CN109943601B - 利用2-酮基-l古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用2‑酮基‑L古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法,该方法是以2‑酮基‑L‑古龙酸结晶母液为原料液,从中提取出4,5‑二氢‑4,5‑二氧代‑1H‑吡咯并[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸。本发明利用2‑酮基‑L‑古龙酸结晶母液制备4,5‑二氢‑4,5‑二氧代‑1H‑吡咯并[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸,不需要再经过发酵、离子交换、浓缩等工艺,步骤简单,节约了大量成本,变废为宝,充分利用资源,对环境友好。且本发明方法制备的产品吡咯喹啉醌为还原态,抗氧化效果更好。本发明步骤简便,分离效率高,绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备吡咯喹啉醌的方法,具体涉及一种利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸的方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ,又名4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸)包括氧化态和还原态形式。它是继核黄素和烟酰胺之后发现的第三类辅酶,为B族维生素成员,其作为多种酶类辅基,对生命体有重要生理活性。研究发现,缺乏PQQ的小鼠生长缓慢、皮肤脆弱、骨质疏松、骨骼异常、免疫应答低下、生殖能力差,容易产生关节炎症。值得注意的是,哺乳动物体内不能合成PQQ,必须从外部摄入以满足生命活动的需要。因此,PQQ被认为是人体必须的维生素及营养素,可用作新型功能食品原料。
然而,PQQ的生产制备却是其大规模应用的瓶颈。目前,PQQ的制备方法主要有微生物发酵和化学合成方法。已报道的PQQ化学合成方法需要经过十步以上的反应才能获得,产率低,并且需要使用大量有毒试剂和重金属催化剂,对环境破坏比较大。微生物发酵法制备PQQ的主要问题是PQQ发酵产量非常低(报道的仅有一百微克每升),远远达不到生产要求。因此,寻找高效、绿色的PQQ制备方法至关重要。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸的方法,该方法步骤简便,分离效率高,且得到的吡咯喹啉醌为还原态,抗氧化效果更好。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:
利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸的方法,是以2-酮基-L-古龙酸结晶母液为原料液,从中提取出4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸。
2-酮基-L-古龙酸结晶母液是维生素C生产过程中的二步发酵法产生的2-酮基-L-古龙酸钠醪液,经阴离子交换、浓缩、结晶而来的母液。
上述提取包括沉淀除杂、有机溶剂萃取富集、色谱分离纯化和结晶过程。
沉淀除杂是利用二价金属离子与2-酮基-L-古龙酸结晶母液中组分进行反应形成沉淀物除杂,其中二价金属离子为Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+中的至少一种;二价金属离子以金属盐或金属盐溶液的形式参与反应,金属盐溶液与2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1:2-10,金属盐溶液中二价金属离子总浓度为1-10mol/L。
有机溶剂萃取富集是先用萃取液对沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液进行萃取,分离有机层,再用氨水对有机层进行反萃,分离氨水层,得到氨水反萃液;所述萃取液与沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1-5:1;萃取液包括萃取剂和稀释剂,萃取剂与稀释剂的体积比为1:1-20;氨水与萃取剂的体积比为1-3:1;氨水的质量分数为1-20%。
萃取剂为乙二胺、三乙胺、氨水、吡啶、四丁基氢氧化铵、三辛胺中的至少一种;稀释剂为正丙醇、正丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正辛醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一种。
色谱分离纯化是将氨水反萃液浓缩,上色谱柱,再洗脱,收集洗脱液;色谱柱填料为聚酰胺、聚苯乙烯微球、氨基硅胶,柱体积与浓缩后的氨水反萃液的体积比为1:1-3;色谱柱洗脱是依次用2-10倍柱体积水、3-15倍柱体积5-80%(v/v)乙醇-水洗脱,收集乙醇-水洗脱部位;洗脱后将乙醇-水洗脱部位旋蒸,得到粗产品。
乙醇-水的水中含有质量分数0.01-0.1%的氨水。
结晶是将粗产品在30-60℃下用质量分数0.5-30%的氨水溶解得到粗产品溶液,然后滴加质量分数0.5-20%的盐酸,4-10℃下静置4-10h,过滤得到沉淀结晶,即为4,5-二氢-4,5-二氧代-1H-吡咯并[2,3-f]喹啉-2,7,9-三羧酸。
粗产品与氨水的料液比为1:1-10(g/mL),盐酸体积为粗产品溶液体积的0.3-20倍。
本发明有益效果:
1、变废为宝,充分利用资源。在维生素C生产过程中,所用菌种转化山梨醇生产山梨糖以及山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸等发酵过程,不仅产生了2-酮基-L-古龙酸,也发酵产生了吡咯喹啉醌。由于吡咯喹啉醌具有酸性,因此其可与2-酮基-L-古龙酸一起经过离子交换、浓缩、结晶等工艺步骤,累积在2-酮基-L-古龙酸结晶母液中。2-酮基-L-古龙酸经过三次结晶之后的母液一般作为废液排放,不仅污染环境,而且缺乏对资源的有效利用。本发明则是利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌,不需要再经过发酵、离子交换、浓缩等工艺,步骤简单,节约了大量成本,且对环境友好。
2、本发明方法制备的产品吡咯喹啉醌为还原态,抗氧化效果更好。本发明生产工艺的结晶母液中2-酮基-L-古龙酸在现有条件下转变为维生素C,维生素C可以将氧化态吡咯喹啉醌还原为还原态。还原态吡咯喹啉醌具有更高的抗氧化活性。
3、本发明利用二价金属盐选择性沉淀杂质。根据对2-酮基-L-古龙酸结晶母液中化学成分分析,该母液中主要杂质成分为2-酮基-L-古龙酸、2-酮基-L-古龙酸氧化物、维生素C、腺苷等。钙、镁、锰、锌、铁、铜等金属离子可以与这些杂质发生络合反应形成不溶性沉淀,从而达到分离杂质与目标物的目的。
4、本发明在萃取富集和分离纯化中充分利用目标物结构特征,使用可以与目标物进行特异性分子间相互作用的材料,从而达到选择性分离纯化的目的。例如,在萃取富集中,使用碱性有机溶剂(三辛胺、乙二胺、吡啶、氨水等)可与目标物形成离子对;在色谱分离中,使用聚酰胺、聚苯乙烯微球、氨基硅胶等可与目标物形成氢键络合、π离域电子络合等。
5、本发明步骤简便,分离效率高,绿色环保。能够利用反萃取法循环利用有机萃取液,所用有机洗脱剂和氨水减压浓缩回收后可继续利用,这些措施可减少有机液排放,达到绿色环保的效果。
附图说明
图1为2-酮基-L-古龙酸三次结晶母液色谱图。
图2为本发明最终产物的质谱图。
图3为本发明最终产物的1H-NMR图谱。
图4为本发明最终产物的13C-NMR图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、2-酮基-L-古龙酸结晶母液的制备
D-山梨醇通过二步发酵法产生2-酮基-L-古龙酸钠醪液。2-酮基-L-古龙酸钠醪液经过超滤过滤去除蛋白、菌丝等杂质,再经过树脂柱进行树脂交换,产生2-酮基-L-古龙酸树脂交换液。量取2-酮基-L-古龙酸树脂交换液1L,进行减压浓缩(温度55~80℃,真空度-0.055~-0.09MPa),其中,2-酮基-L-古龙酸含量为123mg/mL,再降温至4℃结晶,经过离心分离得到2-酮基-L-古龙酸一次母液70mL。2-酮基-L-古龙酸一次母液,减压浓缩(温度50~70℃,真空度-0.065~-0.1MPa),再降温至4℃结晶、离心分离得到2-酮基-L-古龙酸二次母液。2-酮基-L-古龙酸二次母液加质量分数为2%的碳酸钠和5%的甲醇,4℃结晶、离心分离得到2-酮基-L-古龙酸三次母液,即为本发明所用的2-酮基-L-古龙酸结晶母液。
HPLC检测(图1):采用XB-SAX色谱柱,以乙腈:水(乙腈和水均含2%甲酸)为流动相,梯度洗脱(30-90%,30min),流速0.5mL/min,洗脱60min,检测波长249nm,可以得到较好的色谱分析结果。通过在上述HPLC条件下与PQQ标准品对比,发现28.369min为PQQ峰。
实施例2
利用10L规模2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备PQQ的方法,包括以下步骤:
1、沉淀除杂
利用铁和钙盐沉淀法除杂,将1L的二价金属离子总浓度为1mol/L的CaCl2和FeCl2溶液加入10L 2-酮基-L-古龙酸结晶母液中,再加入200g Ca(OH)2调节pH,搅拌1h,过滤分离,得到沉淀物和上清液。
2、萃取富集
在上清液中加入萃取液,进行有机溶剂离子对络合萃取富集,萃取液与上清液的体积比为1:1,萃取液包括萃取剂(三辛胺、氨水(质量分数31.2%))和稀释剂(正丁醇、叔丁醇、正辛醇),其体积比为正丁醇:叔丁醇:正辛醇:三辛胺:氨水=6:2:1:1:0.2,分离有机层,用质量分数2%氨水对有机层进行反萃,氨水与萃取剂体积比1:1,分离氨水层,得到氨水反萃液。
3、色谱分离
将氨水反萃液减压浓缩至1L,上柱体积1L的聚酰胺柱色谱分离,依次用3L水、4L5%(v/v)乙醇-水(水中含有质量分数0.01%的氨水)洗脱,HPLC法分析检测。在乙醇-水部位中含有PQQ,旋蒸,获得5.2g纯度为90%的PQQ粗产品,收率为91.3%。
4、结晶纯化
碱溶酸沉法:1g PQQ粗产品在50℃下用质量分数1%氨水溶解,得到浓度为1g/mLPQQ溶液,然后滴加质量分数10%的盐酸0.3mL,再加入0.3mL乙腈和0.1mL二甲基亚砜,4℃下静置6h,过滤得到0.71g沉淀结晶。
产物分析:
产物的质谱、1H-NMR、13C-NMR数据(图2、3、4):通过质谱、1H-NMR、13C-NMR对产品PQQ进行结构鉴定,最终确定产品为还原态二钾盐(PQQH2K2)。首先,通过质谱分析确定产品的分子量。PQQ分子量为330,还原态PQQ分子量为332,还原态二钾盐PQQH2K2分子量为408,从图中可以看出,图为去氢负离子,即[M-H]-=408-1=407。通过1H-NMR分析可以确定结构中的氢信号。有三种氢信号分别对应PQQ结构中3种氢,1号7.2,2号6.8,3号6.2。通过13C-NMR分析可以确定结构中的碳信号。图中13个碳信号对应结构中13种碳,1号151.5,2号133.8,3号158.3,4号145.7,5号116.1,6号117.8,7号118.3,8号158.8,9号158.5,10号113.8,11号120.9,12号159.1,13号和14号172.9。
产物的HPLC检测:采用XB-SAX色谱柱,以乙腈:水(乙腈和水均含2%甲酸)为流动相,梯度洗脱(30-90%,30min),流速0.5mL/min,洗脱60min,检测波长249nm,可以得到较好的色谱分析结果。结果表明,最终产物为纯度达到95%以上的吡咯喹啉醌。
实施例3
利用10L规模2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备PQQ的方法,包括以下步骤:
1、沉淀除杂
利用锌和锰盐沉淀法除杂,将2L二价金属离子总浓度为3mol/L的ZnCl2和MnCl2溶液加入10L 2-酮基-L-古龙酸结晶母液中,再加入100g Ca(OH)2调节pH,搅拌1h,过滤分离,得到沉淀物和上清液。
2、萃取富集
在上清液中加入萃取液,进行有机溶剂离子对络合萃取富集,萃取液与上清液的体积比为3:1,萃取液包括萃取剂(三辛胺、乙二胺)和稀释剂(正丁醇、正丙醇、异戊醇),其体积比为正丁醇:正丙醇:异戊醇:三辛胺:乙二胺=6:2:2:2:0.5,分离有机层,用质量分数5%氨水对有机层进行反萃,氨水与萃取剂体积比2:1,分离氨水层,得到氨水反萃液。
3、色谱分离
将氨水反萃液减压浓缩至2L,上柱体积1L的氨基硅胶色谱柱分离,依次用2L水、6L10%(v/v)乙醇-水(水中含有质量分数0.02%的氨水)洗脱,在乙醇-水部位中含有PQQ,旋蒸,获得5.1g纯度为90%的PQQ粗产品,收率为90.9%。
4、结晶纯化
碱溶酸沉法:1g PQQ粗产品在50℃下用质量分数1%氨水溶解,得到浓度为1g/mLPQQ溶液,然后滴加质量分数10%的盐酸0.3mL,再加入0.3mL乙腈和0.1mL二甲基亚砜,4℃下静置6h,过滤得到0.70g沉淀结晶,即纯度在95%以上的PQQ产品。
实施例4
利用10L规模2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备PQQ的方法,包括以下步骤:
1、沉淀除杂
利用镁和铜盐沉淀法除杂,将5L二价金属离子总离子浓度3mol/L的MgCl2和CuCl2溶液加入10L 2-酮基-L-古龙酸结晶母液中,再加入100g Ca(OH)2调节pH,搅拌1h,过滤分离,得到沉淀物和上清液。
2、萃取富集
在上清液中加入萃取液,进行有机溶剂离子对络合萃取富集,萃取液与上清液的体积比为3:1,萃取液包括萃取剂(三辛胺、吡啶、四丁基氢氧化铵)和稀释剂(正丁醇、叔丁醇、正辛醇),其体积比为正丁醇:叔丁醇:正辛醇:三辛胺:吡啶:四丁基氢氧化铵=6:3:2:3:0.2:0.3,分离有机层,用质量分数5%氨水对有机层进行反萃,氨水与萃取剂体积比3:1,分离氨水层,得到氨水反萃液。
3、色谱分离
将氨水反萃液减压浓缩至3L,上柱体积1L的聚苯乙烯微球色谱柱分离,依次用6L水、9L 10%(v/v)乙醇-水(水中含有质量分数0.02%的氨水)洗脱,在乙醇-水部位中含有PQQ,旋蒸,获得5.2g纯度为90%的PQQ粗产品,收率为91.2%。
4、结晶纯化
碱溶酸沉法:1g PQQ粗产品在50℃下用质量分数1%氨水溶解,得到浓度为1g/mLPQQ溶液,然后滴加质量分数10%的盐酸0.3mL,再加入0.3mL乙腈和0.1mL二甲基亚砜,4℃下静置6h,过滤得到0.72g沉淀结晶,即纯度在95%以上的PQQ产品。
对比实验1、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)清除O2 -自由基能力
采用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶测试盒,利用黄嘌呤氧化酶法测定不同样品清除O2 -自由基能力,具体步骤参照试剂盒标准操作说明进行,结果见下表。
从上表可以看出,本发明获得的产品清除O2 -自由基的能力高于在市场上购买的PQQ标准品。
对比实验2、Fenton试剂法测定过氧化氢酶清除羟基自由基活力
实验采用测吸光度的方法测定样品清除羟基自由基的活性。
基本原理:Fenton试剂是H2O2与Fe2+构成的氧化体系。Fe2+与H2O2反应快速生成羟基,羟基有很强的加成反应性。反应中会有Fe3+生成,Fe3+可以与H2O2反应生成Fe2+,如此反复,会生成大量的羟基自由基。加入显色剂,测定其吸光度,就可以知道Fenton反应初始产生的羟基自由基的量。加入待测样品,再次测量吸光度,就可以推断出样品的羟基自由基的清除率。
具体步骤:①在10mL容量瓶中加入1mL 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH=7),0.8mL0.15mol/L的亚甲蓝溶液,用90%(v/v)乙醇稀释至10mL,摇匀,作为空白组;②在10mL容量瓶中加入1mL 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH=7),0.8mL 0.15mol/L的亚甲蓝溶液,0.4mL的Fe(Ⅱ)-EDTA溶液和0.2mL 7.5mmol/L的H2O2溶液,用90%(v/v)乙醇稀释至10mL,摇匀,作为对照组;③在10mL容量瓶中加入1mL 0.02mol/L的PBS缓冲液(pH=7),0.8mL 0.15mol/L的亚甲蓝溶液,0.4mL的Fe(Ⅱ)-EDTA溶液,0.2mL 7.5mmol/L的H2O2溶液和1mL1mg/mL的待测样品溶液(维生素C溶液,PQQ标准品溶液,以及实施例2产品溶液),用90%(v/v)乙醇稀释至10mL,摇匀,作为测试组;反应2h,用紫外-可见分光光度计测定660nnm下的吸光度。
羟基自由基清除率(%)=[1-(A0-A2)/(A0-A1)]×100
公式中,A0——空白组的吸光度;
A1——对照组的吸光度;
A2——测试组的吸光度;
测试结果
从上表可以看出,本发明获得的产品清除羟基自由基的能力高于在市场上购买的PQQ标准品。
Claims (4)
1.利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法,其特征在于,以2-酮基-L-古龙酸结晶母液为原料液,从中提取出吡咯喹啉醌;所述2-酮基-L-古龙酸结晶母液是维生素C生产过程中的二步发酵法产生的2-酮基-L-古龙酸钠醪液,经阴离子交换、浓缩、结晶而来的母液;所述提取包括沉淀除杂、有机溶剂萃取富集、色谱分离纯化和结晶过程;
所述沉淀除杂是利用二价金属离子与2-酮基-L-古龙酸结晶母液中组分进行反应形成沉淀物除杂,其中二价金属离子为Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+中的至少一种;二价金属离子以金属盐或金属盐溶液的形式参与反应,金属盐溶液与2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1:2-10,金属盐溶液中二价金属离子总浓度为1-10 mol/L;
所述有机溶剂萃取富集是先用萃取液对沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液进行萃取,分离有机层,再用氨水对有机层进行反萃,分离氨水层,得到氨水反萃液;所述萃取液与沉淀除杂后的2-酮基-L-古龙酸结晶母液的体积比为1-5:1;萃取液包括萃取剂和稀释剂,萃取剂与稀释剂的体积比为1:1-20;氨水与萃取剂的体积比为1-3:1;氨水的质量分数为1-20%;
所述萃取剂为乙二胺、三乙胺、氨水、吡啶、四丁基氢氧化铵、三辛胺中的至少一种;所述稀释剂为正丙醇、正丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正辛醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一种;
所述色谱分离纯化是将氨水反萃液浓缩,上色谱柱,再洗脱,收集洗脱液;色谱柱填料为聚酰胺、聚苯乙烯微球、氨基硅胶,柱体积与浓缩后的氨水反萃液的体积比为1:1-3;色谱柱洗脱是依次用2-10倍柱体积水、3-15倍柱体积5-80% v/v乙醇-水洗脱,收集乙醇-水洗脱部位;洗脱后将乙醇-水洗脱部位旋蒸,得到粗产品。
2.根据权利要求1所述的利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法,其特征在于,所述乙醇-水的水中含有质量分数0.01-0.1%的氨水。
3.根据权利要求1所述的利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法,其特征在于,所述结晶是将粗产品在30-60℃下用质量分数0.5-30%的氨水溶解得到粗产品溶液,然后滴加质量分数0.5-20%的盐酸,4-10℃下静置4-10h,过滤得到沉淀结晶,即为吡咯喹啉醌。
4.根据权利要求3所述的利用2-酮基-L-古龙酸结晶母液制备吡咯喹啉醌的方法,其特征在于,粗产品与氨水的料液比为1:1-10 g/mL,盐酸体积为粗产品溶液体积的0.3-20倍。
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CN109943601A (zh) | 2019-06-28 |
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