BRPI0808753A2 - Alfa-amilase de trichoderma reesei é uma enzima maltogênica - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "ENZIMA MALTOGÊNICA ALFA-AMILASE DE TRICHODERMA REESEÍ'.

Este pedido de patente reivindica a prioridade dos pedidos de patentes Provisórias americanas 60/906.811, arquivado em 14 de março de 2007 e 60/906.812, arquivado em 14 de março de 2007, cada um dos quais é neste pedido incorporado por referência em sua totalidade.

Listagem de Seqüências

Além disso, está anexada uma listagem de seqüências compreendendo as SEQ ID NOS: 1 a 7, que estão neste pedido incorporadas por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

Uma α-amilase maltogênica de Trichoderma reesei (TrAA), ácidos nucleicos que codificam a mesma e células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos são fornecidos. Métodos de uso de TrAA incluem sacarificação do amido a um xarope rico em glicose.

Antecedentes

Xarope de milho de alta frutose (HFCS) é uma forma processada do xarope de milho que tem um alto conteúdo de frutose e uma doçura comparável com o açúcar, fazendo HFCS útil como um substituto de açúcar em 20 refrigerantes e outros alimentos processados. HFCS atualmente representa uma indústria de um bilhão de dólares. O processo de produção de HFCS progrediu ao longo dos anos a partir de hidrólise ácida a uma seqüência de reações catalisadas por enzima:

(1) Liquefação: α-amilases (EC 3.2.1.1) são primeiro usadas para degradar uma suspensão de amido contendo 30 a 40% p/p de sólidos

secos (sólidos secos) a maltodextranas. α-Amilases são endo-hidrolases que catalisam a clivagem randômica de ligações internas a-1,4-Dglicosídicas. Como a liquefação tipicamente é conduzida em altas temperaturas, por exemplo, 90 a 100°C, α-amilases termoestáveis, tais como uma aamilase de Bacillus sp., são preferenciais para esta etapa.

(2) Sacarificação: Glicoamilases e/ou α-amilases maltogênícas comumente são usadas para catalisar a hidrólise de extremidades nãoreduzidas das maltodextranas formadas após liquefação, liberando Dglicose, maltose e isomaltose. Enzimas de desramificação, tais como pululanase, podem ser usadas para ajudar a sacarificação. Sacarificação tipicamente ocorre sob condições acidícas em temperaturas elevadas, por exem5 pio, 60°C, pH 4,3. As glicoamilases usadas neste processo tipicamente são obtidas de fungos, por exemplo, glicoamilase de Aspergillus niger (AnGA) usado em Optidex® L400 ou glicoamilase de Humicola grisea (HgGA). As aamilases maltogênicas atualmente usadas para esta aplicação incluem amiIases vegetais e a α-amilase de Aspergillus oryzae, o ingrediente ativo de 10 Clarase® L. Sacarificação pode ser usada para produzir xaropes de alta maltose ou ricos em glicose.

(3) Isomerização: um xarope rico em glicose pode ser ainda processado para produzir frutose, quando produtos mais doces são desejados. Isomerização de glicose à frutose é catalisada pela glicose isomerase e pro15 duz aproximadamente 42% (p/v) de frutose, glicose de 50 a 52% e uma mistura de outros açúcares. Manipulações adicionais enfim podem produzir a classe comercial HFCS tendo um conteúdo de frutose de 42%, 55% ou 90%, por exemplo.

As α-amilases e glicoamilases são adicionadas diretamente a um processo em batelada do xarope de milho e não são reutilizadas. Glicose isomerases, por outro lado, são imobilizadas em colunas sobre as quais a mistura de açúcar é passada. As colunas de glicose isomerase são reutilizadas até que as enzimas percam a maior parte de sua atividade.

A etapa de sacarificação é a etapa Iimitante da taxa de produção 25 de HFCS. Sacarificação tipicamente ocorre durante 48 a 72 horas, tempo pelo qual muitas glicoamilases fúngicas perderam atividade significante. Além disso, embora ambas α-amilases maltogênicas e glicoamilases possam ser usadas para catalisar a sacarificação, as enzimas tipicamente funcionam em pH e temperaturas diferentes ótimos. Por exemplo, as α-amilases malto30 gênicas tipicamente têm um pH ótimo de pelo menos pH 5,0 e uma temperatura ótima de menos do que 55°C, enquanto AnGA tipicamente tem um pH ótimo de pH 4,0 a 4,5 e uma temperatura ótima de aproximadamente 60°C. A diferença nas condições de reação entre as duas enzimas exige ajuste de pH e temperatura, que retarda o processo global e pode dar a origem à formação de agregados de amilose insolúveis. Qualquer α-amilase bacteriana restante será inativada quando o pH é reduzido; entretanto, a α-amilase bacteriana pode ser substituída mais tarde por uma α-amilase estável em ácido.

De maneira ideal, a etapa de sacarificação produz um xarope com uma composição de aproximadamente 95 a 97% p/p de glicose, 1 a 2% p/p de maltose, e 0,5 a 2% p/p de isomaltose. Este xarope rico em glicose pode ser usado na reação de isomerização, etapa (3) acima, ou usado para 10 a produção de glicose cristalina. Estas altas concentrações de glicose não são facilmente alcançadas. Por exemplo, a glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) oferece atividade específica melhorada em relação à AnGA ou HgGA; entretanto, TrGA produz um produto que tem uma concentração de glicose final tipicamente aproximadamente de 88% p/v. Além disso, altas 15 concentrações de glicose no xarope promovem a conversão de glicose à maltose e maltotriose.

Consequentemente, há uma necessidade na técnica de um processo melhorado de produção de HFCS, que inclui uma etapa de sacarificação que usa uma α-amilase com um pH ótimo e temperatura ótima compatí20 veis com o uso de glicoamilases fúngicas. Há também uma necessidade por uma α-amilase que possa catalisar a sacarificação em menos tempo. Além disso, há uma necessidade por uma α-amilase que possa alcançar estes objetivos, produzindo um xarope após sacarificação que tem uma concentração de glicose de aproximadamente 96% p/p.

Sumário

Estas e outras necessidades na técnica são satisfeitas por uma α-amilase maltogênica de Trichoderma reesei (TrAA). A enzima, variantes da enzima e ácidos nucleicos de codificação são fornecidos. Células hospedeiras que expressam TrAA também são fornecidas.

TrAA é vantajosamente usada em vários processos, particular

mente a sacarificação de maltodextranas formadas após liquefação. Em um aspecto, uma TrAA é usada em um processo de produção de maltose por si mesma ou em combinação com outras enzimas, tais como pululanase. TrAA vantajosamente catalisa a produção de maltose em um pH relativamente baixo e temperatura alta, permitindo o uso de condições de reação compatíveis com glicoamilases fúngicas, por exemplo, AnGA. Além disso, a facilida5 de de produzir TrAA a faz mais econômica do que α-amilases atualmente usadas para produção de maltose.

Em outro aspecto, TrAA é usada em um processo de sacarificação que produz uma alta concentração de glicose. TrAA vantajosamente suprime a reação reversa que forma maltoligossacarídeos de glicose, permi10 tindo concentrações de glicose em uma mistura de amido de milho processada alcançar concentrações tão altas como aproximadamente 96% p/v. Além disso, esta concentração de glicose pode ser alcançada em menos tempo que se a reação fosse catalisada com somente uma glicoamilase. Em uma modalidade, uma glicoamilase é adicionada com TrAA. A glicoamilase 15 pode ser uma glicoamilase fúngica, tal como TrGA, ou uma mistura de glicoamilases pode ser adicionada, tais como uma combinação de TrGA, HgGA e AnGA, por exemplo.

Consequentemente, um objetivo é fornecer um polipeptídeo isolado compreendendo (i) resíduos 21 a 463 da SEQ ID NO:3, ou (ii) uma variante da α-amilase de Tnchoderma reesei (TrAA), em que a variante tem a atividade de α-amilase e identidade de seqüência de aminoácido de pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% aos resíduos 21a 463 da SEQ ID NO:3. Por exemplo, a variante pode ter de 1 a 10 substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação aos resíduos 21 a 463 da SEQ ID NO:3. Alternativamente, o polipeptídeo pode compreender SEQ ID NO: 3 ou resíduos 21 a 463 da SEQ ID NO:3, isto é, a seqüência polipeptídica madura sem a seqüência sinal. O polipeptídeo pode compreender uma seqüência sinal de uma outra espécie exceto Trichoderma reesei. O polipeptídeo em uma modalidade é glicosilado. O polipeptídeo isolado ainda pode ser purificado.

Outro objetivo é fornecer um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo acima. O polinucleotídeo pode compreender SEQ ID NO:2, isto é, uma seqüência de cDNA. Um mRNA isolado também é fornecido, onde os resíduos T na SEQ ID NO:2 são substituídos com resíduos U (uracila).

Outro objetivo é fornecer um vetor compreendendo o polinucleotídeo acima, e uma célula bacteriana compreendendo este vetor. Uma célula hospedeira que expressa o polinucleotídeo também é fornecida, onde a célula hospedeira em uma modalidade é um Trichorderma sp., particularmente T. reesei. O hospedeiro alternativamente pode ser um RL-P37 isolado, uma célula fúngica filamentosa, um Aspergillus sp., um Fusarium sp., ou um Penicillium sp. A célula hospedeira Aspergillus pode ser Aspergillus nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, ou A. japonicus. A célula hospedeira Fusarium pode ser Fusarium oxysporum, ou F. solani. A célula hospedeira pode ainda expressar um ácido nucleico que codifica uma glicoamilase heteróloga, isto é, uma glicoamilase que não é da mesma espécie que a célula hospedeira. A glicoamilase, por exemplo, pode ser uma glicoamilase de Humicola grisea. A célula hospedeira alternativamente ou além disso pode não expressar uma glicoamilase endógena da célula hospedeira.

Outro objetivo é fornecer um método de sacarificação de amido compreendendo: adição a uma solução de amido liqüefeita de um polipeptídeo apresentado acima, e sacarificação da solução de amido liqüefeita. O 20 polipeptídeo pode ser adicionado à solução de amido liqüefeita em aproximadamente 0,3 a 1 kg por tonelada métrica de sólidos secos. A solução de amido liqüefeita pode ser uma pasta fluida do amido liqüefeito em aproximadamente 20 a 35% p/p de sólidos secos.

O método de sacarificação do amido pode produzir um xarope 25 rico em maltose. O método pode ainda compreender uma etapa de adição de pululanase, uma β-amilase, uma α-amilase fúngica que não é TrAA1 uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma isoamilase ou uma combinação das mesmas, para uma solução de amido liqüefeito. A solução de amido liqüefeito pode estar a aproximadamente 50° 30 a aproximadamente 60°. A solução de amido liqüefeito pode estar em pH 4,0 a aproximadamente pH 6,0, ou aproximadamente pH 4,2 a aproximadamente pH 4,8. É um objetivo adicional fornecer um amido que processa composição compreendendo o polipeptídeo acima e opcionalmente uma glicoamilase, uma pululanase, uma α-amilase, uma α-amilase fúngica que não é TrAA1 uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma Iipase1 uma cutinase, uma isoamilase, ou uma combinação das mesmas.

É outro objetivo fornecer uma composição de cozimento compreendendo o polipeptídeo acima em uma solução ou em um gel. Um método de cozimento compreendendo a adição da composição de cozimento de reivindicação 46 para uma substância a ser cozida e cozimento da substância.

É ainda um objeto adicional fornecer uma composição de desengomagem de tecido compreendendo o polipeptídeo em uma solução aquosa, e opcionalmente com outra enzima. Um método de desengomagem de um tecido compreende contatar com a composição de desengomagem com um tecido por um tempo suficiente para desengomar o tecido.

Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos associados são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo e ilustram várias modalidades. Nos desenhos: A figura 1 representa a capacidade da TrAA1 na presença da glicoamilase, catalisar um processo de sacarificação com uma eficiência superior àquela alcançada pela glicoamilase sozinha. O eixo y mostra a porcentagem em peso de glicose (DPI) produzida após 24 horas de um processo de sacarificação em pH 4,2, 60°C. A reação foi catalisada por 1,0 kg/mt de sólidos secos de glicoamilase sozinha (GA) ou por GA combinada com a quantidade indicada de TrAA em kg/mt de sólidos secos. Observa-se que a adição de 1 mg de enzima a 50 mL de uma solução contendo 32% de sólidos secos, por exemplo, significa que a solução contém 1 mg de enzima/16 g de sólidos secos, ou 0,0625 kg/mt de sólidos secos.

A figura 2 representa a capacidade da TrAA de catalisar a produção de maltose em um pH baixo. O eixo y mostra a porcentagem em peso de maltose (DP2) produzida após 24 horas de um processo de produção de maltose catalisada por 0,5 kg/mt de sólidos secos de TrAA a 55°C. O pH da reação é mostrado no eixo x.

A figura 3 representa a capacidade da TrAA de catalisar a produção de maltose com uma eficiência comparável com porcentagem de Clarase® L. A porcentagem em peso de maltose (DP2) produzida após 48 ho5 ras de um processo de produção de maltose é mostrada no eixo y. A enzima usada para catalisar a reação é mostrada no eixo x. "Clarase": 10 SKBU/g de sólidos secos de Clarase® L em pH 5,5, 55°C. "10 TrAA": 10 SKBU/g de sólidos secos de α-amilase de Trichoderma reesei em pH 4,5, 60CC. "15 TrAA" e "20 TrAA" representam a TrAA em 15 SKBU/g de sólidos secos e 20 10 SKBU/g de sólidos secos, respectivamente, em pH 4,5, 60°C. "20 TrAA + PU" representa a adição de 0,25 kg/mt de sólidos secos de pululanase a 20 SKBU/g de sólidos secos de TrAA em pH 4,5, 60°C.

A figura 4 representa um processo de produção de maltose catalisado pela TrAA na quantidade ótima de pululanase. O eixo y mostra a porcentagem em peso de maltose (DP2) produzida após 48 horas em pH 4,6, 58°C na presença de 0,5 kg/mt de sólidos secos de TrAA. O eixo x mostra a quantidade da pululanase em kg/mt de sólidos secos adicionados à reação.

A figura 5 mostra proteínas resolvidas por SDS-PAGE a partir de uma alíquota de células cultivadas que expressam TrAA (coluna 1) ou de TrAA purificada (coluna 2). Os marcadores de pesos moleculares mostrados na coluna M.

A figura 6A mostra atividade de α-amilase relativa (em unidades arbitrárias) de TrAA purificada como uma função do pH, usando reagente Ceralpha (Megazyme International Ireland, Ltd., Wicklow, lreland; Cat. N0 KCERA) como um substrato.

A figura 6B mostra atividade de α-amilase relativa (em unidades arbitrárias) de TrAA purificada como uma função da temperatura, usando o mesmo substrato artificial.

As figura 7A e figura 7B é uma listagem das SEQ ID NOS:1 a 7. Descrição Detalhada

Uma α-amilase fúngica é fornecida a partir de Trichoderma reesei. TrAA oferece várias vantagens sobre as α-amilases atualmente usadas. Em primeiro lugar, TrAA é ativa em um pH relativamente baixo e alta temperatura, permitindo a enzima ser usada em combinação com uma glicoamilase fúngica sob as mesmas condições de reação. Isto livra da necessidade de realizar uma reação de sacarificação como um processo em batelada, 5 onde o pH e a temperatura devem ser reajustados para uso ótimo da aamilase ou glicoamilase. Em segundo lugar, em combinação com uma pululanase, TrAA catalisa geração de maltose com a mesma eficiência como enzimas mais caras comumente usadas, tais como Clarase® L.

1. Definições & Abreviaturas Conforme esta descrição detalhada, as seguintes abreviaturas e

definições aplicam-se. Deve ser observado que como usado neste pedido, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a", incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa maneira, por exemplo, a referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade de tais enzi15 mas, e a referência a "a formulação" inclui referência a uma ou mais formulações e equivalentes das mesmas conhecidas por aqueles versados na técnica, e similares.

A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm a mesma significação que comumente entendida por um versado ordinário na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

1.1. Definições

"Amilase" significa uma enzima que é, entre outras coisas, capaz de catalisar a degradação do amido. Geralmente, α-amilases (EC 3.2.1.1; a25 D-(1—>4)-glican glicano-hidrolase) são definidas como enzimas endoatuantes clivando ligações a-D-(1->4) O-glicosídicas dentro da molécula de amido de uma maneira randômica. Ao contrário, as enzimas amilolíticas exoatuantes, tais como α-amilases maltogênicas (EC 3.2.1.133); β-amilases (EC 3.2.1.2; e a-D-(1-*4)-glican malto-hidrolase) clivam a molécula de amido a 30 partir da extremidade não-reduzida do substrato. β-Amilases, a-glicosidases (EC 3.2.1.20; α-D-glicosídeo glico-hidrolase), glicoamilase (EC 3.2.1.3; a-D(1—>4)-glican glico-hidrolase) e amilases específicas para o produto podem produzir malto-oligossacarídeos de um tamanho específico a partir de amido. As glicoamilases liberam resíduos glicosil a partir das extremidades nãoreduzidas de moléculas de amilopectina e amilose. As glicoamilases também catalisam a hidrólise de ligações a-1,6 e a-1,3, embora em taxa muito mais lenta do que as ligações a-1 ,4.

"Variante de α-amilase", "polipeptídeo variante de α-amilase" e "enzima variante" significam uma proteína α-amilase que tem uma seqüência de aminoácidos que foi modificada a partir da seqüência de aminoácidos de uma α-amilase de tipo selvagem. Como usado neste pedido, "enzimas pa10 rentais", "seqüência parental", "polipeptídeo parental", "proteína a-amilase de tipo selvagem" e "polipeptídeos parentais" significam enzimas e polipeptídeos a partir dos quais os polipeptídeos variantes de α-amilase são baseados, por exemplo, uma α-amilase de Trichoderma reesei. Por "ácido nucleico parental" é representada uma seqüência de ácido nucleico que codifica o 15 polipeptídeo parental. Uma α-amilase de tipo selvagem ocorre naturalmente. "Variantes de α-amilase" diferenciam-se de uma α-amilase de tipo selvagem nos resíduos de aminoácido da proteína madura, isto é, sem uma seqüência sinal. A variante de α-amilase pode ser uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo de α-amilase heterólogo. Por exemplo, a proteína a-amilase 20 pode compreender uma proteína α-amilase madura ligada ao peptídeo sinal de outra a-amilase.

"Variantes" referem-se a polipeptídeos e ácidos nucleicos. O termo "variante" pode ser usado intercambiavelmente com o termo "mutante". As variantes incluem inserções, substituições, transversões, truncamen25 tos e/ou inversões em uma ou mais posições na seqüência de aminoácidos ou nucleotídica, respectivamente. Ácidos nucleicos variantes podem incluir seqüências que são complementares a seqüências que são capazes de hibridizar às seqüências nucleotídicas apresentadas neste pedido. Por exemplo, uma seqüência variante é complementar a seqüências capazes de hibri30 dizar sob condições estrigentes, por exemplo, 50°C e 0,2X SSC (1X SSC = NaCI a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH 7,0), às seqüências nucleotídicas apresentadas neste pedido. Mais particularmente, o termo variante engloba seqüências que são complementares a seqüências que são capazes de hibridizar sob condições altamente estrigentes, por exemplo, 65°C e 0,1 X SSC, às seqüências nucleotídicas apresentadas neste pedido.

Como usado neste pedido, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na seqüência de ácido nucleico de um gene. O processo inclui ambas transcrição e tradução.

"Isolado" significa que a seqüência é pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente que a seqüência é naturalmente associada e encontrada na natureza.

"Purificado" significa que o material está em um estado relativa

mente puro, por exemplo, pelo menos aproximadamente 90% puro, pelo menos aproximadamente 95% puro ou pelo menos aproximadamente 98% puro.

"Termoestável" significa que a enzima conserva a atividade após exposição a temperaturas elevadas. A termoestabilidade de uma enzima, tal como uma α-amilase, é medida pela sua meia-vida (ti/2), onde a metade da atividade da enzima é perdida pela meia-vida. O valor de meia-vida é calculado sob condições definidas pela mensuração da atividade amilase residual.

"Faixa de pH" significa a capacidade da enzima de exibir atividade catalítica em condições acídicas a básicas variando pH de 5 unidades ou mais.

Como usado neste pedido, "estável a pH" relaciona-se à capacidade da enzima de conservar atividade sobre uma ampla faixa de pHs.

Como usado neste pedido, "seqüência de aminoácido" é sinônima ao termo "polipeptídeo" e/ou o termo "proteína". Em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácido" é sinônimo ao termo "peptídeo"; em alguns exemplos, o termo "seqüência de aminoácido" é sinônimo ao termo "enzima".

Como usado neste pedido, "seqüência nucleotídica" ou "sequência de ácido nucleico" se referem a uma seqüência oligonucleotídica ou seqüência polinucleotídica e variantes, homólogos, fragmentos e derivados das mesmas. A seqüência nucleotídica pode ser de origem genômica, sintética ou recombinante e pode ser dupla fita ou fita simples, se representar a fita de sentido direto ou sentido reverso. Como usado neste pedido, o termo "seqüência nucleotídica" inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA.

"Homólogo” significa uma entidade que tem um certo grau de 5 identidade ou "homologia" com as seqüências de aminoácido objeto e as seqüências nucleotídicas objeto. Uma "seqüência homóloga" inclui um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que tem uma certa porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade de seqüência com outra seqüência. Identidade de porcentagem significa que, quando alinhadas, a10 quela porcentagem de bases ou resíduos de aminoácido são os mesmos quando comparados às duas seqüências. Seqüências de aminoácido não são idênticas, onde um aminoácido é substituído, deletado ou adicionado em comparação à seqüência objeto. A porcentagem de identidade de seqüência tipicamente é medida em relação à seqüência madura da proteína objeto, 15 isto é, após modificação pós-traducional para remover uma seqüência sinal, por exemplo. Tipicamente, homólogos compreenderão os mesmos resíduos de sítio ativos que a seqüência de aminoácido objeto. Homólogos também conservam atividade α-amilase maltogênica, embora o homólogo possa ter propriedades enzimáticas diferentes que a proteína objeto.

Como usado neste pedido, "hibridização" inclui o processo pelo

qual uma fita de ácido nucleico se junta com uma fita complementar através do pareamento de bases, bem como o processo de amplificação como realizado nas tecnologias de reação de polimerase em cadeia (PCR). O ácido nucleico variante de α-amilase pode existir como DNA ou RNA fita simples 25 ou dupla, um heteroduplex de RNA/DNA ou um copolímero de RNA/DNA. Como usado neste pedido, "copolímero" refere-se a uma fita simples de ácido nucleico que compreende ambos ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. O ácido nucleico variante de α-amilase pode ser otimizado pelo códon para ainda aumentar a expressão.

Como usado neste pedido, um composto "sintético" é produzido

por síntese química ou enzimática in vitro. Inclui, mas não é limitado a, ácidos nucleicos de variante de α-amilase feitos com uso ótimo do códon de organismos hospedeiros, tais como leveduras metilotróficas Pichia, Hansenula, Streptomyces e Trichoderma, por exemplo, T. reesei, ou outros hospedeiros de expressão de escolha.

Como usado neste pedido, "célula transformada" inclui células, 5 incluindo ambas as células bacterianas e fúngicas, que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recombinante. Transformação tipicamente ocorre pela inserção de uma ou mais seqüências nucleotídicas em uma célula. A seqüência nucleotídica inserida pode ser uma seqüência nucleotídica heteróloga, isto é, é uma seqüência que não é natural para a célula que de10 ve ser transformada, tal como uma proteína de fusão.

Como usado neste pedido, "operacionalmente ligado" significa que os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira desejada. Por exemplo, uma seqüência regulatória operacionalmente ligada a uma seqüência de codificação é ligada de tal modo 15 que a expressão da seqüência de codificação é realizada sob condição compatível com as seqüências de controle.

Como usado neste pedido, "biologicamente ativo" refere-se a uma seqüência tendo uma função estrutural, regulatória ou bioquímica similar à seqüência que ocorre naturalmente, embora não necessariamente no mesmo grau.

O termo "fungos filamentosos" refere-se a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Ver Alexopoulos, INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York (1962). Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, celulose 25 e outros polissacarídeos complexos. Fungos filamentosos são morfologicamente, fisiologicamente e geneticamente distintos de leveduras. O crescimento vegetativo em fungos filamentosos é através de alongamento de hifas e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Uma célula parental fúngica filamentosa pode ser uma célula de Trichoderma sp., por exemplo, 30 T. reesei (anteriormente classificado como T. Iongibrachiatum e atualmente também conhecido como Hypocrea jecorina), T. vinde, T. koningii, T. harzianum\ Penieillium sp.', Humieola sp., por exemplo, H. insolens e H. grisea, Chrysosporium sp., por exemplo, C. Iucknowense; Gliocladium sp.; Aspergillus sp., por exemplo, A. oryzae, A. nigere A. awamorr, Fusarium sp.; Neurospora sp.; Hypoerea sp.; e EmerieeIIa sp. Ver também Innis et al. Science 228: 21-26 (1985).

Como usado neste pedido, o termo "amido" refere-se a qualquer

material compreendido dos carboidratos polissacarídicos complexos de plantas, compreendidos de amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10Os)x, onde X pode ser qualquer número. O termo "amido granular" refere-se amido bruto, isto é, amido não cozido, por exemplo, aquele que não foi submetido à gelatinização.

Como usado neste pedido, o termo "sacarificação" refere-se à conversão enzimática do amido à glicose.

O termo "liquefação" refere-se ao estágio na conversão do amido em que amido gelatinizado é hidrolisado para formar dextrinas solúveis 15 de baixo peso molecular. O termo "grau de polimerização" (DP) refere-se ao número (n) de unidades de anidroglicopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos maltose e sacarose.

Como usado neste pedido, o termo "conteúdo de sólidos secos" (ds) refere-se aos sólidos totais de uma pasta fluida em uma base de porcentagem de peso seco. O termo "pasta fluida" refere-se a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.

O termo "DE", ou "dextrose equivalente" é definido como a percentagem de redução de açúcar, isto é, D-glicose, como uma fração de carboidrato total em um xarope.

A frase "sacarificação e fermentação simultânea (SSF)" referese a um processo na produção de bioquímicos nos quais um organismo microbiano, tal como um micro-organismo de produção de etanol e pelo menos uma enzima, tal como TrAA ou uma variante da mesma, estão presentes 30 durante a mesma etapa do processo. SSF refere-se à hidrólise contemporânea de substratos de amido granular a sacarídeos, incluindo a glicose, e a fermentação dos sacarídeos e, álcool, por exemplo, no mesmo vaso de reação.

Como usado neste pedido "micro-organismo etanologênico" refere-se a um micro-organismo com capacidade de converter um açúcar ou oligossacarídeo em etanol.

1.2. Abreviaturas

As seguintes abreviaturas aplicam-se a menos que indicado de outra maneira:

ADA azodicarbonamida

AnGA glicoamilase de Aspergillus niger

ATCC American Type Culture Collection

BBA β-amilase Spezyme® BBA 1500L

cDNA DNA complementar

DE Dextrose Equivalente

DEAE dietilamino etanol

DNA ácido desoxirribonucleico

DNS ácido 3,5-dinitrossalicílico

DPn grau de polimerização com n subunidades

Ds sólido seco

EC encarregado enzimático para classificação enzimática

EDTA ácido etilenodiaminotetra-acético

FGSC Fungai Genetics Stock Center

G173A resíduo glicina (G) na posição 173 é substituído por uma

resíduo de alanina (A) onde os aminoácidos são denominados pelas abreviações de letra única comumente conhecidas na técnica GA Glicoamilase

GAU unidade de atividade de glicoamilase

HFCS xarope de milho de alta frutose

HFSS xarope baseado em amido de alta frutose

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Perfomance

HgGA glicosilase de Humincola grisea

HS açúcares maiores (DPn, onde n > 3) kb Quilobase

LAT α-amilase de B. Iicheniformis

LB caldo de Luria Bertani

LU Unidades de Lipase1 uma medição da atividade de fosfolipase por unidade de massa de enzima

MOPS ácido 3-(n-morfolino) propanossulfônico

mRNA ácido ribonucleico mensageiro

mt tonelada métrica (1000 kg)

PCR reação da polimerase em cadeia

PEG Polietilenoglicol

ppm partes por milhão

PU pululanase ou unidades de pululanase

RT-PCR reação da polimerase em cadeia por transcriptase reversa

SD caldo de dextrose Sabouraund

SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio

SKBU/g ds Unidade de α-Amilase por grama de sólidos secos. Uma Unidade de α-Amilase dextriniza um grama de substrato limitado por dextrina por hora sob condições do ensaio

1X SSC NaCI a 0,15 M, citrato de sódio a 0,015 M, pH 7,0

SSF sacarificação e fermentação simultâneas

TE Tris a 10 mM, pH 7,4, EDTA a 1 mM

TrAA α-amilase de Trichoderma reesei

TrGA glicoamilase de Trichoderma reesei

p/v peso/volume

p/p peso/peso

YM Caldo de Extrato de Malte de Levedura

pL Microlitro

2. α-Amilase de Trichoderma reesei (TrAA) e variantes da mesma

Um polipeptídeo isolado e/ou purificado compreendendo a SEQ ID NO:3 é fornecido. Esta é uma α-amilase de Trichoderma reesei de tipo selvagem (TrAA) compreendendo uma seqüência líder de 20 aminoácidos. Em uma modalidade, a TrAA é uma forma madura do polipeptídeo, em que a seqüência líder de 20 aminoácidos é clivada, para que o N-terminal do polipeptídeo comece no resíduo de ácido aspártico (D) na posição 21 da SEQ ID NO:3. Ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo compreendendo a 5 SEQ ID NO:3 ou resíduos de aminoácido 21 a 463 da SEQ ID NO: 3 também são fornecidos. Em uma modalidade, uma TrAA de codificação de ácido nucleico é um DNA genômico compreendendo a SEQ ID NO:1; em outra modalidade, o ácido nucleico é um cDNA compreendendo SEQ ID NO:2. Como é bem entendido por um versado na técnica, o código genético é de10 generado, significando que múltiplos códons em alguns casos podem codificar o mesmo aminoácido. Ácidos nucleicos incluem DNA genômico, mRNA e cDNA que codificam uma TrAA ou variante da mesma.

Além da α-amilase de Trichoderma reesei de tipo selvagem (TrAA), variantes das mesmas são as fornecidas que diferem da seqüência de TrAA de tipo selvagem mostrada na SEQ ID NO: 3 por substituição, inserção ou deleção de um ou mais aminoácidos. Por exemplo, uma a-amilase variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20,

25, 30, 35, ou 40 modificações de aminoácidos, por exemplo, 1 a 10 substituições de aminoácidos, que conservam a atividade α-amilase maltogênica. 20 A TrAA variante pode conservar uma atividade específica mais alta ou mais baixa do que a TrAA de tipo selvagem. As variantes são sinônimas a "homólogos". Ácidos nucleicos variantes são os fornecidos que codificam polipeptídeos variantes. Ácidos nucleicos variantes incluem todos os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos variantes.

2.1. Caracterização da Variante de TrAA

Variantes enzimáticas podem ser caracterizadas pelas suas seqüências polipeptídicas primárias e de ácidos nucleicos, por modelagem estrutural tridimensional, e/ou por sua atividade específica. Características adicionais da variante de TrAA incluem estabilidade, faixa de pH, estabilidade à 30 oxidação e termoestabilidade, por exemplo. Em um aspecto, as variantes de TrAA são expressas a níveis mais altos do que a TrAA de tipo selvagem, enquanto conservam as características de desempenho da TrAA de tipo seivagem. Níveis de expressão e atividade enzimática podem ser avaliados usando ensaios padrão conhecidos ao versado neste campo. Em outro aspecto, variantes demonstram características de desempenho melhoradas em relação à enzima de tipo selvagem, tais como estabilidade melhorada em 5 altas temperaturas (isto é, 70 a 120°C) e/ou extremos de pH (isto é, pH 4,0 a 6,0, ou pH 8,0 a 11,0).

Uma característica de expressão significa um nível alterado da expressão da variante, quando a variante é produzida em uma determinada célula hospedeira. A expressão geralmente relaciona-se à quantidade da 10 variante ativa que é recuperável de um caldo de fermentação usando técnicas padrão conhecidas nesta técnica em um dado período de tempo. A expressão também pode relacionar-se à quantidade ou taxa da variante produzida na célula hospedeira ou secretada pela célula hospedeira. A expressão também pode relacionar-se à taxa de tradução do mRNA que codifica a en15 zima de variantes.

As variantes de TrAA também podem ter alterado a estabilidade de oxidação em comparação com a α-amilase parental. Por exemplo, a estabilidade de oxidação reduzida pode ser vantajosa na composição da liquefação de amido.

Variante de TrAA pode ser mais termoestável do que a a

amilase de tipo selvagem. Tais variantes de TrAA são vantajosas para o uso em cozimento ou outros processos que necessitam temperaturas elevadas. Por exemplo, uma variante de TrAA termoestável pode degradar o amido em temperaturas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 80°C ou mais. 25 Uma variante de TrAA termoestável pode conservar sua atividade após exposição a temperaturas de até aproximadamente 95°C.

Os polipeptídeos variantes de α-amilase descritos neste pedido também podem ter mutações que estendem a meia-vida em relação à enzima parental em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 30 200% ou mais, particularmente em temperaturas elevadas de aproximadamente 55°C a aproximadamente 95°C ou mais, particularmente a aproximadamente 80°C. Em uma modalidade, a variante de TrAA pode ser aquecida por aproximadamente 1 a 10 minutos a 80°C ou maior.

Os polipeptídeos variantes de TrAA podem ainda incluir mutações na seqüência sinal do polipeptídeo parental, ou em outro lugar no polipeptídeo TrAA parental. Por exemplo, a variante de TrAA pode estar na for5 ma de uma proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo heterólogo, tal como o peptídeo sinal de B. Iicheniformis (LAT), fusionado à TrAA para promover a secreção da proteína expressa de uma célula hospedeira bacteriana. Outros polipeptídeos heterólogos que podem ser fusionados a variantes de TrAA incluem seqüências para facilitar a purificação da proteína ex10 pressa, por exemplo. Em uma modalidade, uma seqüência heteróloga inclui um sítio sensível à protease que permite à seqüência heteróloga ser clivada a partir da variante de TrAA expressa.

Em um aspecto, o polipeptídeo variante de TrAA codificado pelo ácido nucleico tem a mesma estabilidade ao pH que a seqüência parental. 15 Em outro aspecto, a variante de TrAA compreende uma mutação que confere uma maior faixa de estabilidade ao pH ou desloca a faixa de pH para uma área desejada para objetivo de fins comerciais da enzima. Por exemplo, em uma modalidade, a variante de TrAA pode degradar o amido em aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 10,5. O polipeptídeo variante de 20 TrAA pode ter uma meia-vida mais longa ou atividade mais alta (dependendo do ensaio) em comparação com o polipeptídeo parental sob condições idênticas, ou a variante de TrAA pode ter a mesma atividade que o polipeptídeo parental. O polipeptídeo variante de α-amilase também pode ter meiavida de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 25 90%, 100%, 200% ou mais longa em comparação com seu polipeptídeo parental sob condições de pH idênticas. Alternativamente, ou ainda, a variante de TrAA pode ter atividade específica mais alta em comparação com o polipeptídeo parental sob condições de pH idênticas.

Em outro aspecto, um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico que codifica alguma das variantes de TrAA apresentadas neste pedido é fornecido. Adicionalmente, um ácido nucleico capaz de hibridizar ao complemento é fornecido. Em outra modalidade, a seqüência para uso nos métodos e composições descritas neste pedido é uma seqüência sintética. Inclui, mas não é limitada a seqüências feitas com uso ótimo de códon para expressão em organismos hospedeiros, tais como leveduras metilotróficas Trichoderma, Pichia e Hansenula.

3. Produção de TrAA e variantes da mesma

Em uma modalidade, a TrAA de tipo selvagem é expressa em uma cepa de T. reesei e opcionalmente é isolada antes do uso. Em outra modalidade, a TrAA de tipo selvagem é purificada, após expressão. As cepas de T. reesei particularmente úteis são selecionadas usando técnicas 10 bem-conhecidas ao versado que expressam TrAA de tipo selvagem em altos níveis. A expressão de alto nível pode ser aproximadamente 12 a 20 g de TrAA ou uma variante da mesma por litro do meio de cultura, aproximadamente 14 a 18g/L, ou aproximadamente 16 a 19g/L. Em outras modalidades, a TrAA de tipo selvagem ou uma variante da mesma é recombinantemente 15 expressa em uma célula hospedeira. O gene de TrAA pode ser clonado e expresso como descrito, por exemplo, nos Pedidos de Patente Americana Publicados N0 2007/0004018 e N0 2006/0094080.

3.1 Enzimas Recombinantemente Expressas.

Em algumas modalidades, os micro-organismos são geneticamente construídos para expressar TrAA ou suas variantes. Células hospedeiras adequadas incluem células fúngicas filamentosas, que podem ser uma cepa de Aspergillus sp., Trichoderma sp., Fusarium sp. ou Penicillium sp., por exemplo. Células hospedeiras fúngicas particularmente adequadas incluem Aspergillus nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, Trichoderma reesei, T. viride, Fusarium oxysporum e F. solani. Cepas de Aspergillus são descritas em Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743 (1993) e Goedegebuur et al., Curr. Gene. 41:89-98 (2002). Em uma modalidade particularmente adequada, o hospedeiro é uma cepa de Trichoderma reesei que produz TrAA em níveis relativamente altos, por exemplo, 15 a 20 g/L. T. reesei adequadas são conhecidas, e exemplos nãoIimitantes incluem ATCC N0 13631, ATCC N0 26921, ATCC N0 56764, ATCC N0 56765, ATCC N0 56767 e NRRL 15709. Em algumas modalidades, a cepa hospedeira é um derivado de RL-P37, que é descrito em Sheir-Neiss et al., Appl. MicrobioL Biotechnology 20:46-53 (1984). Quando TrAA ou suas variantes são expressas em uma célula hospedeira eucariótica, a TrAA expressa em uma modalidade particularmente adequada tem o mesmo padrão 5 da glicosilação como encontrado na TrAA de tipo selvagem. Células hospedeiras particularmente adequadas incluem células hospedeiras de Trichoderma reesei construídas de acordo com os procedimentos apresentados na Patente Americana N0 5.874.276 e WO 05/001036 (Genencor International, Inc.).

Em outras modalidades, a célula hospedeira será uma célula

hospedeira geneticamente construída com genes nativos inativados, por exemplo, genes deletados. Por exemplo, inativação de um ou mais genes em uma célula hospedeira fúngica pode empregar métodos conhecidos, tais como os descritos na Patente Americana N0 5.246.853, Patente Americana 15 N0 5.475.101 e W092/06209. A inativação gênica pode ser realizada pela deleção completa ou parcial, pela inativação insercional, ou por quaisquer outros meios que forneçam um gene não funcional para seu objetivo desejado, tal que o gene é inibido de expressão de uma proteína funcional. Genes inativados podem incluir, por exemplo, genes que codificam enzimas celulolí20 ticas, tais como endoglicanases e exocelobiohidrolases, por exemplo, cbhl, cbh2, egll, egl2 e egl3. Em uma modalidade, quando a célula hospedeira é uma célula Trichoderma, particularmente uma célula hospedeira T. reesei, os genes cbhl, cbh2, egll e egl2 serão inativados e particularmente deletados. Células T. reesei hospedeiras particularmente adequadas tendo proteí25 nas quad-deletadas são apresentadas e descritas na Patente Americana N0 5.874.276 e WO 05/001036. Em outra modalidade, a Patente Americana N0 5.650.322 revela cepas derivadas de RL-P37 tendo deleções no gene cbhle no gene cbh2, por exemplo.

Em outra modalidade, células hospedeiras adequadas incluem uma bactéria Gram-positiva selecionada a partir do grupo composto de Bacillus subtilis, B. Iicheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces Iividans ou S. murinus\ ou uma bactéria Gramnegativa, em que a dita bactéria Gram-negativa é Escheriehia eoli ou uma espécie Pseudomonas.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é genetica5 mente projetada para expressar uma variante de TrAA com uma seqüência de aminoácido que tem identidade de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com a TrAA de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma TrAA ou variante da mesma terá uma seqüência de ácido nucleico de SEQ ID NO:2 ou uma seqüência de 10 ácido nucleico que tem identidade de seqüência de pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com SEQ ID NO:2. Em outras modalidades, a cepa hospedeira expressando uma TrAA ou variante da mesma também é geneticamente construída para expressar uma GA heteróloga.

3.2. Vetores

Em algumas modalidades, um construto de DNA compreenden

do um ácido nucleico que codifica uma TrAA ou variante da mesma é construído para ser expresso em uma célula hospedeira. Ácidos nucleicos representativos que codificam TrAA incluem SEQ ID NO:1 e 2. Em uma modalidade, o construto de DNA é transferido para uma célula hospedeira por um 20 vetor de expressão que compreende seqüências regulatórias operacionalmente ligadas a uma seqüência de codificação de TrAA.

O vetor pode ser qualquer vetor que pode ser integrado em um genoma da célula hospedeira fúngica e replicado quando introduzido na célula hospedeira. O Catálogo de Cepas FGSC (lista vetores adequados. Ver 25 FGSC, Catálogo de Cepas, University of Missouri, em www.fgsc.net (última modificação em 17 de janeiro de 2007). Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Bennett et 30 al, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego

(1991), pp. 396 a 428; e Patente Americana N0 5.874.276. Vetores particularmente úteis incluem pFB6, pBR322, pUC18, pUCIOO e pENTR/D, pDON™ 201, pDONR™ 221, pENTR™, pGEM® 3Z e pGEM® 4Z. Plasmídeos adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19, que permitem a replicação em E.coli, e pE194, por exemplo, que permite a replicação em Bacillus.

Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica uma

TrAA ou uma variante da mesma é operacionalmente ligado a um promotor adequado, que permite a transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser derivado de genes que codificam proteína homóloga ou heteróloga à célula hospedeira. Preferencialmente, o promotor é útil em um hospedeiro de Trichoderma. Exemplos não-limitantes adequados de promotores incluem promotores cbhl, cbh2, eglleegl2. Em uma modalidade, o promotor é aquele que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor de T. reesei nativo. Em uma modalidade, o promotor é cbhl de T. reesei, que é um promotor induzível que é depositado no GenBank sob o número de acesso D86235. Um "promotor induzível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou desenvolvimento. Em outra modalidade, o promotor é aquele que é heterólogo à célula hospedeira. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores de Aspergillus awamori e genes de glicoamilase de A. niger. Ver Nunberg et al., Moi Celi Bioi 4: 2306-2315 (1984) e Boel et ai, EMBO J. 3: 1581-1585 (1984).

Em algumas modalidades, a seqüência de codificação é operacionalmente ligada a uma seqüência sinal. O DNA que codifica a seqüência sinal pode ser a seqüência de DNA naturalmente associada com o gene de TrAA a ser expresso. Por exemplo, o DNA de codificação pode compreender 25 a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:4, que codifica a seqüência sinal de TrAA da SEQ ID NO:5. Em outras modalidades, o DNA de codificação não compreende SEQ ID NO:4, que é substituído por uma seqüência nucleotídica que codifica uma seqüência sinal de uma espécie exceto Trichooderma reesei. Nesta modalidade, o polinucleotídeo que codifica a seqüência sinal 30 está imediatamente a montante e na região do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Em modalidades adicionais, uma seqüência sinal e uma seqüência promotora compreendendo um construto ou vetor de DNA a ser introduzido em uma célula hospedeira fúngica são derivadas da mesma fonte. Por exemplo, em algumas modalidades, a seqüência sinal é a seqüência sinal de cbhl que está operacionalmente ligada a um promotor cbhl.

Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui 5 uma seqüência de terminação. Em uma modalidade, a seqüência de terminação e a seqüência promotora são derivadas da mesma fonte. Em outra modalidade, a seqüência de terminação é homóloga à célula hospedeira. Uma seqüência terminadora particularmente adequada é cbhl derivada de uma cepa de Trichoderma e particularmente T. reesei. Outros terminadores 10 fúngicos úteis incluem o terminador do gene de glicoamilase de Aspergillus niger ou A. awamori. Ver Nunberg et al. (1984), supra, e Boel et al. (1984), supra.

Em algumas modalidades, um vetor de expressão inclui um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados 15 incluem aqueles que conferem resistência a agentes antimicrobianos, por exemplo, higromicina ou fleomicina. Marcadores seletivos nutricionais também são adequados e incluem amdS, argB e pyr4. Marcadores úteis em sistemas de vetor de transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Fin20 kelstein et al., Eds., Butterworth-Heinemann, Boston, Mass. (1992), Cap. 6; e Kinghorn et al., APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London

(1992). Em uma modalidade, o marcador seletivo é o gene amdS, que codifica a enzima acetamidase; permite a células transformadas crescer em acetamida como uma fonte de nitrogênio. O uso de um gene amdS de A. niduIans como um marcador seletivo é descrito em Kelley et al., EMBO J. 4: 475- 479 (1985) e Penttila et ai, Gene 61:155-164 (1987).

Um vetor de expressão adequado compreendendo um construto de DNA com um polinucleotídeo que codifica uma TrAA ou variante da mesma pode ser qualquer vetor que é capaz de replicação autonomamente em um dado organismo hospedeiro ou integração no DNA do hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um plasmídeo. Em algumas modalidades, dois tipos de vetores de expressão para obtenção da expressão de genes são contemplados. O primeiro vetor de expressão compreende seqüências de DNA nas quais o promotor, região de codificação de TrAA1 e terminador todos se originam do gene a ser expresso. Em algumas modalidades, o truncamento gênico é obtido pela deleção de seqüências de DNA não desejadas, por exemplo, DNA que codifica domínios não desejados, para deixar o domínio a ser expresso no controle das suas próprias seqüências regulatórias transcricionais e traducionais. O segundo tipo do vetor de expressão é pré-montado e contém seqüências necessárias para a transcrição de alto nível e um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a região de codificação de um gene de TrAA ou parte do mesmo é inserida neste vetor de expressão de uso geral, tal que está sob o controle transcricional das seqüências promotoras e terminadoras do construto de expressão. Em algumas modalidades, genes ou parte dos mesmos são inseridos a jusante do promotor cbhl forte.

Métodos usados para ligar um construto de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma TrAA ou variante da mesma, um promotor, um terminador e outras seqüências e métodos para inserir o construto em um vetor adequado são bem-conhecidos na técnica. A ligação é 20 geralmente realizada pela ligação a sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os Iigadores de oligonucleotídeos sintéticos são usados conforme a prática convencional. Ver, por exemplo, Sambrook (2001), supra, e Bennett et al. (1991), supra. Adicionalmente, vetores podem ser construídos usando técnicas de recombinação conhecidas bem-conhecidas na téc25 nica.

Métodos conhecidos podem ser usados para obter uma célula hospedeira fúngica tendo um ou mais genes inativados, como descrito, por exemplo, na Patente Americana N0 5.246.853; Patente Americana N0 5.475.101; e WO 92/06209. A inativação gênica pode ser realizada pela de30 leção completa ou parcial, pela inativação insercional ou por qualquer outro meio que fornece um gene não funcional para seu alvo desejado, tal que o gene é inibido de expressão de uma proteína funcional. Qualquer gene de uma Trichoderma sp. ou outro hospedeiro fúngico filamentoso que foi clonado pode ser deletado, por exemplo, genes cbhl, cbh2, egll e egl2. Em algumas modalidades, a deleção gênica pode ser realizada pela inserção de uma forma do gene desejado a ser inativado em um plasmídeo por métodos 5 conhecidos na técnica. O plasmídeo de deleção então é cortado em um sítio(s) de enzima de restrição apropriado interno na região de codificação gênica desejada, e a seqüência de codificação gênica ou uma parte da mesma é substituída com um marcador selecionável. Seqüências de DNA flanqueadoras a partir do Iocus do gene a ser deletado, por exemplo, entre aproxima10 damente 0,5 a 2,0 kb, permanece em ambos os lados do gene marcador. Um plasmídeo de deleção apropriado terá geralmente sítios de restrição enzimática únicos presentes para permitir o fragmento contendo o gene deletado, incluindo as seqüências de DNA flanqueadoras e os marcadores gênicos selecionáveis, ser removido como uma parte linear única.

3.3 Transformação. Expressão e Cultura de Células Hospedeiras

A introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, por exemplo, transfecção mediada por lipofecção e mediada por DEAE-dextrina; precipitação de DNA por incu20 bação com fosfato de cálcio; bombardeio de alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA; e fusão protoplástica. Técnicas de transformação gerais são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Ausubel et al. (1987), supra, capítulo 9; Sambrook et al. (2001), supra; e Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56 (1989). A expressão da proteína heteróloga em Trichoderma é 25 descrita, por exemplo, na Patente Americana N0 6.022.725; Patente Americana N0 6.268.328; Harkki et al., Enzyme Microb. Technoi 13: 227-233 (1991); Harkki et al., BioTechnoi 7:596-603 (1989); EP 244.234; EP 215.594; e Nevalainen et al., "The molecular biology of Trichoderma and its application to the expression of both homologous and heterologous genes," 30 em MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Leong and Berka, eds., Mareei Dekker Inc., New York (1992), pp. 129-148. Referência também é feita a Cao et ai, Science 9: 991-1001 (2000) para transformação de cepas de Aspergillus. Em uma modalidade, transformantes geneticamente estáveis são construídos com sistemas de vetor pelo qual o ácido nucleico que codifica uma TrAA ou variante da mesma é estavelmente integrado em um cromossomo da célula hospedeira. Transformantes então são purificados por técnicas conhecidas.

Em um exemplo não-limitante, os transformantes estáveis incluindo um marcador amdS são distinguidos de transformantes não estáveis pela sua taxa de crescimento mais rápida e a formação de colônias circulares com um traçado regular, em vez de irregular no meio de cultura sólido 10 contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos um teste adicional de estabilidade é conduzido pelo cultivo dos transformantes em meio não seletivo sólido, por exemplo, um meio sem acetamida, coleta de esporos deste meio de cultura e determinação da porcentagem destes esporos que posteriormente germinam e crescem em meio seletivo contendo acetamida. Ou15 tros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para selecionar transformantes.

Em uma modalidade específica, a preparação de Trichoderma sp. para transformação envolve a preparação de protoplastos de micélios fúngicos. Ver Campbell et al., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989). Em algumas 20 modalidades, os micélios são obtidos de esporos vegetativos germinados. Os micélios são tratados com uma enzima que digere a parede celular, resultando em protoplastos. Os protoplastos são protegidos pela presença de um estabilizador osmótico no meio de suspensão. Estes estabilizadores incluem sorbitol, manitol, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e similares. 25 Normalmente a concentração destes estabilizadores varia entre 0,8 M e 1,2 M, por exemplo, uma solução a 1,2 M de sorbitol pode ser usada no meio de suspensão.

A entrada de DNA na cepa hospedeira Trichoderma sp. é dependente da concentração de íon de cálcio. Geralmente, entre aproximadamente 10 a 50 mM de CaCfe são usados em uma solução de entrada. Compostos adequados adicionais incluem um sistema de tamponamento, tal como tampão TE (Tris a 10 mM, pH 7,4; EDTA a 1 mM) ou MOPS 10 mM, pH 6,0 e polietileno glicol. Acredita-se que o polietileno glicol fusiona-se às membranas celulares, permitindo dessa forma os conteúdos do meio serem entregues no citoplasma da cepa de Trichoderma sp.. Esta fusão frequentemente deixa múltiplas cópias do DNA do plasmídeo integradas no cromos5 somo do hospedeiro.

Normalmente a transformação de Trichoderma sp. usa protoplastos ou células que foram submetidas a um tratamento de permeabilidade, tipicamente a uma densidade de 105 a IO7VmL, particularmente 2x106/mL. Um volume de 100 pL destes protoplastos ou células em uma so10 lução apropriada (por exemplo, sorbitol a 1,2 M e CaCb a 50 mM) são misturados com o DNA desejado. Geralmente, uma alta concentração de PEG é adicionada à solução de entrada. De 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplasto; entretanto, é útil adicionar aproximadamente 0,25 volume à suspensão de protoplasto. Os aditivos, tais 15 como sulfóxido de dimetila, heparina, espermidina, cloreto de potássio e similares, também podem ser adicionados à solução de entrada para facilitar a transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas. Ver, por exemplo, Patentes Americanas Nos. 6.022.725 e 6.268.328, ambas as quais estão incorporadas por referência.

Geralmente, a mistura é então incubada em aproximadamente

0°C por um período entre 10 a 30 minutos. PEG adicional então é adicionado à mistura para aumentar ainda a entrada do gene ou seqüência de DNA desejados. PEG 4000 a 25% é geralmente adicionado em volumes de 5 a 15 vezes o volume da mistura de transformação; entretanto, os maiores e me25 nores volumes podem ser adequados. PEG 4000 a 25% é tipicamente aproximadamente 10 vezes o volume da mistura de transformação. Após PEG ser adicionado, a mistura de transformação é incubada à temperatura ambiente ou em gelo antes da adição de uma solução de sorbitol e CaCfe. A suspensão de protoplasto então é ainda adicionada a alíquotas fusionadas de 30 um meio de crescimento. Este meio de crescimento permite o crescimento somente de transformantes.

Geralmente, células são cultivadas em um meio padrão contendo sais e nutrientes fisiológicos. Ver, por exemplo, Pourquie et ai, BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, Aubert et ai, eds., Academic Press (1988), pp. 71-86; e Ilmen et ai, Appl. Environ. Microbioi 63: 1298-1306 (1997). Os meios comuns comercialmente preparados, 5 por exemplo, caldo de Extrato de Malte de Levedura (YM), caldo de Luria Bertani (LB), ou caldo de Dextrose Sabouraud (SD), também são adequados.

Condições de cultura padrão são adequadas, por exemplo, culturas são incubadas a aproximadamente 28°C no meio apropriado em cultu10 ras ou fermentadores de agitação até um nível desejado de expressão de uma TrAA ou variante da mesma ser alcançado. Condições de cultura preferenciais de um dado fungo filamentoso são conhecidas na técnica e estão disponíveis, por exemplo, na American Type Culture Collection (ATCC) e Fungai Genetics Stock Center (FGSC). Após o crescimento fúngico ter sido 15 estabelecido, as células são expostas a condições eficazes para causar ou permitir a expressão de uma TrAA ou uma variante da mesma.

3.4. Identificação de Atividade de TrAA

Para avaliar a expressão de uma TrAA ou variante da mesma em uma célula hospedeira, ensaios podem medir a proteína expressa, mRNA correspondente ou atividade maltogênica da α-amilase. Por exemplo, ensaios adequados incluem Northern e Southern blotting, RT-PCR (reação de polimerase em cadeia via transcriptase reversa), e hibridização in situ, usando uma sonda de hibridização apropriadamente marcada. Ensaios adequados também incluem mensuração de atividade de TrAA em uma amostra, por exemplo, por ensaios que diretamente medem redução de açúcares, tal como glicose nos meios de cultura. Por exemplo, a concentração de glicose pode ser determinada usando conjunto de reagente de glicose N0 15- UV (Sigma Chemical Co) ou um instrumento, tal como Technieon Autoanalyzer. A atividade de glicoamilase pode ser analisada pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS). Ver, Goto et ai, Biosci. Biotechnol. Biochem. 58:49-54 (1994).

Geralmente, a TrAA expressa por um hospedeiro Trichoderma ou Aspergillus terá uma concentração no meio de cultura de maior que 1 grama de proteína por litro (g/L), maior do que 2 g/L, maior do que 5 g/L, maior do que 10 g/L, maior do que 20 g/L, ou maior do que 25 g/L. Em uma modalidade, a TrAA ou variante da mesma expressa por um hospedeiro Tri5 choderma ou Aspergillus será glicosilada, isto é, a TrAA ou variante da mesma compreenderá uma porção glicosil. Em uma modalidade particularmente adequada, o padrão de glicosilação será o mesmo como presente na TrAA de tipo selvagem.

3.5. Métodos para Purificação de TrAA Em geral, uma TrAA ou variante da mesma produzida na cultura

celular é secretada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exemplo, pela remoção de componentes não desejados do meio de cultura celular. Em alguns casos, uma TrAA ou variante da mesma pode ser recuperada de um Iisado celular. Em tais casos, a enzima é purificada a partir das células 15 nas quais foi produzida usando técnicas costumeiramente empregadas por aqueles versados na técnica. Exemplos incluem, mas não são limitados a, cromatografia de afinidade, métodos cromatográficos de troca iônica, incluindo troca iônica de alta resolução, cromatografia de interação hidrofóbica, particionamento em duas fases, precipitação em etanol, HPLC em fase re20 versa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE, cromatofocalização, SDS-PAGE, precipitação em sulfato de amônio e filtração em gel usando Sephadex G-75, por exemplo.

3.6 Fermentação

Em algumas modalidades, células fúngicas expressando uma 25 TrAA ou variante da mesma são cultivadas sob condições de fermentação em batelada ou contínua. Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, onde a composição do meio é estabelecida no início da fermentação e não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo(s) desejado. Neste método, permite-se 30 que a fermentação ocorra sem adição de quaisquer componentes ao sistema. Tipicamente, uma fermentação em batelada prepara-se como uma "batelada" com respeito à adição da fonte de carbono, e tentativas são muitas vezes feitas para controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio. As composições de biomassa e metabólitos da modificação do sistema em batelada mudam constantemente até o tempo da fermentação ser parado. Dentro de culturas em batelada, células progridem através de uma fase Iag 5 estática a uma fase Iog de alto crescimento e finalmente a uma fase estacionária, onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não tratadas, as células na fase estacionária consequentemente morrem. Em geral, as células na fase Iog são responsáveis pelo volume da produção do produto.

Uma variação adequada no sistema em batelada padrão é o sis10 tema de fermentação em "batelada alimentada". Nesta variação de um sistema em batelada típico, o substrato é adicionado em incrementos com os progressos da fermentação. Os sistemas de batelada alimentada são úteis provavelvente quando a repressão do catabólito provavelmente inibe o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de subs15 trato no meio. A mensuração da concentração do substrato real em sistemas de batelada alimentada é difícil e por isso é estimada com base nas modificações de fatores mensuráveis, tais como pH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gases residuais, tais como CO2. Fermentações em batelada e batelada alimentada são comuns e bem-conhecidas na técnica.

Fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de

fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual do meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, onde as células estão principalmente na fase 25 de crescimento log. A fermentação contínua leva em conta a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração do produto. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, é mantido em uma taxa fixa e permite-se que todos outros parâmetros se moderem. Em outros sistemas, 30 diversos fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente enquanto a concentração celular, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Sistemas contínuos esforçam-se para manter condições de crescimento em estado de equilíbrio. Dessa maneira, a perda celular devido ao meio que é retirado deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento em processos de fermentação contínua, bem como técnicas 5 para maximizar a taxa de formação de produto, são bem-conhecidos na técnica da microbiologia industrial.

4. Composições e Usos de TrAA e Variantes da Mesma

TrAA e suas variantes produzidas e purificadas pelos métodos descritos acima são úteis para uma variedade de aplicações industriais. Em 10 uma modalidade, TrAA e suas variantes são úteis em um processo de conversão de amido, particularmente em um processo de sacarificação de um amido que sofreu a liquefação. O produto final desejado pode ser qualquer produto que possa ser produzido pela conversão enzimática do substrato de amido. Por exemplo, produto desejado pode ser um xarope rico em maltose, 15 que pode ser usado em outros processos, tais como a preparação de HFCS. O produto alternativamente pode ser um xarope rico em glicose, que pode ser usado diretamente como uma fonte de glicose cristalina, por exemplo, ou que pode ser convertido em diversos outros produtos úteis, tais como intermediários de ácido ascórbico (por exemplo, gliconato; ácido 2-ceto-L20 gulônico; 5-ceto-gliconato; e 2,5-dicetogliconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos aromáticos (por exemplo, tirosina, fenilalanina e triptofano); ácidos orgânicos (por exemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato e oxaloacetato); aminoácidos (por exemplo, serina e glicina); antibióticos; enzimas; vitaminas; e hormônios.

Ainda em outra modalidade, o processo de conversão de amido

pode ser um precursor, ou simultâneo com um processo de fermentação desenhado para produzir álcool para combustível ou bebida (isto é, álcool potável). Um versado na técnica está ciente das várias condições de fermentação que podem ser usadas na produção destes produtos finais. TrAA e 30 variantes da mesma também são úteis em composições e métodos de preparação alimentícia. Estes vários usos de TrAA e suas variantes são descritos em mais detalhes abaixo. 4.1 Preparação de Substratos de Amido

Aqueles de conhecimento geral na técnica estão cientes de métodos disponíveis que podem ser usados para preparar substratos de amido para uso nos processos descritos neste pedido. Por exemplo, um substrato de amido útil pode ser obtido a partir de tubérculos, raízes, caules, legumes, cereais ou grão inteiro. Mais especificamente, o amido granular pode ser obtido a partir de milhos, espigas de milho, trigo, cevada, centeio, milo, sagu, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, ervilhas, feijão, banana ou batatas. Milho contém aproximadamente 60 a 68% de amido; cevada contém aproximadamente 55 a 65% de amido; painço contém aproximadamente 75 a 80% de amido; trigo contém aproximadamente 60 a 65% de amido; e arroz polido contém 70 a 72% de amido. Substratos de amido especificamente contemplados são amido de milho e amido de trigo. O amido de um grão pode ser moído ou inteiro e inclui sólidos de milho, tais como sementes, farelo e/ou espigas de milho. O amido pode ser amido bruto altamente refinado ou matéria-prima de processos de refinaria de amido. Vários amidos também estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, amido de milho está disponível em Cerestar, Sigma e Katayama Chemical Industry Co. (Japão); amido de trigo está disponível em Sigma; amido de batata-doce está disponível em Wako Pure Chemical Industry Co. (Japão); e amido de batata está disponível em Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japão).

O substrato de amido pode ser um amido bruto a partir do grão inteiro moído, que contém frações não-amido, por exemplo, resíduos de germe e fibras. A moagem pode compreender moagem úmida ou moagem 25 seca. Na moagem úmida, o grão inteiro é embebido em água ou ácido diluído para separar o grão em suas partes componentes, por exemplo, amido, proteína, germe, óleo, fibras da semente. A moagem úmida separa eficientemente o germe e a farinha (isto é, grânulos de amido e proteína) e é especialmente adequada para a produção de xaropes. Na moagem seca, as se30 mentes inteiras são quebradas em um pó fino e processadas sem fracionamento do grão nas suas partes componentes. O grão moído a seco dessa forma compreenderá quantidades significantes de compostos de carboidrato não-amido, além do amido. A maior parte do etanol vem da moagem seca. Alternativamente, o amido a ser processado pode ser uma qualidade de amido altamente refinada, por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99,5% puro.

4.2. Gelatinizacão e Liauefacão de Amido

Como usado neste pedido, o termo "liquefação" ou "liquefazer" significa um processo pelo qual o amido é convertido em menos dextrinas de cadeia mais curtas e menos viscosas. Geralmente, este processo envolve gelatinização do amido simultaneamente com ou seguido pela adição de 10 uma α-amilase, embora as enzimas adicionais indutoras de liquefação opcionalmente possam ser adicionadas. Em algumas modalidades, o substrato de amido preparado como descrito acima é misturado com água. A pasta fluida de amido pode conter amido com uma porcentagem em peso de sólidos secos de aproximadamente 10 a 55%, aproximadamente 20 a 45%, a15 proximadamente 30 a 45%, aproximadamente 30 a 40% ou aproximadamente 30 a 35%. α-amilase (EC 3.2.1.1) pode ser adicionada á pasta fluida, com uma bomba de medição, por exemplo. A α-amilase tipicamente usada para esta aplicação é uma α-amilase termicamente estável, bacteriana, tal como uma α-amilase de B. licheniformis. A α-amilase é normalmente fornecida, por 20 exemplo, em aproximadamente 1500 unidades por kg de matéria seca de amido. Para otimizar a estabilidade e a atividade da α-amilase, o pH da pasta fluida é ajustado a aproximadamente o pH 5,5 a 6,5 e aproximadamente 1 mM de cálcio (aproximadamente 40 ppm de íons de cálcio livres) tipicamente é adicionado. Outras α-amilases podem requerer condições diferentes. A a25 amilase bacteriana que permanece na pasta fluida após liquefação pode ser desativada pela redução do pH em uma etapa de reação subsequente ou pela remoção de cálcio da pasta fluida.

A pasta fluida do amido mais a α-amilase podem ser bombeadas continuamente através de um fogareiro a jato, que é aquecido por vapor a 105°C. A gelatinização ocorre muito rapidamente sob estas condições, e a atividade enzimática, combinada com forças significantes de corte, começam a hidrólise do substrato de amido. O tempo de permanência no fogareiro a jato é muito breve. O amido parcialmente gelatinizado pode ser passado em uma série de tubos de armazenamento mantidos de 100 a 105°C e contido por 5 minutos para concluir o processo de gelatinização. A hidrólise para o DE requerido é concluída em tanques de armazenamento a temperaturas de 5 90 a 100°C ou mais altas por aproximadamente 1 a 2 horas. Estes tanques podem conter intrumentos que regulam o fluxo para prevenir mistura de volta.

Como usado neste pedido, o termo "liquefação secundária" refere-se à etapa de liquefação subsequente à liquefação primária (aquecimento 10 de 90 a 100°C), quando se permite que a pasta fluida esfrie à temperatura ambiente. Esta etapa de esfriamento pode ser de 30 minutos a 180 minutos, por exemplo, 90 minutos a 120 minutos. Como usado neste pedido, o termo "minutos de liquefação secundária" refere-se ao tempo decorrido a partir do início da liquefação secundária ao tempo que a Dextrose Equivalente (DE) é 15 medida.

O amido liqüefeito resultante do processo acima tipicamente contém aproximadamente 98% de oligossacarídeos e aproximadamente 2% de maltose e 0,3% de D-glicose. O amido liqüefeito tipicamente está na forma de uma pasta fluida tendo aproximadamente 10 a 50% de sólidos secos; 20 aproximadamente 10 a 45%; aproximadamente 15 a 40%; aproximadamente 20 a 40%; aproximadamente 25 a 40%; ou aproximadamente 25 a 35% de sólidos secos.

4.3. Sacarificacão: Criação de Xaropes de Maltose ou Glicose

O amido liqüefeito pode ser sacarificado em um xarope de glico25 se ou em um xarope de maltose usando a TrAA e variantes da mesma, opcionalmente na presença de outra enzima(s). A composição exata dos produtos da sacarificação depende da combinação de enzimas usadas, bem como o tipo do amido granular processado. Vantajosamente, o xarope de glicose obtenível usando a TrAA e variantes da mesma fornecidas pode con30 ter D-glicose em aproximadamente 96% p/p. A quantidade máxima de glicose que atualmente pode ser obtida sob qualquer conjunto de condições de sacarificação é aproximadamente 95 a 97%. O xarope de glicose pode ser usado diretamente após concentração para a produção de xaropes de alta frutose ou para a produção de glicose cristalina. Igualmente vantajosamente, o xarope de maltose obtenível usando TrAA e variantes da mesma fornecidas pode conter maltose excedendo 60% p/p.

Em geral, TrAA ou uma variante da mesma será adicionada a

uma pasta fluida de um substrato de amido granular em uma quantidade da enzima de aproximadamente 0,01 a 1 kg de enzima por tonelada métrica de sólidos secos. Em algumas modalidades, TrAA ou uma variante da mesma é adicionada a 0,1 a 5 kg/mt de sólidos secos, ou 0,3 a 1 kg/mt de sólidos se10 cos, ou a aproximadamente 0,5 kg/mt de sólidos secos. A atividade específica da TrAA ou variante da mesma pode ser aproximadamente 10.000 a

80.000 SKBU/g de enzima, ou aproximadamente 15.000 a 60.000 SKBU/g, ou aproximadamente 15.000 a 30.000 SKBU/g.

A TrAA ou uma variante da mesma pode ser adicionada à pasta 15 fluida na forma de uma enzima purificada. Alternativamente, TrAA ou uma variante da mesma pode ser adicionada como uma solução enzimática isolada. Em uma modalidade, TrAA ou uma variante da mesma é adicionada na forma de um extrato celular produzido a partir de uma cultura de células expressando a TrAA ou variante da mesma. Em outra modalidade, TrAA ou 20 uma variante é adicionada na forma de uma célula hospedeira que expressa e secreta a TrAA ou variante no meio de reação, tal que a enzima é fornecida continuamente na reação. Nesta modalidade, a célula hospedeira que expressa TrAA ou uma variante da mesma também pode expressar outra enzima que é usada para catalisar a sacarificação além da TrAA ou sua va25 riante. Por exemplo, uma célula hospedeira, por exemplo, Trichoderma reesei ou Aspergillus niger, pode ser projetada para co-expressar TrAA ou uma variante da mesma e uma glicoamilase, por exemplo, TrGA ou HgGA. Em uma modalidade, a célula hospedeira é geneticamente modificada para não expressar sua glicoamilase endógena.

4.3.1. Xaropes de glicose

Em um aspecto, TrAA e suas variantes são usadas em um processo de sacarificação para produzir um xarope rico em glicose. Para produzir um xarope de glicose, TrAA ou variantes da mesma tipicamente são adicionadas com uma glicoamilase (EC 3.2.1.3), por exemplo, glicoamilase AMG™. Como mostrado na TABELA 1, Figura 1 e discutido nos exemplos abaixo, o processo de sacarificação catalisado pela TrAA ou uma variante da 5 mesma na presença de uma glicoamilase pode produzir concentrações de glicose perto ou excedendo 97%. Vantajosamente, uma concentração máxima de glicose pode ser alcançada em menos tempo que se a reação fosse catalisada por uma glicoamilase sozinha. Em uma modalidade, as concentrações máximas de glicose são alcançadas em 12 horas, 24 horas ou 36 10 horas. Ver a TABELA 2 e o texto associado nos exemplos. Particularmente vantajosamente, TrAA e suas variantes suprimem a reação reversa da glicose a malto-oligossacarídeos, para que a concentração máxima de glicose seja mantida por de um tempo mais longo do que em um processo de sacarificação convencional. Ver TABELA 2. Em algumas modalidades, a concen15 tração máxima de glicose é mantida por aproximadamente 12 horas ou aproximadamente 24 horas após a concentração máxima ser alcançada.

Uma glicoamilase exemplar é glicoamilase de Trichoderma reesei (TrGA) e variantes da mesma que possui atividade específica e estabilidade térmica superiores. VerPedido de Patente Americana Publicados Nos. 20 2006/0094080, 2007/0004018, e 2007/0015266 (Genencor International, Inc.). Variantes adequadas de TrGA incluem aquelas com atividade de glicoamilase e identidade de seqüência de pelo 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da TrGA de tipo selvagem. TrAA e suas variantes vantajosamente aumentam o rendimento de glicose produzida em um processo de 25 sacarificação catalisado por TrGA. Sem a adição da TrAA ou suas variantes, TrGA tipicamente produz uma solução de glicose de aproximadamente 88% em pH 4,3; entretanto, quando TrAA ou suas variantes são adicionadas à reação, a mistura de TrAA e TrGA produz uma solução com uma concentração de glicose significativamente mais alta, por exemplo 94%.

Alternativamente, a glicoamilase pode ser outra glicoamilase de

rivada de plantas, fungos ou bactérias. Por exemplo, as glicoamilases podem ser glicoamilase Gl ou G2 de Aspergillus niger ou suas variantes (por exemplo, Boel et al., EMBO J. 3: 1097-1102(1984), WO 92/00381 e WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S)); e glicoamilase de A. awamori (por exemplo, WO 84/02921 (Cetus Corp.)). Outra glicoamilase de Aspergillus contemplada inclui variantes com estabilidade térmica aumentada, por exemplo, G137A e 5 G139A (Chen et ai, Prot. Eng. 9: 499-505(1996)); D257E e D293E/Q (Chen et al., Prot. Eng. 8: 575-582(1995)); N182 (Chen et ai, Biochem. J. 301; 275- 281(1994)); A246C (Fierobe et ai, Biochemistry, 35: 8698-8704(1996)); e variantes com resíduos Pro nas posições A435 e S436 (Li et ai, Protein Eng. 10: 1199-1204(1997)). Outras glicoamilases contempladas incluem glicoami10 Iases de Talaromyces, em particular derivadas de T. emersonii (por exemplo, WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S), T. Ieycettanus (por exemplo, Patente Americana N0 RE 32.153 (CPC International, Inc.)), T. duponti ou T. thermophilus (por exemplo, Patente Americana N0 4.587.215). Glicoamilases bacterianas contempladas incluem glicoamilases do gênero Clostridium, em parti15 cular C. thermoamylolyticum (por exemplo, EP 135.138 (CPC International, Inc.) e C. thermohydrosulfuricum (por exemplo, WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Glicoamilases adequadas incluem as glicoamilases derivadas de Aspergillus oryzae, tais como uma glicoamilase que tem homoIogia de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou até de 90% à se20 quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2 em WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S). Também são adequadas glicoamilases comerciais, tais como AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER e AMGtmE (de Novozymes); OPTIDEX® 300 (de Genencor International, Inc.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS(de DSM); G-ZYME® G900 (de Enzyme Bio-Systems); e G-ZYME® 25 G990 ZR (glicoamilase de A. niger com um baixo conteúdo de protease). Glicoamilases tipicamente são adicionadas em uma quantidade de 0,02 a

2,0 GAU/g de sólido seco ou 0,1 a 1,0 GAU/g de sólido seco, por exemplo,

0,2 GAU/g de sólido seco.

Outras enzimas adequadas que podem ser usadas com TrAA ou suas variantes incluem uma enzima de desramificação, tal como uma isoamilase (EC 3.2.1.68). Enzimas de desramificação podem ser adicionadas em quantidades eficazes bem-conhecidas ao versado na técnica. Uma pululanase (EC 3.2.1.41), por exemplo, Promozyme®, é também adequada. PuluIanase é tipicamente adicionada a 100 U/kg de sólido seco. Enzimas adicionais adequadas incluem proteases, tais como proteases fúngicas e bacterianas. Proteases fúngicas incluem aquelas obtidas a partir de Aspergillus, tais 5 como A. niger, A. awamori, A. oryzae\ Mucor (por exemplo, M. miehei); e Rhizopus. Outras enzimas adequadas incluem, mas não são limitadas a, celulases, hemicelulases, Iipases e cutinases.

Ao passo que a liquefação é geralmente dirigida como um processo contínuo, a sacarificação muitas vezes é conduzida como um processo em batelada. Sacarificação tipicamente é a mais eficaz em temperaturas de aproximadamente 60°C e a um pH de aproximadamente 4,0 a 4,5, por exemplo, pH 4,3, exigindo esfriamento e ajuste do pH do amido liqüefeito. A sacarificação pode ser realizada, por exemplo, a uma temperatura entre aproximadamente 40°C, aproximadamente 50°C, ou aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C. Sacarificação é normalmente conduzida em tanques agitados, que podem levar várias horas para encher-se ou esvaziar-se. Enzimas tipicamente são adicionadas em uma proporção fixa a sólidos secos quando os tanques são enchidos ou adicionados como uma dose única no começo da etapa de enchimento. Uma reação de sacarificação para fazer um xarope de glicose tipicamente é realizada em aproximadamente 24 a 72 horas, ou 24 a 28 horas, ou particularmente 24 ou menos horas, por exemplo, 20 a 21 horas. Quando um DE máximo foi alcançado, a reação é parada pelo aquecimento a 85°C por 5 minutos, por exemplo. Incubação adicional resultará em um DE mais baixo, eventualmente a aproximadamente 90 DE, já que a glicose acumulada repolimeriza à isomaltose com a aproximação do equilíbrio termodinâmico. O rendimento final de glicose, como uma porcentagem do total de sólidos secos solubilizados, pode ser pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98%. Em uma modalidade, a glicose é produzida em um processo contínuo, e substancialmente toda glicose é usada para produzir um produto de fermentação, tal como etanol.

4.3.2. Xaropes de maltose

Em outro aspecto, TrAA ou uma variante da mesma é usada em um processo para produzir um xarope de alta maltose. Entre as vantagens oferecidas pela TrAA e suas variantes está a capacidade de usar a TrAA e suas variantes em pHs relativamente baixos. Uma dependência de pH da TrAA representativa para produção da maltose (DP2) é representada na Fi5 gura 2. Como a sacarificação tipicamente se realiza sob condições acidíferas em temperaturas elevadas, por exemplo, 60°C, pH 4,3, a alta atividade da TrAA ou suas variantes sob estas condições vantajosamente permite a TrAA ou suas variantes serem usadas sob condições que são ótimas para outras enzimas, por exemplo, glicoamilases, usadas na sacarificação.

Xaropes de alta maltose produzidos com uma TrAA ou suas va

riantes têm propriedades vantajosas. A concentração de maltose alcançada usando TrAA ou suas variantes é comparável ou mais alta do que aquela alcançada com enzimas maltogênicas convencionais, tais como BBA ou a aamilase fúngica Clarase® L. Ver as TABELAS 3 e 4 e a Figura 2. Em uma 15 modalidade, a concentração de maltose atinge uma porcentagem de sólidos secos de aproximadamente 50% a aproximadamente 62%. Em outra modalidade, a concentração de maltose atinge aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, ou aproximadamente 61% a aproximadamente 62%. Além disso, o xarope de alta maltose obtido usando TrAA pode conter glicose em 20 uma concentração de aproximadamente 8 a 9%, ao passo que um xarope de alta maltose convencional produzido sob condições comparáveis, por exemplo, usando Clarase® L, tipicamente tem uma concentração de glicose de aproximadamente 4 a 5%. UerTABELA 3. O rendimento relativamente alto de glicose vantajosamente permite ao xarope de alta maltose feito usando 25 TrAA ou suas variantes ser mais doce do que xaropes de alta maltose produzidos usando enzimas convencionais.

TrAA ou uma variante da mesma podem catalisar a produção de um xarope de alta maltose por si mesmas na presença de pelo menos uma outra enzima. Uma enzima particularmente adequada para uso com TrAA ou 30 uma variante da mesma é pululanase. A adição de uma pululanase aumenta significativamente o rendimento da maltose, como mostrado na TABELA 5 e na Figura 3. A quantidade de pululanase adicionada pode ser aproximadamente 0,1 kg/mt de sólido seco, aproximadamente 0,25 kg/mt de sólido seco, ou aproximadamente 0,5 kg/mt de sólido seco. Em uma modalidade, a quantidade de pululanase adicionada para fornecer um aumento máximo na maltose produzida na reação. Os dados na TABELA 5 indicam que o efeito 5 da pululanase na formação de maltose é ainda maior quando a concentração da pululanase é aproximadamente 0,25 kg/mt de sólido seco sob as condições particulares usadas para produzir maltose observadas no texto que acompanha a TABELA 5 nos exemplos abaixo.

Outras enzimas adequadas para uso com TrAA ou variantes das 10 mesmas incluem β-amilases bacterianas, por exemplo, BBA, outras aamilases fúngicas, por exemplo, Clarase® L. ou glicoamilase. Enzimas adicionais adequadas incluem proteases, tais como proteases fúngicas e bacterianas. Proteases fúngicas incluem aquelas obtidas a partir de Aspergillus, tais como A. niger, A. awamori, A. oryzae\ Mucor, por exemplo, M. mieher, e 15 Rhizopus. Outras enzimas adequadas incluem, mas não são limitadas a, celulases, hemicelulases, lipases, isoamilases e cutinases.

β-amilases (EC 3.2.1.2) são amilases maltogênicas de exoatuação, que catalisam a hidrólise de ligações 1,4-a-glicosídicas em amilopectina e polímeros de glicose relacionados, por meio disso, liberando mal20 tose. β-amilases foram isoladas de várias plantas e micro-organismos. Ver Fogarty et ai, em PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, PP. 112-115 (1979). Estas β-amilases têm temperaturas ótimas na faixa de 40°C a 65°C e pH ótimo na faixa de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0. β-amilases contempladas incluem, mas não são limitadas a, β25 amilases de cevada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Genencor International, Inc.); e Novozym™ WBA (Novozymes A/S).

5. Produção e fermentação de HFCS

Em uma modalidade, o hidrolisado de amido solúvel produzido pelo tratamento com TrAA1 variantes da mesma, ou misturas de enzimas compreendendo TrAA ou suas variantes, é convertido em xarope de alta frutose baseado em amido (HFSS), tal como xarope de milho de alta frutose(HFCS). Esta conversão pode ser alcançada usando uma glicose isomerase, particularmente uma glicose isomerase imobilizada em um suporte sólido. O pH é aumentado para aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, por exemplo, pH 7,5, e Ca2+ é removido por troca iônica. Isomerases ade5 quadas incluem Sweetzyme®, IT(Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, e Gzyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquido, e GenSweet® IGI. Após isomerização, a mistura tipicamente contém aproximadamente 40 a 45% de frutose, por exemplo, 42% de frutose.

Em outra modalidade, o hidrolisado de amido solúvel, particuIarmente um xarope rico em glicose, é fermentado pelo contato do hidrolisado com um organismo fermentador tipicamente a uma temperatura por volta de 32°C, tal como de 30°C a 35°C. Os produtos de fermentação incluem etanol, ácido cítrico, glutamato monossódico, ácido glucônico, gliconato de sódio, gliconato de cálcio, gliconato de potássio, glicono delta-lactona, e sódio eritorbato. Os processos de sacarificação e de fermentação podem ser realizados como um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Fermentação opcionalmente pode compreender a purificação subsequente e recuperação de etanol. Durante a fermentação, o conteúdo de etanol do caldo ou "cerveja" pode alcançar pelo menos aproximadamente 8%, pelo menos aproximadamente 12%, ou aproximadamente 16% de etanol. O caldo pode ser destilado para produzir soluções de etanol enriquecidas, por exemplo, 96% puras. Além disso, CO2 gerado pela fermentação pode ser coletado com um depurador de CO2, comprimido e vendido para outros usos, por exemplo, produção de bebida gaseificada ou gelo seco. Os resíduos sólidos do processo de fermentação podem ser usados como produtos ricos em proteína, por exemplo, ração de gado.

Micro-organismos etanologênicos incluem levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae e bactérias, por exemplo, Zymomonas mobilis, expressando álcool desidrogenase e piruvato decarboxilase. Em algumas 30 modalidades, o micro-organismo etanologênico expressa xilose redutase e xilitol desidrogenase, enzimas que convertem xilose em xilulose. Fontes comerciais de levedura incluem RED STAR (Red Star); FERMIOL® (DSM Specialties) e SUPERSTART® (Alltech).

Em uma modalidade, células fúngicas expressando uma glicoamilase heteróloga e/ou TrAA ou suas variantes são cultivadas sob condições de fermentação em batelada ou contínuas. Uma fermentação em batelada 5 clássica é um sistema fechado, onde a composição do meio é estabelecida no início da fermentação. Isto é, permite-se que a fermentação ocorra sem a adição de qualquer componente ao sistema. Dentro de culturas em batelada, células progridem através de uma fase Iag estática a uma fase Iog de alto crescimento e finalmente a uma fase estacionária onde a taxa de crescimen10 to é diminuída ou parada. Geralmente, as células na fase Iog são responsáveis pelo volume da produção heteróloga de glicoamilase e/ou TrAA ou suas variantes.

Uma variação neste processo é uma sistema de "fermentação de alimentação em batelada", onde o substrato é adicionado em incremen15 tos com os progressos da fermentação. Os sistemas de alimentação em batelada são úteis quando a repressão de catabólito pode inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter limitadas quantidades de substrato no meio. A concentração real de substrato em sistemas de alimentação em batelada é estimada pelas modificações de fatores mensuráveis, tais como pH, 20 oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tais como CO2. Fermentações em batelada e de alimentação em batelada são comuns e bem-conhecidas na técnica.

Fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma 25 quantidade igual do meio condicionado é removida simultaneamente para o processamento. Fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma alta densidade constante, onde as células estão principalmente na fase de crescimento log. A fermentação contínua leva em conta a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração do 30 produto. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, é mantido em uma taxa fixa e permite-se que todos outros parâmetros se moderem. Como o crescimento é mantido em um estado de equilíbrio, a perda celular devida ao meio que é retirado deve ser equilibrada contra a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de otimização de processos de fermentação contínua e maximização da taxa da formação de produto são bem-conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

6. Composições e Métodos para Cozimento e Preparação de Alimento

Para o uso comercial e doméstico de farinha para cozimento e produção de alimento, é importante manter um nível apropriado de atividade de α-amilase na farinha. Um nível de atividade que seja muito alto pode resultar em um produto que é pegajoso e/ou pastoso e por isso não comercializável. Farinha com atividade de α-amilase insuficiente pode não conter açúcar suficiente para função apropriada da levedura, resultando em pão seco, esfarelado ou produtos endurecidos pelo calor. Consequentemente, uma TrAA ou variante da mesma, por si mesmas ou em combinação com outra aamilase(s), podem ser adicionadas à farinha para aumentar o nível de atividade de α-amilase endógena na farinha. A TrAA ou variante da mesma nesta modalidade podem ter uma temperatura ótima na presença de amido nas faixas de 30 a 90°C, 40 a 80°C, 40 a 50°C, 45 a 65°C, ou 50 a 60°C, por exemplo. O pH ótimo em uma solução de 1% de amido solúvel pode estar entre o pH 4,5 a 6, por exemplo.

Grãos, tais como cevada, aveia, trigo, bem como componentes vegetais, tais como milho, lúpulo e arroz, também são usados para fermentação, tanto na indústria como para fermentação doméstica. Os componentes usados na fermentação podem ser não maltados ou podem ser malta25 dos, isto é, parcialmente germinados, resultando em um aumento nos níveis de enzimas, incluindo a α-amilase. Para fermentação bem sucedida, níveis adequados da atividade de enzima α-amilase são necessários para assegurar os níveis apropriados de açúcares para fermentação. Uma TrAA ou variante da mesma, por si mesmas ou em combinação com outra a-amilase(s), 30 consequentemente podem ser adicionadas aos componentes usados para fermentação.

Como usado neste pedido, o termo "farinha" significa grãos de cereal moídos ou triturados. O termo "farinha" também pode significar produtos de Sagu ou tubérculo que foram triturados ou amassados. Em algumas modalidades, a farinha também pode conter componentes além de cereal ou matéria vegetal moída ou amassada. Um exemplo de um componente adi5 cional, embora não destinado a ser limitante, é um agente fermentador. Grãos de cereal incluem trigo, aveia, centeio e cevada. Produtos de tubérculo incluem farinha de tapioca, farinha de mandioca e pó para pudim. O termo "farinha" também inclui a farinha de milho triturado, farinha de milho, farinha de arroz, farinha de trigo integral, farinha com fermento, farinha de tapioca, 10 farinha de mandioca, arroz triturado, farinha enriquecida e pó para pudim.

Como usado neste pedido, o termo "estoque" significa grãos e componentes vegetais que são esmagados ou triturados. Por exemplo, a cevada usada na produção de cerveja é um grão que foi grosseiramente triturado ou esmagado para produzir uma consistência apropriada para produ15 ção de uma massa para fermentação. Como usado neste pedido, o termo "estoque" inclui qualquer um dos tipos acima mencionados de plantas e grãos nas formas esmagadas ou grosseiramente trituradas. Os métodos descritos neste pedido podem ser usados para determinar níveis de atividade de α-amilase em ambos, farinhas e estoque.

Uma TrAA ou variante da mesma pode ser ainda adicionada so

zinha ou em uma combinação com outras amilases para prevenir ou retardar o envelhecimento, isto é, a solidificação do miolo de produtos cozidos no forno. A quantidade da amilase antienvelhecimento estará tipicamente na faixa de 0,01 a 10 mg de proteína enzima por kg de farinha, por exemplo, 0,5 25 mg/kg de sólido seco. Amilases antienvelhecimento adicionais que podem ser usadas em combinação com uma TrAA ou variante da mesma incluem uma endoamilase, por exemplo, uma endoamilase bacteriana de Bacillus. Amilase adicional pode ser outra α-amilase maltogênica (EC 3.2.1.133), por exemplo, de Bacillus. Novamyl® é uma α-amilase maltogênica exemplar da 30 cepa de B. stearothermophilus NCIB 11837 e é descrito em Christophersen et al., Starch 50:39-45 (1997). Outros exemplos de endoamilases antienvelhecimento incluem α-amilases bacterianas derivadas de Bacillus, tais como B. Iicheniformis ou B. amyloliquefaciens. A amilase antienvelhecimento pode ser uma exoamilase, tal como β-amilase, por exemplo, de fontes vegetais, tais como soja, ou de fontes microbianas, tais como Bacillus.

A composição de cozimento compreendendo uma TrAA ou variante da mesma pode ainda compreender uma fosfolipase. A fosfolipase pode ter atividade Ai ou A2 para remover ácido graxo dos fosfolipídeos, formando um lisofosfolipídeo. Pode ou não ter atividade lipase, isto é, atividade sobre substratos triglicerídicos. A fosfolipase tipicamente tem uma temperatura ótima na faixa de 30 a 90°C, por exemplo, 30 a 70°C. As fosfolipases adicionadas podem ser de origem animal, por exemplo, do pâncreas, por exemplo, pâncreas bovino ou porcino, veneno de cobra ou veneno de abelha. Alternativamente, a fosfolipase pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungos filamentosos, levedura ou bactérias, tais como gêneros ou espécies Aspergillus, A. niger, Dictyostelium, D. d isco ide um] Mucor, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, N. crassa; Rhizomucor; R. pusillus', Rhizopus, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer, Sclerotinia, S. Iibertiana; Trichophyton, T. rubrum; Whetzelinia, W. sclerotiorum] Bacillus, B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, C. freundii; Enterobacter, E. aerogenes, E. c/oacae; Edwardsiella, E. tarda; Etwinia, E. herbicola; Escherichia, E. coli; Klebsiella, K. pneumoniae; Proteus, P. vulgaris\ Providencia, P. stuartii; Salmonella, S. typhimurium; Serratia, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella,

S. flexneri; Streptomyces, S. violeceoruber; Yersinia, Y. enterocolitica; Fusarium, F. oxysporum, cepa DSM 2672), por exemplo.

A fosfolipase é adicionada em uma quantidade que melhora a 25 maciez do pão durante o período inicial após cozimento, particularmente nas primeiras 24 horas. A quantidade de fosfolipase estará tipicamente na faixa de 0,01 a 10 mg de proteína enzima por kg de farinha, por exemplo, 0,1 a 5 mg/kg. Isto é, a atividade de fosfolipase geralmente estará na faixa de 20 a 1000 Unidades de Lipase (LU)/kg de farinha, onde uma Unidade de Lipase é 30 definida como a quantidade da enzima necessária para liberar 1 pmol de ácido butírico por minuto a 30°C, pH 7,0, com goma arábica como emulsificador e tributirina como substrato. Composições da massa de farinha geralmente compreendem farelo de trigo ou farinha de trigo e/ou outros tipos de farelo, farinha ou amido, tais como farinha de milho, amido de milho, farelo de centeio, farinha de centeio, farinha de aveia, farelo de aveia, farinha de soja, farelo de sorgo, 5 farinha de sorgo, farelo de batatas, farinha de batatas ou amido de batatas. A massa de farinha pode ser fresca, congelada ou semicozida. A massa de farinha pode ser uma massa de farinha fermentada ou uma massa de farinha a ser submetida à fermentação. A massa de farinha pode ser fermentada de vários modos, tais como pela adição de agentes químicos fermentado10 res, por exemplo, bicarbonato de sódio ou adição de um fermento, isto é, fermentação da massa de farinha. A massa de farinha também pode ser fermentada pela adição de uma cultura de levedura adequada, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro), por exemplo, uma cepa comercialmente disponível de S. cerevisiae.

A massa de farinha também pode compreender outros ingredi

entes de massa de farinha convencionais, por exemplo, proteínas, tais como leite em pó, glúten e soja; ovos (por exemplo, ovos inteiros, gemas de ovos ou claras de ovos); um oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbonamida (ADA) ou perssulfato de amô20 nio; um aminoácido, tal como L-cisteína; um açúcar; ou um sal, tal como cloreto de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio. A massa de farinha pode ainda compreender gordura, por exemplo, triglicerídeo, tal como gordura granulada ou vegetal. A massa de farinha pode ainda compreender um emulsificador tal como mono- ou diglicerídeos, ésteres de ácido 25 diacetil tartárico de mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, ésteres de ácido lático de monoglicerídeos, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, estearatos de polioxietileno ou lisolecitina. Em particular, a massa de farinha pode ser feita sem adição de emulsificadores.

Opcionalmente, uma enzima adicional pode ser usada em con

junto com a amilase antienvelhecimento e a fosfolipase. A enzima adicional pode ser uma segunda amilase, tal como uma amiloglicosidase, uma aamilase, uma ciclodextrina glicanotransferase, ou a enzima adicional pode ser uma peptidase, em particular, uma exopeptidase, uma transglutaminase, uma lipase, uma celulase, uma hemicelulase, em particular, um pentosanase, tal como xilanase, uma protease, uma dissulfeto proteína isomerase, por 5 exemplo, uma dissulfeto proteína isomerase como descrita em WO 95/00636, por exemplo, uma glicosiltransferase, uma enzima de ramificação (enzima de ramificação 1,4-a-glicana), uma 4-a-glicanotransferase (dextrina glicosiltransferase) ou uma oxidorredutase, por exemplo, uma peroxidase, uma lacase, uma glicose oxidase, um piranose oxidase, um lipo-oxigenase, 10 uma L-aminoácido oxidase ou uma carboidrato oxidase. A enzima(s) adicional pode ser de qualquer origem, incluindo mamífera e vegetal, e particularmente de origem microbiana (bacteriana, de levedura ou fúngica) e pode ser obtida por técnicas convencionalmente usadas na técnica.

A xilanase é tipicamente de origem microbiana, por exemplo, derivada de uma bactéria ou fungo, tal como uma cepa de Aspergillus, em particular de A. aculeatus, A. niger (ef. WO 91/19782), A. awamorí (por exemplo, WO 91/18977), ou A. tubingensis (por exemplo, WO 92/01793); de uma cepa de Trichoderma, por exemplo, T. reesei, ou de uma cepa de Humicola, por exemplo, H. insolens (por exemplo, WO 92/17573). Pentopan® e Novozym 384® são preparações de xilanase comercialmente disponíveis produzidas a partir de Trichoderma reesei. A amiloglicosidase pode ser uma amiloglicosidase de A. niger (tal como AMG®). Outros produtos de amilase úteis incluem Grindamyl® A 1000 ou A 5000 (disponível em Grindsted Products, Dinamarca) e Amylase® H ou Amylase® P (disponíveis em GistBrocades, Holanda). A glicose oxidase pode ser uma glicose oxidase fúngica, em particular, uma glicose oxidase de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®). Uma protease exemplar é Neutrase®. Uma lipase exemplar pode ser derivada de cepas de Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus, Rhizopus, ou Pseudomonas, em particular, de Thermomyees Ianuginosus (Humicola lanuginosa), Rhizomucor miehei, Candida antaretiea, Aspergillus niger, Rhizopus delemar ou Rhizopus arrhizus, ou Pseudomonas eepacia. Em modalidades específicas, a lipase pode ser Lipase A ou Lipase B derivadas de Candida antarctica como descrito em WO 88/02775, por exemplo, ou a lipase pode ser derivada de Rhizomucor miehei como descrito em EP 238.023, por exemplo, ou Humicola lanuginosa, descrita em EP 305.216, por exemplo, ou Pseudomonas cepacia como descrito em EP 214.761 e WO 89/01032, por exemplo.

O processo pode ser usado para qualquer espécie de produto cozido preparado a partir de massa de farinha, de um caráter macio ou crocante, de um tipo branco, leve ou escuro. Exemplos são pão, particularmente branco, pão integral ou de centeio, tipicamente na forma de pães de forma 10 ou pãezinhos, tais como, mas não limitados a, pão tipo baguete francesa, pão árabe, tortilhas, bolos, panquecas, biscoitos, bolachas, torta coberta, pão crocante, pão cozido no vapor, pizza e similares.

Em outra modalidade, uma TrAA ou variante da mesma pode ser usada em uma mistura para bolo, compreendendo farinha em conjunto com 15 uma amilase antienvelhecimento, uma fosfolipase e um fosfolipídeo. A mistura para bolo pode conter outros aditivos de melhoramento da massa de farinha e/ou de melhoramento do pão, por exemplo, qualquer um dos aditivos, incluindo enzimas, mencionadas acima. Em um aspecto, a TrAA ou variante da mesma é um componente de uma preparação enzimática compreenden20 do uma amilase antienvelhecimento e uma fosfolipase, para uso como um aditivo de cozimento.

A preparação enzimática está opcionalmente na forma de pó granular ou aglomerado. A preparação pode ter uma distribuição de tamanho de partícula estreita com mais de 95% (por peso) das partículas na faixa de 25 25 a 500 μηι. Pós granulares e aglomerados podem ser preparados por métodos convencionais, por exemplo, pela pulverização de TrAA ou variante da mesma em um veículo em um granulador de leito fluido. O veículo pode consistir de núcleos particulados que têm um tamanho de partícula adequado. O veículo pode ser solúvel ou insolúvel, por exemplo, um sal (tal como 30 NaCI ou sulfato de sódio), um açúcar (tal como sacarose ou lactose), um álcool de açúcar (tal como sorbitol), amido, arroz, farinha grossa de milho ou soja. Outro aspecto contempla o envelopamento de partículas compreendendo uma TrAA ou variante da mesma, isto é, partículas de aamilase. Para preparar as partículas de α-amilase envelopadas, a enzima é contatada com um lipídio de classificação alimentícia em quantidade sufici5 ente para suspender todas as partículas de α-amilase. Lipídios de classificação alimentícia, como usados neste pedido, podem ser qualquer composto orgânico natural que seja insolúvel em água mas seja solúvel em solventes orgânicos não-polares, tais como hidrocarboneto ou dietil éter. Lipídios de classificação alimentícia adequados incluem, mas não são limitados a, trigli10 cerídeos na forma de gorduras ou óleos que são saturados ou insaturados. Exemplos de ácidos graxos e combinações dos mesmos que compõem os triglicerídeos saturados incluem, mas não são limitados a, butírico (derivado da gordura do leite), palmítico (derivado de gordura animal e vegetal) e/ou esteárico (derivado de gordura animal e vegetal). Exemplos de ácidos gra15 xos e combinações dos mesmos que compõem os triglicerídeos insaturados incluem, mas não são limitados a, palmitoleico (derivado de gordura animal e vegetal), oleico (derivado de gordura animal e vegetal), Iinoleico (derivado de óleos vegetais) e/ou linolênico (derivado do óleo de semente de linho). Outros lipídios de classificação alimentícia adequados incluem, mas não são 20 limitados a, monoglicerídeos e diglicerídeos derivados dos triglicerídeos discutidos acima, fosfolipídeos e glicolipídeos.

O lipídio de classificação alimentícia, particularmente na forma líquida, é contatado com uma forma em pó das partículas de α-amilase de tal maneira que o material lipídico cobre pelo menos uma porção da superfí25 cie de pelo menos uma maioria, por exemplo, 100% das partículas de aamilase. Dessa maneira, cada partícula de α-amilase é individualmente envelopada em um lipídio. Por exemplo, todas ou substancialmente todas as partículas de α-amilase são fornecidas de um filme de envelopamento fino, contínuo de lipídio. Isto pode ser realizado pela mistura inicial de uma quan30 tidade de lipídio em um recipiente, e então misturando as partículas de aamilase para que o lipídio completamente umidifique a superfície de cada partícula de α-amilase. Após um período curto da agitação, as partículas de α-amilase envelopadas, transportando uma quantidade substancial dos lipídios nas suas superfícies, são recuperadas. A espessura do revestimento como aplicado às partículas de α-amilase pode ser controlada pela seleção do tipo de lipídio usado e pela repetição da operação a fim de construir um filme mais espesso, quando desejado.

O armazenamento, manejo e incorporação do veículo de entrega carregado podem ser realizados por meio de uma mistura empacotada. A mistura empacotada pode compreender a α-amilase envelopada. Entretando, a mistura empacotada pode conter ainda ingredientes adicionais quando 10 requeridos pelo fabricante ou padeiro. Após a α-amilase envelopada ter sido incorporada na massa de farinha, o padeiro prossegue através do processo de produção normal para aquele produto.

As vantagens de envelopar as partículas de α-amilase são duplas. Em primeiro lugar, o lipídio de classificação alimentícia protege a enzi15 ma da desnaturação térmica durante o processo de cozimento daquelas enzimas que são lábeis ao calor. Consequentemente, enquanto a α-amilase é estabilizada e protegida durante os estágios de prova e cozimento, é liberada a partir do revestimento protetor no produto final assado, onde hidrolisa as ligações glicosídicas em poliglicanos. O veículo de entrega carregado 20 também fornece uma liberação sustentada da enzima ativa no assado. Isto é, após o processo de cozimento, a α-amilase ativa é continuamente liberada do revestimento protetor em uma taxa que neutraliza, e por isso reduz a taxa de mecanismos de envelhecimento.

Em geral, a quantidade do lipídio aplicado às partículas de a25 amilase pode variar de alguma porcentagem do peso total de α-amilase a muitas vezes aquele peso, dependendo da natureza do lipídio, maneira na qual é aplicado às partículas de α-amilase, composição da mistura de massa de farinha a ser tratada e a severidade da operação de mistura da massa de farinha envolvida.

O veículo de entrega carregado, isto é, a enzima envelopada no

lipídio, é adicionado aos ingredientes usados para preparar um assado em uma quantidade eficaz para estender o prazo de validade do assado. O padeiro computa a quantidade da α-amilase envelopada, preparada como discutido acima, que será requerida para alcançar o efeito antienvelhecimento desejado. A quantidade da α-amilase envelopada requerida é calculada com base na concentração da enzima envelopada e na proporção da a-amilase 5 na farinha especificada. Uma ampla faixa de concentrações foi considerada ser eficaz, embora, como foi discutido, melhorias observáveis no antienvelhecimento não correspondem linearmente com a concentração de aamilase, mas acima de certos níveis mínimos, grandes aumentos na concentração de α-amilase produzem pequena melhoria adicional. A concentração 10 de α-amilase atualmente usada em uma determinada produção de padaria pode ser muito mais alta do que o mínimo necessário a fim de fornecer ao padeiro com alguma garantia contra erros na medição inadvertida pelo padeiro. O menor limite de concentração enzimática é determinado pelo mínimo efeito antienvelhecimento que o padeiro deseja alcançar.

Um método de preparação de um assado pode compreender: a)

preparação de partículas de α-amilase cobertas por lipídio, onde substancialmente todas as partículas de α-amilase são cobertas; b) mistura de uma massa de farinha contendo farinha; c) adição da α-amilase coberta por lipídio à massa de farinha antes da mistura é completa e terminação da mistura 20 antes que o revestimento lipídico seja removido da α-amilase; d) prova da massa de farinha; e e) cozimento da massa de farinha para fornecer o assado, onde a α-amilase é inativa durante os estágios de mistura, prova e cozimento e está ativa no assado.

A α-amilase envelopada pode ser adicionada à massa de farinha 25 durante o ciclo de mistura, por exemplo, próximo ao final do ciclo de mistura. A α-amilase envelopada é adicionada em um ponto no estágio de mistura que permite a distribuição suficiente da α-amilase envelopada em todas as partes da massa de farinha; entretanto, a etapa de mistura é terminada antes que o revestimento protetor seja retirado da partícula(s) de a-amilase. 30 Dependendo do tipo e volume da massa de farinha, e ação e velocidade do misturador, em qualquer tempo de um a seis minutos ou mais pode ser requerido para a mistura à α-amilase envelopada na massa de farinha, mas dois a quatro minutos é a média. Dessa forma, diversas variáveis podem determinar o procedimento preciso. Em primeiro lugar, a quantidade de aamilase envelopada deve ter um volume total suficiente para permitir à aamilase envelopada ser espalhada em todas as partes da mistura de massa 5 de farinha. Se a preparação de α-amilase envelopada for altamente concentrada, óleo adicional pode precisar ser adicionado à mistura para bolo antes que a α-amilase envelopada seja adicionada à massa de farinha. Receitas e processos de produção podem requerer modificações específicas; entretanto, bons resultados geralmente podem ser alcançados quando 25% do óleo 10 especificado em uma fórmula de massa de farinha de pão são mantidos fora da massa de farinha e é usado como um veículo para uma α-amilase envelopada concentrada quando adicionado próximo ao final do ciclo de mistura. No pão ou outros assados, particularmente aqueles que têm um baixo conteúdo de gordura, por exemplo, pães de estilo francês, uma mistura de a15 amilase envelopada de aproximadamente 1% do peso de farinha seca é suficiente para misturar a α-amilase envelopada propriamente com a massa de farinha. A faixa de porcentagens adequadas é larga e depende da fórmula, produto terminado e exigências de metodologia de produção do padeiro individual. Em segundo lugar, a suspensão de α-amilase envelopada deve ser 20 adicionada à mistura com o tempo suficiente para mistura completa na massa de farinha, mas não um tempo que a ação mecânica excessiva remova o revestimento lipídico protetor das partículas de α-amilase envelopadas.

7. Composições e Uso na Desenqomaqem Têxtil

Também contemplados são composições e métodos de trata25 mento de tecidos (por exemplo, para desengomar um tecido) usando uma TrAA ou uma variante da mesma. Métodos de tratamento de tecido são bem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente Americana N0 6.077.316). Por exemplo, em um aspecto, a sensação e aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contatar o tecido 30 com uma TrAA ou uma variante da mesma em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão.

Em um aspecto, uma TrAA ou uma variante da mesma é aplicada durante ou após a tecelagem de um tecido, ou durante a etapa de desengomagem, ou uma ou mais etapas de processamento de tecido adicionais. Durante a tecelagem de tecidos, os fios são expostos à tensão mecânica considerável. Antes da tecelagem em teares mecânicos, os fios de urdidura 5 muitas vezes são cobertos com engomagem de amido ou derivados de amido para aumentar sua força elástica e prevenir quebra. Uma TrAA ou uma variante da mesma pode ser aplicada durante ou após a tecelagem para remover estas engomagens de amido ou derivadas de amido. Após tecelagem, uma TrAA ou uma variante da mesma pode ser usada para remover o 10 revestimento de goma antes ainda do processamento do tecido para assegurar um resultado homogêneo e à prova de lavagem.

Uma TrAA ou uma variante da mesma pode ser usada sozinha ou com outros reagentes químicos de desengomagem e/ou enzimas de desengomagem para desengomar tecidos, incluindo tecidos contendo algodão, como aditivos detergentes, por exemplo, em composições aquosas. Uma TrAA ou uma variante da mesma também pode ser usada em composições e métodos para produção de uma aparência desgastada no tecido de algodão tingido com índigo e artigos de vestuário. Para a fabricação de roupas, o tecido pode ser cortado e costurado em roupas ou artigos de vestuário, que são posteriormente terminados. Em particular, para a fabricação da jeans de tecido de algodão, diferentes métodos enzimáticos de acabamento foram desenvolvidos. O acabamento do artigo de vestuário de tecido de algodão normalmente é iniciado com uma etapa de desengomagem enzimática, durante a qual os artigos de vestuário são submetidos à ação de enzimas amilolíticas para fornecer maciez ao tecido e fazer o algodão mais acessível às etapas de acabamento enzimático subsequentes. Uma TrAA ou uma variante da mesma pode ser usada em métodos de acabamento de artigos de vestuário de tecido de algodão (por exemplo, um "processo de biodesgaste"), desengomagem enzimática e fornecimento de maciez a tecidos e/ou processo de acabamento.

Será evidente àqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas nas composições e métodos de uso dos mesmos sem afastar-se do espírito ou escopo de uso desejado. Dessa maneira, estão as modificações e variações fornecidas por eles no escopo das reivindicações acrescentadas e seus equivalentes.

Exemplos 5 Exemplo 1

1.1 Clonagem do gene TrAA

DNA cromossõmico de T. reesei QM6a foi isolado de uma massa micelial de uma cultura líquida no Caldo de Dextrose de Batata (Difco™ Cat. N0 254920) usando o Sistema BI0101 Fast Prep® de acordo com o método descrito pelo fornecedor (Qbiogene, Inc., Irvine, CA). O DNA foi purificado usando uma coluna Quick Spin (Qiagen, Inc., Valencia, CA; Cat. N0 28106). O gene TrAA foi isolado usando iniciadores com seqüências específicas para TrAA1 um iniciador de sentido direto NSP331 (SEQ ID NO:6: ATGAAGCTCCGGTACGCTCTCC) e um iniciador de sentido reverso NSP332 (SEQ ID NO:7: TCACGAAGACAGCAAGACAATGGGC) desenhados de acordo com a seqüência nucleotídica predita no banco de dados de genoma de Trichoderma reesei de United States Departament of Energy Joint Genome lnstitute. Os iniciadores foram flanqueados na extremidade 5' pelas seqüências Gateway® attB (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). DNA cromossômico de T. reesei QM6a foi usado como molde.

A mistura de PCR continha os seguintes componentes: 4 μΙ_ de iniciador de sentido direto (10 μΜ); 4 μΙ_ de iniciador de sentido reverso (10 μΜ); 1 μΙ_ de molde de DNA (500 ng/pL); 2 μ!_ de mistura de dNTP (10 mM); 10 μί de tampão Cx 10x; e 0,5 μΙ_ de DNA polimerase PfuTurbo® Cx Hots25 tart (Stratagene, La Jolla, CA; Cat. N0 600410). Água deionizada foi adicionada até um volume total de 100 μί. O protocolo de PCR foi como se segue: Desnaturação inicial por 30 s a 98°C, desnaturação, anelamento e extensão em 30 ciclos de 10 s a 98°C; 30 s a 68°C; 45 s a 72°C, respectivamente, e uma etapa de extensão final de 10 min a 72°C.

Os fragmentos de PCR foram analisados por eletroforese em gel

de agarose a 1%. Os fragmentos do tamanho esperado foram isolados usando o kit de Purificação de Extração em Gel (Qiagen Cat. N0 28706). Os fragmentos PCR foram clonados no vetor pDC)NR201 Gateway® Entry e transformados em células de E. coli DH5a de Máxima Eficiência (Invitrogen Cat. N0 18258012). A seqüência nucleotídica do DNA inserido foi determinada, a partir da qual a seqüência de DNA genômico do gene TrAA foi deduzida (SEQ ID N0.1).

1.2 Transformação de T. reesei e fermentação/expressão de TrAA

DNA do vetor contendo o gene TrAA foi recombinado em T. reesei em um vetor de expressão pTrex3g, que é descrito em detalhes em WO 2006/060062. O vetor de expressão resultante foi transformado em uma ce10 pa hospedeira de T. reesei derivada de RL-P37 tendo várias deleções gênicas (Ucbhl, Ucbh2, Degll, □ egi2, isto é, "quad-deletado"; ver WO 92/06184 e WO 05/001036) usando bombardeio de partícula pelo Sistema PDS1000/Helium (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA; Cat. N0 165-02257). O protocolo é delineado abaixo, e a referência é feita a exemplos 6 e 11 de 15 WO 05/001036.

Uma suspensão de esporos (aproximadamente 5x108 esporos/mL) de uma cepa quad-deletada de T. reesei foi preparada. Uma suspensão de esporos de 100 a 200 pL foi espalhada no centro de placas do Meio Acetamida de Meio Mínimo (MM). Meio de acetamida MM é 0,6 g/L de 20 acetamida; 1,68 g/L de CsCI; 20 g/L de glicose; 20 g/L de KH2PO4; 0,6 g/L de CaCI2.2H2O; solução de elementos-traço; 20 g/L ágar Noble; pH 5,5. Uma solução estoque de elementos-traço de 1000x continha 5,0 g/L de FeS04.7H20; 1,6 g/L de MnSO4-H2O; 1,4 g/L ZnS04.7H20; e 1,0 g/L de CoCI2.6H20. Permitiu-se que a suspensão de esporo secasse na superfície do 25 meio de acetamida MM.

A transformação seguiu a instrução do fabricante. Resumidamente, 60 mg de partículas de tungstênio M10 foram colocados em um tubo de microcentrífuga. 1 mL de etanol foi adicionado, e permitiu-se que a solução permanecesse por 15 s. As partículas foram centrifugadas a 15.000 rpm 30 por 15 s. O etanol foi removido, e as partículas foram lavadas três vezes com dH20 estéril antes que 250 pL de 50% (v/v) de glicerol estéril fossem adicionados. 25 μί de suspensão de partículas de tungstênio foram colocados em um tubo de microcentrífuga. As seguintes soluções então foram adicionadas com agitação contínua: 5 μΙ_ (100 a 200 ng/pL) de DNA plasmidial, μΙ_ de CaCI2 a 2,5 M, e 10 μί de espermidina a 0,1 M. As partículas foram centrifugadas por 3 s. O sobrenadante foi removido, e as partículas foram lavadas com 200 μΐ_ de etanol a 100% e centrifugadas por 3 s. O sobrenadante foi removido, 24 μΙ_ de etanol a 100% foram adicionados e misturados por pipetagem, então alíquotas de 8 pL de partículas foram removidas e colocadas no centro de discos macrocarreadores em um dessecador. Uma vez que tungstênio/solução de DNA foram secos, os discos macrocarreadores foram colocados em uma câmara de bombardeio junto com a placa de acetamida MM com esporos, e o processo de bombardeio foi realizado de acordo com instruções do fabricante. Após bombardeio dos esporos plaqueados com as partículas de tungstênio/partículas de DNA, as placas foram incubadas a 30°C. As colônias transformadas foram transferidas para placas frescas de meio de acetamida MM e incubadas a 30°C.

1.3 Demonstração de atividade de α-amilase de TrAA expressa

Após 5 dias de crescimento em placas de acetamida MM, transformantes mostrando morfologia estável foram inoculados em frascos de agitação de 250 ml_ contendo 30 ml_ de meio Proflo. O meio Proflo continha 20 30 g/L de a-lactose; 6,5 g/L de (NH4)2SO4; 2 g/L de KH2PO4; 0,3 g/L de MgSO4TH2O; 0,2 g/L de CaCI2; solução de elementos-traço; 2 mL/L de Tween 80 a 10%; 22,5 g/L de farinha de semente de algodão ProFIo (Traders Protein, Memphis, TN); e 0,72 g/L de CaCO3. Após dois dias de crescimento a 28°C com a agitação a 140 rpm, 10% da cultura Proflo foram transferidos 25 para um frasco de agitação de 250 mL contendo 30 mL de Meios de Lactose Definidos. A composição de Meios de Lactose Definidos é 5 g/L de (NH4)2SO4; 33 g/L de tampão PIPPS; 9 g/L de casaminoácidos; 4,5 g/L de KH2SO4; 1,0 g/L de MgSO4TH2O; 5 ml_/L de antiespumante Mazu DF60-P (Mazur Chemicals, IL); solução de elementos-traço; pH 5,5. Após esteriliza30 ção, 40 mL/L de solução de Iactose a 40% (p/v) foram adicionados ao meio. Os frascos de agitação de Meio de Lactose Definido foram incubados a 28°C, 140 rpm por 4 a 5 dias. Os micélios foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante foi analisado para a proteína total (BCA Protein Assay Kit, Pierce CA; Cat. N0 23225). Atividade de α-amilase foi analisada usando o reagente Ceralpha (p-nitrofenil maltoheptaosídeo bloqueado por benzilideno) como um substrato (Megazyme International Ireland, Ltd., Wicklow, Irlanda; Cat. N0 K-CERA).

Amostras do sobrenadante da cultura foram misturadas com um volume apropriado de tampão de carregamento de amostra 2X com agente redutor, e as proteínas foram resolvidas por eletroforese em gel de poliacriIamida em dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) usando NUPAGE® Novex 10 10% de Bis-Tris Gel com Tampão de Corrida MES SDS. Proteínas foram coradas com SímplyBlue™ SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA). O padrão de marcação proteica de uma amostra bruta do sobrenadante de cultura é mostrado na figura 5, coluna 1. É evidente que as células hospedeiras expressam quantidades relativamente altas de uma proteína com um peso mo15 Iecular aparente de aproximadamente 47 kDa, como determinado por comparação com marcadores de peso molecular na coluna M. Esta TrAA é estimada ser aproximadamente 89% pura.

1.4 Caracterização bioquímica do produto gênico TrAA

Transformantes expressando de TrAA foram cultivados em uma cultura de 3 L. A célula hospedeira secretou TrAA na cultura em uma concentração de aproximadamente 15 a 20 g/L. O filtrado da cultura foi concentrado usando uma unidade de ultrafiltração com um peso molecular limite de

10.000 Da (Pall Corp., Omega™ Membrane1 Cat. N0 OSOIOdO). A preparação enzimática bruta foi purificada usando um Sistema AKTA Explorer 100 25 FPLC (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Uma coluna HiPrep 16/10 FF Q-Sepharose (Amersham BioSciences, Cat. N0 17-5190-01) foi equilibrada com Tris a 25 mM, pH 6,0, e a proteína foi eluída da coluna com NaCI 100 mM, Tris a 25 mM, pH 6,0. Uma segunda etapa de cromatografia por afinidade foi realizada usando resina Cbind 200 (Novagen Cat. N0 701212-3) 30 e Tris a 50 mM, pH 7,0 contendo NaCI a 500 mM como tampão de eluição. Após esta purificação por afinidade, a TrAA pode ser concentrada novamente pela ultrafiltração como descrito acima. A TrAA purificada foi analisada por SDS-PAGE, e os resultados são mostrados na figura 5, coluna 2. A TrAA foi estimada ser aproximadamente 98% pura.

Os perfis de pH e temperatura da atividade de α-amilase do produto gênico foram determinados usando o reagente Ceralpha (Megazyme 5 International Ireland, Ltd., Wicklow, Irlanda; Cat. N0 K-CERA) como um substrato. Como mostrado na figura 6A, TrAA demonstra um pH ótimo de aproximadamente pH 5 a 6, e como mostrado na figura 6B, TrAA demonstra uma temperatura ótima de aproximadamente 42°C sob as condições testadas. Exemplo 2

TrAA é útil para aumentar o rendimento de glicose em uma rea

ção de sacarificação catalisada por uma glicoamilase em um pH baixo. TrAA (Lote N. GCI2004017/018-UF) foi purificada como descrito na seção 1.3 do Exemplo 1. Glicoamilase foi GA-L, Lote N0 901-04290-001 (Genencor International, Inc.), que tinha uma atividade de 385 GAU/g. O substrato consistiu 15 em um substrato de amido liqüefeito preparado como se segue: 745 g de amido de milho bruto foi diluído com água para criar uma pasta fluida de 32% p/p de sólido seco. A α-amilase bacteriana termoestável Spezyme® Ethyl (Genencor International, Inc.), Lote N0 107-04107-001, foi adicionada a uma concentração de 0,3 kg/mt de sólido seco, e a solução foi liqüefeita a 20 92°C por 25 min. Um teste de iodo foi realizado para medir a concentração restante de amido usando procedimentos bem-conhecidos na técnica.

O amido liqüefeito foi resfriado a 60°C e o pH foi ajustado a 4,2 com 20% v/v de ácido sulfúrico. TrAA e Optimax® 4060 foram adicionados nas concentrações indicadas abaixo, e a reação foi realizada por 30 horas a 25 60°C. No fim da reação, DPn produzidos pela reação foram determinados usando HPLC, após diluição da amostra em 1:40 com água de classificação para HPLC e filtração das amostras através de um filtro de 0,45 mícron. Para a análise de HPLC, 20 pL das amostras foram injetados em uma coluna Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid(H+) e resolvidas em uma corrida de 30 16 min em uma fase móvel de água de classificação para HPLC a 60°C. Os produtos (DPn) no eluente foram medidos por modificação no índice refrativo. A tabela 1 mostra DPn obtidos de uma reação representativa; a figura 1 representa a produção de DP1 como uma função de concentrações enzimáticas usadas neste experimento. Como pode ser visto, TrAA na presença de uma glicoamilase produz um xarope rico em glicose tendo uma 5 maior concentração de glicose do que uma glicoamilase por si só.

Tabela 1

GA TrAA Tempo (h) DP1 DP2 DP3 DP4+ 0,6 kg/mt de só¬ Nenhum 30 95,7 1,7 0,2 2,5 lido seco 0,6 kg/mt de só¬ 0,06 kg/mt 30 96,7 1,7 0,1 1,5 lido seco de sólido seco 0,6 kg/mt de só¬ 0,12 kg/mt 30 96,7 1,8 0,2 1,3 lido seco de sólido seco 0,6 kg/mt de só¬ 0,18 kg/mt 30 97,0 1,8 0,2 1,1 lido seco de sólido seco 0,6 kg/mt de só¬ 0,3 kg/mt de 30 97,2 1,8 0,2 0,8 lido seco sólido seco Exemplo 3

Uma reação de sacarificação catalisada por TrAA e uma glicoamilase alcança um nível mais alto de glicose em um tempo mais curto do 10 que uma reação catalisada somente por uma glicoamilase. O amido de milho bruto liqüefeito foi preparado como descrito no Exemplo 2 como uma pasta fluida de 32% de sólido seco. O amido liqüefeito foi resfriado a 60°C e o pH foi ajustado a 4,2 antes da adição de enzimas nas concentrações indicadas na TABELA 2. TrAA (Lote N0 GCI12004017/018-UF) foi preparada como 15 descrito na seção 1.3 do Exemplo 1. Glicoamilase foi fornecida como GA-L (Lote N0 901-04290-001) em 385 GAU/g. DPn foram medidos no fim da reação como indicado no Exemplo 2 acima. Tabela 2

GA TrAA Tempo (h) DP1 DP2 DP3 DP4+ 1 kg/mt de sólido Nenhum 21 93,9 2,5 0,3 3,3 24 94,6 2,6 0,3 2,4 29 95,0 2,8 0,3 1,9 48 95,2 3,8 0,4 0,7 1 kg/mt de sólido 0,1 kg/mt de 21 94,6 2,5 0,3 2,4 24 95,1 2,6 0,3 2,0 29 95,4 2,9 0,3 1,4 48 95,3 3,7 0,4 0,7 1 kg/mt de sólido 0,2 kg/mt de 21 95,1 2,5 0,3 2,0 24 95,3 2,6 0,3 1,7 29 95,5 2,9 0,4 1,2 48 95,4 3,7 0,4 0,5 1 kg/mt de sólido 0,3 kg/mt de 21 95,6 2,5 0,3 1,7 24 95,7 2,6 0,3 1,4 29 95,7 2,9 0,3 1,1 48 95,3 3,6 0,3 0,7 1 kg/mt de sólido 0,5 kg/mt de 21 95,6 2,6 0,3 1,4 24 95,9 2,6 0,3 1,2 29 95,9 2,9 0,3 0,9 48 95,2 3,8 0,4 0,7 0,5 kg/mt ds 0,5 kg/mt de 21 94,2 2,0 0,4 3,4 24 94,5 2,5 0,4 3,0 29 95,3 2,1 0,4 2,3 48 95,9 2,5 0,3 1,3 A adição da TrAA à reação de sacarificação causou um aumento em DP1, isto é, glicose, na reação. Condições ótimas da produção de DP1 foram encontradas onde glicoamilase estava a 1 kg/mt de sólido seco e TrAA estava a 0,5 kg/mt de sólido seco. DP1 sob estas condições alcançou 95,9% p/p de sólido seco, que foi mais alto do que o nível máximo de DP1 obtido sem TrAA, 95,2% p/p de sólido seco. O nível máximo de DP1 foi alcançado após 24 horas na presença de TrAA, mas foi alcançado somente após 48 horas com glicoamilase sozinha. Na presença de 0,5 kg/mt de sólido seco e TrAA, a reversão de DP1 a oligossacarídeos maiores não começou até 48 horas após a reação ter sido iniciada.

Exemplo 4

TrAA é também útil para aumentar o rendimento de maltose em uma reação de sacarificação. TrAA exibe atividade maltogênica em pH relativamente baixo, como determinado no experimento seguinte. O substrato 10 consistiu em um substrato de amido liqüefeito preparado como descrito no Exemplo 2, exceto que o milho bruto foi diluído com água para criar uma pasta fluida de 30% p/p de sólido seco, a qual 0,25 kg/mt de sólido seco de Spezyme® Ethyl (Genencor International, Inc., Lote N0 107-04107-001) foi adicionado. Após liquefação a 92°C por 25 min, o amido liqüefeito foi resfria15 do a 55°C e o pH foi ajustado usando 20% v/v de ácido sulfúrico. DPn foi medido como descrito no Exemplo 2 acima. A figura 2 representa a dependência de pH da produção de DP2 após uma reação de 24 horas catalisada por 0,5 kg/mt de sólido seco de TrAA (Lote N0 GCI12004017/018-UF). Como mostrado na Figura 2, TrAA mostrou atividade ótima em pH 5,0 a 5,5; entre20 tanto, TrAA também mostrou atividade quase ótima acima de uma faixa de pH de 4,5 a 6,0. Este experimento indica que TrAA é altamente ativa em pH relativamente baixo de 4,5.

Exemplo 5

TrAA pode catalisar a produção de DP2 a níveis comparáveis 25 àqueles obtidos com a α-amilase fúngica maltogênica Clarase® L (Genencor International, Inc.). TrAA foi produzida a partir de T. reesei e purificada de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1 acima. A TrAA (Lote N0 150906) usada para este experimento demonstrou uma atividade específica de aproximadamente 18.000 SKBU/g. TrAA também foi testada em 30 combinação com uma pululanase na forma de Optimax® L-1000 (Genencor International, Inc., Lote N0 107-04224-001), que tinha uma atividade específica de aproximadamente 1040 unidades de PU/g. Atividade específica do Clarase® L (Lote N0 107-04330-001) neste experimento foi aproximadamente 41.000 SKBU/g.

Amido liqüefeito foi preparado como descrito no Exemplo 2 e foi ajustado a 55°C, pH 5,5, ou 60°C, pH 4,5. Enzimas foram adicionadas nas concentrações indicadas abaixo, e a reação foi realizada por 48 horas na temperatura indicada. DPn produzidos durante a reação foram medidos em

24 horas e 48 horas após a reação ter sido iniciada, usando os procedimentos descritos no Exemplo 2. A TABELA 3 mostra os DPn obtidos a partir de uma reação representativa. A figura 3 representa a concentração de DP2 obtido após 48 horas da reação de sacarificação como uma função da concentração enzimática em unidades de SKBU/g.

Tabela 3

Enzima 1 Enzima o PH Tempo % de % de % % (dose) 2 (do¬ I- s- (h) DP1 DP2 de de se) DP3 HS Clarase® NA 55 5,5 24 3,0 53,9 21,3 21,7 48 4,4 58,2 17,1 20,3 TrAA (10 NA 60 4,5 24 4,5 37,8 23,7 34,0 48 6,4 46,2 21,7 25,7 TrAA (15 NA 60 4,5 24 6,7 47,4 21,3 24,6 48 8,9 52,8 17,3 21,1 TrAA (20 NA 60 4,5 24 8,7 52,6 17,6 21,1 48 10,5 55,1 14,5 19,9 TrAA (20 PU 60 4,5 24 8,9 54,5 19,4 17,2 48 11,3 58,9 16,5 13,4 Em 48 horas, a concentração de DP2 tinha aumentado em apro

ximadamente 58% p/p de sólido seco na presença de 10 SKBU/g de Clarase® L a 55°C, pH 5,5. Em comparação, reações catalisadas por 20 SKBU/g de TrAA a 60°C, pH 4,5 produziram aproximadamente 55% de DP2 em 48 horas. Na presença de 20 SKBU/g de TrAA e 0,25 kg/mt de pululanase, entretanto, DP2 aumentou a aproximadamente 59% p/p de sólido seco em 48 horas, excedendo a concentração obtida com Clarase® L. Além disso, TrAA por si só ou em combinação com uma pululanase produziu um xarope rico em maltose com uma concentração mais alta de DP1 do que a obtida com 5 Clarase® L: aproximadamente 11% p/p de sólido seco contra aproximadamente 4% p/p de sólido seco. Este experimento consequentemente mostra que TrAA pode ser usada para produzir um xarope de alta maltose em um pH baixo, onde o xarope contém níveis comparáveis de maltose, bem como níveis mais altos de glicose, do que os obtidos com Clarase® L.

Exemplo 6

Quando usado em pH baixo, TrAA significativamente superou outras amilases maltogênicas convencionais, como mostrado no seguinte experimento. As condições experimentais usadas foram as mesmas do Exemplo 5, exceto que a reação foi conduzida a 58°C, pH 4,6 e a produção de 15 DPn foi catalisada por 0,2 kg/mt de sólido seco BBA (uma β-amilase; Lote N0 05189-001), 0,2 kg/mt de sólido seco de Clarase® L (Lote N0 9016231002), ou 0,5 kg/mt de sólido seco de TrAA (Lote N0 GCI2004017/018-UF). Como indicado na TABELA 4, concentrações significativamente mais altas de DP2 foram obtidas na presença de TrAA do que na BBA ou Clarase® L.

TABELA 4

Enzima (dose) T(0C) PH Tempo % de % de % de % de DE (h) DP1 DP2 DP3 HS BBA (0,2 kg/mt 58 4,6 24 0,6 12,5 3,2 83,6 25 48 0,3 12,2 3,1 84,4 24 Clarase® L (0,2 58 4,6 24 0,6 9,9 17,9 71,6 28 48 10,0 18,0 14,2 71,3 28 TrAA (0,5 kg/mt 58 4,6 24 6,0 44,4 20,8 28,7 46 48 8,1 51,2 17,8 22,9 49 Exemplo 7

A produção de DP2 pela TrAA foi significativamente aumentada pela adição de uma pululanase. No experimento seguinte, as condições experimentais foram as mesmas como descritas no Exemplo 5, exceto que a reação foi a 58°C, pH 4,6. Pululanase foi adicionada na forma de Optimax® L-1000 (Genencor International, Inc.; Lote N0 9016167004 a 1165 PU/g) nas concentrações indicadas na TABELA 5. A reação foi realizada a 58°C, pH 5 4,6, nos tempos indicados. Como mostrado na TABELA 5, 0,1 a 0,25 kg/mt de sólido seco de pululanase aumentaram significativamente a produção de DP2 catalisada por TrAA em 48 horas. A figura 4 representa a formação de DP2 em 48 horas sob as várias condições descritas neste exemplo.

Tabela 5

TrAA PU T PH Tempo % de % % de % DE (0C) (h) DP1 de DP3 de DP2 HS 0,5 kg/mt Nenhuma 58 4,6 24 7,2 44,8 20,1 27,9 47 48 9,2 51,6 16,8 22,3 50 0,5 kg/mt 0,1 kg/mt 58 4,6 24 6,7 44,9 21,5 26,9 47 48 10,4 61,8 22,4 5,3 57 0,5 kg/mt 0,25 kg/mt 58 4,6 24 7,8 49,4 23,6 19,2 50 48 10,8 61,7 22,0 5,5 57 0,5 kg/mt 0,5 kg/mt 58 4,6 24 7,5 50,3 25 17,2 51 48 10,3 60,9 22,9 5,9 56 Todas as referências citadas acima são neste pedido incorpora

das por referência em sua totalidade para todos os objetivos.

Claims (11)

1. Polipeptídeo isolado compreendendo (i) resíduos 21 a 463 da SEQ ID NO:3, ou (ii) uma variante da α-amilase de Trichoderma reesei (TrAA)1 em que a variante tem atividade de α-amilase e identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% aos resíduos 21 a 463 da SEQ ID NO:3.

2. Método de sacarificação de amido liqüefeito para produzir um xarope rico em maltose compreendendo: adição de um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 a uma solução de amido liqüefeito, e sacarificação da solução de amido liqüefeito, em que a dita sacarificação da solução de amido liqüefeito produz um xarope rico em maltose.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito polipeptídeo é adicionado à solução de amido liqüefeito em aproximadamente0,3 a 1 kg por tonelada métrica de sólidos secos.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a solução de amido liqüefeito é uma pasta fluida de amido liqüefeito a aproximadamente 20 a 35% p/p de sólidos secos.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a solução de amido liqüefeito é sacarificada de aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a solução de amido liqüefeito é sacarificada de aproximadamente 55°C a aproximadamente 60°C.

7. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a solução de amido liqüefeito é sacarificada em aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente pH 6,0.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a solução de amido liqüefeito é sacarificada em aproximadamente pH 4,2 a aproximadamente pH 4,8.

9. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendo ainda uma etapa de adição de uma pululanase, uma β-amílase, uma aamilase fúngica que não é uma TrAA, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma isoamílase, ou uma combinação das mesmas, à solução de amido liqüefeito.

10. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a concentração final de maltose atinge uma porcentagem em peso de sólidos secos de aproximadamente 50% a aproximadamente 62%.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a concentração final de maltose atinge uma porcentagem em peso de sólidos secos de aproximadamente 60% a aproximadamente 62%.