JP2706778B2 - 油脂の改質法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明は、エステル交換反応によって油脂の改質を行
うに際し、エステル交換活性の高いリパーゼを触媒とし
て用いる方法に関する。

油脂のエステル交換反応は、加工脂の製造において重
要な技術である。

〔従来技術〕 油脂のエステル交換反応はアルカリ金属、アルカリ金
属水酸化物等のアルカリ性物質を触媒として来たが、こ
の方法では油脂中の脂肪酸の交換位置に特異性が認めら
れず、選択性が低いのが欠点である。

この様な非選択的な方法に換わり、位置特異的なエス
テル交換方法としてリパーゼを用いる方法が注目されて
いる（特開昭52−104506号）。

しかし、リパーゼは本来、水の存在下で油脂を加水分
解する酵素であるため、反応系の水分が0.2〜1.0％と少
量であってもジグリセライド等の副生成物の生成が避け
られない。

副生成物の生成は、改質油の収率を低下させるだけで
なく、その後の分別精製に支障をきたすため、それを抑
えることを目的に多くの方法が提示されている。

それらには、吸水性樹脂を用い水分をコントロールす
る方法（特開昭58−116689号）、リパーゼの活性化剤と
して水に代わる物質として低級多価アルコールを用い油
脂の加水分解を抑える方法（特公昭57−6480号）、界面
活性剤の添加により油と水の不均一な反応系でのリパー
ゼの接触を効率化させる方法（特開昭57−198798号）、
融点の低い脂肪酸の低級アルコールエステルを用いる方
法（特公昭57−27159号）等がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、ジグリセリド等の副生成物の生成を抑える目
的で水分含量を低下させたり、低級多価アルコールを用
いることは加水分解はある程度抑えられるが、逆にエス
テル交換速度は極めて低下すると言う欠点を有し、反応
効率を上げるための界面活性剤の添加は工業規模での実
施を難しくする。一方、融点の低い脂肪酸エステルの添
加は、脂肪酸エステルを別途に製造する必要がある事
と、脂肪酸に比べ反応速度が遅いこと等が知られている
〔ジャーナル・オブ・アグリカルチャル・アンド・フー
ド・ケミストリー（J.Agric.Food Chem.），35,1005〜1
008,（1987）〕。又、従来のリパーゼによるエステル交
換反応は市販のリパーゼ剤を用いたものであり、必ずし
もエステル交換能は十分に高いとは言えない。副生成物
の生成を抑え、エステル交換反応速度を上昇させるため
には、低水分の反応系においても反応効率を低下させな
い高エステル交換活性を持つリパーゼが必要である。こ
れらの現状に鑑み、従来法は十分満足出来る方法とは言
え難い。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕

本発明者らはエステル交換活性の高いリパーゼを、リ
ゾプス（Rhizopus）属の由来のリパーゼから検索し、そ
のエステル交換活性の高いリパーゼを用い油脂の改質が
効率良く達成出来ることを見い出し、本発明を完成する
に至った。

エステル交換活性の高いリパーゼの給源としてすでに
1,3−位置特異性の知られているリゾプス属、例えばリ
ゾプス・ジャバニカス（Rhizopus javanicus）IAM602
8、リゾプス・シュードキネンシス（（Rhizopus pseudo
chinensis）IAM6042、リゾプス・デレマー（Rhizopus d
elemar）IAM6038、リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryz
ae）IAM4698、リゾプス・デレマー（Rhizopus delema
r）（生化学工業製）、リパーゼＦ（天野製薬製）、タ
リパーゼ（田辺製薬製）の中からエステル交換活性の高
いリパーゼを検索した。

更にリゾプス属が一般に３種のリパーゼを産生するこ
とが知られており〔アグリカルチャル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.），38,124
1,（1974）〕、それらのアイソザイムについても活性を
調べた。

リパーゼの検索 リゾプス属に属するリパーゼの産生菌を、大豆粉2.5
％，澱粉1.0％，大豆油0.5％，リン酸アンモニウム0.5
％及びリン酸二カリウム0.2％よりなる培地に接種し、2
5℃に３日間培養した。

得られた培養物をpH7.5に調整後、菌体をろ別し、粗
酵素液とした。その後〔アグリカルチャル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.），3
8,1241,（1974）〕の方法に従いアイソザイム（リパー
ゼA,B及びＣ）に分画後、加水分解活性，エステル合成
活性，エステル交換活性及び等電点を測定した。

加水分解活性測定法 市販のリパーゼ測定用キット（リパーゼキットＳ・大
日本製薬社製）を用い、pH7.0,37℃において分画した各
種のリパーゼを反応し、15分間インキュベートした後、
412nmにおける吸光度の上昇を測定する。

リパーゼの単位は上記条件で0.Dを１上昇させる酵素
量を１単位とした。

エステル合成活性測定法 グリセロール5g,オレイン酸0.5gに分画した各種のリ
パーゼ液0.4mlを加え、pH6.0,40℃で60分間撹拌し、合
成反応を行った。この条件下、１分間当り１マイクロモ
ルのオレイン酸をエステル化させる酵素量を１単位とし
た。

エステル交換活性測定法 分画した各種のリパーゼ液5mlにセライトNo.535を5g
添加し均一に混和後、減圧下（5mmHg）に30℃で20時間
放置しセライト吸着酵素剤を調製した。

上記セライト吸着酵素剤に、オレンイン酸5g,パーム
油5gを添加し、密栓後、45℃に15時間振盪反応させた。
反応油を分取し、ガスクロマトグラフィー法によりトリ
グリセライド組成を分析した。

上記条件下でC₅₄トリグリセライド組成を１％増加さ
せる酵素量を１単位とした。

等電点の測定法 キャリアー・アンホライト（pH3〜10,アンホライン,L
KB社製）を用い、アクタ・ケミカ・スカンジナビア（Ac
ta Chem.Scand.），20,820,（1966）の方法に準じ750V,
45時間,3℃で通電、分画した各種のリパーゼの等電点を
測定した。

結果を表−１に示す。

以上の結果より加水分解活性，エステル合成活性及び
エステル交換活性には、互いに相関関係が無い事が判明
し、かつ等電点を４〜５に持つリパーゼには特にエステ
ル交換活性が高いことが認められた。更に等電点を４〜
５にもつリパーゼは粗酵素液の状態でこの等電点付近の
pHにおいて微細に不溶化しており、容易にセライト等の
ろ過助剤に捕集することも出来、その後エタノール，ア
セトン等の有機溶媒で洗浄することにより、又はそのま
ま真空乾燥することにより非常に効率良くセライト吸着
酵素剤が調製可能である。

即ち、本発明は本質的にエステル交換活性の高いリパ
ーゼを用い低廉価なパーム油等から高価なカカオバター
代用脂等を工業的な規模で効率良く製造する事を可能に
するものである。

試験例１ リゾプス・ジャバニカス（Rhizopus javanicus）IAM602
8由来リパーゼの分画及び吸着酵素剤の調製 大豆粉2.5％，澱粉1.0％，大豆油0.5％，リン酸アン
モニウム0.5％及びリン酸二カリウム0.2％を30容ジャ
ーファーメンターにとり、pHを6.0に調整後、121℃,30
分間殺菌した。培地液量は殺菌後20とした。

同培地に25℃で48時間培養したリゾプス・ジャバニカ
ス（Rhizopus javanicus）IAM6028を接種し、通気量10
，撹拌250回転，温度27℃で65時間培養した。

培養後水酸化ナトリウムでpH7.5に調整し、菌体をろ
別した。ろ液をpH4.5に調整しケイソウ土をろ過助剤と
して再度ろ過し、ろ液は限外ろ過膜により濃縮した。こ
の濃縮液を60℃で10分間処理したのち沈澱をろ別し、ろ
液にエタノール３倍量を加えてリパーゼを沈澱させ、更
にろ別後、減圧下に乾燥させ、リパーゼＡ粉末3gを得
た。このリパーゼ粉末の加水分解活性は28,000u/gであ
った。別に濃縮液にエタノール３倍量を加えてリパーゼ
を沈澱させ、ろ別後、減圧下に乾燥させ、リパーゼＡと
Ｃの混合粉末28gを得た。このリパーゼ粉末の加水分解
活性は32,500u/gであった。またろ過助剤として使用し
たケイソウ土は、水に懸濁しpHを7.5に調整してリパー
ゼを溶解後、ケイソウ土をろ別した。得られたリパーゼ
液を限外ろ過膜で濃縮後、アルコール３倍量を加え、リ
パーゼを沈澱させ、真空乾燥してリパーゼＢ粉末45gを
得た。得られたリパーゼ粉末の加水分解活性は11,700u/
gであった。

得られた各種リパーゼ粉末を精製水10mlに溶解し、10
gのセライトNo.535に均一に散布後、減圧下（5mmHg）、
30℃に20時間乾燥し、セライト吸着酵素剤を調製した。

試験例２ リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）IAM6038由来
リパーゼの分画及び吸着酵素剤の調製 試験例１と同様にリゾプス・デレマー（Rhizopus del
emar）（IAM6038）を培養し、リパーゼＡとＣの混合粉
末及びリパーゼＢ粉末を調製し、各々の収量及び加水分
解活性は31g,28,000u/g及び41g,9,250u/gであった。但
し、試験例１と違いリパーゼＡのみの分別は非常に含量
が低い為、調製が困難であった。得られたリパーゼ２種
は試験例１と同様にしてセライト吸着酵素剤とした。

試験例３ 市販酵素剤を用いた吸着酵素剤の調製 市販の酵素剤としてリパーゼＦ（天野製薬製）及びリ
ゾープス・リパーゼ（生化学工業製）を試験例１と同様
に操作してセライト吸着酵素剤とした。

比較例 精製パーム5g,オレイン酸5gに試験例１〜３で調製し
たセライト吸着酵素剤を加水分解活性で300単位添加
し、40℃に24時間エステル交換反応を行った。反応後、
交換脂をろ別し、ガスクロマトグラフィーによりトリグ
リセライド組成を分析し、C₅₄トリグリセライド含量を
測定した。結果を表−２に示す。（但し表中でTGはトリ
グリセライドを示し、DGはジグリセライドを示す。） 実施例１ オリーブ油5g,メチルステアレイト5gに試験例１で調
製したセオライト吸着リパーゼB1gを添加し、45℃に15
時間エステル交換した。反応後、薄層クロマトグラフィ
ーにてトリグリセライド画分を分取し、ガスクロマトグ
ラフィーによりトリグリセライド組成を分析した。結果
を表−３に示す。

実施例２ オリーブ油10g,ステアリン酸10gに試験例１で得たセ
オライト吸着リパーゼB1.5gを添加し、70℃に15時間エ
ステル交換反応を行い、実施例１と同様にトリグリセラ
イド組成を分析した。結果を表−４に示す。

実施例３ パーム油中融点部100g,ステアリン酸エチル100gに試
験例１で得たセライト吸着リパーゼＢを10g加え、45℃
に24時間エステル交換反応した。反応終了後、フロリジ
ルカラムクロマトによりトリグリセライド画分を分取
し、高速液体クロマトグラフィーによりトリグリセライ
ド組成を調べた。結果を表−５に示す。（但し、表−５
中のＰはパルミチン酸、Ｏはオレイン酸、Ｓはステアリ
ン酸のそれぞれの略であり、且つグリセロールに対する
それぞれの結合部位を示している。即ち、POPとは、グ
リセロールの1,3の位置にパルミチン酸が結合し、２位
に位置にオレイン酸が結合していることを示す。） 〔発明の効果〕 本発明はエステル交換活性の高いリパーゼを用いジグ
リセライド等の副生成物の精製を最小限に抑え、低水分
下の油脂の改質反応においても目的とするエステル交換
反応を効率良く行うことができる生産性の高い方法を提
供する。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リゾプス・ジャバニカス（Rhizopus javan
   icus）、リゾプス・シュードキネンシス（Rhizopus pse
   udochinensis）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delem
   ar）又はリゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）由来
   の等電点を4.0〜5.0に有するリパーゼを触媒として用い
   る油脂の改質法。