FI120541B - Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sellulaasilla - Google Patents

Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sellulaasilla Download PDF

Info

Publication number
FI120541B
FI120541B FI931491A FI931491A FI120541B FI 120541 B FI120541 B FI 120541B FI 931491 A FI931491 A FI 931491A FI 931491 A FI931491 A FI 931491A FI 120541 B FI120541 B FI 120541B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cellulase
cbh
components
cotton
fabric
Prior art date
Application number
FI931491A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI931491A0 (fi
FI931491A (fi
Inventor
Kathleen A Clarkson
Geoffrey L Weiss
Edmund A Larenas
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24376762&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI120541(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/US1991/007274 external-priority patent/WO1992006221A1/en
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI931491A0 publication Critical patent/FI931491A0/fi
Publication of FI931491A publication Critical patent/FI931491A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120541B publication Critical patent/FI120541B/fi

Links

Classifications

    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M2200/00—Functionality of the treatment composition and/or properties imparted to the textile material
    • D06M2200/50—Modified hand or grip properties; Softening compositions

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Treatments For Attaching Organic Compounds To Fibrous Goods (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sei-lulaasilla
Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön ala Tämä keksintö koskee parannettuja menetelmiä puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi sellulaasil-la sekä näistä menetelmistä saatuja kankaita. Erityisesti tämän keksinnön mukaiset parannetut menetelmät koskevat 10 puuvillaa sisältävien kankaiden saattamista kosketuksiin vesiliuoksen kanssa, joka sisältää kaikista CBH I -tyyppiä olevista sellulaasin komponenteista oleellisesti vapaan sienisellulaasikoostumuksen. Kun puuvillaa sisältävää kangasta käsitellään tällaisilla liuoksilla, tulokseksi saa-15 dulla kankaalla on odotetut parannukset esimerkiksi tunnun, ulkonäön ja/tai pehmennyksen jne. suhteen verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä ja kankaalla on myös pienen-tynyt lujuuden menetys verrattuan kankaaseen, jota on käsitelty CBH I -tyyppiä olevia sellulaasin komponentteja 20 sisältävällä sellulaasikoostumuksella.
2. Alan nykytilanne
Puuvillaa sisältäviä kankaita voidaan niiden valmistuksen aikana tai vähän sen jälkeen käsitellä sellulaa-silla toivottavien ominaisuuksien tuottamiseksi kankaalle. 25 Esimerkiksi tekstiiliteollisuudessa on sellulaasia käytet ty parantamaan puuvillaa sisältävien kankaiden tuntua ja/tai ulkonäköä, poistamaan pintakuituja puuvillaa sisältävistä neuleista, antamaan kivipestyn ulkonäön puuvillaa sisältäville denimeille ja vastaavia tarkoituksia varten. 30 Erityisesti JP-patenttihakemukset 58-36217 ja 58- 54032 sekä Ohishi et ai., "Reformation of Cotton Fabric by Cellulase" ja JTN joulukuu 1988 -lehden artikkeli "What's Mew -- Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric" esittävät kukin, että puuvillaa sisältävien kan-35 kaiden käsittely sellulaasilla aikaansaa kankaalle paran- ·-··· · — - - - ·-··-»( ' * .· m - 1* · </. r «.* 2 tuneen tunnun. Uskotaan yleensä, että tämä sellulaasikä-sittely poistaa puuvillan nukkautuneisuutta ja/tai pinta-kuituja, mikä vähentää kankaan painoa. Näiden vaikutusten yhdistelmä antaa kankaalle parantuneen tunnun, so. kangas 5 tuntuu enemmän silkin kaltaiselta.
Lisäksi alalla on näihin asti ollut tunnettua käsitellä puuvillaa sisältäviä neuleteoksia sellulaasiliuok-sella sekoittaen ja vesisyöksyolosuhteissa, esimerkiksi käyttämällä suihkua, tarkoituksessa poistaa katkenneita 10 kuituja ja säikeitä, jotka ovat yleisiä näillä neuleteok-silla. Täten käsiteltäessä ei yleensä käytetä puskuri-aineita, koska niiden uskotaan vaikuttavan haitallisesti valittujen värien värisävyyn.
Lisäksi on näihin asti ollut alalla tunnettua käsi-15 teliä puuvillaa sisältäviä kudottuja kankaita sellulaasi-liuoksella sekoittaen ja vesisyöksyolosuhteissa. Täten käsitellyllä puuvillaa sisältävällä kudotulla kankaalla on parantunut tuntu ja ulkonäkö verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä.
20 Vihdoin on näihin asti myös ollut tunnettua, että puuvillaa sisältävän värjätyn denimin käsittely sellulaa-siliuoksilla sekoittaen ja vesisyöksyolosuhteissa so. rum-pupesukoneessa, antaisi denimille "kivipestyn" ulkonäön.
Tällaisten puuvillaa sisältävien kankaiden käsitte-25 lyyn sellulaasiliuoksella liittyvä yleinen ongelma on, että käsitellyt kankaat osoittavat merkittävää lujuuden menetystä verrattuna käsittelemättömiin kankaisiin. Lujuuden menetys johtuu siitä, että sellulaasi hydrolysoi selluloosaa ( β-l, 4-glukaanisidoksia), mikä puolestaan voi 30 johtaa osan puuvillapolymeeristä hajoamiseen. Kun yhä enemmän puuvillapolymeerejä katkeaa (rikkoutuu) kankaan vetolujuus vähenee.
Koska menetelmät, joihin liittyy sellulaasiliuosten sekoitusta ja ryöpyttämistä kudottujen puuvillakankaiden 35 päällä, vaativat lyhyempiä reaktioaikoja, näiden menetel- "·—-· ··“**·— " -*· ·-.··-!* ··.—*. m *.· · * ·. \ ~ li ·. 1*4*. r «*/ v - jt ; ' ]i 'iät* 3 mien uskotaan aikaansaavan vähentyneen lujuuden menetyksen omaavia puuvillaa sisältäviä kudottuja kankaita verrattuna sellulaasilla käsittelyn menetelmiin, joihin ei liity sekoittamista eikä vesisyöksyä. Joka tapauksessa tällaiset 5 menetelmät kuitenkin vielä johtavat merkittävään lujuuden menetykseen.
Sen mukaisesti olisi erityisen toivottavaa muuntaa tällaisia sellulaasilla käsittelyn menetelmiä niin, että aikaansaataisiin käsitellylle puuvillaa sisältävälle kan-10 kaalle vähentynyt lujuuden menetys samalla kun vielä aiheutettaisiin toivotut sellulaasilla käsittelystä syntyvät parannukset verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä.
Lisäksi koska sellulaasin sienilähteiden tiedetään erittävän hyvin suuria määriä sellulaasia ja lisäksi koska 15 fermentaatiomenetelmiä tällaisia sienilähteitä varten sekä eristys- ja puhdistusmenetelmiä sellulaasin eristämiseksi tunnetaan alalla, olisi erityisen edullista käyttää tällaisia sienisellulaaseja menetelmissä tunnun ja/tai ulkonäön parantamiseksi.
20 Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee havaintoa, että näihin asti tunnettuja menetelmiä puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi sienisellulaaseilla voidaan parantaa käyttämällä sienisellulaasikoostumusta, joka on oleellisesti 25 vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista.
Yllättäen on havaittu, että EG-tyyppiä olevat komponentit kykenevät aiheuttamaan käsitellylle kankaalle parannuksia tunnun, ulkonäön, pehmeyden, värin vahvistumisen ja/tai kivipestyn ulkonäön suhteen verrattuna kankaaseen ennen 30 tällaisella sellulaasikoostumuksella käsittelyä. Lisäksi on havaittu, että nimenomaan CBH I -tyyppiä olevat komponentit ovat yhdistelmässä EG-tyyppiä olevien komponenttien kanssa vastuussa huomattavasta osasta lujuuden menetystä käsitellyssä kankaassa.
- « " ϊ» ·..*!*».#·»· ·»··_'!* ‘t.MäKm.r*! .· ·-.-*· -·,4ΜΓ^.#·*; *· j* . * ι» ·****·*-. #ά; ♦· j» .
4
Yllä olevan vuoksi yksi tämän keksinnön menetelmiin liittyvä puoli koskee parannettua menetelmää puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi sienisellulaasi-koostumuksella, jossa mainittu parannus käsittää sellaisen 5 sienisellulaasikoostumuksen käyttämisen, joka on oleel lisesti vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista. Edullisessa suoritusmuodossa sienisellulaasikoos-tumus on vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista ja kaikista CBH il -tyyppiä olevista komponenteista. Vielä toisessa 10 edullisessa suoritusmuodossa sienisellulaasikoostumus si sältää vähintään noin 10 paino-% ja edullisesti vähintään noin 20 paino-% EG-tyyppiä olevia komponentteja sellulaa-sikoostumuksessa olevan proteiinin kokonaispainon perusteella.
15 Toinen tämän keksinnön menetelmiin liittyvä puoli koskee parannettua menetelmää puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi sienisellulaasin vesiliuoksella, jossa mainittu menetelmä suoritetaan sekoittaen sellaisissa olosuhteissa, että aikaansaadaan sellulaasiliuoksen 20 syöksyvaikutus kankaan ylle, jossa mainittu parannus kä sittää sellaisen sienisellulaasikoostumuksen käyttämisen, joka on oleellisesti vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista. Edullisessa suoritusmuodossa sienisellulaasikoostumus on vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista 25 komponenteista ja kaikista CBH II -tyyppiä olevista komponenteista. Vielä eräässä edullisessa suoritusmuodossa sienisellulaasikoostumus sisältää vähintään noin 10 paino-% ja edullisesti vähintään noin 20 paino-% EG-tyyppiä olevia komponentteja sellulaasikoostumuksessa olevan proteiinin 30 kokonaispainon perusteella.
Puuvillaa sisältävät kankaat, joita on käsitelty tämän keksinnön mukaisten menetelmien avulla, omaavat odotetun parannuksen (parannukset) verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä samalla kun ne osoittavat pienentynyttä 35 lujuuden menetystä verrattuna kankaaseen, jota on käsitel- - »· ·· « -· ··.·’»· 4Ά· »' · Μ - ϊ' -'iilW/.f Α »· ’ * ; ± ' ϊ" 5 ty CBH I -tyyppiä olevia sellulaasin komponentteja sisältävällä sienisellulaasikoostumuksella. Pienentynyt lujuuden menetys todistaa, että tämän keksinnön mukaiset menetelmät ovat lujuuden menetystä vastustavia.
5 Eräs tämän keksinnön koostumuksiin liittyvä puoli koskee puuvillaa sisältävää kangasta, jota on käsitelty tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä kuten on määritelty yllä.
Piirrosten lyhyt kuvaus 10 Kuvio 1 on pääpiirteittäinen esitys plasmidin pACBHIpyr4 kokoonpanemisesta.
Kuvio 2 valaisee T. reesei -geenin deleetiota integroimalla plasmidista pACBHlpyr4 saatu suurempi EcoRI-fragmentti yhdessä T. reesei -kromosomeista olevan cbhl-15 lokuksen kohdalle.
Kuvio 3 on sellaisen DNA:n autoradiogrammi, joka on peräisin EcoRI:llä pilkotulla pACBHIpyr4:llä transformoidusta T. reesei -kannasta GC69, Southern blot analyysin jälkeen, jossa on käytetty 32P:llä merkittyä 20 pACBHIpyr4: ää koettimena. Molekyylipainomerkkifragmenttien koot on esitetty kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella.
Kuvio 4 on sellaisen DNA:n autoradiogrammi, joka on peräisin EcoRI:llä pilkotulla pACBHIpyr4:llä transformoi-25 dusta T. reesei -kannasta GC69, kun on käytetty 32P:llä merkittyä pIntCBHI:tä koettimena. Molekyylipainomerkki-fragmenttien koot on esitetty kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella.
Kuvio 5 on isoelektrisen fokusoinnin geeli, joka 30 esittää T. reesei -villityypin ja transformoitujen kanto jen erittämät proteiinit. Erikoisesti kuviossa 5 isolek-trisen fokusoinnin geelin kaistassa A on käytetty T. ree-seistä peräisin olevaa osittain puhdistettua CBHI:tä; kaistassa B on käytetty villityyppi-T. reeseitä; kaistassa 35 C on käytetty T. reesei -kannasta, josta cbhl-geeni on ..... - .- .... — — . I 1 . , II, WI · W tfw .· tt t * ' I ,«m I Mk *· ft \ J 1 · · I _ JtjfTl 6 poistettu, peräisin olevaa proteiinia ja kaistassa D on käytetty T. reesei -kannasta, josta on poistettu cbhl- ja cbh2-geeni, peräisin olevaa proteiinia. Kuviossa 5 kuvion oikea puoli on merkitty osoittamaan yksittäisten prote-5 iinien, jotka löytyvät yksien tai useampien eritettyjen proteiinien joukosta, asema. Erikoisesti BG viittaa β-glu-kosidaasiin, El viittaa endoglukanaasiin I, E2 viittaa endoglukanaasiin II, E3 viittaa endoglukanaasiin III, Cl viittaa eksosellobiohydrolaasiin I ja C2 viittaa eksosel-10 lobiohydrolaasiin II.
Kuvio 6A esittää T. reesei -cbh2-lokuksen, joka on kloonattu 4,1 kiloemäksen EcoRi-fragmenttina genomi-DNA:han, ja kuvio 6B esittää cbh2-geenideleetiovektorin pPACBHII.
15 Kuvio 7 on sellaisen DNA:n autoradiograrami, joka on peräisin EcoRI:llä pilkotulla pPACBHIl:lla transformoidusta T. reesei -kannasta P37FACBHlPyr"26, Southern blot -analyysin jälkeen, jossa on käytetty 32P:llä merkittyä pPACBHII:ta koettimena. Molekyylipainomerkkifragmenttien 20 koot on esitetty kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolel la.
Kuvio 8 on kaavioesitys plasmidista pEGIpyr4.
Kuvio 9 valaisee happamien EG-komponenttien suhteen rikastetun sienisellulaasikoostumuksen (CBH I ja II pois-25 tettu), joka on peräisin Trichoderma reeseistä, aktiivi-suusprofiilia RBB-CMC:n suhteen sarjassa pH-arvoja 40 °C:ssa sekä EG III:n suhteen rikastetun sellulaasikoos-tumuksen, joka on peräisin Trichoderma reeseistä, aktii-visuusprofiilia sarjassa pH-arvoja 40 °C:ssa.
30 Kuvio 10 kuvaa lujuudenmenetystuloksia pesulait- teessa suoritetun kolmen pesukierroksen jälkeen puuvillaa sisältävillä kankailla, joita on käsitelty vaihtelevia määriä CBH-komponentteja sisältävillä sellulaasikoostumuk-silla.
' j« ...«««ι. #« · m · ' ι» -I.*·.#»' .. m n ·· m f' ·'»**·»·.#«* #· * : „* <* lt 7
Kuvio 11 kuvaa kuidunpoistotuloksia (paneelitesti-pistemäärien perusteella) puuvillaa sisältävillä kankailla, joita on käsitelty villityyppi-Trichoderma reesein erittämällä sellulaasilla (täydellinen sellulaasi) vaihte-5 levissä pH-arvoissa.
Kuvio 12 kuvaa kuidunpoistotuloksia (paneelitesti-pistemäärien perusteella) puuvillaa sisältävillä kankailla, joita on käsitelty vaihtelevilla pitoisuuksilla (miljoonasosina) sellulaasia, jonka on erittänyt villityyppi-10 Trichoderma reesei, ja puuvillaa sisältävällä kankaalla, jota on käsitelty sellaisen Trichoderma reesei -kannan erittämällä sellulaasilla, joka on geneettisesti muunnettu olemaan kykenemätön erittämään CBH I ja CBH II,
Kuvio 13 kuvaa pehmeyden paneelitestituloksia vaih-15 televilla pitoisuuksilla (miljoonasosina) EG:n suhteen rikastettua sellaiselta Trichoderma reesei -kannalta pe räisin olevaa sellulaasikoostumusta, joka on geneettisesti muunnettu olemaan kykenemätön tuottamaan CBH I & II.
Kuvio 14 on kaavioesitys paikkaspesifisistä muutok-20 sista, jotka on tehty egll- ja cbhl-geeneihin sopivien restriktioendonukleaasien katkaisukohtien aikaansaamiseksi. Kussakin tapauksessa ylärivi esittää alkuperäistä DNA-sekvenssiä, tuotetut muutokset on esitetty keskirivissä ja uusi sekvenssi on esitetty alarivissä.
25 Kuvio 15 on kaaviokuva suuremmasta EcoRl-fragmen tista, joka voidaan saada pCEPClrstä.
Kuvio 16 on transformoimattomasta T. reesei RutC30 -kannasta peräisin olevan ja kahdesta transformantista, jotka on saatu transformoimalla T. reesei EcoRl:llä pilko-30 tulla pCEPCl:llä, peräisin olevan DNA:n autoradiogrammi.
DNA pilkottiin PstI:llä, aikaansaatiin Southern blot ja hybridisoitiin 32P:llä merkityn pUC4K::cbhl:n kanssa. Merk-ki-DNA-fragmenttien koot on esitetty kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella, 35 Kuvio 17 on kaaviokuva plasmidista pEGII::P-l.
n ..... · r. w **- » < 1 · i . mvt · m **..!· M .ΚΟΚ j r Mk V iän*' .. » KL »· 8
Kuvio 18 on sellaisen DNA:n autoradiogrammi, joka on peräisin Hindin:11a ja BamHI:llä pilkotulla pEGII::ΡΊ: llä transformoidusta T. reesei -kannasta Ρ37ΡΔΔ67ΡΊ. Valmistettiin Southern blot ja DNA hybridisoi-5 tiin radioaktiivisuudella merkityn T. reesei -DNA:n noin 4 kiloemäksen PstI-fragmentin kanssa, joka sisälsi eq!3-gee-nin. Kaistat A, C ja E sisältävät DNA transformoimattomas-ta kannasta, kun taas kaistat B, D ja F sisältävät DNA transformoimattomasta T. reesei -kannasta. T. reesei -DNA 10 oli pilkottu Bglll:11a kaistoissa A ja B, EcoRV:llä kaistoissa C ja D ja PstI:llä kaistoissa E ja F. Merkki-DNA-fragmenttien koko on esitetty kiloemäspareina kuvion vasemmalla puolella.
Kuvio 19 on kaaviokuva plasmidista pPAEGI-l.
15 Kuvio 20 on sellaisen DNA:n Southern blot -analyy sin autoradiogrammi, joka on eristetty Hindlll:11a pilkotulla pAEGIpyr-3:11a aikaansaaduista kannan GC69 transfor-manteista. Koettimen, radioaktiivisuudella merkityn pAEGIpyr-3:n, kanssa hybridisoitumisen tapa, joka on odo-20 tettu transformoimattomalla kannalla, on esitetty kaistassa C. Kaista A esittää tavan, joka on odotettu transfor-mantilla, jossa egll-geeni on katkennut, ja kaista B esittää transformantin, jossa pAEGIpyr-3-DNA on integroitunut genomiin mutta rikkomatta egll-geeniä. Kaista D sisältää 25 pAEGIpyr-3:n, jota on pilkottu Hindlll:11a sopivien koko-merkkifragmenttien aikaansaamiseksi. Merkki-DNA-fragment-tien koot on esitetty kiloemäspareina kuvion oikealla puolella.
Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen ku-30 vaus
Kuten yllä on mainittu, tämän keksinnön mukaiset menetelmät ovat parannuksia alan aikaisempiin menetelmiin puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi sellu-laasilla. Parannus käsittää sellaisen erityisen sellulaa-35 sikoostumuksen käyttämisen, joka aikaansaa kankaalle toi- .* m . . * » * '»·.!' Ί .*W*. r * · JM i „ 1' ‘,r «·.
9 votun parannuksen (parannukset) saaden samalla kankaan lujuuden menetyksen mahdollisimman vähäiseksi. Kuitenkin ennen tämän keksinnön yksityiskohtaista tarkastelua määritellään ensiksi seuraavat termit.
5 Termi "puuvillaa sisältävä kangas" viittaa ommel tuihin tai ompelemattomiin kankaisiin, jotka on valmistettu puhtaasta puuvillasta tai puuvillasekoitteista mukaan lukien kudotut puuvillakankaat, puuvillaneuleet, puuvilla-denimit, puuvillalangat ja vastaavat. Kun käytetään puu-10 villasekoitteita, puuvillan määrän kankaassa tulisi olla vähintään noin 40 paino-% puuvillaa, edullisesti enemmän kuin noin 60 paino-% puuvillaa ja edullisimmin enemmän kuin noin 75 paino-% puuvillaa. Sekoitteita käytettäessä kankaassa käytetty seuralaisaine voi käsittää yhden tai 15 useampia ei-puuvillakuituja mukaan lukien synteettisiä kuituja kuten polyamidikuituja (esimerkiksi nailon 6 ja nailon 66), akryylikuituja (esimerkiksi polyakryylinitrii-likuituja) ja polyesterikuituja (esimerkiksi polyeteeni-tereftalaatti), polyvinyylialkoholikuituja (esimerkiksi 20 Vinylon), polyvinyylikloridikuituja, polyvinylideeniklori- dikuituja, polyuretaanikuituja, polyureakuituja ja arami-dikuituja. On mahdollista, että regeneroitua selluloosaa kuten raionia voitaisiin käyttää puuvillan korvaajana tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä.
25 Termi "viimeistely" tarkoittaa tässä käytettynä riittävän määrän viimeistelyainetta käyttämistä puuvillaa sisältävään kankaaseen, jotta oleellisesti estettäisiin sellulaasin selluloosaa hajottava vaikutus kankaaseen. Viimeistelyaineita käytetään yleensä kankaanvalmistusmene-30 telmän lopussa tai lähellä sitä kankaan ominaisuuksien, esimerkiksi pehmeyden, laskostuvuuden jne. parantamiseksi, mikä lisäksi suojaa kangasta sellulaasien reaktiolta. Viimeistelyaineita, jotka ovat hyödyllisiä puuvillaa sisältävän kankaan viimeistelyä varten, tunnetaan alalla, ja ne 35 käsittävät hartsiaineita kuten melamiini, glyoksaali tai 10 ureaformaldehydi sekä vahoja, silikoneja, fluorikemikaale-ja ja kvaternaarisia. Siten viimeisteltynä puuvillaa sisältävä kangas on oleellisesti vähemmän reaktiokykyinen sellulaasin suhteen.
5 Termi "sienisellulaasi" viittaa entsyymikoostumuk- seen, joka on peräisin slenilähteistä tai mikro-organismeilta, jotka on geneettisesti muunnettu sisältämään ja ilmentämään kaikkia tai osaa sienilähteestä saaduista sel-lulaasigeeneistä. Sienisellulaasit vaikuttavat sellu-10 loosaan ja sen johdannaisiin hydrolysoiden selluloosaa ja tuottaen primaarisia tuotteita glukoosia ja sellobioosia. Sienisellulaasit eroavat sellulaaseista, jotka on tuotettu ei-sienilähteistä mukaan lukien mikro-organismeja kuten sädesieniä, liukuvia bakteereja (myksobakteereja) ja oi-15 keitä bakteereja. Sieniä, jotka kykenevät tuottamaan tässä kuvattujen sellulaasikoostumusten valmistuksessa hyödyllisiä sellulaaseja, on esitelty GB-patentissa 2 094 825 A, jonka sisältö liitetään tähän viitteenä.
Useimmilla sienisellulaaseilla on yleensä optimiak-20 tiivisuus happamalla tai neutraalilla pH-alueella, vaikka joillakin sienisellulaaseilla tiedetään olevan merkittävää aktiivisuutta neutraaleissa ja lievästi aikalisissä olosuhteissa, so. esimerkiksi sellulaasilla, joka on peräisin lajilta Humicola insolens, tiedetään olevan aktiivisuutta 25 neutraaleista lievästi aikalisiin olevissa olosuhteissa.
Sienisellulaasien tiedetään muodostuvan useista entsyymiluokituksista, joilla on erilainen substraatti-spesifisyys, erilaisia entsymaattisia vaikutustapoja ja vastaavia. Lisäksi kussakin luokituksessa olevat entsyymi-30 komponentit voivat osoittaa erilaisia molekyylipainoja, erilaisia glykosylaatioasteita, erilaisia isoelektrisiä pisteitä, erilaista substraattispesiflsyyttä jne. Esimerkiksi sienisellulaasit voivat sisältää sellulaasiluokituk-sia, jotka käsittävät endoglukanaaseja (EG:eja), eksosel-35 lobiohydrolaaseja (CBH:eja), β-glukosidaaseja (BG:eja) • -•'n .· -- i' * ·«;·*' *· ' · · «u*»- . r *. *· ' j» : j» - ϊ' *· ' * ; J' 11 jne. Toisaalta vaikka bakteerisellulaasien selostetaan kirjallisuudessa sisältävän vähän tai ei ollenkaan CBH-komponentteja, on muutamia tapauksia, joissa bakteerisel-lulaaseista peräisin olevilla CBH:n kaltaisilla komponen-5 teillä on selostettu olevan eksosellobiohydrolaasiaktiivi- suutta.
Sienisellulaasikoostumusta, jonka on tuottanut luonnossa esiintyvä sienllähde ja joka sisältää yhden tai useampia CBH- ja EG-komponentteja, jolloin kutakin näistä 10 komponenteista on sienilähteen tuottamassa suhteessa, nimitetään tässä joskus "täydelliseksi sienisellulaasijärjestelmäksi" tai "täydelliseksi sienisellulaasikoostumuk-seksi" sen erottamiseksi siitä eristetyistä sellulaasin luokituksista ja komponenteista, bakteerien ja joidenkin 15 sienten tuottamista epätäydellisistä sellulaasikoostumuk- sista tai sellaisesta mikro-organismista saadusta sellu-laasikoostumuksesta, joka on geneettisesti muunnettu yli-tuottamaan, alituottamaan tai olemaan tuottamatta yhtä tai useampaa sellulaasin CBH- ja/tai EG-komponenteista.
20 Fermentaatiomenetelmät sienten viljelemiseksi sel lulaasin tuotantoa varten ovat alalla sinänsä tunnettuja. Esimerkiksi sellulaasijärjestelmiä voidaan tuottaa joko kiinteän tai vedenalaisen viljelmän avulla mukaan lukien erä-, syöttöerä- ja jatkuvatoimisia menetelmiä. Sellulaa-25 sijärjestelmien kokoaminen ja puhdistaminen fermentaatio- liemestä voidaan myös suorittaa käyttäen alalla sinänsä tunnettuja menetelmiä.
"Endoglukanaasi ("EG") -tyyppiä olevat komponentit" viittaavat kaikkiin niihin sienisellulaasin komponenttei-30 hin tai sellaisten komponenttien yhdistelmään, jotka osoittavat samankaltaisia tekstiiliinvaikutusominaisuuksia kuin lajin Trichoderma reesei -endoglukanaasikomponentit.
Mitä tähän tulee, lajin Trichoderma reesei -endoglukanaasikomponentit (erityisesti EG I, EG II, EG III ja vas-35 taavat joko yksin tai yhdistelmässä) antavat parantuneen ·«·:.!' -1 'M*m. r *' μ . ' J' · < out* >. r * μ ., ' i1 · ·, r «£ #· ’ jy . ' i* «s 12 tunnun, parantuneen ulkonäön, pehmennyksen, värin vahvistumisen ja/tai kivipestyn ulkonäön puuvillaa sisältäville kankaille (verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä), kun näitä komponentteja sisällytetään tekstiilinkäsittelyai-5 neeseen ja kangasta käsitellään tällä aineella. Lisäksi puuvillaa sisältävien kankaiden käsittely lajin Trichoderma reesei -endoglukanaasikomponenteilla johtaa pienempään lujuuden menetykseen verrattuna lujuuden menetykseen, joka aiheutuu käsittelystä koostumuksella, joka 10 on samanlainen, mutta lisäksi sisältää CBH I -tyyppiä olevia komponentteja.
Sen mukaisesti endoglukanaasityyppiä olevat komponentit ovat sellaisia sienisellulaasin komponentteja, jotka antavat parantuneen tunnun, parantuneen ulkonäön, peh-15 mennyksen, värin vahvistumisen ja/tai kivipestyn ulkonäön puuvillaa sisältäville kankaille (verrattuna kankaaseen ennen käsittelyä), kun näitä komponentteja sisällytetään aineeseen, jota käytetään kankaiden käsittelyyn, ja jotka tuottavat pienemmän lujuuden menetyksen puuvillaa sisältä-20 ville kankaille verrattuna lujuuden menetykseen, joka aiheutuu käsittelystä samanlaisella mutta lisäksi CBH I “"tyyppiä olevia komponentteja sisältävällä sellulaasikoos-tumuksella.
Tällaiset endoglukanaasityyppiä olevat komponentit 25 eivät ehkä käsitä komponentteja, jotka perinnäisesti luokitellaan endoglukanaaseiksi käyttäen sellaisia aktiivi-suustestejä kuin komponentin kykyä a) hydrolysoida liukoisia selluloosajohdannaisia kuten karboksimetyyliselluloo-saa (CMC) vähentäen siten CMC:aa sisältävien liuosten vis-30 koosiutta, b) helposti hydrolysoida selluloosan hydratoi-tuneita muotoja kuten fosforihapolla turvotettua selluloosaa (esim. Walseth-selluloosa) ja hydrolysoida vähemmän helposti selluloosan kiteisempiä muotoja (esim. Avicel, Solkafloc jne.). Toisaalta uskotaan, etteivät kaikki täl-35 laisten aktiivisuustestien avulla määritellyn mukaiset C * M '..i l* a: ·' m *' ''(«"'.r* #' Jf J *’ «K*#** ·. r «*. # M . ., »· ' 14**»·· ·, r- 13 endoglukanaasikomponentit aikaansaa yhtä tai useampaa kyseisistä parannuksista puuvillaa sisältäville kankaille sekä pienentynyttä lujuuden menetystä puuvillaa sisältäville kankaille. Sen mukaisesti on täsmällisempää tässä 5 olevia tarkoituksia varten määritellä endoglukanaasityyp-piä olevat komponentit sellaisiksi sienisellulaasin komponenteiksi, joilla on samanlaiset tekstiiliinvaikutus-ominaisuudet kuin on lajin Trichoderma reesei -endogluka-naasikomponenteilla.
10 Sienisellulaasit voivat sisältää usemman kuin yhden EG-tyyppiä olevan komponentin. Erilaisilla komponenteilla on yleensä erilaiset isoelektriset pisteet, erilaiset molekyylipainot, erilaiset glykosylaatioasteet, erilainen substraattispesifisyys, erilaiset entsymaattiset vaikutus-15 tavat jne. Komponenttien erilaiset isoelektriset pisteet mahdollistavat niiden erottamisen ioninvaihtokromatogra-fian ja vastaavien menetelmien avulla. Itse asiassa komponenttien eristäminen erilaisista sienilähteistä on alalla tunnettua. Katso esimerkiksi Björk et ai., US 07/422 814, 20 Schulein et ai., kansainvälinen patenttihakemus W0 89/09259, Wood et ai., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, (1988) 31 - 52; Wood et ai.,
Carbohydrate Research, voi. 190 (1989) 279 - 297;
Schulein, Methods in Enzymology, voi. 160 (1988) 234 - 25 242, ja vastaavia. Kunkin näistä kirjallisuusviitteistä koko sisältö liitetään tähän viitteenä.
Yleensä on mahdollista, että EG-tyyppiä olevien komponenttien yhdistelmät voivat aikaansaada synergistisen vaikutuksen parannusten tuottamisessa puuvillaa sisältä-30 ville kankaille sekä pienentyneen lujuuden menetyksen tuottamisessa verrattuna yhteen ainoaan EG-komponenttiin. Toisaalta yksi ainoa EG-tyyppiä oleva komponentti voi olla stabiilimpi tai omata laajemman aktiivisuuskirjon sarjassa pH-arvoja. Sen mukaisesti tässä keksinnössä käytetyt EG-35 tyyppiä olevat komponentit voivat olla joko yksi ainoa EG- ·· ., .«**». *· «*· .* · j» ·. j' ·.««*, r*' v j» k i * #**: *· jt i’ . »: * · _» *’ 'κ"η 14 tyyppiä oleva komponentti tai kahden tai useamman EG-tyyppiä olevan komponentin yhdistelmä. Kun käytetään komponenttien yhdistelmää, EG-tyyppiä olevat komponentit voivat olla peräisin samasta tai eri sienilähteistä.
5 On mahdollista, että EG-tyyppiä olevat komponentit voivat olla peräisin bakteereista saaduista sellulaaseis-ta.
"Eksosellobiohydrolaasityyppiä ( "CBH-tyyppiä" ) olevat komponentit" viittaavat sellaisiin sienisellulaasin 10 komponentteihin, jotka osoittavat samanlaisia tekstiiliin-vaikutusominaisuuksia kuin lajin Trichoderma reesei CBH I-ja/tai CBH II -sellulaasin komponentit. Mitä tähän tulee, kun Trichoderma reesein CBH I- ja CBH II -komponentteja käytetään EG-tyyppiä olevien sellulaasin komponenttien 15 (yllä määritellyn mukaisten) puuttuessa, ne eivät yksin aikaansaa mitään merkittäviä parannuksia tunnun, ulkonäön, värin vahvistumisen ja/tai kivipestyn ulkonäön suhteen siten käsitellyille puuvillaa sisältäville kankaille. Lisäksi yhdessä EG-tyyppiä olevien komponenttien kanssa käy-20 tettynä Trichoderma reesein CBH I -komponentti aikaansaa suurentuneen lujuuden menetyksen puuvillaa sisältäville kankaille.
Sen mukaisesti CBH I -tyyppiä olevat komponentit ja CBH II -tyyppiä olevat komponentit viittaavat sellaisiin 25 sienisellulaasin komponentteihin, jotka osoittavat vastaavasti samanlaisia tekstiiliinvaikutusominaisuuksia kuin Trichoderma reesein CBH I- ja CBH II -komponentit. Kuten yllä on mainittu CBH I -tyyppiä olevien komponenttien yhteydessä, tämä sisältää puuvillaa sisältävien kankaiden 30 lujuuden menetyksen suurentamisen, kun käytetään EG-tyyp-piä olevien komponenttien läsnä ollessa. Edullisessa suoritusmuodossa ja yhdessä EG-tyyppiä olevien komponenttien kanssa käytettäessä Trichoderma reesein CBH I -tyyppiä olevat komponentit voivat tuottaa lisääntyneen puhdis-35 tuhyödyn. Lisäksi on mahdollista, että Trichoderma reesein · M ' Ι· .· M . . i' ' * ilW" .-. W A V J» . .. ·’ 1 tMT* ·. r tO. f M * " ’ ‘ »J**·· ·* «* % *· · j* 15 CBH I -komponentit yksin tai yhdessä EG-tyyppiä olevien komponenttien kanssa käytettäessä voivat tuottaa lisääntyneen pehmennyshyödyn.
Voisi olla mahdollista, että tällaiset eksosello-5 biohydrolaasityyppiä olevat komponentit eivät käsitä komponentteja, jotka perinnäisesti luokitellaan eksosellobio-hydrolaaseiksl käyttäen sellaisia aktiivisuustestejä kuin käytetään lajista Trichoderma reesei peräisin olevien CBH I:n ja CBH II:n karakterisoimiseen. Esimerkiksi a) tällai-10 siä komponentteja estää sellobioosi kilpailevasti (KA noin 1 mM; b) ne ovat kykenemättömiä merkittävässä määrin hydrolysoimaan substituoituja selluloosia kuten karboksi-metyyliselluloosaa jne. ja c) hydrolysoivat fosforihapolla turvotettua selluloosaa ja vähemmässä määrin erittäin ki-15 teistä selluloosaa. Toisaalta uskotaan, että jotkut sieni-sellulaasin komponentit, jotka karakterisoidaan CBH-kom-ponenteiksi tällaisten aktiivisuustestien avulla, antavat parannetun tunnun, ulkonäön, pehmennyksen, värin vahvistumisen ja/tai kivipestyn ulkonäön puuvillaa sisältäville 20 kankaille yhdessä minimaalisen lujuuden menetyksen kanssa, kun niitä käytetään yksin sellulaasikoostumuksessa. Sen mukaisesti uskotaan olevan täsmällisempää tässä olevia tarkoituksia varten määritellä sellaiset eksosellobiohyd-rolaasit EG-tyyppiä oleviksi komponenteiksi, koska näillä 25 komponenteilla on samanlaisia funktionaalisia ominaisuuksia tekstiilikäytössä kuin on lajin Trichoderma reesei -endoglukanaasikomponenteilla.
Sellaisten pesuainekoostumusten yhteydessä, jotka sisältävät CBHI-vajaita, CBHl:n suhteen rikastettuja tai 30 EGIII:n suhteen rikastettuja sellulaasikoostumuksia, on havaittu, että sellulaasin määrä eikä erityisten entsyymi-komponenttien suorittaman hydrolyysin suhteellinen nopeus pelkistävien sokerien tuottamiseksi selluloosasta on se tekijä, joka antaa pesuainekoostumukselle toivotut pesu-35 ominaisuudet puuvillaa sisältäviä kankaita kohtaan, esim.
r · ^ *' - - V -1 ,Λ*η - r ** * Jt . . i' f Μ * ’ # J* , _, · · ' iJVm -, r «$.
16 yhden tai useamman ominaisuuksista parantunut värin palauttaminen, parantunut pehmennys ja parantunut puhdistus.
Sienisellulaaseja, jotka ovat oleellisesti vapaita kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista, voidaan 5 saada puhdistustekniikkojen avulla. Erikoisesti täydellinen sellulaasijärjestelmä voidaan puhdistaa oleellisesti puhtaiksi komponenteiksi kirjallisuudessa julkaistujen tunnettujen erotustekniikkojen avulla mukaan lukien ionin-vaihtokromatografia sopivassa pH-arvossa, affiniteettikro-10 matografia, kokoon perustuva ekskluusio ja vastaavia menetelmiä. Esimerkiksi ioninvaihtokromatografiässä (tavallisesti anioninvaihtokromatografia) on mahdollista erottaa sellulaasin komponentit eluoimalla pH-gradientin, suola-gradientin tai sekä pH- että suolagradientin avulla. Tässä 15 käytettynä termi "sellulaasikoostumus, joka on oleellisesti vapaa kaikista CBH 1 -tyyppiä olevista sellulaasin komponenteista" tarkoittaa, että sellulaasikoostumus proteiinin painon perusteella sisältää vähemmän kuin 1 pai-no-% CBH I -tyyppiä olevia sellulaasin komponentteja.
20 On myös mahdollista, että sellulaasikoostumuksia, jotka ovat oleellisesti vapaita kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista, voidaan valmistaa muulla tavoin kuin komponenttien eristämisen ja uudellleen yhdistämisen avulla. Esimerkiksi voidaan käyttää rekombinanttitekniik-25 koja sellaisten mikro-organismien valmistamiseksi, jotka ovat kykenemättömiä tuottamaan mitään CBH I -tyyppiä olevia komponentteja tai jotka ovat kykenemättömiä tuottamaan mitään CBH-tyyppiä olevia komponentteja.
Yllä olevaan liittyen edullinen menetelmä sellais-30 ten sellulaasikoostumusten valmistamiseksi, jotka ovat oleellisesti vapaita CBH I -tyyppiä olevista komponenteista, on muuntaa geneettisesti mikro-organismi olemaan kykenemätön ilmentämään CBH I -tyyppiä olevia komponentteja, jotka menetelmät eivät aikaansaa minkään vieraalta lajilta 35 peräisin olevan proteiinin ilmentämistä. Samoin on myös ' ·. I ’ i.iM , r .·.· · ' * ' J ‘ t ,MP ,#·**.· '*..·(· - ' ilM·* ., T 14, 1' Jf I ' ' 1,1^ 's W «4 V *·.>·' 17 mahdollista muuntaa geneettisesti mikro-organismi lisäksi yli-ilmentämään yhtä tai useampaa EG-tyyppiä olevaa komponenttia. Esimerkiksi US-patenttihakemus 07/593 919, joka on jätetty 5. lokakuuta 1990 ja joka liitetään tähän viit-5 teenä kokonaisuudessaan, esittelee menetelmiä Trichoderma reesein muuntamiseksi geenimanipulaation avulla olemaan kykenemätön ilmentämään yhtä tai useampaa CBH-komponenttia ja/tai yli-ilmentämään yhtä tai useampaa EG-komponenttia.
Lisäksi tuon patenttihakemuksen mukaiset menetelmät ai-10 kaansaavat Trichoderma reesei -kantoja, jotka eivät ilmennä mitään vieraalta lajilta peräisin olevia proteiineja. Samoin Miller et al·., "Direct and Indirect Gene Replacement in Aspergillus nidulans", Molecular and Cellular Biology (1985) 1714 - 1721, esittelee menetelmiä 15 geenien poistamiseksi Aspergillus nidulansissa DNA:n välittämän transformaation avulla käyttäen lineaarista homologisen DNA:n fragmenttia. Millerin et ai. menetelmät aikaansaisivat geenldeleetion tuottamatta mitään vieraalta lajilta peräisin olevia proteiineja.
20 Yllä oleva huomioon ottaen CBH I -tyyppiä ja/tai CBH II -tyyppiä olevien sellulaasin komponenttien tuottamisesta vastuussa olevien geenien deleetion vaikutuksena olisi myös sellulaasikoostumuksessa läsnä olevien EG-tyyppiä olevien komponenttien määrän rikastaminen. Samoin noi-25 den geenien, jotka ovat vastuussa CBH I- ja CBH II -tyyppiä olevien komponenttien tuottamisesta, poistaminen johtaisi CBH-tyyppiä olevista komponenteista vapaaseen sel-lulaasikoostumukseen.
Lisäksi on vielä mahdollista, että tässä voidaan 30 käyttää sienisellulaasikoostumuksia, jotka ovat peräisin epätäydellisiä sienisellulaasikoostumuksia tuottavista sienilähteistä. Esimerkiksi tiedetään, että eräät sienet tuottavat sellulaasikoostumuksia, jotka ovat vapaita CBH-komponenteista. Katso esimerkiksi Coughlan et ai., 35 Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, Aubert — t» · ·. m^· w m mm 4 · * > ww ^ 4m | » · i ,mP / #" ife. * Jr . 4 ' ' ’ iM*· *. W Ifc. *· 18 et ai. toimittajat, s. 11 - 30 (Academic Press, 1988), jotka esittävät, että ruskolahosienet eivät selvästi tuota CBH-komponentteja, mutta voi olla mahdollista, että yksi tai useampia näistä komponenteista on CBH I -tyyppiä ole-5 via komponentteja.
"β-glukosidaasi (BG) -komponentit" viittaavat sellaisiin sellulaasin komponentteihin, jotka osoittavat BG-aktiivisuutta; toisin sanoen tällaiset komponentit vaikuttavat sellobioosin ja muiden liukoisten sello-oligosakka-10 ridien ("sellobioosi") ei-pelkistävästä päästä ja tuottavat glukoosia ainoana tuotteena. BG-komponentit eivät adsorboidu selluloosapolymeereihin tai reagoi niiden kanssa.
Lisäksi tällaisia BG-komponentteja inhiboi glukoosi kilpailevasta (K£ noin 1 mM). Vaikka täsmällisesti ottaen BG-15 komponentit eivät ole kirjaimellisesti sellulaaseja, koska ne eivät kykene hajottamaan selluloosaa, tällaiset BG-kom-ponentit luetaan mukaan sellulaasijärjestelmän määritelmään, koska nämä entsyymit helpottavat selluloosan koko-naishajotusta hajottamalla edelleen estäviä selluloosan 20 hajotustuotteita (erityisesti sellobioosia), joita tuottaa CBH-komponenttien ja EG-komponenttien yhteisvaikutus. Ilman BG-komponenttien läsnäoloa esiintyy kohtalaisesti tai vähän kiteisen selluloosan hydrolyysiä, BG-komponentteja karakterisoidaan usein aryylisubstraattien kuten p-nitro-25 fenoli-B-D-glukosidin (PNPG) suhteen ja niitä nimitetään siten usein aryyliglukosidaaseiksi. Huomattakoon, etteivät kaikki aryyliglukosidaasit ole BG-komponentteja, sillä jotkut eivät hydrolysoi sellobioosia.
On mahdollista, että BG-komponenttien länäoloa sel-30 lulaasikoostumuksessa tai puuttumista siitä voidaan käyttää minkä tahansa koostumuksessa olevien CBH-komponenttien (so. ei-CBH I -tyyppiä olevien komponenttien) aktiivisuuden säätelemiseen. Erikoisesti koska sellobioosia muodostuu CBH-komponenttien hajottaessa selluloosaa ja koska 35 suurten sellobioosipitoisuuksien tiedetään estävän CBH- • . .1111 II . W M MI .JIM ·Μ··Ι · T ah -· m I ' t .rt*. *· J$ , I ' · I ιΜ·* ·. Ψ A i’ M * i ' ·, Ψ 19 aktiivisuutta ja lisäksi koska BG-komponentit hydrolysoivat tällaisen sellobioosin glukoosiksi, BG-komponenttlen puuttuminen sellulaasikoostumuksesta "katkaisee" CBH-ak-tiivisuuden, kun sellobioosin pitoisuus saavuttaa estäviä 5 tasoja. On myös mahdollista, että yhtä tai useampaa lisäainetta (esim. sellobioosia, glukoosia jne.) voidaan lisätä sellulaasikoostumukseen, jotta tehokkaasti "katkaistaisiin" suoraan tai välillisesti CBH I -tyyppiä oleva aktiivisuus yhtä hyvin kuin muu CBH-aktiivisuus. Kun käytetään 10 tällaisia lisäaineita, tulokseksi saadun koostumuksen katsotaan olevan kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista vapaa koostumus, jos lisäaineen määrä on riittävä johtamaan tehokkaasti CBH I -tyyppiä olevan aktiivisuuden puuttumiseen.
15 Toisaalta sellulaasikoostumus, joka sisältää lisät tyjä määriä BG-komponentteja, voi lisätä selluloosan koko-naishydrolyysiä, jos CBH-komponenttien aikaansaaman sellobioosin määrä tulee tällaista kokonaishydrolyysiä rajoittavaksi lisättyjen BG-komponenttien puuttuessa.
20 Menetelmiä BG-komponenttien määrän joko suurenta miseksi tai pienentämiseksi sellulaasikoostumuksessa on esitelty US-patenttihakemuksessa 07/625 140, joka on jätetty 10. joulukuuta 1990 asianajajaluettelonumerona 010055-056 ja otsikoituna "Saccharification of cellulose 25 by cloning and amplification of the β-glucosidase gene by Trichoderma reesei", joka patenttihakemus liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan.
Sienisellulaasit voivat sisältää useampia kuin yhden BG-komponentin. Erilaisilla komponenteilla on yleensä 30 erilaiset isoelektriset pisteet, jotka tekevät mahdolliseksi niiden erottamisen ioninvaihtokromatografian ja vastaavien menetelmien avulla. Voidaan käyttää joko yhtä ainoaa BG-komponenttia tai BG-komponenttien yhdistelmää.
Kun BG-komponenttia käytetään tekstiilinkäsittely-35 liuoksissa, sitä lisätään yleensä määränä, joka on riittä- » - - *' -I.aon. «-m. ·.· m . e ’ ' »«V··» ·. *· ml *· Jt I - ' liip· λ w ·&. #' JM . a> ·· '')ΐ·ΡΊη| _ »· 4» 20 vä estämään sellobioosin aiheuttaman sellulaasikoostumuk-sessa esiintyvien minkä tahansa CBH- ja EG-komponenttien inhibition. Lisättävä BG-komponentin määrä riippuu teks-tiilikoostumuksessa tuotetun sellobioosin määrästä, jonka 5 alan ammatti-ihminen kykenee helposti määrittämään. Kuitenkin BG-komponenttia käytettäessä sen painoprosenttimää-rä suhteessa mihin tahansa sellulaasikoostumuksessa läsnä oleviin CBH-tyyppiä oleviin komponentteihin on edullisesti noin 0,2 - noin 10 paino-% ja edullisemmin noin 0,5 - noin 10 5 paino-%.
Edullisia sienisellulaaseja käytettäväksi valmistettaessa tässä keksinnössä käytettyjä sienisellulaasi-koostumuksia ovat sellaiset, jotka saadaan lajeilta Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Pencillum sp,, 15 Humicola insolens ja vastaavilta. Eräitä sienisellulaaseja on kaupallisesti saatavana, so. CELLUCAST (saatavana toi-minimeltä Novo Industry, Kööpenhamina, Tanska), RAPIDASE (saatavana toiminimeltä Gist Brocades, N.V., Delft, Hollanti), CYT0LASE 123 (saatavana toiminimeltä Genencor 20 International, South San Francisco, Kalifornia) ja vas taavat. Muita sienisellulaaseja voidaan helposti eristää alalla tunnettujen fermentaatio- ja eristysraenetelmien avulla.
Termi "puskuriaine" viittaa alalla tunnettuihin 25 happo/emäsreagensseihin, jotka stabiloivat sellulaasi- liuoksen epäsuotavia pH-arvon muutoksia vastaan puuvillaa sisältävän kankaan sellulaasikäsittelyn aikana. Tätä koskien on alalla tunnettua, että sellulaasin aktiivisuus on pH-arvosta riippuvaista. Toisin sanoen tietty sellulaasi-30 koostumus osoittaa selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta määrätyllä pH-alueella, jolloin optimaalinen selluloosaa hajottava aktiivisuus yleensä esiintyy tämän määrätyn alueen pienellä osalla. Selluloosaa hajottavan aktiivisuuden erityinen pH-alue vaihtelee kunkin sellulaasikoostu-35 muksen mukaan. Kuten yllä on mainittu, vaikka useimmat .· m . - 1» - = .μ** . *· a- ^ -»·.· ί * - = .λλ*ι , rik: * j» , » ί ’ ’«ι«π> ·. r u. * λ . .. f' '' >,r« f ' j$ 21 sellulaasit osoittavat selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta happamalla tai neutraalilla pH-profiilialueella, on joitakin sellulaasikoostumuksia, jotka osoittavat selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta alkalisella pH-profiili-5 alueella.
Puuvillaa sisältävän kankaan sellulaasikäsittelyn aikana on mahdollista, että lähtösellulaasiliuoksen pH-arvo voisi olla sellulaasiaktllvlsuuden vaatiman alueen ulkopuolella. On lisäksi mahdollista, että pH-arvo muuttuu 10 puuvillaa sisältävän kankaan käsittelyn aikana, esimerkiksi sellaisen reaktiotuotteen muodostumisen vaikutuksesta, joka muuttaa liuoksen pH-arvoa. Kummassakin tapauksessa puskuroimattoman sellulaasiliuoksen pH-arvo voisi olla selluloosaa hajottavan aktiivisuuden vaatiman alueen ulko-15 puolella. Kun tällaista esiintyy, tapahtuu selluloosaa hajottavan aktiivisuuden epäsuotavaa vähenemistä tai lakkaamista sellulaasiliuoksessa. Esimerkiksi jos happaman aktiivisuusproflilin omaavaa sellulaasia käytetään neutraalissa puskurolmattomassa vesiliuoksessa, silloin liuok-20 sen pH-arvo johtaa vähempään selluloosaa hajottavaan aktiivisuuteen ja mahdollisesti selluloosaa hajottavan aktiivisuuden lakkaamiseen. Toisaalta neutraalin tai alkali-sen pH-prof±ilin omaavan sellulaasin käytön neutraalissa puskurolmattomassa vesiliuoksessa pitäisi aluksi aikaan-25 saada huomattavaa selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta.
Yllä oleva huomioon ottaen sellulaasiliuoksen pH-arvo tulisi pitää selluloosaa hajottavan aktiivisuuden vaatimalla alueella. Yksi keino tämän suorittamiseksi on yksinkertaisesti tarkkailla järjestelmän pH-arvoa ja sää-30 tää vaadittaessa pH-arvo lisäämällä joko happoa tai emästä. Kuitenkin edullisessa suoritusmuodossa järjestelmän pH-arvo säilytetään edullisesti toivotulla pH-alueella käyttämällä puskuriainetta sellulaasiliuoksessa. Yleensä käytetään riittävää määrää puskuriainetta liuoksen pH-ar-35 von säilyttämiseksi alueella, jossa käytetty sellulaasi «* .- τ, ..***.*·* .· ' » ϊ» * .turn. r <*; .,- - * , ϊ* -ίλλ"..#1»; · μ ' .., ϊ* 22 osoittaa aktiivisuutta. Sikäli kun erilaiset sellulaasi-koostumukset osoittavat sellulaasiaktiivisuutta erilaisilla pH-alueilla, käytettävä erityinen puskuriaine valitaan käytettävän erityisen sellulaasikoostumuksen mukaan, Pus-5 kuriaineen (-aineet), jo(t)ka valitaan käytettäväksi käytettävän sellulaasikoostumuksen kanssa, kykenee alan ammatti- ihminen helposti määrittämään ottamalla huomioon käytettävän sellulaasikoostumuksen pH-alue ja -optimi sekä sellulaasiliuoksen pH-arvo. Edullisesti käytettävä pus-10 kuriaine on sellainen, joka sopii yhteen sellulaasikoostumuksen kanssa ja joka pitää sellulaasiliuoksen pH-arvon optimiaktiivisuuden vaatimalla pH-alueella. Sopivia pusku-riaineita ovat natriumsitraatti, ammoniumasetaatti, nat-riumasetaatti, dinatriumfosfaatti ja mitkä tahansa muut 15 alalla tunnetut puskuriaineet.
Puuvillaa sisältävien kankaiden vetolujuus voidaan mitata loimen ja kuteen suunnassa, jotka ovat suorassa kulmassa toisiinsa nähden. Sen mukaisesti termi "loimen vetolujuus" viittaa tässä käytettynä puuvillaa sisältävän 20 kankaan vetolujuuteen mitattuna puuvillaa sisältävän kankaan pituussuunnassa, kun taas termi "kuteen vetolujuus" viittaa puuvillaa sisältävän kankaan vetolujuuteen mitattuna puuvillaa sisältävän kankaan leveyssuunnassa. Tulokseksi saadun sellulaasiliuoksella käsitellyn puuvillaa 25 sisältävän kankaan vetolujuutta verrataan sen vetolujuuteen ennen sellulaasiliuoksella käsittelyä käsittelyn lujuutta vähentävän vaikutuksen määrittämiseksi. Jos vetolujuus on vähentynyt liikaa, tulokseksi saatu puuvillaa sisältävä kangas helposti repeää ja/tai siihen muodostuu 30 helposti reikiä. Sen mukaisesti on toivottavaa säilyttää käsittelyn jälkeinen vetolujuus (sekä loimen että kuteen), joka on vähintään noin 50 % ennen käsittelyä olleesta ve-toluj uudesta.
Puuvillaa sisältävien kankaiden vetolujuus määrite-35 tään helposti noudattaen ASTM D1682 -testimenetelmiä. So- I. .. - #· -. ·-···'*' ’t.MJtm.rtk: .- · m ' ?* '+***. #Ά“ .· ’ * : ' Γ» '’*A**·-. #Ά »’ ' jr . Λ ' T* ·’**»* 23 pivia laitteita tällaisten kankaiden vetolujuuden testaamista varten ovat Scott-koetuslaite tai Instron-koetus-laite, joita kumpaakin on kaupallisesti saatavana. Testattaessa sellulaasiliuoksilla käsiteltyjen puuvillaa sisäl-5 tävien kankaiden vetolujuutta tulisi huolehtia siitä, että estetään kankaan kutistuminen käsittelyn jälkeen ja ennen testaamista. Tällainen kutistuminen johtaisi virheellisiin vetolujuustuloksiin.
Puuvillaa sisältävälle kankaalle aikaansaadaan palo rannuksia näihin asti käytettyjen menetelmien avulla. Esimerkiksi parannetun tunnun omaavia puuvillaa sisältäviä kankaita voidaan aikaansaada kuten JP-patenttihakemuksissa 58-36 217 ja 58-54 032 sekä kuten julkaisussa Ohishi et ai., "Reformation of Cotton Fabric by Cellulase" ja JTN 15 joulukuu 1988 -lehden artikkelissa "What's New -- Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric". Kunkin näistä kirjallisuusviitteistä opetukset liitetään tähän viitteenä.
Samoin menetelmiä puuvillaa sisältävien kankaiden 20 sekä tunnun että ulkonäön parantamiseksi ovat kankaan saattaminen kosketuksiin sellulaasia sisältävän vesiliuoksen kanssa sellaisissa olosuhteissa, että liuosta sekoitetaan ja että aikaansaadaan sellulaasiliuoksen syöksyvaiku-tus puuvillaa sisältävän kankaan ylle. Tällaiset menetel-25 mät johtavat siten käsitellyn puuvillaa sisältävän kankaan parantuneeseen tuntuun ja ulkonäköön ja niitä on kuvattu US-patenttihakemuksessa 07/598 506, jätetty 16. lokakuuta 1990, ja patenttihakemus liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan.
30 Menetelmiä puuvillaa sisältävien neuleiden paranta miseksi on kuvattu julkaisussa International Textile Bulletin, Dyeing/Printing/Finishing, sivut 5 ynnä seuraa-vat, 2. neljännesvuosi, 1990, joka liitetään tähän viitteenä.
Jk i’ · < ,M*T. r JA, * j# , . -ium·*.. r *. V Λ . . Ϊ· ·!«* J. r A *· « . .J Γ* s ** »' » -· 24
Samoin menetelmiä kivipestyn ulkonäön antamiseksi puuvillaa sisältäville denimeille on kuvattu US-patentissa 4 832 864, joka liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan.
5 Muita menetelmiä puuvillaa sisältävien kankaiden parantamiseksi käsittelemällä sellulaasikoostumuksella tunnetaan alalla. Edullisesti tällaisissa menetelmissä puuvillaa sisältävän kankaan käsittely sellulaasilla suoritetaan ennen puuvilla sisältävän ankaan viimeistelyä.
10 Kuten yllä on mainittu, tämä keksintö on parannus verrattuna alan aikaisempiin menetelmiin puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi, koska tässä keksinnössä käytetään erityistä sellulaasikoostumusta, joka saa mahdollisimman vähäiseksi lujuuden menetyksen käsitellyssä 15 kankaassa. Tässä käytetty sellulaasikoostumus on sienisel-lulaasikoostumus, joka on oleellisesti vapaa CBH I -tyyppiä olevista komponenteista ja edullisesti oleellisesti vapaa kaikista CBH-tyyppiä olevista komponenteista.
Lisäksi tässä kuvattujen sellulaasikoostumusten 20 käyttö johtaa myös rasitettujen puuvillaa sisältävien kankaiden kankaan/värin paranemiseen. Erikoisesti puuvillaa sisältävien kankaiden valmistuksen aikana kangas voi joutua rasitetuksi ja siten rasitettuna se sisältää katkenneita ja epäjärjestyksessä olevia kuituja. Tällaiset kui-25 dut antavat kankaalle haitallisesti kuluneen ja himmeän ulkonäön. Kuitenkin tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käsiteltäessä siten rasitetun kankaan kangas/väri paranee. Tämän uskotaan johtuvan joidenkin katkenneista ja sekaisin olevista kuiduista poistamisesta, jonka vaikutuk-30 sena on kankaan ennen rasitetuksi joutumista omanneen ulkonäön palautuminen.
Lisäksi on mahdollista, että käytettäessä tässä kuvattua sellulaasikoostumusta pigmentillä värjättyjen kankaiden (esim. denimit) yhteydessä, nämä sellulaasikoos-35 tumukset aiheuttavat vähemmän väriaineen uudelleensaostu- " «* . *· Ml M 1’ · > .MW . *· ·* *· -H « ' <<«!*· ^ ». .· Jf * f ’ UAra** ft 25 mistä. On myös mahdollista, että nämä uudelleensaostumista vastustavat ominaisuudet voivat olla vahvistuneet yhden tai useamman erityisen EG-tyyppiä olevan komponentin tapauksessa verrattuna muihin komponentteihin.
5 Yllä kuvattuja sienisellulaaslkoostumuksia käyte tään vesiliuoksessa, joka sisältää sellulaasia ja multa valinnaisia aineosia mukaan lukien esimerkiksi puskurianne, pinta-aktiivinen aine, puhdistusaine ja vastaavia.
Tässä liuoksessa käytetty sellulaasikoostumuksen pitoisuus 10 on yleensä sellainen pitoisuus, joka on riittävä sen aiottua tarkoitusta varten. Toisin sanoen käytetään sellaista sellulaasikoostumuksen määrää, joka aikaansaa toivotun parannuksen (parannukset) puuvillaa sisältävälle kankaalle. Käytetty sellulaasikoostumuksen määrä riippuu myös 15 käytetystä laitteistosta, käytetyistä menetelmän parametreistä (sellulaasiliuoksen lämpötila, sellulaasiliuoksen vaikutuksen alaisena olon aika ja vastaavat), sellulaasin aktiivisuudesta (esim. sellulaasiliuos vaatii pienemmän pitoisuuden aktiivisempaa sellulaasikoostumusta verrattuna 20 vähemmän aktiiviseen sellulaasikoostumukseen) ja vastaavista. Sellulaasikoostumuksen täsmällisen pitoisuuden kykenee alan ammatti-ihminen helposti määrittämään yllä olevien tekijöiden sekä toivotun vaikutuksen perusteella. Edullisesti sellulaasikoostumuksen pitoisuus tässä käyte-25 tyssä sellulaasiliuoksessa on noin 0,01 grammaa/litra sel-lulaasiliuosta - noin 10,0 grammaa/litra sellulaasiliuosta ja edullisemmin noin 0,05 grammaa/litra sellulaasiliuosta - noin 2 grammaa/litra sellulaasiliuosta. (Yllä mainittu sellulaasipitoisuus viittaa kokonaisproteiinin pai-30 noon).
Kun puskuriainetta käytetään sellulaasiliuoksessa, puskuriaineen pitoisuus sellulaasin vesiliuoksessa on sellainen, joka on riittävä liuoksen pH-arvon pitämiseksi alueella, jolla käytetty sellulaasi osoittaa aktiivisuut-35 ta, ja tämä puolestaan riippuu käytetyn sellulaasin laa- »♦ w ·* *· · · *»**—. m- m. · · ί' ·1 . ***» V - wAiff* ., r «J * j* . "7 * 'U«V« 26 dusta. Käytettävä puskuriaineen tarkka pitoisuus riippuu useista tekijöistä, jotka alan ammatti-ihminen kykenee helposti ottamaan huomioon. Esimerkiksi edullisessa suoritusmuodossa puskuriaine sekä puskuriaineen pitoisuus väli-5 taan siten että sellulaasiliuoksen pH-arvo säilytetään sellulaasin optimaalisen aktiivisuuden vaatimalla pH-alueella. Yleensä puskuriaineen pitoisuus sellulaasiliuok-sessa on noin 0,005 N ja suurempi. Edullisesti puskuriaineen pitoisuus sellulaasiliuoksessa on noin 0,01 - noin 10 0,5 N ja edullisemmin noin 0,05 - noin 0,15 N. On mahdol lista, että suurennetut puskuriaineen pitoisuudet sellulaasiliuoksessa voivat suurentaa käsitellyn kankaan vetolujuuden menetyksen nopeutta.
Sellulaasin ja puskuriaineen lisäksi sellulaasi-15 liuos voi valinnaisesti sisältää pienen määrän pinta-aktiivista ainetta, so. vähemmän kuin noin 2 paino-% ja edullisesti noin 0,01 - noin 2 paino-%. Sopivia pinta-ak-tiivisia aineita ovat mikä tahansa pinta-aktiivinen aine, joka sopii yhteen sellulaasin ja kankaan kanssa mukaan 20 lukien esimerkiksi anionisia, ionoitumattomia ja amfolyyt-tisiä pinta-aktiivisia aineita.
Sopivat anioniset pinta-aktiiviset aineet tässä käytettäväksi käsittävät lineaarisia tai haarautuneita alkyylibentseenisulfonaatteja; alkyyli- tai alkenyylieet-25 terisulfaatteja, joissa on lineaarisia tai haarautuneita alkyyliryhmiä tai alkenyyliryhmiä; alkyyli- tai alkenyyli-sulfaatteja; olefiinisulfonaatteja; alkaanisulfonaatteja ja vastaavia. Sopivia vastaioneja anionisia pinta-aktiivisia aineita varten ovat alkalimetalli-ionit, kuten 30 natrium ja kalium; maa-alkalimetalli-ionit, kuten kalsium ja magnesium; ammoniumioni ja alkanoliamiinit, joissa on 1-3 alkanoliryhmää, joiden hiilien lukumäärä on 2 tai 3.
Amfolyyttiset pinta-aktiiviset aineet käsittävät kvaternaarinen ammonium -suolasulfonaatteja, betaiinityyp-35 piä olevia amfolyyttisiä pinta-aktiivisia aineita ja vas- .· » - ii ·ι .«km* . w t* tt . 4' “ i···1 , m- »· » < · ..m »· j» i * 'UMV** -. r «► >’4» 27 taavia. Tällaisissa amfolyyttisissä pinta-aktiivisissa aineissa ovat sekä positiivisesti että negatiivisesti varautuneet ryhmät samassa molekyylissä.
Ionoitumattomat pinta-aktiiviset aineet käsittävät 5 yleensä polyoksialkeenieettereitä sekä korkeampi rasvahappo -alkanoliamrdeja tai sellaisen alkeenioksidiadduktin, glyserolin rasvahappomonoestereitä ja vastaavia.
Voidaan myös käyttää tällaisten pinta-aktiivisten aineiden seoksia.
10 Nestesuhteet, so. sellulaasiliuoksen painon ja kan kaan painon suhde, jota käytetään tässä, on yleensä määrä, joka on riittävä halutun parannuksen aikaansaamiseksi puuvillaa sisältävässä kankaassa, ja on riippuvainen käytetystä menetelmästä ja aikaansaatavasta parannuksesta.
15 Edullisesti nestesuhteet ovat yleensä noin 0,1 : 1 ja suurempia ja edullisemmin suurempia kuin noin 1 : 1 ja vielä edullisemmin suurempia kuin noin 10 : 1. Nestesuhteiden, jotka ovat suurempia kuin noin 50 : 1, käyttö ei yleensä ole edullista taloudelliselta kannalta.
20 Sellulaaslkäsittelyn reaktiolämpötiloja ohjaa kaksi kilpailevaa tekijää. Ensiksikin korkeammat lämpötilat yleensä vastaavat vahvistunutta reaktiokinetiikkaa, so. nopeampia reaktioita, jotka mahdollistavat lyhentyneitä reaktioaikoja verrattuna alemmissa lämpötiloissa vaadit-25 turhin reaktioaikoihin. Sen mukaisesti reaktiolämpötilat ovat yleensä vähintään noin 30 °C ja suurempia. Toiseksi sellulaasi on proteiini, joka menettää aktiivisuutta määrätyn reaktiolämpötilan yläpuolella, joka lämpötila riippuu käytetystä sellulaasilajista. Siten jos reaktiolämpö-30 tilan sallitaan kohoavan liian korkeaksi, silloin selluloosaa hajottava aktiivisuus katoaa seurauksena sei-lulaasin denaturoitumisesta. Tämän johdosta tässä käytetyt maksimireaktiolämpötilat ovat yleensä noin 55 °C. Yllä oleva huomioon ottaen reaktiolämpötilat ovat yleensä noin ’ ·' ~ ·*» ·<.***» . ,τ «*. - m . „ ί* ''υΜΤη-.^Λ 28 30 - noin 65 °C; edullisesti noin 35 - noin 60 °C ja edullisemmin noin 35 - noin 50 °C.
Reaktioajat ovat yleensä noin 0,1 - noin 24 tuntia ja edullisesti noin 0,25 - noin 5 tuntia.
5 Puuvillaa sisältävien kankaiden, joita on käsitelty yllä kuvatuissa menetelmissä käyttäen tällaisia sellulaa-slkoostumuksia, lujuuden menetys on pienempi verrattuna samaan puuvillaa sisältävään kankaaseen, jota on käsitelty samalla tavalla täydellisellä sienisellulaasikoostumuksel-10 la.
Edullisessa suoritusmuodossa voidaan valmistaa tiiviste käytettäväksi tässä kuvatuissa menetelmissä. Tällaiset tiivisteet sisältäisivät väkevöityjä määriä yllä kuvattua sellulaasikoostumusta, puskuriainetta ja pinta-ak-15 tiivistä ainetta, edullisesti vesiliuoksessa. Siten formuloituna tiiviste voidaan helposti laimentaa vedellä sellaisten sellulaasiliuosten valmistamiseksi nopeasti ja tarkasti, joissa on näiden lisäaineiden tarpeellinen pitoisuus. Edullisesti sellaiset tiivisteet sisältävät noin 20 0,1 - noin 20 paino-% yllä kuvattua sellulaasikoostumusta (proteiinia); noin 10 - noin 50 paino-% puskuriainetta; noin 10 - noin 50 paino-% pinta-aktiivista ainetta ja noin 0-80 paino-% vettä. Kun formuloidaan vesipitoisia tiivisteitä, nämä tiivisteet voidaan laimentaa käyttäen ker-25 toimia, jotka ovat noin 2 - noin 200, niin että saavutetaan komponenttien vaadittu pitoisuus sellulaasiliuokses-sa. Kuten on itsestään selvää, tällaiset tiivisteet mahdollistavat sellulaasiliuosten helpon formuloinnin sekä mahdollistavat tiivisteen toteutettavissa olevan kuljetuk-30 sen sen käyttöpaikalle. Yllä kuvatun mukainen sellulaasi-koostumus voidaan lisätä tiivisteeseen joko nestemäisessä laimennusaineessa, rakeissa, emulsioissa, geeleissä, tahnoissa ja vastaavissa. Tällaiset muodot ovat alan ammatti-ihmiselle tunnettuja.
IV I ' " ---1. — — ·—1 4» t · · IMPI» '•’Mk «» I · 1 ·ΜΡ a · K *· Jf , _ J » ’ T ιΜΛ1 29
Kun käytetään kiinteää sellulaasitiivistettä, sel-lulaasikoostumus on yleensä rae, jauhe, agglomeraatio ja vastaava. Kun käytetään rakeita, rakeet voidaan edullisesti formuloida sisältämään sellulaasia suojaavan aineen.
5 Katso esimerkiksi US-patenttihakemus 07/642 669, joka on jätetty 17. tammikuuta 1991 asianajajaluettelonumerona 010055-073 ja otsikoituna "Granules containing both an enzyme and an enzyme protecting agent and detergent compositions containing such granules" ja joka patenttiha-10 kemus liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan. Samoin rakeet voidaan formuloida sisältämään aineita rakeiden pesuliuokseen liukenemisen nopeuden vähentämiseksi. Tällaisia aineita ja rakeita on esitelty US-patenttihakemuk-sessa 07/642 596, joka on jätetty 17. tammikuuta 1991 15 asianajajaluettelonumerona GCS-171-US1 ja otsikoituna "Granular compositions" ja joka patenttihakemus liitetään tähän viitteenä kokonaisuudessaan.
Tarkoitus on, että tässä kuvattuja sellulaasikoos-tumuksia voidaan lisäksi käyttää esipesussa ja liotusai-20 neena joko nesteenä tai suihkeena. Lisäksi on vielä tarkoitus, että tässä kuvattuja sellulaasikoostumuksia voidaan myös käyttää kotikäytössä erillisvalmisteena, joka sopii kankaiden värin ja ulkonäön parantamiseen. Katso esimerkiksi US-patentti 4 738 682, joka liitetään tähän 25 viitteenä kokonaisuudessaan.
Seuraavat esimerkit annetaan tämän keksinnön valaisemiseksi, eikä niitä tulisi tulkita millään tavoin sen suojapiiriä rajoittaviksi.
Esimerkkejä 30 Esimerkit 1 - 12 ja 22 - 30 esittelevät sellaisen
Trichoderma reesein valmistamisen, joka on geenimanipulaation avulla muunnettu olemaan kykenemätön tuottamaan yhtä tai useampaa sellulaasin komponenttia tai ylituottamaan määrättyjä sellulaasin komponentteja.
• --- — .. -··”'» · · +· · m “ ί1 «»· « ' I * -«·. V* «A. »' W* 30
Esimerkki 1
Trichoderma reesein ργτ4“-johdannaisten valinta pyr4-qeeni koodaa orotidiini-5 *-monofosfaattidekar-boksylaasin, joka entsyymi vaaditaan uridiinin biosyn-5 teesiä varten. Villityyppiä olevat solut liittävät myrkyllisen inhibiittorin 5-fluorioroottihapon (FOA) uridiinin ja tämä inhibiittori myrkyttää siten solut. Kuitenkin solut, jotka ovat puutteellisia pyr4-geenissä, ovat vastustuskykyisiä tämän inhibiittorin suhteen, mutta vaativat 10 uridiinia kasvaakseen. On sen vuoksi mahdollista valita pyr4-johdannaiskantoja käyttäen FOA. Käytännössä reesei -kannan RL-P37 (Sheir-Neiss, G. ja Montenecourt, B. S.,
Appi. Microbiol. Biotechnol. 20 (1984) 46 - 53) itiöitä levitettiin sellaisen jähmetetyn elatusaineen pinnalle, 15 joka sisälsi 2 mg/ml uridiinia ja 1,2 mg/ml FOA. Spontaaneja FOA-resistenttejä bakteeripesäkkeitä ilmaantui kolmesta neljään päivän kuluessa, ja oli mahdollista seu-raavaksi identifioida sellaisia FOA-resistenttejä johdannaisia, jotka vaativat uridiinia kasvaakseen. Sellaisten 20 johdannaisten identifioimiseksi, joilla erikoisesti oli puutteellinen pyr4-geeni, aikaansaatiin protoplasteja ja ne transformoitiin plasmidilla, joka sisälsi villityypin pyr4-geenin (katso esimerkit 3 ja 4). Transformaation jälkeen protoplasteja sijoitettiin levyviljelmäksi kasvualus-25 talle, josta puuttui uridiini. Seurannut transformoitujen bakteeripesäkkeiden kasvu osoitti puutteellisen pyr4-gee-nin täydentämisen plasmidissa olevan pyr4-geenin avulla.
Tällä tavoin kanta GC69 identifioitiin kannan RL-P37 pyr4~ -johdannaiseksi.
30 Esimerkki 2 CBHI-deleetiovektorin valmistus CBHI-proteiinin koodaava cbhl-geeni kloonattiin T. reesei -kannan RL-P37 genomi-DNA:sta hybridisoimalla sellaisen oligonukleotidikoettimen kanssa, joka oli suun-35 niteltu tämän geenin julkaistun sekvenssin perusteella • · " — " i > · . » * m t i' · t mum,. r λ. f jt J ’ · I u^v>*., f 4£ 31 käyttäen tunnettuja koettimensynteesimenetelmiä (Schoemaker et ai., 1983b). cbhl-geeni sijaitsee 6,5 kilo-emäksen Pstl-fragmentissa ja siirrettiin PstI:llä leikattuun pUC4K:hon (hankittu toiminimeltä Pharmacia Inc., 5 Piscataway, NJ) korvaten tämän vektorin Kanr-geeni käyttäen alalla tunnettuja tekniikkoja, jotka tekniikat on esitetty teoksessa Maniatis et ai., (1989) ja liitetään tähän viitteenä. Tulokseksi saatu plasmidi pUC4K::cbhl katkottiin sitten Hindin:11a ja suurempi noin 6 kiloemäksen frag-10 mentti eristettiin ja uudelleenyhdistettiin ligaation avulla, jolloin saatiin pUC4K::cbhlAH/H (katso kuvio 1).
Tämä menettely poistaa koko cbhl:n koodaavan sekvenssin ja noin 1,2 kiloemästä vastavirtaan sijaitsevia ja 1,5 kilo-emästä myötävirtaan sijaitsevia vierussekvenssejä. Suun-15 nilleen 1 kiloemäksen verran vierus-DNA:ta alkuperäisen Pstl-fragmentin jommastakummasta päästä jää.
T. reesei -pyr4-geeni kloonattiin genomi-DNA:n 6,5 kiloemäksen Hindlll-fragmenttina pUC18:aan muodostaen pTpyr2 (Smith et ai., 1991) noudattaen menetelmiä teokses-20 ta Maniatis et ai., supra. Plasmidi pUC4K::cbhlAH/H katkottiin HindiII:11a ja päät defosforyloitiin vasikan suolen alkalisen fosfataasin avulla. Tämä päistä defosfory-loitu DNA yhdistettiin ligaation avulla 6,5 kiloemäksen Hindlll-frgamentin kanssa, joka sisälsi T. reesei -pyr4-25 geenin, jolloin saatiin pACBHIpyr4. Kuvio 1 valaisee tämän plasmidin kokoonpanemista.
Esimerkki 3
Protoplastien eristäminen
Huovastoa saatiin istuttamalla 100 ml:aan YEG 30 (0,5 % hiivauutetta, 2 % glukoosia) 500 ml:n kolvissa noin 5 x 107 T. reesei GC69 -itiötä (pyr4~-johdannaiskanta).
Kolvia inkuboitiin sitten 37 °C:ssa ravistaen noin 16 tunnin ajan. Huovasto koottiin talteen sentrifugoimalla nopeudella 2 750 x g. Koottua huovastoa pestiin lisäksi 35 1,2 M sorbitoliliuoksessa ja se uudelleensuspendoitiin - ’ 1 -.-- .... — — λ -it· 1 . «m·* «r «h · 4· .*'·!, atmr M . 4 ' 32 40 ml:aan liuosta, joka sisälsi 5 mg/ml NovozymE 234 -liuosta (joka on kauppanimi monen komponentin entsyymi-järjestelmälle, joka sisältää 1,3-alfaglukanaasia, 1,3-beetaglukanaasia, laminarinaasia, ksylanaasia, kitinaasia 5 ja proteaasia, toiminimeltä Novo Biolabs, Danbury, CT); 5 mg/ml MgS04*7H20; 0,5 mg/ml naudan seerumin albumiinia; 1,2 M sorbitolia. Protoplastit poistettiin solujätteistä suodattamalla Miraclothin (Calbiochem Corp, La Jolla, CA) läpi ja koottiin sentrifugoimalla nopeudella 2 000 x g.
10 Protoplastit pestiin kolme kertaa 1,2 M sorbitolissa ja kerran liuoksessa, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 50 mM CaCl2, sentrifugoitiin ja uudelleensuspendoitiin tiheydeksi noin 2 x 108 protoplastia ml:aa sellaista liuosta kohti, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 50 mM CaCl2.
15 Esimerkki 4
Sieniprotoplastien transformaatio pACBHIpyr4:llä 200 μΐ protoplastisuspensiota, joka oli valmistettu esimerkissä 3, lisättiin seokseen, jossa oli 20 μΐ EcoRl:llä pilkottua pACBHIpyr4 (valmistettu esimerkissä 2) 20 TE-puskuriliuoksessa (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) ja 50 μΐ polyeteeniglykoli (PEG) -Ilosta, joka sisälsi 25 % PEG 4000, 0,5 M KC1 ja 50 mM CaCl2. Tätä seosta inkuboitiin jään päällä 20 minuutin ajan. Tämän inkubaatioajan jälkeen 2.0 ml yllä identifioitua PEG-liuosta lisättiin siihen, 25 liuosta sekoitettiin lisäksi ja inkuboitiin huoneenlämpö- tilassa 5 minuutin ajan. Tämän toisen inkubaation jälkeen 4.0 ml liuosta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolia ja 50 mM CaCl2, lisättiin siihen ja tätä liuosta sekoitettiin lisää. Protoplastiliuos lisättiin sitten välittömästi suliin an- 30 noksiin Vogelin elatusainetta N (3 g natriumsitraattia, 5 g KH2P04, 2 g NH4N03, 0,2 g MgS04-7H20, 0,1 g CaCl2*2H20, 5 pg a-biotiinia, 5 mg sitruunahappoa, 5 mg ZnS04*7H20, 1 mg Fe(NH4)2*6H20, 0,25 mg CuS04*5H20, 50 pg MnS04*4H20 litraa kohti), joka sisälsi lisäksi 1 % glukoosia, 1,2 M 35 sorbitolia ja 1 % agaroosia. Protoplasti/elatusaineseos • ——— ” » — · ·> . t—ψψ· *r μ .· ik i ' Ί . *- ah «· « , j » · t ,j/|r .. ψ· *' jw · ..» ♦ 33 kaadettiin sitten kiinteälle kasvualustalle, joka sisälsi samaa Vogelin elatusainetta kuin yllä on mainittu. Uridii-nla ei ollut läsnä kasvualustassa, ja sen vuoksi ainoastaan transformoituja bakteeripesäkkeitä kykeni kasvamaan 5 seurauksena kannan GC69 pyr4-mutaation täydentämisestä pACBHIpyr4:ssä olevan viliityyppi-pyr4-geeni-insertin avulla. Nämä bakteeripesäkkeet siirrettiin sen jälkeen ja puhdistettiin kiinteällä Vogelin elatusaineella N, joka sisälsi lisäaineena 1 % glukoosia, ja stabiileja transfor-10 mänttejä valittiin lisäanalyysiä varten.
Tässä vaiheessa stabiileja transformantteja erotettiin epästabiileista transformanteista niiden suuremman kasvunopeuden perusteella ja sen avulla, että ne muodostivat pyöreitä bakteeripesäkkeitä, joiden ääriviiva oli si-15 leä eikä rosoinen, kiinteällä kasvualustalla, josta puuttui uridiini. Joissakin tapauksissa tehtiin stabiiliutta koskeva lisätesti kasvattamalla transformantteja kiinteällä ei-selektiivisellä kasvualustalla (so. joka sisälsi uridiinia), kokoamalla itiöitä tältä kasvualustalta ja 20 määrittämällä se prosenttimäärä näistä itiöistä, joka myöhemmin itää ja kasvaa selektiivisellä kasvualustalla, josta puuttuu uridiini.
Esimerkki 5
Transformanttien analyysi 25 DNA eristettiin transformanteista, jotka oli saatu esimerkissä 4, sen jälkeen kun niitä oli kasvatettu nestemäisessä Vogelin elatusaineessa N, joka sisälsi 1 % glukoosia. Näitä transformanttien DNA-näytteitä katkottiin lisäksi Pstl-restriktioentsyymillä ja niille suoritettiin 30 agaroosigeelielektroforeesi. Geelistä suoritettiin sitten blot-siirtäminen Nytran-kalvosuodattimelle ja hybridisoi-tiin 32P:llä merkityn pACBHIpyr4-koettimen kanssa. Koetin oli valittu tarkoituksena identifioida alkuperäinen cbhl-geeni 6,5 kiloemäksen PstI-fragmenttina, alkuperäinen . .,.. - · · .. - -1. .. -L.B» 4 1 · . . *UMt . r lb- λ· M „ J ’ M ,Μ» j. f IA. , 34 pyr4-geeni ja mahdolliset DNA-sekvenssit, jotka olivat peräisin transformoivasta DNA-fragentista.
Hybridisaatiosta saadut radioaktiiviset vyöhykkeet tehtiin näkyviksi autoradiografiän avulla. Autoradiogrammi 5 nähdään kuviossa 3. Viisi näytettä ajettiin kuten on kuvattu yllä, josta näytteet A, B, C, D ja E. Kaista E on transformoimaton kanta GC69, ja sitä käytettiin kontrollina tässä analyysissä. Kaistat A - D edustavat tarnsfor-mantteja, jotka on saatu yllä kuvattujen menetelmien avul-10 la. Autoradiogrammin sivulla olevat numerot edustavat mo-lekyylipainomerkkifragmenttien kokoja. Kuten voidaan nähdä tästä autoradiogrammista, kaista D ei sisällä 6,5 kilo-emäksen CBHI-vyöhykettä, mikä osoittaa, että tämä geeni on kokonaan poistettu transformantissa integroimalla DNA-15 fragmentti cbhl-geenin kohdalle, cbhl-deleetiokannalle on annettu nimitys P37PACBHI. Kuvio 2 esittää pääpiirteittäin T. reesei -cbhl-geenin deleetion integraation avulla pACBHIpyr4:stä peräisin olevan suuremman EcoRI-fragmentin kaksois-osienvaihto (cross-over) -tapahtuman kautta yh-20 dessä T. reesein kromosomeista olevassa cbhl-lokuksessa.
Muut analysoidut transformantit näyttävät identtisiltä transformoimattoman kontrollikannan kanssa.
Esimerkki 6
Transformaattien analyysi käyttäen p!ntCBHI:tä 25 Tässä esimerkissä käytettiin samaa menetelmää kuin esimerkissä 5, paitsi että käytetty koetin vaihdettiin 32P:llä merkittyyn plntCBHI-koettimeen. Tämä koetin on pUC-tyyppinen plasmidi, joka sisältää 2 kiloemäksen Bglll-fragmentin cbhl-lokuksesta alueella, joka oli poistettu 30 plasmidissa pUC4K::cbhlAH/H. Tässä esimerkissä ajettiin kaksi näytettä mukaan lukien kontrolli, näyte A, joka on transformoimaton kanta GC69, ja transformantti P37PACBHI, näyte B. Kuten voidaan nähdä kuviossa 4, näyte A sisälsi cbhl-geenin, kuten osoittaa vyöhyke kohdalla 6,5 kilo-35 emästä; transformantti, näyte B, ei kuitenkaan sisällä I mc**». *- -m n ·'*«·*., re. v m . . f ·'*·»". r a. *> λ . f ijvT" ^ #· #·.»«' r**.
35 tätä 6,5 kiloemäksen vyöhykettä eikä sen vuoksi sisällä cbhl-geeniä eikä sisällä mitään pUC-plasmidista peräisin olevia sekvenssejä.
Esimerkki 7 5 Kannan P37PACBHI proteiinien eritys
Tuotetulta Ρ37ΡΔθ3ΗΙ-kannalta saatuja itiöitä istutettiin 50 ml:aan Trichoderma-peruselatusainetta, joka sisälsi 1 % glukoosia, 0,14 % (NH4)2S04, 0,2 % KH2P04, 0,03 % MgS04, 0,03 % ureaa, 0,75 % baktotryptonia, 0,05 % 10 Tween 80, 0,000016 % CuS04*5H20, 0,001 % FeS04*7H20, 0,000128 % ZnS04 · 7H20 , 0,00 0 0 0 54 % Na2Mo04 * 2H20, 0,0000007 %
MnCl·4H20. Elatusainetta inkuboitiin ravistaen 250 ml:n kolvissa 37 °C:ssa noin 48 tunnin ajan. Tulokseksi saatu huovasto koottiin suodattamalla Miraclothin (Calbiochem 15 Corp. ) läpi ja pestiin kaksi tai kolme kertaa 17 mM kaliumfosfaatilla. Huovasto suspendoitiin lopuksi 17 mM kaliumfosfaattiin, jossa oli 1 mM soforoosia, ja inkuboitiin lisäksi 24 tunnin ajan 30 °C:ssa ravistaen. Näistä viljelmistä koottiin sitten supernatantti ja huovasto heitettiin 20 pois. Viljelmän supernatantin näytteitä analysoitiin iso-elektrisen fokusoinnin avulla käyttäen Pharmacia Phastgel -järjestelmää ja pH 3 - 9 - ennalta valettuja geelejä valmistajan ohjeiden mukaan. Geeli värjättiin hopeavärjäyk-sellä proteiinivyöhykkeiden tekemiseksi näkyviksi, cbhl-25 proteiinia vastaava vyöhyke puuttui näytteestä, joka oli peräisin kannalta P37PACBHI, kuten on esitetty kuviossa 5.
Tämä isoelektrisen fokusoinnin geeli osoittaa erilaisia proteiineja erilaisissa T. reesein viljelmien supernatan-teissa. Kaista A on osittain puhdistettu CBHI; kaista B on 30 transformoimattoman T. reesein viljelmästä saatu supernatantti; kaista C on tämän keksinnön menetelmien mukaan tuotetulta kannalta P37PACBH1 saatu supernatantti. Erilaisten sellulaasin komponenttien asema on merkitty CBHI, CBHII, EGI, EGII ja EGIII. Koska CBHI muodostaa 50 % kai-35 kesta solunulkopuolisesta proteiinista, se on tärkein eri- ·* ** ** sm . . i- 't.Msem.ws*. .· 4. „ .. # 4* * J» . Τ' •'j***·-·.#· «k! * J* . .., i 36 tetty proteiini ja on sen vuoksi tummin vyöhyke geelissä* Tämä isoelektrisen fokusoinnin geeli osoittaa selvästi CBHI-proteiinin katoamisen P37PACBHI-kannassa.
Esimerkki 8 5 pPACBHII:n valmistus T. reesein cbh2-geeni, joka koodaa CBHII-prote-iinin, on kloonattu genomi-DNA:n 4,1 kiloemäksen EcoRI-fragmenttina, joka on esitetty kaavamaisesti kuviossa 6A (Chen et ai., Biotechnology 5 (1987) 274 - 278). Tämä 4,1 10 kiloemäksen fragmentti siirrettiin pUC4XL:n EcoRI-kohtien väliin. Viimeksi mainittu plasmidi on pUC-johdannainen (jonka on kokoonpannut R. M. Berka, Genencor International Inc.), joka sisältää monen restriktioentsyymin tunnistus-kohdan, jossa on restriktioendonukleaasien tunnistuskohtia 15 symmetrisesti järjestettynä tässä esitetyssä järjestyksessä: EcoRI, BamHI, SacI, Smal, HindiII, XhoI, Bglll, Clal,
Bglll, XhoI, Hindin, Smal, SacI, BamHI, EcoRI. Käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä on kokoonpantu plasmidi pPACBHII (kuvio 6B), jossa tämän geenin 1,7 kiloemäksen 20 keskialue HindiII-kohdan (kohdassa 74 emäsparia 3' CBHII:n translaation aloituskohdasta) ja Clal-kohdan (kohdassa 265 emäsparia 3' CBHII:n viimeisestä kodonista) väliltä on poistettu ja korvattu 1,6 kiloemäksen HindiII - Clal-DNA-fragmentilla, joka sisältää T. reesei -pyr4-geenin.
25 T. reesei -pyr4-geeni poistettiin pTpyr2:sta (katso esimerkki 2) 1,6 kiloemäksen Nhel - Sphl-fragmentissa ja siirrettiin pUC219:n (katso esimerkki 23) Sphl- ja Xbal-kohtien väliin, jolloin aikaansaatiin p219M (Smith et ai.,
Curr. Genet. 19 (1991) 27 - 33). pyr4-geeni poistettiin 30 sitten HindiII - Clal-fragmenttina, jossa oli toisessa päässä seitsemän emäsparia DNA:ta ja toisessa päässä kuusi emäsparia DNA:ta, joka oli peräisin pUC219:n monen restriktioentsyymin tunnistuskohdasta, ja se sijoitettiin cbh2-geenin Hindin- ja Clal-kohtiin, jolloin muodostui 35 plasmidi pPACBHII (katso kuvio 6B).
37 Tämän plasmidin pilkkominen EcoRl:llä vapauttaa fragmentin, jossa on 0,7 kiloemästä vierus-DNA:ta cbh2-lokuksesta toisessa päässä, 1,7 kiloemästä vierus-DNA:ta cbh2-lokuksesta toisessa päässä ja T. reesei -pyr4-geeni 5 keskellä.
Esimerkki 9 cbh2-geenin deleetio reesei -kannassa GC69
Aikaansaadaan kannan GC69 protoplasteja ja ne transformoidaan EcoRl:llä pilkotulla pPACBHII:lla esimer-10 keissä 3 ja 4 pääpiirteittäin esitettyjen menetelmien mukaan. Transformanteista saatua DNA:ta pilkotaan EcoRl:llä ja Asp718:11a ja sille suoritetaan agaroosigeelielektro-foreesi. DNA siirretään (blotting) geelistä kalvosuodatti-melle ja hybridisoidaan 32P:llä merkityn pPACBHII:n kanssa 15 esimerkissä 11 olevien menetelmien mukaan. Identifioidaan transformantteja, joissa on pPACBHll:sta saadun EcoRl-fragmentin yksi ainoa kopio integroituneena tarkalleen cbh2-lokuksen kohdalle. Transformantteja kasvatetaan myös ravistuskolveissa kuten esimerkissä 7 ja viljelmien super-20 natanteissa oleva proteiini tutkitaan isoelektrisen foku soinnin avulla. Tällä tavoin aikaansaadaan T. reesei GC69 -transformantteja, jotka eivät tuota CBHII-proteiinia.
Esimerkki 10 P37PACBHI:n pyr4"~johdannaisen aikaansaaminen 25 Transformantin (P37PACBHI), jolle oli tuotettu cbhl-geenideleetio, itiöitä levitettiin kasvualustalle, joka sisälsi F0A:ta. Tämän transformantin pyr4"-johdannainen saatiin sen jälkeen käyttämällä esimerkin 1 menetelmiä. Tälle pyr4'-kannalle annettiin nimitys 30 P37PACBHIPyr’26.
Esimerkki 11 cbh2-geenin poisto kannassa, josta on aikaisemmin poistettu cbhl
Aikaansaatiin kannan P37PACBHIPyr'26 protoplasteja 35 ja ne transformoitiin EcoRl:llä pilkotulla pPACBHII:lla « ._· «····> ... «μ· · <r n «* , * · 1 .m« .*-··. *. ·» (- · ’ ««uv** ·. w m. »’ jr . > >' '*4m/w·· ·, r i* 38 esimerkeissä 3 ja 4 pääpiirteittäin esitettyjen menetelmien mukaan.
Puhdistettuja stabiileja transformantteja kasvatettiin ravistuskolveissa kuten esimerkissä 7 ja viljelmien 5 supernatanteissa oleva proteiini tutkittin isoelektrisen fokusoinnin avulla. Identifioitiin yksi transformantti (sille on annettu nimitys Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67), joka ei tuottanut mitään CBHII-proteiinia. Kuvion 5 kaista D osoittaa sellaiselta transformantilta saadun supernatantin, jolta on 10 poistettu sekä cbhl- että cbh2-geeni ja joka on tuotettu tämän keksinnön mukaisten menetelmien mukaan.
Kannasta Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67 eristettiin DNA, sitä pilkottiin EcoRI:llä ja Asp718:11a ja sille suoritettiin agaroo-sigeelielektroforeesi. DNA siirrettiin (blotting) tästä 15 geelistä kalvosuodattimelle ja hybridisoitiin 32P:llä merkityn pPACBHII:n kanssa (kuvio 7). Kuvion 7 kaista A osoittaa hybridisoitumistavan, joka havaittiin transfor-moimattomalta T. reesei -kannalta saadun DNA:n tapauksessa. Havaittiin 4,1 kiloemäksen EcoRI-fragmentti, joka si-20 saisi villityypin cbh2-geenin. Kaista B osoittaa hybridisoitumistavan, joka havaittiin kannan Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67 tapauksessa. Yksinäinen 4,1 kiloemäksen vyöhyke on poistettu ja korvattu kahdella vyöhykkeellä, jotka ovat suunnilleen 0,9 ja 3,1 kiloemästä. Tämä on odotettu malli, jos 25 pPACBHIIrsta saadun EcoRI-fragmentin yksi ainoa kopio on integroitunut tarkalleen cbh2-lokuksen kohtaan.
Samoja DNA-näytteitä pilkottiin myös EcoRI:llä ja suoritettiin Southern blot -analyysi kuten yllä. Tässä esimerkissä koetin oli 32P:llä merkitty plntCBHII. Tämä 30 plasmidi sisältää osan cbh2-geenin koodaavasta sekvenssistä cbh2-geenin sen kappaleen sisältä, joka oli poistettu plasmidissa ρΡΔΟΒΗΙΙ. Ei havaittu hybridisaatiota kannasta Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67 peräisin olevan DNA:n kanssa, mikä osoittaa, että cbh2-geeni oli poistettu eikä pUC-plasmidista peräi-35 sin olevia sekvenssejä ollut läsnä tässä kannassa.
39
Esimerkki 12 pEGipyr4:n kokoonpaneminen T. reesei -egll-geeni, joka koodaa EGI:n, on kloonattu kannalta RL-P37 peräisin olevan genomi-DNA:n 4,2 5 kiloemäksen HindiΙΙ-fragmenttlna hybridisoimalla oligonuk- leotidien kanssa, jotka on syntetisoitu julkaistun sekvenssin mukaan (Penttilä et ai., Gene 45 (1986) 253 - 263; van Arsdell et ai., Bio/Technology 5 (1987) 60 - 64). 3,6 kiloemäksen HindiII - BamHI-fragmentti otettiin tästä 10 kloonista ja yhdistettiin ligaation avulla T, reesei -pyr4-geenin sisältävän 1,6 kiloemäksen Hindin - BamHI-fragmentin kanssa, joka oli saatu pTpyr2;sta (katso esimerkki 2), ja pUC218:n kanssa (identtinen pUC219:n kanssa, katso esimerkki 25, mutta siinä on monen restriktioentsyy-15 min tunnistuskohta vastakkaisen suuntaisena), jota oli katkottu Hindlll:11a, jolloin saatiin plasmidi pEGIpyr4 (kuvio 8). pEGIpyr4:n pilkkominen HindIII:lla vapauttaisi DNA-fragmentin, joka sisältää ainoastaan T. reesei -geno-mi-DNA:ta (egll.- ja pyr4-geenin) 24 emäsparin sekvenssoi-20 tua synteettistä DNA:ta lisäksi, joka on kahden geenin välissä, ja 6 emäsparin sekvenssoitua, synteettistä DNA:ta lisäksi, joka on toisessa päässä (katso kuvio 8).
Esimerkki 13
Cytolase 123 -sellulaasin puhdistaminen sellulaasin 25 komponenteiksi CYTOLASE 123 -sellulaasi fraktioitiin seuraavalla tavalla. Sellulaasin komponenttien normaali jakauma on tässä sellulaasisysteemissä seuraavanlainen: CBH I 45-55 paino-% 30 CBH II 13-15 paino-% EG I 11 - 13 paino-% EG II 8 - 10 paino-% EG III 1-4 paino-% BG 0,5-1 paino-% ' ’ 1 · 1 " » < ’ I, -»p· 1 *- M. »> ** * · ’•«P . Τ' Ä ,· j* . . Γ * · ‘iMP .. ^ tö. * 40
Fraktiointi suoritettiin käyttäen pylväitä, jotka sisälsivät seuraavia hartseja: Sephadex G-25 -geelisuoda-tushartsi toiminimeltä Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsi ja SP Trisacryl M 5 -kationinvaihtohartsi toiminimeltä IBF Biotechnics (Savage, MD). CYTOLASE 123 -sellulaasista, 0,5 g, poistettiin suola käyttäen pylvästä, jossa oli 3 litraa Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia, 10 mM natriumfosfaattipuskuri-liuoksen, pH 6,8, kanssa. Liuos, josta oli poistettu suo-10 la, lisättiin sitten pylvääseen, jossa oli 20 ml QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsia. Tähän pylvääseen sitoutunut fraktio sisälsi CBH l;tä ja EG I:tä. Nämä komponentit erotettiin gradienttieluution avulla käyttäen vesi-liuosgradienttia, joka sisälsi 0 - noin 500 mM natriumklo-15 ridia. Fraktio, joka ei sitoutunut tähän pylvääseen, sisälsi CBH II ja EG II. Näistä fraktioista poistettiin suola käyttäen pylvästä, jossa oli Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia tasapainotettuna 10 mM natriumsitraatilla, pH 3,3. Tämä liuos, 200 ml, lisättiin sitten pylvääseen, jos-20 sa oli 20 ml SP Trisacryl M -kationinvaihtohartsia. CBH II ja EG II eluoitiin erikseen käyttäen vesiliuosgradienttia, joka sisälsi 0 - noin 200 mM natriumkloridia.
Noudatettaessa samanlaisia menetelmiä kuin esimerkin 13 menetelmä yllä ovat muita sellulaasijärjestelmiä, 25 jotka voidaan erotella komponentteihinsa, CELLUCAST (saa tavana toiminimeltä Novo Industry, Kööpenhamina, Tanska), RAPIDASE (saatavana toiminimeltä Gist Brocades, N.V.,
Delft, Hollanti) ja sellulaasijärjestelmät, jotka ovat peräisin lajeilta Trichoderma koningii, Penicillum sp. ja 30 vastaavilta.
Esimerkki 14 EG III:n puhdistaminen Cytolase 123 -sellulaasista
Yllä oleva esimerkki 13 esittelee useiden komponenttien eristämisen Cytolase 123 -sellulaasista. Kuiten-35 kin koska EG III on läsnä hyvin pieninä määrinä Cytolase 41 123 -sellulaasissa, käytettiin seuraavia menetelmiä tämän komponentin eristämiseen, A. EG III -sellulaasientsyymin uuttaminen suuressa mittakaavassa 5 100 litraa soluista vapaata sellulaasisuodosta kuu mennettiin noin 30 °C:seen. Kuumennettuun aineeseen lisättiin PEG 8000 (polyeteeniglykoli, mol. p. noin 8000) pitoisuudeksi noin 4 paino/tilavuus-% ja vedetöntä natrium-sulfaattia pitoisuudeksi noin 10 paino/tilavuus-%. Seos 10 muodosti kaksifaasisen nesteseoksen. Faasit erotettiin käyttäen SA-l-levypinosentrifugia. Faasit analysoitiin käyttäen isoelektrisen fokusoinnin geelien hopeavärjäystä. Erottaminen aikaansaatiin EG Ulille ja ksylanaasille. Talteenotettu koostumus sisälsi noin 20 - 50 paino-% EG 15 III.
Yllä olevan menetelmän yhteydessä polyeteeniglyko-lin, jonka molekyylipaino oli pienempi kuin noin 8 000, käyttö tuotti riittämättömän erottumisen; sen sijaan poly-eteeniglykolin, jonka molekyylipaino oli suurempi kuin 20 noin 8 000, käyttö johti toivottujen entsyymien poissulke miseen talteensaadusta koostumuksesta. Mitä tulee natrium-sulfaatin määrään, natriumsulfaattitasot, jotka olivat korkeampia kuin noin 10 paino/tilavuus-%, aiheuttivat saostumisongelmia; sen sijaan natriumsulfaattitasot, jotka 25 olivat alempia kuin noin 10 paino/tilavuus-%, tuottivat heikon erottumisen tai liuos jäi yhdeksi ainoaksi faasiksi .
B. EG III:n puhdistaminen fraktioinnin avulla EG III:n puhdistaminen suoritetaan fraktioimalla 30 täydellisestä sienisellulaasikoostumuksesta (CYTOLASE 123 -sellulaasi, kaupallisesti saatavana toiminimeltä Genencor International, South San Francisco, CA), jonka on tuottanut villityyppiä oleva Trichoderma reesel. Tarkemmin sanoen fraktiointi suoritetaan käyttäen pylväitä, jotka si-35 sältävät seuraavia hartseja: Sephadex G-25 -geelisuodatus- - τ · · · *< — · ~ · · »· ’ r ...... im -Μ*· — (· ’. ill· I . ’ n .· tm * ’ · «/ «a. *· Λ . . 1 ’ 42 hartsi toiminimeltä Sigma Chemical Company (St. Louis,
Mo), QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsi ja SP Trisacryl M -kationinvaihtohartsi toiminimeltä IBF Biotechnics (Savage, Md). CYTOLASE 123 -sellulaasista, 0,5 g, pois-5 tetaan suola käyttäen pylvästä, jossa on 3 litraa Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia, 10 mM natriumfosfaattipuskuri-liuoksen, pH 6,8, kanssa. Liuos, josta on poistettu suola, lisätään sitten pylvääseen, jossa on 20 ml QA Trisacryl M -anioninvaihtohartsia. Tähän pylvääseen sitoutunut fraktio 10 sisälsi CBH I ja EG I. Fraktio, joka ei sitoutunut tähän pylvääseen, sisältää CBH II, EG II ja EG III. Näistä fraktioista poistetaan suola käyttäen pylvästä, jossa on Sephadex G-25 -geelisuodatushartsia tasapainotettuna 10 mM natriumsitraatilla, pH 4,5. Tämä liuos, 200 ml, lisätään 15 sitten pylvääseen, jossa on 20 ml SP Trisacryl M -ka-tioninvaihtohartsia. EG III eluoitiin 100 ml:11a vesi-liuosta, jossa oli 200 mM natriumkloridia.
EG III:n eristämisen tehokkuuden lisäämiseksi voi olla toivottavaa käyttää Trichoderma reeseitä, joka on 20 geneettisesti muunnettu olemaan kykenemätön tuottamaan yhtä tai useampaa komponenteista EG I, EG II, CBH I ja/tai CBH II. Yhden tai useamman näistä komponenteista puuttuminen johtaa välttämättä EG III:n tehokkaampaan eristämiseen.
25 Samoin voi olla toivottavaa, että yllä kuvatut EG
III -koostumukset puhdistetaan lisäksi, niin että aikaansaadaan oleellisesti puhtaita EG III -koostumuksia, so. koostumuksia, jotka sisältävät EG III enemmän kuin noin 80 paino-% proteiinista. Esimerkiksi tällaista oleellisesti 30 puhdasta EG III -proteiinia voidaan saada käyttämällä menetelmästä A saatua ainetta menetelmässä B tai päinvastoin. Yksi erityinen menetelmä EG III:n lisäpuhdistusta varten on tämän esimerkin 14 osassa b) saadun EG III -näytteen lisäfraktiointi. Lisäfraktiointi suoritettiin 35 FPLC-järjestelmässä käyttäen Mono-S-HR 5/5 -pylvästä (saa- *· j* 1 *****. *· *fc- v * , , f > 1 <****». r λ *· hm* .»’«l * j# ; . i » ” 1*7·*.. c e. * 43 tavana toiminimeltä Pharmacia LKB Biotechnology, Piscata-way, NJ). FPLC-järjestelmä koostuu nestekromatografiakont-rollerista, 2 pumpusta, kaksirataisesta monitorista, frak-tionkokoojasta ja piirturista (joita kaikkia on saatavana 5 toiminimeltä Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Fraktiointi suoritettiin poistamalla suola 5 ml:sta tämän esimerkin 14 osassa b) valmistettua EG III -näytettä käyttäen 20 ml:n Sephadex G-25 -pylvästä, joka oli aikaisemmin tasapainotettu 10 mM natriumsitraatilla, pH 4. Pylväs 10 eluoitiin sitten 0 - 200 mM NaCl:n vesiliuosgradientilla nopeudella 0,5 ml/minuutti kooteen näytteitä 1 ml:n fraktioihin. EG III saatiin talteen fraktioissa 10 ja 11 ja sen määritettiin olevan yli 90 % puhdasta SDS-geelielek-troforeesin avulla. Näin puhdas EG III on sopivaa N-ter-15 minaalisen aminohapposekvenssin määritykseen tunnettujen tekniikkojen avulla.
Oleellisesti puhdasta EG III samoin kuin myös EG I ja EG II -komponentteja, jotka on puhdistettu esimerkissä 13 yllä, voidaan käyttää yksin tai seoksina tämän keksin-20 nön mukaisissa menetelmissä. Näillä EG-komponenteilla on seuraavat ominai suudet:
Mol.p. pl pH-optimi1 EG I n. 47 - 49 kD 4,7 n. 5 25 EG II n. 35 kD 5,5 n. 5 EG III n. 25 - 28 kD 7,4 n. 5,5 - 6,0 1. pH-optimi määritetty käyttäen aktiivisuutta RBB-CMC:aa kohtaan kuten esimerkissä 15 alla.
30 Näiden komponenttien seoksen käyttö tämän keksinnön käytännössä voi tuottaa synergistisen vaikutuksen pehmennyksen, värin säilyttämisen/palautuksen ja/tai tunnun parantamisessa verrattuna yhteen ainoaan komponenttiin. Toisaalta yhden ainoan komponentin käyttö tämän keksinnön 35 käytännössä voi olla stabiilimpaa tai tarjota laajemman lie rit · at . i* * im*1 ·, w M· *· m „ *' · > i«***r «a. ·· m · > ta**· r t*. ·* m . . i» a: 44 aktiivisuuskirjon sarjassa pH-arvoja. Esimerkiksi alla oleva esimerkki 15 osoittaa, että EG III:11a on huomattavaa aktiivisuutta RBB-CMC:aa kohtaan aikalisissä olosuhteissa.
5 Esimerkki 15
Sellulaasikoostumusten aktiivisuus sarjassa pH-ar- voja
Seuraavaa menetelmää käytettiin kahden erilaisen sellulaasikoostumuksen pH-profiilien määrittämiseen. En-10 simmäinen sellulaasikoostumus oli sellulaasikoostumus, josta oli poistettu CBH I ja CBH II, ja se oli valmistettu Trichoderma reeseiltä, joka oli geneettisesti muunnettu samalla tavoin kuin on kuvattu yllä olemaan kykenemätön tuottamaan CBH I- ja CBH II -komponentteja. Koska tämä 15 sellulaasikoostumus ei sisällä CBH I: tä eikä CBH II: ta, jotka yleensä käsittävät noin 58 - 70 % sellulaasikoostu-muksesta, joka on peräisin Trichoderma reeseiltä, tämä sellulaasikoostumus on välttämättä oleellisesti vapaa CBH I -tyyppiä olevista ja CBH II -tyyppiä olevista sel-20 lulaasin komponenteista ja on siten rikastettu EG-kom- ponenttien, so. komponenttien EG I, EG II, EG III ja vastaavien suhteen.
Toinen sellulaasikoostumus oli noin 20 - 40 % puhdas EG III -fraktio, joka oli eristetty Trichoderma ree-25 seiltä peräisin olevasta sellulaasikoostumuksesta käyttäen samanlaisia puhdistusmenetelmiä kuin esimerkin 14 osa b).
Näiden sellulaasikoostumusten aktiivisuus määritettiin 40 °C:ssa ja määritykset tehtiin käyttäen seuraavia menetelmiä.
30 Lisätään 5 - 20 μΐ sopivaa entsyymiliuosta, jonka
pitoisuus on riittävä tarjoamaan vaaditun määrän entsyymiä lopullisessa liuoksessa. Lisätään 250 μΐ 2-paino-%:ista RBB-CMC (Remazol Brilliant Blue R-karboksimetyylisellu-loosa -- kaupallisesti saatavana toiminimeltä MegaZyme, 6 35 Aitona Place, North Rocks, N.S.W. 2151, Austraalia) 0,05 M
·' .mj&w r .- tt . . a < .«*·* . r ä » j»» . . 1 ’ i*»*-.. # «ft. * Jr . . < · ri*T*· ¢- ’ J» ^ ' 45 sitraatti/fosfaattipuskuriliuoksessa pH-arvossa 4, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ja 8.
Sekoitetaan pyörresekoxttimen avulla ja inkuboidaan 40 °C:ssa 30 minuutin ajan. Jäähdytetään jäähauteessa 5 -5 10 minuutin ajan. Lisätään 1 000 μΐ metyylisellosolvia, joka sisältää 0,3 M natriumasetaattia ja 0,02 M sinkkiase-taattia. Sekoitetaan pyörresekoxttimen avulla ja seisotetaan 5-10 minuutin ajan. Sentrifugoidaan ja kaadetaan supernatantti kyvetteihin. Mitataan kussakin kyvetissä 10 olevan liuoksen optinen tiheys (OD) aallonpituudella 590 nm. Korkeammat optisen tiheyden tasot vastaavat entsyymiaktiivisuuden korkeampia tasoja.
Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 9, joka kuvaa sellaisen sellulaasikoostumuksen, josta on 15 poistettu CBH I ja CBH II, suhteellista aktiivisuutta verrattuna EG III -sellulaasikoostumukseen. Tästä kuviosta nähdään, että sellulaasikoostumuksella, josta on poistettu CBH I ja CBH II, on optimaalinen selluloosaa hajottava aktiivisuus RBB-CMC:aa kohtaan lähellä pH-arvoa 5,5 ja 20 sillä on jonkin verran aktiivisuutta aikalisissä pH-ar-voissa, so. pH-arvoissa yli 7:stä 8:aan. Toisaalta sellu-laasikoostumus, jossa on rikastetusti EG III, omaa optimaalisen selluloosaa hajottavan aktiivisuuden noin pH-ar-vossa 5,5 - 6 ja omaa merkittävää aktiivisuutta alkalisis-25 sa pH-arvoissa.
Yllä olevan esimerkin perusteella alan ammatti-ih-misen tarvitsisi ainoastaan säätää ja ylläpitää kankaiden-käsittelykoostumuksen vesiliuoksen pH-arvo siten, että sellulaasikoostumus on aktiivinen ja edullisesti omaa op-30 timiaktiivisuuden. Kuten yllä on mainittu, tällaiset sää döt ja ylläpito voivat käsittää sopivan puskuriaineen käytön.
• ä *» · · tr * 1' ' . mvvt ·-<·. «· .<-·- * «bp , m· ·» .· j» I * · 1 . ^ jj^· 46
Esimerkki 16
Sellulaasikoostumuksia koskeva pesulaitteella suoritettava lujuuderouenetyskoe Tässä esimerkissä tutkitaan erilaisten sellulaasi-5 koostumusten kykyä vähentää puuvillaa sisältävien kankaiden lujuutta. Tässä esimerkissä käytetään pH-arvossa 5 pidettyä sellulaasin vesiliuosta, koska useimpien Trichoderma reeseistä saatujen sellulaasin komponenttien aktiivisuus on suurin pH-arvossa 5 tai lähellä sitä ja 10 siten lujuudenmenetystulokset ovat selvimpiä, kun koe suoritetaan suunnilleen tässä pH-arvossa.
Erikoisesti tässä esimerkissä ensimmäinen analysoitu sellulaasikoostumus oli täydellinen sienisellulaasi-koostumus (CYTOLASE 123 -sellulaasi, kaupallisesti saata-15 vana toiminimeltä Genencor International, South San Francisco, CA), jonka oli tuottanut villityyppiä oleva Trichoderma reesei, ja se on identifioitu nimityksellä GC010.
Toinen analysoitu sellulaasikoostumus oli sellulaa-20 sikoostumus, josta oli poistettu CBH II, ja se oli valmistettu Trichoderma reeseiltä, joka oli geneettisesti muunnettu samalla tavoin kuin esimerkeissä 1-12 yllä ja 22 -30 alla olemaan kykenemätön ilmentämään CBH II:ta, ja se on identifioitu nimityksellä CBHIId. Koska CBH II käsittää 25 noin 15 %:iin saakka sellulaasikoostumuksesta, tämän komponentin poistaminen johtaa CBH I:n ja kaikkia EG-kompo-nenttien rikastettuihin määriin.
Kolmas analysoitu sellulaasikoostumus oli sellulaasikoostumus, josta oli poistettu CBH I ja CBH II ja joka 30 oli valmistettu Trichoderma reeseiltä, joka oli geneettisesti muunnettu samalla tavoin kuin on kuvattu yllä olemaan kykenemätön ilmentämään CBH I:tä ja CBH II:ta, ja se on identifioitu nimityksellä CBHI/IId. Koska tämä muunnettu mikro-organismi ei tuota CBH I:tä eikä CBH II:ta, sel-35 lulaasi on välttämättä vapaata kaikista CBH I -tyyppiä 47 olevista komponenteista samoin kuin kaikista CBH-komponen-teista.
Viimeinen analysoitu sellulaasikoostumus oli sellu-laasikoostumus, josta oli poistettu CBH I ja joka oli val-5 mistettu Trichoderma reeseiltä, joka oli geneettisesti muunnettu samalla tavoin kuin on kuvattu yllä olemaan kykenemätön ilmentämään CBH I:tä, ja se on identifioitu nimityksellä CBHId. Koska muunnettu mikro-organismi ei kykene ilmentämään CBH l:tä, tämä sellulaasikoostumus on valtio tämättä vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista sellulaasin komponenteista.
Testattiin yllä kuvattujen sellulaasikoostumusten vaikutusta puuvillaa sisältävien kankaiden lujuuden menetykseen pesulaitteessa (launderometer). Koostumukset nor-15 malisoitiin ensin niin että käytettiin EG-komponenttien yhtä suuria määriä. Kutakin sellulaasikoostumusta lisättiin sitten erillisiin liuoksiin, joissa oli 400 ml 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuriliuosta titrattuna pH-arvoon 5 ja joka sisälsi 0,5 ml ionoitumatonta pinta-aktiivista 20 ainetta. Kukin tulokseksi saaduista liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesulaitteen (launderometer) kanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin joukko marmorikuulia helpottamaan lujuuden menetystä sekä kooltaan 40 cm x 50 cm oleva puuvillakangas (100 % kudottua puuvillaa, saa-25 tavana lajinumerona 467 toiminimeltä Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846). Kanisteri suljettiin sitten ja kanisteri laskettiin pesulaitteen hauteeseen, joka pidettiin 43 °C:ssa. Kanisteria pyöritettiin sitten hauteessa nopeudella, joka oli vähintään noin 40 30 kierrosta minuutissa, noin 1 tunnin ajan. Sen jälkeen kangas otettiin pois, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin nor-maalikuivurissa.
Lujuudenmenetystulosten maksimoimiseksi yllä oleva menettely toistettiin vielä kaksi kertaa ja kolmannen kä-35 sittelyn jälkeen puuvillakankaat otettiin pois ja analy-
·—··« ' ·«" — · ·· i · < . III 11 I # * t> J» . ·· i 1 M . #· «.· Ar — , - ] I M jMT>· .. r Λ1 *· M
48 soitiin niiden lujuuden menetys. Lujuuden menetys mitattiin määrittämällä vetolujuus kuteen suunnassa ("FTS") käyttäen laitetta Instron Tester ja tuloksia verrattiin sellaisen kankaan FTS-arvoon, jota oli käsitelty samassa 5 liuoksessa sillä poikkeuksella, ettei oltu lisätty sel-lulaasia. Tämän analyysin tulokset on ilmoitettu prosenttisena lujuuden menetyksenä, joka määritetään seuraavasti: FTS sellulaasin kanssa 10 Lujuudenmenetys-% = 100 x [1 - -] FTS ilman sellulaasia Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 10, joka osoittaa, että CBH I:tä sisältävät koostumukset, so.
15 täydellinen sellulaasi (GC010) ja sellulaasi, josta oli poistettu CBH II, tuottivat suurimman lujuudenmenetyksen, kun taas koostumukset, jotka eivät sisältäneet CBH I:tä, tuottivat merkittävästi pienentyneen lujuudenmenetyksen verrattuna täydelliseen sellulaasiin ja sellulaasiin, jos-20 ta oli pioistettu CBH II. Näistä tuloksista nähdään, että CBH I -tyyppiä olevien komponenttien läsnäolo sellulaasi-koostumuksessa saa koostumuksen aiheuttamaan suurentuneen lujuudenmenetyksen verrattuna samanlaiseen koostumukseen, joka ei sisällä CBH I -tyyppiä olevia komponentteja.
25 Samoin nämä tulokset osoittavat, että CBH II myötä vaikuttaa jonkin verran lujuudenmenetykseen.
Siten näiden tulosten perusteella lujuuden menetystä vastustavia sellulaasikoostumuksia ovat sellaiset koostumukset, jotka ovat vapaita kaikista CBH I -tyyppiä ole-30 vista sellulaasin komponenteista ja edullisesti kaikista CBH-tyyppiä olevista sellulaasin komponenteista. Tässä suhteessa on mahdollista, että sellaiset sellulaasikoostu-mukset johtavat vielä pienempään lujuudenmenetykseen pH-arvossa > 7 kuin pH-arvossa 5 havaitut tulokset, jotka on 35 esitetty kuviossa 10.
“* w » *» * · I r m »> J» * * · r iiiok . r M> »· Jt ., < · ’ t ιΜπ .. ψ· η *· λ - ’ 1ΙΜΓ’ ·, · ·λ 49
Puuvillaa sisältävien kankaiden valmistuksen aikana kangas voi joutua rasitetuksi, ja siten rasitettuna se sisältää katkenneita ja epäjärjestyksessä olevia kuituja. Tällaiset kuidut antavat haitallisesti kankaalle kuluneen 5 ja himmeän ulkonäön. Kuitenkin on havaittu, että tämän keksinnön mukaiset menetelmät johtavat kankaan/värin paranemiseen. Tämän uskotaan aiheutuvan joidenkin katkenneista ja epäjärjestyksessä olevista kuiduista poistamisesta, josta on seurauksena kankaan ennen rasitetuksi joutumista 10 omaavan ulkonäön palautuminen.
Seuraavat esimerkit 17 ja 18 valaisevat tämän keksinnön hyödyllisyyttä. Huomataan, että näissä esimerkeissä käytettiin sekä kuluneita puuvillaisia T-paitoja (neuleita) että uusia puuvillaneuletuotteita. Kuluneen puuvillaa 15 sisältävän kankaan haalistunut ulkonäkö johtuu katken neiden ja irrallisten pintakuitujen kertymisestä kankaan pinnalle ajan kuluessa. Nämä kuidut aikaansaavat kankaalle haalistuneen ja takkuisen ulkonäön, ja siten näiden kuitujen poistaminen on välttämätön edellytys alkuperäisen 20 kirkkaan värin palauttamiselle kankaalle. Lisäksi katken neiden pintakuitujen kertyminen uusien puuvillaneuleiden pinnalle antaa sellaisille kudoksille samean ulkonäön.
Siten nämä kokeet ovat ilman muuta sovellettavissa rasitettujen puuvillaa sisältävien kankaiden värin paran-25 tautiseen, koska kumpaankin liittyy pintakuitujen poistaminen kankaasta.
Esimerkki 17 Värin parantaminen
Seuraavissa kokeissa analysoitiin EG-komponenttien 30 kykyä parantaa puuvillaa sisältävien kankaiden väriä. Erikoisesti ensimmäinen koe mittaa täydellisen sellulaasijärjestelmän (CYTOLASE 123 -sellulaasi, kaupallisesti saatavana toiminimeltä Genencor International, South San Francisco, CA), jonka on tuottanut villityyppiä oleva 35 Trichoderma reesei, kykyä poistaa pintakuituja puuvillaa • 11 · .. .«ip»- · « · ' - a- A- .· m < » i . » . 4» i' i. n«l . *" «h «» a * · 50 sisältävästä kankaasta eri pH-arvoissa. Tämän sellulaasin kykyä poistaa pintakuituja testattiin pesulaitteessa (launderometer). Sopiva määrä sellulaasia tarjoamaan joko 25 miljoonasosaa tai 100 miljoonasosaa sellulaasia lopul-5 lisessa koostumuksessa lisättiin erillisiin liuoksiin, joissa oli 400 ml 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuriliuosta, joka sisälsi 0,5 ml ionoitumatonta pinta-aktiivista ainetta. Valmistettiin näytteitä ja ne titrattiin niin että aikaansaatiin näytteitä pH-arvoissa 5, 6, 7 ja 7,5. Kukin 10 tulokseksi saaduista liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesulaitteen kanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin joukko marmorikuulia helpottamaan kuitujen poistoa sekä kooltaan 18 cm x 13 cm oleva puuvillakangas (100 % kudottua puuvillaa, saatavana lajina n:o 439W toiminimeltä 15 Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846). Kanisteri suljettiin sitten ja kanisteri laskettiin pesulaitteen hauteeseen, joka pidettiin 43 °C:ssa. Kanisteria pyöritettiin sitten hauteessa nopeudella, joka oli vähintään 40 kierrosta minuutissa, noin 1 tunnin ajan.
20 Sen jälkeen kangas otettiin pois, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin normaalikuivurissa.
Siten käsitellyt kankaat analysoitiin sitten kuitujen poiston suhteen arvioimalla paneelitestissä. Tarkemmin sanoen kankaiden (merkitsemättömiä) kuitutason arvioi 6 25 henkilöä. Kankaat arvioitiin silmämääräisesti pintakuitu-jen suhteen ja luokitettiin käyttäen asteikkoa 0-6. Asteikossa on kuusi standardia merkitsevien vertailujen mahdollistamiseksi. Standardit ovat seuraavat:
Luokitus Standardi9 30 0 kangasta ei ole käsitelty sellulaasilla 1 kangasta käsitelty15 8 miljoonasosalla sellulaasia 2 kangasta käsitelty 16 miljoonasosalla sellulaasia 3 kangasta käsitelty 20 miljoonasosalla sellulaasia 4 kangasta käsitelty 40 miljoonasosalla sellulaasia 35 5 kangasta käsitelty 50 miljoonasosalla sellulaasia 6 kangasta käsitelty 100 miljoonasosalla sellulaasia τ- Γ — · ·*.··>« *'. «i.—l . ·«·.·-·· I» ' c .MM**, *· JW Ϊ* ''illF'-rA »· m V " 51 a) Kaikissa standardeissa kangas oli 100 % puuvil-lalakanakangasta oleva standardisoitu testikangas (laji nro 439W), jota on saatavana toiminiraeltä Test Fabrics,
Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846.
5 b) Kaikkia näytteitä käsiteltiin samalla sellulaa- sikoostumuksella. Sellulaasipitoisuudet ovat kokonaispro-teiinipitoisuuksina. Pesulaitteen käsittelyolosuhteet ovat samat kuin on esitetty yllä esimerkissä 16.
10 Luokiteltavalle kankaalle annettiin luokitus, joka lähimmin sopi yhteen jonkin standardeista kanssa. Kankaiden täydellisen analyysin jälkeen kaikkien henkilöiden kullekin kankaalle merkitsemät arvot laskettiin yhteen ja muodostettiin keskiarvo.
15 Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 11.
Erikoisesti kuvio 11 kuvaa sitä, että samassa pH-arvossa nähdään annoksesta riippuvainen vaikutus poistettujen kuitujen määrässä. Toisin sanoen samassa pH-arvossa kankaiden, joita oli käsitelty suuremmalla määrällä sellulaasia, 20 kuidunpoistomäärät olivat suurempia verrattuna kankaisiin, joita oli käsitelty pienemmällä määrällä sellulaasia. Lisäksi tämän kuvion tulokset osoittavat, että korkeammissa pH-arvoissa kuitujen poistoa voidaan vielä suorittaa pelkästään käyttämällä suurempia sellulaasipitoisuuksia.
25 Toisessa kokeessa verrattiin kahden erilaisen sel- lulaasikoostumuksen kykyä poistaa kuitua. Tarkemmin sanoen ensimmäinen analysoitu sellulaasikoostumus oli täydellinen sellulaasijärjestelmä (CYTOLASE 123 -sellulaasi, kaupallisesti saatavana toiminimeltä Genencor International, 30 South San Francisco, CA), jonka oli tuottanut villityyppiä oleva Trichoderma reesei, ja se on identifioitu nimityksellä GC010.
Toinen analysoitu sellulaasikoostumus oli sellulaasikoostumus, joka oli oleellisesti vapaa kaikista CBH-35 tyyppiä olevista komponenteista (mukaan lukien CBH I
- ** - * ·>.Mjmm m- ·*. v j» , s | ' - ciMF 'W «k. ·' A » ι 'ι·Ρ' ·,» «Λ #’ Jr · «r « ’ 'r ^ , 52 -tyyppiä olevat komponentit) ja joka koostumus oli valmistettu Trichoderma reeseiltä, joka oli geneettisesti muunnettu samalla tavoin kuin on kuvattu yllä olemaan kykenemätön ilmentämään CBH I ja CBH II, ja se on identifioitu 5 nimityksellä CBHI/II deletoitu. Koska CBH I ja CBH II käsittävät noin 70 %:iin saakka sellulaasikoostumuksesta, näiden komponenttien poistaminen johtaa kaikkien EG-kom-ponenttien rikastettuihin määriin.
Näiden koostumusten kykyä poistaa pintakuituja tes-10 tattiin pesulaitteessa. Sopiva määrä sellulaasia aikaansaamaan EG-komponenttien vaaditut pitoisuudet lopullisissa koostumuksissa lisättiin erillisiin liuoksiin, joissa oli 400 ml 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuriliuosta, joka sisälsi 0,5 ml ionoitumatonta pinta-aktiivista ainetta. Val-15 mistettiin näytteitä ja ne tiirattiin pH-arvoon 5. Kukin tulokseksi saaduista liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesulaitteen kanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin joukko marmorikuulia helpottamaan kuitujen poistoa sekä kooltaan 18 cm x 13 cm oleva puuvillakangas (100 % 20 kudottua puuvillaa, saatavana lajinumerona 439W toimini-meltä Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846). Kanisteri suljettiin sitten ja kanisteri laskettiin pesulaitteen hauteeseen, joka pidettiin 43 °C:ssa.
Kanisteria pyöritettiin sitten hauteessa nopeudella, joka 25 oli vähintään noin 40 kierrosta minuutissa, noin 1 tunnin ajan. Sen jälkeen kangas otettiin pois, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin normaalikuivurissa.
Siten käsitellyt kankaat analysoitiin sitten kuitujen poiston suhteen arvioimalla paneelitestissä, joka on 30 kuvattu yllä. Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 12, joka on piirretty arvioitujen EG-pitoisuuksien perusteella. Erityisesti kuvio 12 kuvaa sitä, että GC010- ja CBH I/II deletoitu -sellulaasikoostumukset antoivat oleellisesti identtiset kuitujenpoistotulokset oleellisesti 35 yhtä suurilla EG-pitoisuuksilla. Tämän kuvion tulokset η ".μμ,,γα' .· jt k ϊ' ',***,. ra: »· j* J’ ·ίλλ*1 λ . ,t »· ''((»»•j.r *. *· j> . ..* i’ ·'****·> 53 viittaavat siihen, että EG-komponentit aikaansaavat kuitujen poistumisen. Nämä tulokset yhdessä kuvion 11 tulosten kanssa osoittavat, että EG-komponentit poistavat pin-takuituja.
5 Esimerkki 18
Tergotometri - värin palautus Tämä esimerkki on lisänä esimerkille 17 ja vahvistaa, etteivät CBH-tyyppiä olevat komponentit ole välttämättömiä värin parantamisessa, ja tämän esimerkin tarkoi-10 tuksena on tutkia CBH-tyyppiä olevien komponenttien suhteen vajaiden sellulaasikoostumusten kykyä parantaa puuvillaa sisältävien kankaiden väriä.
Erikoisesti tässä esimerkissä käytetty sellulaasi-koostumus oli oleellisesti vapaa kaikista CBH-tyyppiä ole-15 vista komponenteista (mukaan lukien CBH I -tyyppiä olevat komponentit), sillä tämä koostumus oli valmistettu Trichoderma reeseiltä, joka oli geneettisesti muunnettu samalla tavalla kuin on kuvattu yllä olemaan kykenemätön ilmentämään CBH I ja CBH II. Koska CBH I ja CBH II käsit-20 tävät noin 70 %:iin saakka sellulaasikoostumuksesta, näiden komponenttien poistaminen johtaa kaikkien EG-komponenttien rikastettuihin määriin.
Koe suoritettiin lisäämällä riittävä pitoisuus tätä sellulaasikoostumusta 50 mM sitraatti/fosfaattipuskuri-25 liuokseen tarjoamaan 500 miljoonasosaa sellulaasia. Liuos titrattiin pH-arvoon 5, ja se sisälsi 0,1 paino-% ionoi-tumatonta pinta-aktiivista ainetta (Grescoterg GL100 -kaupallisesti saatavana toiminimeltä Gresco Mfg., Thomas-ville, NC 27360). Kooltaan 25 cm x 25 cm oleva haalistunut 30 puuvillaa sisältävä kangas sekä kooltaan 25 cm x 25 cm oleva uusi neuleteos, jossa oli irrallisia ja katkenneita pintakuituja, pantiin sitten 1 litraan tätä puskuriliuosta ja sitä seisotettiin 43 °C:ssa 30 minuutin ajan ja sekoitettiin sitten 30 minuutin ajan nopeudella 100 kierrosta 35 minuutissa. Kankaat poistettiin sitten puskuriliuoksesta, » ·«*··" τι .1 Mi ·. " f .· · . f* ->.*»«.. r tai * jt i .* I ’ · ·, r · j» 54 huuhdottiin ja kuivattiin. Tulokseksi saatuja kankaita verrattiin sitten kankaaseen ennen käsittelyä. Tämän analyysin tulokset ovat seuraavanlaiset: 5 Puuvillaa sisältävä materiaali Tulos kulunut puuvillainen T-paita hyöty nähty uusi puuvillaneule hyöty nähty
Termi "hyöty nähty" tarkoittaa, että käsitelty kan-10 gas osoittaa värin paranemista (so. on vähemmän haalistunut) verrattuna käsittelemättömään kankaaseen, mikä käsittää katkenneiden pintakuitujen poistamista mukaan lukien katkenneita pintakuituja, jotka ovat muodostuneet tuloksena tergotometrin käytöstä. Nämä tulokset vahvistavat esi-15 merkin 17 tulokset, että CBH-tyyppiä olevien komponenttien läsnäolo ei ole välttämätön haalistuneiden puuvillaa sisältävien kankaiden värin palautumisen aikaansaamiseksi.
On mahdollista, että tällaisten sellulaasikoostu-musten käyttö olisi hyödyllistä kankaan muokkaamisen aika-20 na, koska tällaiset koostumukset poistaisivat muokkaamisen aikana muodostuvia katkenneita/irrallisia kuituja ilman kankaan haitallista lujuuden menetystä.
Esimerkki 19
Pehmeys 25 Tämä esimerkki osoittaa, että CBH-tyyppiä olevien komponenttien läsnäolo ei ole oleellista parantuneen pehmeyden aikaansaamiseksi puuvillaa sisältäville kankaille. Erikoisesti tässä esimerkissä käytetään sellulaasikoostu-musta, joka on vapaa kaikista CBH-tyyppiä olevista kompo-30 nenteista ja joka koostumus on saatu Trichoderma reeseil-tä, joka on geneettisesti muunnettu yllä kuvatulla tavalla olemaan kykenemätön tuottamaan CBH I- ja CBH II -kompo-nenttej a.
Testattiin tämän sellulaasikoostumuksen kykyä peh-35 mentää froteepesulappua. Tarkemmin sanoen pehmentämättömiä «*> *· m i · >.r a. f jt . . i< "i«« ..ra »· m i ’ •tMP'·. r & ·· jh ί,μ" #· «& 55 240 g:n puuvillafroteeliinoja, 36 cm x 38 cm (saatavana lajinumerona 420NS toiminimeltä Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846), leikattiin kooltaan 18 cm x 19 cm oleviksi tilkuiksi.
5 Yllä kuvatun sellulaasikoostumuksen kykyä pehmentää näitä tilkkuja testattiin pesulaitteessa (launderometer). Tarkemmin sanoen sopiva määrä sellulaasia tarjoamaan 500 miljoonasosaa, 250 miljoonasosaa, 100 miljoonasosaa, 50 miljoonasosaa ja 10 miljoonasosaa sellulaasia lopullisessa 10 sellulaasiliuoksessa lisättiin erillisiin liuoksiin, joissa oli 400 ml 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuriliuosta, joka sisälsi 0,025 paino-% ionoitumatonta pinta-aktiivista ainetta (Triton X114). Lisäksi suoritettiin sokea koe, joka sisälsi saman liuoksen mutta ilman lisättyä sellulaa-15 siä. Siten valmistetut näytteet titrattiin pH-arvoon 5.
Kukin tulokseksi saaduista liuoksista lisättiin sitten erilliseen pesulaitteen kanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin joukko marmorikuulia helpottamaan pehmeyden aikaansaamista sekä yllä kuvattuja puuvillatilkkuja. Kaikkia 20 olosuhteita tutkittiin kolmena rinnakkaiskokeena käyttäen kahta tilkkua kanisteria kohti. Kukin kanisteri suljettiin sitten ja kanisteri laskettiin pesulaitteen hauteeseen, joka pidettiin 37 °C:ssa. Kanisteria pyöritettiin sitten hauteessa nopeudella, joka oli vähintään noin 40 kierrosta 25 minuutissa, noin 1 tunnin ajan. Sen jälkeen tilkut otettiin pois, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin normaalikuivu-rissa.
Tilkkujen pehmeys analysoitiin sitten arvioimalla etusijakokeessa. Tarkemmin sanoen kuudelle panelistille 30 annettiin kullekin oma tilkkujoukko ja heitä pyydettiin luokittamaan ne pehmeyden suhteen pehmeyskriteerien kuten koko kankaan taipuisuuden perusteella. Tilkut, jotka oli saatu käsittelystä viidellä erilaisella entsyymipitoisuudella ja sokeakokeesta, pantiin näkösuojan taakse ja pane-35 listeja pyydettiin järjestämään ne vähiten pehmeästä peh- . 4’ ''iMc-.ra; *· λ . . ΐ’ a » ja .► ί' ‘^«Ρ’ι.ηι. » *’ ·<·, r 19. *; μ . f 'u 56 meimpään. Kullekin tilkulle annettiin pistemäärä, joka perustui sen järjestysasemaan muihin tilkkuihin verrattuna; tällöin 5 oli pehmein ja 0 oli vähiten pehmeä. Kaikilta panelisteista saadut pistemäärät laskettiin yhteen 5 ja sitten määritettiin keskiarvot.
Tämän keskiarvojen määrittämisen tulokset on esitetty kuviossa 13. Erikoisesti nämä tulokset osoittavat, että suuremmilla pitoisuuksilla saadaan parantunut pehmennys. On merkittävää, että tämä parantunut pehmennys ai-10 kaansaadaan ilman CBH I:n tai II:n läsnäoloa sellulaasi-koostumuksessa.
Esimerkki 20
Tuntu ja ulkonäkö Tämä esimerkki osoittaa, että CBH-tyyppiä olevien 15 komponenttien läsnäolo ei ole olleellista parannetun tunnun ja ulkonäön antamiseksi puuvillaa sisältäville kankaille. Erikoisesti tässä esimerkissä käytetään sellaisel-ta Trichoderma reeseiltä peräisin olevaa sellulaasikoos-tumusta, joka on geneettisesti muunnettu yllä kuvatulla 20 tavalla olemaan kykenemätön tuottamaan mitään CBH-tyyppiä olevia komponentteja (so. kykenemätön tuottamaan CBH I- ja II -komponentteja).
Testattiin tämän sellulaasikoostumuksen kykyä parantaa puuvillaa sisältävien kankaiden ulkonäköä. Erikoi-25 sesti käytettiin sopivan kokoista 100 % puuvillaa olevaa lakanakangasta (saatavana lajina n:o 439W toiminimeltä Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Milddlesex, NJ 08846) tämän esimerkin ulkonäköä koskevissa osissa.
Testattiin yllä kuvatun sellulaasikoostumuksen ky-30 kyä parantaa näiden näytteiden ulkonäköä pesulaitteessa (launderometer), Tarkemmin sanoen sopiva määrä sellu-laasia, josta puuttui CBH I ja II, aikaansaamaan 25 miljoonasosaa, 50 miljoonasosaa ja 100 miljoonasosaa lopullisessa sellulaasiliuoksessa lisättiin erillisiin liuoksiin, 35 joissa oli 400 ml 20 mM sitraatti/fosfaattipuskuriliuosta, » ' ” ' ·-*" · ·· “ *· j 1 \ .an . w « J · ’ t ·«> . r Λ v J* . . «(Μη.. W U. f 57 joka sisälsi 0,025 paino-% ionoitumatonta pinta-aktiivista ainetta (Triton X114). Lisäksi tehtiin sokea koe, joka sisälsi saman liuoksen, mutta ilman lisättyä sellulaasia.
Siten valmistetut näytteet titrattiin pH-arvoon 5. Kukin 5 tulokseksi saaduista liuoksista lisättiin sitten eril liseen pesulaitteen kanisteriin. Näihin kanistereihin lisättiin joukko marmorikuulia helpottamaan ulkonäön parannusten aikaansaamista sekä yllä kuvattuja puuvi11anäytteitä. Kukin kanisteri suljettiin sitten ja kanisteri lasket-10 tiin pesulaitteen hauteeseen, joka pidettiin noin 40 °C:ssa. Kanisteria pyöritettiin sitten hauteessa nopeudella, joka oli vähintään noin 40 kierrosta minuutissa, noin 1 tunnin ajan. Sen jälkeen näytteet otettiin pois, huuhdottiin hyvin ja kuivattiin normaalikuivurissa.
15 Näytteet analysoitiin sitten parantuneen ulkonäön suhteen arvioimalla etusijatestissä. Tarkemmin sanoen 6 panelistille annettiin kyseiset 4 näytettä (ei identifioitu) ja heidän pyydettiin luokittaa ne ulkonäön suhteen. Panelisteja neuvottiin, että termi "ulkonäkö" viittaa puu-20 villaa sisältävän kankaan silmin havaittavaan fysikaaliseen ulkomuotoon ja sen määrää osaksi nukan, pintakuitujen ja vastaavien läsnäolo kankaan pinnalla tai puuttuminen siitä sekä se, että joko kyetään tai ei kyetä erottamaan kankaan rakennetta (kudosta). Kankailla, joissa on vähän 25 mikäli ollenkaan nukkaa ja pintakuituja ja joissa rakenne (kudos) on selvästi havaittavissa, on parantunut ulkonäkö verrattuna kankaisiin, joissa on nukkaa ja/tai irrallisia kuituja ja/tai huomaamaton kudos.
Panelistit merkitsivät sitten pistemäärän kullekin 30 näytteelle sen järjestysaseman muihin näytteisiin nähden perusteella; 4 oli tällöin paras ulkonäkö ja 1 oli huonoin ulkonäkö. Kultakin panelistilta saadut pisteet laskettiin yhteen ja sitten määritettiin keskiarvot. Tämän testin tulokset olivat seuraavanlaiset: • · " ** » · · ·;» · ·,. aitn > f -· * . j t .jum . j* * Jt -- t' ' i iiM«* ·. r· ϋ. V jf , „ , * · 'ι,^Τ··., w « 58
Sellulaasin määrä Keskimääräinen ulkonäkö ei ollenkaan 1 25 miljoonasosaa 2 50 miljoonasosaa 3 5 100 miljoonasosaa 4
Sitten testattiin sellulaasikoostumuksen, josta oli poistettu CBH I ja II, kykyä parantaa puuvillaa sisältävien kankaiden tuntua. Tarkemmin sanoen käytettiin sopivan 10 kokoista 100 % puuvillaa olevaa lakanakangasta (saatavana lajina nro 439W toiminimeltä Test Fabrics, Inc., 200 Blackford Ave., Middlesex, NJ 08846) tämän esimerkin tuntua koskevissa osissa.
Testattiin yllä kuvatun sellulaasikoostumuksen ky-15 kyä parantaa näiden näytteiden tuntua pesulaitteessa. Tarkemmin sanoen sopiva määrä sellulaasia tarjoamaan 500 miljoonasosaa, 1 000 miljoonasosaa ja 2 000 miljoonasosaa sellulaasia lopullisessa sellulaasiliuoksessa lisättiin erillisiin liuoksiin, joissa oli 24 1 20 mM sitraatti/fos-20 faattipuskuriliuosta. Lisäksi tehtiin sokea koe, joka si sälsi saman liuoksen, mutta ilman lisättyä sellulaasia.
Kaikki testit suoritettiin pH-arvossa 5,8 ja käyttäen teollisuuspesulaitetta. Pesulaitetta käytettiin 50 °C:ssa, kokonaistilavuus oli 24 1, nesteen ja kankaan suhde oli 25 50 : 1 (painon suhde painoon) ja pesulaitetta käytettiin 30 minuutin ajan. Sen jälkeen näytteet otettiin pois ja kuivattiin teollisuuskuivurissa.
Näytteet analysoitiin sitten parantuneen tunnun suhteen arvioimalla etusijatestissä. Tarkemmin sanoen 5 30 panelistille annettiin kyseiset 4 näytettä (ei identifioitu) ja heidän pyydettiin luokittaa ne tunnun suhteen. Panelisteja opastettiin, että parantuneen tunnun omaavat kankaat tuntuvat kosketeltaessa sileämmiltä ja silkkimäi-semmiltä kuin toiset kankaat ja että tuntu erotetaan sel-35 laisista ominaisuuksista kuin pehmeys (joka viittaa pikem- ' .» >’ »· * - rT •'t*»*’ ·.*«* ♦’ #-.**' «*. »; ·1 w φ ^ t; λ . ,;r” ϊ» 59 minkin kankaan taipuisuuteen kuin sen tuntuun), paksuus, väri tai muut fysikaaliset ominaisuudet, jotka eivät liity knakaan s ileyteen.
Panelistit merkitsivät sitten kullekin näytteelle 5 pistemäärän sen järjestysaseman muihin näytteisiin nähden perusteella; 4 omasi parhaan tunnun ja 1 omasi huonoimman tunnun. Kultakin panelistilta saadut pisteet laskettiin yhteen ja sitten määritettiin keskiarvot. Tämän testin tulokset ovat seuraavanlaiset: 10 Sellulaasin määrä Keskimääräinen tuntu ei ollenkaan 1,5 ± 0,5 500 miljoonasosaa 1,7 ± 0,4 1 000 miljoonasosaa 3,2 ± 0,4 2 000 miljoonasosaa 3,8 ± 0,4 15
Yllä olevat tulokset osoittavat, että tunnun ja ulkonäön parannuksia voidaan saada aikaan sellulaasikoos-tumuksilla, jotka ovat vapaita kaikista CBH-tyyppiä olevista komponenteista.
20 Esimerkki 21
Kivipesty ulkonäkö Tämä esimerkki osoittaa, että CBH-tyyppiä olevien komponenttien läsnäolo ei ole oleellista kivipestyn ulkonäön aikaansaamiseksi puuvillaa sisältäville kankaille.
25 Erikoisesti tässä esimerkissä käytetään sellaiselta Trichoderma reeseiltä peräisin olevaa sellulaasikoostumus-ta, joka on geneettisesti muunnettu yllä kuvatulla tavalla olemaan kykenemätön tuottamaan mitään CBH-tyyppiä olevia komponentteja (so. kykenemätön tuottamaan CBH I- ja II 30 -komponentteja), sekä täydellistä sellulaasikoostumusta, joka on peräisin Trichoderma reeseiltä ja joka on saatavana Cytolase 123 -sellulaasina toiminimeltä Genencor International, South San Francisco, Kalifornia.
Testattiin näiden sellulaasikoostumusten kykyä an-35 taa kivipesty ulkonäkö värjätyille puuvillaa sisältäville * » ' · · · -.ψ ^ 4· Jt . .. · · · ' 14Μ·- Λ ψ· «h ·' J» , , « ’ ’ tm/r~ Λ I* * J» . .* ί ' '«UV*** ·. # 4*. , 60 denimhousuille. Tarkemmin sanoen näytteet valmistettiin käyttäen teollisuuspesulaitetta ja -kuivuria seuraavissa olosuhteissa: 10 mM sitraatti/fosfaattipuskuriliuos pH 5 5 kokonaistilavuus 40 1 43 °C (110 eF) neljä paria denimhousuja suoritusoaika 1 tunti 50 miljoonasosaa sellulaasia, josta oli poistettu 10 CBH I ja II, tai 100 miljoonasosaa täydellistä sellulaasia (so. suunnilleen yhtä suurina EG-pitoisuuksina)
Kahdeksan panelistia arvioi näytteet niiden kivi-pestyn ulkonäön suhteen. Kaikki kahdeksan panelistia va-15 litsevat 100 miljoonasosalla täydellistä sellulaasia käsiteltyjen housujen omaavan paremman kivipestyn ulkonäön verrattuna ilman entsyymiä käsiteltyihin housuihin. Neljä kahdeksasta panelistista valitsee sellulaasilla, josta on poistettu CBH I ja II, käiteltyjen housujen omaavan parem-20 man kivipestyn ulkonäön kuin täydellisellä sellulaasilla käsiteltyjen housujen; sen sijaan muut panelistit valitsevat täydellisellä sellulaasilla käsiteltyjen housujen omaavan paremman kivipestyn ulkonäön. Nämä tulokset osoittavat, ettei sellulaasilla, josta oli poistettu CBH I ja 25 II, käsiteltyjä housuja voitu erottaa täydellisellä sellulaasilla käsitellyistä housuista ja etteivät CBH I ja/tai CBH II ole oleellisia kivipestyn ulkonäön aikaansaamiseksi puuvillaa sisältäville kankaille.
Ottaen huomioon esimerkit 16 - 21, sellulaasikoos-30 tumuksia, jotka ovat vapaita CBH I -tyyppiä olevista komponenteista ja peräisin muilta mikro-organismeilta kuin Trichoderma reesei, voitaisiin käyttää näissä esimerkeissä kuvattujen sellulaasikoostumusten asemesta. Erityisesti EG-tyyppiä olevia komponentteja sisältävän sellulaasikoos-35 tumuksen lähde ei ole tärkeä tässä keksinnössä, ja mitä •ier*'·-'. m au ♦' M · ,» f ' 'tefl*· ·, Ψ 1^ #· Λ . .Λ *' 't.*/*·' ·.··* . ί’ A - t* ·> r «*. . *. *·..*'· 61 tahansa sienisellulaasikoostumusta, joka sisältää yhtä tai useampaa EG-tyyppiä olevaa komponenttia ja on oleellisesti vapaa kaikista CBH i -tyyppiä olevista komponenteista, voidaan käyttää tässä. Esimerkiksi sienisellulaaseja käy-5 tettäväksi valmistettaessa tässä keksinnössä käytettyjä sienisellulaasikoostumuksia voidaan saada lajeilta Trichoderma koningii, Pencillum sp. ja vastaavilta tai voidaan käyttää kaupallisesti saatavana olevia sellulaase-ja, so. CELLUCAST (saatavana toiminimeltä Novo Industry, 10 Kööpenhamina, Tanska), RAPIDASE (saatavana toiminimeltä Gist Brocades, N. V., Delft, Hollanti) ja vastaavia.
Esimerkki 22
Trichoderma reesein transformantteja, jotka sisältävät plasmidin pEGIpyr4 15 T. reesei -kannan RutC30 (Sheir-Neiss ja Mon- tenecourt, Appi. Microbiol. Biotechnol. 20 (1984) 46 - 53) pyr4-vajaa johdannainen saatiin käyttäen menetelmää, joka on pääpiirteittäin kuvattu esimerkissä 1. Tämän kannan protoplasteja transformoitiin pilkkomattomalla 20 pEGIpyr4:llä ja puhdistettiin stabiileja transformantteja.
Viittä näistä transformanteista (joille on annettu nimitykset EP2, EP4, EP5, EP6, EP11) sekä transformoima-tonta RutC30 istutettiin 50 ml:aan YEG-elatusainetta (hii-vauutetta 5 g/1; glukoosia 20 g/1) 250 ml:n ravistuspul-25 loihin ja kasvatettiin ravistaen kahden päivän ajan 28 °C:ssa. Tulokseksi saatu huovasto pestiin steriilillä vedellä ja lisättiin 50 ml:aan TSF-elatusainetta (0,05 M sitraatti-fosfaattipuskuriliuos, pH 5,0; Avicel- hienoki-teistä selluloosaa 10 g/1; KH2P04 2,0 g/1; (NH4)2S04 30 1,4 g/1; proteoosipeptonia 1,0 g/1; ureaa 0,3 g/1;
MgS04·7H20 0,3 g/1; CaCl2 0,3 g/1; FeS04*7H20 5,0 mg/1;
MnS04>H20 1,6 mg/1; ZnS04 1,4 mg/1; CoCl2 2,0 mg/1; 0,1 %
Tween 80). Näitä viljelmiä inkuboitiin ravistaen vielä neljän päivän ajan 28 °C:ssa. Näistä viljelmistä otettiin 35 supernatantin näytteitä ja analyysejä, jotka oli suunni- .· · ‘ . IW , *- ab- 1 , Jfc *· J* . „ i ’' <Μ*< .·, r & *’ Μ . ί · ’ < ,Μ*· /,ri(i (· * 62 teltu proteiinin kokonaismäärän ja endoglukanaasiaktiivi-suuden mittaamiseksi, suoritettiin kuten on kuvattu alla.
Endoglukanaasin määritys perustui liukoisten, värjättyjen oligosakkaridien vapautumiseen Remazol Brilliant 5 Blue -karboksimetyyliselluloosasta (RBB-CMC, hankittu toi-minimeltä MegaZyme, North Rocks, NSW, Austraalia). Substraatti valmistettiin lisäämällä 2 g kuivaa RBB-CMC 80 ml:aan juuri kiehutettua deionoitua vettä sekoittaen voimakkaasti. Huoneenlämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen 10 lisättiin 5 ml 2 M natriumasetaattipuskuriliuosta (pH 4,8) ja pH säädettiin arvoon 4,5. Tilavuus säädettiin lopuksi 100 ml:ksi deionoidulla vedellä ja natriumatsidia lisättiin lopulliseksi pitoisuudeksi 0,02 %. Näytteitä T, ree-sei -kontrolliviljelmästä, pEGIpyr4-transformanttiviljel-15 män supernatantista tai 0,1 M natriumasetaattia sokeako-keeksi (10 - 20 μΐ) pantiin putkiin, 250 μΐ substraattia lisättiin ja putkia inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Putket pantiin jään päälle 10 minuutin ajaksi ja 1 ml kylmää saostinta (3,3 % natriumasetaattia, 0,4 % 20 sinkkiasetaattia, pH 5 HCl:n avulla, 76 % etanolia) lisättiin sitten. Putkia sekoitettiin pyörresekoittimen avulla ja seisotettiin viiden minuutin ajan ennen kuin sentrifu-goitiin kolmen minuutin ajan nopeudella noin 13 000 x g.
Optinen tiheys mitattiin spektrofotometrisesti aallonpi-25 tuudella 590 - 600 nm.
Käytetty proteiinin määritys oli BCA (bikinkoniini-happo) -määritys käyttäen reagensseja, jotka oli hankittu toiminimeltä Pierce, Rockford, Illinois, USA, Standardi oli naudan seerumin albumiini (BSA). BCA-reagenssi valmis-30 tettiin sekoittamalla 1 osa reagenssia B 50 osan kanssa reagenssia A. Yksi ml BCA-reagenssia sekoitettiin 50 μ1:η kanssa sopivasti laimennettua BSA tai koeviljelmän super-natanttia. Inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa ja lopuksi mitattiin optinen tiheys spektrofotometrisesti aal-35 lonpituudella 562 nm.
»' · »· »' f * ' 'ιΜ«· . λ: »· Λ . ί · ' ΜΙ1 . Λ »· JU * ’ > IM*· . «t V Λ » ι · - ’ iMrt»’ j. *' Ο, 63
Yllä kuvattujen määritysten tulokset on esitetty taulukossa 1. On selvää, että jotkut transformanteista tuottivat suurentuneita määriä endoglukanaasiaktiivisuutta verrattuna transformoimattomaan kantaan RutC30. Ajatel-5 laan, että endoglukanaasit ja eksosellobiohydrolaasit, jotka transformoimaton T. reesei tuottaa, muodostavat vastaavasti noin 20 ja 70 % eritetystä proteiinin kokonaismäärästä, Sen vuoksi sellaisen transformantin kuin EPS, joka tuottaa noin neljä kertaa enemmän endoglukanaasia 10 kuin kanta RutC30, odottaisi erittävän suunnilleen yhtä suuria määriä endoglukanaasityyppiä olevia ja eksosello-biohydrolaasityyppiä olevia proteiineja.
Tässä esimerkissä kuvatut transformantit saatiin käyttäen ehyttä pEGIpyr4 ja sisältävät genomiin integroi-15 tuneena DNA-sekvenssejä, jotka ovat peräisin pUC-plasmi-dista. Ennen transformaatiota olisi mahdollista pilkkoa pEGIpyr4 Hindin:11a ja eristää suurempi DNA-fragmentti, joka sisältää ainoastaan T, reesei DNA:ta. T. reesein transformaatio tällä eristetyllä DNA-fragmentilla tekisi 20 mahdolliseksi sellaisten transformanttien eristämisen, jotka ylituottavat EGI eivätkä sisällä vieraalta lajilta peräisin olevia DNA-sekvenssejä lukuun ottamatta kahta lyhyttä synteettisen DNA:n palasta, jotka on esitetty kuviossa 8. Olisi myös mahdollista käyttää pEGIpyr4 sellai-25 sen kannan transformointiin, josta on poistettu joko cbhl-geeni tai cbh2-geeni tai kummatkin geenit. Tällä tavalla voitaisiin aikaansaada kanta, joka ylituottaisi EGI ja tuottaisi joko rajoittuneen valikoiman tai ei ollenkaan eksosellobiohydrolaasej a.
30 Esimerkin 22 menetelmiä voitaisiin käyttää sellais ten T. reesei -kantojen valmistamiseen, jotka ylituot-taisivat mitä tahansa muista sellulaasin komponenteista, ksylanaasin komponenteista tai muista proteiineista, joita T. reesei normaalisti tuottaa.
35 m . i ’ m . r ·*.· -· ·*►.,«’ · - .Mir. w * j* f ’ t 1«·*· , w «h. * * ,. f * ’ i uw" <. f ik « j* ; 64
Taulukko 1 T. reesei -transformanttien erittämä endoglukanaa- siaktiivisuus
A B
5 Endoglukanaasi- aktiivisuus (absorbanssi aallon- Proteiini
Kanta pituudella 590 nm) (mg/ml) A/B
RutC30 0,32 4,1 0,078 10 EP2 0,70 3,7 0,189 EP4 0,76 3,65 0,208 EP5 1,24 4,1 0,302 EP6 0,52 2,93 0,177 EP11 0,99 4,11 0,241 15
Yllä olevat tulokset on esitetty tarkoituksessa osoittaa EGI-komponentin ylituotanto verrattuna proteiinin kokonaismäärään eikä tarkoituksessa osoittaa ylituotannon aste. Mitä siihen tulee, ylituotannon asteen odotetaan 20 vaihtelevan kunkin kokeen kohdalla.
Esimerkki 23 pCEPCl:n kokoonpaneminen
Kokoonpantiin plasmidi pCEPCl, jossa EGI:n koodaava sekvenssi on funktionaalisesti fuusioitu cbhl-geenistä 25 peräisin olevaan promoottoriin. Tämä on suoritettu käyttämällä in vitro paikkaspesifistä mutageneesiä cbhl- ja egll-geenien DNA-sekvenssin muuttamiseen, jotta aikaansaataisiin sopivia restriktioendonukleaasien katkaisukohtia juuri 5' (vastavirtaan) kulloinkin niiden translaation 30 aloituskohdasta. Suoritettiin DNA-sekvenssianalyysi odote tun sekvenssin varmistamiseksi kyseisen kahden DNA-kap-paleen välisessä liitoskohdassa. Tehdyt spesifiset muutokset on esitetty kuviossa 14.
65 DNA-fragmentit, jotka yhdistettiin pCEPCl:n muodostamiseksi, sijoitettiin pUC4K:n EcoRI-kohtien väliin ja olivat seuraavanlaiset (katso kuvio 15): A) 2,1 kiloemäksen fragmentti cbhl-lokuksen 5’-vie-5 rusalueelta. Tämä sisältää promoottorialueen ja jatkuu aikaansaatuun Bell-kohtaan eikä siten sisällä cbhl:n koo-daavaa sekvenssiä.
B) egll-lokuksesta peräisin oleva 1,9 kiloemäksen fragmentti genomi-DNA:ta, joka lähtee 5'-päästä, jossa on 10 rakennettu BamHI-kohta, ja jatkuu koodaavan alueen läpi ja sisältää noin 0,5 kiloemästä translaation pysäytyskodonin takaa. Fragmentin 3'-päässä on 18 emäsparia, jotka ovat peräisin pUC218:n monen restriktioentsyymin tunnistuskoh-dasta, ja 15 emäsparin synteettinen oligonukleotidi, jota 15 käytettiin liittämään tämä fragmentti alla olevaan fragmenttiin.
C) cbhl-lokuksen 3'-vierusalueelta peräisin oleva DNA-fragmentti, joka ulottuu cbhl-translaationpysäytysko-donista noin 1 kiloemästä myötävirtaan olevasta kohdasta 20 noin 2,5 kiloemästä myötävirtaan olevaan kohtaan.
D) Fragmentissa (C) olevaan Nhel-kohtaan sijoitettuna oli 3,1 kiloemäksen Nhel - Sphl-DNA-fragmentti, joka sisälsi pTpyr2:sta (esimerkki 2) saadun T. reesei -pyr4-geenin ja jossa oli toisessa päässä 24 emäsparia pUC18:n 25 monen restriktioentsyymin tunnistuskohdasta peräisin ole vaa DNA:ta,
Flasmidi pCEPCl suunniteltiin siten, että EGI :n koodaava sekvenssi integroituisi cbhl-lokukseen korvaten CBHI:n koodaavan sekvenssin ilman että tuotaisiin mitään 30 vierasta DNA:ta isäntäkantaan. Tämän plasmidin pilkkominen EcoRI:llä vapauttaa fragmentin, joka sisältää cbhl-pro-moottorialueen, egll:n koodaavan sekvenssin ja transkription päätösalueen, T. reesei -pyr4-geenin ja kappaleen DNA:ta cbhl-lokuksen 3'- (myötävirran) vierusalueelta 35 (katso kuvio 15).
“· *· m l ' ' « *ΜΚ / · » V * , « ’ ’ « |Μ" . r Mk · « · - ' Ι«Ρ' Γ- ^ · *·Τ*— ', * 66
Esimerkki 24
Transformantteja, jotka sisältävät pCEFCl-DNA
Aikaansaatiin pyr4-vajaa T. reesei RutC30 -kanta (Sheir-Neiss, yllä) käyttäen menetelmää, joka on pääpiir-5 teittäin esitetty esimerkissä 1. Tämä kanta transformoitiin pCEPCl:llä, jota oli pilkottu EcoRI:llä. Valittiin stabiileja transformantteja ja niitä viljeltiin sen jälkeen ravistuspulloissa sellulaasin tuotantoa varten kuten on kuvattu esimerkissä 22. Sellulaasiproteiinien tekemi-10 seksi näkyviksi suoritettiin isoelektrinen fokusointi -geelielektroforeesi näistä viljelmistä saaduille näytteille käyttäen menetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 7. Tällä tavoin analysoidusta 23 transformantin kjokonaismää-rästä 12:n todettiin olevan tuottamatta CBHI-proteiinia, 15 mikä on odotettu tulos CEPCl-DNA:n integroitumisesta cbhl-lokuksen kohdalle. Southern blot -analyysin avulla varmistettiin, että integraatio oli todella tapahtunut cbhl-lo-kuksen kohdalle joissakin näistä transformanteista ja ettei bakteeriplasmidivektorista (pUC4K) peräisin olevia 20 sekvenssejä ollut läsnä (katso kuvio 16). Tätä analyysiä varten transformanteista saatua DNA:ta pilkottiin Pstl:llä ennen kuin sille suoritettiin elektroforeesi ja siirtäminen kalvosuodattimelle. Tulokseksi saatu Southern blot tutkittiin käyttäen koettimena radioaktiivisuudella mer-25 kittyä plasmidia pUC4K::cbhl (katso esimerkki 2). Koetin hybridisoitui cbhl-geeniin, joka oli transformoimattomasta kontrolliviljelmästä saadun DNA:n 6,5 kiloemäksen fragmentissa (kuvio 16, kaista A). CEPCl-DNA-fragmentin integraation cbhl-lokuksen kohdalle odottaisi johtavan tämän 30 6,5 kiloemäksen vyöhykkeen katoamiseen ja kolmen muun vyö hykkeen, jotka vastaisivat suunnilleen 1,0 kiloemäksen, 2,0 kiloemäksen ja 3,5 kiloemäksen DNA-fragmentteja, ilmestymiseen. Tämä on tarkalleen malli, joka havaittiin kuviossa 16, kaistassa C esitetyllä transformantilla. Ku-35 viossa 16, kaistassa B on myös esitetty esimerkki trans- , f ' .. r tk *' m * · ·. ψ e. v .» . * * ^jm*·«. ^ tA, *· .» . .. ί' · t lim*< i. r- -i*, * „¥ . j ’ 67 formantista, jossa on monia pCEPClrn kopioita integroitunut muihin kohtiin genomissa kuin cbhl-lokukseen.
Endoglukanaasiaktiivisuuden määrityksiä suoritettiin transformoimattomasta viljelmästä ja transformanteil-5 ta saaduille viljelmäsupernatantin näytteille tarkalleen kuten on kuvattu esimerkissä 22 paitsi että näytteet laimennettiin 50-kertaisesti ennen määritystä, niin että näytteissä oli proteiinipitoisuus väliltä noin 0,03 -0,07 mg/ml. Tulokset määrityksistä, jotka on suoritettu 10 transformoimattomalle kontrolliviljelmälle ja neljälle erilaiselle transformantille (joille on annettu nimitykset CEPC1-101, CEPC1-103, CEPC1-105 ja CEPC1-112), on esitetty taulukossa 2. Transformantit CEPC1-103 ja CEPC1-112 ovat esimerkkejä, joissa CEPC1-fragmentin integraatio oli joh-15 tanut CBHI-tuotannon menetykseen.
Taulukko 2 T. reesei -transformanttien erittämä endoglukanaa-siaktiivisuus
20 A B
Endoglukanaasi-aktiivisuus (absorbanssi aallon- Proteiini
Kanta pituudella 590 nm) (mg/ml) A/B
25 RutC300 0,037 2,38 0,016 CEPC1-101 0,082 2,72 0,030 CEPC1-103 0,099 1,93 0,051 CEPC1-105 0,033 2,07 0,016 CEPC1-112 0,093 1,72 0,054 30
Yllä olevat tulokset on esitetty tarkoituksesssa osoittaa EGI-komponentin ylituotanto suhteessa proteiinin kokonaismäärään eikä tarkoituksessa osoittaa ylituotannon aste. Mitä siihen tulee, ylituotannon asteen odotetaan 35 vaihtelevan kunkin kokeen kohdalla.
·' Jl . * ϊ' · · ιΛΛ" ·. Γ tai. *· Λ . 1' «itf» ·. W Λ, *? Λ . I * ’ ' υβ»· *. W Mk * 4 , j ’ «ijvfw ., #» «£ #.
68
Olisi mahdollista rakentaa plasmideja, jotka ovat samankaltaisia kuin pCEPCl, mutta joissa mikä tahansa muu T. reesei -geeni korvaa egll-geenin. Tällä tavalla voitaisiin aikaansaada muiden geenien yli-ilmentäminen ja saman-5 aikainen cbhl-geenin deleetio.
Olisi myös mahdollista transformoida sellaisia T. reesein pyr4-johdannaiskantoja, joista olisi aikaisemmin poistettu muita geenejä, esim. cbh2, pCEPCl:llä sellaisten transformanttien aikaansaamiseksi, jotka esimerkiksi eivät 10 tuottaisi eksosellobiohydrolaaseja ja yli-ilmentäisivät endoglukanaasej a.
Käyttäen samankaltaisia rakennelmia kuin pCEPCl, mutta joissa toisesta T. reesein lokuksesta peräisin oleva DNA korvaisi cbhl-lokuksesta peräisin olevan DNA:n, olisi 15 mahdollista sijoittaa geenejä toisen promoottorin säätelyn alaiseksi toiseen lokukseen T. reesei -genomissa.
Esimerkki 25
Plasmidin pEGH::P-l kokoonpaneminen eg!3-geeni, joka koodaa EGII:n (josta toiset ovat 20 aikaisemmin käyttäneet nimitystä EGIII), on kloonattu lajista T. reesei ja DNA-sekvenssi on julkaistu (Saloheimo et ai.. Gene 63 (1988) 11 - 21). Olemme hankkineet geenin kannasta RL-P37 noin 4 kiloemäksen Pstl - Xhol-fargmentti-na genomi-DNA:ta, joka on sijoitettu pUC219:n Pstl- ja 25 Xhol-kohtien väliin. Viimeksi mainittu vektori pUC219 on saatu pUC119:stä (kuvattu julkaisussa Wilson et ai., Gene 77 (1989) 69 - 78) laajentamalla monen restriktioentsyymin tunnistuskohta sisältämään restriktiokohdat entsyymejä Bglll, Clal ja XhoI varten. Käyttäen alalla tunnettuja 30 menetelmiä T. reesei -pyr4-geeni, joka oli läsnä genomi-DNA:n 2,7 kiloemäksen Sali-fragmentissa, sijoitettiin EGII:n koodaavan sekvenssin sisällä olevaan Sali-kohtaan jolloin aikaansaatiin plasmidi pEGII::P-l (kuvio 17). Tämä johti EGII:n koodaavan sekvenssin katkeamiseen mutta ilman 35 minkään sekvenssien poistamista. Plasmidia pEGII::P-l voi- • I.JUWI . e*. M * ' ........ . w «' M . f '1 .M*T . W t» k· A» 1 ,ΛΛ*· i f W. »' J* f * · t f ^ 69 daan pilkkoa HindiII:11a ja BamHI:115, jolloin saadaan lineaarinen DNA-fragmentti, joka on peräisin yksinomaan T. reeseistä lukuunottamatta 5 emäsparia toisessa päässä ja 16 emäsparia toisessa päässä, jotka kummatkin ovat peräi-5 sin pUC219:n monen restriktioentsyymin tunnistuskohdasta.
Esimerkki 26 T. reesei GC69:n transformaatio käyttäen pEGII::P-l:tä sellaisen kannan aikaansaamiseksi, joka ei kykene tuottamaan EGZI:ta 10 T. reesei -kanta GC69 transformoidaan käyttäen pEGII::P-l:tä, jota on aikaisemmin pilkottu Hindin:11a ja BamHI:llä, ja valitaan stabiileja transformantteja. Koko-nais-DNA eristetään transformanteista ja Southern blot -analyysiä käytetään sellaisten transformanttien iden-15 tifiointiin, joissa pyr4- ja eg!3-geenin sisältävä DNA-fragmentti oli integroitunut egl3-lokuksen kohdalle ja siten katkaissut EGIItn koodaavan sekvenssin. Kyseiset transformantit eivät kykene tuottamaan EGII:ta. Olisi myös mahdollista käyttää pEGII::P-l:tä sellaisen kannan trans-20 formointiin, josta on poistettu jokin tai kaikki geeneistä cbhl, cbh2 tai egll. Tällä tavalla voitaisiin aikaansaada kanta, joka tuottaisi ainoastaan eräitä sellulaasin komponentteja eikä EGII-komponenttia.
Esimerkki 27 25 T. reesein transformaatio käyttäen pEGII::P-1:tä sellaisen kannan aikaansaamiseksi, joka ei kykene tuottamaan CBHI:tä, CBHIItta eikä EGII:ta
Kannan Ρ37ΡΔΔ0ΒΗ67 (esimerkistä 11) pyr4-vajaa johdannainen aikaansaatiin käyttäen menetelmää, joka on pää-30 piirteittäin esitetty esimerkissä 1. Tämä kanta Ρ37ΡΔΔ67Ρ"1 transformoitiin käyttäen pEGII::P-l:tä, jota oli aikaisemmin pilkottu Hindin:11a ja BamHI:llä, ja valittiin stabiileja transformantteja. Kokonais-DNA eristettiin transformanteista ja Southern blot -analyysiä käytettiin sel-35 laisten kantojen identifiointiin, joissa pyr4~ ja eg!3- ~ ·. * » ·' Μ , Μ I 1 ιβΙ· *. w Mk i* M . *’ 'iJ»»· ·. Τ' β. » Λ - <' «φ. * Jf '. , 70 geeni sisältävä DNA-fragmentti oli integroitunut eg!3-lo-kuksen kohtaan ja siten katkaissut EGII:n koodaavan sekvenssin. Southern blot, joka on esitetty kuviossa 18, tutkittiin käyttäen koettimena T. reesei -DNA:n noin 4 kilo-5 emäksen Pstl-fragmenttia, joka sisälsi eg!3-geenin, joka oli kloonattu pUC18:n Pstl-kohtaan ja myöhemmin uudelleen eristetty. Kun kannasta Ρ37ΡΔΔ67ΡΊ eristettyä DNA:ta pilkottiin PstI:llä Southern blot -analyysiä varten, eg!3~ lokus tuli sen jälkeen näkyväksi yhtenä ainoana 4 kilo-10 emäksen vyöhykkeenä autoradiogrammissa (kuvio 18, kaista E). Kuitenkin transformantilla, jonka eg!3-geeni oli katkaistu, tämä vyöhyke oli kadonnut ja korvautunut odotetusti kahdella uudella vyöhykkeellä (kuvio 18, kaista F). Jos DNA:ta pilkottiin EcoRV:llä tai Bglll:11a, eg!3-geeniä 15 vastaavan vyöhykkeen koko suureni noin 2,7 kiloemäksen verran (liitetyn pyr4-fragmentin koko) transformoimattoman Ρ37ΡΔΔ67Ρ"1-kannan (kaistat A ja C) ja trans formant in, jossa eg!3 oli katkaistu, (kuvio 18, kaistat B ja D) välillä.
Katkaistun eg!3-geenin sisältävälle transformantille, joka 20 on esitetty kuviossa 18 (kaistat B, D ja F), annettiin nimitys A22. Kuviossa 18 identifioitu transformantti ei kykene tuottamaan CBHI:tä, CBHII:ta tai EGII:ta.
Esimerkki 28
Plasmidin pPAEGl-l kokoonpaneminen 25 T. reesei -kannan RL-P37 egll-geeni saatiin kuten on kuvattu esimerkissä 12 genomi-DNA:n 4,2 kiloemäksen HindiII-fragmenttina. Tämä fragmentti sijoitettiin pUC100:n HindiII-kohtaan (pUCIOO on pUC18:n johdannainen; Yanisch-Perron et ai., Gene 33 (1985) 103 - 119, jossa on 30 oligonukleotidi sijoitettu monen restriktioentsyymin tun-nistuskohtaan lisäten restriktiokohdat entsyymejä Bglll,
Clal ja XhoI varten). Käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä noin 1 kiloemäksen EcoRV-fragmentti, joka ulottui lähellä EGI: n koodaavan sekvenssin keskustaa olevasta pai-35 kasta koodaavan sekvenssin 3’-pään takana olevaan paik- r ·' Μ ... I ’ 1 ·. * ». f Jt . . i ’ '!«*»·. r «k .· Jt . i' a ·' Λ . . Γ' ·',,****<. r A1 71 kaan, poistettiin ja korvattiin T. reesei -DNA:n 3,5 kilo-emäksen Seal-fragmentilla, joka sisälsi pyr4-geenin. Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pPAEGI-l (katso kuvio 19).
5 Plasmidia pPAEGI-l voidaan pilkkoa Hindin:11a sel laisen ainoastaan T. reesei -genomi-DNA:ta sisältävän DNA-fragmentin vapauttamiseksi, jossa on kappale egll-geeniä kummassakin päässä ja osan EGI:n koodaavasta sekvenssistä korvaava pyr4-geeni keskellä.
10 Sopivan T. reesei -pyr4-vaj aan kannan transformaa tio pPAEGI-l:llä, jota on pilkottu HindiII:11a, johtaa tämän DNA-fragmentin integroitumiseen egll-lokuksen kohdalle jossakin osassa transformantteja. Tällä tavalla saadaan kanta, joka ei kykene tuottamaan EGl:tä.
15 Esimerkki 29
Plasmidin pAEGIpyr-3 kokoonpaneminen ja T. reesein pyr4-vajaan kannan transformaatio Tämä koe vahvistaa oletuksen, että EGI-geeni voitaisiin inaktivoida käyttäen esimerkissä 26 pääpiirteit-20 täin esitettyä menetelmää. Tässä tapauksessa kokoonpantiin plasmidi pAEGlpyr-3, joka oli samanlainen kuin pPAEGI-l, paitsi että Aspergillus niger -pyx4-geeni korvasi T. reesei -pyr4-geenin valittavana merkkigeeninä. Tässä tapauksessa egll-geeni oli jälleen läsnä 4,2 kiloemäksen 25 HindIII-fragmenttina, joka oli sijoitettu pUCIOOrn
HindiII-kohtaan. Poistettiin sama sisäinen 1 kiloemäksen EcoRV-fragmentti kuin pPAEGI-l:n kokoonpanemisen aikana (katso esimerkki 28), mutta tässä tapauksessa se korvattiin 2,2 kiloemäksen fragmentilla, joka sisälsi kloonatun 30 A. niger -pyrG-geenin (Wilson et ai., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 2339). T. reesein pyr4-vajaan kannan (kanta GC69) transformaatio pAEGIpyr-3:11a sen jälkeen kun tätä oli pilkottu Hindlll:11a sellaisen fragmentin vapauttamiseksi, joka sisälsi pyrG-geenin ja egll-lokuksesta peräisin ole-35 via vierusalueita kummassakin päässä, johti transfor- * ’ ' »«w** ·. ψ- «a. ·· j* . ’ ’ >m«· w a. v .» . . f ’ · ’ <«** . r ak. *- λ ; . j» · > .μλ* ..#«: *· jt 1' 72 mantteihin, joissa egll-geeni oli rikottu. Nämä transfor-mantit tunnistettiin suorittamalla Southern blot -analyysi transformantti-DNA:Ile, jota oli pilkottu Hindlll:11a ja jota tutkittiin käyttäen koettimena radioaktiivisuudella 5 merkittyä pAEGIpyr-3. Transformoimattomassa T. reesei -kannassa egll-geeni oli läsnä 4,2 kiloemäksen Hindlll-DNA-fragmentissa, ja tätä hybridisoitumismallia esittää kuvio 20, kaista C. Kuitenkin sen jälkeen kun egll-geeni oli poistettu integroimalla haluttu pAEGIpyr-3:sta peräi-10 sin oleva fragmentti, tämä 4,2 kiloemäksen fragmentti oli kadonnut ja sen oli korvannut kooltaan noin 1,2 kiloemästä suurempi fragmentti, kuvio 20, kaista A. Kuviossa 20, kaistassa B on myös esitetty esimerkki transformantista, jossa pPAEGIpyr-3:n yhden ainoan kopion integroituminen on 15 tapahtunut muuhun kohtaan genomissa kuin egl1-lokukseen.
Esimerkki 30 T. reesein transformaatio käyttäen pPAEGI-l:tä sellaisen kannan aikaansaamiseksi, joka ei kykene tuottamaan CBHI:tä, CBHll:ta, EGI:tä eikä EGIX:ta 20 Kannan A22 (esimerkistä 27) pyr4-vajaa johdannainen saadaan käyttämällä esimerkissä 1 pääpiirteittäin esitettyä menetelmää. Tämä kanta transformoidaan käyttäen pPAEGI-l:tä, jota on aikaisemmin pilkottu Hindlll:11a sellaisen DNA-fragmentin vapauttamiseksi, joka sisälsi aino-25 astaan T. reesei -genomi-DNA:ta ja jossa oli kappale egll-geeniä kummassakin päässä ja osa EGI:n koodaavasta sekvenssistä korvattu pyr4-geenillä.
Valitaan stabiileja pyr4+—transformantteja ja ko-konais-DNA eristetään transformanteista. DNA:ta tutkitaan 30 käyttäen koettimena 32P:llä merkittyä pPAEGI-l Southern blot -analyysin jälkeen sellaisten transformanttien identifioimiseksi, joissa pyr4-geenin ja egl1-sekvenssejä sisältävä DNA-fragmentti on integroitunut egl1-lokuksen kohdalle ja siten rikkonut EGI:n koodaavan sekvenssin. Iden-35 tifioidut transformantit eivät kykene tuottamaan CBHI:tä, CBHIIjta, EGI:tä eikä EGlI:ta.

Claims (3)

1, Tiiviste puuvillaa sisältävien kankaiden käsittelemiseksi kankaan lujuutta menettämättä, tunnettu 5 siitä, että se sisältää 0,5 - 20 paino-% sienisellulaa-sikoostumusta, joka sisältää endoglukanaasi-komponentteja ja on oleellisesti vapaa kaikista CBH I -tyyppiä olevista komponenteista; 10 - 50 paino-% puskuriainetta; 10 - 50 paino-% pinta-aktiivista ainetta ja 0 - 80 paino-% vettä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tiiviste, tun nettu siitä, että mainittu sienisellulaasikoostumus on vapaa kaikista CBH-tyyppiä olevista komponenteista.
3, Patenttivaatimuksen 1 mukainen tiiviste, tunnettu siitä, että mainittu sienisellulaasikoostumus si-15 sältää vähintään noin 20 paino-% EG-tyyppiä olevia komponentteja sellulaasikoostumuksessa olevan proteiinin kokonaispainon perusteella. ' I ρ Ml *1 JM I > * \ j MJVf* , f1 fll i * ' 1 *JW1 , Γ A «I iH J ’ · l , ^WT *' » M J ' * M · M'
FI931491A 1990-10-05 1993-04-01 Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sellulaasilla FI120541B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59391990A 1990-10-05 1990-10-05
US59391990 1990-10-05
PCT/US1991/007274 WO1992006221A1 (en) 1990-10-05 1991-10-04 Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
US9107274 1991-10-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI931491A0 FI931491A0 (fi) 1993-04-01
FI931491A FI931491A (fi) 1993-05-25
FI120541B true FI120541B (fi) 2009-11-30

Family

ID=24376762

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI931495A FI931495A (fi) 1990-10-05 1993-04-01 Trichoderma reesei, som innehaoller avlaegsnade och/eller anrikade cellulas- och andra enzymgener, och daerav erhaollna cellulaskompositioner
FI931491A FI120541B (fi) 1990-10-05 1993-04-01 Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sellulaasilla
FI931492A FI931492A0 (fi) 1990-10-05 1993-04-01 Foerfaranden foer behandling av bomullsinnehaollande tyger med cellulas

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI931495A FI931495A (fi) 1990-10-05 1993-04-01 Trichoderma reesei, som innehaoller avlaegsnade och/eller anrikade cellulas- och andra enzymgener, och daerav erhaollna cellulaskompositioner

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI931492A FI931492A0 (fi) 1990-10-05 1993-04-01 Foerfaranden foer behandling av bomullsinnehaollande tyger med cellulas

Country Status (9)

Country Link
EP (4) EP1416045A1 (fi)
JP (3) JPH06511379A (fi)
AT (2) ATE257511T1 (fi)
CA (3) CA2093421A1 (fi)
DE (2) DE69133352T2 (fi)
DK (2) DK0553280T4 (fi)
ES (1) ES2170748T3 (fi)
FI (3) FI931495A (fi)
WO (1) WO1992006209A1 (fi)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837515A (en) * 1990-05-16 1998-11-17 Alko-Yhtiot Oy Enzyme preparations and methods for their production
CA2097180C (en) * 1990-12-10 2007-08-14 Timothy Fowler Saccharification of cellulose by cloning and amplification of the .beta.-glucosidase gene of trichoderma reesei
US5997913A (en) * 1990-12-10 1999-12-07 Genencor International, Inc. Method enhancing flavor and aroma in foods by overexpression of β-glucosidase
KR950701974A (ko) * 1992-05-29 1995-05-17 안티 쿠오카넨, 시스코 크누쓰-레에톨라 신규한 효소 제제 및 그의 제조방법(novel enzyme preparations and methods for their production)
US6251144B1 (en) 1992-06-12 2001-06-26 Genencor International, Inc. Enzymatic compositions and methods for producing stonewashed look on indigo-dyed denim fabric and garments
US5665585A (en) * 1992-09-03 1997-09-09 Alko-Yhiot Oy Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma
DE69435154D1 (de) * 1993-03-10 2008-12-04 Novozymes As Enzyme mit Xylanaseaktivität aus Aspergillus aculeatus
DK81293D0 (da) * 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
US7005128B1 (en) 1993-12-17 2006-02-28 Genencor International, Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it
US6268196B1 (en) 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
GB9416841D0 (en) * 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
EP0709452A1 (en) 1994-10-27 1996-05-01 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising xylanases
GB9426102D0 (en) 1994-12-23 1995-02-22 Merck Sharp & Dohme Pharmacuetical compositions
US6723549B2 (en) 1995-10-17 2004-04-20 Ab Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6184019B1 (en) 1995-10-17 2001-02-06 Röhm Enzyme Finland OY Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
FI964691A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammasaettning foer behandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
FI964692A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammansaettning foer bioefterbehandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
ATE295850T1 (de) 1996-12-06 2005-06-15 Diversa Corp Glycosidase-enzyme
BR9810701A (pt) 1997-07-11 2000-08-08 Genencor Int Proteìna "swollenina" de trichoderma reesei e seqâências de codificação de dna
US6407046B1 (en) 1998-09-03 2002-06-18 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US7977051B2 (en) 1999-04-10 2011-07-12 Danisco Us Inc. EGIII-like enzymes, DNA encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
US6623949B1 (en) 2000-08-04 2003-09-23 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US6635465B1 (en) 2000-08-04 2003-10-21 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
EP2322607B1 (en) 2002-08-16 2015-09-16 Danisco US Inc. Novel variant Hyprocrea jecorina CBH1 cellulases with increase thermal stability comprising substitution or deletion at position S113
JP4744879B2 (ja) 2002-11-07 2011-08-10 ジェネンコー・インターナショナル・インク ＢＧＬ６β−グルコシダーゼ及びそれをエンコードする核酸
US8278079B2 (en) 2002-11-07 2012-10-02 Danisco Us Inc. BGL6 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
EP2298876A1 (en) 2003-03-21 2011-03-23 Genencor International, Inc. Novel cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
JP5427342B2 (ja) 2003-04-01 2014-02-26 ジェネンコー・インターナショナル・インク 変異体フミコーラ・グリセアｃｂｈ１．１
EP1862539B1 (en) 2003-05-29 2012-01-25 Danisco US Inc. Novel trichoderma genes
CA2546659C (en) 2003-11-21 2014-02-18 Genencor International, Inc. Expression of granular starch hydrolyzing enzymes in trichoderma and process for producing glucose from granular starch substrates
EP1709163B1 (en) 2004-01-16 2010-11-24 Novozymes, Inc. Methods for degrading lignocellulosic materials
ES2391826T3 (es) 2004-01-30 2012-11-30 Novozymes, Inc. Polipéptidos con actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que los codifican
WO2005093050A2 (en) 2004-03-25 2005-10-06 Genencor International, Inc. Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
CA2567612A1 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Genencor International, Inc. Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
US7332319B2 (en) 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
US7413887B2 (en) 2004-05-27 2008-08-19 Genecor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
WO2005117756A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
CA2592550C (en) 2004-12-30 2015-05-19 Genencor International, Inc. Novel variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases
WO2006089107A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Genencor International, Inc. Polypeptides having alpha-amylase and granular starch hydrolyzing activity
EP2385110A3 (en) 2005-09-30 2011-11-16 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
BRPI0714870A2 (pt) 2006-07-21 2013-05-28 Novozymes Inc mÉtodo para produzir um polipeptÍdeo secretado tendo atividade biolàgica, proteÍna de fusço isolada, polinucleotÍdeo isolado, construÇço de proteÍna de fusço, vetor de expressço, cÉlula hospedeira féngica, mÉtodos para degradar ou conventer um material celulàsico e para produzir uma substÂncia
EP2195423A1 (en) 2007-10-09 2010-06-16 Danisco US Inc. Glucoamylase variants with altered properties
JP5568307B2 (ja) 2006-10-10 2014-08-06 ダニスコ・ユーエス・インク、ジェネンコー・ディビジョン 修飾された性質を有するグルコアミラーゼ変異体
US8043828B2 (en) 2007-01-18 2011-10-25 Danisco Us Inc. Modified endoglucanase II and methods of use
MX2009009692A (es) 2007-03-14 2010-03-03 Danisco Us Inc Genencor Div Alfa-amilasa de trichoderma reesei que es una enzima maltogenica.
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
JP5463294B2 (ja) 2007-10-18 2014-04-09 ダニスコ・ユーエス・インク 発酵用酵素ブレンド
DK2222842T3 (en) 2007-11-20 2015-01-19 Danisco Us Inc Glucoamylasevarianter with changed properties
US8048412B2 (en) 2008-02-11 2011-11-01 Danisco Us Inc. Enzyme with microbial lysis activity from Trichoderma reesei
JP5564441B2 (ja) 2008-03-11 2014-07-30 ダニスコ・ユーエス・インク 糖化におけるグルコアミラーゼ及びブティアウクセラ属フィターゼ
KR20110020243A (ko) 2008-06-06 2011-03-02 다니스코 유에스 인크. 비-셀룰로오스 물질에 대해 감소된 친화성을 갖는 셀룰라아제 변이체를 포함하는 조성물 및 방법
CN102803482B (zh) 2009-06-03 2015-04-29 丹尼斯科美国公司 具有改善的表达、活性和/或稳定性的纤维素酶变体，及其用途
CA2770607C (en) 2009-08-19 2019-02-26 Danisco A/S Variants of glucoamylase
CN102712915B (zh) 2009-08-19 2014-12-10 丹尼斯科美国公司 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体
CN102844429B (zh) 2009-11-20 2015-11-25 丹尼斯科美国公司 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
JP2013533737A (ja) 2010-06-03 2013-08-29 ダニスコ・ユーエス・インク 糸状菌宿主株及びｄｎａ構築物並びにその使用方法
EP2561083B1 (en) 2010-08-06 2017-01-11 Danisco US Inc. Use of Humicola grisea glucoamylase in an SSF process at neutral pH
CA2807558A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Production of isoprene under neutral ph conditions
EP2608682B1 (en) 2010-08-24 2017-12-13 Danisco US Inc. Method of making a snack bar comprising a low temperature rice protein concentrate
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
US8785165B2 (en) 2011-04-29 2014-07-22 Danisco Us Inc. Single pH process for starch liquefaction and saccharification for high-density glucose syrups
BR112014002745A8 (pt) 2011-08-05 2017-06-20 Danisco Us Inc produção de isoprenoides sob condições de ph neutro
BR112014004190A2 (pt) 2011-08-24 2017-03-01 Novozymes Inc método para construir uma cepa fúngida filamentosa, cepa fúngida filamentosa, método para produzir múltiplos polipeptídeos recombinantes, e, construto em tandem
MX352973B (es) 2011-09-22 2017-12-15 Danisco Us Inc Actividad de adnasa endogena para reducir el contenido de adn.
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
KR20150093739A (ko) 2012-12-12 2015-08-18 다니스코 유에스 인크. 셀로바이오하이드롤라제의 변이체
WO2014093282A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Danisco Us Inc. Variants of cellobiohydrolases
EP2931889A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 Danisco US Inc. Variants of cellobiohydrolases
BR112015013646A2 (pt) 2012-12-12 2017-11-14 Danisco Us Inc variante isolada de uma enzima celobio-hidrolase (cbh) parental, polinucleotídeo isolado, vetor, célula hospedeira, composição detergente, aditivo alimentar, método para hidrolisar um substrato celulósico, sobrenadante de cultura celular, métodos de produção de um polipeptídeo cbh variante e sobrenadante de cultura celular
MX2015007234A (es) 2012-12-12 2015-10-29 Danisco Us Inc Variantes de celobiohidrolasas.
JP2014150745A (ja) * 2013-02-06 2014-08-25 Nagaoka Univ Of Technology トリコデルマ属に属する微生物の変異株および該変異株の使用
JP2016533741A (ja) 2013-07-29 2016-11-04 ダニスコ・ユーエス・インク 酵素の変異体
HUE047199T2 (hu) 2013-12-04 2020-04-28 Danisco Us Inc Glükoamiláz variánsok
BR112016017349A2 (pt) 2014-01-31 2017-10-17 Danisco Us Inc métodos para melhorar os subprodutos de processos de fermentação usando xilanase
US10612058B2 (en) 2014-12-19 2020-04-07 Danisco Us Inc Methods for saccharifying a starch substrate
CN107636151B (zh) 2015-05-22 2023-04-04 杜邦营养生物科学有限公司 乙酰乳酸脱羧酶
BR112017024855A2 (pt) 2015-05-22 2018-08-07 Dupont Nutrition Biosci Aps métodos de produção de aldc
EP3192866A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Endocellulases and uses thereof
BR112019004988A2 (pt) 2016-09-16 2019-06-04 Dupont Nutrition Biosci Aps variantes de decarboxilase de acetolactato que tem atividade específica aprimorada
EP3523415A1 (en) 2016-10-04 2019-08-14 Danisco US Inc. Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates
EP3502126A1 (en) 2017-12-19 2019-06-26 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Ancestral cellulases and uses thereof
CN109988714B (zh) * 2017-12-29 2021-12-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种里氏木霉及其应用
CN112654704A (zh) 2018-07-30 2021-04-13 丹尼斯科美国公司 包含蛋白质生产率提高表型的突变和遗传修饰的丝状真菌菌株及其方法
US11339516B2 (en) * 2018-09-27 2022-05-24 Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve Tic. A.S. Dyed fabric finishing process
JP2022513085A (ja) 2018-11-20 2022-02-07 デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス 改変ロバスト高Ｔｍ－フィターゼ分岐群ポリペプチド及びその断片
MX2022000077A (es) 2019-07-01 2022-05-20 Cotton Inc Tela de desecho de textil de algodón usada como biomasa para producción de azúcar.
US20230009832A1 (en) 2019-11-20 2023-01-12 Dupont Nutrition Biosciences Aps Thermostable phytase variants
EP3872172A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Conductive cellulose composite materials and uses thereof
BR112022017034A2 (pt) 2020-02-28 2022-12-13 Dupont Nutrition Biosci Aps Composições de ração
EP3872173A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias Method for producing crystalline nanocellulose
JP2023523925A (ja) 2020-04-22 2023-06-08 ダニスコ・ユーエス・インク 糸状菌細胞におけるタンパク質産生の増強のための組成物及び方法
WO2024124013A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 International N&H Denmark Aps Feed formulations comprising a phytase for dairy ruminant animals

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI841500A0 (fi) * 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
DE68911131T2 (de) * 1988-03-24 1994-03-31 Novonordisk As Cellulosezubereitung.
JPH0639597B2 (ja) * 1989-10-19 1994-05-25 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 劣化抵抗洗浄剤組成物
WO1992017572A1 (en) * 1991-03-29 1992-10-15 Genencor International, Inc. Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase

Also Published As

Publication number Publication date
CA2093421A1 (en) 1992-04-06
EP1416045A1 (en) 2004-05-06
DK0553280T4 (da) 2010-11-15
ATE211773T1 (de) 2002-01-15
EP0553280A1 (en) 1993-08-04
CA2093428A1 (en) 1992-04-06
DK0551386T3 (da) 2004-05-10
FI931492A (fi) 1993-04-01
DE69132894T3 (de) 2011-03-03
EP0551394A1 (en) 1993-07-21
DE69133352T2 (de) 2004-11-04
EP0553280A4 (en) 1993-12-01
EP0553280B1 (en) 2002-01-09
DK0553280T3 (da) 2002-04-29
FI931495A0 (fi) 1993-04-01
EP0551386A4 (en) 1993-12-01
FI931491A0 (fi) 1993-04-01
WO1992006209A1 (en) 1992-04-16
ES2170748T3 (es) 2002-08-16
FI931492A0 (fi) 1993-04-01
EP0553280B2 (en) 2010-08-11
DE69132894T2 (de) 2002-08-14
JPH06502223A (ja) 1994-03-10
JPH06511379A (ja) 1994-12-22
FI931491A (fi) 1993-05-25
ATE257511T1 (de) 2004-01-15
DE69132894D1 (de) 2002-02-14
EP0551386A1 (en) 1993-07-21
FI931495A (fi) 1993-05-27
DE69133352D1 (de) 2004-02-12
CA2093424A1 (en) 1992-04-06
JPH06502226A (ja) 1994-03-10
CA2093428C (en) 1996-06-11
EP0551386B1 (en) 2004-01-07
CA2093424C (en) 2000-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120541B (fi) Menetelmä pumpulipitoisten kudosten käsittelemiseksi sellulaasilla
US5246853A (en) Method for treating cotton-containing fabric with a cellulase composition containing endoglucanase components and which composition is free of exo-cellobiohydrolase I
US5650322A (en) Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases
WO1992006221A1 (en) Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
WO1992006183A1 (en) Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase
JP2654562B2 (ja) セルラーゼによる綿含有織物の処理方法
US5668009A (en) Methods for treating cotton-containing fabrics with CBH I enriched cellulase
EP0692041A1 (en) Method for reducing lint generation during treatment of cotton-containing and non-cotton-containing cellulosic fabrics
US5525507A (en) Methods for treating cotton-containing fabric with cellulase composition containing endoglucanase component and which is free of all CBH I component
JP3511381B2 (ja) セルラーゼによる綿含有織物の処理方法
US5654193A (en) Methods for treating cotton containing fabrics with cellulase
FI115306B (fi) Menetelmiä puuvillaa sisältämättömien selluloosapitoisten kankaiden käsittelemiseksi sellulaasilla

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120541

Country of ref document: FI

MA Patent expired