JP2743015B2 - Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法 - Google Patents
Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、Ｏ−アセチル化されたガングリオシドGM3
に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ及びその作製方法に関する。
に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ及びその作製方法に関する。
［従来の技術］ 細胞膜の構成成分である糖脂質は、構成糖の種類、
数、結合方法等の違いにより多様な分子種が存在し、種
特異的、臓器特異的、細胞特異的な分布を示している。
その生理的機能としては、細胞毒素、ホルモン等の受容
体として、また血液型物質等免疫学的決定基としての相
互作用に関し重要な役割を有していることが明らかにな
ってきている。また、細胞のガン化に伴いその質的、量
的な組成変化が起こり、一部はガン抗原となり、またあ
る種の糖脂質が増殖因子やタンパク質キナーゼを介する
細胞増殖機構の調節役を果たしていることが示唆されて
いる。
数、結合方法等の違いにより多様な分子種が存在し、種
特異的、臓器特異的、細胞特異的な分布を示している。
その生理的機能としては、細胞毒素、ホルモン等の受容
体として、また血液型物質等免疫学的決定基としての相
互作用に関し重要な役割を有していることが明らかにな
ってきている。また、細胞のガン化に伴いその質的、量
的な組成変化が起こり、一部はガン抗原となり、またあ
る種の糖脂質が増殖因子やタンパク質キナーゼを介する
細胞増殖機構の調節役を果たしていることが示唆されて
いる。
特にガンとの関連性については、モノクローナル抗体
の生産手段がミルスタインらにより報告され［Nature,2
56,495（1975）］ガン細胞に特異的なモノクローナル抗
体が作製されてくる中で、このうちのいくつかは糖脂質
または糖タンク質の糖鎖を認識する抗体であることが明
らかになってきている［J.Natl.Cancer Inst.,71,231
（1983）］。例えば、膵臓ガンのモノクローナル抗体CA
−19−９（米国Centocor社）は、ガンに特異的な糖鎖モ
ノシアロガングリオシドを識別するものである。
の生産手段がミルスタインらにより報告され［Nature,2
56,495（1975）］ガン細胞に特異的なモノクローナル抗
体が作製されてくる中で、このうちのいくつかは糖脂質
または糖タンク質の糖鎖を認識する抗体であることが明
らかになってきている［J.Natl.Cancer Inst.,71,231
（1983）］。例えば、膵臓ガンのモノクローナル抗体CA
−19−９（米国Centocor社）は、ガンに特異的な糖鎖モ
ノシアロガングリオシドを識別するものである。
このようにガン化機構解明の手掛かりとして、またガ
ン抗原及びガンマーカーとして糖脂質が研究されてい
る。
ン抗原及びガンマーカーとして糖脂質が研究されてい
る。
近年、ガングリオシドの構成成分であるシアル酸にガ
ン特異的抗原性を示すような量的、質的変化が認められ
注目されている。例えば、ガングリオシドGD3は正常組
織にはほとんど検出されないヒトメラノーマ関連抗原で
あり、これに対するモノクローナル抗体もいくつか作製
されている（J.Exp.Med.155,1133−1137（1982）、Int.
J.Cancer 29,269−275,（1982））。さらにrat B49セル
ラインに対し作製されたモノクローナル抗体D1.1は、ヒ
トメラノーマ特異的に反応し、Ｎ−アセチルノイラミン
酸の９位がアセチル化されたガングリオシドGD3（９−
Ｏ−Ac−GD3）を認識する（J.Biol.Chem.259,7453−745
9（1984））。また、逆に、シアル酸の９位をアセチル
化する試薬、Ｎ−アセチルイミダゾールを用いGD3をア
セチル化したところ、モノクローナル抗体D1.1と反応し
た（Science,225,844−846（1984））。
ン特異的抗原性を示すような量的、質的変化が認められ
注目されている。例えば、ガングリオシドGD3は正常組
織にはほとんど検出されないヒトメラノーマ関連抗原で
あり、これに対するモノクローナル抗体もいくつか作製
されている（J.Exp.Med.155,1133−1137（1982）、Int.
J.Cancer 29,269−275,（1982））。さらにrat B49セル
ラインに対し作製されたモノクローナル抗体D1.1は、ヒ
トメラノーマ特異的に反応し、Ｎ−アセチルノイラミン
酸の９位がアセチル化されたガングリオシドGD3（９−
Ｏ−Ac−GD3）を認識する（J.Biol.Chem.259,7453−745
9（1984））。また、逆に、シアル酸の９位をアセチル
化する試薬、Ｎ−アセチルイミダゾールを用いGD3をア
セチル化したところ、モノクローナル抗体D1.1と反応し
た（Science,225,844−846（1984））。
このように、Ｏ−アセチル化されたシアル酸及び／又
はＯ−アセチル化されたシアル酸含有糖鎖が癌関連抗原
となる可能性が示唆され、それに対する抗体は、癌化機
構の解明、癌診断及び癌治療に用いることができる可能
性がある。
はＯ−アセチル化されたシアル酸含有糖鎖が癌関連抗原
となる可能性が示唆され、それに対する抗体は、癌化機
構の解明、癌診断及び癌治療に用いることができる可能
性がある。
また、９位がアセチル化されたシアル酸を含有する複
合糖質は、インフルエンザＣウイルスのレセプターであ
ることがわかっている（J.Biol.Chem.261,5947−951,
（1986）、Virology,159,102−108,（（1987））。従っ
て、これに対するモノクローナル抗体は、インフルエン
ザウイルスの感染機構解明、感染防御に応用することが
できる可能性がある。
合糖質は、インフルエンザＣウイルスのレセプターであ
ることがわかっている（J.Biol.Chem.261,5947−951,
（1986）、Virology,159,102−108,（（1987））。従っ
て、これに対するモノクローナル抗体は、インフルエン
ザウイルスの感染機構解明、感染防御に応用することが
できる可能性がある。
一方、ガングリオシドGM3は、下記式で表わされ、正
常組織に広く存在するが、ヒトメラノーマに特異的に反
応するモノクローナル抗体M2590はGM3と反応多する（J.
Biol.Chem.260,13328−13333,（（1985））。
常組織に広く存在するが、ヒトメラノーマに特異的に反
応するモノクローナル抗体M2590はGM3と反応多する（J.
Biol.Chem.260,13328−13333,（（1985））。
ガングリオシドGM3は、存在状態、特に存在密度、存
在量の差により癌関連抗原となり得ることがわかってい
る（J.Immunology,139,3171−3176（1987））。
在量の差により癌関連抗原となり得ることがわかってい
る（J.Immunology,139,3171−3176（1987））。
［発明が解決しようとする問題点］ 上述のように、従来よりシアル酸含有糖鎖の癌関連抗
原としての可能性が示唆されているが、本発明目的は、
シアル酸含有糖鎖と特異的に反応し、癌診断薬としての
用途を有する新規なモノクローナル抗体を提供すること
である。
原としての可能性が示唆されているが、本発明目的は、
シアル酸含有糖鎖と特異的に反応し、癌診断薬としての
用途を有する新規なモノクローナル抗体を提供すること
である。
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、Ｏ−アセチル化さ
れたガングリオシドGM3を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体を作製することに成功し、また、該モノクロー
ナル抗体を用いて癌の診断が可能であることを見出し、
本発明を完成した。
れたガングリオシドGM3を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体を作製することに成功し、また、該モノクロー
ナル抗体を用いて癌の診断が可能であることを見出し、
本発明を完成した。
すなわち、本発明は、Ｏ−アセチル化されたガングリ
オシドGM3に反応し、Ｏ−アセチル化されていないガン
グリオシドGM3には反応しないモノクローナル抗体を提
供する。
オシドGM3に反応し、Ｏ−アセチル化されていないガン
グリオシドGM3には反応しないモノクローナル抗体を提
供する。
さらにまた、本発明は、本発明のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを提供する。
を産生するハイブリドーマを提供する。
さらに本発明は、Ｏ−アセチル化されたガングリオシ
ドGM3を自己免疫疾患マウスに免疫し、該免疫マウス由
来の抗体産生細胞を一方の親細胞として用いるハイブリ
ドーマの作製方法を提供する。
ドGM3を自己免疫疾患マウスに免疫し、該免疫マウス由
来の抗体産生細胞を一方の親細胞として用いるハイブリ
ドーマの作製方法を提供する。
［発明の効果］ 本発明により、Ｏ−アセチル化されたガングリオシド
GM3を特異的に認識する新規なモノクローナル抗体、そ
れを産生するハイブリドーマ及びその作製方法が提供さ
れた。本発明のモノクローナル抗体は、癌、特に子宮癌
及び卵巣癌の診断に用いることができる。
GM3を特異的に認識する新規なモノクローナル抗体、そ
れを産生するハイブリドーマ及びその作製方法が提供さ
れた。本発明のモノクローナル抗体は、癌、特に子宮癌
及び卵巣癌の診断に用いることができる。
［発明の具体的説明］ 上述のように、本発明のモノクローナル抗体は、少な
くともＯ−アセチル化されたガングリオシドGM3と特異
的に反応し、ガングリオシドGM3とは反応しない。後述
の実施例において具体的に示されるように、本発明のモ
ノクローナル抗体は、Ｏ−アセチル化GM3とは反応する
が、Ｏ−アセチル化GM3をアルカリ処理してアセチル基
をはずし、元のGM3としたものには反応しなくなるか
ら、本発明のモノクローナル抗体はＯ−アセチル化GM3
のＯ−アセチル基を含む部分を抗原決定基としているこ
とは明らかである。
くともＯ−アセチル化されたガングリオシドGM3と特異
的に反応し、ガングリオシドGM3とは反応しない。後述
の実施例において具体的に示されるように、本発明のモ
ノクローナル抗体は、Ｏ−アセチル化GM3とは反応する
が、Ｏ−アセチル化GM3をアルカリ処理してアセチル基
をはずし、元のGM3としたものには反応しなくなるか
ら、本発明のモノクローナル抗体はＯ−アセチル化GM3
のＯ−アセチル基を含む部分を抗原決定基としているこ
とは明らかである。
次に、本発明のモノクローナル抗体の作製法を詳細に
説明する。
説明する。
まず、免疫原を哺乳動物に免疫する。免疫する哺乳動
物は細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮し
て選択することが好ましく、マウス、ラットを用いるの
が好ましい。特に、本発明において免疫原として使用す
るＯ−アセチル化されたガングリオシドGM3は、マウス
組織内の存在が考えられており免疫原性は極めて弱いと
考えられるので自己免疫疾患動物を用いることが好まし
い。使用可能な自己免疫疾患マウスとして、NZB、NZW、
B/WF1、MRL/1,BXSB雄、SL/Ni等の自己免疫疾患マウスを
挙げることができる。
物は細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮し
て選択することが好ましく、マウス、ラットを用いるの
が好ましい。特に、本発明において免疫原として使用す
るＯ−アセチル化されたガングリオシドGM3は、マウス
組織内の存在が考えられており免疫原性は極めて弱いと
考えられるので自己免疫疾患動物を用いることが好まし
い。使用可能な自己免疫疾患マウスとして、NZB、NZW、
B/WF1、MRL/1,BXSB雄、SL/Ni等の自己免疫疾患マウスを
挙げることができる。
また、グラム陰性菌脂質多糖体（LPS）、デキストラ
ン硫酸等のポリクローナルＢ細胞活性化剤（PBA）を投
与することにより自己抗体産生能を高めさせたBalb/c等
のマウスを自己免疫疾患状態にして用いることもでき
る。
ン硫酸等のポリクローナルＢ細胞活性化剤（PBA）を投
与することにより自己抗体産生能を高めさせたBalb/c等
のマウスを自己免疫疾患状態にして用いることもでき
る。
免疫原としては、Ｏ−アセチル化されたガングリオシ
ドGM3を有する細胞体、該細胞より分離した細胞膜成分
及び該細胞より分離したＯ−アセチル化されたGM3等を
用いることができるが、Method in Enzymology、83、15
5−167（1982）に記載の方法に従って細胞よりガングリ
オシドGM3を分離し、これをScience、225、844−846（1
984）に記載の方法に従いＮ−アセチルイミダゾールで
Ｏ−アセチル化処理したＯ−アセチル化ガングリオシド
GM3を用いることが好ましい。
ドGM3を有する細胞体、該細胞より分離した細胞膜成分
及び該細胞より分離したＯ−アセチル化されたGM3等を
用いることができるが、Method in Enzymology、83、15
5−167（1982）に記載の方法に従って細胞よりガングリ
オシドGM3を分離し、これをScience、225、844−846（1
984）に記載の方法に従いＮ−アセチルイミダゾールで
Ｏ−アセチル化処理したＯ−アセチル化ガングリオシド
GM3を用いることが好ましい。
免疫は一般的方法により行なうことができる。すなわ
ち、上記した免疫原をリン酸緩衝溶液（以下、PBSと言
う）で希釈し、腹腔内又は静脈内に投与することができ
る。その際、免疫原を牛血清アルブミン（BSA）及び菌
体等の担体に担じさせることもできる。また、フロイン
トアジュバント又は菌体アジュバント等のアジュバント
を共に注射することもできる。免疫原の抗原性を高める
ためには、免疫原を酢酸処理したサルモネラミネソタバ
クテリアに吸着させて投与することが好ましい。酢酸処
理の方法はEur.J.Biochem.,24,116−122（1971）に記載
の方法に従った。
ち、上記した免疫原をリン酸緩衝溶液（以下、PBSと言
う）で希釈し、腹腔内又は静脈内に投与することができ
る。その際、免疫原を牛血清アルブミン（BSA）及び菌
体等の担体に担じさせることもできる。また、フロイン
トアジュバント又は菌体アジュバント等のアジュバント
を共に注射することもできる。免疫原の抗原性を高める
ためには、免疫原を酢酸処理したサルモネラミネソタバ
クテリアに吸着させて投与することが好ましい。酢酸処
理の方法はEur.J.Biochem.,24,116−122（1971）に記載
の方法に従った。
次に、免疫動物から採取した脾細胞はマウス骨髄腫細
胞と融合させる。骨髄腫細胞としては既に公知の種々の
細胞、例えば、NS−１、SP−２、X63.6.5.3、P3−U1等
を用いることができる。融合方法は、公知の手法に準じ
て行なうことができる。融合促進剤としてポリエチレン
グリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等を用い
ることができる。脾細胞と骨髄腫細胞との混合比は１対
１〜10対１が好ましい。
胞と融合させる。骨髄腫細胞としては既に公知の種々の
細胞、例えば、NS−１、SP−２、X63.6.5.3、P3−U1等
を用いることができる。融合方法は、公知の手法に準じ
て行なうことができる。融合促進剤としてポリエチレン
グリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等を用い
ることができる。脾細胞と骨髄腫細胞との混合比は１対
１〜10対１が好ましい。
細胞融合した後、通常の選択用培地で培養することに
よりハイブリドーマを選択することができる。前記した
骨髄腫細胞はHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含む）中では成育できないためHAT培
地中で成育する細胞を選択すればよい。
よりハイブリドーマを選択することができる。前記した
骨髄腫細胞はHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含む）中では成育できないためHAT培
地中で成育する細胞を選択すればよい。
ハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなったとこ
ろで目的とする抗体を産生する株の検索及びクローニン
グを行なう。Ｏ−アセチル化されたGM3に特異的な抗体
の検索は、一般に抗体の検出に用いられる方法、例え
ば、ELISA法［Meth.Enzymolo.,70,419（1980）］、凝集
反応法、RIA法、二重免疫拡散法等により行なうことが
できる。また、クローニングは限界希釈法により行なう
ことができる。すなわち、96穴マイクロタイタープレー
ト上にハイブリドーマが各ウエル当たり１個以下になる
ように分配し、単一コロニーを生育させることを繰り返
し行ないモノクローン化されたハイブリドーマを得るこ
とができる。この際、フィーダー細胞としてマウス胸線
細胞を添加することが好ましい。
ろで目的とする抗体を産生する株の検索及びクローニン
グを行なう。Ｏ−アセチル化されたGM3に特異的な抗体
の検索は、一般に抗体の検出に用いられる方法、例え
ば、ELISA法［Meth.Enzymolo.,70,419（1980）］、凝集
反応法、RIA法、二重免疫拡散法等により行なうことが
できる。また、クローニングは限界希釈法により行なう
ことができる。すなわち、96穴マイクロタイタープレー
ト上にハイブリドーマが各ウエル当たり１個以下になる
ように分配し、単一コロニーを生育させることを繰り返
し行ないモノクローン化されたハイブリドーマを得るこ
とができる。この際、フィーダー細胞としてマウス胸線
細胞を添加することが好ましい。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マは、液体窒素内で長期保存が可能であり、分譲可能な
状態で保持することができる。
マは、液体窒素内で長期保存が可能であり、分譲可能な
状態で保持することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培
地中で培養し、培養上清から分離する方法又はハイブリ
ドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水より回収する
方法により得ることができる。さらに、一般的な方法、
硫安沈殿、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー等を用いて精製することもできる。
地中で培養し、培養上清から分離する方法又はハイブリ
ドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水より回収する
方法により得ることができる。さらに、一般的な方法、
硫安沈殿、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー等を用いて精製することもできる。
本発明のモノクローナル抗体と反応するＯ−アセチル
化されたガングリオシドは正常組織には存在せず、癌組
織、特に子宮癌や卵巣癌組織中にのみ存在するので、本
発明のモノクローナル抗体は、癌、特に子宮癌及び卵巣
癌の診断薬として有用である。
化されたガングリオシドは正常組織には存在せず、癌組
織、特に子宮癌や卵巣癌組織中にのみ存在するので、本
発明のモノクローナル抗体は、癌、特に子宮癌及び卵巣
癌の診断薬として有用である。
［実施例］ 以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ 糖脂質の分離・精製 糖脂質の分離、精製は、Method in Enzymology,83,15
5−167,1982に記載された方法に準じて以下のように行
なった。生理食塩水にて充分に洗浄した犬赤血球を多量
の冷アセトン中に加え、得られた沈殿物をクロロホル
ム：メタノール：水の容量比が（10:20:1）、（10:10:
0）、（20:10:1）の各混合溶液で順次抽出操作を行っ
た。得られた粗製糖脂質をDEAE−セファデックスＡ−25
カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製）にかけ
酸性画分と中性画分とに分離した。酸性画分をアルカリ
処理した後、イアトロビーズカラムクロマトグラフィー
（ヤトロン社製）で精製しガングリオシドGM3を得た。
5−167,1982に記載された方法に準じて以下のように行
なった。生理食塩水にて充分に洗浄した犬赤血球を多量
の冷アセトン中に加え、得られた沈殿物をクロロホル
ム：メタノール：水の容量比が（10:20:1）、（10:10:
0）、（20:10:1）の各混合溶液で順次抽出操作を行っ
た。得られた粗製糖脂質をDEAE−セファデックスＡ−25
カラムクロマトグラフィー（ファルマシア社製）にかけ
酸性画分と中性画分とに分離した。酸性画分をアルカリ
処理した後、イアトロビーズカラムクロマトグラフィー
（ヤトロン社製）で精製しガングリオシドGM3を得た。
免疫原の調製 上記のようにして得られた精製ガングリオシドGM32mg
をピリジン1mlに溶解した後、Ｎ−アセチルイミダゾー
ルのピリジン溶液（2mg/ml）0.5mlを加え50℃で24時間
加熱した。反応生成物は薄層クロマトグラフィー（TL
C）（展開溶媒：クロロホルム：メタノール:0.2％ 塩
化カルシウム水溶液（55:45:10（v/v/v））により定性
した結果、GM3（Rf＝0.50）よりRf値の大きなＯ−アセ
チル化されたGM3（Rf＝0.58）の生成が確認された。反
応混合溶液は溶媒を留去した後、クロロホルム：メタノ
ール（1:1（V/V））に溶解し−20℃で保存した。一部に
ついてはイアトロビーズカラムクロマトグラフィーで各
々の成分を単離した。イアトロビーズカラムクロマトグ
ラフィーの条件はクロロホルム：メタノール：水（75:2
5:2）から（55:47:3）の極性傾ばい法である。この保存
溶液300μｇをリン酸緩衝溶液（PBS）1.5mlに溶解し、
サルモネラミネソタ菌体1.2mgを加えたPBS1.5mlと充分
に混和したものを免疫原として用いた。なお、サルモネ
ラミネソタバクテリアはアセトン、エーテルで洗浄後、
１％酢酸にて100℃、２時間処理し、水洗後、乾燥した
ものを用いた。
をピリジン1mlに溶解した後、Ｎ−アセチルイミダゾー
ルのピリジン溶液（2mg/ml）0.5mlを加え50℃で24時間
加熱した。反応生成物は薄層クロマトグラフィー（TL
C）（展開溶媒：クロロホルム：メタノール:0.2％ 塩
化カルシウム水溶液（55:45:10（v/v/v））により定性
した結果、GM3（Rf＝0.50）よりRf値の大きなＯ−アセ
チル化されたGM3（Rf＝0.58）の生成が確認された。反
応混合溶液は溶媒を留去した後、クロロホルム：メタノ
ール（1:1（V/V））に溶解し−20℃で保存した。一部に
ついてはイアトロビーズカラムクロマトグラフィーで各
々の成分を単離した。イアトロビーズカラムクロマトグ
ラフィーの条件はクロロホルム：メタノール：水（75:2
5:2）から（55:47:3）の極性傾ばい法である。この保存
溶液300μｇをリン酸緩衝溶液（PBS）1.5mlに溶解し、
サルモネラミネソタ菌体1.2mgを加えたPBS1.5mlと充分
に混和したものを免疫原として用いた。なお、サルモネ
ラミネソタバクテリアはアセトン、エーテルで洗浄後、
１％酢酸にて100℃、２時間処理し、水洗後、乾燥した
ものを用いた。
免疫法及び細胞融合 NZBマウス（雌、８週令）に百日咳死歯5x108のPBS溶
液300μｌを腹腔内注射し、同時に調製した免疫原300μ
ｌを静脈注射した。以後、免疫原を同様に３週間おきに
３回静脈注射した。
液300μｌを腹腔内注射し、同時に調製した免疫原300μ
ｌを静脈注射した。以後、免疫原を同様に３週間おきに
３回静脈注射した。
最終免疫の３日後、マウスの脾細胞を摘出し、RPMI16
40培地にて洗浄した。一方、対数増殖期にあるマウス骨
髄腫細胞X63.6.5.3を集めRPMI1640培地で洗浄した。脾
細胞1.5x108の浮遊液とマウスミエローマ3.1x107の浮遊
液を混合し、遠心分離にて培地を除去した。37℃に加温
した水浴中で混合した細胞に50％ポリエチレングリコー
ル−RPMI1640培地1mlを１分間かけて徐々に加え１時間
緩やかに撹拌させ融合を行なった。RPMI1640培地2mlを
２分間かけ、更に7mlを２分間かけて緩やかに撹拌しつ
つ添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞に10％牛
胎児血清含有RPMI1640培地40mlを加えた後、96穴プレー
ト４枚に１穴当たり0.1mlずつ分配した。翌日、HAT培地
（4x10-7Mアミノプテリン、1.6x10-5Mチミジン、1x10-4
Mヒポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640培
地）0.1mlを各ウエルに加えた。各ウエルの培地は、更
に３日又は４日ごとにHAT培地に半量づつ交換した。培
養３週間後、90％のウエルにハイブリドーマの生育が認
められた。
40培地にて洗浄した。一方、対数増殖期にあるマウス骨
髄腫細胞X63.6.5.3を集めRPMI1640培地で洗浄した。脾
細胞1.5x108の浮遊液とマウスミエローマ3.1x107の浮遊
液を混合し、遠心分離にて培地を除去した。37℃に加温
した水浴中で混合した細胞に50％ポリエチレングリコー
ル−RPMI1640培地1mlを１分間かけて徐々に加え１時間
緩やかに撹拌させ融合を行なった。RPMI1640培地2mlを
２分間かけ、更に7mlを２分間かけて緩やかに撹拌しつ
つ添加した。遠心分離にて培地を除去し、細胞に10％牛
胎児血清含有RPMI1640培地40mlを加えた後、96穴プレー
ト４枚に１穴当たり0.1mlずつ分配した。翌日、HAT培地
（4x10-7Mアミノプテリン、1.6x10-5Mチミジン、1x10-4
Mヒポキサンチン、10％牛胎児血清を含むRPMI1640培
地）0.1mlを各ウエルに加えた。各ウエルの培地は、更
に３日又は４日ごとにHAT培地に半量づつ交換した。培
養３週間後、90％のウエルにハイブリドーマの生育が認
められた。
バイブリドーマの選択 ハイブリドーマ培養上清中の抗体の検索は、抗原とし
て上記免疫原の調製で得たＯ−アセチル化されたガング
リオシドGM3混合物を用いてELISA法にて行なった。
て上記免疫原の調製で得たＯ−アセチル化されたガング
リオシドGM3混合物を用いてELISA法にて行なった。
抗原500ngをELISA用マイクロタイタープレートに吸着
させ、１％BSA・PBS溶液にてブロッキングした後、培養
上清を反応させた。更に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、基質としてオル
トフェニレンジアミンを用いて492nmにおける吸光度を
測定することにより目的の抗体を検出した。その結果、
免疫、細胞融合にて作製したハイブリドーマ中、Ｏ−ア
セチル化されたガングリオシドGM3混合物と反応する抗
体が３つのウエルに検出され、このうちＯ−アセチル化
されていないGM3と反応しない抗体が１つ得られた。
させ、１％BSA・PBS溶液にてブロッキングした後、培養
上清を反応させた。更に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、基質としてオル
トフェニレンジアミンを用いて492nmにおける吸光度を
測定することにより目的の抗体を検出した。その結果、
免疫、細胞融合にて作製したハイブリドーマ中、Ｏ−ア
セチル化されたガングリオシドGM3混合物と反応する抗
体が３つのウエルに検出され、このうちＯ−アセチル化
されていないGM3と反応しない抗体が１つ得られた。
得られたハイブリドーマはHAT培地からアミノプテリ
ンを除いたHT培地に移し、更に10％牛胎児血清（FCS）
含有RPMI1640培地に移し培養した。
ンを除いたHT培地に移し、更に10％牛胎児血清（FCS）
含有RPMI1640培地に移し培養した。
次に、得られたハイブリドーマを限定希釈法によりク
ローニングした。すなわち、96穴プレートに１穴当り0.
8個の密度に細胞を希釈して１穴当り4x105個のマウス胸
線細胞と共に培養し、２週間後にELISA法にて抗体産生
細胞を選択した。クローニングを更に繰り返し、安定な
ハイブリドーマMAc−301を得た。
ローニングした。すなわち、96穴プレートに１穴当り0.
8個の密度に細胞を希釈して１穴当り4x105個のマウス胸
線細胞と共に培養し、２週間後にELISA法にて抗体産生
細胞を選択した。クローニングを更に繰り返し、安定な
ハイブリドーマMAc−301を得た。
モノクローナル抗体MAc−301は、ELISA法によりクラ
スはIgG3と決定された。ハイブリドーマMAc−301は、平
成元年７月20日に微工研に寄託され、その寄託番号は微
工研菌寄第10869号である。
スはIgG3と決定された。ハイブリドーマMAc−301は、平
成元年７月20日に微工研に寄託され、その寄託番号は微
工研菌寄第10869号である。
実施例２ 抗原特異性 実施例１で得られたＯ−アセチル化されたガングリオ
シドGM3又はＯ−アセチル化していないGM3を抗原として
ELISA法を行なった。
シドGM3又はＯ−アセチル化していないGM3を抗原として
ELISA法を行なった。
各抗原500ngをタイタープレートに吸着させ、ハイブ
リドーマ培養上清を10％ウシ胎児血清含有RPMI1640培地
で段階希釈した液を反応させ、さらにパーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させた。反
応混合物は、オルトフェニレンジアミンを基質とし492n
mにおける吸光度を測定した。その結果を図１に示し
た。
リドーマ培養上清を10％ウシ胎児血清含有RPMI1640培地
で段階希釈した液を反応させ、さらにパーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させた。反
応混合物は、オルトフェニレンジアミンを基質とし492n
mにおける吸光度を測定した。その結果を図１に示し
た。
図１より、本発明のモノクローナル抗体はＯ−アセチ
ル化されたGM3とは反応するが、Ｏ−アセチル化されな
いGM3とは反応しないことがわかる。
ル化されたGM3とは反応するが、Ｏ−アセチル化されな
いGM3とは反応しないことがわかる。
実施例３ 抗原特異性 TLCプレートＡにはTLCプレートの下端から1cmのとこ
ろに5mmの幅で実施例１で得た抗原Ｏ−アセチル化され
たGM3混合物（レーン２）及びＯ−アセチル化されてい
ないGM3（レーン１）を２μｇずつスポットし展開溶媒
クロロホルム：メタノール:0.2％塩化カルシウム水溶液
（55:45:10（v/v/v））で展開した後、オルシノール試
薬で発色した。
ろに5mmの幅で実施例１で得た抗原Ｏ−アセチル化され
たGM3混合物（レーン２）及びＯ−アセチル化されてい
ないGM3（レーン１）を２μｇずつスポットし展開溶媒
クロロホルム：メタノール:0.2％塩化カルシウム水溶液
（55:45:10（v/v/v））で展開した後、オルシノール試
薬で発色した。
TLCプレートＢには、上記の抗原400ngずつをスポット
し同様に展開した後、MAc−301の溶液を反応させ、更に
パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体
を反応させた。基質として４−クロロ−１−ナフトール
を用いて青紫色の発色スポットを検出した。このオルシ
ノール発色及び酵素免疫染色の結果を図２に示した。
し同様に展開した後、MAc−301の溶液を反応させ、更に
パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体
を反応させた。基質として４−クロロ−１−ナフトール
を用いて青紫色の発色スポットを検出した。このオルシ
ノール発色及び酵素免疫染色の結果を図２に示した。
図２より、本発明のモノクローナル抗体はＯ−アセチ
ル化されたGM3とは反応するが、Ｏ−アセチル化されな
いGM3とは反応しないことが分かる。
ル化されたGM3とは反応するが、Ｏ−アセチル化されな
いGM3とは反応しないことが分かる。
実施例４ 抗原として実施例１で得た精製ガングリオシドGM
3（レーン１）、単離したＯ−アセチル化されたGM3（レ
ーン２）及び単離したＯ−アセチル化されたGM3をアル
カリ処理してＯ−アセチル基をはずしたもの（レーン
３）を用いることを除いて実施例３と同様な操作を行な
った。なお、このアルカリ処理は、Ｏ−アセチル化され
たGM3をTLC上にスポットした後、アンモニア蒸気下24時
間静置して行なった。その結果を図３に示した。プレー
トＡはオルシノール試薬による発色、プレートＢは酵素
免疫染色によるものである。
3（レーン１）、単離したＯ−アセチル化されたGM3（レ
ーン２）及び単離したＯ−アセチル化されたGM3をアル
カリ処理してＯ−アセチル基をはずしたもの（レーン
３）を用いることを除いて実施例３と同様な操作を行な
った。なお、このアルカリ処理は、Ｏ−アセチル化され
たGM3をTLC上にスポットした後、アンモニア蒸気下24時
間静置して行なった。その結果を図３に示した。プレー
トＡはオルシノール試薬による発色、プレートＢは酵素
免疫染色によるものである。
本発明のモノクローナル抗体はＯ−アセチル化された
GM3とは反応するが、Ｏ−アセチル化されないGM3とは反
応していない。また、アルカリ処理によりＯ−アセチル
化されたGM3がＯ−アセチル化されていないGM3に転化さ
れると本発明の抗体MAc−301との反応性もなくなること
が分かる。このことから、MAc−301は、Ｏ−アセチル化
されたGM3のＯ−アセチル基を含む部分を抗原決定基と
して認識していることが明らかになった。
GM3とは反応するが、Ｏ−アセチル化されないGM3とは反
応していない。また、アルカリ処理によりＯ−アセチル
化されたGM3がＯ−アセチル化されていないGM3に転化さ
れると本発明の抗体MAc−301との反応性もなくなること
が分かる。このことから、MAc−301は、Ｏ−アセチル化
されたGM3のＯ−アセチル基を含む部分を抗原決定基と
して認識していることが明らかになった。
実施例５ 子宮癌２例、卵巣癌２例の各癌組織の細胞を用いて、
実施例１のイヌ赤血球と同様な操作を行ないDEAE−セフ
ァデックスＡ−25カラムクロマトグラフィーにより得ら
れた酸性画分をガングリオシド画分とした。得られたガ
ングリオシド画分をシアル酸量にして２μｇずつTLC上
にスポットし、実施例３と同様に酵素免疫染色を行なっ
た。なお、展開溶媒はクロロホルム：メタノール:2.5％
アンモニア水（55:45:10（v/v/v））を用いた。
実施例１のイヌ赤血球と同様な操作を行ないDEAE−セフ
ァデックスＡ−25カラムクロマトグラフィーにより得ら
れた酸性画分をガングリオシド画分とした。得られたガ
ングリオシド画分をシアル酸量にして２μｇずつTLC上
にスポットし、実施例３と同様に酵素免疫染色を行なっ
た。なお、展開溶媒はクロロホルム：メタノール:2.5％
アンモニア水（55:45:10（v/v/v））を用いた。
その結果、４例中子宮癌１例、卵巣癌２例に発色スポ
ットが検出され、Ｏ−アセチル化されたガングリオシド
の癌関連抗原としての存在及び本発明のモノクローナル
抗体による検出が確認された。
ットが検出され、Ｏ−アセチル化されたガングリオシド
の癌関連抗原としての存在及び本発明のモノクローナル
抗体による検出が確認された。
図１は、本発明のモノクローナル抗体の、Ｏ−アセチル
化されたGM3及びＯ−アセチル化されていないGM3に対す
る反応性を示す酵素免疫分析の結果を示す図、 図２は、本発明のモノクローナル抗体の、Ｏ−アセチル
化されたGM3及びＯ−アセチル化されていないGM3に対す
る反応性を示す、薄層クロマトグラフィーによるオルシ
ノール発色パターン及び酵素免疫染色パターンを示す
図、 図３は、本発明のモノクローナル抗体の、精製ガングリ
オシドGM3、単離したＯ−アセチル化されたGM3及び単離
したＯ−アセチル化されたGM3をアルカリ処理してＯ−
アセチル基をはずしたものに対する反応性を示す、薄層
クロマトグラフィーによるオルシノール発色パターン及
び酵素免疫染色パターンを示す図である。
化されたGM3及びＯ−アセチル化されていないGM3に対す
る反応性を示す酵素免疫分析の結果を示す図、 図２は、本発明のモノクローナル抗体の、Ｏ−アセチル
化されたGM3及びＯ−アセチル化されていないGM3に対す
る反応性を示す、薄層クロマトグラフィーによるオルシ
ノール発色パターン及び酵素免疫染色パターンを示す
図、 図３は、本発明のモノクローナル抗体の、精製ガングリ
オシドGM3、単離したＯ−アセチル化されたGM3及び単離
したＯ−アセチル化されたGM3をアルカリ処理してＯ−
アセチル基をはずしたものに対する反応性を示す、薄層
クロマトグラフィーによるオルシノール発色パターン及
び酵素免疫染色パターンを示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】Ｏ−アセチル化されたガングリオシドGM3
に反応し、Ｏ−アセチル化されていないガングリオシド
GM3には反応しないモノクローナル抗体。 - 【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ。 - 【請求項３】Ｏ−アセチル化されたガングリオシドGM3
を自己免疫疾患マウスに免疫し、該免疫マウス由来の抗
体産生細胞を一方の親細胞として用いるハイブリドーマ
の作製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1219432A JP2743015B2 (ja) | 1989-08-25 | 1989-08-25 | Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1219432A JP2743015B2 (ja) | 1989-08-25 | 1989-08-25 | Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0383597A JPH0383597A (ja) | 1991-04-09 |
| JP2743015B2 true JP2743015B2 (ja) | 1998-04-22 |
Family
ID=16735310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1219432A Expired - Fee Related JP2743015B2 (ja) | 1989-08-25 | 1989-08-25 | Ｏ―アセチル化されたガングリオシドｇｍ▲下３▼に特異的なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ及びその作製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2743015B2 (ja) |
-
1989
- 1989-08-25 JP JP1219432A patent/JP2743015B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0383597A (ja) | 1991-04-09 |
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