JPS6185187A - 新規なアルド−スレダクタ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ、産業上の利用分野 近年、還元型ニコチンアミド・アデノシン・ジヌクレオ
チド（以下、この型の酵素反応器においては、高価な補
酵素を有効に利用するという考えから、還元系の酵素反
応で生じた酸化型の補酵素（たとえばＮＡＤやＮＡＤＰ
）を再び、還元型（ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ）に戻す必要
があり、通常、再生系酵素と呼ばれる酵素を添加して連
続的に反応を行うことが必須となる。

通常の酵素はＮＡＤあるいはＮＡＤＰ特異的であること
が多く、ＮＡＤ、ＮＡＤＰの両者に作用する酵素は限ら
れている。

そこで、主反応酵素の補酵素特異性が、ＮＡＤおよびＮ
ＡＤＰの両者に作用する特異のものであれば、ＮＡＤあ
るいはＮＡＤＰ特異的な再生系酵素のいずれも利用する
ことができ、より利用範囲を拡げることが期待できる。

本発明はこのような利用範囲の拡大への要望に応えるべ
く開発されたもので、ケトース類に対し還元能を有し且
つ補酵素としてＮＡＤＰＨまダ属菌やピキア属菌の生産
するアルドースレダクターゼが知られている。

しかし、これらの酵素はＮＡＤＰＨに特異的に作用する
がＮＡＤＨは作用しないことが報告されている。

一方、動物起源、たとえば牛肝臓、豚脳、ウサギ水晶体
より抽出されたアルドースレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ
だけでな（ＮＡＤＨにも作用することが報告されている
。

ハ３発明が解決しようとする問題点 アルドースレダクターゼとしては、前記に示すのみが知
られているが、これら酵素には一長一短があり実用的価
値が低い。

すなわち、微生物由来のアルドースレダクターゼは■Ｎ
ＡＤＰＨには作用するがＮＡＤＨには作用しないこと、
■動物由来のフルドースレグクターゼはフラクトースや
ソルボースなどのケトース類には５元作用を有しないこ
と、及び大量培養にはむかないことなどの欠点を有して
いる。

そこで、本発明者らはこれらの諸欠点を一挙に解決すべ
く本発明を完成させた。

すなわち、ケトース類に対し還元能を有し且つ補酵素と
して、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを利用可能な新規なア
ルドースレダククーゼを提供するものである。

二３問題を解決するための手段 る。

なお本菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。

国学的性質 （ａ）各培地における生育状態 ■ＹＭ液体培地（２５℃、３日間培養）だ円形（３，２
〜４．８　）　Ｘ　（３，２〜５．３）μ多極出芽 皮膜は形成しない ■ＹＭ寒天培地（２５℃、１ケ月培養）表面平滑、乳白
色 ■ポテト・デキストロース培地におけるスライド培養口
糸および偽菌糸の形成は認められない（ｂ）子のう胞子
の形成 改良ゴロドコワ培地、オートミール培地、アダムス培地
および７Ｍ培地などの各寒天培地上で培養したが、いず
れも子のう胞子の形成は認められなかった。

（ｃ）射出胞子の形成 ＹＭ寒天培地上で射出胞子の形成は認められなかった。

（ｄ）各生理的性質 ■最適生育条件 最適ｐＨ４，５〜７．５ 最適生育温度　３０〜４５℃ ■生育の範囲 ｐＨ２，５〜８．５ 温度１５〜４８°Ｃ ■硝酸塩は同化しない ■脂肪は分解しない ■尿素は分解しない ■ゼラチンを液化しない ■耐浸適圧性　５０％グルコースを含むＹＭ寒天培地で
生育しない■カロチノイドの生成はない ■デンプン様物質の生成はない ［相］ビタミンフリーの培地では生育しない■アルブチ
ンを分解する （６）各種炭素源の発酵性及び同化性 ■発酵性 Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、シ＊ｔｌ
＆、乳糖、及びラフィノースの発酵性はない。

■同化性 第１表に示した通りである。

第１表　　炭素源の同化性 Ｄ−アラビノース　−　　　α−メチルグルコシド　−
Ｌ−アラビノース　−　　　可溶性デンプン　　　　−
Ｄ−リボース　　　−　　　イヌリン　　　　　　　−
Ｄ−キシロース　　＋　　　エタノール　　　　　　＋
Ｄ−グルコース　　＋　　　アトニット　　　　　　±
Ｄ−ガラクトース　−　　　エリトリット　　　　　　
−Ｌ−ラムノース　　−　　　イノシント　　　　　　
＋し一ソルボース　　十　　　〇−マンニット　　　　
−麦芽糖　　　　　　−〇−ソルビフト　　　　−シラ
糖　　　　　　−ズルシット　　　　　　−乳糖　　　
　　　　−グリセリン　　　　　　＋メリビオース　　
　−Ｄ、　　Ｌ−乳酸塩　　　　十セロビオース　　　
−　　　コハク酸塩　　　　　　十トレハロース　　　
−　　　クエン酸塩　　　　　　−ラフィノース　　　
−　　　サリンン　　　　　　　−メレジトース　　　
− 以上の菌学的性質から本菌株の分類学上の位置を「ザ・
イースト第２版（Ｊ、　Ｌｏｄｄｅｒ、Ｔｈｅ　　Ｙｅ
ａｓｔｓ、Ａ　　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　　５ｔｕｄｙ、
２ｎｄ　　Ｒｅｖｉｅｗ　　＆　　Ｅｎｌａｒｇｅｄ　
　Ｅｄ、、　　Ｎｏｒｔｈ　　Ｈｏ１ｌａｎｄ　　Ｐｕ
ｂ、Ｃｏ、１９７０）Ｊにより検索すると、偽菌糸をつ
くらないこと、発酵性のないこと、イノジットを同化す
ること、及び硝酸塩を同化しないことなどの点から本菌
株はクリプトコツカス・ラクタチボルスの性状に類似す
る。一方２本国株は４８℃で生育可能であるがクリプト
コアカス・ラクタチボルスの１１株の生育限界は４４℃
であることにおいてのみ異なっている程度である。

従って、本菌株はクリプトコツカス・ラクタチボルスで
あると判断し、−−； 量的性質を示す。

理化学的性質 ８１作用 当工亥酵素は１モルのＤ−キシロースやＤ−グルコース
、Ｌ−ソルボースなどをｉｔとし、ＮＡＤＰＨあるいは
ＮＡＤＨの存在下で１モルのキンリトールやソルビトー
ル、Ｌ−イノトールなどを生産する。

ｂ、基質特異性 第２表に示したように、Ｄ−キシロースに対する活性が
最も強いさらにその他のフルドースｌｉｌ、Ｄ、　　Ｌ
−グリセルアルデヒド、フェニルグリオキザールなどの
アルデヒド類及びソルボース、フラクトースなどのケト
ース類などを還元する。

第２表　　アルドースレダクターゼの基質特異性Ｄ−キ
シロース　　　　　　　３００　　　１００　　　１２
５Ｌ−キシロース　　　　　　　３００　　　　　１　
　　　　０Ｄ−リボース　　　　　　　　３００　　　
　８６　　　　７６Ｄ−アラビノース　　　　　　３０
０　　　　１　　　　〜″１３Ｌ１３Ｌ−アラビノース
　　３００　　　　２３　　　　１７Ｄ−リキソース　
　　　　　　３００　　　　１２　　　　　−Ｄ−グル
コース　　　　　　　３００　　　　３５　　　　２３
Ｄ−ガラクトース　　　　　　３００　　　　　５　　
　　　−Ｄ−マンノース　　　　　　　　３００　　　
　　　１　　　　　　−し−ソルボース　　　　　　　
３００　　　　１７　　　　　１１Ｄ−フラクトース　
　　　　　３００　　　　　６　　　　　３２−デオキ
ングルコース　　　３００　　　　　３　　　　　−２
−デオキシガラクトース　　３００　　　　　４　　　
　　−Ｄ−グルクロン酸　　　　　　３００　　　　　
４　　　　　−Ｄ−グルクロノラクトン　　　３００　
　　　　０　　　　　−Ｄ、　　Ｌ−グリセルアルデヒ
ド　３００　　　　２７　　　　３７グリオキザール　
　　　　　３００　　　　７１　　　　２５１０ビルア
ルデヒド　　　　　１５０　　　　２１　　　　　７エ
タノール”　　　　　　　　　８９０　　　　　０．４
　　　　　０．１ソクロへキサノン　　　　　　ｌｏｏ
　　　　　　　１　　　　　−ＮＡＤ（Ｐ　）Ｈ０，１
５ｍＭ、　　ｐ　Ｈ６，８３，０，１Ｍリン酸緩衝液”
　ｓａｔ、　：　飽和温度（＜１５ｍＭ）”　ＮＡ［Ｉ
Ｐ　１ｍＭ　　あルイは　ＮＡＯ１＋ａＭ　　Ｔ！反応
を行った。

１−：試験していない Ｃ０反応至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 反応至適ｐＨはＮＡＤＰＨ４：補酵素としたとき約７付
近に、ＮＡＤＨを補酵素としたとき約６付近にあった。

安定ｐＨ範囲はｐＨ５〜８の範囲では、３０℃、２４ｈ
ｒで約９０％以上の活性が残存していた。

ｄ０反応至適温度及び安定温度範囲 反応至適温度はＮＡＤＰＨを補酵素としたとき６０℃付
近に、ＮＡＤＨを補酵素にしたとき５０℃付近にあった
。

安定温度範囲はｐ　Ｈ６，２，０，１Ｍクエン酸緩衝液
中に１０分間保温したとき、５０℃で約９０％、６０℃
で約６５％の活性が残存していた。

ｅ、１Ｉｌｌ害剤等の影響 第３表に示すように０．０１　ｍ　Ｍのケルセチンやル
チンは本酵素をわずかに阻害する程度である。またｌツ
Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）は２５％［害した。

その他、本酵素を顕著に阻害するものはなかった。

Ｃ以下、介、自つ 第３表　　阻害剤の影響 ＮＡＤＰＨＮＡＤＨ 無添加　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　
　１００ケルセチン　　　　　　　　０．０１　　　　
９３　　　　９５ルチン　　　　　　　　　　０．０１
　　　　８７　　　　９００．０２　　　　　−　　　
　８８ ジチオスレイトール　　　　１．０　　　　　７５　　
　　　−エチレンジアミン四酢酸　　２．０　　　　　
９６　　　　９６ｘｙｌｏｓｅ　　Ｏ，ＩＭ、　　ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｉ　　　Ｏ，１５５Ｍ、　　ｐＨ６，８，０，
ＩＭ　　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　ｂｕｆｆｅｒまた第４
表に示すように、金属イオンの中では銅イオンが約１０
％活性化した。

一方亜鉛、二価鉄イオンは３０〜４０％阻害した。

第４表　　金属イオンの影響 金ｍ４ｔン　　　　　濃度（ｍＭ）　　　−一徂対這１
」亘と−ＮＡＤＰＨＮＡＤＨ 無添加　　　　　　　　　　　　　　　　＋００　　　
１００硫酸マグネンウム　　　　　　２　　　　　９７
　　　　−硫酸コバルト　　　　　　　　２　　　　１
００　　　　９８塩化カルシウム　　　　　　　２　　
　　９１　　　　−塩化マンガン　　　　　　　　２　
　　　　８６　　　　８５硫酸亜鉛　　　　　　　　　
　２　　　　　６９　　　　７２硫酸第−鉄　　　　　
　　　　２　　　　　６０　　　　６４硫酸リチウム　
　　　　　　　２　　　　　９５　　　　９５モリブデ
ン酸ナトリウム　　　２．４　　　　１０３　　　１０
５硫酸ナトリウム　　　　　　　　２　　　　　９６　
　　　９５グルコース０．９８５Ｍ、ＮＡＤ（Ｐ）ＨＯ
，１５ｍＭ、ｐｌ＋７．５．１／１５４１　　）リス−
１１ｃＬ　１１街液ｒ、ミカエリス定数（Ｋｍ） 第５表に示すように、グルコース、キシロース及び、グ
リセルアルデヒドに対する見かけのＫｍはそれぞれ４２
０　ＩＩＭ、　９．１　μＭ及び２０μＭである。

第５表　　アルドースレダクターゼのミカエリス定数（
１）基質　　　　　　Ｋ、皐ｍｅ　　ｙ、ａｘｉｓ−補
酵素（μＭ）　　　（Ｕ／■） ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）中、３０℃で活性
測定した一方、補酵素に対する見かけのＫｍは、第６表
に示すようにＮＡＤＨが１７０ＭＭ、ＮＡＤＰＨが６μ
Ｍである。

第６表　　アルドースレダクターゼのミカエリス定数（
２）各市酵素　　　　　　　Ｋｍ　　”’　　　　ＶＭ
ａＸ　　”’　　　　　　　　　　　　　　５ｍ（μ−
）　　　　　（１１／＊） ＮＡＤＩ＋　　　　　１７０　　　　８．５　　　　　
０．９　Ｍグルコースｇ、精製方法 精製方法を第７表に示す、菌体破砕後、硫安分画、アフ
ィニティクロマト、イオン交換クロマトを行うことによ
って電気泳動的に均一な酵素を得る。

第７表　　アルドースレダクターゼの晴製手順第７表の
ＤＥＡＥ−セファロースを用いたクロマトグラムを第１
図に示す。

アルドースレダクターゼ活性の溶出位置（−）及び蛋白
質の溶出位置（−）は等しく、かつ単一ピークであった
。

第１図中のアルドースレダクターゼ画分をＳＤＳ電気泳
動した結果、単一バンドであった。

ｉ３分子量 ゲル濾過テハ分子量約６２，０００．　　ＳＤＳ？ｉｔ
気泳動では約３３．０００７あった。

したがって当該酵素は分子ｆｆ１３３，０００のサブユ
ニントから成る二量体と考えられる。

ｊ、紫外吸収スペクトル 第４図中のフルドースレダクターゼ画分の紫外吸収スペ
クトルを第２図に示す。

２７Ｏｎｍ付近に吸収極大があった。

ｋ９等電点 等電点電気泳動を行った結果、当該酵素の等電点は３．
５５であった。

以上の理化学的性質、特にケトース類に対し還元能を有
し且っＮＡＤＰ　ＨまたはＮＡＤＨを利用可能な点から
、従来より知られていない文献末記載の新規なアルドー
スレダクターゼであると認められた。

のコロニーの中から、ＮＡＤＨ存在下でキシロースを還
元する能力をもった菌株を選抜することにより行われる
。

当該国を用いて新規アルドースレダクターゼを生産する
には適度のイーストエキス（０，１χ）と０．１〜２０
％好ましくは１−１０％のキシロースを加えて培養する
か、あるいは先ず適度のイーストエキスと０．１〜１０
％好ましくは１〜４％グルコースで培養し、次に１〜１
０９４のキシロース、リボースあるいはアラビノースな
どの五炭楯のうち少なくとも１種類を加えて再度培養を
行うことによって達成できる。

培養方法は液体振とう培養、あるいは固体培養でも可能
である。

培養温度は２５〜４５℃が好ましく、培養時間は培養温
度、培地のｌｌ頻などによって異なるが、１Ｑｈｒから
１週間で良い。

なお当該国が生産するアルドースレダクターゼはフルク
トースなどのケトースを還元する能力を存するが、当該
国の培養にあたってはケトーホ、実施例 実施例１゜ クリプトコアカス・ラクタチボルス８１３１株（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ−７８４０１を第８表に示した培＋ｔｈ１００ｒ
ｌ！中に一白金耳植菌し、４５℃　、３日間培養した。

この菌体を１／１５Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で
２回洗浄したのち、同緩街液にＱｆｉし、これをヴイブ
ロゲンセル（エドムント・ヴユーラー社製）で１５分間
、細胞破砕し、１５ｍ１の細胞抽出液を得た。この抽出
液を一夜、同緩衝液中で透析した液についてアルドース
レダクターゼ活性を調べた０反応液組成は第９表に示し
た。キシロースをｕ’ｆｆとした時、透析液（粗酵素液
）１７ｍｌ中に、ＮＡＤＰＨ添加では、３１Ｕ、ＮへＤ
Ｈ添加では１６Ｕの活性を含んでいた。

一方し−ソルボースを基質としたときはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ
　Ｈ添加では６．２　Ｕ。

ＮへＤＨ添加では４．ＯＵの活性を含んでいた。

第８表　　菌体生産培地 Ｄ−キシロース　　　　　　　　　８．　０％リン酸二
水素カリウム　　　　　　０．　１％硫酸マグネシウム
・７水塩　　　　Ｏ，ＯＳ％ｐＨ７，０ 第９表　　酵素活性測定液 ０．３Ｍキシロース　　　　　　　　　　　９８０μｌ
（あるいは０．３ＭＬ−ソルボース） １５ｍＭ　　ＮＡＤＰＨ（ＮへＤＨＩ　　　　　　　ｌ
０ｕｌＩＵは１分間にｌｕｍｏｌｅのＮＡＤＰＨを酸化
する酵素量とした 実施例２゜ 実施例トで用いた菌株を、第８表のキシロースの代わり
に２％グルコースを含む液体培地ｌｏｏｍ　Ｒ中に植菌
し、３７℃で１日間培養した。

これを同上組成の液体培地１００ｒｎ！中１０００ｍ　
ｌ中に移しジャーファーメンタ−で１日間培養した０条
件は１ｖシ１３７℃、ｐＨ７，０である。

次に別殺菌した４０％キソロースを１００ｍ　ｌ　’ｆ
５加し、さらに同上の条件で１日間培養した。

この菌体を実施例１と同じようにして細胞破砕し、１２
０ｍ７の細胞抽出液を得た。これを透析した粗酵素液１
４３ｍＡについて第９表の酵素活性測定液中で、アルド
ースレダクターゼ活性を調べた。キソロース添加、ＮＡ
ＤＰＨ存在下では４３０［Ｊ、　ＮＡＤＨ存在下では２
４０Ｕのアルドースレダクターゼがあった。

実施例３６ 実施例１と同条件（ただし、培養液総量は４．ＯＯＯｍ
ｊ！である）で培養した菌体を破砕し、第７表に示す方
法でアルドースレダクターゼの精製を行った。

グルコースを、１１としたときは１３８ｕ、Ｌ−ソルボ
ースを基質としたときは６５ｕの活性があった。また精
製酵素の回収率は３６％であった（第１０表）。

第１Ｏ表　　アルドースレダクターゼの精製結果容量　
総蛋白　　比活性　　　　比活性　　　回収率精製過程
　　（ｍｌ）　　（ｍｇ）　　　　（υ）　　　−」Ｚ
旦と−　（１）ＮＡＤＨＮＡＤＰＨＮＡＤＩＩ　ＮＡＤ
ＰＩ＋３、Ｒｅｄ　　Ａ　　４２１　４６．５　　　９
３　２３（１２，００４，９５６１４、ＤＥＡＥ−１３
８１７，８６２１３８３，４８７，７５３６セフアロー
ス へ０発明の効果 実施例３で得た精製アルドースレダクターゼの諸性質を
調べた。第１１表に示したように温度安定性については
５０℃における酵素活性の半減期が１４ｈｒであり、牛
肝臓起源のものに比べて極めて安定であ、た。

また°ＮＡＤＰＨをｈｌｉ酵素としたときの活性に対す
るＮＡＤＨの活性比は当該酵素が９０％であり、牛肝臓
（５０％）ウサギ水晶体（３８％）、祿脳（５％）に比
べていずれも高く、これらの点がら酵素反応器に用いろ
ｒＹ素としての性質を十分に有しており工業的実施価値
は人さいものである。

４、図の簡単な説明 第１図はＤＥＡＥセファロースを用いた本酵素のクロマ
トグラムを示す。

第２図は本酵素の紫外吸収スペクトルを示す。

特許出願人　　工業技術院長　　　　　等々力　達シ容
　士、ンＬ’ｆｌ：Ｃ戴ン Ｚｏｏ　　　　Ｊ＃ｌｌ　　　　４ｔａ。

４表（乍す

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ケトース類に対し還元能を有し且つ補酵素として、ＮＡ
   ＤＰＨまたはＮＡＤＨを利用可能な新規なアルドースレ
   ダクターゼ。