JPH0662850A - ホスホリパーゼａ１ - Google Patents
ホスホリパーゼａ１Info
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- JPH0662850A JPH0662850A JP5143173A JP14317393A JPH0662850A JP H0662850 A JPH0662850 A JP H0662850A JP 5143173 A JP5143173 A JP 5143173A JP 14317393 A JP14317393 A JP 14317393A JP H0662850 A JPH0662850 A JP H0662850A
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- JP
- Japan
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- phospholipase
- enzyme
- activity
- aspergillus
- phospholipid
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 リン脂質の１位のアシル基を選択的に加水分
解し、２−アシル型のリゾリン脂質を生成する作用を有
し、作用至適ｐＨが３．５乃至４．５であり、安定ｐＨ
域が５．５乃至１０．５であり、分子量が37,000であ
り、等電点がpI３．９であるかまたは分子量が35,000で
あり、等電点がpI４．３であるホスホリパーゼＡ１。 【効果】 本発明の酵素は、すぐれたホスホリパーゼ活
性を有し、かつすぐれた選択性を有する。
解し、２−アシル型のリゾリン脂質を生成する作用を有
し、作用至適ｐＨが３．５乃至４．５であり、安定ｐＨ
域が５．５乃至１０．５であり、分子量が37,000であ
り、等電点がpI３．９であるかまたは分子量が35,000で
あり、等電点がpI４．３であるホスホリパーゼＡ１。 【効果】 本発明の酵素は、すぐれたホスホリパーゼ活
性を有し、かつすぐれた選択性を有する。
Description
【０００１】
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明は、リン脂質の１位のアシ
ル基を選択的に加水分解し、２−アシル型のリゾリン脂
質を生成するホスホリパーゼＡ１、特に、アスペルギル
ス(Aspergillus) 属の糸状菌が生産するホスホリパーゼ
Ａ１に関するものである。
ル基を選択的に加水分解し、２−アシル型のリゾリン脂
質を生成するホスホリパーゼＡ１、特に、アスペルギル
ス(Aspergillus) 属の糸状菌が生産するホスホリパーゼ
Ａ１に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】レシチンは界面活性作用、酸化防止作
用、生理活性作用等を有するリン脂質で、食品工業用、
飼料用、医薬品用と幅広く使用されている。レシチンの
界面活性作用は、他の食品界面活性剤に比べ、乳化安定
性に劣るため、酵素分解を用いて、乳化安定性を改善す
る研究がなされている。リゾリン脂質は、リン脂質のグ
リセリン残基にエステル結合した脂肪酸の一部を加水分
解して得られる部分分解リン脂質であり、リン脂質に比
べて水溶性が増すことに伴い、乳化性が増強し、乳化力
を発揮する温度領域が拡大して、油または水系のいずれ
に添加しても乳化力を発揮すること、カルシウム、マグ
ネシウム等の金属イオンが高濃度で共存しても乳化力が
低下しないこと、酸性下での乳化安定性が良いこと等の
特性が付与されると報告されている。
用、生理活性作用等を有するリン脂質で、食品工業用、
飼料用、医薬品用と幅広く使用されている。レシチンの
界面活性作用は、他の食品界面活性剤に比べ、乳化安定
性に劣るため、酵素分解を用いて、乳化安定性を改善す
る研究がなされている。リゾリン脂質は、リン脂質のグ
リセリン残基にエステル結合した脂肪酸の一部を加水分
解して得られる部分分解リン脂質であり、リン脂質に比
べて水溶性が増すことに伴い、乳化性が増強し、乳化力
を発揮する温度領域が拡大して、油または水系のいずれ
に添加しても乳化力を発揮すること、カルシウム、マグ
ネシウム等の金属イオンが高濃度で共存しても乳化力が
低下しないこと、酸性下での乳化安定性が良いこと等の
特性が付与されると報告されている。
【０００４】現在、酵素を利用してリン脂質を分解した
リゾリン脂質が市販されているが、これはブタ膵臓から
調製された酵素剤パンクレアチンに含まれるホスホリパ
ーゼＡ２活性を用いたものであり、この酵素剤には臓器
特有の臭みがあったり、供給量に制限があり価格が高い
こと等が問題とされ、パンクレアチンに代わるホスホリ
パーゼＡの給源が求められている。また、既に幾つかの
微生物が生産するホスホリパーゼＡ（特開昭58-212783
号公報）やリパーゼ類（特開昭63- 42691 号公報）を利
用したリン脂質の分解方法が示され、また、「酵素の宝
庫」と呼ばれている麹カビ、アスペルギルス・オリゼ(A
spergillus oryzae)起源のタカヂアスターゼ（登録商
標）にも、古くから、リン脂質分解活性を含むリパーゼ
の存在が知られていた（Biochem. Z., 261,275(1933))
が、これらの酵素を用いる方法は、酵素活性がパンクレ
アチンに比べて低かったり、基質特異性に劣る酵素を利
用した場合には、リゾリン脂質の収量が悪化したり、副
生物の共存によるリゾリン脂質の品質の低下を招く等の
欠点がある。 従って、上記の問題点、欠点を克服する
ため、優れた活性及び選択性を有し、安価に定常的に供
給できる酵素の開発が望まれている。
リゾリン脂質が市販されているが、これはブタ膵臓から
調製された酵素剤パンクレアチンに含まれるホスホリパ
ーゼＡ２活性を用いたものであり、この酵素剤には臓器
特有の臭みがあったり、供給量に制限があり価格が高い
こと等が問題とされ、パンクレアチンに代わるホスホリ
パーゼＡの給源が求められている。また、既に幾つかの
微生物が生産するホスホリパーゼＡ（特開昭58-212783
号公報）やリパーゼ類（特開昭63- 42691 号公報）を利
用したリン脂質の分解方法が示され、また、「酵素の宝
庫」と呼ばれている麹カビ、アスペルギルス・オリゼ(A
spergillus oryzae)起源のタカヂアスターゼ（登録商
標）にも、古くから、リン脂質分解活性を含むリパーゼ
の存在が知られていた（Biochem. Z., 261,275(1933))
が、これらの酵素を用いる方法は、酵素活性がパンクレ
アチンに比べて低かったり、基質特異性に劣る酵素を利
用した場合には、リゾリン脂質の収量が悪化したり、副
生物の共存によるリゾリン脂質の品質の低下を招く等の
欠点がある。 従って、上記の問題点、欠点を克服する
ため、優れた活性及び選択性を有し、安価に定常的に供
給できる酵素の開発が望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、長年に
亘り、ホスホリパーゼを生産する微生物及びホスホリパ
ーゼについて、鋭意検討を行い、アスペルギルス(Asper
gillus) 属の糸状菌が生産する酵素を単離精製して、す
ぐれた活性及び選択性を有する高度に精製されたホスホ
リパーゼＡ１を見出して、本発明を完成させた。
亘り、ホスホリパーゼを生産する微生物及びホスホリパ
ーゼについて、鋭意検討を行い、アスペルギルス(Asper
gillus) 属の糸状菌が生産する酵素を単離精製して、す
ぐれた活性及び選択性を有する高度に精製されたホスホ
リパーゼＡ１を見出して、本発明を完成させた。
【０００６】
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のホスホリパーゼ
Ａ１は、分子量が37,000であり、等電点がpI３．９であ
る酵素蛋白（ホスホリパーゼＡ１ａ）および分子量が3
5,000であり、等電点がpI４．３である酵素蛋白（ホス
ホリパーゼＡ１ｂ）であり、何れも、次の特性を有す
る。
Ａ１は、分子量が37,000であり、等電点がpI３．９であ
る酵素蛋白（ホスホリパーゼＡ１ａ）および分子量が3
5,000であり、等電点がpI４．３である酵素蛋白（ホス
ホリパーゼＡ１ｂ）であり、何れも、次の特性を有す
る。
【０００８】１．作用および基質特異性 本酵素は、リン脂質の１位のアシル基のみを加水分解
し、その作用形式は、ホスホリパーゼＡ１（酵素番号EC
3.1.1.32）に属する。
し、その作用形式は、ホスホリパーゼＡ１（酵素番号EC
3.1.1.32）に属する。
【０００９】２．至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは、通常の活性測定系（トライトンＸ
−１００の存在下、３７℃で１０分間反応）では、３．
５乃至４．５であり、最高の活性は、およそｐＨ４で得
られる（図１参照）。また、トライトンＸ−１００を含
まない活性測定系（３７℃で１０分間反応）では、至適
ｐＨは、４．５乃至５．５である（図２参照）。
−１００の存在下、３７℃で１０分間反応）では、３．
５乃至４．５であり、最高の活性は、およそｐＨ４で得
られる（図１参照）。また、トライトンＸ−１００を含
まない活性測定系（３７℃で１０分間反応）では、至適
ｐＨは、４．５乃至５．５である（図２参照）。
【００１０】３．安定なｐＨ領域 本酵素の安定なｐＨ領域は、酵素それ自身の濃度、共存
する物質の種類や濃度等の影響を受け、変化する。すな
わち、約１０単位／ｍｌの酵素溶液の安定なｐＨ領域
は、３３ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液中では、ｐＨ
５．５以上であり、３３ｍＭグリシン・食塩ー水酸化ナ
トリウム緩衝液中では、ｐＨ１０．５以下である（図３
参照）。
する物質の種類や濃度等の影響を受け、変化する。すな
わち、約１０単位／ｍｌの酵素溶液の安定なｐＨ領域
は、３３ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液中では、ｐＨ
５．５以上であり、３３ｍＭグリシン・食塩ー水酸化ナ
トリウム緩衝液中では、ｐＨ１０．５以下である（図３
参照）。
【００１１】４．力価の測定法 ホスホリパーゼ活性試験 2.0(w/v)% ＳＬＰーホワイト（ツルーレシチン工業
（株）製）および4(v/v)%トライトン(Triton)Ｘ−100
水溶液0.5ml に0.1 Ｍ塩化カルシウム0.05mlと0.2Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）0.25mlを加える。次いで、酵素
液0.1ml を加えて、撹拌して均一にして、３７℃で静置
し、１０分間酵素反応を行う。その後、1 Ｎ塩酸0.1ml
を加えて、酵素反応を停止させる。反応液0.02mlを採
り、遊離脂肪酸定量試薬デタミナＮＥＦＡ（協和メデッ
クス（株）製）を用いて、遊離脂肪酸を定量する。酵素
反応１分間当り１μmol の脂肪酸を生成する酵素活性を
１単位とする。
（株）製）および4(v/v)%トライトン(Triton)Ｘ−100
水溶液0.5ml に0.1 Ｍ塩化カルシウム0.05mlと0.2Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）0.25mlを加える。次いで、酵素
液0.1ml を加えて、撹拌して均一にして、３７℃で静置
し、１０分間酵素反応を行う。その後、1 Ｎ塩酸0.1ml
を加えて、酵素反応を停止させる。反応液0.02mlを採
り、遊離脂肪酸定量試薬デタミナＮＥＦＡ（協和メデッ
クス（株）製）を用いて、遊離脂肪酸を定量する。酵素
反応１分間当り１μmol の脂肪酸を生成する酵素活性を
１単位とする。
【００１２】５．作用適温の範囲 本酵素は、３０℃乃至６５℃で作用を有し、至適温度
は、５０℃乃至６０℃であり、５５℃付近で酵素の最大
活性を示す（図４参照）。
は、５０℃乃至６０℃であり、５５℃付近で酵素の最大
活性を示す（図４参照）。
【００１３】６．阻害、活性化及び安定化 本酵素は、水銀、鉛、鉄等の金属多価イオンによる阻害
は特に認められない。またエチレンジアミン４酢酸(EDT
A)による活性の変化も認められない。
は特に認められない。またエチレンジアミン４酢酸(EDT
A)による活性の変化も認められない。
【００１４】７．精製方法 アスペルギルス(Aspergillus) 属の糸状菌のふすま麹培
養抽出液に、攪拌しながら、冷却アセトンを終濃度６０
乃至８０(v/v)%になるように加え、しばらく放置して、
遠心分離して、沈殿を収得する。また、アセトンの代わ
りにエタノールを使用しても、同様に沈殿が得られる。
この沈殿を５０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、
硫酸アンモニウムで塩析し、遠心分離して、沈殿を分離
する。得られた沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０
mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、不溶物を濾別し
た後、カラムクロマトグラフィー［カラム：ブチルトヨ
パールパック６５０Ｓ(Butyl-Toyopearl Pak 650S)、東
ソー社製、流出溶剤：硫酸アンモニウム含有５０mM酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）］を用いて、精製する。得られた
半精製酵素を２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で透析し
た後、カラムクロマトグラフィー［カラム：Ｑーセファ
ロース（Ｑ-Sepharose）、ファルマシア社製、流出溶
剤：食塩含有２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）］を用い
て、精製し、ホスホリパーゼＡ１を得る。さらに、これ
を硫酸アンモニウムで塩析し、ゲル濾過［カラム：スー
パーロース１２（Superose 12 ）、ファルマシア社製］
をした後、カラムクロマトグラフィー［カラム：モノＱ
（MonoＱ）、ファルマシア社製、流出溶剤：食塩含有２
０mM酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）］を用いて、精製し、酵
素蛋白ホスホリパーゼＡ１ａ及びＡ１ｂを得る。
養抽出液に、攪拌しながら、冷却アセトンを終濃度６０
乃至８０(v/v)%になるように加え、しばらく放置して、
遠心分離して、沈殿を収得する。また、アセトンの代わ
りにエタノールを使用しても、同様に沈殿が得られる。
この沈殿を５０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、
硫酸アンモニウムで塩析し、遠心分離して、沈殿を分離
する。得られた沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０
mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶かし、不溶物を濾別し
た後、カラムクロマトグラフィー［カラム：ブチルトヨ
パールパック６５０Ｓ(Butyl-Toyopearl Pak 650S)、東
ソー社製、流出溶剤：硫酸アンモニウム含有５０mM酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）］を用いて、精製する。得られた
半精製酵素を２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で透析し
た後、カラムクロマトグラフィー［カラム：Ｑーセファ
ロース（Ｑ-Sepharose）、ファルマシア社製、流出溶
剤：食塩含有２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）］を用い
て、精製し、ホスホリパーゼＡ１を得る。さらに、これ
を硫酸アンモニウムで塩析し、ゲル濾過［カラム：スー
パーロース１２（Superose 12 ）、ファルマシア社製］
をした後、カラムクロマトグラフィー［カラム：モノＱ
（MonoＱ）、ファルマシア社製、流出溶剤：食塩含有２
０mM酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）］を用いて、精製し、酵
素蛋白ホスホリパーゼＡ１ａ及びＡ１ｂを得る。
【００１５】９．分子量 本酵素の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法［K. Weber et al.,
J. Biol. Chem., 244, 4406(1969)］により測定され、
ホスホリパーゼＡ１ａ及びＡ１ｂの値は、それぞれ、3
7,000及び35,0000である。また、本酵素の等電点は、等
電点電気泳動法により測定され、ホスホリパーゼＡ１ａ
及びＡ１ｂの値は、それぞれ、、ｐＩ３．９及びｐＩ
４．３である。
リアクリルアミドゲル電気泳動法［K. Weber et al.,
J. Biol. Chem., 244, 4406(1969)］により測定され、
ホスホリパーゼＡ１ａ及びＡ１ｂの値は、それぞれ、3
7,000及び35,0000である。また、本酵素の等電点は、等
電点電気泳動法により測定され、ホスホリパーゼＡ１ａ
及びＡ１ｂの値は、それぞれ、、ｐＩ３．９及びｐＩ
４．３である。
【００１６】１０．結晶構造 本酵素は、結晶状に得られていないため、その結晶構造
は決定できない。
は決定できない。
【００１７】本発明のホスホリパーゼＡ１を生産する生
産菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ(Asper
gillus oryzae:例えば、SANK-11870、IFO-30102 等) 、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger：例え
ば、IFO-4407、ATCC-9642 等)、アスペルギルス・ウサ
ミイ（Aspergillus usamii：例えば、IFO-6082、IAM-24
14等) 、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awam
ori : 例えば、IFO-4033、IAM-2112等) 、アスペルギル
ス・フミガータス（Aspergillus fumigatus：例えば、
IAM-2034等) 、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillu
s sojae：例えば、IAM-2666等) 、アスペルギルス・フ
ォエニキス（Aspergillus phoenicis：例えば、IAM-22
15等) 、アスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus w
entii ：例えば、IAM-2133等) のようなアスペルギルス
属に属する糸状菌があげられ、好適には、アスペルギル
ス・オリゼである。 上記糸状菌は、いずれも、公知菌
（例えば、特公昭46-32792号公報、J. Gen. Appl. Micr
obiol., 17, 281(1971)、 Biochem. Z., 261 275(1933)
等）であり、財団法人発酵研究所(Institute for Ferme
ntation Osaka:IFO)等の保存機関にそれぞれの番号で保
存され、自由に分譲を受けることができる。また、SANK
-11870は、微工研条寄第3887号(FERM BP-3887)として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。ま
た、これらの菌株は、天然の元株のほか、その人工変異
株をも含む。
産菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ(Asper
gillus oryzae:例えば、SANK-11870、IFO-30102 等) 、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger：例え
ば、IFO-4407、ATCC-9642 等)、アスペルギルス・ウサ
ミイ（Aspergillus usamii：例えば、IFO-6082、IAM-24
14等) 、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awam
ori : 例えば、IFO-4033、IAM-2112等) 、アスペルギル
ス・フミガータス（Aspergillus fumigatus：例えば、
IAM-2034等) 、アスペルギルス・ソジャエ（Aspergillu
s sojae：例えば、IAM-2666等) 、アスペルギルス・フ
ォエニキス（Aspergillus phoenicis：例えば、IAM-22
15等) 、アスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus w
entii ：例えば、IAM-2133等) のようなアスペルギルス
属に属する糸状菌があげられ、好適には、アスペルギル
ス・オリゼである。 上記糸状菌は、いずれも、公知菌
（例えば、特公昭46-32792号公報、J. Gen. Appl. Micr
obiol., 17, 281(1971)、 Biochem. Z., 261 275(1933)
等）であり、財団法人発酵研究所(Institute for Ferme
ntation Osaka:IFO)等の保存機関にそれぞれの番号で保
存され、自由に分譲を受けることができる。また、SANK
-11870は、微工研条寄第3887号(FERM BP-3887)として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。ま
た、これらの菌株は、天然の元株のほか、その人工変異
株をも含む。
【００１８】菌株の培養は、ふすまに、水を０．５乃至
２倍重量（好適には、等量）加えて、蒸煮して得た固体
培地に種菌を接種して、麹式培養法で行う。培地原料と
しては、ふすまの他に、穀類（例えば、米、麦等）、各
種雑穀類（例えば、とうもろこし、大豆、ごま等）、綿
実かす等を単独または組み合わせて用いることもでき
る。
２倍重量（好適には、等量）加えて、蒸煮して得た固体
培地に種菌を接種して、麹式培養法で行う。培地原料と
しては、ふすまの他に、穀類（例えば、米、麦等）、各
種雑穀類（例えば、とうもろこし、大豆、ごま等）、綿
実かす等を単独または組み合わせて用いることもでき
る。
【００１９】培養温度は、１０℃乃至４０℃（好適に
は、２０℃乃至３２℃）であり、培養時間は、培地組
成、培養温度等により異なるが、通常３日乃至２０日間
（好適には、４日乃至８日間）である。培養終了後、麹
に水又は適当な緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液、リン酸
塩緩衝液等）を１乃至２０倍重量加え、よく攪拌した
後、圧搾濾過して、酵素液を得ることができる。さら
に、酵素を採取精製するための常法、例えば、塩析法、
有機溶媒沈澱法、イオン交換体等を吸着体として用いる
吸着法、限外濾過法、真空乾燥法等を単独でまたは適宜
組合せて用いることにより、上記酵素液から本発明の酵
素が採取され、単離精製される。
は、２０℃乃至３２℃）であり、培養時間は、培地組
成、培養温度等により異なるが、通常３日乃至２０日間
（好適には、４日乃至８日間）である。培養終了後、麹
に水又は適当な緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液、リン酸
塩緩衝液等）を１乃至２０倍重量加え、よく攪拌した
後、圧搾濾過して、酵素液を得ることができる。さら
に、酵素を採取精製するための常法、例えば、塩析法、
有機溶媒沈澱法、イオン交換体等を吸着体として用いる
吸着法、限外濾過法、真空乾燥法等を単独でまたは適宜
組合せて用いることにより、上記酵素液から本発明の酵
素が採取され、単離精製される。
【００２０】
【発明の効果】本発明のホスホリパーゼＡ１は、すぐれ
た活性及び選択性を有し、微生物由来の安価に定常的に
供給できる酵素であり、極めて有用なホスホリパーゼで
ある。本酵素を用いてリン脂質を分解させる酵素反応
は、酵素と基質を、水性媒体中または湿潤状態で、接触
させることにより行われる。使用される基質は、例え
ば、小麦粉、大豆、卵黄等のレシチンであり、その濃度
は、好適には、１乃至５０重量％である。使用する水
は、井水、水道水がそのまま使えるが、より効率的な酵
素反応のため、酸（例えば酢酸）、アルカリ（例えば、
水酸化ナトリウム）あるいは緩衝液（例えば、酢酸緩衝
液）を加えて、ｐＨを３乃至７（特に好適には、３．５
乃至５．５）に調整して用いることもできる。反応温度
は、１０℃乃至７０℃（好適には、２０℃乃至６５℃、
特に好適には、約３０℃乃至６０℃）であり、反応に要
する時間は、基質、反応温度、ｐＨ等により異なるが、
通常１０分間乃至１０日間（好適には、１時間乃至２日
間）である。酵素反応終了後、得られたリゾリン脂質
は、分離することなく直接加工処理に使用できる。ま
た、常法により不溶物を濾別し、直接使用するか、濃縮
により適当なリゾリン脂質液を得ることもできる。さら
に、必要に応じて、水を加えて、水不混和性有機溶剤で
抽出し、抽出溶剤を留去することにより得ることもでき
る。また、必要に応じて、常法、例えば、カラムクロマ
トグラフィー、再結晶法等によりさらに精製することも
できる。
た活性及び選択性を有し、微生物由来の安価に定常的に
供給できる酵素であり、極めて有用なホスホリパーゼで
ある。本酵素を用いてリン脂質を分解させる酵素反応
は、酵素と基質を、水性媒体中または湿潤状態で、接触
させることにより行われる。使用される基質は、例え
ば、小麦粉、大豆、卵黄等のレシチンであり、その濃度
は、好適には、１乃至５０重量％である。使用する水
は、井水、水道水がそのまま使えるが、より効率的な酵
素反応のため、酸（例えば酢酸）、アルカリ（例えば、
水酸化ナトリウム）あるいは緩衝液（例えば、酢酸緩衝
液）を加えて、ｐＨを３乃至７（特に好適には、３．５
乃至５．５）に調整して用いることもできる。反応温度
は、１０℃乃至７０℃（好適には、２０℃乃至６５℃、
特に好適には、約３０℃乃至６０℃）であり、反応に要
する時間は、基質、反応温度、ｐＨ等により異なるが、
通常１０分間乃至１０日間（好適には、１時間乃至２日
間）である。酵素反応終了後、得られたリゾリン脂質
は、分離することなく直接加工処理に使用できる。ま
た、常法により不溶物を濾別し、直接使用するか、濃縮
により適当なリゾリン脂質液を得ることもできる。さら
に、必要に応じて、水を加えて、水不混和性有機溶剤で
抽出し、抽出溶剤を留去することにより得ることもでき
る。また、必要に応じて、常法、例えば、カラムクロマ
トグラフィー、再結晶法等によりさらに精製することも
できる。
【００２１】次に実施例をあげて、本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明は、これらに限定されるもので
はない。
的に説明するが、本発明は、これらに限定されるもので
はない。
【００２２】
実施例１粗ホスホリパーゼＡ アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae ）ＳＡＮ
Ｋ11870 株を、ふすまと水の等量混合物からなる培地１
２ｇで、３０℃にて６日間培養し、次いで、前培養した
全菌株を、ふすまと水の等量混合物６００ｇを金属皿
（４２ｘ２４ｘ７（深さ）ｃｍ）に入れ、１２０℃にて
３０分間蒸煮した培地に植菌し、３０℃にて１５時間、
さらに１９℃にて５日間培養した。こうして調製した麹
に水３ｌを加え、よく混合し、３７℃にて２時間放置し
た後、濾過して、ホスホリパーゼＡ力価５．９単位／ｍ
ｌの酵素抽出液２．８７ｌを得た。この酵素抽出液に酢
酸を加え、ｐＨを４．０に調整し、冷却したアセトンを
３倍量加え、冷所に一夜放置した。その後上澄を捨て、
沈殿部をアセトンで良く洗い、真空乾燥して、ホスホリ
パーゼＡ力価１１７０単位／ｇの粗酵素末１１．１ｇを
得た。
Ｋ11870 株を、ふすまと水の等量混合物からなる培地１
２ｇで、３０℃にて６日間培養し、次いで、前培養した
全菌株を、ふすまと水の等量混合物６００ｇを金属皿
（４２ｘ２４ｘ７（深さ）ｃｍ）に入れ、１２０℃にて
３０分間蒸煮した培地に植菌し、３０℃にて１５時間、
さらに１９℃にて５日間培養した。こうして調製した麹
に水３ｌを加え、よく混合し、３７℃にて２時間放置し
た後、濾過して、ホスホリパーゼＡ力価５．９単位／ｍ
ｌの酵素抽出液２．８７ｌを得た。この酵素抽出液に酢
酸を加え、ｐＨを４．０に調整し、冷却したアセトンを
３倍量加え、冷所に一夜放置した。その後上澄を捨て、
沈殿部をアセトンで良く洗い、真空乾燥して、ホスホリ
パーゼＡ力価１１７０単位／ｇの粗酵素末１１．１ｇを
得た。
【００２３】実施例２ホスホリパーゼＡ１ａ及びＡ１ｂ 実施例１で得られた粗ホスホリパーゼＡ１０ｇを水約１
００ｍｌに溶かし、1N酢酸を加えて、ｐＨ４．０に調整
し、水を加えて２００ｍｌとした後、２００ｍｌの冷ア
セトンを加えて混合し、1 時間放置した。その後、混合
液を遠心分離して、第一沈殿を得た。この沈殿は、アミ
ラーゼ活性、一部のプロテアーゼおよび３２０単位のホ
スホリパーゼＡ活性を有していた。上澄液に６００ｍｌ
の冷アセトンを加えて混合し、1 時間放置した。その
後、混合液を遠心分離して、第二沈殿を５ｇ得た。この
沈殿は、7,800 単位のホスホリパーゼＡ活性を有してい
た。
００ｍｌに溶かし、1N酢酸を加えて、ｐＨ４．０に調整
し、水を加えて２００ｍｌとした後、２００ｍｌの冷ア
セトンを加えて混合し、1 時間放置した。その後、混合
液を遠心分離して、第一沈殿を得た。この沈殿は、アミ
ラーゼ活性、一部のプロテアーゼおよび３２０単位のホ
スホリパーゼＡ活性を有していた。上澄液に６００ｍｌ
の冷アセトンを加えて混合し、1 時間放置した。その
後、混合液を遠心分離して、第二沈殿を５ｇ得た。この
沈殿は、7,800 単位のホスホリパーゼＡ活性を有してい
た。
【００２４】第二沈殿を５０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．
５）５００ｍｌに溶かし、硫酸アンモニウム300gを加え
て、塩析した。遠心分離して得た沈殿を１Ｍ硫酸アンモ
ニウムを含む５０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶か
し、不溶物を濾別した後、カラムクロマトグラフィー
［カラム：ブチルトヨパールパック６５０Ｓ(Butyl-Toy
opearl Pak 650S) 、東ソー社製、流出溶剤：硫酸アン
モニウム含有５０mM酢酸緩衝液、硫酸アンモニウム濃
度，１〜０Ｍ；グラジェント溶出］を実施した。アミラ
ーゼおよびプロテアーゼを含まないホスホリパーゼＡ活
性画分は、硫酸アンモニウム濃度０．６Ｍ以下で溶出し
た。このホスホリパーゼＡ活性画分を２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で透析した後、カラムクロマトグラフィ
ー［カラム：Ｑーセファロース（Ｑ- Sepharose)、ファ
ルマシア社製、流出溶剤：食塩含有２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、食塩濃度，０〜０．５Ｍ；グラジェン
ト溶出］を用いて精製し、ホスホリパーゼＡ１画分4,00
0 単位を得た。なお、このホスホリパーゼＡ１を２位の
パルミトイル基が14Ｃ標識されたＬ−α−ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（L-α-di-palmitoyl-phosphat
idylcholine 、ＤｕＰｏｎｄ／ＮＥＮ社製 NEC-764 ）
及び１，２位のパルミトイル基が14Ｃ標識されたＬ−α
−ジパルミトイルホスファチジルコリン（NEC-682 ）に
作用させた。その結果、１，２位のパルミトイル基が14
Ｃ標識されたホスファチジルコリンからのみ14Ｃ標識さ
れたパルミチン酸が遊離し、この酵素が１−アシル基の
みに作用することを確認した。
５）５００ｍｌに溶かし、硫酸アンモニウム300gを加え
て、塩析した。遠心分離して得た沈殿を１Ｍ硫酸アンモ
ニウムを含む５０mM酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶か
し、不溶物を濾別した後、カラムクロマトグラフィー
［カラム：ブチルトヨパールパック６５０Ｓ(Butyl-Toy
opearl Pak 650S) 、東ソー社製、流出溶剤：硫酸アン
モニウム含有５０mM酢酸緩衝液、硫酸アンモニウム濃
度，１〜０Ｍ；グラジェント溶出］を実施した。アミラ
ーゼおよびプロテアーゼを含まないホスホリパーゼＡ活
性画分は、硫酸アンモニウム濃度０．６Ｍ以下で溶出し
た。このホスホリパーゼＡ活性画分を２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で透析した後、カラムクロマトグラフィ
ー［カラム：Ｑーセファロース（Ｑ- Sepharose)、ファ
ルマシア社製、流出溶剤：食塩含有２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、食塩濃度，０〜０．５Ｍ；グラジェン
ト溶出］を用いて精製し、ホスホリパーゼＡ１画分4,00
0 単位を得た。なお、このホスホリパーゼＡ１を２位の
パルミトイル基が14Ｃ標識されたＬ−α−ジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（L-α-di-palmitoyl-phosphat
idylcholine 、ＤｕＰｏｎｄ／ＮＥＮ社製 NEC-764 ）
及び１，２位のパルミトイル基が14Ｃ標識されたＬ−α
−ジパルミトイルホスファチジルコリン（NEC-682 ）に
作用させた。その結果、１，２位のパルミトイル基が14
Ｃ標識されたホスファチジルコリンからのみ14Ｃ標識さ
れたパルミチン酸が遊離し、この酵素が１−アシル基の
みに作用することを確認した。
【００２５】上記ホスホリパーゼＡ１に、硫酸アンモニ
ウムを加えて、塩析し、ゲル濾過［カラム：スーパーロ
ース１２（Superose 12)、ファルマシア社製、流出溶
剤：２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）］をした後、カラ
ムクロマトグラフィー［カラム：モノＱ（MonoＱ）、フ
ァルマシア社製、流出溶剤：食塩含有２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）、食塩濃度，０〜０．２５Ｍ；グラジェ
ント溶出］により、目的とするホスホリパーゼＡ１ａ８
８０単位及びＡ１ｂ2,400 単位を得た。
ウムを加えて、塩析し、ゲル濾過［カラム：スーパーロ
ース１２（Superose 12)、ファルマシア社製、流出溶
剤：２０mM酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）］をした後、カラ
ムクロマトグラフィー［カラム：モノＱ（MonoＱ）、フ
ァルマシア社製、流出溶剤：食塩含有２０mM酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）、食塩濃度，０〜０．２５Ｍ；グラジェ
ント溶出］により、目的とするホスホリパーゼＡ１ａ８
８０単位及びＡ１ｂ2,400 単位を得た。
【００２６】ホスホリパーゼＡ１ａ 分子量：37,000（ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法による）。 等電点：ｐＩ３．９（等電点電気泳動法による）。 作用至適ｐＨ：ｐＨ３．５乃至４．５（トライトンＸ−
１００存在下）またはｐＨ４．５乃至５．５（トライト
ンＸ−１００不存在下）［ｐＨと酵素活性の関係（ｐＨ
活性曲線）を図１（トライトンＸ−１００存在下）及び
図２（トライトンＸ−１００不存在下）に示す。］。 安定ｐＨ域：ｐＨ５．５以上（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液
中）またはｐＨ１０．５以下（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭグリシン・食塩ー水酸化ナトリ
ウム緩衝液中）［酵素を３７℃で１時間前処理した後の
残存酵素活性と前処理ｐＨの関係（酵素のｐＨ安定性；
ｐＨ３．２−６．０：酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ ５．５−８．５：第一リン酸カリウム・第二リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ ８．０−１２．５：グリシン・食塩ー水酸化ナトリウム
緩衝液）を図３に示す。］。 至適温度：５０℃乃至６０℃［温度と酵素活性との関係
（温度活性曲線）を図４に示す。］。
アクリルアミドゲル電気泳動法による）。 等電点：ｐＩ３．９（等電点電気泳動法による）。 作用至適ｐＨ：ｐＨ３．５乃至４．５（トライトンＸ−
１００存在下）またはｐＨ４．５乃至５．５（トライト
ンＸ−１００不存在下）［ｐＨと酵素活性の関係（ｐＨ
活性曲線）を図１（トライトンＸ−１００存在下）及び
図２（トライトンＸ−１００不存在下）に示す。］。 安定ｐＨ域：ｐＨ５．５以上（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液
中）またはｐＨ１０．５以下（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭグリシン・食塩ー水酸化ナトリ
ウム緩衝液中）［酵素を３７℃で１時間前処理した後の
残存酵素活性と前処理ｐＨの関係（酵素のｐＨ安定性；
ｐＨ３．２−６．０：酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ ５．５−８．５：第一リン酸カリウム・第二リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ ８．０−１２．５：グリシン・食塩ー水酸化ナトリウム
緩衝液）を図３に示す。］。 至適温度：５０℃乃至６０℃［温度と酵素活性との関係
（温度活性曲線）を図４に示す。］。
【００２７】ホスホリパーゼＡ１ｂ 分子量：35,000（ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法による）。 等電点：ｐＩ４．３（等電点電気泳動法による）。 作用至適ｐＨ：ｐＨ３．５乃至４．５（トライトンＸ−
１００存在下）またはｐＨ４．５乃至５．５（トライト
ンＸ−１００不存在下）［ｐＨと酵素活性の関係（ｐＨ
活性曲線）を図１（トライトンＸ−１００存在下）及び
図２（トライトンＸ−１００不存在下）に示す。］。 安定ｐＨ域：ｐＨ５．５以上（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液
中）またはｐＨ１０．５以下（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭグリシン・食塩ー水酸化ナトリ
ウム緩衝液中）［酵素を３７℃で１時間前処理した後の
残存酵素活性と前処理ｐＨの関係（酵素のｐＨ安定性；
ｐＨ３．２−６．０：酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ ５．５−８．５：第一リン酸カリウム・第二リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ ８．０−１２．５：グリシン・食塩ー水酸化ナトリウム
緩衝液）を図３に示す。］。 至適温度：５０℃乃至６０℃［温度と酵素活性との関係
（温度活性曲線）を図４に示す。］。
アクリルアミドゲル電気泳動法による）。 等電点：ｐＩ４．３（等電点電気泳動法による）。 作用至適ｐＨ：ｐＨ３．５乃至４．５（トライトンＸ−
１００存在下）またはｐＨ４．５乃至５．５（トライト
ンＸ−１００不存在下）［ｐＨと酵素活性の関係（ｐＨ
活性曲線）を図１（トライトンＸ−１００存在下）及び
図２（トライトンＸ−１００不存在下）に示す。］。 安定ｐＨ域：ｐＨ５．５以上（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液
中）またはｐＨ１０．５以下（約１０単位／ｍｌの酵素
溶液について、３３ｍＭグリシン・食塩ー水酸化ナトリ
ウム緩衝液中）［酵素を３７℃で１時間前処理した後の
残存酵素活性と前処理ｐＨの関係（酵素のｐＨ安定性；
ｐＨ３．２−６．０：酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ ５．５−８．５：第一リン酸カリウム・第二リン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ ８．０−１２．５：グリシン・食塩ー水酸化ナトリウム
緩衝液）を図３に示す。］。 至適温度：５０℃乃至６０℃［温度と酵素活性との関係
（温度活性曲線）を図４に示す。］。
【００２８】
【外１】
【００２９】
【図１】本発明の酵素のｐＨ活性曲線（トライトンＸ−
１００存在下）
１００存在下）
【図２】本発明の酵素のｐＨ活性曲線（トライトンＸ−
１００不存在下）
１００不存在下）
【図３】本発明の酵素のｐＨ安定性（ｐＨ３．２−６．
０：酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５−８．
５：第一リン酸カリウム・第二リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ８．０−１２．５：グリシン・食塩ー水酸化ナ
トリウム緩衝液）
０：酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５−８．
５：第一リン酸カリウム・第二リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ８．０−１２．５：グリシン・食塩ー水酸化ナ
トリウム緩衝液）
【図４】本発明の酵素の温度活性曲線
Claims (3)
- 【請求項１】 リン脂質の１位のアシル基を選択的に加
水分解し、２−アシル型のリゾリン脂質を生成する作用
を有し、作用至適ｐＨが３．５乃至４．５であり、安定
ｐＨ域が５．５乃至１０．５であり、分子量が37,000で
あり、等電点がpI３．９であるかまたは分子量が35,000
であり、等電点がpI４．３であるホスホリパーゼＡ１。 - 【請求項２】 アスペルギルス(Aspergillus) 属の糸状
菌が生産する請求項１のホスホリパーゼＡ１。 - 【請求項３】 アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus o
ryzae)が生産する請求項１のホスホリパーゼＡ１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5143173A JPH0662850A (ja) | 1992-06-16 | 1993-06-15 | ホスホリパーゼａ１ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-156264 | 1992-06-16 | ||
| JP15626492 | 1992-06-16 | ||
| JP5143173A JPH0662850A (ja) | 1992-06-16 | 1993-06-15 | ホスホリパーゼａ１ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662850A true JPH0662850A (ja) | 1994-03-08 |
Family
ID=26474960
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5143173A Pending JPH0662850A (ja) | 1992-06-16 | 1993-06-15 | ホスホリパーゼａ１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0662850A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010063470A (ja) * | 2009-12-24 | 2010-03-25 | Tsuji Seiyu Kk | 高純度リゾホスファチジルイノシトール及び糖脂質の製造方法 |
-
1993
- 1993-06-15 JP JP5143173A patent/JPH0662850A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010063470A (ja) * | 2009-12-24 | 2010-03-25 | Tsuji Seiyu Kk | 高純度リゾホスファチジルイノシトール及び糖脂質の製造方法 |
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