JPH07182A - アルコール／アルデヒド脱水酵素 - Google Patents

アルコール／アルデヒド脱水酵素

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JPH07182A
JPH07182A JP5349815A JP34981593A JPH07182A JP H07182 A JPH07182 A JP H07182A JP 5349815 A JP5349815 A JP 5349815A JP 34981593 A JP34981593 A JP 34981593A JP H07182 A JPH07182 A JP H07182A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 アルコール及びアルデヒドからアルデヒド、
カルボン酸、ケトン、特にＬ−ソルボースよりＬ−ソル
ボソンを経て２ＫＧＡを生成する酸化反応を触媒する酵
素を提供する。 【構成】 以下のような物理化学的特性を有するアルコ
ール／アルデヒド脱水素酵素： a) 至適pH ：約 7.0 - 9.0 b) 至適温度：約 20 - 40℃ c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン（それぞれ分
子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブ
ユニットとベータ サブユニットの組み合わせからなる
２つのサブユニットからなる。） d) 基質特異性：一級および二級アルコール類、および
アルデヒド類に活性を示す e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン f) 等電点：約 4.4。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なアルコール／アル
デヒド脱水素酵素（本文中AADHと記す）およびその製造
法、および本酵素をもちいたアルデヒド類、カルボン酸
類およびケトン類化合物、特に該酵素をもちいた２ーケ
トーＬーグロン酸（本文中2KGAと記す）の製造方法に関
する。
【０００２】本発明によるAADHはアルコール類およびア
ルデヒド類化合物の酸化を触媒し、それぞれに対応する
アルデヒド類およびケトン類化合物およびカルボン酸化
合物を生成する。さらに特徴的に、本発明によるAADHは
L-ソルボースを酸化しＬ−ソルボソンをへて2KGAを生成
する。2KGAはビタミンC製造における重要な中間体であ
る。
【０００３】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】アルコー
ルおよびアルデヒド化合物の酸化により対応するアルデ
ヒドおよびカルボン酸を生成しピロロキノリン キノン
（本文中PQQと記す）を補欠分子族として含有している
酵素はこれまでにもいくつか報告されている。
【０００４】アルコール脱水素酵素に属するメタノール
脱水素酵素は一般にメタノール酸化によるホルムアルデ
ヒド生成のみならずホルムアルデヒド酸化によるギ酸の
生成も触媒する。（アドバンセズ.イン.マイクロバイア
ル・フイジオロジー 第２７巻、１１３−２０９頁、１
９８６）これらの酵素はメタノール、エタノールのよう
な一級アルコール類やアルデヒド類をアンモニアやメチ
ルアミン類を活性化剤として酸化する、しかしこれらの
酵素のうち大部分は二級アルコールを酸化することはで
きない。メチロバクテリウム オルガノフィラム、シュ
ードモナス Ｃ、ヂィプロコッカス PAR および ロ
ドシュードモナス アシドフフィル、より得られている
メタノール脱水素酵素は二級アルコールを酸化を触媒す
ることができる例である。これらの前例に対して本発明
によるAADHは広い範囲の一級および二級アルコールを酸
化し、既存のメタノール脱水素酵素と以下の点において
明らかに異なっている。
【０００５】本AADHはエタノールはよい基質とするが、
メタノールを酸化できない。アンモニアやメチルアミン
などの活性化剤を必要としない。一般のメタノール脱水
素酵素の等電点が7.0以上なのに対して、本AADHの等電
点は約4.4である。
【０００６】PQQを補欠分子族として含むアルコール脱
水素酵素の例としてほかにシュードモナス エルギノー
サのキノプロテインアルコール脱水素酵素（バイオケミ
カル・ジヤーナル、 第２２３巻、９２１−９２４頁、
１９８４）およびシュ−ドモナス テストステロニのキ
ノヘムプロテインアルコ−ル脱水素酵素（バイオケミカ
ル・ジヤーナル、第２３４巻、６１１−６１５頁、１９
８６）が知られている。前者は、本発明によるAADHがサ
ブユニットの二量体で存在し活性化剤を必要としないの
に対して、分子量１０１、０００の単量体で活性化剤と
してアンモニウム塩又はアミンを必要とする。後者は、
本発明によるAADHがサブユニットの二量対でヘムｃ分子
団を含まないのに対して、分子量６７、０００の単量体
で一分子ずつのPQQとヘムｃ分子団を含む。
【０００７】上記で述べたように、今日まで本発明で述
べられているようなAADHの報告はない。特定の菌株の菌
体可溶性画分より単離された精製酵素がアルコ−ル類お
よびアルデヒド類の酸化を触媒し、アルコ−ル類からは
アルデヒド類またはケトン類、アルデヒド類からはカル
ボン酸類を生成することが見いだされた。さらに特徴的
には該酵素はＬ−ソルボ−スをL-ソルボソンを経て2KGA
に酸化する。本発明はこの知見を基礎として完成され
た。
【０００８】
【課題を解決するための手段】後述の実施例に従って調
製されたAADH精製標品の物理化学的諸性質をいかに示
す： １）酵素活性 本研究によるAADHは電子受容体存在化でアルコ−ル類お
よびアルデヒド類の酸化を触媒し、アルコ−ル類からは
アルデヒド類またはケトン類、アルデヒド類からはカル
ボン酸類を生成する。
【０００９】本酵素は酸素を直接電子受容体として利用
できない。しかし、電子受容体として機能する能力のあ
るいくつかの適切な物質を本発明による酵素は利用する
ことができる。電子受容体として、２、６−ジクロロフ
ェノ−ルインドフェノ−ル（本文中以後、DCIPと記
す）、フェナジン メソサルフェイト（本文中以後、PM
Sと記す）、ウルスタ− ブル−、フェリシアナイド、
コエンザイムＱおよびチトクロ−ムｃなどが使用でき
る。
【００１０】酵素活性測定はスペクトロフォトメ−タ−
（UVIKON 810、コントロン社製）を用いDCIPの600 nmの
吸光度の減少を25℃で測定することによっておこなっ
た。酵素活性１単位は１分間に1 μmole量のDCIPの還元
を触媒する酵素の量と定義した。DCIPの分子吸光係数は
pH 8.0においてmM濃度当たり１５とした。標準反応溶液
( 1 ml)は0.1 mMのDCIP、1 mMのPMS、125 mMのL-ソルボ
−ス、50 mMのトリス−マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液(pH
8.0)と3-8 μlの酵素溶液を含んでいる。比較対照用と
して上記反応溶液に基質のみを含まないものをもちい
た。
【００１１】２）基質特異性 AADHの基質特異性はL-ソルボ−スのかわりに様々な基質
をもちいた上記１）の酵素活性測定法をもちいて決定さ
れた。測定結果は表１に示す。一級アルコ−ル、二級ア
ルコ−ル、アルデヒドおよびポリエチレングリコ−ル、
ポリビニルアルコ−ルを含む高分子量アルコ−ルと様々
な物質が基質となりえた。
【００１２】３）至適pH AADHの反応速度とpHのあいだの関連性はトリス−マレイ
ト−苛性ソ−ダ緩衝液(pH 6.0から8.0)とトリス−塩酸
緩衝液(pH 9.0)でいくつかの基質をもちいて測定され
た。結果は表２に示す。基質の種類に関係なく、AADHは
pH 7.0から9.0の範囲でもっとも高い活性を示した。
【００１３】４）pH安定性 精製AADHは表３に示す様々なpH値の緩衝液中4℃で一定
時間放置された。残存酵素活性はL-ソルボ−スまたはL-
ソルボソンを基質としてもちい上記１）の酵素活性測定
法で測定された。測定結果を表３に示す。精製酵素はア
ルカリpH領域で比較的安定で、酸性化により不安定とな
る。
【００１４】５）熱安定性 精製AADHは0.1 M NaCl 、5%スクロ−スを含む25 mMト
リス−塩酸緩衝液(pH 8.0)中様々な温度で10分間処理さ
れた後に、ただちに氷冷された。残存酵素活性はいくつ
かの基質をもちい上記１）の酵素活性測定法で測定され
た。測定結果を表４に示す。AADHは30℃以下では安定で
あるが、40℃以上で不安定である。
【００１５】６）至適温度 AADH の酵素活性は10℃から50℃の温度下でいくつかの
基質をもちい上記１）の酵素活性測定法で測定された。
結果は表５に示す。本酵素は20℃から40℃の温度領域に
反応至適を示す。
【００１６】７）分子量 AADHの分子量はゲル濾過カラムクロマトグラフィ−をも
ちいて決定された。酵素サンプルは酵素精製のための樹
脂、たとえば0.1 M NaCl 、5%スクロ−スを含む25 mM
トリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化されたセファクリ
ルS-300HR（ファルマシア社製）に添加された。分子量
スタンダ−ドとして、チログロブリン(670,000 ダルト
ン)、フェリチン(450,000 ダルトン)、カタラ−ゼ(240,
000 ダルトン)、アルドラ−ゼ(158,000 ダルトン)、ガ
ンマ グロブリン(158,000 ダルトン)、ウシ血清アルブ
ミン(66,200 ダルトン)、オボアルブミン(45,000 ダル
トン)、キモトリプシノゲン A(25,000 ダルトン)、ミオ
グロビン(17,000 ダルトン)、チトクロ−ム c(12,500
ダルトン)およびビタミン B12(1,360 ダルトン)がもち
いられた。結果として、AADHの分子量は135,000±5,000
ダルトンと決定された。つぎに、精製AADHはベ−タ
メルカプトエタノ−ル存在下ソディウム ドデシル サ
ルフェイト(SDS)で処理され、その分子構造はSDS-ポリ
アクリルアミド電気泳動分析により解析された。分子量
スタンダ−ドとして、 フォスフォリラ−ゼ B(92,500
ダルトン)、ウシ血清アルブミン(66,200 ダルトン)、オ
ボアルブミン(45,000 ダルトン)、カ−ボニック アン
ヒドラ−ゼ(31,000 ダルトン)、大豆トリプシン イン
ヒビタ−(21,500 ダルトン)およびリゾチ−ム(14,400
ダルトン)がもちいられた。本酵素は２種のサブユニッ
トから成ることが示された。第一のサブユニット(アル
ファ サブユニット)は分子量が64,500±2,000であり、
第二のサブユニット(ベ−タ サブユニット)は分子量が
62,500±2,000である。
【００１７】８）Km（ミカエリス定数）値の測定 １）に記載の方法をもちいて、酸化速度と基質濃度変化
の関係をみかけ上のミカエリス定数(Km)として決定する
ために測定した。DCIPとPMSを電子受容体として含む反
応液で測定した。L-ソルボ−スおよび1-プロパノ−ルに
対するKm値はそれぞれ230 mMおよび2 mMと算出された。
【００１８】９）金属イオンの影響 １）に記載の方法をもちいて、様々な金属イオンの酵素
活性に対する影響を測定した。表６に結果を示す。検査
された金属イオン中、Mg2+とCa2+イオンのみが酵素活性
に影響を与えなかった。他は酵素活性に対して強度およ
び中度の影響を示した。Cu2+, Mn2+, Fe3+ は酵素の強
い阻害剤である。
【００１９】１０）阻害剤の影響 １）に記される方法をもちいて、阻害剤の酵素活性に対
する影響を測定した。表７に結果を示す。エチレンヂア
ミン テトラアセティック アシッド(EDTA)およびエチ
レン グリコ−ル ビス（ベ−タ−アミノエティルエ−
テル）-N,N,N',N'-テトラアセティック アシッド(EGT
A)は酵素活性に対して強い阻害を示した。
【００２０】１１）補欠分子族 精製AADHの吸光スペクトルは図１に示すように280 nmの
極大吸収と290 nmの肩を示した。第二の吸収ピ−クが34
0 nmに380-420 nmの広い肩をともない検出された。この
吸収スペクトルはAADHがPQQを補欠分子族としてもって
いることを強く示唆した。
【００２１】100 mM NaH2PO4-塩酸(pH 約 1.0) 中の精
製酵素(4.5 mg量）に同容量のメタノ−ルを添加し混合
した。サンプルより15,000 rpm、10分間遠心分離で沈殿
物を除去した。この抽出物を補欠分子族の同定にもちい
た。抽出物の吸収スペクトルはPQQの標準サンプル（三
菱ガス化学社製）と完全に一致した。さらに、逆相カラ
ム(TSK-ODS 80TM, トヨ−ソ−ダ社製）をもちいた高圧
液体クロマトグラフィ−分析でAADH抽出物はPQQ標準サ
ンプルと同一の保持時間を示した。
【００２２】１２）等電点 AADHの等電点(pI)が決定された。エレクトロ フォ−カ
シングのため8.5 M尿素、2%(w/v)非イオン性界面活性剤
例えばノイデット P-40および2.4%(w/v)のpH勾配形成の
ための緩衝剤物質；アンフォライト例えばファルマライ
ト, pH 2.5-5.0（ファルマシア社製）を含んだ4%濃度の
ポリアクリルアミド ゲルをもちいた。電極液として
は、0.01 Mのイミノ二酢酸を陰極に、0.01 MのN-2-ヒド
ロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルフォニック
アシッド(HEPES)を陽極にもちいた。サンプルの等電点
はファルマシア社製の低pHキャリブレ−ション キッ
ト、pH 2.5-5.0との比較により算出した。結果として、
AADH は等電点約4.4 のバンド群を示した。
【００２３】１３）精製法 AADHの精製は以下のような通常もちいられる精製法の組
み合わせが有効である。
【００２４】沈殿剤による分画、例えば 硫酸アンモニ
ウム、ポリエチレングリコールなど イオン交換クロマトグラフィー 吸着クロマトグラフィー ゲル濾過クロマトグラフィー ゲル電気泳動 塩析および透析 本発明によるAADHは、適切な微生物株を培養し、得られ
た細胞を破砕し、破砕細胞の無細胞抽出物、好ましくは
微生物菌体可溶性画分(cytosol fraction)から調製する
事ができる。
【００２５】本発明により使用される微生物菌株は前述
したAADHを生産する能力をもつグルコノバクター属に属
するすべての菌株を含む。また、本菌株の機能的同等
物、継代培養、変異株および誘導体も本発明に使用でき
る。
【００２６】好適な菌株はグルコノバクター オキシダ
ンス(Gluconobacter oxydans)である。特に好適なグル
コノバクター オキシダンス株はゲッチンゲン（ドイ
ツ）にあるドイツ微生物寄託所(Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen in Gottingen; Germany) にDSM No.
4025株として1987年4月17日に寄託されている。
【００２７】さらに、該菌株の継代培養はブタペスト条
約(Budapest Treaty) の契約規定にもとずいて微生物工
業技術研究所（日本）(Industrial Science and Techno
logy, Fermentation Research Institute, Japan) に；
グルコノバクター オキシダンス(Gluconobacter oxyda
ns) DSM No. 4025 FERM BP-3812株として1992年3月30日
に寄託されている。
【００２８】さらに、ヨーロッパ特許公開(European Pa
tent Publication) No.0278 447 (4226/081k)に本菌株
の性質が記載されている。
【００２９】本微生物は好気条件下、適切な栄養源を含
んだ液体培地によって培養される。培養はpH 約4.0-9.0
の間でおこなえるが、好ましくはpH約6.0-8.0のあいだ
がのぞましい。培養時間は、pH、温度および使用される
培地条件によりことなるが、通常２ー５日間で好結果を
もたらす。好ましい培養のための温度範囲は、約13℃か
ら36℃であるが、好ましくは約18℃から33℃がのぞまし
い。
【００３０】通常培養用培地は資化可能な炭素源、利用
可能な窒素源や無機物質、ビタミン類、微量成分および
他の成育促進因子などを含む。資化可能な炭素原として
は、L-ソルボース、グリセロール、D-グルコース、D-マ
ニトール、D-フルクトース、D-アラビトールおよびこれ
らに類するものが使用できる。
【００３１】様々な無機および有機物質が窒素源として
もちいられる、例えばイースト エキストラクト、ミー
ト エキストラクト、ペプトン、カゼイン、コーン ス
チィープ リカー、尿素、アミノ酸、硝酸、アンモニウ
ム塩およびこれらに類するものが使用できる。 無機物
質として硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一
および第二鉄、炭酸カルシウムおよびこれらに類するも
のが使用できる。
【００３２】以下に、培養後の菌体からのAADHの単離精
製法の実施態様を簡便に記す。
【００３３】（１）菌体を培養槽より遠心分離もしくは
濾過によって収集する。
【００３４】（２）該菌体を緩衝液に懸濁した後、ホモ
ゲナイザー、超音波、リゾチーム処理など細胞破砕液を
調製できるもので破砕する。
【００３５】（３）AADHは破砕された細胞の無細胞抽出
液より、さらに好ましくは微生物菌体の可溶性画分より
単離精製される。
【００３６】本発明によるAADHはアルコール類およびア
ルデヒド類からのアルデヒド類、カルボン酸類およびケ
トン類、とくにL- ソルボースよりL-ソルボソンを経て2
KGAを生産する触媒として有用である。
【００３７】反応はトリスー塩酸緩衝液、リン酸緩衝液
又はそれに類する溶媒中で、電子受容体例えばDCIP、PM
S、ウルスタ− ブル−、フェリシアナイド、コエンザ
イムＱ、チトクロ−ムｃおよびそれに類するものの存在
化、pH約 6.0-9.0でおこなわれる。
【００３８】該反応のためのこのましい温度範囲は約10
℃から50℃である。pHと温度がそれぞれ約7.0-8.0、20
℃-40℃に設定されたとき通常最もこのましい反応結果
が与えられる。
【００３９】反応溶媒中の基質濃度は他の反応条件によ
って変得ることができる、しかし、一般的に約10-100 g
/l濃度、さらに最も好ましくは約30-40 g/lである。
【００４０】該反応において、AADHは適切な担体に固定
された状態でも使用できる。一般的にこれまで知られて
いるような固定化酵素としても使用可能である。例え
ば、本酵素は直接反応基をもった膜、粒子、もしくは樹
脂のようなものに結合できる、又はグルタルアルデヒド
のような反応基物質を架橋として樹脂に結合することも
できる。上記に加えて、培養された細胞もアルコール類
およびアルデヒド類からのアルデヒド類、カルボン酸類
およびケトン類、とくにL- ソルボースより2KGAを生産
する触媒として有用である。
【００４１】
【実施例】以下の実施例にてさらに本発明についてのべ
る。
【００４２】実施例 １ AADHの調製 すべての操作は特に記載のないかぎり4℃でおこなわれ
た。
【００４３】（１）グルコノバクター オキシダンス D
SM No. 4025(FERM BP-3812)の培養 （A）培地調製 L-ソルボース 8%(w/v)(別滅菌)、グリセロール 0.05%、
MgSO4・7H2O 0.25%、コーン スティープ リカー 1.75
%、ベーカーズ イースト 5.0%、CaCO3 0.5%と尿素 0.5
%(別滅菌)(滅菌前pH 7.0)を含む培養培地を試験管(それ
ぞれ5 ml)にいれ120℃, 20分間滅菌した。
【００４４】（B）植菌、培養 この種培養培地に、D-マニトール 5.0%、MgSO4・7H2O
0.25%、コーン スティープ リカー 1.75%、ベーカー
ズ イースト 0.25%、CaCO3 0.5%、尿素 0.5%(別滅菌)
および寒天 2.0%(滅菌前pH 7.0)を含むスラント培養培
地で27℃、３日培養された菌株より一白金耳の細胞を植
菌し30℃で24時間培養した。この種培養(5ml)は500 ml
エルレンマイヤ− フラスコにいれた100 mlの上記と
同様の培地に植菌され30℃、24時間培養した。さらに、
この種培養(5 ml)は500 ml エルレンマイヤ− フラス
コにいれた100 mlの上記と同様の培地に植菌され30℃、
24時間培養された。このように調製された種培養を30 l
ジャー培養槽中の15 l の本培地への種菌としてもちい
た。培地はL-ソルボース 10%(w/v)(別滅菌)、グリセロ
ール 0.05%、尿素 1.6%(別滅菌)、MgSO4・7H2O 0.25%、
ベーカーズ イースト5.0%、CaCO3 1.5%とコーン ステ
ィープ リカー 3.0%を含む。発酵は、温度30℃、攪拌5
00 rpmおよび通気7.5 l/分でおこなった。発酵開始40時
間後、菌体は遠心分離(10,000 g, 15分)で集菌された。
菌体は1 l の0.9% NaCl、5 mMのMgCl2および1 mMのフェ
ニルメチルスルファニル フルオライド(PMSF)をふくむ
25 mMトリスー塩酸、pH 7.0、に懸濁された。懸濁液はC
aCO3および他の沈降性培地成分を除去するため500 g、
５分間遠心分離された。その後、細胞は10,000 g、15分
間の遠心分離で回収された。上記の操作は再度繰り返さ
れた。結果として、125 g(湿式重量) のグルコノバクタ
ー オキシダンス DSM No. 4025(FERM BP-3812)細胞が
得られた。洗浄菌体は次の精製段階まで、-20℃で１週
間冷凍保存された。
【００４５】（２）可溶性画分の調整 上記ステップ(1)でえられたグルコノバクター オキシ
ダンス DSM No. 4025(FERM BP-3812)細胞は100 mlの0.
5 mMのPMSFをふくむ25 mMのトリスー塩酸緩衝液、pH 8.
0に懸濁され細胞破砕のため細胞破砕装置(フレンチ プ
レス)で２度処理(1,500 kg/cm2)された。この均一化さ
れた懸濁液に 2 mlの1 mg/ml のDNA切断用DNA分解酵素I
(シグマ社製)と1 mlの0.5 M濃度のMgCl2を添加し、混合
物を15分間放置した後に、細胞残さを除くため6,000
g、15分間遠心分離した。こうして得られた無細胞抽出
液(210 ml)は100,000 g、60分間遠心分離された。この
上清を可溶性画分として回収した(200 ml)。
【００４６】（３）PEG(MW6000) 処理(DNA沈殿) 上記ステップ(2)の可溶性画分(200 ml)は2 Lの0.5 mMの
PMSFをふくむ25 mMのトリスー塩酸緩衝液、pH 8.0に対
して透析された後に、40 gのPEG 6000( 半井化学工業)
と5 ml の2N KClを添加され、30分間放置され、14,000
g、20分間遠心分離された。上清は同様の緩衝液で400 m
lまで希釈された。
【００４７】（４）DEAE トヨパール 650M(弱イオン交
換) カラム クロマトグラフィー 上記ステップ(3)でえられた上清(400 ml)は0.25 mMのPM
SF、5%のスクロースを含む25 mMのトリスー塩酸緩衝
液、pH 8.0で平衡化されたジエチルアミノエチル(DEAE)
トヨパール 650M カラム(内径2.5 cm、全長35 cm)に添
加された。カラムが同様の緩衝液600 mlで洗浄された
後、酵素は同様の緩衝液(2000 ml)に含まれる 0から0.5
MまでのNaClの濃度勾配によって溶出された。活性画分
(174 ml)は回収され次のステップに供された。
【００４８】（５）Ｑ−セファロース(強イオン交換)
カラム クロマトグラフィー 「第２ステップ」 前ステップで得られた活性画分は0.25 mMのPMSF、5%の
スクロースを含む25 mMのトリスー塩酸緩衝液、pH 8.0
で平衡化されたＱーセファロース カラム(内径2.5 c
m、全長35 cm)に添加された。カラムが緩衝液により完
全に洗浄された後、酵素活性溶出は同様の緩衝液(2000
ml)に含まれる 0.25から0.5 MまでのNaClの濃度勾配に
よってなされた。電気泳動的に均一なAADHを含む画分は
回収され、PM−30膜(アミコン コーポレイション)によ
り20 mlまで濃縮された。
【００４９】AADH の精製段階の要約は表８に示す。
【００５０】（６）単離されたAADH の純度 単離されたAADH の純度検定のため、ポリアクリルアミ
ド ゲル電気泳動をおこなった。 サンプルはデイビス
(Davis)らの方法(Ann. N.Y.Acad. Sci. 121:404, 196
9)にしたがってトリスー塩酸緩衝液、pH 9.4の7.5% ポ
リアクリルアミドゲルに添加された。タンパク質はタン
パク染色剤であるコマシー ブリリアント ブルー R-2
50によって染色された。ゲル中の酵素活性はニトロ ブ
ルー テトラゾリウム クロライド(シグマ社製)の還元
との共役によって検出された。ゲルは50 mMのトリス−
マレイト−苛性ソ−ダ緩衝液、pH 8.0、0.01 mMのPQQ、
0.1mMのPMS、0.4 mMのニトロ ブルー テトラゾリウム
クロライドおよび0.25 MのL-ソルボースを含む溶液
に、30 ℃暗所下浸された。
【００５１】AADHはタンパク染色において３本の近接し
たバンドを示し、すべてのバンドは酵素活性を示した。
３本のゲル中でのタンパクバンドは電気泳動中、酵素
より補欠分子族であるPQQが解離することに起因する。
【００５２】（７）反応生成物の同定 50 μlの精製AADH(1.5 mg)、0.1 mlの10 mM PMS、0.5
mlの0.4 M リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5、0.25 ml
の水および0.1 mlのさまざまな基質の20%溶液を含む反
応液が30℃、15時間、緩やかな攪拌をともない反応させ
られた。反応生成物は薄層クロマトグラフィ−で分析さ
れた。生成物は標準サンプルと直接比較することで同定
された。結果は表９に示す。
【００５３】実施例 ２ 精製AADHによる2KGA生産 0.5 mlの精製AADH(15 mg)、1 mlの20% L-ソルボ−ス溶
液、1 mlの10 mM PMS、5 mlの0.4 M リン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 6.5 および2.5 mlの水を含む反応液が30
℃で緩やかな攪拌をともない反応させられた。結果とし
て、約70 mg／時間の生成速度で2KGAが生産された。
【００５４】実施例 ３ 休止菌体系での2KGA生産 反応液(10 ml): 実施例 １のステップ(1)と同様の方
法で調整されたグルコノバクタ− オキシダンス DSM N
o. 4025 (FERM BP-3812)菌体 0.25 g、1 mlの20%L-ソル
ボ−ス溶液、1 mlの10 mM PMS、1 mlの3% 食塩水、1 m
l の30 μM PQQ、0.1 g 炭酸カルシウム、が30℃で緩
やかな攪拌をともない反応させられた。結果として、約
6 mg／時間の生成速度で2KGAが生産された。
【００５５】
【表１】 表 １ ＡＡＤＨの基質特異性 基質 濃度（ｍＭ） 相対的活性（％） Ｌ−ソルボース １２５ １０.９ Ｌ−ソルボソン ２ １６.２ Ｄ−ソルビトール ５０ ７.１ Ｄ−グルコース ５０ ２５.３ Ｄ−マンニトール ５０ ２２.２ Ｄ−フルクトース １２５ ６.６ ＤＬ−グリセルアルデヒド ２５ ８０.２ メタノール ５０ ０.３ エタノール ５０ ８８.６ １−プロパノール ５０ １００.０ １−ブタノール ５０ ６９.４ １−ペンタノール ５０ ４９.８ １−ヘキサノール ５０ ４９.１ １−ヘプタノール ５０ ４７.７ ２−プロパノール ５０ ７８.２ ２−ブタノール ５０ ８７.４ プロピオンアルデヒド ２５ ８３.３ ＰＥＧ＊１０００ ０.４％ ６８.９ ＰＥＧ＊２０００ ０.４％ ６０.２ ＰＥＧ＊４０００ ０.４％ ３４.５ ＰＥＧ＊６０００ ０.４％ １４.１ＰＶＡ＊＊ ０.４％ ３８.１ ＊ポリエチレングリコール（製造会社：半井化学株式会
社） ＊＊ポリビニルアルコール（製造会社：和光純薬化学工
業株式会社）
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】 緩衝液：ＭＣ マクイルベイン(McIlvaine)緩衝液 ＡＣ 酢酸塩緩衝液 ＴＭ トリス−マレイト−ＮａＯＨ緩衝液 ＴＨ トリス−ＨＣｌ緩衝液
【００５８】
【表４】
【００５９】
【表５】
【００６０】
【表６】 表 ６ ＡＡＤＨ活性に対する金属イオンの影響 金属 相対的活性 （５ｍＭ） （％） ＣｕＣｌ2 ０ ＭｎＣｌ2 ０ ＦｅＣｌ3 ２.６ ＺｎＣｌ2 ９.６ ＦｅＣｌ2 １１.３ ＣｏＣｌ2 １６.５ ＮｉＳＯ4 ２３.０ ＭｇＣｌ2 ９３.０ ＣａＣｌ2 ９７.８ 対照 １００.０
【００６１】
【表７】 表 ７ ＡＡＤＨ活性に対する阻害剤の影響 阻害剤 相対的活性 （ｍＭ） （％） ＥＤＴＡ （５） １２.６ ＥＧＴＡ （５） １０.９ ＮａＦ （１） １０１.３ キニン （１） ９８.７ ＮＥＭ* （２） ９１.７ ヒドロキシアミン(0.5) ９８.３ ＩＣＨ2ＣＯＯＮａ(1) ９９.１ Control １００.０ * Ｎ−エチルマレイミド
【００６２】
【表８】 (a) “活性“は５頁の酵素活性１）に記載の方法によ
り測定した。
【００６３】(b) “無細胞抽出物”は実施例１（２）
に記載の方法により調製された。
【００６４】(c) “可溶性画分”は実施例１（２）に
記載の方法により調製された。
【００６５】(d) “ＰＥＧ ６０００上清は実施例１
（３）に記載の方法により調製された。 (e) “ＤＥＡＥ−トヨパール”は実施例１（４）に記
載の方法により調製された。
【００６６】(f) “Ｑ−セフアロース”は実施例１
（５）に記載の方法により調製された。
【００６７】
【表９】 表 ９ ＡＡＤＨによる種々の基質からの生成物 基質 生成物 ソルボース ソルボソン ２−ＫＧＡ ソルボソン ２−ＫＧＡ ソルビトール グルコース グルコネート ソルボース グルコース グルコネート フルクトース ２−ケト−Ｄ−グルコネート
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＡＤＨの吸収スペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/60 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のような物理化学的特性を有するア
    ルコール／アルデヒド脱水素酵素： a) 至適pH ：約 7.0 - 9.0 b) 至適温度：約 20 - 40℃ c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン（それぞれ分
    子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブ
    ユニットとベータ サブユニットのいずれの組み合わせ
    からなる２つのサブユニットからなる。） d) 基質特異性：一級および二級アルコール類、および
    アルデヒド類に活性を示す、 e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン f) 等電点：約 4.4
  2. 【請求項２】 請求項１に示された性質を有するアルコ
    ール／アルデヒド脱水素酵素を生産可能なグルコノバク
    ター属に属する微生物より取得される、請求項１のアル
    コール／アルデヒド脱水素酵素。
  3. 【請求項３】 微生物がグルコノバクタ− オキシダン
    ス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)と同等と見なされる性
    質をもつグルコノバクター オキシダンスである請求項
    ２のアルコール／アルデヒド脱水素酵素。
  4. 【請求項４】 該微生物がグルコノバクター オキシダ
    ンス DSM No. 4025(FERM BP-3812)、その機能的同等
    物、継代培養、変異株および誘導体である請求項３のア
    ルコール／アルデヒド脱水素酵素。
  5. 【請求項５】 以下のような物理化学的特性、 a) 至適pH ：約 7.0 - 9.0 b) 至適温度：約 20 - 40℃ c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン（それぞれ分
    子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブ
    ユニットとベータ サブユニットのいずれの組み合わせ
    からなる２つのサブユニットからなる） d) 基質特異性：一級および二級アルコール、およびア
    ルデヒドに活性を示す、 e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン f) 等電点：約 4.4 を有するアルコール／アルデヒド脱水素酵素の製造方法
    であり、好気条件下液体栄養培地中で上記の性質を有す
    るアルコール／アルデヒド脱水素酵素を生産する能力を
    もつグルコノバクター属に属する微生物を培養し、該微
    生物の細胞破砕し、該微生物の破砕された細胞の無細胞
    抽出液よりの酵素の単離精製よりなる方法。
  6. 【請求項６】 微生物がグルコノバクタ− オキシダン
    ス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)と同等と見なされる性
    質をもつグルコノバクター オキシダンスである請求項
    ５の製造方法。
  7. 【請求項７】 微生物がグルコノバクター オキシダン
    ス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)、その機能的同等物、
    継代培養、変異株および誘導体である請求項６の製造方
    法。
  8. 【請求項８】 アルコール及び／又はアルデヒドを、電
    子受容体の存在下に、 (i) 以下のような物理化学的特性を有するアルコール
    ／アルデヒド脱水素酵素a) 至適pH ：約 7.0 - 9.0 b) 至適温度：約 20 - 40℃ c) 分子量：135,000 ± 5,000 ダルトン（それぞれ分
    子量64,500± 2,000 と62,500±2,000のアルファ サブ
    ユニットとベータ サブユニットのいずれの組み合わせ
    からなる２つのサブユニットからなる） d) 基質特異性：一級および二級アルコール、およびア
    ルデヒドに活性を示す、 e) 補欠分子族：ピロロキノリン キノン f) 等電点：約 4.4 または (ii) 好気条件下液体栄養培地中で上記の性質を有する
    アルコール／アルデヒド脱水素酵素を生産する能力をも
    つグルコノバクター属に属する微生物、または (iii) 該微生物の無細胞抽出液 と、接触させ、そして生成アルデヒド、ケトン又はカル
    ボン酸を反応混合物から単離することよりなる、アルコ
    ール又はアルデヒドからアルデヒド、ケトン及び／また
    はカルボン酸を製造する方法。
  9. 【請求項９】 微生物がグルコノバクタ− オキシダン
    ス DSM No. 4025 (FERM BP-3812)と同等と見なされる性
    質をもつグルコノバクター オキシダンスである請求項
    ８の方法。
  10. 【請求項１０】 微生物がグルコノバクター オキシダ
    ンス DSM No. 4025(FERM BP-3812)、その機能的同等
    物、継代培養、変異株および誘導体である請求項９の方
    法。
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