JPH0673471B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH0673471B2 JPH0673471B2 JP61305248A JP30524886A JPH0673471B2 JP H0673471 B2 JPH0673471 B2 JP H0673471B2 JP 61305248 A JP61305248 A JP 61305248A JP 30524886 A JP30524886 A JP 30524886A JP H0673471 B2 JPH0673471 B2 JP H0673471B2
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- ganglioside
- glycolyl
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- monoclonal antibody
- yhd
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノクローナル抗体、特にＮ−グリコリルノ
イラミン酸含有糖鎖を特異的に認識するモノクローナル
抗体に関する。
イラミン酸含有糖鎖を特異的に認識するモノクローナル
抗体に関する。
糖脂質は細胞の形質膜構成成分であり、構成糖の種類、
数、結合方法の違いにより多様な分子種が存在し、種特
異的、臓器特異的、細胞特異的な分布を示す。その機能
としては、細菌毒素、ホルモン等の受容体として、ま
た、血液型物質等、免疫学的決定量としての働きの他、
増殖又は分化の制御や細胞間の相互作用に関し、重要な
役割りを演じていることが明らかになりつつある。更
に、細胞のガン化に伴い、質的、量的な組成変化が起こ
り、一部はガン抗原となりうることが示され、また、あ
る種の糖脂質が増殖因子、タンパクキナーゼを介する細
胞増殖機構の調節者として働く例など、その組成変化
が、ガン化機構に直接的に関与している可能性も示唆さ
れている。
数、結合方法の違いにより多様な分子種が存在し、種特
異的、臓器特異的、細胞特異的な分布を示す。その機能
としては、細菌毒素、ホルモン等の受容体として、ま
た、血液型物質等、免疫学的決定量としての働きの他、
増殖又は分化の制御や細胞間の相互作用に関し、重要な
役割りを演じていることが明らかになりつつある。更
に、細胞のガン化に伴い、質的、量的な組成変化が起こ
り、一部はガン抗原となりうることが示され、また、あ
る種の糖脂質が増殖因子、タンパクキナーゼを介する細
胞増殖機構の調節者として働く例など、その組成変化
が、ガン化機構に直接的に関与している可能性も示唆さ
れている。
一方、１種類の抗原決定基に対し特異性を有する、均一
な抗体を産生する細胞株の樹立方法がミルスタインらに
より報告され〔ネーチヤー（Nature）、第256巻、第495
〜497頁（1975年）〕、微量物質の定性、定量が可能と
なつた。ガン抗原の検索を行うため、この技術を用い、
ガン細胞に特異的な多くのモノクローナル抗体が作製さ
れたが、このうちのいくつかは糖脂質あるいは糖タンパ
ク質の糖鎖を認識する抗体であることが明らかにされた
〔ジヤーナル オブ ナシヨナル キヤンサー インス
テイチユート（J.Natl.Cancer Inst.）第71巻、第231
〜251頁、（1983年）〕。
な抗体を産生する細胞株の樹立方法がミルスタインらに
より報告され〔ネーチヤー（Nature）、第256巻、第495
〜497頁（1975年）〕、微量物質の定性、定量が可能と
なつた。ガン抗原の検索を行うため、この技術を用い、
ガン細胞に特異的な多くのモノクローナル抗体が作製さ
れたが、このうちのいくつかは糖脂質あるいは糖タンパ
ク質の糖鎖を認識する抗体であることが明らかにされた
〔ジヤーナル オブ ナシヨナル キヤンサー インス
テイチユート（J.Natl.Cancer Inst.）第71巻、第231
〜251頁、（1983年）〕。
例えば、人のメラノーマに対するモノクローナル抗体と
してGD2ガングリオシド、あるいはGD3ガングリオシドな
どの糖脂質と反応する抗体が得られている。また、すい
ガンに特異的なモノクローナル抗体NS19−９は、シアロ
シルルイスＡ型の糖鎖を有する糖脂質と反応する。これ
らの抗体はガンの診断、治療経過の観察に有用であり、
更に治療への利用も試みられている。糖脂質のガン化に
伴う質的、量的変化は、遺伝子の発現異常により糖鎖生
合成機構における種々の糖転移酵素の活性が変化するる
ことに起因しており、その結果、正常組織に存在しない
ような糖鎖構造が作り出される。その糖鎖構造は、ガン
マーカーとしての利用が可能である。
してGD2ガングリオシド、あるいはGD3ガングリオシドな
どの糖脂質と反応する抗体が得られている。また、すい
ガンに特異的なモノクローナル抗体NS19−９は、シアロ
シルルイスＡ型の糖鎖を有する糖脂質と反応する。これ
らの抗体はガンの診断、治療経過の観察に有用であり、
更に治療への利用も試みられている。糖脂質のガン化に
伴う質的、量的変化は、遺伝子の発現異常により糖鎖生
合成機構における種々の糖転移酵素の活性が変化するる
ことに起因しており、その結果、正常組織に存在しない
ような糖鎖構造が作り出される。その糖鎖構造は、ガン
マーカーとしての利用が可能である。
このように、ガン化機構解明の手掛りとして、また、ガ
ン抗原及びガンマーカーとしての糖脂質の重要性、有用
性が注目されており、診断、治療等、臨床分野への応用
が期待される。
ン抗原及びガンマーカーとしての糖脂質の重要性、有用
性が注目されており、診断、治療等、臨床分野への応用
が期待される。
糖脂質のうち、酸性糖であるシアル酸をその糖鎖中に含
有するものはガングリオシドと総称される。シアル酸の
種類としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸と、Ｎ−グリ
コリルノイラミン酸が主なものである。シアル酸は動物
種の諸臓器、細胞、体液中に広く検出されるがＮ−グリ
コリルノイラミン酸については、正常人、及びニワトリ
には今までのところ見出されていない。
有するものはガングリオシドと総称される。シアル酸の
種類としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸と、Ｎ−グリ
コリルノイラミン酸が主なものである。シアル酸は動物
種の諸臓器、細胞、体液中に広く検出されるがＮ−グリ
コリルノイラミン酸については、正常人、及びニワトリ
には今までのところ見出されていない。
血清病患者に検出され、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、
モルモツトの赤血球を凝集する異好性抗体はハンガナチ
ウ−ダイヘル（Hanganatziu−Deicher、以下、Ｈ−Ｄと
略記する）抗体と呼ばれる。この抗体により認識される
抗原はＨ−Ｄ抗原と呼ばれる。Ｎ−グリコリルノイラミ
ン酸含有ガングリオシドがＨ−Ｄ抗原活性を有すること
が報告され、〔バイオケミカル アンド バイオフイジ
カル リサーチ コミユニケーシヨンズ（Biochem.Biop
hys.Res.Commun.）第79巻、第388〜395頁（1977）〕、N
euGc α２−３ Galの糖鎖構造が主な抗原決定基とし
て同定された。
モルモツトの赤血球を凝集する異好性抗体はハンガナチ
ウ−ダイヘル（Hanganatziu−Deicher、以下、Ｈ−Ｄと
略記する）抗体と呼ばれる。この抗体により認識される
抗原はＨ−Ｄ抗原と呼ばれる。Ｎ−グリコリルノイラミ
ン酸含有ガングリオシドがＨ−Ｄ抗原活性を有すること
が報告され、〔バイオケミカル アンド バイオフイジ
カル リサーチ コミユニケーシヨンズ（Biochem.Biop
hys.Res.Commun.）第79巻、第388〜395頁（1977）〕、N
euGc α２−３ Galの糖鎖構造が主な抗原決定基とし
て同定された。
近年、Ｈ−Ｄ抗原活性を有するガングリオシドであるＮ
−グリコリルGM3ガングリオシド（II3NeuGc−LacCer）
をニワトリに免疫して、血清からＨ−Ｄ抗原活性を有す
る種々のガングリオシドと反応する抗体を作製し、この
抗体を用いて、Ｎ−グリコリルノイラミン酸が人ガン組
織に特徴的に存在することが報告された〔ビケン ジヤ
ーナル（Biken J.）第25巻、第47〜50頁（1982
年）〕。また、人大腸ガン組織より抽出された糖脂質中
に、数種のＨ−Ｄ抗原アクテイブなＮ−グリコリルノイ
ラミン酸含有ガングリオシドが検出され、奇型腫の組織
中からは、Ｈ−Ｄ抗原アクテイブな糖鎖を有する糖たん
ぱくが検出された〔ガン（Gann）、第75巻、第1025〜10
29頁（1984年）〕。ニワトリにて作製した抗体を用いて
ヒト大腸ガン組織より検出されるＨ−Ｄ抗原活性を有す
る糖脂質を分析したところ、Ｎ−グリコリルGM2ガング
リオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、Ｏ−ア
シル−Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、IV3NeuGc−n
LcOse4Cerであり、これらは正常組織には検出されなか
つた〔キヤンサー リサーチ（Cancer Res.）第45巻、
第3796〜3802頁（1985年）〕。
−グリコリルGM3ガングリオシド（II3NeuGc−LacCer）
をニワトリに免疫して、血清からＨ−Ｄ抗原活性を有す
る種々のガングリオシドと反応する抗体を作製し、この
抗体を用いて、Ｎ−グリコリルノイラミン酸が人ガン組
織に特徴的に存在することが報告された〔ビケン ジヤ
ーナル（Biken J.）第25巻、第47〜50頁（1982
年）〕。また、人大腸ガン組織より抽出された糖脂質中
に、数種のＨ−Ｄ抗原アクテイブなＮ−グリコリルノイ
ラミン酸含有ガングリオシドが検出され、奇型腫の組織
中からは、Ｈ−Ｄ抗原アクテイブな糖鎖を有する糖たん
ぱくが検出された〔ガン（Gann）、第75巻、第1025〜10
29頁（1984年）〕。ニワトリにて作製した抗体を用いて
ヒト大腸ガン組織より検出されるＨ−Ｄ抗原活性を有す
る糖脂質を分析したところ、Ｎ−グリコリルGM2ガング
リオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、Ｏ−ア
シル−Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、IV3NeuGc−n
LcOse4Cerであり、これらは正常組織には検出されなか
つた〔キヤンサー リサーチ（Cancer Res.）第45巻、
第3796〜3802頁（1985年）〕。
また、ニワトリのリンパ腫の１種であるマレツク病の細
胞株中にも、Ｈ−Ｄ抗原活性を有するガングリオシドが
検出された｛ジヤーナル オブ バイオケミストリー
（東京）、〔J.Biochem.（Tokyo）〕第95巻、第785〜79
4頁（1984）｝。
胞株中にも、Ｈ−Ｄ抗原活性を有するガングリオシドが
検出された｛ジヤーナル オブ バイオケミストリー
（東京）、〔J.Biochem.（Tokyo）〕第95巻、第785〜79
4頁（1984）｝。
Ｎ−グリコリルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラ
ミン酸含有糖鎖はガン関連抗原と考えられ、これらを高
感度に精度よく検出することはガン診断上極めて重要で
ある。
ミン酸含有糖鎖はガン関連抗原と考えられ、これらを高
感度に精度よく検出することはガン診断上極めて重要で
ある。
Ｎ−グリコリルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラ
ミン酸含有糖鎖を効率よく検出するには、検出感度、精
度の面から、免疫学的測定法が優れていると考えられ
る。
ミン酸含有糖鎖を効率よく検出するには、検出感度、精
度の面から、免疫学的測定法が優れていると考えられ
る。
Ｈ−Ｄ抗原活性を有するＮ−グリコリルノイラミン酸含
有糖鎖と反応する抗体は、従来、ニワトリにＨ−Ｄ抗原
活性を有する精製糖脂質抗原を免疫し、その血清より分
離することにより得られた。しかしながら、この方法は
いくつかの欠点を有している。すなわち、（１）抗血清
を得るためには、そのたびごとに大量の精製抗原が必要
である。（２）主として免疫動物の固体差に起因する、
親和性や力価のバラツキがある。（３）目的とする抗体
以外の抗体も混在するため、目的の抗体を精製するため
には繁雑な操作が必要である。（４）一度に作製できる
量に限度がある等の欠点である。それ故、正確かつ、最
大の効果を持つて免疫学的測定を行うためには、他の抗
体の混入しない品質の安定した均一な抗体が大量に供給
できることが望まれていた。このような抗体の作製は、
既に、モノクローナル抗体産生技術として報告されてい
る。
有糖鎖と反応する抗体は、従来、ニワトリにＨ−Ｄ抗原
活性を有する精製糖脂質抗原を免疫し、その血清より分
離することにより得られた。しかしながら、この方法は
いくつかの欠点を有している。すなわち、（１）抗血清
を得るためには、そのたびごとに大量の精製抗原が必要
である。（２）主として免疫動物の固体差に起因する、
親和性や力価のバラツキがある。（３）目的とする抗体
以外の抗体も混在するため、目的の抗体を精製するため
には繁雑な操作が必要である。（４）一度に作製できる
量に限度がある等の欠点である。それ故、正確かつ、最
大の効果を持つて免疫学的測定を行うためには、他の抗
体の混入しない品質の安定した均一な抗体が大量に供給
できることが望まれていた。このような抗体の作製は、
既に、モノクローナル抗体産生技術として報告されてい
る。
しかしながら、Ｈ−Ｄ抗原活性を有するＮ−グリコリル
ノイラミン酸含有糖鎖に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体及び該抗体産生能を有するハイブリドーマについ
ては現在まで作製に成功したという報告はなされていな
い。
ノイラミン酸含有糖鎖に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体及び該抗体産生能を有するハイブリドーマについ
ては現在まで作製に成功したという報告はなされていな
い。
本発明の第１目的はＨ−Ｄ抗原活性を有するＮ−グリコ
リルノイラミン酸含有糖鎖を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を提供することにあり、第２の目的はＨ−Ｄ
抗原活性を有するＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖
を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマの作製方法を提供することにある。
リルノイラミン酸含有糖鎖を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を提供することにあり、第２の目的はＨ−Ｄ
抗原活性を有するＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖
を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマの作製方法を提供することにある。
〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はモノクロー
ナル抗体に関する発明であつて、Ｎ−グリコリルノイラ
ミン酸含有糖鎖を認識し、Ｎ−アセチルノイラミン酸含
有糖鎖及びシアル酸を含有しない糖鎖を認識しないもの
であることを特徴とする。
ナル抗体に関する発明であつて、Ｎ−グリコリルノイラ
ミン酸含有糖鎖を認識し、Ｎ−アセチルノイラミン酸含
有糖鎖及びシアル酸を含有しない糖鎖を認識しないもの
であることを特徴とする。
以下、本明細書において、Ｎ−グリコリルノイラミン酸
含有糖鎖を特異的に認識するとは、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸含有糖鎖、及びシアル酸を含有しない糖鎖をいず
れも認識しないことを意味する。
含有糖鎖を特異的に認識するとは、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸含有糖鎖、及びシアル酸を含有しない糖鎖をいず
れも認識しないことを意味する。
本発明者は、Ｈ−Ｄ抗原活性を有するＮ−グリコリルノ
イラミン酸含有ガングリオシドを特異的に認識するモノ
クローナル抗体、及び該モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを作製することを試み鋭意検討した結果、本発
明を完成した。
イラミン酸含有ガングリオシドを特異的に認識するモノ
クローナル抗体、及び該モノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを作製することを試み鋭意検討した結果、本発
明を完成した。
本明細書に記述される糖脂質の構造を下記に示す。
〔式中、Calはガラクトース、Glcはグルコース、CalNAc
はＮ−アセチルガラクトサミン、GlcNAcはＮ−アセチル
グルコサミン、Neu GcはＮ−グリコリルノイラミン
酸、Neu AcはＮ−アセチルノイラミン酸、Cerはセラミ
ドを意味する〕 本発明のモノクローナル抗体は人ガン関連抗原と考えら
れるＨ−Ｄ抗原活性を有する１つ又は数種のガングリオ
シドとの反応性を有し、Ｎ−アセチルノイラミン酸含有
ガングリオシド、及びシアル酸を含まない糖脂質とは反
応しない。
はＮ−アセチルガラクトサミン、GlcNAcはＮ−アセチル
グルコサミン、Neu GcはＮ−グリコリルノイラミン
酸、Neu AcはＮ−アセチルノイラミン酸、Cerはセラミ
ドを意味する〕 本発明のモノクローナル抗体は人ガン関連抗原と考えら
れるＨ−Ｄ抗原活性を有する１つ又は数種のガングリオ
シドとの反応性を有し、Ｎ−アセチルノイラミン酸含有
ガングリオシド、及びシアル酸を含まない糖脂質とは反
応しない。
本発明のモノクローナル抗体により認識されるＨ−Ｄ抗
原活性を有する糖鎖は、糖脂質だけでなく糖たんぱくに
も存在する。したがつて人ガン関連抗原と考えられるこ
れらの糖鎖を認識する本発明のモノクローナル抗体は、
ガン診断上極めて有用である。
原活性を有する糖鎖は、糖脂質だけでなく糖たんぱくに
も存在する。したがつて人ガン関連抗原と考えられるこ
れらの糖鎖を認識する本発明のモノクローナル抗体は、
ガン診断上極めて有用である。
本発明のモノクローナル抗体は組織、細胞診断又は血
液、尿診断又は画像診断等による人ガン診断に極めて有
用であり、また、抗体に薬物を結合させるミサイル療法
や細胞傷害性を利用した治療への応用が可能である。更
に本発明のモノクローナル抗体は、Ｈ−Ｄ抗体の検出に
も使用可能である。また、ニワトリのマレツク病の診
断、治療にも適用可能である。
液、尿診断又は画像診断等による人ガン診断に極めて有
用であり、また、抗体に薬物を結合させるミサイル療法
や細胞傷害性を利用した治療への応用が可能である。更
に本発明のモノクローナル抗体は、Ｈ−Ｄ抗体の検出に
も使用可能である。また、ニワトリのマレツク病の診
断、治療にも適用可能である。
本発明のモノクローナル抗体は、糖鎖とガン化機構との
関連や、糖鎖の生体内での役割り等についての基礎的研
究において、有用な道具として用いることが可能であ
る。
関連や、糖鎖の生体内での役割り等についての基礎的研
究において、有用な道具として用いることが可能であ
る。
本発明のモノクローナル抗体は次のような方法で得られ
る。
る。
まず、免疫原を哺乳動物に免疫する。この際、免疫する
哺乳動物は細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、マウス、ラツトを用い
るのがより好ましい。本発明において対象とするＮ−グ
リコリルノイラミン酸含有糖脂質の場合には、自己免疫
疾患動物に用いることが更に好ましく、自己免疫マウス
を用いることが特に好ましい。使用可能な自己免疫疾患
マウスとしてはNZB、NZW、B/WF1、MRL/1、BXSB雄、SL/N
i等が挙げられる。
哺乳動物は細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、マウス、ラツトを用い
るのがより好ましい。本発明において対象とするＮ−グ
リコリルノイラミン酸含有糖脂質の場合には、自己免疫
疾患動物に用いることが更に好ましく、自己免疫マウス
を用いることが特に好ましい。使用可能な自己免疫疾患
マウスとしてはNZB、NZW、B/WF1、MRL/1、BXSB雄、SL/N
i等が挙げられる。
また、バクテリアル リポポリサツカライド（LPS）、
デキストランサルフエート等のポリクローナルＢセルア
クチベーター（PBA）を投与することにより自己抗体産
生能を高めさせた、Balb/c等の正常マウスを自己免疫疾
患状態にし、免疫動物として用いても良い。
デキストランサルフエート等のポリクローナルＢセルア
クチベーター（PBA）を投与することにより自己抗体産
生能を高めさせた、Balb/c等の正常マウスを自己免疫疾
患状態にし、免疫動物として用いても良い。
Ｎ−グリコリルノイラミン酸はマウスを含む多くの動物
体内に存在する。
体内に存在する。
本発明において対象とするＨ−Ｄ抗原活性を有するガン
グリオシドを含むＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂
質はマウス組織内に広く存在することが知られており、
マウスにとつては、これらの糖脂質は自己抗原であり、
免疫原性は極めて弱いと考えられる。Balb/cマウス等の
正常マウスを免疫動物として用いる従来の方法において
はＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂質に対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることは極めて
困難である。他方、自己免疫疾患マウスは、抗核抗体や
抗赤血球抗体等の自己抗原に対する抗体を産生すること
が知られている。
グリオシドを含むＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂
質はマウス組織内に広く存在することが知られており、
マウスにとつては、これらの糖脂質は自己抗原であり、
免疫原性は極めて弱いと考えられる。Balb/cマウス等の
正常マウスを免疫動物として用いる従来の方法において
はＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂質に対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることは極めて
困難である。他方、自己免疫疾患マウスは、抗核抗体や
抗赤血球抗体等の自己抗原に対する抗体を産生すること
が知られている。
本発明者はＨ−Ｄ抗原活性を有する糖脂質に対するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を試み、自己
免疫疾患マウスに免疫することにより、極めて容易に目
的のハイブリドーマが作製されることを見出し、本発明
を完成した。
クローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を試み、自己
免疫疾患マウスに免疫することにより、極めて容易に目
的のハイブリドーマが作製されることを見出し、本発明
を完成した。
本発明により、自己抗原と考えられるＮ−グリコリルノ
イラミン酸含有糖鎖に対するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを容易に作製することが可能とな
り、該モノクローナル抗体を入手することが可能となつ
た。
イラミン酸含有糖鎖に対するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを容易に作製することが可能とな
り、該モノクローナル抗体を入手することが可能となつ
た。
免疫原としては、Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂
質を有する細胞自体、該細胞より分離した細胞膜成分及
び該細胞より分離したＮ−グリコリルノイラミン酸含有
糖脂質のいずれも用いることが可能である。また、糖脂
質をリン脂質とコレステロールと共にリポソームとし用
いることも可能である。免疫は一般的方法により行わ
れ、上記免疫原をリン酸緩衝溶液（以下PBSと略記す
る）等にて希釈し、腹腔内若しくは静脈内に投与すれば
よい。その際、免疫原を牛血清アルブミン（BSA）や、
菌体等の担体に担持させてもよく、また、フロイントア
ジユバントや、菌体アジユバント等のアジユバントを共
に注射してもよい。
質を有する細胞自体、該細胞より分離した細胞膜成分及
び該細胞より分離したＮ−グリコリルノイラミン酸含有
糖脂質のいずれも用いることが可能である。また、糖脂
質をリン脂質とコレステロールと共にリポソームとし用
いることも可能である。免疫は一般的方法により行わ
れ、上記免疫原をリン酸緩衝溶液（以下PBSと略記す
る）等にて希釈し、腹腔内若しくは静脈内に投与すれば
よい。その際、免疫原を牛血清アルブミン（BSA）や、
菌体等の担体に担持させてもよく、また、フロイントア
ジユバントや、菌体アジユバント等のアジユバントを共
に注射してもよい。
免疫動物から採取した脾細胞はマウス骨髄腫細胞と融合
させる。骨髄腫細胞としては、既に公知の種々の細胞、
例えばNS−１、SP−２、X63.6.5.3、P3−U1等が使用さ
れる。融合方法は公知の手法に準じて行われる。融合促
進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PE
G）、センダイウイルス（HVJ）等が使用される。脾細胞
と骨髄腫細胞との使用比は一般的方法と同様であり、１
対１〜10対１が好ましい。
させる。骨髄腫細胞としては、既に公知の種々の細胞、
例えばNS−１、SP−２、X63.6.5.3、P3−U1等が使用さ
れる。融合方法は公知の手法に準じて行われる。融合促
進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PE
G）、センダイウイルス（HVJ）等が使用される。脾細胞
と骨髄腫細胞との使用比は一般的方法と同様であり、１
対１〜10対１が好ましい。
融合終了後、通常の選択用培地にて培養することにより
ハイブリドーマを選択する。前記した骨髄腫細胞はHAT
培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを
含む培地）中では生育できないため、HAT培地中で生育
する細胞を選択すればよい。
ハイブリドーマを選択する。前記した骨髄腫細胞はHAT
培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを
含む培地）中では生育できないため、HAT培地中で生育
する細胞を選択すればよい。
ハイブリドーマのコロニーが充分大きくなつたところで
目的とする抗体の産生株の検索及びクローニングが行わ
れる。
目的とする抗体の産生株の検索及びクローニングが行わ
れる。
該抗体産生株の検索は、一般に抗体の検出に用いられて
いる方法、例えばELISA法〔メソツド イン エンザイ
モロジー（Meth.Enzymol.）第70巻、第419〜439頁（198
0年）〕、凝集反応法、RIA法、二重免疫拡散法などによ
り行われる。
いる方法、例えばELISA法〔メソツド イン エンザイ
モロジー（Meth.Enzymol.）第70巻、第419〜439頁（198
0年）〕、凝集反応法、RIA法、二重免疫拡散法などによ
り行われる。
具体的には、精製した糖脂質抗原を付着させたプレート
をBSAにてブロックした後、被検ハイブリドーマの培養
上清と反応させ、更に、酵素標識したマウス抗体に対す
る抗体を反応させ、該抗原に結合した抗体の存在を、酵
素活性を測定することにより確認し、所望の抗体産生株
を選択する。
をBSAにてブロックした後、被検ハイブリドーマの培養
上清と反応させ、更に、酵素標識したマウス抗体に対す
る抗体を反応させ、該抗原に結合した抗体の存在を、酵
素活性を測定することにより確認し、所望の抗体産生株
を選択する。
また、クローニングは限界希釈法により行われる。すな
わち、96穴マイクロタイタープレート上に、ハイブリド
ーマが各ウエル当り１個以下になるよう分配し、単一コ
ロニーを生育させる。この際、フイーダー細胞としてマ
ウス胸腺細胞を添加することが好ましい。
わち、96穴マイクロタイタープレート上に、ハイブリド
ーマが各ウエル当り１個以下になるよう分配し、単一コ
ロニーを生育させる。この際、フイーダー細胞としてマ
ウス胸腺細胞を添加することが好ましい。
上述のクローニングを繰返し、モノクローン化されたハ
イブリドーマを得る。
イブリドーマを得る。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は液体窒素内で長期保存が可能であり、分譲可能な状態
に保持されている。
は液体窒素内で長期保存が可能であり、分譲可能な状態
に保持されている。
本発明のモノクローナル抗体を得るには、ハイブリドー
マを倍地中にて培養し、培養上清から分離する方法、あ
るいはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹
水より回収する方法がある。更に、一般的な方法、すな
わち硫安沈殿、ゲル過、イオン交換カラムクロマトグ
ラフイー等を用いて精製することも可能である。
マを倍地中にて培養し、培養上清から分離する方法、あ
るいはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹
水より回収する方法がある。更に、一般的な方法、すな
わち硫安沈殿、ゲル過、イオン交換カラムクロマトグ
ラフイー等を用いて精製することも可能である。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ １）抗原及び各種糖脂質の単離、精製 ウサギ胸腺細胞膜成分 生後６週齢のウサギ２匹より得た胸腺組織をリン酸緩衝
溶液中ホモジナイズし、800rpmにて５分間遠心分離し
た。上清を10,000gにて１時間遠心分離し、得られたペ
レツトをPBS10mlに分散し、免疫原として用いた。
溶液中ホモジナイズし、800rpmにて５分間遠心分離し
た。上清を10,000gにて１時間遠心分離し、得られたペ
レツトをPBS10mlに分散し、免疫原として用いた。
糖脂質 牛腎臓を冷アセトン中ホモジナイズし、更に、多量の冷
アセトンを加え、得られた沈殿物より、容量比クロロホ
ルム：メタノール：水（10:20:1）（10:10:0）（20:10:
1）の各混合溶液にて順次抽出操作を行つた。得られた
粗製糖脂質をDEAE−セフアデツクスＡ−25カラムクロマ
トグラフイーにかけ、酸性画分と中性画分に分け、酸性
画分をイアトロビーズカラムクロマトグラフイーにか
け、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドを得た。同様に
して馬赤血球よりＮ−グリコリルGM3ガングリオシド
を、牛赤血球よりIV3NeuGc−nLcOse4Cer及びIV3NeuGc−
nLcOse6Cerを、人脳よりＮ−アセチルGM2ガングリオシ
ド及びＮ−アセチルGM3ガングリオシドを、人赤血球よ
りCDHを得た。Ｎ−アセチルGM2ガングリオシドを1Nギ酸
中にて100℃、１時間反応させ、DEAE−セフアデツクス
Ａ−25カラムクロマトグラフイー、次いでイアトロビー
ズカラムクロマトグラフイーを行い、アシアロGM2を得
た。C3H/Heマウス赤血球より酸性糖脂質画分を得、その
まま精製することなしにTLC上エンザイムイムノステイ
ニングに用いた。
アセトンを加え、得られた沈殿物より、容量比クロロホ
ルム：メタノール：水（10:20:1）（10:10:0）（20:10:
1）の各混合溶液にて順次抽出操作を行つた。得られた
粗製糖脂質をDEAE−セフアデツクスＡ−25カラムクロマ
トグラフイーにかけ、酸性画分と中性画分に分け、酸性
画分をイアトロビーズカラムクロマトグラフイーにか
け、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドを得た。同様に
して馬赤血球よりＮ−グリコリルGM3ガングリオシド
を、牛赤血球よりIV3NeuGc−nLcOse4Cer及びIV3NeuGc−
nLcOse6Cerを、人脳よりＮ−アセチルGM2ガングリオシ
ド及びＮ−アセチルGM3ガングリオシドを、人赤血球よ
りCDHを得た。Ｎ−アセチルGM2ガングリオシドを1Nギ酸
中にて100℃、１時間反応させ、DEAE−セフアデツクス
Ａ−25カラムクロマトグラフイー、次いでイアトロビー
ズカラムクロマトグラフイーを行い、アシアロGM2を得
た。C3H/Heマウス赤血球より酸性糖脂質画分を得、その
まま精製することなしにTLC上エンザイムイムノステイ
ニングに用いた。
免疫感作用の糖脂質含有リポソームは、糖脂質1mg、ホ
スフアチジルコリン4mg、コレステロール10mgの容量比
クロロホルム：メタノール（1:1）混合溶液をフラスコ
中、減圧下、完全に溶媒を除去した後、PBS5mlを加え、
超音波をかけることにより調製した。
スフアチジルコリン4mg、コレステロール10mgの容量比
クロロホルム：メタノール（1:1）混合溶液をフラスコ
中、減圧下、完全に溶媒を除去した後、PBS5mlを加え、
超音波をかけることにより調製した。
２）免疫法及び細胞融合 １回目 ウサギ胸腺細胞膜成分PBS溶液と同量のフロイント完全
アジユバントを乳化混合し、400μをNZBマウス（雌、
６週齢）の腹腔内に注射した。２週間後、更にフロイン
ト不完全アジユバントを用い、同様に注射した。13週間
後、IV3NeuGc−nLcOse4Cer含有リポソームPBS溶液100μ
を腹腔内注射し、更に２週間後同様にリポソームを注
射した。
アジユバントを乳化混合し、400μをNZBマウス（雌、
６週齢）の腹腔内に注射した。２週間後、更にフロイン
ト不完全アジユバントを用い、同様に注射した。13週間
後、IV3NeuGc−nLcOse4Cer含有リポソームPBS溶液100μ
を腹腔内注射し、更に２週間後同様にリポソームを注
射した。
細胞融合 最終免疫の３日後にマウスより脾臓を取出し、単細胞に
ほぐした後、脾細胞を、RPMI1640培地にて洗浄した。一
方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞X63.6.5.3を集
め、RPMI1640培地にて洗浄した。脾細胞７×107個の浮
遊液とマウスミエローマ1.4×107の浮遊液を混合し遠心
分離にて培地を除去した。37℃に加温した水浴中にて、
混合した細胞に50％ポリエチレングリコール−RPMI1640
培地1mlを１分間かけて徐々に加え、１分間ゆるやかに
かくはんさせ融合を行つた。RPMI1640培地2mlを２分間
かけ、更に7mlを２分間かけゆるやかにかくはんしつつ
添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞に10％牛胎
児血清含有RPMI1640培地20mlを加え、96穴プレート２枚
に１穴当り0.1mlずつ分配した。翌日、HAT培地（４×10
-7Mアミノプリテン、1.6×10-5Mチミジン、１×10-4Mヒ
ポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640培地）0.
1mlをウエルに加えた。各ウエルの培地は、更に、３日
又は４日毎にHAT培地に半量ずつ交換した。３週間後、8
0％のウエルにハイブリドーマの生育が見られた。
ほぐした後、脾細胞を、RPMI1640培地にて洗浄した。一
方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞X63.6.5.3を集
め、RPMI1640培地にて洗浄した。脾細胞７×107個の浮
遊液とマウスミエローマ1.4×107の浮遊液を混合し遠心
分離にて培地を除去した。37℃に加温した水浴中にて、
混合した細胞に50％ポリエチレングリコール−RPMI1640
培地1mlを１分間かけて徐々に加え、１分間ゆるやかに
かくはんさせ融合を行つた。RPMI1640培地2mlを２分間
かけ、更に7mlを２分間かけゆるやかにかくはんしつつ
添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞に10％牛胎
児血清含有RPMI1640培地20mlを加え、96穴プレート２枚
に１穴当り0.1mlずつ分配した。翌日、HAT培地（４×10
-7Mアミノプリテン、1.6×10-5Mチミジン、１×10-4Mヒ
ポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640培地）0.
1mlをウエルに加えた。各ウエルの培地は、更に、３日
又は４日毎にHAT培地に半量ずつ交換した。３週間後、8
0％のウエルにハイブリドーマの生育が見られた。
２回目 ウサギ胸腺細胞膜成分PBS溶液と、同量のフロイント完
全アジユバントを乳化混合し、300μをNZBマウス
（雌、６週齢）の腹腔内に注射した。以後、酸で処理し
たサルモネラミネソタバクテリア80μｇに吸着させたＮ
−グリコリルGM3ガングリオシド20μｇのPBS溶液200μ
を２週間ごとに５回静脈注射した。
全アジユバントを乳化混合し、300μをNZBマウス
（雌、６週齢）の腹腔内に注射した。以後、酸で処理し
たサルモネラミネソタバクテリア80μｇに吸着させたＮ
−グリコリルGM3ガングリオシド20μｇのPBS溶液200μ
を２週間ごとに５回静脈注射した。
最終免疫の３日後にマウスより脾臓を取出し、単細胞に
ほぐした後、脾細胞を、RPMI1640培地にて洗浄した。一
方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞X63.6.5.3を集
め、RPMI1640培地にて洗浄した。脾細胞4.7×108個の浮
遊液とマウスミエローマ9.2×107個の浮遊液を混合し遠
心分離にて培地を除去した。37℃に加温した水浴中に
て、混合した細胞に50％ポリエチレングリコール−RPMI
1640培地2mlを１分間かけて徐々に加え、１分間ゆるや
かにかくはんさせ融合を行つた。RPMI1640培地4mlを２
分間かけ、更に14mlを２分間かけゆるやかにかくはんし
つつ添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞に10％
牛胎児血清含有RPMI1640培地120mlを加え、96穴プレー
ト12枚に１穴当り0.1mlずつ分配した。翌日、HAT培地
（４×10-7Mアミノプテリン、1.6×10-5Mチミジン、１
×10-4Mヒポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI164
0培地）0.1mlを各ウエルに加えた。各ウエルの培地は、
更に、３日又は４日ごとにHAT培地に半量ずつ交換し
た。３週間後、90％のウエルにハイブリドーマの生育が
見られた。
ほぐした後、脾細胞を、RPMI1640培地にて洗浄した。一
方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞X63.6.5.3を集
め、RPMI1640培地にて洗浄した。脾細胞4.7×108個の浮
遊液とマウスミエローマ9.2×107個の浮遊液を混合し遠
心分離にて培地を除去した。37℃に加温した水浴中に
て、混合した細胞に50％ポリエチレングリコール−RPMI
1640培地2mlを１分間かけて徐々に加え、１分間ゆるや
かにかくはんさせ融合を行つた。RPMI1640培地4mlを２
分間かけ、更に14mlを２分間かけゆるやかにかくはんし
つつ添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞に10％
牛胎児血清含有RPMI1640培地120mlを加え、96穴プレー
ト12枚に１穴当り0.1mlずつ分配した。翌日、HAT培地
（４×10-7Mアミノプテリン、1.6×10-5Mチミジン、１
×10-4Mヒポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI164
0培地）0.1mlを各ウエルに加えた。各ウエルの培地は、
更に、３日又は４日ごとにHAT培地に半量ずつ交換し
た。３週間後、90％のウエルにハイブリドーマの生育が
見られた。
３回目 免疫法は、静脈注射を８回行つた以外は２回目と同様に
行つた。
行つた。
細胞融合は、脾細胞3.6×108個、マウスミエローマ7.1
×107個を用い、100mlの10％牛胎児血清含有RPMI培地を
加え、96穴プレート10枚に分配した以外は２回目と同様
に行つた。
×107個を用い、100mlの10％牛胎児血清含有RPMI培地を
加え、96穴プレート10枚に分配した以外は２回目と同様
に行つた。
３週間後、80％のウエルにハイブリドーマの生育が見ら
れた。
れた。
３）ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマ培養上清中の抗体の検索はELISA法にて
行つた。
行つた。
抗原として、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシド、Ｎ−
グリコリルGM3ガングリオシド及びIV3NeuGc−nLcOse4Ce
rを用いた。抗原500ngをELISA用マイクロタイタープレ
ートに吸着させ、１％BSA PBS溶液にてブロツキングし
た後、培養上清を反応させた。更に、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させ、基
質としてオルトフエニレンジアミンを用い、492nmの吸
光度を測定することにより、目的の抗体を検出した。そ
の結果、１回目の免疫、細胞融合にて作製したハイブリ
ドーマ中、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドに強く反
応する抗体が１つのウエルに検出され、また２回目の免
疫、細胞融合にて作製したハイブリドーマ中、Ｎ−グリ
コリルGM2ガングリオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリ
オシド及びIV3NeuGc−nLcOse4Cerと強く反応する抗体が
１つのウエルに検出された。
グリコリルGM3ガングリオシド及びIV3NeuGc−nLcOse4Ce
rを用いた。抗原500ngをELISA用マイクロタイタープレ
ートに吸着させ、１％BSA PBS溶液にてブロツキングし
た後、培養上清を反応させた。更に、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させ、基
質としてオルトフエニレンジアミンを用い、492nmの吸
光度を測定することにより、目的の抗体を検出した。そ
の結果、１回目の免疫、細胞融合にて作製したハイブリ
ドーマ中、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドに強く反
応する抗体が１つのウエルに検出され、また２回目の免
疫、細胞融合にて作製したハイブリドーマ中、Ｎ−グリ
コリルGM2ガングリオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリ
オシド及びIV3NeuGc−nLcOse4Cerと強く反応する抗体が
１つのウエルに検出された。
また、３回目の免疫、細胞融合にて作製したハイブリド
ーマ中、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドと強く反応
する抗体が２つのウエルに、Ｎ−グリコリルGM2ガング
リオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド及びIV3Ne
uGc−nLcOse4Cerと強く反応する抗体が１つのウエルに
検出された。
ーマ中、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドと強く反応
する抗体が２つのウエルに、Ｎ−グリコリルGM2ガング
リオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド及びIV3Ne
uGc−nLcOse4Cerと強く反応する抗体が１つのウエルに
検出された。
これらのハイブリドーマはHAT培地からアミノプテリン
を除いたHT培地に移し、更に10％牛胎児血清（FCS）含
有RPMI1640培地に移し培養した。
を除いたHT培地に移し、更に10％牛胎児血清（FCS）含
有RPMI1640培地に移し培養した。
このハイブリドーマを限界希釈法により、クローニング
した。すなわち、96穴プレートに１穴当り0.8個の密度
に細胞を希釈して１穴当り４×105個のマウス胸腺細胞
と共に培養し、２週間後にELISA法にて抗体産生細胞を
選択した。クローニングを更に繰返し、安定なハイブリ
ドーマPyK−２、YHD−02、YHD−04、YHD−05及びYHD−0
7を得た。
した。すなわち、96穴プレートに１穴当り0.8個の密度
に細胞を希釈して１穴当り４×105個のマウス胸腺細胞
と共に培養し、２週間後にELISA法にて抗体産生細胞を
選択した。クローニングを更に繰返し、安定なハイブリ
ドーマPyK−２、YHD−02、YHD−04、YHD−05及びYHD−0
7を得た。
PyK−２は１回目の、YHD−02は２回目の、YHD−04、YHD
−05、YHD−07は３回目の免疫、細胞融合から各々得ら
れた。
−05、YHD−07は３回目の免疫、細胞融合から各々得ら
れた。
モノクローナル抗体PyK−２、YHD−02、YHD−04、YHD−
05及びYHD−07は二重免疫拡散法及びELISA法にて、抗体
のクラスはそれぞれIgM、IgM3、IgM、IgM及びIgMと決定
された。
05及びYHD−07は二重免疫拡散法及びELISA法にて、抗体
のクラスはそれぞれIgM、IgM3、IgM、IgM及びIgMと決定
された。
実施例２ １）ELISA法によるPyK−２の抗原特異性の測定 Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドを抗原とし、ELISA
用プレート上に、段階的に量を変化させた抗原を吸着さ
せ、４倍希釈したハイブリドーマ培養上清を反応させ
た。PBSにて洗浄後、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体を反応させPBSにて洗浄後、オ
ルトフエニレンジアミンを基質として492nmの吸光度を
測定し、抗体の反応性を調べた。この結果を第１図に示
す。なお図中、縦軸は492nmの吸光度を、横軸は抗原量
（ng）を意味する。
用プレート上に、段階的に量を変化させた抗原を吸着さ
せ、４倍希釈したハイブリドーマ培養上清を反応させ
た。PBSにて洗浄後、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン抗体を反応させPBSにて洗浄後、オ
ルトフエニレンジアミンを基質として492nmの吸光度を
測定し、抗体の反応性を調べた。この結果を第１図に示
す。なお図中、縦軸は492nmの吸光度を、横軸は抗原量
（ng）を意味する。
各種糖脂質を抗原として、その500ngをELISA用プレー
ト上に吸着させた。段階希釈したハイブリドーマ培養上
清を反応させ、と同様に本発明抗体PyK−２との反応
性を調べた。結果を第２図に示す。なお、第２図におい
て、縦軸は吸光度を、横軸は抗体の希釈倍（2-n）を示
す。また、各符号は次のものを示す。
ト上に吸着させた。段階希釈したハイブリドーマ培養上
清を反応させ、と同様に本発明抗体PyK−２との反応
性を調べた。結果を第２図に示す。なお、第２図におい
て、縦軸は吸光度を、横軸は抗体の希釈倍（2-n）を示
す。また、各符号は次のものを示す。
白丸:N−グリコリルGM2ガングリオシド（II3NeuGc−GgO
se3Cer） 黒丸:N−グリコリルGM3ガングリオシド（II3NeuGc−Lac
Cer） 白三角:IV3NeuGc−nLcOse4Cer 黒三角:VI3NeuGc−nLcOse6Cer 白四角： 第２図から明らかなように、本発明抗体PyK−２はＮ−
グリコリルGM2ガングリオシドに対し強い反応性を有
し、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドから末端Ｎ−ア
セチルガラクトサミンが除かれた構造を有する糖脂質例
えばＮ−グリコリルGM3ガングリオシドとはごく弱く反
応することが確かめられた。また、PyK−２はＮ−アセ
チルGM2ガングリオシド及びアシアロGM2とは反応しない
ことが確かめられた。
se3Cer） 黒丸:N−グリコリルGM3ガングリオシド（II3NeuGc−Lac
Cer） 白三角:IV3NeuGc−nLcOse4Cer 黒三角:VI3NeuGc−nLcOse6Cer 白四角： 第２図から明らかなように、本発明抗体PyK−２はＮ−
グリコリルGM2ガングリオシドに対し強い反応性を有
し、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドから末端Ｎ−ア
セチルガラクトサミンが除かれた構造を有する糖脂質例
えばＮ−グリコリルGM3ガングリオシドとはごく弱く反
応することが確かめられた。また、PyK−２はＮ−アセ
チルGM2ガングリオシド及びアシアロGM2とは反応しない
ことが確かめられた。
２）TLC（Thin Layer Chromatography）プレート上で
のPyK−２の反応性の測定 TLCプレートの下端から1cmの場所に6mmの幅で種々の糖
脂質をスポツテイングし、適当な溶媒系にて展開した。
同じ操作を行つた２枚のプレートのうち、１枚はオルシ
ノール試薬にて発色させた。もう１枚にはエンザイムイ
ムノステイニングを行つた。すなわち、本発明抗体を反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を反応させた。基質として４−クロロ−
１−ナフトールを用い、青紫色の発色スポツトを検出し
た。
のPyK−２の反応性の測定 TLCプレートの下端から1cmの場所に6mmの幅で種々の糖
脂質をスポツテイングし、適当な溶媒系にて展開した。
同じ操作を行つた２枚のプレートのうち、１枚はオルシ
ノール試薬にて発色させた。もう１枚にはエンザイムイ
ムノステイニングを行つた。すなわち、本発明抗体を反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を反応させた。基質として４−クロロ−
１−ナフトールを用い、青紫色の発色スポツトを検出し
た。
第３図は、抗原としてＮ−グリコリルGM2ガングリオシ
ドとＮ−アセチルGM2ガングリオシドを用いた結果を示
す。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール:2.5Nア
ンモニア水（55:45:10容量比）を用いた。Ａはオルシノ
ール試薬による発色を、またＢはエンザイムイムノステ
イニングを行つたプレートである。１にはＮ−アセチル
GM2ガングリオシド、２にはＮ−グリコリルGM2ガングリ
オシドを展開した。明らかに、本発明抗体はＮ−グリコ
リルGM2ガングリオシドと反応するが、Ｎ−アセチルGM2
ガングリオシドと反応しないことがわかる。
ドとＮ−アセチルGM2ガングリオシドを用いた結果を示
す。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール:2.5Nア
ンモニア水（55:45:10容量比）を用いた。Ａはオルシノ
ール試薬による発色を、またＢはエンザイムイムノステ
イニングを行つたプレートである。１にはＮ−アセチル
GM2ガングリオシド、２にはＮ−グリコリルGM2ガングリ
オシドを展開した。明らかに、本発明抗体はＮ−グリコ
リルGM2ガングリオシドと反応するが、Ｎ−アセチルGM2
ガングリオシドと反応しないことがわかる。
第４図は、抗原としてＮ−グリコリルGM2ガングリオシ
ドとマウス赤血球粗製酸性糖脂質画分を用いた結果を示
す。
ドとマウス赤血球粗製酸性糖脂質画分を用いた結果を示
す。
展開触媒としてクロロホルム：メタノール:0.2％塩化カ
ルシウム（55:45:10容量比）を用いた。Ａ、Ｂのプレー
トは第３図と同様である。１にはＮ−グリコリルGM2ガ
ングリオシド、２にはマウス赤血球粗製酸性糖脂質画分
を展開した。C3H/Heマウス赤血球にはガングリオシドと
してＮ−アセチルGM4ガングリオシドとＮ−グリコリルG
M2ガングリオシドが多く含まれていることが報告されて
おり｛ジヤーナル オブ バイオケミストリー（東
京）、〔J.Biochem.（Tokyo）〕第94巻、第327〜330頁
（1983年）｝、エンザイムイムノステイニングの結果、
２ではＮ−グリコリルGM2と同じRf値に発色スポツトが
検出できた。
ルシウム（55:45:10容量比）を用いた。Ａ、Ｂのプレー
トは第３図と同様である。１にはＮ−グリコリルGM2ガ
ングリオシド、２にはマウス赤血球粗製酸性糖脂質画分
を展開した。C3H/Heマウス赤血球にはガングリオシドと
してＮ−アセチルGM4ガングリオシドとＮ−グリコリルG
M2ガングリオシドが多く含まれていることが報告されて
おり｛ジヤーナル オブ バイオケミストリー（東
京）、〔J.Biochem.（Tokyo）〕第94巻、第327〜330頁
（1983年）｝、エンザイムイムノステイニングの結果、
２ではＮ−グリコリルGM2と同じRf値に発色スポツトが
検出できた。
本発明抗体PyK−２の反応性を牛腎臓及びマウス赤血球
という２つの異なつた組織からの抽出物にて検索した結
果、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドそのものと反応
することが確かめられた。
という２つの異なつた組織からの抽出物にて検索した結
果、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオシドそのものと反応
することが確かめられた。
３）ELISA法によるYHD−02、YHD−04、YHD−05及びYHD
−07の抗原特異性の測定 各種糖脂質0.2nmolを抗原とし、ELISA法を行つた。プレ
ート上に吸着させた抗原とハイブリドーマ培養上清を反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を反応させた。オルトフエニレンジアミ
ンを基質とし、492nmの吸光度を測定し、各種抗原に対
するモノクローナル抗体の反応性を調べた。その結果を
表１に示す。
−07の抗原特異性の測定 各種糖脂質0.2nmolを抗原とし、ELISA法を行つた。プレ
ート上に吸着させた抗原とハイブリドーマ培養上清を反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を反応させた。オルトフエニレンジアミ
ンを基質とし、492nmの吸光度を測定し、各種抗原に対
するモノクローナル抗体の反応性を調べた。その結果を
表１に示す。
YHD−04及びYHD−07はＮ−グリコリルGM2ガングリオシ
ドと、またYHD−02及びYHD−05はＮ−グリコリルGM2ガ
ングリオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、IV3
NeuGc−nLcOse4Cer及びVI3NeuGc−nLcOse6Cerと反応す
ることがわかつた。
ドと、またYHD−02及びYHD−05はＮ−グリコリルGM2ガ
ングリオシド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、IV3
NeuGc−nLcOse4Cer及びVI3NeuGc−nLcOse6Cerと反応す
ることがわかつた。
また、いずれのモノクローナル抗体もＮ−アセチルノイ
ラミン酸含有糖脂質であるＮ−アセチルGM3ガングリオ
シド及びＮ−アセチルGM2ガングリオシドとは反応しな
いこと、及びシアル酸を含まない、アシアロGM2及びCDH
とは反応しないことがわかつた。
ラミン酸含有糖脂質であるＮ−アセチルGM3ガングリオ
シド及びＮ−アセチルGM2ガングリオシドとは反応しな
いこと、及びシアル酸を含まない、アシアロGM2及びCDH
とは反応しないことがわかつた。
４）TLC（Thin Layer Chromatography）プレート上で
のYHD−02、YHD−04、YHD−05及びYHD−07の反応性の測
定 TLCプレートの下端から1cmの場所に6mmの幅で種々の糖
脂質をスポツテイングし、適当な溶媒系にて展開した。
同じ操作を行つた２枚のプレートのうち、１枚はオルシ
ノール試薬にて発色させた。もう１枚にはエンザイムイ
ムノステイニングを行つた。すなわち、本発明抗体を反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を反応させた。基質として４−クロロ−
１−ナフトールを用い、青紫色の発色スポツトを検出し
た。
のYHD−02、YHD−04、YHD−05及びYHD−07の反応性の測
定 TLCプレートの下端から1cmの場所に6mmの幅で種々の糖
脂質をスポツテイングし、適当な溶媒系にて展開した。
同じ操作を行つた２枚のプレートのうち、１枚はオルシ
ノール試薬にて発色させた。もう１枚にはエンザイムイ
ムノステイニングを行つた。すなわち、本発明抗体を反
応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノ
グロブリン抗体を反応させた。基質として４−クロロ−
１−ナフトールを用い、青紫色の発色スポツトを検出し
た。
第５図に抗原として４種のガングリオシドを用いた結果
を示す。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール:2.5
Nアンモニア水（55:45:10容量比）を用いた。Ａはオル
シノール試薬による発色を、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは各々YHD
−02、YHD−04、YHD−05、YHD−07を用いエンザイムイ
ムノステイニングを行つたプレートである。１にはＮ−
アセチルGM2ガングリオシド、２にはＮ−グリコリルGM2
ガングリオシド、３にはＮ−アセチルGM3ガングリオシ
ド、４にはＮ−グリコリルGM3ガングリオシドを展開し
た。
を示す。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール:2.5
Nアンモニア水（55:45:10容量比）を用いた。Ａはオル
シノール試薬による発色を、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは各々YHD
−02、YHD−04、YHD−05、YHD−07を用いエンザイムイ
ムノステイニングを行つたプレートである。１にはＮ−
アセチルGM2ガングリオシド、２にはＮ−グリコリルGM2
ガングリオシド、３にはＮ−アセチルGM3ガングリオシ
ド、４にはＮ−グリコリルGM3ガングリオシドを展開し
た。
本発明のモノクローナル抗体YHD−02及びYHD−05はＮ−
グリコリルGM3ガングリオシド及びＮ−グリコリルGM2ガ
ングリオシドと反応することが、また、YHD−04及びYHD
−07はＮ−グリコリルGM2ガングリオシドと反応するこ
とが確められた。また本発明のいずれのモノクローナル
抗体も、Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖脂質とは反応
しないことが確められた。
グリコリルGM3ガングリオシド及びＮ−グリコリルGM2ガ
ングリオシドと反応することが、また、YHD−04及びYHD
−07はＮ−グリコリルGM2ガングリオシドと反応するこ
とが確められた。また本発明のいずれのモノクローナル
抗体も、Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖脂質とは反応
しないことが確められた。
以上説明したように、本発明により新規なモノクローナ
ル抗体が提供された。これらの抗体は、ガンの発生機構
の解明、診断及び治療に非常に有効なものである。
ル抗体が提供された。これらの抗体は、ガンの発生機構
の解明、診断及び治療に非常に有効なものである。
第１図は、本発明抗体PyK−２のＮ−グリコリルGM2ガン
グリオシドに対する反応性をELISA法において抗原量を
変化させることにより示したグラフ、第２図は本発明抗
体PyK−２の各種糖脂質に対する反応性をELISA法におい
て抗体量を変化させることにより示したグラフ、第３図
及び第４図はＮ−グリコリルGM2ガングリオシド、Ｎ−
アセチルGM2ガングリオシド及びマウス赤血球粗製糖脂
質画分をプレート上に展開し、本発明抗体PyK−２との
反応性をエンザイムイムノステイニングにより検出した
スポツト図、第５図はＮ−グリコリルGM2ガングリオシ
ド、Ｎ−アセチルGM2ガングリオシド、Ｎ−グリコリルG
M3ガングリオシド、Ｎ−アセチルGM3ガングリオシドを
プレート上に展開し、本発明抗体YHD−02、YHD−04、YH
D−05、YHD−07との反応性をエンザイムイムノステイニ
ングにより検出したスポツト図である。
グリオシドに対する反応性をELISA法において抗原量を
変化させることにより示したグラフ、第２図は本発明抗
体PyK−２の各種糖脂質に対する反応性をELISA法におい
て抗体量を変化させることにより示したグラフ、第３図
及び第４図はＮ−グリコリルGM2ガングリオシド、Ｎ−
アセチルGM2ガングリオシド及びマウス赤血球粗製糖脂
質画分をプレート上に展開し、本発明抗体PyK−２との
反応性をエンザイムイムノステイニングにより検出した
スポツト図、第５図はＮ−グリコリルGM2ガングリオシ
ド、Ｎ−アセチルGM2ガングリオシド、Ｎ−グリコリルG
M3ガングリオシド、Ｎ−アセチルGM3ガングリオシドを
プレート上に展開し、本発明抗体YHD−02、YHD−04、YH
D−05、YHD−07との反応性をエンザイムイムノステイニ
ングにより検出したスポツト図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｂ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，276，269−270（1978) Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，19（１）, 87−94（1982) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）, 95（３），785−794（1984) Ｇａｎｎ，75（11），1025−1029 （1984) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，129（２），334− 341（1985) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，45（８）, 3796−3802（1985)
Claims (5)
- 【請求項１】Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖を認
識し、Ｎ−アセチルノイラミン酸含有糖鎖及びシアル酸
を含有しない糖鎖を認識しないものであることを特徴と
するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】該Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖
が、ハンガナチウ−ダイヘル抗原活性を有する糖鎖であ
る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】該Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖
が、糖脂質の構成要素である特許請求の範囲第１項又は
第２項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】該抗体が、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオ
シドを認識するものである特許請求の範囲第１項〜第３
項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】該抗体が、Ｎ−グリコリルGM2ガングリオ
シド、Ｎ−グリコリルGM3ガングリオシド、IV3Neu Gc−
nLcOse4Cer及びVI3Neu Gc−nLcOse6Cerを認識するもの
である特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に
記載のモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-289245 | 1985-12-24 | ||
| JP28924585 | 1985-12-24 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6079228A Division JP2614822B2 (ja) | 1985-12-24 | 1994-03-28 | 抗体産生ハイブリドーマの作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62235569A JPS62235569A (ja) | 1987-10-15 |
| JPH0673471B2 true JPH0673471B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=17740655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61305248A Expired - Lifetime JPH0673471B2 (ja) | 1985-12-24 | 1986-12-23 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673471B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3150991B2 (ja) * | 1991-04-10 | 2001-03-26 | 協和醗酵工業株式会社 | ハイブリドーマの製造法 |
| WO2009006613A1 (en) * | 2007-07-03 | 2009-01-08 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Polysialic acid derivatives, methods of production, and uses in enhancing cancer antigen production and targeting |
-
1986
- 1986-12-23 JP JP61305248A patent/JPH0673471B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２９（２），３３４−３４１（１９８５） |
| ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４５（８），３７９６−３８０２（１９８５） |
| Ｇａｎｎ，７５（１１），１０２５−１０２９（１９８４） |
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），９５（３），７８５−７９４（１９８４） |
| Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９（１），８７−９４（１９８２） |
| Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62235569A (ja) | 1987-10-15 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
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|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
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