JPH02490A

JPH02490A - モノクローナル抗体の製造方法

Info

Publication number: JPH02490A
Application number: JP63094077A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Yamazaki; 山崎　誠彦; Katsutaka Nagai; 永井　克孝
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1987-04-27
Filing date: 1988-04-15
Publication date: 1990-01-05

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、少くともＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオシ
ドと反応するモノクローナル抗体のハイプリドーマによ
る産生、製造方法に関する。〔従来の技術〕糖脂質は細胞膜の構成成分であり、構成糖の種類、数、
結合方法の違いにより多様な分子種が存在し、種特異的
、臓器特異的、細胞特異的な分布を示す。その機能とし
ては、細菌毒素、ホルモン等の受容体として、また血液
型物質等免疫学的決定基としての働きの他増殖又は分化
の制御や細胞間の相互作用に関し、重要な役割を演じて
いることが明らかになりつつある。更に細胞の癌化に伴
い、質的、量的な組成変化が起り、一部は癌抗原となり
うろことが示され、またある種の糖脂質が増殖因子、蛋
白質キナーゼを介する細胞増殖機構の調節者として働く
例など、その組成変化が癌化機構に直接的に関与してい
る可能性も示唆されている。一方、１種類の抗原決定基に対し特異性を有する均一な
抗体を産生ずる細胞株の樹立方法がミルスタインらによ
り報告され（不一チャ　；　Ｎａｔｕｒｅ　。２５６４９５〜４９７．１９７５）、微量物質の定性、
定量が可能となった。癌抗原や分化抗原の検索を行うた
めこの技術を用い、癌細胞や分化しつつある胎児性細胞
に特異的な多くのモノクローナル抗体が作製されたが、
このうちのいくつかは糖脂質あるいは糖蛋白質の糖鎖を
認識する抗体であることが明らか１こされに（・ジャー
ナル　オブ　ナンヨナルキャンサ　インステイチュート
　；　Ｊ、　Ｎａ１１．　Ｃａｎｃｅｒｌｎｓｔ、　７
１２３１−２５１　、１９８３）。例えば、人のメラノーマに対するモノクローナル抗体と
してＧＯ，カングリオンドあるいはＧＤ、ガングリオシ
ドなとの糖脂質と反応する抗体が得られている。また膵
癌に特異的なモノクローナル抗体Ｎ５１９−９は、ンア
ロンルルイスＡ型の糖鎖を有する糖脂質及び糖蛋白質と
反応する。これらの抗体は癌の診断、治療経過の観察に
有用であり、更に治療への利用も試みられている。糖脂
質の癌化に伴う質的、量的変化は、遺伝子の発現異常に
より糖鎖生合成機構における種々の糖転移酵素の活性が
変化することに起因しており、その結果、正常組織に存
在しないような糖鎖構造が作り出される。そのａ！ｆ鎖構造は、癌マーカとしての利用が可能であ
る。このように、癌化機構解明の手掛として、また、癌抗原
及び癌マーカとしての糖脂質の重要性、有用性が注目さ
れており、診断、治療等、臨床分野への応用が期待され
る。糖脂質のうち、酸性糖であるシアル酸をその糖鎖中に含
有するものはガングリオシドと総称される。シアル酸の
種類としては、Ｎ−アセチルノイラミン酸と、Ｎ−グリ
コリルノイラミン酸が主なものである。シアル酸は動物
種の諸臓器、細胞、体液中に広く検出されるがＮ−グリ
コリルノイラミン酸については、正常人及びニワトリに
は今までのところ見出されていない。以後の記述でこれらシアル酸の種類を特に区別する必要
がある時は、糖脂質の名称の前にＮ−グリコリルもしく
はＮ−アセチルをつけて区別するものとする。血清病、［Ｉ：検出され、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ
、モルモットの赤血球を凝集する異好性抗体にはハンガ
ナチウーダイヘル（ＨａｎｇａｎａｔｚｉｕＤｅｉｃｈ
ｅｒ、以下１１−Ｄと略記する）抗体と呼ばれる。この抗体により確認される抗原はＨ−Ｄ抗原と呼ばれる
。Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有ガングリオシドがＨ
−Ｄ抗原活性を有することが報告され〔バイオケミカル
　アンドバイオフィジカル　リサーチ　コミュニケーシ
ョンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）第７９巻、第３８８〜３９
５頁（１９７７））、ＮｅｕＧｃσ２−３　Ｇａｌの糖
鎖構造が主な抗原決定基として同定された。近年、）Ｉ−Ｄ抗原活性を有するガングリオシドである
Ｎ−グリコリルＧＭ、ガングリオシド（Ｕ　３ＮｅｕＧ
ｃ−ＬａｃＣｅｒ）をニワトリに免疫して、血清からＨ
−Ｄ抗原活性を有する種々のガングリオシドと反応する
抗体を作製し、この抗体を用いて、Ｎ−グリコリルノイ
ラミン酸が人カン組織に特徴的に存在することが報告さ
れた［ビケン・ジャーナル（Ｂｉｋｅｎ　Ｊ、）、第２
５巻、第４７〜５０頁（１９８２年）１゜また、人大腸
ガン組織より抽出された糖脂質中に、数種のＨ−Ｄ抗原
活性な吋−グリコリルノイラミン酸含有ガングリオシド
が検出され、奇形腫の組織中からは、Ｈ−Ｄ抗原活性な
糖鎖を有する糖蛋白質が検出された［ガフ　（Ｇａｎｎ
）、第７５巻、第１０２５−１０２９頁（１９８４年）
］。ニワトリにて作製した抗体を用いて人大腸ガン組織より
検出されるＨ−Ｄ抗原活性を有する糖脂質を分析したと
ころ、Ｎ−グリコリルＧＭ、ガグリオシド、Ｎ−グリコ
リルＧＭ３ガングリオシド、０−アシル−Ｎ−グリコリ
ルＧＭ３ガングリオシド、ＩＶ　３ＮｅｕＧｃ−ｎＬｃ
ｏｓｅ＋Ｃｅｒであり、これらは正常組織には検出され
なかった［キヤツプ・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
、）、第４５巻、第３７９６〜３８０２頁（１９８５年
）１゜また、ニワトリのリンパ腫の１種であるマレック
病の細胞株中にも、トＤ抗原活性を有するガングリオシ
ドが検出された〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
（東京）；Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（Ｔｏｋｙｏ）、第９
５巻、第７８５〜７９４頁（１９８４年）〕。〕Ｎ−グリコリルノイラミン酸びＮ−グリコリルＧＭ、
ガングリオシドの糖鎖を含め、Ｎ−グリコリルノイラミ
ン酸含を糖鎖はガン関連抗原と考えられ、これらを高感
度に精度よく検出することはガン診断上極めて重要であ
る。Ｎ−グリコリルノイラミン酸又はＮ−グリコリルＧＭ２
ガングリオンドの糖鎖を含め、Ｎ−グリコリルノイラミ
ン酸含有糖鎖を効率よく検出するには、検出感度、精度
の面から、免疫学的測定法が優れていると考えられる。Ｈ−Ｄ抗原活性を有するＮ−グリコリルノイラミン酸含
有糖鎖と反応する抗体は、従来、ニワトリにＨ−Ｄ抗原
活性を有する精製糖脂質抗原を免疫し、その血清より分
離することにより得られた〔モレキュラ・イムノロシイ
（Ｍｏｌｅｃ、Ｊｍｍｕｎｏｌ、）第１９巻、第８７〜
９４頁（１９８２年）〕。〕Ｎ−グリコリルＧＭ！ガングリオシに特異性の高いポ
リクローナル抗体は、ニワトリにＮ−グリコリルＧＭ、
ガングリオシドを免疫する事により得る事ができ〔バイ
オケミカル　アンド　バイオフィジカル　リサーチ　コ
ミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）、第１
２９巻、第３３４−３４１頁（１９８５年）〕、〕Ｎ−
グリコリルＧＭ、ガングリオシドびＮ−グリコリルＧＭ
３ガングリオシドに対し反応性を有するポリクローナル
抗体はニワトリにＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド
を免疫する事により得る事ができる〔キヤツジ・リサー
チ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）第４５巻、第３７９６〜３
８０２頁Ｃｌ９８５年）〕。しかしながら、これら方法はいくつかの欠点を有してい
る。即ち、（１）抗血清を得るためには、そのたびごと
に大量の精製抗原が必要である。（２）主として免疫動
物の固体差に起因する、親和性や力価のバラツキがある
。（３）目的とする抗体以外の抗体も混在するため、目
的の抗体を精製するためには繁雑な操作が必要である。（４）−度に作製できる量に限度がある等の欠点がある
。それ故、正確にかつ最大の効果を持って免疫学的測定
を行うためには、他の抗体の混入しない品質の安定した
均一な抗体が大量に供給できることが望まれていた。こ
のような抗体の作製は、既に、モノクローナル抗体産生
技術として報告されている。一方、メラノーマ患者のりんば球をＥＢウィルスにて癌
化させる事により得られたメラノーマを特異的に認識す
るヒトモノクローナル抗体が、ＧＭ２ガングリオシドと
反応する事が報告されている　（プロシーデインダス　
オブザナショナルア力デミイオブサイエンスズオブザユ
ーエスエイ　；Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　
８０　、５３９２−５３９６゜１９８５）。また、正常の赤血球にはＧＭ２ガングリオシドがほとん
ど存在しないにもかかわらず、ヒト赤白血病細胞には、
ＧＭ！ガングリオシドが蓄積する事が報告されている　
（ブラッド　；　Ｂｌｏｏｄ、馴、　１２３０〜１２４
１　、１９８３）。また、マウスメラノーマを免疫する事により得られたＮ
−アセチ１１ＧＭ２ガングリオシド及びＮ−グリコリル
ＧＭ２ガングリオシドを認識するモノクローナル抗体を
用いてＧＭ、ガングリオシドが主として神経外胚葉山来
の癌細胞に発現する事が示されている（キヤツジ・リサ
ーチ；Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６．４１１６〜４
１２０．１９８６）。このように、Ｎ−アセチルＧＭ！ガングリオンド及びＮ
−グリコリルＧＭ、ガングリオシドは癌関連抗原と考え
られ、これらを高感度に精度よく検出することは癌の診
断上重要である。上述したように、Ｎ−グリコルＧＭ、ガングリオシド及
びその関連糖脂質及びそれらの糖鎖構造はガン関連抗原
として極めて重要であり、それ故Ｎ−グリコリルＧＭ２
ガングリオシドとの反応性を有するモノクローナル抗体
、たとえばＮ−グリコリルＧＭ！ガングリオシド及びＮ
−アセチルＧＩＪ、ガングリオシドとの特異的反応性を
有するモノクローナル抗体や、Ｎ−グリコリルＧＭ２ガ
ングリオシド及びその他のＮ−グリコリルノイラミン酸
を含有する糖脂質との特異的な反応性を有するモノクロ
ーナル抗体は、各種の疾患の診断、特に組織、細胞診断
又は血液、尿診断又は画像診断等による人癌診断に極め
て有用である。また、抗体に薬物を結合させるミサイル
療法や細胞傷害性を利用した治療への応用が可能であり
糖鎖に対する抗体の検出による診断にも応用可能である
。また、Ｎ−グリコリルＧＭ、ガングリオシドとの反応
性を有する種々のモノクローナル抗体は糖鎖と癌化機構
との関連や、糖鎖や糖脂質の構造や生体内での役割機能
等についての基礎的研究において、有用な道具として用
いることが可能°である。このように、少くともＮ−グリコリルＧＭ２ガングリオ
シドを認識するモア／クローナル抗体を製造する事は極
めて重要な事と考えられる。しかしながら、Ｎ−グリコリルノイラミン酸は人及びニ
ワトリを除きマウスを含む多くの動物体内ｌこ存在する
事及び本発明において対象とするＮ−グリコリルＧＭ、
ガングリオシドを含むＮ−グリコリルノイラミン酸含有
糖脂質はマウス組織内に広く存在することが知られてお
り、マウスにとっては、これらの糖脂質は自己抗原であ
り、免疫原性は極めて弱いと考えられ、従ってＢａ１ｂ
／ｃマウス等の正常マウスを免疫動物として用いる従来
の方法においてはＮ−グリフリルＧＭ、ガングリオシド
を含めＮ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂質に対する
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることは極
めて困難であった。一方、自己免ぽ疾患動物は、抗核抗体や抗赤血球抗体等
自己抗原に対する抗体を産生ずる事が知られている〔イ
ムノロジカル　レビュー（Ｉａ＋５ｕｎｏｌ。Ｒｅｖ、）、第５５巻、第１２１−１５４頁（１９８１
年）〕。本発明者は自己免疫疾患動物特に自己免疫疾患
マウスに免疫感作する事により、自己抗原と考えられる
Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖脂質に対し免疫反応
性を高める事ができハイブリドーマの作成が可能となる
と考え、これを試みその目的を達した。この過程で特に、Ｎ−グリコリルＧＭ、ガングリオシド
を認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マを容易に作成する事ができる事を見い出し、本発明を
完成するに至った。〔発明の目的〕本発明の目的は少くともＮ−グリコリルＧＭ２ガングリ
オシドを特異的ｔこ認識するモノクローナル抗体の製造
方法を提供することにある。〔発明の構成〕本発明は、少なくともＮ−グリコリルＣＭ、ガングリオ
シドを認識するモノクローナル抗体の製造方法に関する
ものであり骨髄腫細胞と自己免疫動物の形質細胞を融合
させたハイブリドーマにより産生する事を特徴とする。以後に記述される糖脂質の構造を下記に示す。Ｎ−アセチルＧＭ、ガングリオシド（Ｕ　’ＮｅｕＡｃ
−ＧｇＯｓｅ４　Ｃｅｒ）Ｇａｌβｌ−”３ＧａｌＮＡ
ｃβＩ−”４Ｇａｌβｌ”４Ｇ１ｃβｌ−１ｃｅｒ↑ ２　ａ　ＮｅｕＡｃＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオシド（ＩＩ　３Ｎｅｕ
　Ｇｃ−ＧｇＯｓｅ、　Ｃｅｒ）Ｇａｌ　／ｊ　１−”
３ＧａｌＮＡｃβｌ−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβｌ→ｌ
　Ｃｅｒ２ａ　ＮｅｕＧｃＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオシド（Ｍ　３ＮｅｕＧ
ｃ−ＧｇＯｓｅ、　Ｃｅｒ）Ｇａ　ｌＮＡｃβ１−４Ｇ
ａｌ　ｆｉ　ｌ→４Ｇ１ｃβ１−ＩＣｅｒ↑ ２　ａ　ＮｅｕＧｃＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオシド（Ｉｆ　’　Ｎｅ
ｕＧｃ−Ｌａｃ　Ｃｅｒ）Ｇａｌβｌ−４Ｇｌｃβｌ−
＊ＩＣｅｒ↑ ２　ａ　ＮｅｕＧｃＴＶ　３ＮｅｕＧｃ−ｎＬｅｏｓｅ４ＣｅｒＧａ　１７
？　１−４Ｇ　ＩｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβｌ−４ＧＩ
ｃβｌ−１ｃｅｒＮ−アセチルＧＭ２ガングリオシド（
ＩＩ　３ＮｅｕＡｃ−ＧｇＯｓｅ、　Ｃｅｒ）Ｇａ　ｌ
ＮＡｃβＩ→４ＧａｌβＩ→４ＧＩｃβＩ−ＩＣｅｒ２
ａ　ＮｅｕＡｃＮ−アセチルＧＭ、ガングリオシド（ＩＩ　３ＮｅｕＡ
ｃ−ＬａｃＣｅｒ　）Ｇａｌβ１−”４Ｇｌｃβ１＝１
ｃｅｒ↑ ２ａ　ＮｅｕＡｃＧＤ、ガングリオシド（ＩＩ　３（ＮｅｕＡｃ）、−Ｇ
ｇＯｓｅ、　Ｃａｒ）ＧａｌＮＡｃβ１−−４０ａｌβ
ｌ−４Ｇｌｃβｌ＋１Ｃｅｒ↑ ２　ａ　ＮｅｕＡｃ ↑ ２　ａ　ＮｅｕＡｃアシアロＧＭ、（ＧｇＯｓｅ、　Ｃｅｒ）ＧａｌＮＡｃ
β１→４Ｇａｌβｌ→４Ｇｌｃβｌ−＝ＩＣｅｒＣＤ　
Ｉ　（Ｌａｃ　Ｃｅｒ）Ｇａｌβｌ→４Ｇ１ｃβｌ−”１ｃｅｒ式中、Ｇａｌは
ガラクトース、Ｇｌｃはグリコース、Ｇａ１ＮＡｃはＮ
−アセチルガラクトサミン、ＧＩｃＮＡｃはＮアセチル
グルコサミン、ＮｅｕＧｃはＮ−グリコリルノイラミン
酸、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｃｅｒは
セラミドを意味する。該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作成
方法を以下に説明する。形質細胞を得るための哺乳動物
として自己免疫疾患動物を用いるが、その際細胞融合に
使用する骨髄種細胞との適合性を考慮して選択するのが
好ましく、マウス、ラットが好ましい。使用可能な自己免疫疾患マウスとしてはＮＺＢ　。ＮＺＷ、　Ｂ／ＷＦＩ、ＭＲＬ／１．　ＢＸＳＢ雄、Ｓ
Ｌ／Ｎｌの各系統のマウス等が挙げられ、自己免疫疾患
ラットとしては高血圧自然発症ラットが挙げられる。また、ダラム陰性菌脂質多糖体（ＬＰＳ）、デキストラ
ン硫酸等のポリクローナルＢ　細胞活性化剤（ＰＢＡ）
を投与することにより自己抗体産生能を高めさせたＢａ
１ｂ／ｃ等の正常マウスを自己免疫疾患状態にし、用い
ても良い。免疫原としては、対象とするＮ−グリコリルＧ「ガング
リオシドを有する細胞自体、該細胞より分離した細胞膜
成分及び該細胞より分離したＮ−グリコリルＧＭ、ガン
グリオシドのいずれも用いることが可能である。また、
糖脂質を燐脂質とコレステロールと共にリポソームとし
用いることも可能である。免疫は一般的方法により行わ
れ、上記免疫原を燐酸緩衝溶液（以下ＰＢＳと称する）
等にて希釈し、腹腔内若しくは静脈内に投与すればよい
。その際、免疫原を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や菌体等
の担体に担持させてもよく、また、７０インドアジユバ
ントや菌体アジュバント等のアジュバントを共に注射し
てもよい。また自己免疫疾患マウスを用いる本発明の方法では必ず
しも免疫原を用いる必要はない。マウス赤血球にはＮ−グリコリルＧＭ！ガングリオシド
が存在する事〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ（
東京）（Ｊ　、　　Ｂ　１ｏｃｂｅ＋ｓ、　（Ｔ　ｏｋ
ｙｏ））、第９１巻、第１０３９〜１０４６頁（１９８
２年）〕、及び自己免疫疾患マウスは、抗赤血球抗体を
含む自己抗体を産生ずる事から自己免疫疾患マウスはＮ
−グリコリルＧＭ！ガングリオシドに対する抗体を抗赤
血球自己抗体もしくは他の自己抗体として産生じている
、もしくは産生じやすい状態にあると考えられる。それ故、自己免疫疾患マウスを用いる場合は免疫原を用
いる事なく、Ｎ−グリコリルＧＭｚガングリオシドと反
応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成が
可能である。免疫原を用いない場合においては、自己免
疫疾患マウスに対し何ら注射しなくても良いが、７０イ
ンドの完全アジュバントや７０インドの不完全アジュバ
ントや百日ぜき死菌体やサルモネラ死菌体等、各種アジ
ュバントを注射し、自己免疫疾患マウスの免疫応答能を
高める事が好ましい。動物から採取した形質細胞は骨髄腫細胞と融合させる。形質細胞は一般に肺細胞として得られる。骨髄腫細胞としては、マウス骨髄種細胞が好ましく、既
に公知の種々の細胞、例えばＮＳ−１％ＳＰ−２、Ｘ　
６３．６．５．３、Ｐ３−Ｕｌ等が使用できる。融合方
法は公知の手法に準じて行われる。融合促進剤としては
、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイ
ウィルス（ＨＶＪ）等が使用される。肺細胞と骨髄腫細
胞との使用比は一般的方法と同様であり、１対１−１０
対ｌが好ましい。融合終了後、通常の選択用培地にて培養することにより
ハイブリドーマを選択する。前記した骨髄腫細胞はＨＡ
Ｔ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む培地）中では生育できないため、ＨＡＴ培地中で
生育する細胞を選択すればよい。ハイブリドーマのコロニが充分大きくなったところで目
的とする抗体の産生株の検索及びクローニングが行われ
る。該抗体産生株の検索は、一般に抗体の検出に用いられて
いる方法、例えばＥＬＩＳＡ法（メソッド　イン　エン
ザイモロジイ；　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　７０
．４１９〜４３９．１９８０）、凝集反応法、ＲｒＡ法
、二重免疫拡散法などにより行われる。具体的には、精製した糖脂質抗原を付着させたプレート
をＢＳ＾にてブロッキングした後、被検ハイブリドーマ
の培養上清と反応させ、更に、酵素標識したマウス抗体
に対する抗体を反応させ、該抗原に結合した抗体の存在
を、酵素活性を測定することにより確認し、所望の抗体
産生株を選択する。また、クローニングは限界希釈法により行われる。すな
わち、９６穴マイクロタイタ　プレート上に、ハイブリ
ドーマが各ウェル当り１個以下になるよう分配し、単一
コロニを生育させる。この際、フィーダ細胞としてマウ
ス胸腺細胞を添加することが好ましい。上述のクローニングを繰返し、モノクローン化されたハ
イブリドーマを得る。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗体を得るに
は、ハイブリドーマを培地中にて培養し、培養上清から
分離する方法、あるいはハイブリドーマをマウス腹腔内
に投与し、その腹水より回収する方法がある。更に、−
収約な方法、すなわち硫安沈殿、ゲル濾過、イオン交換
カラムクロマトグラフィ等を用いて精製することも可能
である。〔実施例〕以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。実施例１１）抗原及び各種糖脂質の単離、精製 ■　ウサギ胸腺細胞膜成分生後６週齢のウサギ２匹より得た胸腺組織をＰＢＳ中ホ
モジナイズし、８００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上溝を１０，０００ｇにて１時間遠心分離し、得られた
ベレットをＰＢＳ　ｌＯ＋ａ（２に分散し、免疫原とし
て用いた。 ■　糖脂質牛腎臓を冷アセトン中ホモジナイズし、更に、多量の冷
アセトンを加え、得られた沈殿物より、容量比クロロホ
ルム：メタノール：水（１０：２０：　１　）（１０：
１０：０　）　Ｃ２０：１０：　１　）の各混合溶液に
て順次抽出操作を行った。得られた粗製糖脂質をＤＥＡ
Ｅ−セファデックスＡ−２５カラムクロマトグラフィに
かけ、酸性画分と中性画分に分け、酸性画分をイアトロ
ビーズカラムクロマトグラフィにかけ、Ｎ−グリコリル
ＧＭ、ガングリオシドを得た。同様にして馬赤血球より
Ｎ−グリコリルＧＭ、ガングリオシドを、牛赤血球より
ＩＶ　３ＮｅｕＧｃ−ｎＬｃｏｓｅ、　Ｃｅｒを、大脳
よりＮ−アセチルＧＭ！ガングリオシド及びＮ−アセチ
ルＧＭ３ガングリオシドを、人赤血球よりＣＤＩを得た
。Ｎ−アセチルＧＭ２ガングリオシドをＩＮ蟻酸中にて
１００℃、１時間反応させ、ＤＥＡＥ−セファデックス
Ａ−２５カラムクロマトグラフィ、次いでイアトロビー
ズカラムクロマトグラフィを行い、アシアロＧＭ！を得
た。免疫感作用の糖脂質含有リポソームは、糖脂質ｌｌ１１
ｇ、ホスファチジルコリン４１１ｇ、コレステロール１
０ｍｇの容量比クロロホルム：メタノール（１：１）混
合溶液をフラスコ中、減圧下、完全に溶媒を除去した後
、ＰＢＳ５１１ｆｆを加え、超音波をかけることにより
調製した。２）免疫法及び細胞融合 ■　１回目ウサギ胸腺細胞膜成分ＰＢＳ溶液と、同量のフロイント
完全アジュバントを乳化混合し、４００μａをＮＺＢマ
ウス　（雌、６週齢）の腹腔内に注射した。２週間後、更に７０イント不完全アジユバントを用い、
同様に注射した。１３週間後、ＴＶ　３ＮｅｕＧｃ−ｎ
ＬｃＯｓｅ、Ｃｅｒ含有リポす−ムＰＢＳ溶液１００．
ｕＱを腹腔的注射し、更に２週間後同様にリポソームを
注射しｌ二。細胞融合最終免疫の３日後にマウスより肺臓を取出し、単細胞に
ほぐした後、牌細胞を、ＲＰＭ１１６４０培地にて洗浄
した。一方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞Ｘ６３
．６．５．３を集め、ＲＰＭ［１６４０培地にて洗浄し
た。牌細胞７　Ｘ　１０’個の浮遊液とマウスミエロー
マ１．４Ｘ　１０’個の浮遊液を混合し遠心分離にて培
地を除去した。３７°Ｃ加温した水浴中にて、混合した
細胞に５０％ポリエチレングリコールＲＰ旧１６４０培
地１ｍ１２を１分間かけて徐々に加え、１分間ゆるやか
に撹拌し融合を行った。ＲＰ旧１６４０培地２ｅａ（ｌ
を２分間かけ、更に７ｍＱを２分間かけゆるやかに撹拌
しつつ添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞にｌ
Ｏ％牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地２０ＩＩＩＱ
を加え、９６穴プレ一ト２枚に１穴当り０．１ｍ１２ず
つ分配した。翌日、ＨＡＴ培地（４Ｘ　１０−’Ｍアミ
ノプリテン、１．６ｘ　１０−’Ｍチミジン、ｌ　Ｘ　
１０−４Ｍヒポキサンチン、ｌＯ％牛脂児血清を含むＲ
ＰＭ１１６４０培地）０−１１１１１２各ウエルに加え
た。各ウェルの培地は、更に、３日又は４日毎にＨＡＴ
培地に半量ずつ交換した。３週間後、８０％のウェルに
ハイブリドーマの生育が見られた。 ■２回目ウサギ胸腺細胞膜成分ＰＢＳ溶液と、同量の７０インド
完全アジユバントを乳化混合し、３００μＱをＮＺＢマ
ウス（雌、６週齢）の腹腔内に注射した。以後、酸で処
理したサルモ不ラミネタバクテリア８０μｇに吸着させ
たＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオシド２０μｇのＰＢ
Ｓ溶液２００μＱを２週間ごとに５回静脈注射した。最終免疫の３日後にマウスより肺臓を取出し、単細胞に
ほぐした後、牌細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄
した。一方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞Ｘ６３
．６．５．３を集め、ＲＰＭ１１６４０培地にて洗浄し
た。牌細胞４．７Ｘ　１０”個の浮遊液とマウスミエロ
ーマ９．２Ｘ　１０’個の浮遊液を混合し遠心分離にて
培地を除去した。３７℃に加温しｔ；水浴中にて、混合
して細胞に５０％ポリエチレングリコール−ＲＰＭ１１
６４０培地２＋ｗ（２を１分間かけて徐々に加え、１分
間ゆるやかに撹拌させ融合を行った。ＲＰＭ目６４０培
地４ｍＱを２分間かけ、更に１４ｍ＜１を２分間かけゆ
るやかに撹拌しつつ添加した。遠心分離にて培地を除去
し、細胞にｌＯ％牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地
１２０ｍ＜＋を加え、９６穴プレ一ト１２枚に１穴当り
０．１ｍ１２ずつ分配した。翌日、ＨＡＴ培地（４Ｘ　
１０−’Ｍアミノプリテン、１．６Ｘ　１０−’Ｍチミ
ジン、ｌ　Ｘ　１０−’Ｍ　ヒポキサンチン、１０％牛
脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地）０．１ｔＱを各
ウェルに加えた。各ウェルの培地は、更に、３日又は４
日ごとに）ｌ　Ａ　Ｔ培地に半量ずつ交換した。３週間
後、９０％のウェルハイブリドーマの生育が見られた。 ■３回目免疫法は、静脈注射を８回行った以外は２回目と同様に
行った。細胞融合は、牌細胞３．６Ｘ　１０’個、マウスミニロ
ー？７．１ＸｌＯ’個を用い、１００ｍＱのｌθ％牛脂
児血清含有ＲＰＭ　ｒ培地を加え、９６穴プレー１−１
０枚に分配した以外は２回目と同様に行った。３週間後、８０％のウェルにハイブリドーマの生育が見
られた。３）ハイブリドーマの選択ハイブリドーマ培養上溝中の抗体の検索はＥＬＩＳＡ法
にて行った。抗原として、Ｎ−グリコリル０Ｍ２ガングリオシド、Ｎ
−グリコリルＧＭ３ガングリオシド及びＩＶ３ＮｅｕＧ
ｃ−ｎＬｃＯｓｅ、Ｃｅｒを用いた。各抗原５００ｎｇ
をＥＬＩＳＡ用マイクロタイタブレートに吸着させ、１
％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、培養
上清を反応させた。更に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、基質としてオル
トフェニレンジアミンを用い、４９２ｎｍの吸光度を測
定することにより、目的の抗体を検出した。その結果、
１回目の免疫、細胞融合にて作製したハイブリドーマ中
、１つのウェルに活性が検出され、また２回目の免疫、
細胞融合にて作製したハイブリドーマ中、２つのウェル
に活性が検出された。また、３回目の免疫、細胞融合にて作製したハイブリド
ーマ中、４つのウェルに活性が検出された。これらのハイブリドーマはＨＡＴ培地からアミノプリテ
ンを除いたＨＴ培地に移し、更に１０％牛脂児血清（Ｆ
ＣＳ）含有ＲＰＭ目６４０培地に移し培養した。実施例２ＥＬＩＳＡ法による各モノクローナル抗体の抗原特異性
の測定：各種糖脂質Ｑ、２ｎ＋ｓｏｌを抗原とし、ＥＬＩＳＡ法
を行った。プレート上に吸着させた抗原とハイブリドー
マ培養上清を反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させた。オルトフェニレンジアミンを基質とし、４９２ｎ１１の
吸光度を測定し、各種抗原に対するモノクローナル抗体
の反応性を調べた。その結果を次表に示す。＋＋侶得られたモノクローナル抗体のうち、ＰＹＫ−２、ＹＨ
Ｄ−０４及びＹＨＤ−０７はＮ−グリコリルＧＭ！ガン
グリオシドに対し強い反応性を示し、ＹＨＤ−０２、Ｙ
ＨＤ−０３及びＹＨＤ−０５はＮ−グリコリルＧＭ、ガ
ングリオシドのほかにＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオ
シドや■１ＮｅｕＧＬ−ｎＬｃＯｓｅ、Ｃｅｒとの反応
性も示した。またＹＨＤ−〇６はＮ−グリコリルＧＭ、
ガングリオシドのはかＮ−アセチルＣＭ２ガングリオシ
ドとの反応を示した。すなわち、ＰｙＫ−２、ＹＨＤ−０４、ＹＨＤ−０６及
びＹＨＤ−０７は免疫源として用いたＩＶ　’ＮｅｕＧ
ｃ−ｎＬｃｏｓｅ、ｃｅｒ又はＮグリコリルＧＭ３ガン
グリオシドに対する反応性は示さず、Ｎ−グリコリルＧ
Ｍ！がガングリオシドに対し強い反応性を示すものであ
った。実施例３薄層クロマトグラフィ（以下ｒＴＬｃＪという）プレー
ト上でのウサギ胸腺組織中の糖脂質の検討：実施例１に
て免疫源として用いたウサギ胸腺組織中にはＮ−グリコ
リルＧＭ、ガングリオシドやｒＶ３ＮｅｕＧｃ−ｎＬｃ
ｏｓｅ４ｃｅｒ等、多くのＮ−グリコリルノイラミン酸
含有糖脂質が存在する事が報告されている〔バイオキミ
力　エ　バイオフイジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、第６６５巻第２０５−２
１３頁（１９８１年）〕がトグリコリルＧＭ、ガングリ
オシドの存在については不明である。モノクローナル抗
体を用い、その確認を試みた。ウサギ胸腺組織に対し、容量比クロロホルム：メタノー
ル二本（１０：２０：　ｌ　）、（１０：１０：Ｏ）、
（２０：１０：　ｌ　）の各混合溶液にて順次抽出操作
を行い、得られた粗製糖脂質をＤＥＡＥ−セファデック
スス−２５カラムクロマトグラフイにかけ、ガングリオ
シドを含む酸性画分を得た。得られた酸性画分に対し、
モノクローナル抗体ＰｙＫ−２を用いＴＬＣ上酵素免疫
染色を行った。ＴＬＣプレートの下端から１ＣＩ１１の場所に６１１１
１１１の幅でサンプルをスポラティグし、溶媒系クロロ
ホルム：メタノール＋２．５Ｎアンモニア水（５５：４
５：１０容量比）にて展開した。同じ操作を行った２枚
のプレートのうち、１枚はオルシノール試薬にて発色さ
せた。もう１枚にはＰｙＫ−２を反応させ、更にパーオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応
させた。μ質として４−クロル−１−ナフトールを用い
、青紫色の発色スポットを検出した。図にその結果を示す。Ａはオルシノール試薬による発色を、Ｂは酵素免疫染色
を行ったプレートである。１及び３にはＮ−グリコリル
ＧＭ２ガングリオシドをおのおの２ｎｍｏ１２．３０ｐ
ｍｏｌスポソｈ　Ｉ、、２．４にはシアル離合ｆｆｉ　
２　ｎ１ｌｌｏＩのウサギ胸腺組織クロロホルム：メタ
ノール抽出酸性画分をスポットし展開した。本発明の実施例１にて免疫源として用いたウサギ胸腺組
織にはＮ−グリコリルＧＭ２ガングリオシドが存在しな
い事か本実施例により確かめられ、実施例１により作成
されたＮ−グリコリルＧＭ、ガングリオシドに対し反応
性を有する抗体を産生するハイブリドーマは、Ｎ−グリ
コリルＧＭ２ガングリオシドがＮＺＢマウスに注射され
る事なく作成された事が確認された。実施例４１　）　　ＥＬＩＳＡ法によるＹＨＤ−０６の抗原特異
性の測定各種糖脂質を抗原とし、ＥＬＩＳＡ用プレート
上に、段階的に量を変化させた抗原を吸着させ、／Ｓイ
ブリドーマ培養上清を反応させた。ＰＢＳにて洗浄後、
パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体
を反応させＰＢＳにて洗浄後、オルトフェニレンジアミ
ンを基質として４９２■ｍの吸光度を測定し、抗体の反
応性を調べた。その結果を第２図に示す。なお図中、縦
軸は４９２■の吸光度を、横軸は抗原量を意味する。ま
た、各符号は次のものを示す。白　丸二Ｎ−グリコリルＧＭ２ガングリオシド（Ｕ　’
　　ＮｅｕＧｃ−ＧｇＯｓｅ、Ｃｅｒ）白三角二Ｎ−ア
セチルＧＭ２ガングリオンド（ｎ　１ＮｅｕＡｃ−Ｇｇ
Ｏｓｅ３　Ｃｅｒ）白四角：Ｎ−アセチルＧＭ、ガング
リオシド（Ｕ　３ＮｅｕＡｃ−ＧｇＯｓｅ、　Ｃｅｒ）
：Ｎ−グリフ９１１０Ｍ。ガングリオシド（ＩＩ　１Ｎ
ｅｕＧｃ−ＧｇＯｓｅ４　Ｃｅｒ）：Ｎ−アセチルＧＭ
、ガングリオシド（Ｉ［３ＮｅｕＡｃ−Ｌａｃ　Ｃｅｒ）二Ｎ−グリコリ
ルＧＭ、ガングリオシド（Ｉ［”　　ＮｅｕＧｃ−Ｌａ
ｃ　　Ｃｅｒ）：　ＧＤ、ガングリオシド（Ｕ　３（ＮｅｕＡｃ）、−ＧｇＯｓｅｓ　Ｃｅｒ）ニ
アシアｏＧＭ２（ＧｇＯｓｅ３　Ｃｅｒ）：　ＣＤＨ（
Ｌａｃ　Ｃａｒ）第２図から明らかなように、抗体ＹＨＤ−０６はＮ−グ
リコリルＧＭ！ガングリオシド及びＮ−アセチルＧＩＪ
２ガングリオシドに対し強い対応性を有し、他のガング
リオシド及びアシアロ糖脂質とは反応しないことが確か
められた。２）　薄層クロマトグラフィプレート上でのＹＨＤ−０
６の反応性の測定ＴＬＣプレートの下端からｌｃ＋ｓの場所に６■の輻で
種々の糖脂質をスポツティングし、適当な溶媒系にて展
開した。同じ操作を行った２枚のプレートのうち、１枚
はオルシノール試薬にて発色させＩ；。もう１枚には酵
素免疫染色を行った。すなわち、本発明抗体を反応させ
、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリ
ン抗体を反応させた。基質として４−クロル−１−ナフ
トールを用い、青紫色の発色スポットを検出した。第３図は、抗原として各種糖脂質を用いた結果を示す。展開溶媒としてクロロホルム：メタノール：　２．５Ｎ
アンモニア水（５５：４５：１０容量比）を用いた。Ａ
はオル・ノール試薬による発色を、またＢは酵素免疫染
色を行ったプレートである。■にはＮ−アセチルＣＭ、
ガングリオシド、Ｎ−アセチル０Ｍ２ガングリオ／ド及
びＮ−アセチルＧＭ、ガングリオシド、２にはＮ−グリ
コリルＧＭ、ガングリオンド、Ｎ−グリコリルＧＭ２ガ
ングリオンド及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド
、３にはアシアロＧＭ、及びＣＤＨを展開した。明らか
に、本発明抗体はＮ−グリコリルＧＭ２ガングリオシド
及びＮ−アセチルＧＭ！ガングリオシドとのみ反応する
ことがわかる。

【発明の効果】

本発明によれは、Ｎ−グリコリルＧＭ、ガングリオンド
との反応性を有する種々のモノクローナル抗体を提供す
ることができる。該抗体は、癌の発生機構の解明、診断
及び治療に非常に有効なものであり、また、糖脂質、糖
蛋白の基礎的研究に有用なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体ＰｙＫ　−２とＮ−グリ
コリルＧＭ、ガングリオシド及びウサギ胸腺組織クロロ
ホルムメタノール抽出酸性画分との反応性を示す図であ
る。第２図は、本発明抗体ＹＨＤ−０６の各種糖脂質に対す
る反応性をＥＬＩＳＡ法において抗原量を変化させるこ
とにより示したグラフ、第３図は各種糖脂質をプレート
上に展開し、本発明抗体ＹＨＤ−０６との反応性を酵素
免疫染色により示したスポット図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少くともＮ−グリコリルＧＭ＿２ガングリオシド
と反応するモノクローナル抗体を、骨髄腫細胞と自己免
疫疾患動物の形質細胞を融合させて作成したハイブリド
ーマにより産生する事を特徴とする前記モノクローナル
抗体の製造方法。
（２）骨髄腫細胞がマウス骨髄腫細胞である請求項１記
載のモノクローナル抗体の製造方法。
（３）自己免疫疾患動物が自己免疫疾患マウスである請
求項１又は２記載のモノクローナル抗体の製造方法。
（４）自己免疫疾患マウスがＮ−グリコリルＧＭ＿２ガ
ングリオシド、その糖鎖、又はそれらを含む物質で免疫
感作される事のない自己免疫疾患マウスである請求項３
記載のモノクローナル抗体の製造方法。