JPS63219373A - ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業よＬ遭」分野 本発明は、水中および各種有機溶媒中でホスファチジル
基転移活性を有し、かつすぐれた熱安定性を有するホス
ホリパーゼＤお上りその製造法に関するものである。

ホスホリパーゼＤ（特に後記ホスファチジル基転移触媒
能を有するもの）は、大豆や卵黄に含まれているホス７
７チノルコリンやホスファチジルエタノールアミンなど
のリン脂質と各種アルコールから乳化剤、分散剤、農薬
、医薬、工業用試薬等に有用な、リン脂質誘導体を製造
するのに使われる。

従来の技術 ホスホリパーゼＤ　（ＥＣ３，１，４，４）は、リン脂
質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加
水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵
素であるが、その起源によっては、グリセロール、エタ
ノール等のアルコール性水酸基を有する化合物の共存下
でグリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間の
エステル結合を加水分解すると同時にホスファチジル基
と上記アルコール性水酸基を有する化合物とより新たな
エステルを生成する反応（ホスファチジル基転移反応）
を生起させる。

この酵素は、キャベツ、ニンジン等の植物体その他の植
物界に広く存在することが早くから知られており、この
酵素を含有する植物体から抽出する方法により製造する
のが普通であったが、最近では、ストレプトミセス属、
ミクロモノスポラ属、ノルカディオプシス属、アクチノ
マデューラ属、メカルディア属等の微生物を用いて発酵
法により製造する方法が提案され、一部実施されている
（特公昭５２−３９９１８号。

特公昭５８−５２６３３号、特開昭５８−６３３８８号
、特開昭５８−６７１８３号、特開昭６０−１６４４８
３号）。

しかしなが呟これら従来の製造法により得られるホスホ
リパーゼＤは、ホスファチジル基転移活性を有するもの
に関する限り、至適条件下における熱安定性が悪く、そ
のため転移反応を高温で能率よく行わせることができな
いという問題があった。

また、上記従来の微生物利用製造法は、上述のように熱
安定性のよい酵素を与えないだけでなく、培養液当りの
酵素生産性が悪く、したがって製品が高価なものになる
という問題があった。さらに、一部の製法において使わ
れる微生物には病原性が指摘されており、食品用乳化剤
の製造に使用するには安全性の点で問題があった。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、ホスファチジル基転移活性を有する従来のホ
スホリパーゼＤが上述のような欠点を持ち、その製造法
もまた改良の余地あるものであったことに鑑み、高度の
熱安定性およびホスファチジル基転移活性を示すホスホ
リパーゼＤとその効率よい製造法を提供しようとするも
のである。

辿１戸」清りζ１す≧吃Δ±戊 本発明者らは、ホスファチジル基転移活性を示すホスホ
リパーゼＤを生産する能力を多数の微生物について探索
し、さらに、選抜されたホスホリパーゼＤ高能率生産菌
について、特に熱安定性のよい酵素を生産する菌株を探
索する実験を繰返した。その結果、東京都多摩地区で採
取した土壌から分離された新菌株・ストレプトミセス・
プルニカラー（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ−＋ａｙｃｅｓ　ｐｒ
ｕｎｉｃｏｌｏｒ）　Ｓ　Ｋ　−０２−８１がすぐれた
性能を有することを知り、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は上記ストレプトミセス・プル−カラ
ー３Ｋ−０２−８１株を用いるホスホリパーゼＤの製造
法、およびそれにより得られる高耐熱性ホスホリパーゼ
Ｄを提供するものである。

本発明の製法において使われるストレプトミセス・プル
ニカラ−３Ｋ−０２−８１株は、次のような菌学的性質
を有する。

■　形態的特徴 気菌糸：直線状が主であり、僅かに屈曲している。時に
ネストまたはスクレロチウム様のものが認められる。

幅０．４〜０．６ｕｍ。

胞子：大きさ０．４−０．６１１ｍＸ１．１−１．３Ｘ
Ｉｍの短円筒形１表面は平滑。

基土菌糸：多少波状で、短軸分岐している。菌糸の分断
および胞子の着生はない。

鞭毛胞子および胞子嚢：形成しない。

諸種の培地上での生育状態二次表のとおり（但し２８℃
、２週間後の結果０色の表示はＪＩＳ　Ｚ８７２１準拠
標準色票によゐ色の分類に従っている。）。

■　細胞壁のアミノ酸組成および糖組成ｍｅｓｏ−ノア
ミノピメリン酸　　　　−しＬ−ノアミノピメリン酸　
　　　　十グリシン　　　　　　　　　　　＋ グルタミン酸　　　　　　　　　十 アラニン　　　　　　　　　　　＋ アラビノース　　　　　　　　　− ガラクトース　　　　　　　　　− 〃フラクトミン　　　　　　　　　− グルコサミン　　　　　　　　　＋ 以上より、５Ｋ−０２−８１株の細胞壁は１型である。

■　生理的性質 ａ、生育温度範囲：２０〜４０℃ ｂ、至適生育温度：２８〜３５℃ Ｃ０至適ｐ）１：６〜７ ｄ、ゼラチンの液化：なし ｅ、スターチの加水分解：あり ｆ、脱脂牛乳の凝固、ペプ）ン化：なしｇ、メラノイド
色素の産生：なし す、炭素源の利用性（３０″Ｃ９１６日＠ｎ＞　：Ｌ・
アラビノース　　十　　　〇−キシロース　　　十〇−
グルコース　　　十　　　〇・７ラクトース　　十〇−
マニトール　　　＋　　　　シュークロース　　＋イノ
シＦ−ル　　　＋　　　し−ラムノース　　　＋ラフィ
ノース　　　＋ ｉ、ＧＣ含量ニア０，４％ （［放線菌の同定実験法」日本放線菌研究会、１５１〜
１６０頁の方法による） この菌株がストレプトミセス・プルニカラーであること
は、上述の菌学的性質を、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ第８版、第８０７−８０８頁、およびＣｏｏｐｅｒ
ａｔｉｖｅ　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ　　ｏｆ　　ＳＬｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ
　　Ｗ　　　５ｐｅｃｉｅｓ＊　　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎｓｆｒｏｍ　ｔｈｅ　５ｅｃｏｎｃＬＴｈｉｒｄ　
ａｎｄ　Ｆｏｕｒｔｈ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｂｙ　Ｅｌｗ
ｏｏｄ。

Ｂ、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｏｔｔｌｉｅｂｔ第
４６８−４６９頁の各記載と照合することにより確認さ
れた。

ストレプトミセス・プルニカラ−９Ｋ−０２−８１は、
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されており、そ
の寄託番号は、微工研菌寄第９２２５号である。

本発明のホスホリパーゼＤを製造するための、上記入ト
レブＨセス・ブルニカラー５Ｋ−０２−８１の培養は、
放線菌一般の培養に通常採用される方法に従って行うこ
とができる。

すなわち、培地には炭素源としてブドウ糖、果糖、ショ
糖、乳糖、糖蜜、デンプン、デキストリン、グリセリン
等を単独で、または組合せて、適宜用いることができ、
脂肪酸、油脂・レシチン、アルコール類などを用いるこ
ともできる。また窒素源としては、硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナト
リウム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチ
ープリカー、カザミノ酸、脱脂大豆粉、大豆蛋白、デス
チラーズソリュプルなどを用いることができる。培地に
は、ほかに食塩、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩、
各種ビタミン、その他、菌の生育やホスホリパーゼＤの
生産促進に有効な物質を適宜添加することができる。好
ましい培地ｐＨは５〜９、特に好ましくは６〜７である
。培養法としては深部培養法が好ましいが、固体培養法
を採用することもできる。培養は約２０〜４０℃で行う
ことができるが、好ましい培養温度は２５〜３５℃であ
る。好ましい培養期間は温度、ｐＨ１培地によって異な
るが、通常１〜６日程度であり、目的物であるホスホリ
パーゼＤの生産が最大に達しな頃に培養を停止する。

培養終了後、培養液がら菌体をろ別し、ろ液がらホスホ
リパーゼＤを採取する。ホスホリパーゼＤの採取に特に
困難はなく、各種酵素の分離精製に通常採用される方法
を適宜組合せて行うことができる。たとえば、限外ろ過
、減圧濃縮、塩析、有機溶媒沈殿、透析、デルろ過、吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
、等電点電気泳動法、凍結乾燥等の方法を、後述する本
発明のホスホリパーゼＤの理化学的性質を考慮した条件
で採用すればよい。

ストレプトミセス・プルニカラ−３Ｋ−０２−８１が生
産する本発明のホスホリパーゼＤは、次のような理化学
的性質を有するものである。

（イ）作用 ■　リン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステ
ル結合を加水分解し、ホスファチジン酸および塩基を遊
離させる。

■　グリセロール、エタノール等のアルコール性水酸基
を有する化合物の共存下、グリセロリン脂質のホスファ
チジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解すると
同時にホスファチジル基と上記アルコール性水酸基を有
する化合物とより新たなエステルを生成するホスファチ
ジル基転移反応を生じさせる。

（ロ）基質特異性 ■ホスファチジルフリンに対する加水分解活性を１００
とした場合の相対活性は、リゾホスファチジルフリンに
対して１．５、スフィンゴミエリンに対して０．１であ
る。

■　ホスファチジルコリンに対するＫｍ値は０．９ｎＭ
である。

（ハ）至適ｐＨ：約６．０ （加水分解反応およびホスファチジル基転位反応に共通
）（ニ）至適温度：５０〜５５℃ （加水分解反応およびホスファチジル基転位反応に共通
）（ホ）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜８で安定 （へ）熱安定性 ｐＨ５または６において５０℃３力月間の加熱または５
５°Ｃ１００分間の加熱では全く失活しない。

（ト）金属イオンによる影響 濃度１０ｍＭの金属イオンを存在させた場合、加水分解
活性は金属イオンがＭｎ２＋のど外３０％阻害されるが
、Ｃａ　２”、Ｎ　ｉ　２　＋、Ｍｇ＋、Ｂａ２＋、Ｚ
、２４、ｃｏ２＋のときは阻害されない。

（チ）各種阻害剤の影響 モノヨード酢酸により４６％阻害されるが、ジイソプロ
ピルフルオロホス７エート、Ｎ−エチルマレイミド、シ
アン化カリウム、ｐ−クロロマーキュリ−ベンゾニー）
　、ｏ−７１ナンスロリン、２−メルカプトエタノール
、エチレンジ７ミン四酢酸二ナトリウムでは影響されな
（す）分子量 ５．２万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による）。

なお、ホスホリパーゼＤの酵素活性は、基質であるリン
脂質に作用してリン酸と塩基との間のエステル結合を分
解したときに生じる塩基を定量することにより求める。

この明細書に記載した酵素活性は、ホスファチジルコリ
ンを基質として用いる下記の方法により測定されたもの
であって、１分間に１μモルのコリンを遊離する酵素活
性を１ユニツトとしている。

ホスファチジルコリン分解活性測定法二０．８％のホス
ファチジルコリンと０．６％のトリトンｘｉｏｏを含む
イソブロパンール溶液５０ＩＪ１、および０．１％のト
リトンｘｉｏｏを含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６）９００μｍを混合し、これに酵素液５０．
１を加え、５０℃で１０分間反応させる。その後、直ち
に１００℃で２分間煮沸し、反応を完全に停止させる。

次に、コリン測定用試薬（コリンオキシダーゼ３２５ユ
ニツト、パーオキシダーゼ５００ユニツト、塩化カルシ
ウム　１２３ｍｇ、）リドンＸ１００　２５０論ｇ１４
−７ミノアンチピリン５０ｍｇ、フェノール７８ｍｇを
ｐＨ８，０のトリス塩酸緩衝液２５０ｍｌに溶かしたも
の）１論１に上記酵素反応の反応液５０μｌを添加し、
３７℃で１０分間反応させた後、あらかじめ熱失活させ
た酵素液を用いて同様に反応させたものを対照液にして
、５００ｎｍの吸光度を測定する。

実施例 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　１ 培地として、可溶性デンプン４％、大豆粉５％、リン酸
−カリウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、塩化
ナトリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、お
よび７デカノールＬＧ２９４を０．２％含むｐＨ７，０
のものを用意し、その１００ｍ１を５００ｍ１容の板目
７ラスフに入れ、蒸気滅菌後、ストレプトミセス・プル
ニカラ−３Ｋ”０２−８１の前培養液５輪１を植菌し、
２８℃で３日間、１２０ｓｐｍで振とう培養した。

培養終了後、菌体をろ別し、酵素活性が７５．５ユニッ
ト／ｍｌの培養ろ液１００＋ｓｌを得た。

次いで上記ろ液に硫酸アンモニウム９６ｇを攪拌しなが
ら徐々に加え、生成した沈殿を遠心分離により集め、減
圧下に乾燥して、淡褐色のホスホリパーゼＤ　（８８０
μｍ１ｇ、　５３００ユニツトを得た。培養ろ液からの
ホスホリパーゼＤの活性回収率は７０％であった。

実施例　２ 実施例１で用いた培地と同じ培地２０ｅを３０ｇのジャ
ー７アーメングーに入れ、１２０℃で１５分間蒸気滅菌
した後、ストレプトミセス・ブルニカラー５Ｋ−０２−
８１の前培養液１ｅを植菌し、２８℃で４０時間培養し
た。

培養終了後、菌体等の固形物を遠心分離により除去し、
酵素活性が８０．０ユニツト／論１の上清液１８ｇを得
た。

次いで上記上清液を４℃に冷却し、限外ろ過膜・ＡＩＬ
−１０１０（旭化成株式会社製品）を用いて限外ろ過を
行い、濃縮液１．８８を得た。濃縮液に対して４０〜６
０％飽和の硫安塩析を行い、生成した沈殿を５０ｍＭ）
’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７、０）に溶解し、同緩衝液に
対して透析した。その後、同じ緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂのカラムに通し、不純物
である蛋白質および色素を吸着させた。

溶出したホスホリパーゼＤ画分は同じ緩衝液に対して透
析したのち、４．８ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５，４
）で平衡化したＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂのカラム
に通して活性を吸着させ、食塩濃度勾配法（０〜０．２
Ｍ）により活性区分を溶出分離し、凍結乾燥して、白色
のホスホリパーゼＤ１３０１ａｇを得た。

上記精製工程におけるホスホリパーゼＤの活性回収率は
約３０％、得られた精製品の比活性は３３００ユニツ）
／ｍｇ蛋白であった。

次に、精製品について下記のような理化学的性質の試験
を行なった。

■　至適ｐＨ ホスファチジルコリン分解活性：前述の酵素活性測定法
における緩衝液を他の種々のｐＨの緩衝液にかえて酵素
活性を測定することにより、本酵素のホスファチジルコ
リン分解活性のＥＩＨ依存性を調べた。その結果は第１
図のとおりであって、至適ｐｉ−ｔは６．０付近にある
。

ホスファチジル基転移活性：ホスホリパーゼＤの存在下
、ホス７７チジｌレフリンとグリセリンからホスファチ
ジルグリセロールを生成する反応の初速度を種々のｐＨ
で測定した。

その結果は第２図のとおりであって、有機溶媒系、水系
、いずれにおいても、至適ｐＨは６〜７である。［反応
初速度測定法：有磯溶媒（酢酸エチル）系の場合は、１
０％のホスファチジルフリンを含有するインプロパツー
ル溶液２５ＩＪ＋、グリセリン５０μｌ、緩衝液５０μ
ｌ、酢酸エチル４００１＋１、酵素液数ｐ１を混合し、
５０℃で３０分間反応させる０反応終了後、反応液のｐ
Ｈを希塩酸で２以下に調整して全リン脂質を酢酸エチル
層に移し、同層中のホスファチジルグリセロールをイア
トロスキャンにて分析して反応期速度を求める。水系の
場合は、１０％のホスファチジルコリンを含有するイン
プロパツール溶液２５μｍ、グリセリン５０μｍ、緩衝
液４００．１．０．１Ｍ塩化カルシウム水溶液５０μｍ
、酵素液数μｍを混合し、５０℃で３０分間反応させる
０反応終了後、反応液ｐＨを希塩酸で２以下に調整し、
ヘキサン／エーテル／イソプロパツール（１／１１０．
５）混合溶媒を加えて全リン脂質を抽出した後、有機溶
媒層中のホス７アチンルグリセロールをイアトロスキャ
ンにて分析し、反応初速度を求める。］■　至適温度 前述のホスフ７チンルコリン分解活性測定法における酵
素反応の温度を種々変更して酵素活性を測定することに
より、本酵素の活性の温度依存性を調べた。その結果は
第３図のとおりであって、至適温度は５０〜５５℃付近
にある。

■　安定なｐＨ トリ（ンｘｉｏｏを０．１％含有する種々のｐＨの緩衝
液に試料を１ユニット／ｍｌになるように溶解し、それ
ぞれ５０’Ｃで１時間、または４℃で２４時間、静置し
た。その後、酵素活性を測定し、試験前の酵素活性と比
較した。結果は第４図（５０℃保存）および第５図（４
℃保存）のとおりであって、本発明によるホスホリパー
ゼＤが安定なｐＨは約５〜８、特に安定なｐＨは５〜７
であることがわかる。

■　熱安定性 ０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に試
料を溶解し、２０〜７０℃に３０分間保ったのち残存す
る酵素活性を測定した。その結果は第６図のとおりであ
って、５５°Ｃでは全く失活せず、６０℃で約５％の活
性低下が認められた。

別に、ｐＨ５または６において、この酵素の至適温度で
ある５０°ＣＩこ長期間保った場合における活性変化を
調べたが、３か列後も１００％の残存活性を示した。

■　金属イオンの影響 前述の酵素活性測定法において各種金属塩の水溶液を用
い、酵素反応系中で金属イオン濃度が１ｍＭまたは１０
ｍＭになるようにして酵素活性を測定した。金属イオン
無添加のときの活性を１００とする相対活性を、第１表
に示す。

第１表 金属イオンの　　　　金属イオン濃度 種類　’　　　１０ｎＭ　　　　　１ｍＭＣａ”　　　
　　　　９２　　　　　９９Ｎｉ”　　　　　　　９８
　　　　　９９Ｍｇ２＋１０５　　　　１０１ Ｂａ”　　　　　　　　　　　１　０　２　　　　　　
　　　１　０　１Ｚｎ”　　　　　　　　　　　１　０
０　　　　　　　　　　９　９Ｍｎ２＋７０　　　　１
０４ Ｃｏ”　　　　　　　　　　　１　０　４　　　　　　
　　１　００■　阻害剤の影響 前述の酵素活性測定法において各種阻害剤（種々の酵素
に対して阻害作用あることが知られている物質）の水溶
液を用い、酵素反応系中で阻害剤濃度が１ｍＭになるよ
うにして酵素活性を測定した。阻害剤無添加のときに測
定される活性を１００とする相対活性を、第２表に示す
。

第２表 阻　害　剤　　　　　　　　　相対活性ジイソプロピル
フルオロホス７エート　　１０４モ／ヨード酢酸　　　
　　　　　　　　　　５４Ｎ−エチルマレイミド　　　
　　　　　　　１１１シアン化カリウム　　　　　　　
　　　　１０５ｐ−９０ロマーキユ＋）　−ヘンソｓ−
−）　　　　１０１ｏ−７エナンスロリン　　　　　　
　　　　　１１１２−メルカプトエタノール　　　　　
　　　　９６エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム　　
１１２０　分子量 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分子量を測定した。その結
果から推察される本酵素の分子量は、５，２万であった
。

発明の効果 本発明のホスホリパーゼＤは、上述のようにその至適反
応温度である５０℃において３か月以上連続使用しても
１００％の残存活性を示し、この温度では事実上活性低
下を起こさないという、きわめてすぐれた熱安定性を示
す。また、金属イオンや阻害剤の影響も受は難い。した
がって、本発明のホスホリパーゼＤはカビ等微生物増殖
のおそれのない約５０℃またはそれ以上の温度での長期
保存ができるという特長を持つとともに、リン脂質誘導
体の製造を従来よりもはるかに高能率かつ低い酵素コス
トで容易に実施できるようにする優れたものである。

また本発明の製造法によれば、上述のようにすぐれた特
性を有するホスホリパーゼＤをきわめて高い生産性をも
って製造することができる。すなわち、従来報告されて
いるホスホリパーゼＤ生産菌株の培地１ｍｌ当りの酵素
生産量は、ストレプトミセス・タロモフスカスが０．５
ユニツト　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。

８５巻、７９頁、１９７９年）、ミクロモノ又ボラ・チ
ャルセアが０．１３ユニツト　（特公昭５８−５２６３
３号）、メカルディオプシスｓｐが０．５４ユニツト　
（特開昭５８−６３３８８号）、アクチノマデューラｓ
ｐが１．７ユニツト（特開昭５８−６７１８３号）、７
カルデイ７ｓｐが０．１マユニツト（特開昭６０−１６
４４８３号）といった低水準のものであるから、８０ユ
ニツ）／ｍｌもの高力価産生菌を使用する本発明の製造
法によれば、ホスホリパーゼＤの製造能率の飛躍的な向
上が可能になる。

【図面の簡単な説明】

第１図：本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
のｐＨ依存性を示すグラフ。 第２図二本発明の酵素のホスファチジル基転位活性のｐ
Ｈ依存性を示すグラフ。 第３ｌ；本発明の酵素のホスファチジルコリン分解活性
の温度依存性を示すグラフ。 第４ｌ：本発明の酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示
すグラフ（保存温度５０°Ｃ）。 第５ｌ：本発明の酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響を示
すグラフ（保存温度４℃）。 第６ｌ：本発明の酵素の熱安定性を示すグラフ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有するホスホリパーゼＤ：
   （イ）作用 ［１］リン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエス
   テル結合を加水分解し、ホスファチジン酸および塩基を
   遊離させる； ［２］グリセロール、エタノール等のアルコール性水酸
   基を有する化合物の共存下、グリセロリン脂質のホスフ
   ァチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解する
   と同時にホスファチジル基と上記アルコール性水酸基を
   有する化合物とより新たなエステルを生成するホスファ
   チジル基転移反応を生じさせる； （ロ）基質特異性 ［１］ホスファチジルコリンに対する加水分解活性を１
   ００とした場合の相対活性は、リゾホスファチジルコリ
   ンに対して１．５、スフィンゴミエリンに対して０．１
   である； ［２］ホスファチジルコリンに対するにＫｍ値は０．９
   ｍＭである； （ハ）至適ｐＨ：約６．０ （ニ）至適温度：５０〜５５℃ （ホ）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜８で安定 （ヘ）熱安定性 ｐＨ５〜６において５０℃３カ月間の加熱、または５５
   ℃１００時間の加熱で全く失活しない；（ト）金属イオ
   ンによる影響 濃度１０ｍＭの金属イオンを存在させた場合、加水分解
   活性は金属イオンがＭｎ＾２＾＋のとき３０％阻害され
   るが、Ｃａ＾２＾＋、Ｎｉ＾２＾＋、Ｍｇ＾２＾＋、Ｂ
   ａ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾＋、Ｃｏ＾２＾＋のときは阻害
   されない； （チ）各種阻害剤の影響 モノヨード酢酸により４６％阻害されるが、ジイソプロ
   ピルフルオロホスフェート、Ｎ−エチルマレイミド、シ
   アン化カリウム、ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート
   、ｏ−フェナンスロリン、２−メルカプトエタノール、
   エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムでは影響されない
   ； （リ）分子量 ５．２万（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による）。 （２）ストレプトミセス・プルニカラーＳＫ−０２−８
   １株を培養し、培養液からホスホリパーゼＤを採取する
   ことを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法。