JPH07123985A - Dna fragment coding for regucalcin - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a DNA fragment coding for regucalcin derived from a hepatocellular cytoplasm and fulfilling the role as a control factor in a intracellular informational transmitting system with Ca<2+> and mass-producing the regucalcin useful as a reagent for research and a clinical testing agent. CONSTITUTION:This new DNA fragment coding for regucalcin derived from a hepatocellular cytoplasm is expressed by an amino acid sequence represented by the formula. The DNA fragment is obtained by extracting a liver from a Wistar strain male rat, recovering an mRNA according to a guanidinium thiocyanate method, passing, the resultant recovered mRNA through an oligo(dT) cellulosic column, separating the mRNA, reacting a reverse transcriptase therewith, synthesizing a cDNA, then preparing a cDNA library according to a conventional method, screening the prepared library with an antiregucalcin antibody, recovering a DNA from a positive clone and treating the obtained DNA with a restriction enzyme. Thereby, the regucalcin can be mass-produced by a transformant cell containing the DNA fragment.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査薬、試薬とし
ての有用性が期待されるＣａ²⁺結合蛋白質であるレギュ
カルチンをコードするＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む
組換え体ＤＮＡ及び該組換え体ＤＮＡを保有する形質転
換体細胞に関する。The present invention relates to a DNA fragment encoding regucalcin, which is a Ca ²⁺ -binding protein expected to be useful as a clinical test drug and a reagent, a recombinant DNA containing the DNA fragment, and the group. It relates to a transformant cell carrying a recombinant DNA.

【０００２】[0002]

【従来の技術】Ｃａ²⁺による細胞機能調節の主な役割は
細胞内代謝に関与する酵素の活性調節にある。2. Description of the ^Related Art The main role of Ca ^{2+ in} regulating cell function is to regulate the activity of enzymes involved in intracellular metabolism.

【０００３】従来、Ｃａ²⁺がカルモジュリンを介して酵
素の活性化を増幅させる機構は知られていた。Conventionally, the mechanism by which Ca ²⁺ amplifies enzyme activation via calmodulin has been known.

【０００４】これに対し、レギュカルチンはラット肝細
胞質から単離された新しいＣａ²⁺結合蛋白質である。レ
ギュカルチンは上記カルモジュリンとは異なり肝臓に顕
著に存在する等電点pI５．２０の酸性蛋白質であり、そ
のＣａ²⁺結合定数は４．１９×１０⁵Ｍ^-1を示し、６〜
７個の高親和性Ｃａ²⁺結合部位を持ち、α−ヘリックス
構造を３４％含む。レギュカルチンにＣａ²⁺が結合する
とレギュカルチンの構造はルーズになるという特徴を有
する。また、レギュカルチンはＣａ²⁺による肝臓の酵素
の活性化を制御していることが知られており、Ｃａ²⁺に
よる細胞内情報伝達系の制御因子としての役割を果して
いる。さらに、四塩化炭素肝障害時において肝細胞内の
レギュカルチン量の減少とともに血清中に漏洩している
ことが見出されていることから、肝病態との関係が示唆
される。In contrast, regucalcin is a new Ca ^{2+ -binding} protein isolated from rat liver cytoplasm. Unlike calmodulin, regucalcin is an acidic protein with an isoelectric point pI 5.20 which is remarkably present in the liver, and its Ca ²⁺ binding constant is 4.19 × 10 ⁵ M ⁻¹ , and 6 to
It has 7 high-affinity Ca ²⁺ binding sites and contains 34% α-helix structure. When Ca ²⁺ binds to regucalcin, the structure of regucalcin becomes loose. Moreover, regucalcin is known to controlling the activation of the enzyme in the liver by Ca ^2+, it plays a role as a regulator of intracellular signal transduction system by Ca ^2+. Furthermore, it was found that the amount of regucalcin in the hepatocytes was reduced and the substance was leaked into the serum in the case of carbon tetrachloride liver injury, suggesting a relationship with the pathological condition of the liver.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】このようにレギュカル
チンは既存のＣａ²⁺結合蛋白質と異なる性質を有してお
り、すでに試薬として市販されているカルモジュリンと
同様に、研究用試薬として有用性は高い。また、肝病態
との関係が示唆されており、臨床検査薬としても期待さ
れる。しかし、レギュカルチンは肝臓からの抽出、精製
でのみしか入手できず少量しか得ることができなかっ
た。Thus, regucalcin has properties different from existing Ca ²⁺ -binding proteins, and is highly useful as a research reagent like calmodulin, which is already commercially available as a reagent. . In addition, it has been suggested to be related to liver pathology, and is expected as a clinical test drug. However, regucalcin was available only by extraction and purification from the liver, and only a small amount could be obtained.

【０００６】従って本発明の目的は、レギュカルチンの
アミノ酸配列を解明し、これをコードするＤＮＡ断片を
得、これを基に、レギュカルチンを遺伝子組換え技術に
より量産する方法を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide a method for elucidating the amino acid sequence of regucalcin, obtaining a DNA fragment encoding the same, and mass-producing regucalcin by gene recombination technology based on this.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み、本発
明者は鋭意研究を行った結果、ラットの肝臓からｍＲＮ
Ａを分離し、これを基にｃＤＮＡを得、この塩基配列を
解析することに成功し本発明を完成した。In view of such circumstances, the present inventor has conducted diligent research, and as a result, it was found that mRN was detected from rat liver.
A was separated, cDNA was obtained based on this, and this base sequence was successfully analyzed to complete the present invention.

【０００８】すなわち本発明は、レギュカルチンをコー
ドするＤＮＡ断片、当該断片を含有する組換え体ＤＮ
Ａ、及び当該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞
を提供するものである。That is, the present invention provides a DNA fragment encoding regucalcin and a recombinant DN containing the fragment.
A and a transformant cell carrying the recombinant DNA.

【０００９】本発明のＤＮＡ断片は、例えば遺伝子組換
え技術を利用して次の如くして製造される。The DNA fragment of the present invention is produced, for example, by utilizing gene recombination technology as follows.

【００１０】すなわちラットの肝臓からｍＲＮＡを調製
し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。これを発現ベク
ターに組み込み、大腸菌で発現させる。得られた蛋白質
の中から抗レギュカルチン抗体と反応するクローンをス
クリーニングし、陽性クーロンからｃＤＮＡを抽出すれ
ばよい。得られたｃＤＮＡは、シークエンサにより塩基
配列を分析することができる。That is, mRNA is prepared from rat liver to prepare a cDNA library. This is incorporated into an expression vector and expressed in E. coli. The obtained protein may be screened for a clone that reacts with an anti-regucalcin antibody, and cDNA may be extracted from the positive coulomb. The nucleotide sequence of the obtained cDNA can be analyzed by a sequencer.

【００１１】詳細には、次の如くしてＤＮＡ断片を調製
する。まず、ラットからｍＲＮＡを抽出する。ラットは
ウイスター系雄性ラットが好ましく、これから肝臓を摘
出し、ホモジナイズする。これを、フェノール等で抽出
し、遠心分離、アルコール沈澱等の方法を適宜組合せれ
ばｍＲＮＡが得られる。Specifically, a DNA fragment is prepared as follows. First, mRNA is extracted from the rat. The rat is preferably a male Wistar rat, and the liver is excised and homogenized from the rat. This is extracted with phenol and the like, and mRNA can be obtained by appropriately combining methods such as centrifugation and alcohol precipitation.

【００１２】得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵
素を用い、１本鎖のｃＤＮＡを合成する。この一本鎖ｃ
ＤＮＡを新たな鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより
二本鎖のｃＤＮＡを得ることができる。Using the obtained mRNA as a template and a reverse transcriptase, single-stranded cDNA is synthesized. This single chain c
Double-stranded cDNA can be obtained by DNA polymerase using DNA as a new template.

【００１３】二本鎖のＤＮＡは、ファージにパッケージ
ングし、これを大腸菌等に感染させ、培養する。培養
後、例えば抗レギュカルチン抗体に結合した分子を色素
発色反応によって特異的に染め出すことにより、レギュ
カルチンｃＤＮＡ陽性プラークを同定することができ
る。The double-stranded DNA is packaged in a phage, which is infected with Escherichia coli or the like and cultured. After culturing, for example, the molecule bound to the anti-regucalcin antibody is specifically stained by a dye-coloring reaction to identify a regucalcin cDNA-positive plaque.

【００１４】この陽性プラークを単離し、ヘルパーファ
ージと共に大腸菌等の宿主に感染させ、得られたファー
ジ液をさらに大腸菌等に感染させ、レギュカルチンのｃ
ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ（プラスミド）と
して宿主細胞内で複製させる。この宿主細胞をアンピシ
リン含有プレートに植菌し、アンピシリン耐性コロニー
を選択すれば、本発明のＤＮＡ断片を含有する組換え体
ＤＮＡを保有する形質転換体細胞が得られる。This positive plaque was isolated and infected with a host such as Escherichia coli together with a helper phage, and the resulting phage solution was further infected with Escherichia coli or the like to obtain c of regucalcin.
It is replicated in a host cell as a recombinant DNA (plasmid) containing a DNA fragment. When this host cell is inoculated on a plate containing ampicillin and ampicillin-resistant colonies are selected, transformant cells carrying a recombinant DNA containing the DNA fragment of the present invention can be obtained.

【００１５】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換えＤＮＡを採取するには常法により抽出すれば
よく、得られた組換えＤＮＡから本発明のＤＮＡ断片を
切り出すには制限酵素等を用いればよい。Recombinant DNA can be collected from the transformant cells selected as described above by a conventional method. To cut out the DNA fragment of the present invention from the obtained recombinant DNA, a restriction enzyme or the like can be used. Can be used.

【００１６】かくして得られる本発明ＤＮＡ断片の塩基
配列も常法により決定することができる。配列番号２に
本発明ＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１に当該塩基
配列に相当するアミノ酸配列を、配列番号３にこの塩基
配列及びアミノ酸配列を示す。この配列をもとに合成化
学の手法により、このような完全な塩基配列あるいはそ
の一部を合成することができる。また、この塩基配列に
対応したアミノ酸も合成することができる。合成した全
塩基配列あるいはその一部をプローブとしてｍＲＮＡの
定量、ｃＤＮＡの分離を行うこともできる。また、既知
の組換えＤＮＡ技術により、この蛋白質あるいは一部修
飾した蛋白質を発現させることもできる。なお、これら
はラットに限らずヒトを含めた他の動物種にも応用でき
る。本発明ＤＮＡ断片を発現させ、レギュカルチンを生
産するには、上記の形質転換体細胞又は当該ＤＮＡ断片
を強力なプロモータを有するベクターに組込んだ組換え
プラスミドで形質転換された細胞を栄養培地にて培養
し、その培養物から採取すればよい。この場合における
培養は、用いる形質転換体細胞の性質に応じて行なわれ
る。The base sequence of the thus obtained DNA fragment of the present invention can also be determined by a conventional method. SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment of the present invention, SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence, and SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence. Based on this sequence, such a complete base sequence or a part thereof can be synthesized by a synthetic chemistry method. Also, an amino acid corresponding to this base sequence can be synthesized. It is also possible to perform quantification of mRNA and separation of cDNA using the synthesized whole base sequence or a part thereof as a probe. Further, this protein or a partially modified protein can be expressed by a known recombinant DNA technique. These are not limited to rats, but can be applied to other animal species including humans. In order to express the DNA fragment of the present invention and produce regucalcin, the transformant cells described above or cells transformed with a recombinant plasmid in which the DNA fragment is incorporated into a vector having a strong promoter are cultured in a nutrient medium. It may be cultivated and collected from the culture. Culturing in this case is performed depending on the properties of the transformant cells used.

【００１７】[0017]

【発明の効果】本発明の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体細胞を用いれば、活性の高いレギュカルチンを多
量に生産することが可能となる。INDUSTRIAL APPLICABILITY By using a transformant cell carrying the recombinant DNA of the present invention, it becomes possible to produce a large amount of highly active regucalcin.

【００１８】[0018]

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものでは
ない。なお、実施例に用いた試薬、酵素等はすべて市販
のものである。ただし、抗レギュカルチン抗体は精製し
たレギュカルチンをウサギに免疫し作製したものであ
る。EXAMPLES The present invention will now be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. All reagents, enzymes and the like used in the examples are commercially available. However, the anti-regucalcin antibody was prepared by immunizing a rabbit with purified regucalcin.

【００１９】実施例１ （ＲＮＡの調製）ウイスター系雄性ラット（３週齢）か
ら肝臓を摘出し、グアニジン−イソチオシアネート液
（４Ｍグアニジニウムチオシアネート，２５mMクエン酸
ナトリウム（pH７．０），０．５％サルコシル，０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール，２Ｍ酢酸ナトリウム）で
ホモジナイズした。これをフェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコール混液で抽出し、４℃、１０，００
０×ｇで２０分遠心した。水層にイソプロパノールを加
え、−２０℃で放置し、ＲＮＡを沈澱させた。回収した
沈澱はジエチルピロカーボネート処理した０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウムに溶解した。これをオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムに通し、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し
た。Example 1 (Preparation of RNA) The liver was extracted from a male Wistar rat (3 weeks old), and a guanidine-isothiocyanate solution (4M guanidinium thiocyanate, 25 mM sodium citrate (pH 7.0), 0. 5% sarcosyl, 0.1
Homogenized with M2-mercaptoethanol, 2M sodium acetate). Phenol-chloroform-
Extraction with isoamyl alcohol mixture, 4 ℃, 10,000
It was centrifuged at 0 × g for 20 minutes. Isopropanol was added to the aqueous layer and left at -20 ° C to precipitate RNA. The recovered precipitate was dissolved in 0.5% sodium dodecyl sulfate treated with diethylpyrocarbonate. This is oligo (dT)
The poly (A) + RNA was purified by passing through a cellulose column.

【００２０】（ｃＤＮＡライブラリーの作製）精製した
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）に５０ｕｎｉｔのＭｏｌ
ｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａウイルス逆
転写酵素とオリゴ（ｄＴ）₁₈プライマーリンカーを添加
し、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。さらに合成した１本鎖
ｃＤＮＡに大腸菌リボヌクレアーゼＨとＤＮＡポリメラ
ーゼＩを添加し、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにＥ
ｃｏＲＩアダプターを付加し、ＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩで
消化したファージ発現ベクター（λＺＡＰＩＩ）と連結
した。さらにパッケージングエキストラクトを用いてフ
ァージにパッケージングしｃＤＮＡライブラリーのファ
ージを作製した。(Preparation of cDNA library) Purified poly (A) + RNA (5 μg) was added with 50 units of Mol.
One-Murine Leukemia virus reverse transcriptase and oligo (dT) ₁₈ primer linker were added to synthesize single-stranded cDNA. Escherichia coli ribonuclease H and DNA polymerase I were added to the synthesized single-stranded cDNA to synthesize double-stranded cDNA. E to this
A co RI adapter was added and ligated with the phage expression vector (λZAPII) digested with Xho I, Eco RI. Further, the phages of the cDNA library were prepared by packaging the phages using the packaging extract.

【００２１】（レギュカルチンｃＤＮＡクローンの選
抜）ラット肝のｃＤＮＡライブラリーのファージ約１×
１０⁶個を大腸菌と混合し２０個の寒天プレートに植菌
した。４２℃で３時間半インキュベートした後、プレー
トに１０mMイソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシドで処
理したニトロセルロース膜をのせ、３７℃で３時間半イ
ンキュベートした。ニトロセルロース膜はブロッキング
した後、抗レギュカルチンウサギ血清（×２００）と室
温で２時間インキュベートした。膜は洗浄した後、アル
カリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体を加えイン
キュベートした。これを発色液（０．３５mMニトロブル
ーテトラゾリウム，０．４mM５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルホスフェート）に浸し発色させ、レギュ
カルチンｃＤＮＡ陽性プラークを同定した。(Selection of regucalcin cDNA clone) Phage of cDNA library of rat liver About 1 ×
10 ⁶ cells were mixed with E. coli and inoculated on 20 agar plates. After incubating at 42 ° C. for 3 hours and a half, the plate was mounted with a nitrocellulose membrane treated with 10 mM isopropylthioβ-D-galactoside, and incubated at 37 ° C. for 3 hours and a half. After blocking the nitrocellulose membrane, it was incubated with anti-regucalcin rabbit serum (x200) for 2 hours at room temperature. After washing the membrane, alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit IgG antibody was added and incubated. A coloring solution (0.35 mM nitro blue tetrazolium, 0.4 mM 5-bromo-4-chloro-
Regucalcin cDNA positive plaques were identified by soaking in 3-indolyl phosphate).

【００２２】（プラスミドベクターへのサブクローニン
グ）ファージベクターλＺＡＰＩＩは、その配列中にプ
ラスミドベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの塩基
配列を含み、λＺＡＰＩＩにクローニングされたレギュ
カルチンのｃＤＮＡ断片はこのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
に挿入されている。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの両
端にはヘルパーファージの複製開始点と終結点が存在し
ている。そこで同定したプラークよりファージを単離
し、Ｒ４０８ヘルパーファージとともに大腸菌ＳＵＲＥ
に感染させ、レギュカルチンのｃＤＮＡ断片を含むｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔを大腸菌内で合成させ、ヘルパーフ
ァージの形で大腸菌体外に放出させた。このファージ液
をさらに大腸菌ＳＵＲＥに感染させ、レギュカルチンの
ｃＤＮＡ断片を有するプラスミドとして菌内で複製させ
た。この大腸菌を５０μｇ／mlアンピシリン含有のＬＢ
プレートに植菌し、アンピシリン耐性コロニーを選択し
た。(Subcloning into plasmid vector) Phage vector λZAPII contains the nucleotide sequence of plasmid vector pBluescript in its sequence, and the cDNA fragment of regucalcin cloned in λZAPII is the pBluescript fragment.
Has been inserted into. In addition, a replication origin and a termination point of a helper phage exist at both ends of pBluescript. Phages were isolated from the identified plaques, and Escherichia coli SURE was isolated with R408 helper phages.
PB containing a cDNA fragment of regucalcin
Luesscript was synthesized in E. coli and released outside the E. coli in the form of helper phage. This phage solution was further infected with Escherichia coli SURE and replicated in the bacterium as a plasmid having a regucalcin cDNA fragment. LB containing 50 μg / ml ampicillin
The plate was inoculated and ampicillin resistant colonies were selected.

【００２３】（ｃＤＮＡインサートの塩基配列の決定）
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅシステム（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ社製）を用いてｃＤＮＡインサートの全塩基配列
を決定した。すなわちプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで
切断し、断片はアルカリ変性処理した後、プライマーを
加えアニーリングした。これに³⁵ＳｄＣＴＰ、０．１Ｍ
ＤＴＴ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ用酵素液を添加した後４
等分し、各々にｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、
ｄｄＣＴＰを加え、３７℃５分間インキュベートした。
これらはアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オート
ラジオグラフィーを行ない、塩基配列を読み取った。配
列番号３にｃＤＮＡインサートの全塩基配列を示す。
５′末側から８０番目に翻訳開始コドンＡＴＧのＡがみ
られ、９７７〜９７９番目に終始コドンＴＡＡがみられ
た。この読み枠に相当する塩基配列をアミノ酸に変換す
ると合計２９９個のアミノ酸をコードすることがわかっ
た。得られたアミノ酸配列も配列番号３に示す。これか
ら計算されるレギュカルチンの分子量は３３，３８８で
あった。この値は精製したレギュカルチンをＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法により算出した分子量と一致
した。このレギュカルチンをコードするｃＤＮＡの塩基
配列はＥＭＢＬやＧｅｎｂａｎｋのデータベースに登録
されている塩基配列とは一致せず、既存のものとは異な
ることがわかった。また、他のＣａ²⁺結合蛋白質のアミ
ノ酸配列と比較したところ相同性は低かった（カルモジ
ュリン，１３．３％；カルビンデン−Ｄ２８Ｋ，１６．
３％；Ｓ−１００β，１１．０％）。(Determination of nucleotide sequence of cDNA insert)
Sequenase system (US Biochemi
(manufactured by Cal Co.) was used to determine the entire nucleotide sequence of the cDNA insert. That is, the plasmid DNA was cleaved with Eco RI, the fragment was treated with alkaline denaturation, and then a primer was added and annealed. ³⁵ SdCTP, 0.1M
After adding the enzyme solution for DTT and Sequenase, 4
Divide equally into ddATP, ddGTP, ddTTP,
ddCTP was added and incubated at 37 ° C for 5 minutes.
These were separated by acrylamide gel electrophoresis and subjected to autoradiography to read the nucleotide sequence. SEQ ID NO: 3 shows the entire nucleotide sequence of the cDNA insert.
A of the translation initiation codon ATG was found at the 80th position from the 5'end, and a termination codon TAA was found at the 977th to 979th positions. It was found that when the base sequence corresponding to this open reading frame was converted into amino acids, a total of 299 amino acids were encoded. The resulting amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 3. The molecular weight of regucalcin calculated from this was 33,388. This value was consistent with the molecular weight of purified regucalcin calculated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. It was found that the base sequence of the cDNA encoding this regucalcin did not match the base sequence registered in the database of EMBL or Genbank, and was different from the existing one. The homology was low when compared with the amino acid sequences of other Ca ²⁺ -binding proteins (calmodulin, 13.3%; calbinden-D28K, 16.
3%; S-100β, 11.0%).

【００２４】[0024]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：２９９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyl Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asn Gly Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295  SEQ ID NO: 1 Sequence length: 299 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyl Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asn Gly Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295

【００２５】[0025]

【配列表】 配列番号：２ 配列の長さ：８９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ラット 配列： ATGTCTTCCA TCAAGATTGA ATGTGTTTTA AGGGAGAACT ACAGGTGTGG GGAGTCCCCT 60 GTGTGGGAGG AGGCATCAAA GTGTCTGCTG TTTGTAGACA TCCCTTCAAA GACTGTCTGC 120 CGATGGGATT CGATCAGCAA TCGAGTGCAG CGAGTTGGTG TAGATGCCCC AGTCAGTTCA 180 GTGGCACTTC GACAGTCAGG AGGCTATGTT GCCACCATTG GAACCAAGTT CTGTGCTTTG 240 AACTGGGAAG ATCAATCAGT ATTTATCCTA GCCATGGTGG ATCAAGATAA GAAAAACAAT 300 CGATTCAATG ATGGGAAGGT GGATCCTGCT GGGAGATACT TTGCTGGTAC CATGGCTGAG 360 GAAACCGCCC CAGCTGTTCT GGAGCGGCAC CAAGGGTCCT TGTACTCCCT TTTTCCTGAT 420 GACAGTGTGA AGAAATACTT TAACCAAGTG GATATCTCCA ATGGTTTGGA TTGGTCCCTG 480 GACCATAAAA TCTTCTACTA CATTGACAGC CTGTCCTACA CTGTGGATGC CTTTGACTAT 540 GACCTGCCAA CAGGACAGAT TTCCAACCGC AGGACTGTTT ACAAGATGGA AAAAGATGAA 600 CAAATCCCAG ATGGAATGTG CATTGATGTT GAGGGGAAGC TTTGGGTGGC CTGTTACAAT 660 GGAGGAAGAG TAATTCGCCT AGATCCTGAG ACAGGGAAAA GACTGCAAAC TGTGAAGTTG 720 CCTGTTGATA AAACAACTTC ATGCTGCTTT GGAGGGAAGG ATTACTCTGA AATGTACGTG 780 ACATGTGCCA GGGATGGGAT GAGCGCCGAA GGTCTTTTGA GGCAGCCTGA TGCTGGTAAC 840 ATTTTCAAGA TAACAGGTCT TGGGGTCAAA GGAATTGCTC CATATTCCTA TGCAGGG 897[Sequence Listing] SEQ ID NO: 2 Sequence length: 897 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA Origin organism name: Rat sequence: ATGTCTTCCA TCAAGATTGA ATGTGTTTTA AGGGAGAACT ACAGGTGTGG GGAGTCCCCT 60 GTGTGGGAGG AGGCATCAAA GTGTCTGCTG TTTGTAGACA TCCCTTCAAA GACTGTCTGC 120 CGATGGGATT CGATCAGCAA TCGAGTGCAG CGAGTTGGTG TAGATGCCCC AGTCAGTTCA 180 GTGGCACTTC GACAGTCAGG AGGCTATGTT GCCACCATTG GAACCAAGTT CTGTGCTTTG 240 AACTGGGAAG ATCAATCAGT ATTTATCCTA GCCATGGTGG ATCAAGATAA GAAAAACAAT 300 CGATTCAATG ATGGGAAGGT GGATCCTGCT GGGAGATACT TTGCTGGTAC CATGGCTGAG 360 GAAACCGCCC CAGCTGTTCT GGAGCGGCAC CAAGGGTCCT TGTACTCCCT TTTTCCTGAT 420 GACAGTGTGA AGAAATACTT TAACCAAGTG GATATCTCCA ATGGTTTGGA TTGGTCCCTG 480 GACCATAAAA TCTTCTACTA CATTGACAGC CTGTCCTACA CTGTGGATGC CTTTGACTAT 540 GACCTGCCAA CAGGACAGAT TTCCAACCGC AGGACTGTTT ACAAGATGGA AAAAGATGAA 600 CAAATCCCAG ATGGAATGTG CATTGATGTT GAGGGGAAGC TTTGGGTGGC CTGTTACAAT 660 CGAGCGAAGAGAG CCTGAG ACAGGGAAAA GACTGCAAAC TGTGAAGTTG 720 CCTGTTGATA AAACAACTTC ATGCTGCTTT GGAGGGAAGG ATTACTCTGA AATGTACGTG 780 ACATGTGCCA GGGATGGGAT GAGCGCCGAAGGTCTTTTGA GGCAGCTATA 840ATTTCTCTGAGA

【００２６】[0026]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：３ 配列の長さ：１２１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ラット TGGATGCTGG AGTGTTTCCT TTGTCTTCTA TTTTAAAGAT ATCTTGAAAA AAACCTGTCA 60 CTGTCCTTTT CCTGCGACC ATG TCT TCC ATC AAG ATT GAA TGT GTT TTA 109 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu 5 10 AGG GAG AAC TAC AGG TGT GGG GAG TCC CCT GTG TGG GAG GAG GCA TCA 157 Arg Glu Asn Tyr Arg Cys Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser 15 20 25 AAG TGT CTG CTG TTT GTA GAC ATC CCT TCA AAG ACT GTC TGC CGA TGG 205 Lys Cys Leu Leu Phe Val Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Alg Trp 30 35 40 GAT TCG ATC AGC AAT CGA GTG CAG CGA GTT GGT GTA GAT GCC CCA GTC 253 Asp Ser Ile Ser Asn Arg Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val 45 50 55 AGT TCA GTG GCA CTT CGA CAG TCA GGA GGC TAT GTT GCC ACC ATT GGA 301 Ser Ser Val Ala Leu Arg Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly 60 65 70 ACC AAG TTC TGT GCT TTG AAC TGG GAA GAT CAA TCA GTA TTT ATC CTA 349 Thr Lys Phe Cys Ala Leu Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu 75 80 85 90 GCC ATG GTG GAT CAA GAT AAG AAA AAC AAT CGA TTC AAT GAT GGG AAG 397 Ala Met Val Asp Glu Asp Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys 95 100 105 GTG GAT CCT GCT GGG AGA TAC TTT GCT GGT ACC ATG GCT GAG GAA ACC 445 Val Asp Pro Ala Gly Arg Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr 110 115 120 GCC CCA GCT GTT CTG GAG CGG CAC CAA GGG TCC TTG TAC TCC CTT TTT 493 Ala Pro Ala Val Leu Glu Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe 125 130 135 CCT GAT GAC AGT GTG AAG AAA TAC TTT AAC CAA GTG GAT ATC TCC AAT 541 Pro Asp His Ser Val Lys Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn 140 145 150 GGT TTG GAT TGG TCC CTG GAC CAT AAA ATC TTC TAC TAC ATT GAC AGC 589 Gly Leu Asp Trp Ser Leu Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser 155 160 165 170 CTG TCC TAC ACT GTG GAT GCC TTT GAC TAT GAC CTG CCA ACA GGA CAG 637 Leu Ser Tyr Thr Val Asp Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln 175 180 185 ATT TCC AAC CGC AGG ACT GTT TAC AAG ATG GAA AAA GAT GAA CAA ATC 685 Ile Ser Asn Arg Arg Thr Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile 190 195 200 CCA GAT GGA ATG TGC ATT GAT GTT GAG GGG AAG CTT TGG GTG GCC TGT 733 Pro Asp Gly Met Cys Ile Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys 205 210 215 TAC AAT GGA GGA AGA GTA ATT CGC CTA GAT CCT GAG ACA GGG AAA AGA 781 Tyr Asn Gly Gly Arg Val Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg 220 225 230 CTG CAA ACT GTG AAG TTG CCT GTT GAT AAA ACA ACT TCA TGC TGC TTT 829 Leu Gln Thr Val Lys Leu Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe 235 240 245 250 GGA GGG AAG GAT TAC TCT GAA ATG TAC GTG ACA TGT GCC AGG GAT GGG 877 Gly Gly Lys Asp Tyr Ser Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly 255 260 265 ATG AGC GCC GAA GGT CTT TTG AGG CAG CCT GAT GCT GGT AAC ATT TTC 925 Met Ser Ala Glu Gly Leu Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe 270 275 280 AAG ATA ACA GGT CTT GGG GTC AAA GGA ATT GCT CCA TAT TCC TAT GCA 973 Lys Ile Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala 285 290 295 GGG TAA ACTGCAGCTC TTCCTTGCTG TCAGAAGAAA AAGCTTGAAG ACAACTGAGA 1029 Gly ATTAAACTGC TGCTCTTCCT TGCTGTCAGA AGAAAAAGCT TGAAGACAAC TGAGAATTAA 1089 GGGAGAGAAA TCAATGAACT TTCATATTGT TTTTTTAATG AGGCAGTGAT ATTGACATGG 1149 TTAAACTGCT TTAATTTACA CTTTTGATTG GGTGCTGGGG AATAAACCTA AAGCCATGGC 1209 ATATTAA 1216 SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 1216 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Double Strand Topology: Linear Sequence Type: cDNA Origin Organ Name: Rat TGGATGCTGG AGTGTTTCCT TTGTCTTCTA TTTTAAAGAT ATCTTGAAAA AAACCTGTCA 60 CTGTCCTTTT CCTGCGACC ATG TCT TCC ATC AAG ATT GAA TGT GTT TTA 109 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu 5 10 AGG GAG AAC TAC AGG TGT GGG GAG TCC CCT GTG TGG GAG GAG GCA TCA 157 Arg Glu Asn Tyr Arg Cys Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser 15 20 25 AAG TGT CTG CTG TTT GTA GAC ATC CCT TCA AAG ACT GTC TGC CGA TGG 205 Lys Cys Leu Leu Phe Val Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Alg Trp 30 35 40 GAT TCG ATC AGC AAT CGA GTG CAG CGA GTT GGT GTA GAT GCC CCA GTC 253 Asp Ser Ile Ser Asn Arg Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val 45 50 55 AGT TCA GTG GCA CTT CGA CAG TCA GGA GGC TAT GTT GCC ACC ATT GGA 301 Ser Ser Val Ala Leu Arg Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly 60 65 70 ACC AAG TTC TGT GCT TTG AAC TGG GAA GAT CAA TCA GTA TTT ATC CTA 349 Thr Lys Phe Cys Ala Leu Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu 75 80 85 90 GCC ATG GTG GAT CAA GAT AAG AAA AAC AAT CGA TTC AAT GAT GGG AAG 397 Ala Met Val Asp Glu Asp Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys 95 100 105 GTG GAT CCT GCT GGG AGA TAC TTT GCT GGT ACC ATG GCT GAG GAA ACC 445 Val Asp Pro Ala Gly Arg Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr 110 115 120 GCC CCA GCT GTT CTG GAG CGG CAC CAA GGG TCC TTG TAC TCC CTT TTT 493 Ala Pro Ala Val Leu Glu Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe 125 130 135 CCT GAT GAC AGT GTG AAG AAA TAC TTT AAC CAA GTG GAT ATC TCC AAT 541 Pro Asp His Ser Val Lys Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn 140 145 150 GGT TTG GAT TGG TCC CTG GAC CAT AAA ATC TTC TAC TAC ATT GAC AGC 589 Gly Leu Asp Trp Ser Leu Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser 155 160 165 170 CTG TCC TAC ACT GTG GAT GCC TTT GAC TAT GAC CTG CCA ACA GGA CAG 637 Leu Ser Tyr Thr Val Asp Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln 175 180 185 ATT TCC AAC CGC AGG ACT GTT TAC AAG ATG GAA AAA GAT GAA CAA ATC 685 Ile Ser Asn Arg Arg Thr Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile 190 195 200 CCA GAT GGA ATG TGC ATT GAT GTT GAG GGG AAG CTT TGG GTG GCC TGT 733 Pro Asp Gly Met Cys Ile Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys 205 210 215 TAC AAT GGA GGA AGA GTA ATT CGC CTA GAT CCT GAG ACA GGG AAA AGA 781 Tyr Asn Gly Gly Arg Val Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg 220 225 230 CTG CAA ACT GTG AAG TTG CCT GTT GAT AAA ACA ACT TCA TGC TGC TTT 829 Leu Gln Thr Val Lys Leu Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe 235 240 245 250 GGA GGG AAG GAT TAC TCT GAA ATG TAC GTG ACA TGT GCC AGG GAT GGG 877 Gly Gly Lys Asp Tyr Ser Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly 255 260 265 ATG AGC GCC GAA GGT CTT TTG AGG CAG CCT GAT GCT GGT AAC ATT TTC 925 Met Ser Ala Glu Gly Leu Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe 270 275 280 AAG ATA ACA GGT CTT GGG GTC AAA GGA ATT GCT CCA TAT TCC TAT GCA 973 Lys Ile Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala 285 290 295 GGG TAA ACTGCAGCTC TTCCTTGCTG TCAGAAGAAA AAGCTTGAAG ACAACTGAGA 1029 Gly ATTAAACTGC TGCTCTTCCT TGCTGTCAGA AGAAAAAGCT TGAAGACAAC TGAGAATTAA 1089 GGGAGAGAAA TCAATGAACT TTCATATTGT TTTTTTAATG AGGCAGTGAT ATTGACATGG 1149 TTAAACTGCT TTAATTTACA CTTTTGGGAGATACCTTTTGATTA GGCT

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列で表
わされるレギュカルチンをコードするＤＮＡ断片。1. A DNA fragment encoding regucalcin represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列を有する
ものである請求項１記載のＤＮＡ断片。2. The DNA fragment according to claim 1, which has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
換え体ＤＮＡ。3. A recombinant DNA containing the DNA fragment according to claim 1. 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡ断片を含有する組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞。4. A transformant cell carrying a recombinant DNA containing the DNA fragment according to claim 1.