene Vektorkonstruktionen in Beispiel II und Beispiel III nachgewiesenen Chymosinaktivität kann Unterschiede im Erkennen der in jedem Transformationsvektor eingeführten verschiedenen Signale wiederspiegeln. Innerhalb einer speziellen Konstruktion kann die Variation in der Chymosinaktivät mit der Kopienanzahl des in das Pilzgen eingebrachten Vektors und/oder der Lage einer derartigen Integration zusammenhängen.
BEISPIEL 5
Kohlenstoffquellenstudien
Ein Vektor, pGRG4, wurde verwendet, um A. nidulans G191 zu transformieren, welcher hiernach auf den verschiedenen vorstehend beschriebenen Kohlenstoffquellen gezüchtet wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle V gezeigt.
Tabelle V Ausmaß der auf verschiedenen Kohlenstoffquellen (μg/ml) erzeugten Chymosinaktivität
Diese Ergebnisse zeigen klar, daß Chymosin, ungeachtet der Kohlenstoffquelle, sezerniert wird. Dies legt nahe, daß die Transkriptionsregulierung des Glucoamylasepromotors verschieden ist von der in A. niger, d.h. nicht stark durch Stärke induzierbar ist.
BEISPIEL 6
Expression und Sekretion von Mucor meihei Carboxylprotease
A. Carboxylproteasegensonde
Die primäre Teilstruktur von Mucor meihei Säureprotease (54) wurde für den Bereich niedrigster genetischer Redundanz untersucht. Die Reste 187 bis 191 (unter Verwendung des Schweine Pepsin-Numerierungssystems), try-tyr-phe-trp-asp wurden ausgewählt. Zur Codierungssequenz, welche dieser Aminosäuresequenz entsprach komplementäre Oligonukleotide
5'-GC(G/A)TCCCA(G/A)AA(G/A)TA(G/A)TA-3'
wurden synthetisiert (31) und unter Verwendung von Gamma-32P-ATP und T4 Polynukleotidkinase (30) markiert.
B. Klonierung von Mucor meihei Carboxylprotease
Genomische DNA von Mucor meihei (Centraal Bureau Voor Schimmelcultures, Holland 370.75) wurde wie folgt hergestellt. In YMB-Medium gezüchtete Zellen (3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Malzextrakt, 5 g/l Pepton, 10 g/l Glucose) wurden durch Zentrifugation gesammelt, zweimal mit 0,5 M NaCl gewaschen und lyophilisiert. Die Zellwände wurden dann durch Zugabe von Sand zu den Zellen und Reiben des Gemischs mit einem Mörser und einem Pestil aufgebrochen. Das resultierende Pulver wurde in einer Lösung (15 ml pro Gramm Trockengewicht) suspendiert, welche 25% Sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM EDTA enthielt. SDS wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 zugegeben und die Suspension wurde einmal mit einem halben Volumen Phenol und dreimal mit halben Volumina Chloroform extrahiert. Die schließlich erhaltene wäßrige Phase wurde ausgiebig gegen 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA dialysiert. Die DNA wurde dann durch Zugabe von Natriumacetat, pH 5,5, auf eine Konzentration von 0,3 M, gefolgt von der Zugabe von 2,5 Volumina kaltem Ethanol präzipitiert. Aliquote dieser DNA wurden mit einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen gemäß den Anweisungen der Hersteller verdaut und dann auf, zu den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Sonden komplementäre Sequenzen untersucht, unter Verwendung des Verfahrens von Southern. Eine positive Hybridisierungsbande von etwa 2,5 kb (Kilobasen) wurde in der HindIII verdauten DNA identifiziert. HindIII verdaute genomische DNA wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und ein Gelfragment, welches DNA mit 2,0 bis 3,0 kb enthielt wurde elektroeluiert, wie vorstehend beschrieben. Die elektroeluierte DNA, von welcher angenommen wurde, daß sie angereichert war mit dem Mucor miehei Säureproteasegen entsprechenden Sequenzen, wurde mit Ethanol präzipitiert. Der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017) wurde mit HindIII verdaut und unter Verwendung von bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. In einer typischen 10 μl Reaktion wurden 100 ng Vektor und 100 mg von der größenangereicherten DNA in der Gegenwart von ATP und T4 DNA Ligase verbunden. Die Reaktion wurde verwendet, um E.coli 294 (ATCC 31446) durch das Calciumschockverfahren (30) zu transformieren. Etwa 2,0 × 10⁴ Ampicillin-resistente Klone wurden erhalten. Ungefähr 98% von diesen enthielten klonierte Inserts wie durch ihre Unfähigkeit auf Tetracyclin enthaltendem Medium zu wachsen gezeigt wurde. Diese Kolonien wurden durch ein Standard-Kolonie-Hybridisierungsverfahren auf das Vorliegen von zu den DNA-Sonden komplementären Sequenzen getestet. Es wurde gefunden, daß eine positiv hybridisierende Kolonie, welche das pMe5'muc Plasmid enthielt einen HindIII Insert der erwarteten 2,5 kb Größe enthielt. Die Termini dieses Fragments wurden in M13 Sequenzierungsvektoren (33) subkloniert und ihre Sequenzen durch das Dideoxykettenterminationsverfahren bestimmt. Ein Terminus enthielt Sequenzen, welche der bekannten Amino-terminalen Aminosäuresequenz des Säure-Proteasegens entsprach. Der benachbarte 3'-Bereich wurde sequenziert, um mehr C-terminale codierende Sequenzen zu erhalten. Die Sequenzierungsstrategie ist in 10 gezeigt. Auf diesem Weg wurde die vollständige codierende Sequenz für die reife Form des Proteins erhalten. Es wurde gefunden, daß das 5' Ende des Fragments 112 bp (Basenpaare) stromaufwärts von dem, dem reifen Aminoterminus entsprechenden Codon lag. Da dieser Stromaufwärts-Bereich keine Initiationscodons im Leserahmen enthielt, wurde angenommen, daß er Teil eines Propeptids ist.
Um DNA zu erhalten, welche den Initiationscodon als auch nicht translatierte 5' Sequenzen enthielt, wurde ein Klon, der weiter 5' liegende Sequenzen enthielt, wie folgt isoliert. Ein HindIII-ClaI 813 bP 5' Subfragment des pMe5'Cla HindIII Inserts wurde isoliert und durch das Nick-Translationsverfahren (30) markiert. Dieses markierte Fragment wurde verwendet, um ClaI verdaute Mucor miehei genomische DNA durch das Verfahren von Southern zu untersuchen. Dieser Versuch zeigte eine einzelne Hybridisierungsbande, entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 1300 bp. Nach der Größe angereicherte DNA dieser Größe wurde isoliert und kloniert in ClaI verdauten und dephosphorylierten pBR322, wie vorstehend beschrieben.
Ungefähr 9000 Ampecillin-resistente Kolonien wurden erhalten. Etwa 90% von diesen enthielten klonierte Inserts, wie durch ihre Unfähigkeit auf Tetracyclin enthaltendem Medium zu wachsen, gezeigt wurde. Diese Kolonien wurden durch ein Standard-Kolonie-Hybridisierungsverfahren auf das Vorliegen von Sequenzen getestet, welche komplementär zu denen der Nicktranslatierten Sonde sind. Es wurde gefunden, daß eine positiv hybridisierende, Plasmid pMe2 enthaltende Kolonie ein ClaI Insert der erwarteten 1,3 kb Größe enthält. Sequenzieren der Enden dieses Fragments zeigte, daß ein Terminus Sequenzen nahe der ClaI Stelle des HindIII Fragments in pMe5'Cla entsprach und erlaubte somit die Orientierung des Fragments, welche in 10 gezeigt ist. Weiteres Sequenzieren des Cla2-Fragments offenbarte den Initiationscodon und nicht translatierte 5' Sequenzen. Die vollständige Codierungssequenz und die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen sind in 10 gezeigt. Vergleich der deduzierten primären Struktur mit der durch direktes Aminosäuresequenzieren Bestimmten zeigt, daß das Mucor Protein als eine Vorstufe mit einer Amino-terminalen Extension von 69 Resten hergestellt wird. Basierend auf den im allgemeinen in den Leaderpeptiden vorliegenden strukturellen Merkmalen ist es wahrscheinlich, daß die Reste –21 bis –1 ein Leaderpeptid umfassen und daß die Reste 21 bis 69 ein, zu dem in den zymogenen Formen anderer sauren Proteasen, einschließlich Chymosin und Pepsin (55) gefundene analoge Propeptide umfassen.
C. Mucor meihei Carboxylprotease Expressions- und Sekretionsvektor
Ein Vektor zum Exprimieren und Sezernieren von Mucor meihei Carboxyprotease umfaßt die vollständige native Mucor meihei saure Protease-Transkriptions-Einheit, umfassend die codierende Sequenz, 5'-flankierende Sequenzen (Protomor) und 3'-flankierende Sequenzen (Terminator und Polyadenylierungsstelle).
Die Gesamtstrategie zum Herstellen dieses Vektors ist in 12 dargestellt. Der Aspergillus nidulans Transformationsvektor pDJB1 wurde mit ClaI und EcoR1 verdaut und das größere Vektorfragment (Fragment 1) wurde isoliert. Das Plasmid pMe5'Cla wurde mit EcoR1 und ClaI verdaut und Fragment 2 wurde isoliert. Dieses Fragment enthält die 5' Codons der sauren Protease zusammen mit etwa 500 bp 5' flankierender Sequenzen. Die Fragmente 1 und 2 wurden durch Ligation verknüpft und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Eine Plasmid pMeJBint enthaltende Ampicillin-resistente Kolonie wurde isoliert. Dieses Plasmid wurde mit ClaI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Selbstligation zu verringern und wird als Fragment 3 bezeichnet. Plasmid pMe2 wurde mit ClaI verdaut und das kleinere Fragment (Fragment 4) wurde isoliert. Dieses Fragment enthält die 3' Codons von Mucor miehei saurer Protease und etwa 1800 bp von 3' flankierenden Sequenzen. Die Fragmente 3 und 4 wurden durch Ligation verknüpft und verwendet, um E.coli 294 zu transformieren. Eine, Plasmid pMeJB1-7 enthaltende, Ampicillin-resistente Kolonie wurde isoliert. Dieser Vektor wurde verwendet, um Aspergillus nidulans zu transformieren.
D. Expression und Sekretion von Mucor miehei Carboxylprotease durch Aspergillus nidulans
Southern-Blot-Analysen von sechs Transformanten zeigten das Vorliegen des vollständigen Gens für saure Protease aus Mucor miehie im Aspergillus nidulans Genom (Ergebnisse nicht gezeigt). Zusätzlich wurde jeder der Transformanten durch Western-Blots (Ergebnisse nicht gezeigt) und auf saure Proteaseaktivität analysiert. Die Ergebnisse der Proteaseuntersuchung sind in Tabelle VI gezeigt.
Tabelle VI
Diese Versuche zeigen die Expression und Sekretion eines Proteins, welches mit spezifischem Antikörper gegen Mucor miehei Carboxylprotease reagiert und welches Milchflockungsaktivität aufweist. Das Protein hat gemäß elektrophoretischer Analyse ein anscheinendes Molekulargewicht, welches etwas höher als dasjenige des authentischen (von Mucor miehei stammenden) Proteins hat. Dies kann anzeigen, daß Aspergillus nidulans dieses Glycoprotein zu einem von Mucor miehei verschiedenen Ausmaß glykosyliert. Da die aus Aspergillus nidulans stammende saure Protease aus Mucor meihei anscheinend die gleiche spezifische Aktivität aufweist wie das authentische Material, erscheint es, daß sie zu der reifen Form (durch die Zelle oder autokatalytisch) prozessiert wurde. Die unprozessierten Formen anderer saurer Proteasen, wie etwa Chymosin und Pepsin sind zymogene, welche eine Prozessierung (autokatalytisch) erfordern, bevor Aktivität erreicht wird.
Die unterschiedlichen Expressionsgrade in den verschiedenen Transformanten können die Position oder Kopieanzahl des Proteasegens in dem Aspergillus nidulans Genom wiederspiegeln. Jedoch zeigt die Expression und Sekretion von biologisch aktiver Carboxylprotease an, daß der A. nidulans die Promotor-Signal- und Terminatorsignale von Mucor miehei Carboxylprotease erkennt.
BEISPIEL 7
Expression und Sekretion von durch pGRG1-4 codiertem Chymosin aus A. Awamori und Trichoderma reesei pyrG auxotrophen Mutanten
Die Plasmide pGRGl bis pGRG4 (pGRG1-4) wurden ebenfalls verwendet, um Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (OMPCase) defiziente Mutanten von A.awamori und Trichoderma reesei zu transformieren. Das durch das pGRG1-4 Plasmid codierte pyr4 Gen von N.crassa komplementiert diese OMPCase Mutanten in der Abwesenheit von Uridin, um die Isolierung von erfolgreichen Transformanten zu erlauben. Die so transformierten Mutanten von A.awamori und T.reesei sezernierten nachweisbare Mengen von biochemisch aktivem Chymosin in das Kulturmedium.
A. Herstellung von pyrG Auxotrophen
Das zum Erhalten von pyrG auxotrophen Mutanten von A.awamori und T.reesei verwendete Verfahren umfaßte eine Selektion auf der Pyrimidin-analogen 5'-Fluor-orotsäure (FOA) (56). Der Mechanismus, nach welchem FOA Wildtypzellen zerstört ist unklar. Jedoch ist es im Hinblick auf die Resistenz von OMPCase defizienten Mutanten gegen FOA wahrscheinlich, daß die Toxizität durch die Umwandlung von FOA zu 5-Fluor-UMP auftritt. Ob der Zelltod durch ein fluoriertes Ribonukleotid oder Deoxyribonukleotid verursacht wird, ist unklar.
Die folgenden Verfahren beschreiben die Isolierung von OMPCase-defizienten (FOA-resistenten) Mutanten von T.reesei und A.awamori:
1. Trichoderma reesei
Eine frische Sporensuspension von T.reesei Stamm P37 (NRRL 15709) wurde dreimal in sterilem destilliertem Wasser, welches 0,01% Tween-80 enthielt, gewaschen. Fünfzehn Milliliter dieser Sporensuspension (1 × 10⁷ Sporen pro ml) wurden in eine sterile Petrischale (100 × 20 mm) mit einem sterilen Magnetrührstab eingebracht. Der Deckel wurde entfernt und die Sporen wurden ultraviolett (UV) Licht bei 254 nm (7000 uW pro cm²) im Dunkeln ausgesetzt, bei einer Entfernung von 25 cm von der UV-Lichtquelle. Die Sporen wurden konstant gerührt. Das UV-Aussetzen wurde für drei Minuten (ausreichend um 70 getötete Sporen zu ergeben) fortgesetzt. Die bestrahlte Sporensuspension wurde in einem 50 ml Zentrifugenrohr gesammelt und im Dunkeln für eine Stunde gelagert, um Photoreaktivierung zu verhindern. Die Sporen wurden durch Zentrifugation pelletiert und das Pellet wurde in 200 μl sterilem Wasser, welches 0,01% Tween-80 enthielt, resuspendiert.
Die Suspension wurde verdünnt und auf YNB Agarmedium (0,7 Hefestickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 10 mM Uridin, 2% Agar) (56) plattiert, welches 0,15% FOA (SCM Specialty Chemicals, Gainsville, Florida) enthielt. Nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C wurden 75 Kolonien in frischem YNB Altar, welcher FOA enthielt, gespickt. 62 der 75 Kolonien wuchsen und wurden mit Zahnstochern auf Minimalagar (6 g/l NaNO₃, 0,52 g/l KCl, 1,52 g/l KH₂PO₄), 1 ml/l Spurenelementelösung, 1% Glucose, 0,1% MgSO₄, 20 g/l Agar) und auf Minimalagar plus 1 mg/ml Uridin gepickt, um Uridinanforderungen zu bestimmen. Alle 62 Isolate wuchsen auf Minimalagar mit Uridin, aber 9 Isolate waren nicht in der Lage auf Minimalagar alleine zu wachsen. Diese 9 Stämme wurden wieder auf Minimalagar und Minimalagar mit Uridin gespickt. Zwei der Stämme wuchsen nur auf Minimalagar, welcher zusätzlich Uridin enthält. Einer dieser als T.reesei pyrG29 bezeichnete, wuchs gut auf Minimalmedium mit Uridin ohne Hintergrundwachstum auf Minimalmedium alleine.
2. Aspergillus awamori
(i) Herstellung von A.awamori Stamm UVK 143f- ein Hyperproducer von Glucoamylase
Sporen von A.awamori Stamm NRRL 3112 wurden nach 5 bis 7 Tagen Wachstum auf Kartoffeldextroseagar (PDA, Difco Co.) bei 30°C erhalten. Die Sporen wurden geerntet durch Waschen der Oberfläche der Platte mit sterilem 0,1 %-igem Tween-80 in destilliertem Wasser und vorsichtigem Abschaben der Sporen. Die Sporen wurden durch Zentrifugation gewaschen und im selben Puffer resuspendiert, um eine Endkonzentration von zwischen 1 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Sporen/ml zu ergeben. Die Präparationen wurden bei 4°C gelagert.
Zwei ml Sporen wurden in eine sterile Petrischale gegeben. Der obere Teil der Schale wurde entfernt und die Sporen wurden einer Ultraviolett-(UV)-Lampe (15 Watt, keimtötend) ausgesetzt. Bedingungen der Aussetzzeit und des Abstandes von der Lampe wurden derartig eingestellt, daß 90 bis 99,9% der Sporen getötet wurden. Überlebende Sporen wurden auf PDA-Medium plattiert und gezüchtet, um einzelne unabhängige Kolonien zu bilden.
Sporen von einzelnen mutagenisierten Kolonien wurden in 50 ml Screeningmedium inokuliert, welches aus 5% Maismehl, 0,5 Hefeextrakt, 2% Maistränkflüssigkeit, eingestellt auf pH 4,5 enthielt, vor der Sterilisation in 250 ml Kolben. Jedoch wurde erwartet, daß ein beliebiges Medium, welches Mais oder Maisstärke als Kohlenstoffquelle enthält die gleichen Ergebnisse liefern würde. Die Kulturen wurden für 4 bis 5 Tage bei 30 bis 35°C unter konstantem Schütteln gezüchtet. Proben wurden entweder täglich oder am Ende des Laufs für Untersuchungen genommen.
Es wurden Abschätzungen der Glucoamylaseaktivität vorgenommen durch Messen des Freisetzens einer farberzeugenden Gruppe (Para-nitrophenol) aus einem farblosen Substrat (p-Nitrophenyl-alpha-glucosid, PNPAG).
Die folgende Vorschrift wurde verwendet:
Substrat – 180 mg PNPAG wurden in 250 ml 0,1 M NaAcetatpuffer, pH 4,7, gelöst. Bei 4°C gelagert.
Untersuchung – 1 ml Substrat wurde bei 40°C in einem Wasserbad äquilibriert. 0,2 ml Probe (oder verdünnte Probe) wurden zugegeben und für 30 Minuten bei 40°C inkubiert. 9 ml 0,1 M Na₂CO₃ wurden zugegeben, wobei das Gemisch bei Raumtemperatur für 15 Minuten zur Farbentwicklung gehalten wurde. Das Gemisch wurde durch ein Wattman 42-Filterpapier filtriert und die Absorption bei 420 nm wurde in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen. Die PNPAG-Gehalte aller Mutanten wurden mit der Standardmenge verglichen, welche durch den Ursprungsstamm erzeugt wurde und wurden als Prozent PNPAG-Hydrolyse des Ursprungsstamms angegeben.
Ein als UVK 143f bezeichneter Glucoamylasehyperproduzierender Stamm wurde für auxotrophe Mutagenese ausgewählt.
(ii) Auxotrophe Mutagenese
Die Herstellung von Sporen aus A.awamori Stamm UVK143f, UV-Mutagenese und Mutantenanalyse war wie für T.reesei beschrieben, mit den folgenden Modifikationen:

a. 2,5 Minuten waren erforderlich um 70% Tötung mit UV-Licht zu ergeben.
b. Anstelle von YNB-Agar wurde Minimalmedium verwendet.
c. Die FOA-Konzentration war 0,1%.

Fünfzehn pyrG Mutanten wurden gefunden. Drei dieser Isolate, als pyr4-5, pyr4-7 und pyr4-8 bezeichnet, wurden für Transformationsexperimente ausgewählt.
B. Transformation von A.awamori und T.reesei pyr Auxotrophen
A.awamori und T.reesei Auxotrophe wurde durch eine Modifikation des vorstehend beschriebenen Verfahrens für A. nidulans transformiert. Ungefähr 1 × 10⁸ Sporen wurden in Hefeextraktglucose (YEG) Medium, welches aus 2% Glucose, 0,5 Hefeextrakt und zusätzlich 1 mg/ml Uridin besteht, inokuliert. Die Kulturen wurden auf einem 37°C-Schüttler (200 rpm) für 12 bis 15 Stunden inkubiert [T.reesei wurde bei 30°C inkubiert]. Keime wurden durch Zentrifugation geerntet, einmal mit sterilem YEG-Medium gewaschen, dann bei 30°C in 50% YEG-Medium, welches 0,6 M KCl, 0,5% Novozyme 234 (Novo Industries, Dänemark), 0,5% MgSO₄·7H₂O, 0,05 Rinderserumalbumin enthielt, in einer sterilen 200 ml Kunststoffflasche (Corning Corp., Corning, N.Y.) inkubert. Nach 30 Minuten Schütteln bei 150 UPM wurde die Protoplastensuspension fünfmal mit einer 10 ml Pipette kräftig auf und nieder pipettiert, um die Klumpen zu dispergieren. Die Protoplastensuspension wurde weiter wie zuvor für eine Stunde inkubiert und dann durch steriles Miracloth (Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, Californien) filtriert, welches mit 0,6 M KCl angefeuchtet war. Die filtrierten Protoplasten wurden zentrifugiert, gewaschen und mit jedem der pGRG1-4 Plasmide wie vorstehend beschrieben transformiert.
Die folgenden Modifikationen wurden für die A.awamori Transformation vorgenommen:

1. 0,7 M KCl wurde anstelle von 0,6 M KCl verwendet.
2. 1,2 M Sorbitol wurde anstelle von 0,6 M KCl verwendet, um das Transformations- und Regenerationsmedium osmotisch zu stabilisieren.

C. Analyse von A.awamori und T.reesei Transformanten
Sowohl A.awamori als auch T.reesei Transformanten sezernierten Chymosinpolypeptide in das Kulturmedium. Dieses wurde bestimmt durch Analyse von Kulturfiltraten (Ergebnisse nicht gezeigt) sowohl für enzymatisch aktives Chymosin (Milchflockungsversuch) und Chymosinpolypeptide, welche mit spezifischen Chymosinantikörpern reagierten (Enzymimmunoassay und Western-Immunblottingtechniken).
BEISPIEL 8
Expression und Sekretion von heterologen Polypeptiden von argB auxotrophen Mutanten aus Aspergillus Species
Die Expression und Sekretion von heterologen Polypeptiden von argB Auxotrophen aus Aspergillus Spezies wurde ebenfalls erreicht.
Dieses Beispiel beschreibt die komplementäre Transformation von A.nidulans und A.awamori argB Auxotrophen mit Vektoren, welche das argB Gen von A.nidulans und DNA-Sequenzen enthalten, welche die heterologen Polypeptide der Plasmide pGRG1-4 codieren. Das argB Gen codiert Ornithintranscarbamylase (OTC).
Der A.nidulans argB Auxotrophe, der die genetischen, hier verwendeten Marker biA1, argB2, metG1 enthält, wurde erhalten von Dr. P. Weglenski, Department of Genetics, Warschauer Universität, Al. Ujazdowskie 4,00–478 Warschau. Polen. Der A. awamori argB Mutant wurde wie folgt erhalten.
A. Isolierung von Aspergillus awamori argB auxotrophen Mutanten
Eine frische Suspension von A.awamori Stamm UVK 143k Sporen wurde hergestellt und UV-Mutagenese wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, daß die Aussetzzeit ausreichend war, um 95% der Sporen zu töten. Die Sporen wurden dann zentrifugiert, mit sterilem Wasser gewaschen und in 25 ml sterilem Minimalmedium resuspendiert. Diese Suspensionen wurden in einem 37°C Schüttler unter kräftiger Belüftung inkubiert. Unter diesen Bedingungen werden Wildtypsporen keimen und in vegetativen Mycelia wachsen, aber auxotrophe Mutanten werden dies nicht tun. Diese Kultur wurde aseptisch alle 6 bis 8 Stunden für 3 Tage durch steriles Miracloth filtriert. Dieser Schritt entfernt die meisten der Wildtyp-Mycelia, während die nicht gekeimten Auxotrophen durch das Miraclothfilter passieren (d.h. Filtrationsanreicherung). Bei jedem Filtrationsschritt wurden die filtrierten Sporen zentrifugiert und in frischem Minimalmedium resuspendiert. Nach drei Anreicherungstagen wurden die Sporen verdünnt und auf Minimalagar, welcher zusätzlich 50 mM Citrullin enthielt plattiert. Die Platten wurden bei 37°C für 2 bis 3 Tage inkubiert. Einzelne Kolonien aus diesen Platten wurden mit Zahnstochern auf zwei Screening-Platten gespickt – eine Platte welche Minimalagar plus 10 mM Ornithin enthielt und eine Platte, welche Minimalagar plus 50 mM Citrullin enthielt. Der Grund zum Picken der Kolonien auf diese Screening-Platten ist wie folgt. OTC (das argB Genprodukt) katalysiert die Umwandlung von Ornithin zu Citrullin im biosynthetischen Argininweg. Daher werden argB Mutanten (Defizient an OTC) auf Minimalmedium plus Citrullin wachsen, aber nicht auf Minimalmedium mit Ornithin. Das Screening von ungefähr 4000 Kolonien mit diesem Verfahren führte zu 15 möglichen argB Mutanten. Eine dieser Stämme, bezeichnet als A.awamori argB3 ergab kein Hintergrundwachstum auf Minimalmedium und wuchs sehr gut auf Minimalmedium, welches zusätzlich entweder Arginin oder Citrullin enthielt. Untersuchungen zum Bestimmen des Gehalts von OTC-Aktivität (57) zeigten an, daß der argB3 Mutant mindestens 30-mal weniger OTC-Aktivität erzeugte, als der Wildtyp. Auf der Basis dieser Daten wurde der A.awamori argB3 Stamm für Transformationsversuche ausgewählt.
B. Konstruktion von auf argB basierenden Prochymosin Expressionsvektoren zur Transformation von Aspergillus Species
Bei dieser Konstruktion (siehe 15) war der erste Schritt die transformationserhöhende Sequenz ANS-1 und das selektierbare argB Gen auf demselben Plasmid zu kombinieren. Um dies zu erreichen wurde Plasmid pBB116 (59), welches das argB Gen von A.nidulans enthält mit PstI und BamHI verdaut und das angezeigte Fragment A, welches das argB Strukturgen enthält, wurde isoliert. Plasmid pDJB2 (59) wurde mit EcoR1 und PstI verdaut und das angezeigte Fragment B, welches die ANS-1 Sequenz enthält, wurde isoliert. In einer dreiteiligen Ligation wurden die Fragmente A und B mit Fragment C verbunden, welches das große EcoR1-BamHI Fragment von dem Plasmidvektor pUC18 (33) enthält, um das Plasmid pARG-DJB zu ergeben.
In dem zweiten Schritt dieser Konstruktion wurde ein synthetischer DNA-Polylinker, welcher ClaI Stellen enthält, in pARG-DJB insertiert, um die Insertion von ClaI Fragmenten, welche verschiedene Prochymosinexpressionseinheiten enthalten, zu erlauben. Plasmid pARG-DJB wurde mit BamHI verdaut und dann mit bakterieller, alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Der angegebene synthetische DNA-Polylinker wurde mit T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert und dann mit den gespaltenen pARG-DJB ligiert, um pCJ16L zu ergeben. Da gefunden wurde, daß dieses Plasmid gegen Verdau mit ClaI resistent ist, wurde es zuerst verwendet, um den E.coli dam Mutantenstamm GM48 zu transformieren, um Methylierung der ClaI Stellen zu verhindern. Nach Isolierung des Plasmids von GM48 Transformanten wurde es mit Erfolg mit ClaI gespalten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Im letzten Schritt dieser Konstruktion von ClaI gespaltenem pCJ16L wurde ein Vektor mit jeden der ClaI Prochymosinexpressionsfragmente von den Plasmiden pGRGl bis pGRG4 verbunden. Die resultierenden vier Plasmide, pCJ::GRG1 bis pCJ::GRG4 wurden verwendet, um die argB Mutanten von A.nidulans und A.awamori zu Prototrophie zu transformieren. Resultierende Transformanten wurden auf Expression von Prochymosinpolypeptiden analysiert.
C. Analyse von A.nidulans und A.awamori Transformanten
Sezernierte Chymosinpolypeptide von A.awamori und A.nidulans, welche mit pCJ::GRG1 bis pCJ::GRG4 transformiert sind, wurden durch die Milchflockungsuntersuchung nachgewiesen und durch Enzymimmunoassays und Western- Immunblottingtechniken. In jedem Fall (Ergebnisse nicht gezeigt) sezernierten die transformierten Pilze biochemisch aktives Chymosin in das Kulturmedium.
Obwohl sich das vorgehende auf speziell bevorzugte Ausführungsformen bezieht, wird es so verstanden, daß die vorliegende Erfindung nicht derartig begrenzt ist. Es wird für den Fachmann deutlich, daß verschiedene Modifikationen zu den offenbarten Ausführungsformen gemacht werden können und, daß derartige Modifikationen im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen sollen.
Die in der folgenden Bibliographie zusammengefaßten Literaturstellen und entsprechend anhand von Nummern in Klammern im vorgehenden Text zitierte, werden hiermit durch ihre Nennung eingeführt.
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Claims

Verfahren zum Herstellen eines Säugerpolypeptids, umfassend: Transformieren eines Fadenpilzes des Unterstammes Eumycotina, ausgenommen Saccharomyces cerevisae, die in filamentförmiger Form propagiert werden können, mit einem Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert, eine DNA-Sequenz, die für eine Signalsequenz codiert, und eine Promotorsequenz, die operativ mit der DNA verbunden ist, die für die Signalsequenz codiert, wobei die Promotorsequenz funktionell durch den Fadenpilz erkannt wird, wobei die DNA-Sequenzen das Polypeptid exprimieren und eine Sezernierung des Polypeptids aus dem Fadenpilz bewirken können, und Exprimieren und Sezernieren des Polypeptids; worin die Signalsequenz nativ für das Säugerpolypeptid ist oder die Signalsequenz von Rinder-Präprochymosin oder Mucor miehei-Präprocarboxyprotease umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, umfassend: Transformieren eines Fadenpilzes des Unterstammes Eumycotina, ausgenommen Saccharomyces cerevisae, die in filamentförmiger Form propagiert werden können, mit einem Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Polypeptid codiert, d.h. für eines, das in dem Wirtsfadenpilz normalerweise nicht exprimiert und sezerniert wird, eine DNA-Sequenz, die für eine Signalsequenz codiert, und eine Promotorsequenz, die operativ mit der DNA verbunden ist, die für die Signalsequenz codiert, wobei die Promotorsequenz funktionell durch den Fadenpilz erkannt wird, wobei die DNA-Sequenzen das Polypeptid exprimieren und eine Sezernierung des Polypeptids aus dem Fadenpilz bewirken können, und Exprimieren und Sezernieren des Polypeptids; worin die Signalsequenz die Signalsequenz von Rinder-Präprochymosin oder Mucor miehei-Präprocarboxyprotease umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Signalsequenz nativ für das heterologe Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Signalsequenz für das heterologe Polypeptid fremd ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Promotorsequenz von einem endogenen Gen eines Fadenpilzes ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Promotorsequenz von einem Fadenpilz ist, der von dem verschieden ist, der mit dem Vektor transformiert ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Promotor die Promotorsequenz von Aspergillus niger-Glucoamylase, Humicola grisea-Glucoamylase oder Mucor miehei-Carboxyl Protease umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend eine funktionelle Transkriptions-Terminierungs- und eine Polyadenylierungs-Sequenz, die operativ mit der DNA-Sequenz verbunden ist, die für das heterologe Polypeptid codiert.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Polyadenylierungssequenz die Polyadenylierungssequenz von Aspergillus niger-Glucoamylase oder Mucor miehei-Carboxyl Protease umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Selektionsmerkmal codiert, das in dem Fadenpilz exprimierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das Selektionsmerkmal eine DNA-Sequenz ist, die für Neurospora crass pyr4, Aspergillus nidulans Acetamidase, Aspergillus nidulans argB oder Aspergillus nidulans trpC codiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend eine DNA-Sequenz, die die Transformationseffizienz des Vektors in Aspergillus nidulans erhöhen kann.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die DNA-Sequenz zum Erhöhen der Pilz-Transformationseffizienz ANS-1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das sezernierte heterologe Polypeptid ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das sezernierte Polypeptid biochemisch aktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Fadenpilz aus dem Unterstamm Eumycotina aus Mitgliedern der Gattungsgruppe ausgewählt wird, bestehend aus Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Podospora, Endothia, Mucor, Cochibolus und Pyricularia.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Fadenpilz aus dem Unterstamm Eumycotina ausgewählt wird aus Mitgliedern der Gattungsgruppe, bestehend aus Aspergillus und Trichoderma
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Fadenpilz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Aspergillus nidulans oder Aspergillus awamori.