JP3150991B2 - ハイブリドーマの製造法 - Google Patents
ハイブリドーマの製造法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＭクラスのモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラ
スのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにク
ラススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの
製造法に関する。当該ハイブリドーマから生産されるＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体は、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体と比べて、種々の疾病の治療により広
く利用できる。
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラ
スのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにク
ラススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの
製造法に関する。当該ハイブリドーマから生産されるＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体は、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体と比べて、種々の疾病の治療により広
く利用できる。
【０００２】
【従来の技術】抗体のクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがあり、さらにＩｇＧはマウ
スの場合、Ｇ1 、Ｇ2a、Ｇ2b、Ｇ3 （ヒトではＧ1 、Ｇ
2 、Ｇ3 、Ｇ4 ）の４つのサブクラスに分れる。動物に
抗原を免疫した場合、得られる抗体はほとんどＩｇＭか
ＩｇＧに属する。ＩｇＧが分子量およそ16万で単量体構
造を有し、比較的扱いやすい分子であるのに比べ、Ｉｇ
Ｍは分子量がおよそ90万という大きな分子であり、Ｊ鎖
でつながれた複雑な５量体構造を有している。このた
め、精製が困難であること、凝集を起こしやすく保存が
難しいこと、蛋白分解酵素による部分分解で失活しやす
くＦabを作製することが難しいこと、抗癌剤や毒素など
を化学結合させる等の化学修飾をすると結合活性を失う
ことが多い等の欠点を有している〔モノクローナル抗
体：原理と実技、J.W.Goding著、アカデッミクプレス
刊、1986年〕。また、癌に対する治療効果において、Ｉ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体とＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体のどちらが優れているかについては、I.
D.Bernstein 等がリンパ球のThy-1 抗原に対するＩｇＧ
クラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を用いて詳
細に検討している〔モノクローナル抗体、R.H.Kennet,
T.J.McKearn および K.B.Bechtol編集、プレナムプレス
刊、1980年、275 〜291 頁〕。それによると、Thy-1 抗
原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するＩｇＧ
クラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の抗腫瘍効
果において、in vitroの補体依存性抗腫瘍効果はＩｇＭ
モノクローナル抗体が優れていたにもかかわらず、担癌
マウスを用いて調べたin vivo の抗腫瘍効果は、ＩｇＧ
クラスのモノクローナル抗体が有意な抗腫瘍効果を示し
たのに対し、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体は抗腫
瘍効果を示さなかった。さらに、マウスにアイソトープ
で標識したモノクローナル抗体を投与して血中半減期を
調べたところ、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体に比
べ、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体は血中半減期が
非常に短いことが明らかとなった。このような実験事実
は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体がＩｇＧ
クラスでなければならないことを示している。
ｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥがあり、さらにＩｇＧはマウ
スの場合、Ｇ1 、Ｇ2a、Ｇ2b、Ｇ3 （ヒトではＧ1 、Ｇ
2 、Ｇ3 、Ｇ4 ）の４つのサブクラスに分れる。動物に
抗原を免疫した場合、得られる抗体はほとんどＩｇＭか
ＩｇＧに属する。ＩｇＧが分子量およそ16万で単量体構
造を有し、比較的扱いやすい分子であるのに比べ、Ｉｇ
Ｍは分子量がおよそ90万という大きな分子であり、Ｊ鎖
でつながれた複雑な５量体構造を有している。このた
め、精製が困難であること、凝集を起こしやすく保存が
難しいこと、蛋白分解酵素による部分分解で失活しやす
くＦabを作製することが難しいこと、抗癌剤や毒素など
を化学結合させる等の化学修飾をすると結合活性を失う
ことが多い等の欠点を有している〔モノクローナル抗
体：原理と実技、J.W.Goding著、アカデッミクプレス
刊、1986年〕。また、癌に対する治療効果において、Ｉ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体とＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体のどちらが優れているかについては、I.
D.Bernstein 等がリンパ球のThy-1 抗原に対するＩｇＧ
クラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を用いて詳
細に検討している〔モノクローナル抗体、R.H.Kennet,
T.J.McKearn および K.B.Bechtol編集、プレナムプレス
刊、1980年、275 〜291 頁〕。それによると、Thy-1 抗
原陽性リンパ球に対し同じ強さの反応性を有するＩｇＧ
クラスとＩｇＭクラスのモノクローナル抗体の抗腫瘍効
果において、in vitroの補体依存性抗腫瘍効果はＩｇＭ
モノクローナル抗体が優れていたにもかかわらず、担癌
マウスを用いて調べたin vivo の抗腫瘍効果は、ＩｇＧ
クラスのモノクローナル抗体が有意な抗腫瘍効果を示し
たのに対し、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体は抗腫
瘍効果を示さなかった。さらに、マウスにアイソトープ
で標識したモノクローナル抗体を投与して血中半減期を
調べたところ、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体に比
べ、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体は血中半減期が
非常に短いことが明らかとなった。このような実験事実
は、ヒトの臨床に使われるモノクローナル抗体がＩｇＧ
クラスでなければならないことを示している。
【０００３】糖脂質は、細胞膜の重要な構成成分であ
り、細胞の癌化により量的、質的に変化することが知ら
れている〔キャンサー・リサーチ（CancerRes. ）45, 2
405(1985)〕。このような糖脂質に対するモノクローナ
ル抗体を作製することは、癌の治療や診断に有用である
と考えられ、実際にその効果が癌患者に投与されて検討
されている〔ガングリオシド・アンド・キャンサー、H.
F.Oettgen 編、VCH Publishers刊、1989年〕。しかし、
糖脂質等のように、Ｔ細胞非依存性の抗原に対するモノ
クローナル抗体を作製する場合、多くの場合ＩｇＭクラ
スのモノクローナル抗体ができやすく、ＩｇＧクラスの
モノクローナル抗体はできにくいという問題点がある
〔ハイブリドーマ作製方法 A.H.Bartal, Y.Hirshaut
編、Humana Press刊、1987年〕。シアル酸をもつ糖脂質
であるガングリオシドの一種であるＧＭ2 は、正常細胞
には極微量にしか存在しないが、肺小細胞癌、メラノー
マ、神経芽細胞腫などの癌細胞では多量に存在するた
め、ＧＭ2 に対するモノクローナル抗体は、これらの癌
の治療に有効であると考えられている〔ランセット（La
ncet）48, 6154(1988)〕。しかし、現在までに報告され
ているＧＭ2 に対するモノクローナル抗体は全て、Ｉｇ
Ｍクラスである〔キャンサー・リサーチ（Cancer Res.
）46, 4116(1986)、プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA) 79, 7629 (1982)、キャンサー・リサーチ(Cance
r Res.) 48, 6154(1988）、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)264, 12122（19
89）〕。
り、細胞の癌化により量的、質的に変化することが知ら
れている〔キャンサー・リサーチ（CancerRes. ）45, 2
405(1985)〕。このような糖脂質に対するモノクローナ
ル抗体を作製することは、癌の治療や診断に有用である
と考えられ、実際にその効果が癌患者に投与されて検討
されている〔ガングリオシド・アンド・キャンサー、H.
F.Oettgen 編、VCH Publishers刊、1989年〕。しかし、
糖脂質等のように、Ｔ細胞非依存性の抗原に対するモノ
クローナル抗体を作製する場合、多くの場合ＩｇＭクラ
スのモノクローナル抗体ができやすく、ＩｇＧクラスの
モノクローナル抗体はできにくいという問題点がある
〔ハイブリドーマ作製方法 A.H.Bartal, Y.Hirshaut
編、Humana Press刊、1987年〕。シアル酸をもつ糖脂質
であるガングリオシドの一種であるＧＭ2 は、正常細胞
には極微量にしか存在しないが、肺小細胞癌、メラノー
マ、神経芽細胞腫などの癌細胞では多量に存在するた
め、ＧＭ2 に対するモノクローナル抗体は、これらの癌
の治療に有効であると考えられている〔ランセット（La
ncet）48, 6154(1988)〕。しかし、現在までに報告され
ているＧＭ2 に対するモノクローナル抗体は全て、Ｉｇ
Ｍクラスである〔キャンサー・リサーチ（Cancer Res.
）46, 4116(1986)、プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA) 79, 7629 (1982)、キャンサー・リサーチ(Cance
r Res.) 48, 6154(1988）、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)264, 12122（19
89）〕。
【０００４】以上のように、治療にはＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体を使うことが重要であるという観点か
ら、最初にＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が作成で
きた場合においても、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗
体を作成しなおすことが多い。しかしながら、前述した
ように糖脂質に対するモノクローナル抗体等のようにＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困難
な場合は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するようにクラススイッチさせることが必要とな
る。
ノクローナル抗体を使うことが重要であるという観点か
ら、最初にＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が作成で
きた場合においても、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗
体を作成しなおすことが多い。しかしながら、前述した
ように糖脂質に対するモノクローナル抗体等のようにＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困難
な場合は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するようにクラススイッチさせることが必要とな
る。
【０００５】ハイブリドーマのクラススイッチについて
は、ＩｇＧクラスのサブタイプ（マウスの場合はＩｇＧ
1, ＩｇＧ2a, ＩｇＧ2b, ＩｇＧ3)の間でスイッチさせ
た報告は多いが、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ
については、以下の２つの抗原についての報告があるだ
けである。(1) フォスフォリルコリンを抗原とするモノ
クローナル抗体の例で、ＩｇＭクラスのモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマをアガロースまたは96ウ
ェルプレート中でクローニングして、ＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマへ自然にク
ラススイッチしたものを選択した〔ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー（Eur.J.Immunology) 1
3, 614 (1983)、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル
・メソッズ(J.Immunol.Methods) 74, 307 (1984)、ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー (J.Immunology) 140, 2
675 (1988)〕。(2) 大腸菌由来のリポサッカライドを抗
原とする例で、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマを96ウェルプレート中でクローニ
ングして、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマへ自然にクラススイッチしたものを選
択した〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー（Eur.J.Immunol.) 17, 413 (1987)、ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Eur.J.Immuno
l.) 19, 131 (1989)〕。
は、ＩｇＧクラスのサブタイプ（マウスの場合はＩｇＧ
1, ＩｇＧ2a, ＩｇＧ2b, ＩｇＧ3)の間でスイッチさせ
た報告は多いが、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ
については、以下の２つの抗原についての報告があるだ
けである。(1) フォスフォリルコリンを抗原とするモノ
クローナル抗体の例で、ＩｇＭクラスのモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマをアガロースまたは96ウ
ェルプレート中でクローニングして、ＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマへ自然にク
ラススイッチしたものを選択した〔ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー（Eur.J.Immunology) 1
3, 614 (1983)、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル
・メソッズ(J.Immunol.Methods) 74, 307 (1984)、ジャ
ーナル・オブ・イミュノロジー (J.Immunology) 140, 2
675 (1988)〕。(2) 大腸菌由来のリポサッカライドを抗
原とする例で、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマを96ウェルプレート中でクローニ
ングして、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマへ自然にクラススイッチしたものを選
択した〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー（Eur.J.Immunol.) 17, 413 (1987)、ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Eur.J.Immuno
l.) 19, 131 (1989)〕。
【０００６】しかしながら、これらの報告における方法
は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマに積極的にクラススイッチさせたも
のではなく、もともと自然にクラススイッチしたものを
クローニングにより選択しているにすぎない。従って、
この方法は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成
しやすい抗原の場合には適用できるが、前述したような
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困
難な糖脂質抗原等の場合には適用することはできない。
は、ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマをＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマに積極的にクラススイッチさせたも
のではなく、もともと自然にクラススイッチしたものを
クローニングにより選択しているにすぎない。従って、
この方法は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成
しやすい抗原の場合には適用できるが、前述したような
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を作成することが困
難な糖脂質抗原等の場合には適用することはできない。
【０００７】また、Whitmore等は、フォスフォリルコリ
ンに対するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産す
るリンホーマＢ細胞のクラススイッチがいかなる処理で
高率に起きるかを検討した〔インターナショナル・イミ
ュノロジー(Int.Immunol.) 3, 95, 1991〕。すなわち、
Whitmore等は、リンホーマＢ細胞をインターロイキン
４、インターロイキン５、インターロイキン６、インタ
ーフェロンガンマー、TGF ベーター、ヒドロキシウレ
ア、コレラトキシン、または非精製の抗原であるヒツジ
赤血球の存在下で培養することを試みた。その結果、TG
Fベーターを用いた場合は、ＩｇＭクラスからＩｇＡク
ラスへのクラススイッチが高率に起き、インターロイキ
ン４とコレラトキシンを用いた場合でもＩｇＭクラスか
らＩｇＡクラスへのクラススイッチが増加することが判
明した。一方、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ
は、インターロイキン４、TGF ベーター、コレラトキシ
ンの処理で若干効果がある傾向が認められたが、十分な
量のＩｇＧクラスのイミュノグロブリンの生産が認めら
れず、統計学的にも無処理群との間で有意差がなかっ
た。このように、ハイブリドーマよりもクラススイッチ
を起こしやすいと考えられるリンホーマＢ細胞でもＩｇ
ＭからＩｇＧへのクラススイッチを高率に起こすような
方法は今までに報告されていない。
ンに対するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を生産す
るリンホーマＢ細胞のクラススイッチがいかなる処理で
高率に起きるかを検討した〔インターナショナル・イミ
ュノロジー(Int.Immunol.) 3, 95, 1991〕。すなわち、
Whitmore等は、リンホーマＢ細胞をインターロイキン
４、インターロイキン５、インターロイキン６、インタ
ーフェロンガンマー、TGF ベーター、ヒドロキシウレ
ア、コレラトキシン、または非精製の抗原であるヒツジ
赤血球の存在下で培養することを試みた。その結果、TG
Fベーターを用いた場合は、ＩｇＭクラスからＩｇＡク
ラスへのクラススイッチが高率に起き、インターロイキ
ン４とコレラトキシンを用いた場合でもＩｇＭクラスか
らＩｇＡクラスへのクラススイッチが増加することが判
明した。一方、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ
は、インターロイキン４、TGF ベーター、コレラトキシ
ンの処理で若干効果がある傾向が認められたが、十分な
量のＩｇＧクラスのイミュノグロブリンの生産が認めら
れず、統計学的にも無処理群との間で有意差がなかっ
た。このように、ハイブリドーマよりもクラススイッチ
を起こしやすいと考えられるリンホーマＢ細胞でもＩｇ
ＭからＩｇＧへのクラススイッチを高率に起こすような
方法は今までに報告されていない。
【０００８】ハイブリドーマは数万分の一個から数百億
分の一個の確率で、自然にクラススイッチしたモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマに変わると言われ
ている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー（Eur.J.Immunol.) 17,413 (1987)〕。クラススイ
ッチしたモノクローナル抗体を採取する方法としては、
このように自然に変化したハイブリドーマを無変化の大
集団のハイブリドーマの中から選択し、それのみを増殖
させることが必要となる。選択方法としてはアガロース
培地や96ウェルプレートを用いてハイブリドーマをクロ
ーニングし、変化したハイブリドーマを一個一個探して
いくシブ選択法〔ジャーナル・オブ・イミュノロジー
(J.Immunol.) 131, 877 (1983）〕、およびフローサイ
トメトリーを用いて変化したハイブリドーマを数百から
数千個の単位で分取する方法が知られている〔ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Met
hods) 52, 1 (1982)〕。しかしながら、いずれの方法も
ハイブリドーマが自然に変化する確率自体が低いので、
とくに変化する確率が低いと考えられるＩｇＭクラスか
らＩｇＧクラスへのクラススイッチの場合に用いること
は難しい。従って、この方法を糖脂質等のＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体を得るのが困難な抗原の場合に適
用することはできない。
分の一個の確率で、自然にクラススイッチしたモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマに変わると言われ
ている〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロ
ジー（Eur.J.Immunol.) 17,413 (1987)〕。クラススイ
ッチしたモノクローナル抗体を採取する方法としては、
このように自然に変化したハイブリドーマを無変化の大
集団のハイブリドーマの中から選択し、それのみを増殖
させることが必要となる。選択方法としてはアガロース
培地や96ウェルプレートを用いてハイブリドーマをクロ
ーニングし、変化したハイブリドーマを一個一個探して
いくシブ選択法〔ジャーナル・オブ・イミュノロジー
(J.Immunol.) 131, 877 (1983）〕、およびフローサイ
トメトリーを用いて変化したハイブリドーマを数百から
数千個の単位で分取する方法が知られている〔ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Met
hods) 52, 1 (1982)〕。しかしながら、いずれの方法も
ハイブリドーマが自然に変化する確率自体が低いので、
とくに変化する確率が低いと考えられるＩｇＭクラスか
らＩｇＧクラスへのクラススイッチの場合に用いること
は難しい。従って、この方法を糖脂質等のＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体を得るのが困難な抗原の場合に適
用することはできない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、糖脂
質等のＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を得ることが
困難な抗原に対するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマを得る方法を提供することに
ある。
質等のＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を得ることが
困難な抗原に対するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマを得る方法を提供することに
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＩｇＭクラス
に属するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
を、当該抗体と反応する抗原、および胸腺細胞存在下に
培養することを特徴とするＩｇＧクラスのモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマの製造法に関する。
に属するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
を、当該抗体と反応する抗原、および胸腺細胞存在下に
培養することを特徴とするＩｇＧクラスのモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマの製造法に関する。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。（１）ハ
イブリドーマの抗原刺激ＩｇＭクラスに属するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ１×１０ 4 〜１×
１０6 個／mlを胸腺細胞存在下に培養する。ＩｇＭクラ
スに属するモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ2 、シアリル
ＬｅX 、ＬｅX 、ＬｅY 等の糖脂質に対するモノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマ等があげられる。糖
脂質を抗原とするモノクローナル抗体を生産するハイブ
リドーマとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ2 と反
応するモノクローナル抗体を生産するラットハイブリド
ーマＫＭ−６０２、ＫＭ−６０３、ＫＭ−６０４、ＫＭ
−６０５およびＫＭ−６０６、マウスハイブリドーマＫ
Ｍ−５３１、ＫＭ−６９３、ＫＭ−６９４、ＫＭ−６９
５、ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７等があげられる。
ハイブリドーマＫＭ−５３１、ＫＭ−６０３は、それぞ
れ平成元年９月１４日、平成元年１０月３１日付けで、
ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７は、平成３年４月２日
付けで、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ、
FERM BP-2597、FERM BP-2636、FERM BP-3337、FERM BP-
3338として寄託されている。胸腺細胞としては、例え
ば、マウス由来の胸腺細胞があげられ、１×１０6 〜１
×１０8 個／ml用いる。ハイブリドーマを胸腺細胞存在
下に培養する際、当該ハイブリドーマが生産する抗体と
反応する抗原を培養液に加えて抗原刺激を行なう。抗原
の濃度は１０〜１×１０3 ng／mlであり、一回の抗原刺
激に必要な培養時間は５日間から７日間である。抗原
は、リポソームに封入して培養液に加えるのが好まし
い。リポソームは、ジパルミトイルフォスファチジルコ
リン、ジパルミトイルフォスファチジリックアシド等の
リン脂質およびコレステロールを用いて作製するが、リ
ン脂質およびコレステロールは数種を組み合わせて用い
るのが好ましい。また、リピッドＡなどのマイトジェン
を加えて作製すると抗原刺激はより効果的になる。抗原
刺激は、通常一回では不十分であり、６〜１０回程度必
要である。
イブリドーマの抗原刺激ＩｇＭクラスに属するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ１×１０ 4 〜１×
１０6 個／mlを胸腺細胞存在下に培養する。ＩｇＭクラ
スに属するモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ2 、シアリル
ＬｅX 、ＬｅX 、ＬｅY 等の糖脂質に対するモノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマ等があげられる。糖
脂質を抗原とするモノクローナル抗体を生産するハイブ
リドーマとしては、例えば、ガングリオシドＧＭ2 と反
応するモノクローナル抗体を生産するラットハイブリド
ーマＫＭ−６０２、ＫＭ−６０３、ＫＭ−６０４、ＫＭ
−６０５およびＫＭ−６０６、マウスハイブリドーマＫ
Ｍ−５３１、ＫＭ−６９３、ＫＭ−６９４、ＫＭ−６９
５、ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７等があげられる。
ハイブリドーマＫＭ−５３１、ＫＭ−６０３は、それぞ
れ平成元年９月１４日、平成元年１０月３１日付けで、
ＫＭ−６９６およびＫＭ−６９７は、平成３年４月２日
付けで、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれ、
FERM BP-2597、FERM BP-2636、FERM BP-3337、FERM BP-
3338として寄託されている。胸腺細胞としては、例え
ば、マウス由来の胸腺細胞があげられ、１×１０6 〜１
×１０8 個／ml用いる。ハイブリドーマを胸腺細胞存在
下に培養する際、当該ハイブリドーマが生産する抗体と
反応する抗原を培養液に加えて抗原刺激を行なう。抗原
の濃度は１０〜１×１０3 ng／mlであり、一回の抗原刺
激に必要な培養時間は５日間から７日間である。抗原
は、リポソームに封入して培養液に加えるのが好まし
い。リポソームは、ジパルミトイルフォスファチジルコ
リン、ジパルミトイルフォスファチジリックアシド等の
リン脂質およびコレステロールを用いて作製するが、リ
ン脂質およびコレステロールは数種を組み合わせて用い
るのが好ましい。また、リピッドＡなどのマイトジェン
を加えて作製すると抗原刺激はより効果的になる。抗原
刺激は、通常一回では不十分であり、６〜１０回程度必
要である。
【００１２】（２）クラススイッチしたハイブリドーマ
の分取（１）で抗原刺激したハイブリドーマから、Ｉｇ
Ｇクラスのモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マを分取する。分取は、アガロース培地や96ウェルプレ
ートを用いてハイブリドーマをクローニングし、変化し
たハイブリドーマを一個一個探していくシブ選択法〔ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー (J.Immunol.) 131, 8
77 (1983）〕、およびフローサイトメトリーを用いて変
化したハイブリドーマを数百から数千個の単位で分取す
る方法〔ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッ
ズ(J.Immunol.Methods) 52, 1 (1982)〕によって行う
が、効率的に分取するには、フローサイトメトリーによ
る方法が好ましい。以下、フローサイトメトリーによる
分取法について説明する。
の分取（１）で抗原刺激したハイブリドーマから、Ｉｇ
Ｇクラスのモノクローナル抗体を生産するハイブリドー
マを分取する。分取は、アガロース培地や96ウェルプレ
ートを用いてハイブリドーマをクローニングし、変化し
たハイブリドーマを一個一個探していくシブ選択法〔ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジー (J.Immunol.) 131, 8
77 (1983）〕、およびフローサイトメトリーを用いて変
化したハイブリドーマを数百から数千個の単位で分取す
る方法〔ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッ
ズ(J.Immunol.Methods) 52, 1 (1982)〕によって行う
が、効率的に分取するには、フローサイトメトリーによ
る方法が好ましい。以下、フローサイトメトリーによる
分取法について説明する。
【００１３】フローサイトメトリーによる分取を行うた
めには、クラススイッチさせるハイブリドーマの細胞表
面に、分泌するモノクローナル抗体と同一のクラスに属
し、同一の結合特異性を有するイミュノグロブリン分子
を持っていることが必要である。そこで、抗原刺激をす
る前に、細胞表面のイミュノグロブリン分子の有無をFI
TC(fluorescein isothiocyanate)等の蛍光色素を標識し
た抗ＩｇＭ抗体（以下、FITC-anti-ＩｇＭと略記す
る。）を用いて調べる。すなわち、ハイブリドーマにFI
TC-anti-ＩｇＭを反応させ、蛍光顕微鏡による観察やフ
ローサイトメトリーによる解析により、細胞表面の蛍光
強度を測定し、十分な数のＩｇＭクラスのイミュノグロ
ブリン分子を細胞表面に持つハイブリドーマを選択す
る。
めには、クラススイッチさせるハイブリドーマの細胞表
面に、分泌するモノクローナル抗体と同一のクラスに属
し、同一の結合特異性を有するイミュノグロブリン分子
を持っていることが必要である。そこで、抗原刺激をす
る前に、細胞表面のイミュノグロブリン分子の有無をFI
TC(fluorescein isothiocyanate)等の蛍光色素を標識し
た抗ＩｇＭ抗体（以下、FITC-anti-ＩｇＭと略記す
る。）を用いて調べる。すなわち、ハイブリドーマにFI
TC-anti-ＩｇＭを反応させ、蛍光顕微鏡による観察やフ
ローサイトメトリーによる解析により、細胞表面の蛍光
強度を測定し、十分な数のＩｇＭクラスのイミュノグロ
ブリン分子を細胞表面に持つハイブリドーマを選択す
る。
【００１４】（１）の抗原刺激終了後、一千万から一億
個のハイブリドーマに蛍光色素を標識した抗ＩｇＧ抗体
（以下、FITC-anti-ＩｇＧと略記する。）または蛍光色
素を標識したプロテインＡ（以下、FITC-protein Ａと
略記する。）または蛍光色素を標識したプロテインＧ
（以下、FITC-protein Ｇと略記する。）を反応させ
る。反応後、ハイブリドーマをフローサイトメトリーに
かけ、レーザー光をあてることにより蛍光強度の測定を
行なう。蛍光強度の強いハイブリドーマにプラスまたは
マイナスの電荷を与え、偏向板の間にハイブリドーマを
高速で流すことにより電荷を持ったハイブリドーマだけ
を選択的に分取する。抗原刺激の回数が不足している場
合は、蛍光強度の強いハイブリドーマはほとんど検知で
きないが、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットし
て得られる分布曲線上で蛍光強度の強い方にずれている
細胞集団（全体のハイブリドーマ数の数パーセントに相
当する。）を分取し、再び抗原で刺激し、フローサイト
メトリーにかける。抗原刺激の回数が増すに従って、蛍
光強度の強い細胞集団が明確に出現し、分布曲線は二つ
の山（ピーク）になるので、この段階に達したら蛍光強
度の強い方のピークの細胞集団を分取する。
個のハイブリドーマに蛍光色素を標識した抗ＩｇＧ抗体
（以下、FITC-anti-ＩｇＧと略記する。）または蛍光色
素を標識したプロテインＡ（以下、FITC-protein Ａと
略記する。）または蛍光色素を標識したプロテインＧ
（以下、FITC-protein Ｇと略記する。）を反応させ
る。反応後、ハイブリドーマをフローサイトメトリーに
かけ、レーザー光をあてることにより蛍光強度の測定を
行なう。蛍光強度の強いハイブリドーマにプラスまたは
マイナスの電荷を与え、偏向板の間にハイブリドーマを
高速で流すことにより電荷を持ったハイブリドーマだけ
を選択的に分取する。抗原刺激の回数が不足している場
合は、蛍光強度の強いハイブリドーマはほとんど検知で
きないが、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットし
て得られる分布曲線上で蛍光強度の強い方にずれている
細胞集団（全体のハイブリドーマ数の数パーセントに相
当する。）を分取し、再び抗原で刺激し、フローサイト
メトリーにかける。抗原刺激の回数が増すに従って、蛍
光強度の強い細胞集団が明確に出現し、分布曲線は二つ
の山（ピーク）になるので、この段階に達したら蛍光強
度の強い方のピークの細胞集団を分取する。
【００１５】（３）クローニング（２）で得られた蛍光
強度の強いハイブリドーマを適当な細胞濃度に希釈し
て、96ウェルプレートに分注して培養する。この時の細
胞希釈濃度は96ウェルプレートの一ウェルに一細胞また
は、二ウェルに一細胞になるようにするのが好ましい
（限界希釈法によるクローニング）。また、胸腺細胞１
×１０4 〜１×１０7 個／mlを加えて培養すると培養効
率がよい。１〜２週間の培養後に培養上清の一部をと
り、酵素免疫測定法等によりＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体が生産されているウェルの割合を調べ
る。ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されてい
るウェルがある場合は、ＩｇＧクラスのモノクローナル
抗体が生産されているウェルのハイブリドーマをもう一
度、限界希釈法でクローニングする。このようにして、
ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されているウ
ェルがなくなり、90％以上のウェルにＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体の生産が認められるようになるまで、
限界希釈法によるクローニングを繰り返す。最終的にＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体を最もよく生産してい
るウェルをクラススイッチしたハイブリドーマとして選
択する。ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマにクラススイッチしたハイブリドーマと
しては、例えば、ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等のガン
グリオシドＧＭ2 に対するモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマ等があげられる。ハイブリドーマＫＭ
−７５０およびＫＭ−７９６は平成３年４月２日付けで
工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれFERM BP-33
39、FERM BP-3340として寄託されている。
強度の強いハイブリドーマを適当な細胞濃度に希釈し
て、96ウェルプレートに分注して培養する。この時の細
胞希釈濃度は96ウェルプレートの一ウェルに一細胞また
は、二ウェルに一細胞になるようにするのが好ましい
（限界希釈法によるクローニング）。また、胸腺細胞１
×１０4 〜１×１０7 個／mlを加えて培養すると培養効
率がよい。１〜２週間の培養後に培養上清の一部をと
り、酵素免疫測定法等によりＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭクラスのモノ
クローナル抗体が生産されているウェルの割合を調べ
る。ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されてい
るウェルがある場合は、ＩｇＧクラスのモノクローナル
抗体が生産されているウェルのハイブリドーマをもう一
度、限界希釈法でクローニングする。このようにして、
ＩｇＭクラスのモノクローナル抗体が生産されているウ
ェルがなくなり、90％以上のウェルにＩｇＧクラスのモ
ノクローナル抗体の生産が認められるようになるまで、
限界希釈法によるクローニングを繰り返す。最終的にＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体を最もよく生産してい
るウェルをクラススイッチしたハイブリドーマとして選
択する。ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマにクラススイッチしたハイブリドーマと
しては、例えば、ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等のガン
グリオシドＧＭ2 に対するモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマ等があげられる。ハイブリドーマＫＭ
−７５０およびＫＭ−７９６は平成３年４月２日付けで
工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞれFERM BP-33
39、FERM BP-3340として寄託されている。
【００１６】（４）モノクローナル抗体の調製（３）で
選択したクラススイッチしたハイブリドーマをローラー
ボトルやスピンナー等を用いて２〜７日間培養した後、
遠心分離して培養上清を集める。これをプロテインＡカ
ラムやプロテインＧカラムに通塔後、吸着したＩｇＧク
ラスのモノクローナル抗体を溶出し、精製モノクローナ
ル抗体とする。得られるモノクロ−ナル抗体としては、
例えば、ハイブリドーマＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６よ
りそれぞれ生産されるガングリオシドＧＭ2 に対するモ
ノクローナル抗体ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等があげ
られる。得られるモノクローナル抗体がＩｇＧクラスで
あることをＳＤＳ電気泳動等で調べる。また、プリスタ
ン〔2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン(Pristane)〕
0.5ml を腹腔内投与し、３日から２週間飼育したマウス
に、ハイブリドーマを腹腔内投与して得られる腹水から
も同様に、プロテインＡカラムやプロテインＧカラムを
用いて精製抗体を調製できる。モノクローナル抗体のサ
ブクラスは、サブクラスタイピングキットを用いた酵素
免疫測定法や免疫沈降を利用したオクタロニー法で決定
する。蛋白量の決定は、ローリー法や280nm の吸光度よ
り算出する。
選択したクラススイッチしたハイブリドーマをローラー
ボトルやスピンナー等を用いて２〜７日間培養した後、
遠心分離して培養上清を集める。これをプロテインＡカ
ラムやプロテインＧカラムに通塔後、吸着したＩｇＧク
ラスのモノクローナル抗体を溶出し、精製モノクローナ
ル抗体とする。得られるモノクロ−ナル抗体としては、
例えば、ハイブリドーマＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６よ
りそれぞれ生産されるガングリオシドＧＭ2 に対するモ
ノクローナル抗体ＫＭ−７５０、ＫＭ−７９６等があげ
られる。得られるモノクローナル抗体がＩｇＧクラスで
あることをＳＤＳ電気泳動等で調べる。また、プリスタ
ン〔2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン(Pristane)〕
0.5ml を腹腔内投与し、３日から２週間飼育したマウス
に、ハイブリドーマを腹腔内投与して得られる腹水から
も同様に、プロテインＡカラムやプロテインＧカラムを
用いて精製抗体を調製できる。モノクローナル抗体のサ
ブクラスは、サブクラスタイピングキットを用いた酵素
免疫測定法や免疫沈降を利用したオクタロニー法で決定
する。蛋白量の決定は、ローリー法や280nm の吸光度よ
り算出する。
【００１７】（５）モノクローナル抗体の活性と反応特
異性の検討モノクローナル抗体の活性と反応特異性は、
酵素免疫測定法やラジオイミュノアッセイ法 (抗体実験
マニュアル、 E.Harlow, D.Lane 編、 Cold Spring Har
bor Laboratory刊、1988年) を用いて測定する。
異性の検討モノクローナル抗体の活性と反応特異性は、
酵素免疫測定法やラジオイミュノアッセイ法 (抗体実験
マニュアル、 E.Harlow, D.Lane 編、 Cold Spring Har
bor Laboratory刊、1988年) を用いて測定する。
【００１８】以下に本発明の実施例を示す。
【００１９】
【実施例】（１）ハイブリドーマの選択ガングリオシド
ＧＭ2 と反応するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を
生産するラットハイブリドーマＫＭ−６０２，ＫＭ−６
０３，ＫＭ−６０４，ＫＭ−６０５およびＫＭ−６０６
およびマウスハイブリドーマＫＭ−５３１, ＫＭ−６９
３, ＫＭ−６９４, ＫＭ−６９５, ＫＭ−６９６および
ＫＭ−６９７について、細胞表面のイミュノグロブリン
の存在の有無を調べた。すなわち、ハイブリドーマ約百
万個に、200 μl のFITC-anti-mouse ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（0.5mg/ml，フナコシ社製）の32倍希釈液またはFITC-a
nti-rat ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（DAKO社製)200倍希釈液を加
え、4 ℃で30分間反応させた。反応後、ハイブリドーマ
を、冷やしたPBS(phosphate buffered saline, pH7.2)
で２回洗浄後、約6ml のPBS に懸濁し、フローサイトメ
トリー（FCS-1,日本分光社製）を用いて蛍光強度を測定
した。その結果、ハイブリドーマＫＭ−６０２, ＫＭ−
６０３, ＫＭ−６０４, ＫＭ−６０５, ＫＭ−６０６に
は、細胞表面にイミュノグロブリンはＩｇＭクラス、Ｉ
ｇＧクラスとも認められなかった。ハイブリドーマＫＭ
−５３１, ＫＭ−６９３, ＫＭ−６９４, ＫＭ−６９
５, ＫＭ−６９６, ＫＭ−６９７には、細胞表面にフロ
ーサイトメトリーによる分取を行なうのに十分な数のＩ
ｇＭクラスのイミュノグロブリンが認められた。しか
し、これらのハイブリドーマには、細胞表面にFITC-ant
i mouse γ chain（フナコシ社製）と反応するようなＩ
ｇＧクラスのイミュノグロブリンは全く認められなかっ
た。細胞表面にイミュノグロブリンのあったハイブリド
ーマのなかから、抗原に対する反応性が強く、かつ抗原
特異性も高いＫＭ−６９６とＫＭ−６９７を選択し、以
後の実験に供した。ハイブリドーマＫＭ−６９６から生
産されるモノクローナル抗体ＫＭ−６９６はＮ−アセチ
ルＧＭ2 と特異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ3 、Ｎ−
グリコリルＧＭ3 、Ｎ−グリコリルＧＭ2 、ＧＭ1 、Ｇ
Ｄ1 、ＧＤ2 、ＧＤ3 、ＧＤ1a、ＧＤ1b、ＧＴ1b、ＧＱ
1b等のガングリオシドに対しては反応しなかった。ハイ
ブリドーマＫＭ−６９７から生産されるモノクローナル
抗体ＫＭ−６９７はＮ−アセチルＧＭ2 およびＮ−グリ
コリルＧＭ2 と特異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ3 、
Ｎ−グリコリルＧＭ3 、ＧＭ1 、ＧＤ1 、ＧＤ2 、ＧＤ
3 、ＧＤ1a、ＧＤ1b、ＧＴ1b、ＧＱ 1b等のガングリオシ
ドに対しては反応しなかった。
ＧＭ2 と反応するＩｇＭクラスのモノクローナル抗体を
生産するラットハイブリドーマＫＭ−６０２，ＫＭ−６
０３，ＫＭ−６０４，ＫＭ−６０５およびＫＭ−６０６
およびマウスハイブリドーマＫＭ−５３１, ＫＭ−６９
３, ＫＭ−６９４, ＫＭ−６９５, ＫＭ−６９６および
ＫＭ−６９７について、細胞表面のイミュノグロブリン
の存在の有無を調べた。すなわち、ハイブリドーマ約百
万個に、200 μl のFITC-anti-mouse ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（0.5mg/ml，フナコシ社製）の32倍希釈液またはFITC-a
nti-rat ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（DAKO社製)200倍希釈液を加
え、4 ℃で30分間反応させた。反応後、ハイブリドーマ
を、冷やしたPBS(phosphate buffered saline, pH7.2)
で２回洗浄後、約6ml のPBS に懸濁し、フローサイトメ
トリー（FCS-1,日本分光社製）を用いて蛍光強度を測定
した。その結果、ハイブリドーマＫＭ−６０２, ＫＭ−
６０３, ＫＭ−６０４, ＫＭ−６０５, ＫＭ−６０６に
は、細胞表面にイミュノグロブリンはＩｇＭクラス、Ｉ
ｇＧクラスとも認められなかった。ハイブリドーマＫＭ
−５３１, ＫＭ−６９３, ＫＭ−６９４, ＫＭ−６９
５, ＫＭ−６９６, ＫＭ−６９７には、細胞表面にフロ
ーサイトメトリーによる分取を行なうのに十分な数のＩ
ｇＭクラスのイミュノグロブリンが認められた。しか
し、これらのハイブリドーマには、細胞表面にFITC-ant
i mouse γ chain（フナコシ社製）と反応するようなＩ
ｇＧクラスのイミュノグロブリンは全く認められなかっ
た。細胞表面にイミュノグロブリンのあったハイブリド
ーマのなかから、抗原に対する反応性が強く、かつ抗原
特異性も高いＫＭ−６９６とＫＭ−６９７を選択し、以
後の実験に供した。ハイブリドーマＫＭ−６９６から生
産されるモノクローナル抗体ＫＭ−６９６はＮ−アセチ
ルＧＭ2 と特異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ3 、Ｎ−
グリコリルＧＭ3 、Ｎ−グリコリルＧＭ2 、ＧＭ1 、Ｇ
Ｄ1 、ＧＤ2 、ＧＤ3 、ＧＤ1a、ＧＤ1b、ＧＴ1b、ＧＱ
1b等のガングリオシドに対しては反応しなかった。ハイ
ブリドーマＫＭ−６９７から生産されるモノクローナル
抗体ＫＭ−６９７はＮ−アセチルＧＭ2 およびＮ−グリ
コリルＧＭ2 と特異的に反応し、Ｎ−アセチルＧＭ3 、
Ｎ−グリコリルＧＭ3 、ＧＭ1 、ＧＤ1 、ＧＤ2 、ＧＤ
3 、ＧＤ1a、ＧＤ1b、ＧＴ1b、ＧＱ 1b等のガングリオシ
ドに対しては反応しなかった。
【００２０】（２）ハイブリドーマの抗原刺激とフロー
サイトメトリーによる分取まず、ＧＭ2 封入リポソーム
を以下の方法で作製した。0.5 μmol ジパルミトイルフ
ォスファチジルコリン（シグマ社製）、0.05μmol ジパ
ルミトイルフォスファチジリックアシド（シグマ社
製）、0.5 μmol コレステロール（ナカライテスク社
製）、2.5 μg リピッドＡ（フナコシ社製）および2.0
μg ガングリオシドＧＭ2(ベーリンガー・マンハイム社
製）をクロロホルムに溶解した後、減圧下に溶媒を留去
し薄膜を作製した。これに、0.5ml のPBS を加え、50〜
60℃で加熱した後、ミキサーを用いて攪拌し、10分間の
超音波処理を行ない、ＧＭ2 封入リポソームを作製し
た。
サイトメトリーによる分取まず、ＧＭ2 封入リポソーム
を以下の方法で作製した。0.5 μmol ジパルミトイルフ
ォスファチジルコリン（シグマ社製）、0.05μmol ジパ
ルミトイルフォスファチジリックアシド（シグマ社
製）、0.5 μmol コレステロール（ナカライテスク社
製）、2.5 μg リピッドＡ（フナコシ社製）および2.0
μg ガングリオシドＧＭ2(ベーリンガー・マンハイム社
製）をクロロホルムに溶解した後、減圧下に溶媒を留去
し薄膜を作製した。これに、0.5ml のPBS を加え、50〜
60℃で加熱した後、ミキサーを用いて攪拌し、10分間の
超音波処理を行ない、ＧＭ2 封入リポソームを作製し
た。
【００２１】次に、抗原刺激をしていないそれぞれ2 〜
3 千万個のハイブリドーマＫＭ−６９６とＫＭ−６９７
に200 μl のFITC-anti Protein Ａ(5mg/ml,ベーリンガ
ー・マンハイム社製）の20倍希釈液を4 ℃で30分間反応
させた。反応後、ハイブリドーマを冷やしたPBS で２回
洗浄後、6ml のPBS に懸濁してフローサイトメトリーに
供した。
3 千万個のハイブリドーマＫＭ−６９６とＫＭ−６９７
に200 μl のFITC-anti Protein Ａ(5mg/ml,ベーリンガ
ー・マンハイム社製）の20倍希釈液を4 ℃で30分間反応
させた。反応後、ハイブリドーマを冷やしたPBS で２回
洗浄後、6ml のPBS に懸濁してフローサイトメトリーに
供した。
【００２２】フローサイトメトリーにおいて、蛍光強度
の強いハイブリドーマの集団は検知できなかったが、横
軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットして得られる分
布曲線上で蛍光強度の強い方にずれている数十万個の細
胞集団を分取した。分取したハイブリドーマをそれぞれ
数十万個、24ウェルプレート（Nunc社製）を用い、マウ
ス胸腺細胞（3 〜4 週令マウス胸腺細胞全体の50分の1
程度の細胞数）存在下で10％牛胎児血清（CSL 社製）を
含む１〜1.5ml RPMI1640培地（日水製薬社製）中で培養
した。その際、ＧＭ2 封入リポソームをＧＭ2 の最終濃
度が500 ng／mlになるように加えて抗原刺激を行なっ
た。対照として、抗原刺激をせずに培養を行ない、FITC
-anti Protein Ａと反応させ、再びフローサイトメトリ
ーに供する操作をそれぞれのハイブリドーマについて15
回繰り返した。この抗原刺激を行わない培養では、FITC
-anti Protein Ａに反応して蛍光強度が増す細胞集団は
出現しなかった。
の強いハイブリドーマの集団は検知できなかったが、横
軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をプロットして得られる分
布曲線上で蛍光強度の強い方にずれている数十万個の細
胞集団を分取した。分取したハイブリドーマをそれぞれ
数十万個、24ウェルプレート（Nunc社製）を用い、マウ
ス胸腺細胞（3 〜4 週令マウス胸腺細胞全体の50分の1
程度の細胞数）存在下で10％牛胎児血清（CSL 社製）を
含む１〜1.5ml RPMI1640培地（日水製薬社製）中で培養
した。その際、ＧＭ2 封入リポソームをＧＭ2 の最終濃
度が500 ng／mlになるように加えて抗原刺激を行なっ
た。対照として、抗原刺激をせずに培養を行ない、FITC
-anti Protein Ａと反応させ、再びフローサイトメトリ
ーに供する操作をそれぞれのハイブリドーマについて15
回繰り返した。この抗原刺激を行わない培養では、FITC
-anti Protein Ａに反応して蛍光強度が増す細胞集団は
出現しなかった。
【００２３】ＧＭ2 封入リポソーム存在下での抗原刺激
のための培養は、37℃、５％ＣＯ2 存在下で６〜７日間
行なった。抗原刺激後、ハイブリドーマが２〜３千万個
まで増加したら、FITC-anti Protein Ａと反応させ、PB
S で洗浄後、6ml のPBS に懸濁してフローサイトメトリ
ーに供し、蛍光強度の強い側にずれている数十万個の細
胞集団を分取した。抗原刺激の培養とフローサイトメト
リーによる分取を３回繰り返した後、抗原刺激を行わな
い培養とフローサイトメトリーによる分取とをハイブリ
ドーマＫＭ−６９６については２回、ハイブリドーマＫ
Ｍ−６９７については３回繰り返した。さらにそれぞれ
について、再び、抗原刺激を行う培養とフローサイトメ
トリーによる分取とを２回繰り返したところ、ハイブリ
ドーマＫＭ−６９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７とも
FITC-anti Protein Ａに反応し、蛍光強度が増加した細
胞集団が出現した。これらの細胞集団をフローサイトメ
トリーで分取し、もう一度抗原刺激を行って培養したと
ころ、ハイブリドーマＫＭ−６９６、ハイブリドーマＫ
Ｍ−６９７ともFITC-anti Protein Ａに反応し、強い蛍
光強度をもつ細胞集団のみになった。図１に、ハイブリ
ドーマＫＭ−６９７のフローサイトメトリーによる測定
パターンを示す。
のための培養は、37℃、５％ＣＯ2 存在下で６〜７日間
行なった。抗原刺激後、ハイブリドーマが２〜３千万個
まで増加したら、FITC-anti Protein Ａと反応させ、PB
S で洗浄後、6ml のPBS に懸濁してフローサイトメトリ
ーに供し、蛍光強度の強い側にずれている数十万個の細
胞集団を分取した。抗原刺激の培養とフローサイトメト
リーによる分取を３回繰り返した後、抗原刺激を行わな
い培養とフローサイトメトリーによる分取とをハイブリ
ドーマＫＭ−６９６については２回、ハイブリドーマＫ
Ｍ−６９７については３回繰り返した。さらにそれぞれ
について、再び、抗原刺激を行う培養とフローサイトメ
トリーによる分取とを２回繰り返したところ、ハイブリ
ドーマＫＭ−６９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７とも
FITC-anti Protein Ａに反応し、蛍光強度が増加した細
胞集団が出現した。これらの細胞集団をフローサイトメ
トリーで分取し、もう一度抗原刺激を行って培養したと
ころ、ハイブリドーマＫＭ−６９６、ハイブリドーマＫ
Ｍ−６９７ともFITC-anti Protein Ａに反応し、強い蛍
光強度をもつ細胞集団のみになった。図１に、ハイブリ
ドーマＫＭ−６９７のフローサイトメトリーによる測定
パターンを示す。
【００２４】（３）クローニングFITC-anti Protein Ａ
に反応し、強い蛍光強度をもつハイブリドーマＫＭ−６
９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７の細胞集団をそれぞ
れ培養し続けると、再び、FITC-anti Protein Ａには反
応しない細胞集団が出現し増加してきた。そこで、FITC
-anti Protein Ａに反応し、強い蛍光強度をもつ細胞集
団のクローニングを行なった。まず、一ウェルに一細胞
または、二ウェルに一細胞になるように細胞を希釈し
て、96ウェルプレートに分注し、約百万個の胸腺細胞を
加えて培養した。約10日間の培養後、培養上清の一部を
とり、以下に示す酵素免疫測定法でＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭクラス
のモノクローナル抗体が生産されているウェルの割合を
調べた。１回目のクローニングでは、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体が生産されているウェルがあったた
め、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が生産されてい
るウェルのハイブリドーマをもう一度、限界希釈法でク
ローニングした。２回目のクローニングでは、ＩｇＭク
ラスのモノクローナル抗体が生産されているウェルがな
くなり、90％以上のウェルにＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体の生産が認められるようになった。最終的にそ
れぞれＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を最もよく生
産しているウェルを選択し、ハイブリドーマＫＭ−６９
７からクラススイッチしたものとしてハイブリドーマＫ
Ｍ−７５０を、ハイブリドーマＫＭ−６９６からクラス
スイッチしたものとしてＫＭ−７９６をそれぞれ得た。
に反応し、強い蛍光強度をもつハイブリドーマＫＭ−６
９６、ハイブリドーマＫＭ−６９７の細胞集団をそれぞ
れ培養し続けると、再び、FITC-anti Protein Ａには反
応しない細胞集団が出現し増加してきた。そこで、FITC
-anti Protein Ａに反応し、強い蛍光強度をもつ細胞集
団のクローニングを行なった。まず、一ウェルに一細胞
または、二ウェルに一細胞になるように細胞を希釈し
て、96ウェルプレートに分注し、約百万個の胸腺細胞を
加えて培養した。約10日間の培養後、培養上清の一部を
とり、以下に示す酵素免疫測定法でＩｇＧクラスのモノ
クローナル抗体が生産されているウェルとＩｇＭクラス
のモノクローナル抗体が生産されているウェルの割合を
調べた。１回目のクローニングでは、ＩｇＭクラスのモ
ノクローナル抗体が生産されているウェルがあったた
め、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体が生産されてい
るウェルのハイブリドーマをもう一度、限界希釈法でク
ローニングした。２回目のクローニングでは、ＩｇＭク
ラスのモノクローナル抗体が生産されているウェルがな
くなり、90％以上のウェルにＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体の生産が認められるようになった。最終的にそ
れぞれＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を最もよく生
産しているウェルを選択し、ハイブリドーマＫＭ−６９
７からクラススイッチしたものとしてハイブリドーマＫ
Ｍ−７５０を、ハイブリドーマＫＭ−６９６からクラス
スイッチしたものとしてＫＭ−７９６をそれぞれ得た。
【００２５】酵素免疫測定法（ELISA 法）２ngのＧＭ2
（ベーリンガー・マンハイム社製）またはその他のガン
グリオシドを５ngのフォスファチジルコリン（シグマ社
製）と2.5ng のコレステロール（シグマ社製）とを含む
２μl のエタノール溶液に溶解した。この溶液20μl ま
たはこの溶液の希釈液20μl を96ウェルマイクロタイタ
ープレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分
注し、風乾後、１％BSA を含むPBS でブロッキングを行
なった。ここにハイブリドーマの培養上清または精製し
たモノクローナル抗体50〜100 μl を加え、一晩、４℃
で反応させた。反応後、各ウェルをPBS で洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスガンマ鎖抗体（フナコシ社
製）またはペルオキシダーゼ標識プロテインＡ（フナコ
シ社製) を50〜100 μl を加え、１〜２時間、室温で反
応させた。PBSで洗浄後、ABTS基質溶液〔2,2 ’−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸) 二アンモニウム550mg を0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.
2) に溶解し、使用直前に過酸化水素１μl ／mlを加え
た溶液〕を50〜100 μl を加えて発色させ、ＯＤ415 を
測定した。
（ベーリンガー・マンハイム社製）またはその他のガン
グリオシドを５ngのフォスファチジルコリン（シグマ社
製）と2.5ng のコレステロール（シグマ社製）とを含む
２μl のエタノール溶液に溶解した。この溶液20μl ま
たはこの溶液の希釈液20μl を96ウェルマイクロタイタ
ープレート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分
注し、風乾後、１％BSA を含むPBS でブロッキングを行
なった。ここにハイブリドーマの培養上清または精製し
たモノクローナル抗体50〜100 μl を加え、一晩、４℃
で反応させた。反応後、各ウェルをPBS で洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗マウスガンマ鎖抗体（フナコシ社
製）またはペルオキシダーゼ標識プロテインＡ（フナコ
シ社製) を50〜100 μl を加え、１〜２時間、室温で反
応させた。PBSで洗浄後、ABTS基質溶液〔2,2 ’−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸) 二アンモニウム550mg を0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.
2) に溶解し、使用直前に過酸化水素１μl ／mlを加え
た溶液〕を50〜100 μl を加えて発色させ、ＯＤ415 を
測定した。
【００２６】（４）モノクローナル抗体の調製ハイブリ
ドーマＫＭ−７５０とハイブリドーマＫＭ−７９６を１
〜２リットルのスピンナー培養装置を用いて３日間培養
し、大量に培養上清を集めた。これをプロテインＡ−セ
ファロース4Bカラム（ファルマシア社製）に通塔後、吸
着したＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を0.1Mクエン
酸緩衝液（pH4.0)で溶出した。溶出液をPBS で透析し、
これを精製モノクローナル抗体とした。精製したモノク
ローナル抗体がＩｇＧクラスであることをＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で確認した。ゲルには、4 〜
15％グラジエントゲル（第一化学社製）を用いた。図２
に、ＫＭ−７５０のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示す。モノクローナル抗体のサブクラス
は、マウスサブクラスタイピングキット（ザイメット社
製）を用いた酵素免疫測定法により、ハイブリドーマＫ
Ｍ−７５０より生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−７
５０、ハイブリドーマＫＭ−７９６より生産されるモノ
クローナル抗体ＫＭ−７９６ともＩｇＧ3 と決定した。
蛋白量は、BCA 試薬（ピアス社製）を用いて測定した。
ドーマＫＭ−７５０とハイブリドーマＫＭ−７９６を１
〜２リットルのスピンナー培養装置を用いて３日間培養
し、大量に培養上清を集めた。これをプロテインＡ−セ
ファロース4Bカラム（ファルマシア社製）に通塔後、吸
着したＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を0.1Mクエン
酸緩衝液（pH4.0)で溶出した。溶出液をPBS で透析し、
これを精製モノクローナル抗体とした。精製したモノク
ローナル抗体がＩｇＧクラスであることをＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で確認した。ゲルには、4 〜
15％グラジエントゲル（第一化学社製）を用いた。図２
に、ＫＭ−７５０のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動の結果を示す。モノクローナル抗体のサブクラス
は、マウスサブクラスタイピングキット（ザイメット社
製）を用いた酵素免疫測定法により、ハイブリドーマＫ
Ｍ−７５０より生産されるモノクローナル抗体ＫＭ−７
５０、ハイブリドーマＫＭ−７９６より生産されるモノ
クローナル抗体ＫＭ−７９６ともＩｇＧ3 と決定した。
蛋白量は、BCA 試薬（ピアス社製）を用いて測定した。
【００２７】（５）モノクローナル抗体の活性測定段階
希釈（0.05〜25μg ／ml) した精製モノクローナル抗体
の20pmol／ウェルＧＭ2 に対する反応性をELISA 法で測
定した。対照として、サケ成長ホルモンに対するモノク
ローナル抗体ＫＭ−７３７（ＩｇＧ3 クラス）のＧＭ2
に対する反応性も測定した。図３に示したように、モノ
クローナル抗体ＫＭ−７５０、モノクローナル抗体ＫＭ
−７９６とも抗体濃度に依存してＧＭ2 に対する高い結
合性が認められたが、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７
には、ＧＭ2 に対する結合性は認められなかった。
希釈（0.05〜25μg ／ml) した精製モノクローナル抗体
の20pmol／ウェルＧＭ2 に対する反応性をELISA 法で測
定した。対照として、サケ成長ホルモンに対するモノク
ローナル抗体ＫＭ−７３７（ＩｇＧ3 クラス）のＧＭ2
に対する反応性も測定した。図３に示したように、モノ
クローナル抗体ＫＭ−７５０、モノクローナル抗体ＫＭ
−７９６とも抗体濃度に依存してＧＭ2 に対する高い結
合性が認められたが、モノクローナル抗体ＫＭ−７３７
には、ＧＭ2 に対する結合性は認められなかった。
【００２８】次に、段階希釈（0.04〜20pmol／ウェル）
したＧＭ2 に対する、10μg ／mlの精製モノクローナル
抗体の反応性をELISA 法で測定した。対照として、モノ
クローナル抗体ＫＭ−７３７の反応性も測定した。図４
に示したように、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０、モ
ノクローナル抗体ＫＭ−７９６とも抗原濃度に依存して
ＧＭ2 に対する高い結合活性が認められたが、モノクロ
ーナル抗体ＫＭ−７３７には、ＧＭ2 に対する結合性は
認められなかった。
したＧＭ2 に対する、10μg ／mlの精製モノクローナル
抗体の反応性をELISA 法で測定した。対照として、モノ
クローナル抗体ＫＭ−７３７の反応性も測定した。図４
に示したように、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０、モ
ノクローナル抗体ＫＭ−７９６とも抗原濃度に依存して
ＧＭ2 に対する高い結合活性が認められたが、モノクロ
ーナル抗体ＫＭ−７３７には、ＧＭ2 に対する結合性は
認められなかった。
【００２９】（６）反応特異性の検討ガングリオシドＧ
Ｍ1 、Ｎ−アセチルＧＭ2 （ベーリンガー・マンハイム
社製）、Ｎ−グリコリルＧＭ2 、Ｎ−アセチルＧＭ3 、
Ｎ−グリコリルＧＭ3 、ＧＤ 1a、ＧＤ1b（ヤトロン社
製）、ＧＤ2 、ＧＤ3 （ヤトロン社製）、ＧＴ1b（フナ
コシ社製）およびＧＱ1b（ヤトロン社製）に対する、モ
ノクローナル抗体ＫＭ−７５０とＫＭ−７９６の反応性
をELISA 法で測定した。ＧＭ1 とＧＤ1aはウシ脳より、
Ｎ−グリコリルＧＭ2 とＮ−グリコリルＧＭ3 はマウス
肝臓より、Ｎ−アセチルＧＭ3 はイヌ赤血球より、ＧＤ
2 は培養細胞株IMR32(ATCC CCL127)よりそれぞれ公知の
方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(J.Biol.Chem.) 263, 10915 (1988)〕に準じて精製し
た。結果を第１表に示す。第１表に示したように、ＫＭ
−７５０はＮ−アセチルＧＭ2 とＮ−グリコリルＧＭ2
のみに反応し、他のガングリオシドには反応しなかっ
た。これは、クラススイッチする前のモノクローナル抗
体ＫＭ−６９７と同じ反応特異性であり、ＩｇＧにクラ
ススイッチした後も反応特異性が変わらないことを示し
ている。また、ＫＭ−７９６はＮ−アセチルＧＭ2 のみ
に反応し、他のガングリオシドには反応しなかった。こ
れは、クラススイッチする前のモノクローナル抗体ＫＭ
−６９６と同じ反応特異性であり、ＫＭ−７９６につい
てもＩｇＧにクラススイッチした後も反応特異性は変わ
らなかった。
Ｍ1 、Ｎ−アセチルＧＭ2 （ベーリンガー・マンハイム
社製）、Ｎ−グリコリルＧＭ2 、Ｎ−アセチルＧＭ3 、
Ｎ−グリコリルＧＭ3 、ＧＤ 1a、ＧＤ1b（ヤトロン社
製）、ＧＤ2 、ＧＤ3 （ヤトロン社製）、ＧＴ1b（フナ
コシ社製）およびＧＱ1b（ヤトロン社製）に対する、モ
ノクローナル抗体ＫＭ−７５０とＫＭ−７９６の反応性
をELISA 法で測定した。ＧＭ1 とＧＤ1aはウシ脳より、
Ｎ−グリコリルＧＭ2 とＮ−グリコリルＧＭ3 はマウス
肝臓より、Ｎ−アセチルＧＭ3 はイヌ赤血球より、ＧＤ
2 は培養細胞株IMR32(ATCC CCL127)よりそれぞれ公知の
方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(J.Biol.Chem.) 263, 10915 (1988)〕に準じて精製し
た。結果を第１表に示す。第１表に示したように、ＫＭ
−７５０はＮ−アセチルＧＭ2 とＮ−グリコリルＧＭ2
のみに反応し、他のガングリオシドには反応しなかっ
た。これは、クラススイッチする前のモノクローナル抗
体ＫＭ−６９７と同じ反応特異性であり、ＩｇＧにクラ
ススイッチした後も反応特異性が変わらないことを示し
ている。また、ＫＭ−７９６はＮ−アセチルＧＭ2 のみ
に反応し、他のガングリオシドには反応しなかった。こ
れは、クラススイッチする前のモノクローナル抗体ＫＭ
−６９６と同じ反応特異性であり、ＫＭ−７９６につい
てもＩｇＧにクラススイッチした後も反応特異性は変わ
らなかった。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【発明の効果】本発明により、ＩｇＭクラスのモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにクラ
ススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの製
造法が提供される。当該ハイブリドーマから生産される
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体は、種々の疾病の治
療に広く利用することができる。
ーナル抗体を生産するハイブリドーマを、ＩｇＧクラス
のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマにクラ
ススイッチさせることを特徴とするハイブリドーマの製
造法が提供される。当該ハイブリドーマから生産される
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体は、種々の疾病の治
療に広く利用することができる。
【図１】ハイブリドーマＫＭ−６９７にFITC-anti Prot
einＡを反応させ、フローサイトメトリーで蛍光強度を
測定した図である。縦軸が細胞数、横軸が蛍光強度を表
し、実線がFITC-anti ProteinＡを反応させたハイブリ
ドーマのパターン、点線がFITC-anti Protein Ａを反応
させないハイブリドーマのパターンをそれぞれ示す。Ａ
は抗原刺激をしていないハイブリドーマＫＭ−６９７の
パターンを、Ｂは５回の抗原刺激をしたハイブリドーマ
ＫＭ−６９７のパターンを、Ｃは６回の抗原刺激をした
ハイブリドーマＫＭ−６９７のパターンをそれぞれ示
す。
einＡを反応させ、フローサイトメトリーで蛍光強度を
測定した図である。縦軸が細胞数、横軸が蛍光強度を表
し、実線がFITC-anti ProteinＡを反応させたハイブリ
ドーマのパターン、点線がFITC-anti Protein Ａを反応
させないハイブリドーマのパターンをそれぞれ示す。Ａ
は抗原刺激をしていないハイブリドーマＫＭ−６９７の
パターンを、Ｂは５回の抗原刺激をしたハイブリドーマ
ＫＭ−６９７のパターンを、Ｃは６回の抗原刺激をした
ハイブリドーマＫＭ−６９７のパターンをそれぞれ示
す。
【図２】精製したモノクローナル抗体ＫＭ−７５０のＳ
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動（４〜15グラジエント
ゲルを使用）のパターンを表した図である。左より、分
子量マーカー、ＩｇＧのスタンダード、ＩｇＭのスタン
ダード、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０の泳動パター
ンをそれぞれ示す。Ａは還元条件で電気泳動を行った図
であり、Ｂは非還元条件で電気泳動を行った図である。
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動（４〜15グラジエント
ゲルを使用）のパターンを表した図である。左より、分
子量マーカー、ＩｇＧのスタンダード、ＩｇＭのスタン
ダード、モノクローナル抗体ＫＭ−７５０の泳動パター
ンをそれぞれ示す。Ａは還元条件で電気泳動を行った図
であり、Ｂは非還元条件で電気泳動を行った図である。
【図３】段階希釈（0.05〜25μg ／ml) した精製モノク
ローナル抗体の20pmol／ウェルのＧＭ2 に対する反応性
を示した図である。□がＫＭ−７５０、○がＫＭ−７９
６、△がＫＭ−７３７の反応性をそれぞれ示す。
ローナル抗体の20pmol／ウェルのＧＭ2 に対する反応性
を示した図である。□がＫＭ−７５０、○がＫＭ−７９
６、△がＫＭ−７３７の反応性をそれぞれ示す。
【図４】段階希釈（0.04〜20pmol／ウェル）したＧＭ2
に対する10μg ／mlの精製モノクローナル抗体の反応性
を示した図である。□がＫＭ−７５０、○がＫＭ−７９
６、△がＫＭ−７３７の反応性をそれぞれ示す。
に対する10μg ／mlの精製モノクローナル抗体の反応性
を示した図である。□がＫＭ−７５０、○がＫＭ−７９
６、△がＫＭ−７３７の反応性をそれぞれ示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．140 ［８］（1988）ｐ．2675−2680 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ｓ，Ｖｏｌ．86［２］（1987）ｐ．247 −254 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 265［14］（1990）ｐ．7880−7885 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．48 ［21］（1988）ｐ．6154−6160 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/02 - 15/07 C12N 5/10 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 ＩｇＭクラスに属するＮ−アセチルＧＭ
2および／またはＮ−グリコリルＧＭ2と反応するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを、当該抗体と
反応する抗原であるＮ−アセチルＧＭ2および／または
Ｎ−グリコリルＧＭ2、および胸腺細胞存在下に培養す
ることを特徴とするＩｇＧクラスに属するＮ−アセチル
ＧＭ2および／またはＮ−グリコリルＧＭ2と反応するモ
ノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの製造法。 - 【請求項２】 ＩｇＭクラスに属するＮ−アセチルＧＭ
2および／またはＮ−グリコリルＧＭ2と反応するモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマが、ハイブリド
ーマＫＭ−６９３、ＫＭ−６９４、ＫＭ−６９５、ＫＭ
−６９６およびＫＭ−６９７から選ばれる請求項１記載
の製造法。 - 【請求項３】 請求項１記載の方法により得られる、Ｉ
ｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ2と反応する
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 請求項１記載の方法により得られる、Ｉ
ｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ2と反応する
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ−７
９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３４０）。 - 【請求項５】 請求項１記載の方法により得られる、Ｉ
ｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ2およびＮ−
グリコリルＧＭ2と反応するモノクローナル抗体を生産
するハイブリドーマ。 - 【請求項６】 請求項１記載の方法により得られる、Ｉ
ｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ2と反応する
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ−７
５０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３９）。 - 【請求項７】 ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチル
ＧＭ2と反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項８】 請求項４記載のハイブリドーマＫＭ−７
９６（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３４０）が生産する、ＩｇＧ
クラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ2と反応するモノ
クローナル抗体ＫＭ−７９６。 - 【請求項９】 ＩｇＧクラスに属し、かつＮ−アセチル
ＧＭ2およびＮ−グリコリルＧＭ2と反応するモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項１０】 請求項６記載のハイブリドーマＫＭ−
７５０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３３９）が生産する、Ｉｇ
Ｇクラスに属し、かつＮ−アセチルＧＭ2およびＮ−グ
リコリルＧＭ2と反応するモノクローナル抗体ＫＭ−７
５０。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07751891A JP3150991B2 (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | ハイブリドーマの製造法 |
| CA 2065681 CA2065681A1 (en) | 1991-04-10 | 1992-04-09 | Method of producing hybridomas |
| EP92106282A EP0508472B1 (en) | 1991-04-10 | 1992-04-10 | Method of producing hybridomas |
| DE1992633122 DE69233122T2 (de) | 1991-04-10 | 1992-04-10 | Verfahren zur Herstellung von Hybridomen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07751891A JP3150991B2 (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | ハイブリドーマの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04311385A JPH04311385A (ja) | 1992-11-04 |
| JP3150991B2 true JP3150991B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=13636190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07751891A Expired - Fee Related JP3150991B2 (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | ハイブリドーマの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0508472B1 (ja) |
| JP (1) | JP3150991B2 (ja) |
| CA (1) | CA2065681A1 (ja) |
| DE (1) | DE69233122T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5830470A (en) * | 1992-09-07 | 1998-11-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Humanized antibodies to ganglioside GM2 |
| WO1996009805A2 (en) * | 1994-09-23 | 1996-04-04 | Zonagen, Inc. | Chitosan induced immunopotentiation |
| US5912000A (en) * | 1994-09-23 | 1999-06-15 | Zonagen, Inc. | Chitosan induced immunopotentiation |
| JPWO2008090960A1 (ja) | 2007-01-24 | 2010-05-20 | 協和発酵キリン株式会社 | ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物 |
| US8999707B2 (en) | 2008-01-28 | 2015-04-07 | Thomas Jefferson University | Method of making hybrid cells that express useful antibodies |
| SG11201504106XA (en) | 2012-12-06 | 2015-07-30 | Univ Kanazawa Nat Univ Corp | Therapeutic method for mesothelioma |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444887A (en) * | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
| JPH0787798B2 (ja) * | 1987-04-27 | 1995-09-27 | コニカ株式会社 | モノクロ−ナル抗体の製造方法 |
| JPH0673471B2 (ja) * | 1985-12-24 | 1994-09-21 | コニカ株式会社 | モノクローナル抗体 |
| SE461985B (sv) * | 1988-09-13 | 1990-04-23 | Bioinvent Int Ab | In vitro immunisering av lymfocytinnehaallande cellpopulationer och materialsats daerfoer |
| JPH02135098A (ja) * | 1988-11-16 | 1990-05-23 | Mect Corp | Ｎ−グリコリル型ｇｍ↓２を認識するモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ |
| JPH041138A (ja) * | 1990-04-13 | 1992-01-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 抗腫瘍剤 |
| WO1991017769A1 (en) * | 1990-05-22 | 1991-11-28 | The Regents Of The University Of California | Novel methods for producing antigen-specific, high-affinity human monoclonal antibodies |
-
1991
- 1991-04-10 JP JP07751891A patent/JP3150991B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-04-09 CA CA 2065681 patent/CA2065681A1/en not_active Abandoned
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