JPH0650990B2 - トロンビン阻害剤の製造方法 - Google Patents

トロンビン阻害剤の製造方法

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JPH0650990B2 JP61293558A JP29355886A JPH0650990B2 JP H0650990 B2 JPH0650990 B2 JP H0650990B2 JP 61293558 A JP61293558 A JP 61293558A JP 29355886 A JP29355886 A JP 29355886A JP H0650990 B2 JPH0650990 B2 JP H0650990B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵母宿主によるデスルファトヒルジンの製造方
法に関する。
〔従来の技術〕
ヒルジンは天然にはヒルすなわちヒルド・メディシナリ
ス(Hirudo medicinalis)中に存在する抗凝血物質であ
る。ヒルジンは単一の蛋白質種ではなく、少なくとも３
種の、ヒルジン変形体１（ＨＶ１）、ヒルジン変形体２
（ＨＶ２）（欧州特許出願第158,564号明細書を参照さ
れたい）および「デス−(Val)2−ヒルジン」（欧州特許
出願第158,986号明細書を参照されたい）と命名された
成分から成っている。これ等の変形体は構造が互いに幾
つかのアミノ酸において異なっている（特にＨＶ１のＮ
−末端配列がＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであり、ＨＶ２の
Ｎ−末端配列がＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒであり、「デス
−(Val)2−ヒルジン」のＮ−末端配列がＴｈｒ−Ｔｙｒ
である）が、Ｎ−末端の疎水性アミノ酸、Ｃ−末端の極
性アミノ酸、スルフェート・モノエステルとして存在す
るチロシン残基(Tyr63)、３個のジスルフィド・ブリッ
ジおよび抗凝血活性を共通に有する。
Ｋｉ値（複合体解離定数）が６×10-11Mであるヒルジン
は、既知の最も強力なトロンビン阻害剤であり、トロン
ビンへの特異的な親和性を特徴とする。血液凝固カスケ
ートのその他の酵素は、ヒルジンによって阻害されな
い。通常の抗凝血治療における好ましい抗凝血剤である
ヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直接にトロンビンに
対して阻害作用を行い、前者とは異なりアンチトロンビ
ンIIIを介して作用するものではない。精製したヒルジ
ンの唯一の薬理学的に検出し得る効果は、血液凝固の阻
害と血栓症の予防である。犬に静脈内に投与した場合に
は、多量に投与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する効果
は観察されなかった。ラット、豚および犬での試験で
は、ヒルジンは、（鬱血によってまたはトロンビンの注
射によって誘発される）実験的血栓症、内毒素ショック
およびＤＩＣ（散在性脈管内凝血）において有効である
ことが証明されている。直接比較試験を行った場合には
何時でも、ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが
証明されている。また、ヒルジンの毒性は極めて低く、
非抗原性であり且つ生物学的に活性な形で腎臓からのほ
ぼ完全なクリアランスを示す。
〔発明が解決しようとする問題点〕
ヒルジンはかなり以前から知られてはいたが、その優れ
た生物学的特性から期待される広汎な治療的利用は未だ
達成されていない。その極端に限定された入手可能性
は、医薬における広汎に使用する上での重要な欠点であ
る。従来は、ヒルジン製剤は本質的には天然物質（ヒル
抽出液）から得られており、入手には費用が掛かり且つ
困難であり、またこの方法は時間が掛かり且つ費用が掛
かる分離および精製法を用いている（P.WalsmannらのPh
armazie、第３６巻、653頁（1981年）；欧州特許出願第
158,986号明細書を参照されたい）。アミノ酸配列が６
５と比較的長という観点からも、従来のペプチド合成で
は経済的理由から成功の望みが少ない。それ故、ヒルジ
ンの治療効果の詳細な臨床試験及びその広汎な抗凝血治
療での使用を可能にする適当な量のヒルジンを製造する
には、新規な方法を用いなければならない。
かかる方法は、特に組換ＤＮＡ技術によって提供され
る。この技術によれば、非常に多種の生理学的に活性な
ポリペプチドは対応する遺伝学的に変性された宿主生物
を培養することによって製造することが可能である。こ
れに関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸化されるデ
スルファトヒルジンを介してヒルによって製造されるも
のといわなければならない。ヒル以外の宿主は特異的な
スルフェート転移酵素系を欠いており、それゆえヒルジ
ンではなくデスルファトヒルジンを生成するものと予想
される。しかしながら、対応するヒルジン蛋白質のTyr6
3残基のフェノール性ヒドロキシルからのスルフェート
基の酵素による除去によって得られるデスルファトヒル
ジンタンパクによって明らかなように、その生物活性は
スルフェート基の不在によっては損なわれない（欧州特
許出願第142,860号明細書を参照されたい）。
近年に公開された欧州特許出願第158,564号明細書に
は、それぞれのデスルファトヒルジン変形体のための構
造遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されＥ．コリ
(E.coli)細胞によるデスルファトヒルジン変形体および
２、並びにそれ等の類似体の製造が開示されている。培
養されたＥ．コリ細胞の細胞抽出液によって測定され且
つ抗トロンビン単位（「ＡＴＵ」）量で与えられる抗凝
血活性は、3.000〜4,000ATU/0D600／培養液であり、
これは（純粋なヒルジン１ｍｇの理論的比活性を15,000
〜20,000ATUとして）0.2ｍｇヒルジン／ＯＤ／の濃度
に相当する。
形質転換されたＥ．コリ細胞から得られる低収率のヒル
ジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の不正確な折り
畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不活性な形で蓄
積されることに起因するものと考えられる。正確な折り
畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジン分子内の３個
のジスルフィドブリッジの形成によるものである（P.Wa
lsmannらの上記文献を参照されたい）。その他の天然に
分泌される哺乳類の蛋白質、例えば子牛の成長ホルモ
ン、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子およびヒト
γ−インターフェロンも、微生物の細胞質中に生産され
且つ蓄積された場合には本質的には不活性である〔R.A.
Smithら、Science、第229巻、1219頁（1985年）を参照
されたい〕。ジスルフィドブリッジを有するほとんどの
蛋白質は細胞外性であるので、その分泌経路はジスルフ
ィド結合の形成に有利であろう。分泌を非常に好ましく
するその他の特徴がある。すなわち、分泌された蛋白質
は、一般的に細胞内に蓄積された生成物よりも容易に検
出され且つ精製され、所望の生成物が培地中に分泌され
ることにより、生成物を回収するために宿主生物を破壊
する必要がなく；幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対し
て毒性効果を有し、分泌されると、それ等は正状な細胞
機能を余り妨害しなくなり；分泌された蛋白質は、細胞
の崩壊時に蛋白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積
された蛋白質よりもこれ等の酵素によって消化されにく
い。
ほとんどの分泌される蛋白質は、成熟アミノ酸配列に附
随するアミノ末端伸長部としてのシグナルペプチドを有
するプレ蛋白質としてＤＮＡ上にコードされている。シ
グナルペプチドは、小泡体（ＥＲ）の膜中への蛋白質の
翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な役割を演じ
る。シグナルペプチダーゼはＥＲの管腔側で早期にシグ
ナルペプチドを開裂させる。外側細胞膜へのその後の輸
送はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白質はペリプ
ラズム空間（例えば、酸性ホスファターゼ、インベルタ
ーゼ）中へも、または培地（例えばα−ファクター、キ
ラー・トキシン）中へも分泌される。
総ての真核生物は遺伝情報を発現しそして発現された蛋
白質を分別する機構を共有すると思われるので、真核生
物宿主ではＥ．コリよりもはるかに効率的に真核遺伝子
の発現が進行する。真核生物の中では、酵母が最初に操
作され且つ培養されるようになったものである。多数の
異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてきた。しかしな
がら、付加されたシグナルペプチドの場合を除き、媒質
中に効率的に分泌させることができる蛋白質の本質的な
特徴を定義することは今までのところは不可能であっ
た。それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かについて確実
に予測することは可能になっていない。例えば、（プレ
ーグルコアミラーゼについての遺伝子情報を有する）形
質転換された酵母によって産生される総グルコアミラー
ゼの９０％は培地中に分泌され（特許協力条約に基づく
特許出願第84／2921号明細書）、高力価の表皮成長因子
（ＥＧＦ）が附随するαファクター・シグナルペプチド
を有するＥＧＦの遺伝子を含む培養酵母の培地中に見い
出されるが（欧州特許出願第116,201号明細書）、β−
エンドルフィン（α因子シグナルペプチド、特許協力条
約に基づく特許出願第84／4330号明細書）、真核生物の
インターフェロンＡ（インベルターゼシグナルペプチ
ド、欧州特許出願第127,304号明細書）、ヒトγ−イン
ターフェロン、ヒト血清アルブミン、ウシインターフェ
ロンα１およびα２、組織プラスミノーゲン活性化因
子、レニンおよびヒトインシュリン様成長因子（α−フ
ァクター・シグナルペプチド、欧州特許出願第123,544
号明細書）、白血球インターフェロンＤおよびＡ、γ−
インターフェロンおよびヒト成長ホルモン（ＭＧＨ）
（それぞれインターフェロンおよびＭＧＨシグナルペプ
チド、欧州特許出願第88,632号明細書）は少量または痕
跡量しか培地中に検出されず、形質転換された酵母で
は、シュドモナス・カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)
〔G2(CPG2)シグナルペプチド、欧州特許出願第121,352
号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子（PH
05シグナルペプチド、欧州特許出願第143,081号明細
書）の媒質中への分泌は見られない。したがって、附随
のシグナルペプチドを有する所定の蛋白質が酵母によっ
て分泌されるか否かは予測不可能であり、結局のところ
選択される蛋白質によって異る。また、付随のシグナル
ペプチドを有するヒルジンの様な選択された蛋白質が酵
母のような形質転換された宿主生物によって少なくとも
ある程度まで分泌されるかどうかについては、不確実で
あった。
驚くべきことには、デスルファトヒルジンの構造遺伝子
及びその上流にありそしてそれとリーディングフレーム
が合っているシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含んで成るＤＮＡを含有する真核宿主生物によって、
ヒルジン活性を有する蛋白質が培地中に分泌されること
が見い出された。
本発明の目的は、真核宿主生物においてヒルジン活性を
有する蛋白質の生産および分泌のための方法を提供する
ことである。
本発明のもう一つの目的は、デスルファトヒルジンの構
造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を含有するハイブリッドベクター、並びに上記
ハイブリッド・ベクターにより形質転換された真核宿主
生物を提供することである。
〔問題点を解決するための手段〕
具体的な説明 1.デスルファトヒルジンの製造法。
本発明は、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であ
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡ
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るＤ
ＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタンパクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
「成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列」
という用語は、ヒルゲノムに存在することが知られてお
り、そして／または上記ゲノムから分離することができ
る、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコードする総て
の構造遺伝子、例えば、成熟デスルファトヒルジン変形
体ＨＶ１、ＨＶ２、ＰＡ、およびデス−(Val)2−デスル
ファトヒルジン（ＨＶ１遺伝子の発現の単なる人工産物
ではない場合）の構造遺伝子を包含することを意図す
る。「成熟デスルファトヒルジン」という用語は、プレ
−配列およびプロ−配列を欠いているデスルファトヒル
ジンを指す。
「ヒルジン活性を有する蛋白質」とは、トロンビン阻害
作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を有し、そして
デスルファトヒルジンの一次構造を有する分泌宿主細胞
から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸化の様な修飾
がなされた対応するヒルジン化合物、および短縮された
それ等の誘導体、例えばＣ−末端の１〜７個のアミノ酸
を欠いているデスルファトヒルジンであると理解すべき
である。
上記の蛋白質は、具体的には次の式（Ｉ）： 〔式中、Ｘはジペプチド残基Ｖａｌ−Ｖａｌ−（ＨＶ
１）またはＴｈｒ〔デス−(Val)2−ヒルジン〕であり、
そしてＲはＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基または
式−Ｏ−SO3Hで表わされる基である〕、で表わされる蛋
白質、並びにＣ−末端アミノ酸Ｇｌｎ、Ｃ−末端ジペプ
チド−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｃ−末端トリペプチド−Ｔｙｒ
（Ｒ）−Ｌｅｕ−ＧｌｎまたはＣ−末端テトラペプチド
−Glu−Tyr(R)−Leu−Glnを欠いている誘導体；あるい
は、 次の式（II）： （ＨＶ２）（式中、Ｒは上記定義の通りである）で表わ
される蛋白質；あるいは、ヒルジンＰＡと命名され、ヒ
ルによって産生され（J.Dodt、博士論文、ミュンヘン大
学、西ドイツ、1984年）、そして次の式（III）： （ＰＡ）（式中、Ｒは上記定義の通りである）で表わさ
れるもう一つのヒルジン変形体である。
ヒルジン活性を有する好ましい蛋白質は、式Ｉ（但し、
Ｘは残基Ｖａｌ−Ｖａｌ−であり、ＲはＴｙｒのフェノ
ール性ヒドロキシル基である）を有する蛋白質、および
Ｃ−末端においてアミノ酸が１〜７個、特に１〜４個だ
け短縮されているその誘導体である。
好適な真核宿主生物は、高等生物、特に、哺乳類の細
胞、特にVEROもしくはHera細胞またはチャイニーズハム
スターの卵巣（ＣＨＯ）セルラインのような樹立された
ヒトまたは動物セルラインおよびサッカロミセス・セレ
ビシエー(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母であ
る。本発明の好ましい宿主生物は、酵母、特にサッカロ
ミセス・セレビシエーの株である。
上記ＤＮＡ配列を有する真核宿主生物、特に酵母は、当
業界において既知の方法を用いて培養される。
本発明により形質転換された酵母株は、資化可能な炭素
源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で培養
される。
各種の炭素源が利用できる。好ましい炭素源の例は、グ
リコース、マルトースまたはラクトースのような資化性
炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢酸塩であり、
単独でまたは適当な混合物として用いることができる。
好適な窒素源としては、例えカザミノ酸のようなアミノ
酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等の分解生成物、
例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エキス、更に酵母
エキス、マルトエキス、コーンスティープリカー、ある
いはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあり、単独でもま
たは適当な混合物としても用いられる。使用することが
できる無機塩には例えば、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩
および炭酸塩がある。また、培地は成長促進物質を含ん
でいてもよい。成長を促進する物質には、例えば鉄、亜
鉛、マグネシウムなどのような痕跡量の元素またはアミ
ノ酸がある。
自律複製プラスミド、例えば酵母２μプラスミドＤＮＡ
（後記）で形質転換された酵母細胞は、導入されたハイ
ブリッドプラスミドを、種々の程度で失いやすい。この
ため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、すなわち増殖
のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現を要す
る条件下で生育させねばならない。一般に用いられ、そ
して本発明のハイブリッドベクターに存在するほとんど
の選択マーカー（後述）は、アミノ酸またはプリン生合
成の酵素をコードする遺伝子である。これにより、対応
するアミノ酸またはプリン塩基を欠いている合成最少培
地を用いることが必要になる。しかしながら、適当な殺
生物剤に対する耐性を付与する遺伝子（例えば、シクロ
ヘキシミド、アミノグルコシドG418、重金属などに対す
る耐性を付与する遺伝子）も同様に用いられる。抗生物
質耐性遺伝子を有するベクターで形質転換された酵母細
胞を、対応する抗生物質を含む複合培地中で生育させる
ことにより、増殖速度を速め、細胞密度を高くする。
染色体に組み込まれるＤＮＡにより形質転換された酵母
細胞は、選択的増殖条件を必要としない。これ等の形質
転換細胞は十分に安定であり、選択圧なしで増殖を行う
ことができる。これらの細胞は、複合培地中で有利に増
殖する。
構成的プロモーター（例えばADH I、GAPDH）を有するハ
イブリッドプラスミドを含む酵母細胞は、誘導なしに上
記プロモーターによって制御されたたデスルファトヒル
ジン遺伝子を発現する。しかしながら、このデスルファ
トヒルジン遺伝子が調節されるプロモーター（例えばPG
KまたはPH05）の制御下にある場合には、ｍＲＮＡ転写
物の水準を最高にするような増殖培地の組成を採用しな
ければならない。すなわち、PH05プロモーターを用いる
ときには、増殖培地はこのプロモーターを抑制解除する
ための低濃度の無機リン酸塩を含んでいなければならな
い。
培養は、常用技術を用いることによって行う。温度、培
地のpHおよび醗酵時間のような培養条件は、最高水準の
デスルファトヒルジンが産生されるように選択される。
選択された酵母株を、約25℃〜35℃、好ましくは約３０
℃の温度で、４〜８のpH値、例えば約７のpHで、約４〜
約２０時間、好ましくは最大収量の蛋白質が得られるま
で、振盪または攪拌を行いながら、好気性条件下で液内
培養で生育させるのが好ましい。
意外なことには、宿主生物および使用されるシグナルペ
プチドとは無関係に、ほとんどの産生されたヒルジン化
合物は培地中に分泌され、極一部分だけ細胞に結合した
まま残ることが見い出された。分泌された化合物／細胞
に結合した化合物の正確な比率は、醗酵条件および用い
た回収法によって変化する。一般的には、その比率は約
９：１以上になる。したがって、分泌されたヒルジンが
常に圧倒的な割合を占める。
ヒルジン化合物は、通常の方法によって培地から分離す
ることができる。例えば、第一の段階は、遠心分離によ
って細胞を培地から分離することにある。生ずる上澄液
をポリエチレンイミンで処理して大部分の非蛋白質性物
質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウムまたはトリ
クロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を沈澱せしめる
ことによって、ヒルジン化合物の濃度を高くする。宿主
蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性にすることによ
って、例えば、0.1％、pH４〜５）それを沈澱させるこ
ともできる。酢酸上澄液をｎ−ブタノールで抽出するこ
とによって、ヒルジン化合物の濃度を更に高くすること
ができる。他の精製工程は、例えば、脱塩、イオン交換
クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、分配ク
ロマトグラフィ、HPLC、逆相クロマトグラフィ法などの
クロマトグラフィ法である。混合物の成分の分離は、透
析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法による荷電に従
って、適当なセファデックスカラムによる分子サイズに
従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用いるアフィニ
ティークロマトグラフィにより、あるいは適当な担体に
結合したトロンビンを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィにより、あるいはその他の方法、特に文献公知の
方法によって行うこともできる。
細胞に結合しているヒルジン化合物、すなわち細胞内ま
たはペリプラズマ空間に蓄積した化合物をも分離するこ
とが所望ならば、幾つかの補足的精製工程を必要とす
る。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している場合には、
目的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞内部から蛋
白質を遊離させることである。ほとんどの処理において
は、最初に、グルコシダーゼ（後述）を用いる酵素的消
化によって細胞壁を取り除く。次いで、生成するスペロ
プラストをTritonのような洗剤で処理する。また、剪断
力（例えば、Ｘ−プレス、フレンチ−プレス）またはガ
ラス玉との振盪のような機械的力も、細胞を破壊するの
に好適である。ヒルジン化合物が宿主、特に酵母細胞に
よってペリプラズマ空間中に分泌される場合には、単純
化された方法を用いることができる。すなわち、蛋白質
は、細胞壁を酵素的に除去することにより、または化学
的薬剤、例えばチオール試薬もしくはEDTAを用いて処理
し、細胞壁に損傷を与えて産生した蛋白質が放出される
ようにすることによって、細胞を溶解することなく回収
される。
意外なことには、「成熟デスルファトヒルジンをコード
するＤＮＡ配列」に対応するデスルファトヒルジン化合
物とは別に、予想される化合物とはＣ−末端においてア
ミノ酸が１〜４個欠けている点において異なる幾つかの
その他のデスルファトヒルジン化合物を培養液から単離
することができることが見出された。例えば、デスルフ
ァトヒルジン変形体ＨＶ１をコードする遺伝子を有する
酵母細胞を培養すると、この化合物と共に、Ｃ−末端ア
ミノ酸Ｇｌｎを欠いているデスルファトヒルジン化合物
〔デス−(Gln65)−デスルファトヒルジン〕、Ｃ−末端
のジペプチド残基−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを欠いているデスル
ファトヒルジン化合物〔デス−(Leu64，Gln65)−デスル
ファトヒルジン〕、Ｃ−末端のトリペプチド残基−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを欠いているデスルファトヒルジン
化合物〔デス−(Tyr63，Leu64，Gln65)−デスルファト
ヒルジン〕、およびＣ−末端テトラペプチド残基−Glu
−Tyr−Leu−Glnを欠いているデスルファトヒルジン化
合物〔デス−(Glu62，Tyr63，Leu64，Gln65)−デスルフ
ァトヒルジン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの
化合物は、一次発現生成物デスルファトヒルジンの（部
分的）蛋白質分解的な分解によって形成されたものと思
われ、用いた酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関
係に、総ての培溶液中に置いて同定された。
デス−(Gln65)−デスルファトヒルジン、デス−(Ty
r63，Leu64，Gln65)−デスルファトヒルジン〕、および
デス−(Gln62，Tyr63，Leu64，Gln65)−デスルファトヒ
ルジンは新規であり、そしてやはり本発明の目的であ
る。
抗ヒルジン抗体または抗デスルファトヒルジン抗体（例
えば、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル
抗体）を用いる試験、トロンビン試験〔M.U.Bergmeyer
監修、Methods in Enzymatic Analysis、第II巻、314〜
316頁、Verlag Chemie、Weinheim（西ドイツ）、1983
年〕、または凝血試験〔F.Markwardtら、Thromb.Haemos
t.、第４７巻、226頁（1982年）〕を用いてヒルジン活
性を検出することができる。
本発明の方法によってえられるヒルジン化合物は、それ
自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ変換すること
ができる。
例えば、式（Ｉ）〜（III）の化合物（但し、ＲはＴｙ
ｒのフェノール性ヒドロキシル基である）は硫酸二ナト
リウムのような硫酸塩および例えばヒル細胞からえられ
るチロシンスルホトランスフェラーゼと反応させて、式
（Ｉ）〜（III）（但し、Ｒは式−OSO3Hで表わされる基
である）を有する化合物へ変換することができる。
得られたデスルファトヒルジン化合物、例えばデスルフ
ァトヒルジン変形体ＨＶ１を、例えば好適なカルボキシ
ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＹの作用
によってＣ−末端において１〜７このアミノ酸を欠いて
いる誘導体へ変換することも可能である。
本発明によって形質転換された真核宿主生物は、次の工
程を含んで成る組換ＤＮＡ技術によって調製することが
できる。すなわち、 ◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンを
コードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームがあっているシグナルペプ
チドをコードする第一のＤＮＡ配列からなるＤＮＡセグ
メントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるも
のと、真核生物の転写終止シグナルを有するＤＮＡ配列
とを含有するＤＮＡ造成物を調製し； ◎上記ＤＮＡ造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し； ◎調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し；そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する； 工程を含んで成る。
2.シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンのコー
ド領域を含んで成るＤＮＡ造成物 本発明は、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列からなるＤ
ＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るＤＮＡ配列と含有するＤＮＡ造成物に関する。
シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンをコード
するＤＮＡ配列の発現を制御するために数種類の発現制
御配列を用いることができる。詳細には、形質転換され
る宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が用い
られる。
哺乳類の細胞に用いるには、発現制御配列は好ましくは
ウイルスに由来する。例えば、哺乳類の細胞に用いるの
に好適な発現制御配列は、シミアン・ウイルス(Simian
Virus)40(SV40)の初期および後記プロモーター、ワクシ
ニアプロモーター、HTLVプロモーター、またはポリオー
マもしくはアデノウイルス２に由来するプロモーターで
ある。
本発明による最も好ましい宿主生物である酵母の発現制
御配列は、酵母、特にサッカロミセス・セレビシエーの
ゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファトヒルジンの
発現のために用いられる。例えば、TRP１遺伝子、ADH I
またはADH II遺伝子、酸性ホスファターゼ（PH05）遺伝
子、イソチトクロームｃ遺伝子のプロモータ、あるいは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ（GAPDH）、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカル
ボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−
６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレー
トムターゼピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはａ−または
α−ファクターをコードする酵母に適合するフェロモン
遺伝子のプロモーターを用いることができる。一つの酵
母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）ともう一つの酵母
遺伝子の機能性TATAボックスを含有する下流プロモータ
ー要素とを含んで成るハイブリッドプロモーター、例え
ば酵母PH05遺伝子のＵＡＳと酵母GAPDH遺伝子の機能的T
ATAボックスを含有する下流プロモーター要素とを含有
するハイブリッドプロモーターを用いることもできる。
本発明の好ましいベクターは、転写調節を伴うプロモー
ターを含有する。この型のプロモーター、例えばPH05遺
伝子のプロモーターおよびPH05−GAPDHハイブリッドプ
ロモーターは、増殖条件を変えることによってターンオ
ン又はターンオフすることができる。例えば、PH05プロ
モーターは、単に培地中の無機リン酸塩の濃度を増減さ
せることによって、自由に抑制したりまたは抑制を解除
したりすることができる。本発明の他の好ましいプロモ
ーターは、GAPDH遺伝子のプロモーター、特にヌクレオ
チド−300〜180、特にヌクレオチド−263〜−199から始
まり、そしてGAPDH遺伝子のヌクレオチド−５で終了す
る機能性フラグメントである。
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（「シグナル
配列」）は、真核細胞性の、例えば酵母の通常に分泌さ
れるポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。好
適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノムＤＮＡから得
られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナル配列、例え
ば酵母インベルターゼ、ａ−ファクター、α−ファクタ
ー、フェロモンペプチダーゼ、「キラートキシン」およ
び抑制性酸性ホスファターゼ（PH05）遺伝子のシグナル
およびプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ
からグルコミラーゼシグナル配列である。また、融合シ
グナル配列は（存在するとすれば）用いるプロモーター
に天然に結合している遺伝子のシグナル配列の部分をヒ
ルジンシグナル配列の部分に連結することによって造成
することができる。これらの組み合わせは、シグナル配
列と成熟デスルファトヒルジンアミノ酸配列との間で正
確に開裂できるものが好ましい。追加の配列、例えば特
異的なプロセシングシグナルを担持するか又は担持しな
いプロ配列又はスペーサー配列をも造成物中に含ぬるこ
とによって前駆体分子の正確なプロセシングを容易にす
ることもできる。また、生体内または生体外での適切な
成熟を可能にする内部プロセシングシグナルを含有する
融合蛋白質を生成させることができる。例えば、プロセ
シングシグナルは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ残基を含有し、これ
はゴルジ体膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼによ
って認識される。本発明の好ましいシグナル配列は、次
の式： Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Se
r Leu Ala Asn Ala, で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PH05遺
伝子のシグナル配列、および次の式： Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ph
e Ala Ala Lys Ile Ser Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列は、
具体的には上記定義のデスルファトヒルジンの構造遺伝
子から選択される。好ましいＤＮＡ配列は、デスルファ
トヒルジン変形体１（ＨＶ１）をコードし、そして次の
式： で表わされる。
真核性の転写停止シグナルを有するＤＮＡ配列は、好ま
しくは転写停止およびポリアデニル化のための適当なシ
グナルを含有する真核性の遺伝子の３′−フランキング
(flanking)配列である。好適な３′−フランキング配列
は、例えば用いられる発現制御配列に天然に結合してい
る配列である。酵母が宿主生物として用いられる場合に
は、好ましいフランキング配列は酵母PH05遺伝子の配列
である。好ましくは、本発明のＤＮＡ造成物は、クロー
ニングベクターへの造成物挿入及びクローニングを可能
にする合成デオキシヌクレオチドリンカーを両端に備え
ている。
真核性発現制御配列、シグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列、成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮ
Ａ配列および真核性転写停止シグナルを互いに作用可能
に連結される。すなわち、それらの正常な機能が維持さ
れるように併置される。すなわち、この配置において
は、発現制御配列がシグナルペプチド−デスルファトヒ
ルジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転写停止シグ
ナルが転写およびポリアデニル化の適切な停止を行い、
そしてデスルファトヒルジンの分泌が起るようにシグナ
ル配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結合される。
したがって、好ましくは、発現制御配列およびシグナル
配列が異なる遺伝子に由来するものであるときには、発
現制御配列は大ｍＲＮＡ開始部位と発現制御配列に天然
に連結されている遺伝子のＡＴＧとの間でシグナル配列
に結合している。シグナル配列は、翻訳開始のためのそ
れ自身のＡＴＧを有するべきである。これらの配列は、
好ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配列を有するこ
とができる合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーに
よって連結されている。他方、シグナル配列の最後のコ
ドンはデスルファトヒルジンの遺伝子の最初のコドンに
直接連結される。
本発明のＤＮＡ造成物は、当業界において公知の方法、
例えば真核性発現制御配列、デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメ
ント、および真核性転写停止シグナルを含有するＤＮＡ
配列を、ＤＮＡセグメントの適切な発現と生成したデス
ルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物において行われ
るような態様で連結することにより調製される。
各種ＤＮＡ配列を連結して本発明のＤＮＡ造成物を形成
する場合、この連結は平滑末端連結によって、または適
当な共通の制限部位によって、あるいは合成リンカー分
子を介して、正確な連結が生じてこれらのＤＮＡ配列の
正常な機能が維持されるように特別の注意を払いながら
行う。すなわち、シグナル配列およびデスルファトヒル
ジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合させることが
できる。シグナル配列とデスルファトヒルジン遺伝子と
を正しく連結するためのもう一つの方法においては、可
能ならば、シグナル配列をその３′末端近くで制限酵素
切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝子をその５′
末端近くで制限酵素切断して各配列が所定数の塩基対を
欠くようにする。次に、制限切断されたシグナル配列と
制限切断されたデスルファトヒルジン遺伝子とを連結用
オリゴデオキシヌクレオチドを介して連結した場合に、
欠損した塩基対が修復されてデスルファトヒルジン遺伝
子がシグナル配列に関して適切なリーディンフレームに
なるように、合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカー
を造成することができる。
デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列はヒルの
ゲノムＤＮＡから単離することができ、または相補的二
本鎖デスルファトヒルジンＤＮＡ（デスルファトヒルジ
ンｄｓ ｃＤＮＡ）をデスルファトヒルジンｍＲＮＡか
ら調製するか、またはデスルファトヒルジンのアミノ酸
配列をコードする遺伝子を化学的または酵素的方法によ
って調製することができる。例えば、それ自体公知の方
法によって、ゲノム性デスルファトヒルジンＤＮＡ、お
よびデスルファトヒルジンｄｓ ｃＤＮＡが得られる。
例えば、ゲノム性デスルファトヒルジンＤＮＡは、デス
ルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺伝子バンクか
ら、ヒルＤＮＡフラグメントを微生物中でクローン化
し、デスルファトヒルジンＤＮＡを含有するクローン
を、少なくとも１５個の、好ましくは15〜30個のデオキ
シヌクレオチドを含有する放射性ラベル化デスルファト
ヒルジンＤＮＡ−特異的オリゴデオキシヌクレオチドを
用いるコロニーハイブリダイゼーションによって同定す
ることによって得られる。得られるＤＮＡフラグメント
は、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の他に不所望の
その他のＤＮＡ成分を含むが、これらは適当なエキソヌ
クレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処理することに
よって除去することができる。
二本鎖デスルファトヒルジンｃＤＮＡは、例えば、ヒル
ジンを産生するように適切に誘導された適当なヒルの細
胞からｍＲＮＡを分離し、それ自体公知の方法で、生成
するｍＲＮＡ混合物中のデスルファトヒルジンｍＲＮＡ
を濃縮し、このｍＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡを調製する場
合の鋳型として用い、こうしてＲＮＡ依存性のＤＮＡポ
リメラーゼによってｄｓ ｃＤＮＡを合成し、これを適
当なベクター中にクローン化することによって調製する
ことができる。デスルファトヒルジンｃＤＮＡを含むク
ローンは、例えば上記の方法で、放射性物質の標識を有
するデスルファトヒルジンＤＮＡ特異的オリゴデオキシ
ヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーション
によって同定される。
デスルファトヒルジン遺伝子は、化学的合成によっても
製造することができる。この方法は、上記遺伝子のコー
ド鎖および相補鎖のセグメントを化学的に合成して、生
成するセグメントを酵素的にデスルファトヒルジンの構
造遺伝子へと変換することを特徴とする。
ＤＮＡの化学的合成は、当業界におて周知であり、常用
技術を用いる。適当な方法は、S.A.Narang(Tetrahedro
n，第３９巻、３頁、1983年）によってまとめられてい
る。詳細には、欧州特許第146,785号明細書記載の方法
が用いられ、詳細は上記明細書を参照されたい。
同様な方法でシグナル配列は化学的合成によって調製す
ることができ、または適当な真核生物の染色体ＤＮＡか
ら単離することもできる。
3.シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンのコー
ド領域を有するＤＮＡ造成物を含むハイブリッドベクタ
ー 本発明によれば、真核性発現制御配列と、成熟デスルフ
ァトヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から
成るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上の
ＤＮＡインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
本発明のハイブリッドベクターはハイブリッドプラスミ
ドおよび線状ＤＮＡベクターからなる群から選択され、
そして更に形質転換しようとする宿主生物に依存して選
択される。
本発明は特に、真核性発現制御配列と、成熟デスルファ
トヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームが合っている
シグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成
るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含ん
で成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤ
ＮＡインサートを含んで成る線形ＤＮＡベクターであっ
て、上記発現制御配列と上記転写停止シグナルを含んで
成る配列とが同じ真核細胞の遺伝子に由来する上記ベク
ターに関する。特に、本発明は、酵母PH05プロモータ
ー、上記ＤＮＡセグメントおよびPH05の３′フランキン
グ領域を含んで成る線状ＤＮＡベクターに関する。
相同な３′フランキング配列および５′フランキング配
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状ＤＮＡベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母PH05プロモータ
ーおよび酵母PH05遺伝子の３′フランキング配列の場合
には、酵母染色体IIのPH05座に組み込まれる。
本発明はまた特に、発現制御配列、上記ＤＮＡ配列、お
よび転写停止シグナルを含む配列とは別に、プロモータ
の機能、すなわちデスルファトヒルジン遺伝子の発現に
は本質的ではないかまたは余り重要でないが、例えば上
記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に
おいては重要な機能を行うＤＮＡ配列を有するハイブリ
ッドプラスミドに関する。この追加のＤＮＡ配列は、原
核生物および／または真核生物の細胞に由来するもので
もよく、染色体ＤＮＡ配列および／または染色体外ＤＮ
Ａ配列を含有するものでもよい。例えば、この追加のＤ
ＮＡ配列はプラスミドＤＮＡ、例えば細菌または真核生
物のプラスミドＤＮＡ、ウイルスのＤＮＡ、および／ま
たは染色体ＤＮＡ、例えば細菌、酵母または高等真核生
物の染色体ＤＮＡに由来する（またはこれらから成る）
ものでもよい。好ましいハイブリッドプラスミドは、細
菌性プラスミド、特にＥ．コリプラスミドpBR322、また
は関連するプラスミド、バクテリオファージλ、酵母２
μプラスミドおよび／または酵母染色体ＤＮＡに由来す
るＤＮＡ配列も含む。
本発明による好ましいハイブリッドプラスミドにおいて
は、これらの追加のＤＮＡ配列は酵母複製開始点および
酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵母複製開始
点、例えば自律複製セグメント（ａｒｓ）を含有するハ
イブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母細胞内で染
色体外に維持され、有糸***の際に自律複製する。酵母
２μプラスミドＤＮＡと相同な配列を有するハイブリッ
ドプラスミドも、同様に用いられる。これらのハイブリ
ッドプラスミドは組換によって既に存在している２μプ
ラスミドに組み込まれ、または自律複製を行う。
酵母の選択遺伝子マーカーについては、マーカーの表現
型発現により形質転換体の選択を容易にするものであれ
ば、いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。
酵母に好適なマーカーは特に、抗生物質耐性を発現する
ものであるか、または栄養要求酵母変異株の場合には、
宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロヘキサミドに対する耐性を
付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例えばURA1、UR
A3、ARG4、UEU2、HIS4、HIS3、TRP5またはTRP1遺伝子に
原栄養性を付与する。
本発明のハイブリッドプラスミドに存在するその他のＤ
ＮＡ配列はまた、細菌宿主、特にＥ．コリの複製開始点
および選択遺伝子マーカーを含有するのが有利である。
酵母ハイブリッドプラスミド中にＥ．コリ複製開始点お
よびＥ．コリマーカーが存在することに関連する有用な
特徴がある。第一に、Ｅ．コリにおける増殖及び増幅に
より多量のハイブリッドプラスミドＤＮＡを得ることが
でき、第二に、Ｅ．コリに基礎を置くクローン化技術の
全レパートリーを用いてＥ．コリ中でハイブリッドプラ
スミドを便利に造成することである。pBR322などのＥ．
コリプラスミドは、Ｅ．コリ複製開始点、並びに例えば
テトラサイクリンおよびアンピシリンのような抗生物質
に対する耐性を付与するＥ．コリ遺伝子マーカーを含
み、酵母ハイブリッドベクターの一部分として有利に用
いられる。
酵母および細菌宿主（上記参照のこと）の複製開始点お
よび遺伝子マーカーを含有する追加のＤＮＡ配列は、こ
れ以後は「ベクターＤＮＡ」と称し、特に発現制御配列
およびデスルファトヒルジン遺伝子を含む上記ＤＮＡ造
成物と共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成して
いる。
本発明のハイブリッドベクターは１個以上のＤＮＡイン
サートを含有し、これらのインサートのそれぞれは特
に、発現制御配列、シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、および成熟デスルファトヒルジンをコードする
ＤＮＡ配列を含有するであろう。ハイブリッドベクター
が複製のＤＮＡインサート、好ましくは２〜４個のＤＮ
Ａインサートを含有する場合には、これらは縦列(tande
m)に並んでいてもよくまたはハイブリッドベクターの異
なる部位に存在することもできる。好ましいハイブリッ
ドベクターは１個のＤＮＡインサートまたは縦列(tande
m)に並んだＤＮＡインサートを含む。ＤＮＡインサート
は、特に頭対尾に配置される。
本発明によりハイブリッドプラスミドは、当業界におい
て公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの調
製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファト
ヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成る
ＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制御
下にあるものと、真核生物の転写停止シグナルを含有す
るＤＮＡ配列とを含有する１個又は複数個のＤＮＡ造成
物をベクターＤＮＡに導入するか、あるいは上記ＤＮＡ
造成物の構成成分を所定の順序でベクターＤＮＡ中に逐
次的に導入することから成っている。本発明のハイブリ
ッドプラスミドは常用の連結技術を用いて造成される。
プラスミドの成分は、共通の制限部位を介して、および
／または合成リンカー分子により、および／またはプラ
ント末端連結によって連結される。
本発明の線形ＤＮＡベクターは、本質的に第２節に記載
のＤＮＡ造成物に対応し、そして同様な方法で調製され
る。
4.形質転換された真核宿主生物 本発明のもう一つの観点は、真核生物の発現制御配列
と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のＤＮ
Ａ配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフ
レームが合っているシグナルペプチドをコードする第一
のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであって上記発
現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写
停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含
有する１個以上のＤＮＡインサートを含んで成るハイブ
リッドベクターで形質転換された真核生物およびそれら
の変異株に関する。
好適な真核宿主生物は、特に上記のものであり、特に、
クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンディダ(Candid
a)、ピヒア(Pichia)、ヤロウイア(Yarrowia)、サッカロ
ミセス(Saccharomyces)、シツオサッカロミセス(Schizo
saccharomyces)、トルロプシス(Torulopsis)属および関
連の属（J.Lodder、The Yeasts、アムステルダム、1971
年を参照されたい）であり、特にサッカロミセス・セレ
ビシエー(Saccharomyces cerevisiae)の株がある。
形質転換された真核宿主細胞は、真核生物の発現制御配
列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のＤ
ＮＡ配列及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードする第
一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであって上記
発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転
写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが
含有する１個以上のＤＮＡインサートを含んで成るハイ
ブリッドプラスミドで形質転換された真核宿主生物、並
びに宿主の染色体に安定に組み込まれた上記ＤＮＡイン
サートを有する真核宿主生物から選択される。
上記形質転換された真核宿主生物の製造法は、真核生物
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列と
をそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡインサートを含
んで成るハイブリッドベクターにより真核宿主生物を形
質転換することを含んで成る。
真核宿主細胞の形質転換は、当業界において知られてい
る方法によって行われる。例えば、酵母のハイブリッド
ベクターを用いる形質転換は、Hinnenらの記載の方法に
より行うことができる〔Proc.Natl.Acad.Sci,.、USA、
第７５巻、1929頁（1978年）〕。この方法は、３段階に
分けることができる。
（１）カタツムリ消化管汁〔例えばGlusulase（登録商
標）またはHelicase（登録商標）〕のような各種グルコ
シダーゼ製剤、または微生物から得られる酵素混合物
〔例えばZymolyase（登録商標）〕を、浸透圧的に安定
した溶液（例えば１Ｍソルビトール）において用いる酵
母細胞壁またはその部分の除去。
（２）ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびCa2+イ
オンの存在での、ＤＮＡベクターによる「裸の」酵母細
胞（スフェロプラスト）の処理。
（３）寒天の固相における細胞壁の再生および形質転換
された細胞の選定。この再生は、スフェロプラストを寒
天中に埋め込むことによって好都合に行われる。例え
ば、溶融した寒天（５０℃）をスフェロプラストと混合
する。溶液を酵母の増殖温度（約３０℃）にまで冷却す
ることにより固層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須の高分子の速やかな拡散と損失を防止
するためのものであり、それにより細胞壁の再生が促進
される。しかしながら、細胞壁の再生は、予め形成して
おいた寒天層の表面にスフェロプラストをプレートする
ことによっても（効率は低いが）得ることができる。
再生寒天は、形質転換された細胞の再生と選定が同時に
起るような方法で調製するのが好ましい。一般的には選
定マーカー（上述）としてアミノ酸生合成経路の酵素を
コードする酵母遺伝子が用いられるので、再生は好まし
くは酵母の最少寒天中で行われる。極めて高効率の再生
が必要とされる場合には、次の２段階処理が有利であ
る。すなわち、（１）高濃度の複合培地中での細胞壁の
再生、および（２）選択寒天平板上に細胞層をレプリカ
プレートすることによる形質転換された細胞の選定。
上記線状ＤＮＡベクターを用いて真核宿主細胞を形質転
換する場合には、形質転換は好ましくは、酵母の選択マ
ーカーを有する第二のベクターの存在下で行われる。こ
の同時形質転換によると、直接的には選択することがで
きないＤＮＡを取り込んだ宿主細胞を濃縮することがで
きる。コンピテント細胞はいかなる型のＤＮＡをも取り
込むので、選択ベクターで形質転換された細胞はその他
のＤＮＡ（例えば上記線形ＤＮＡベクター）をも高い比
率で担持するであろう。
形質転換された真核宿主生物、特に形質転換された酵母
株であって、本発明のハイブリッドプラスミドを含有す
るか、または宿主染色体に安定に組み込まれたデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を含んで成る線状ＤＮＡベクターを
有するものは、当業界において知られている方法を用い
て変異および選択によってデスルファトヒルジンの産生
を向上させることができる。突然変異は、例えば、紫外
線照射または適当な化合物によって行うことができる。
特に好ましいものは、プロテアーゼを欠損した変異体、
特に酵母変異体であって、細胞内で生成したデスルファ
トヒルジン蛋白質の分解を避けるようにしたものであ
る。好適な変異体は、常用の手段で選定して単離するこ
とができる。
本発明は、特に、デスルファトヒルジン遺伝子を含有す
るＤＮＡ造成物、ハイブリッドベクター、形質転換され
た真核宿主生物およびそれらの調製法、並びに実施例に
記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋白質の製造方
法に関する。
以下の実験の部では、本発明の各種態様を添附図面に言
及しながら説明する。
次の実施例は本発明を説明するためのものであり、発明
の範囲を制限することを意図するものではない。
実験の部 実施例に用いた略号の意味は次の通りである。
TNE：100ｍＭNaCl、50ｍＭトリス・ＨＣｌ（pH7.5）お
よび５ｍＭEDTAを含む溶液、 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム、 EDTA：エチレンジアミン四酢酸、 DTT：１，４−ジチオスレイトール（１，４−ジメルカ
プト−２，３−ブタンジオール）、 BSA：ウシ血清アルブミン、 EtBr：エチジウムブロミド、 tris：トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、 tris・HCl：トリス・一塩酸塩。
〔実施例〕
実施例1.保護されたヌクレオシド−ポリスチレン樹脂の
製造 無水コハク酸750ｍｇおよび４−ジメチルアミノピリジ
ン910ｍｇを、５′−（４−メトキシトリチル）−チミ
ジン（ＭＭＴ−Ｏ−Ｔ−ＯＨ）2.57ｇ（５ミリモル）を
無水ピリジン２０ｍｌに溶解したものに加え、混合物を
室温で１６時間放置する。ピリジン溶液を濃縮した後、
酢酸エチル200ｍｌに入れ、0.1Ｍリン酸緩衝液200ｍｌ
ずつに１０ｍｌの飽和塩化ナトリウム溶液を加えたもの
で２回振盪することによって抽出し、飽和塩化ナトリウ
ムで再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてヘキサンを滴
下して加える。沈澱した生成物を分離して、エーテルと
共に２回すりつぶした後、０℃で0.1Ｍ硫酸水素カリウ
ム(pH2.5)180ｍｌと共に振盪して抽出する。水で２回洗
浄した後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾過して、ピリジン0.5ｍｌを加え、混合物を濃縮し、
ヘキサンを滴下して加えることによって希釈する。沈澱
したコハク酸誘導体を濾別する。この化合物1.0ｇをＮ
−ヒドロキシスクシンイミド190ｍｇと共に酢酸エチル
４ｍｌおよびジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解し、37
0ｍｇのＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドを
０℃で加える。冷蔵庫に一晩放置した後、沈澱したＮ，
Ｎ′−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液を酢酸エチ
ルで希釈し、0.1Ｍ重炭酸ナトリウムと水で抽出して、
乾燥し、真空で蒸発させて濃縮乾固する。残渣をシリカ
ゲル上で酢酸エチルによりクロマトグラフ処理する。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.45（ジクロロメタン／メタノール＝
９：１）。
このＮ−スクシンイミドイルコハク酸エステル（100ｍ
ｇ）を、アミノメチルポリスチレン（１ｇ、アミン含量
110μＭ／ｇ）をジクロロメタン２ｍｌおよびジメチル
ホルムアミド４ｍｌに入れたものと共に２０時間攪拌す
る。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルムアミド、メタ
ノール、ジクロロメタンおよびメタノールで洗浄するこ
とによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリジン６ｍｌ中
で無水酢酸１ｍｌおよび４−ジメチルアミノピリジン10
0ｍｇと共に３０分間攪拌することによって、反応しな
かったアミノ基をアセチル化する。ポリマー樹脂を、ジ
クロロメタン、ジメチルホルムアミド、メタノールおよ
びジクロロメタンで洗浄することによって抽出し、恒量
に達するまで乾燥する。メトキシトリチル（ＭＭＴ）の
分光分析によれば５７μＭ／ｇの付加量である。
実施例2. 次の保護されたヌクレオシド／ポリスチレン樹脂を、実
施例１と同様の方法で製造する。
５′−（４−メトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−
デオキシグアノシンから。３２μＭ／ｇの付加量。
実施例3.トリヌクレオチドの合成 （ａ）ジヌクレオチドの合成 ５′−（４−メトキシトリチル）−チミジン（ＭＭＴ−
Ｏ−Ｔ−ＯＨ）7.73ｇ（１５ｍモル）を無水ピリジンと
共に蒸発させることによって２回濃縮する。残渣を無水
テトラヒドロフラン２０ｍｌに溶解し、0.2Ｍの２−ク
ロロフェニル−ジ−（１−ベンゾトリアゾリル）−ホス
フェート／テトラヒドロフラン溶液８０ｍｌに、攪拌し
そして水分を除きながら滴下して加え、反応混合物を１
時間室温で攪拌する。生成する２−クロロフェニル−１
−ベンゾトリアゾリル−５′−（４−メトキシトリチ
ル）−チミジン３′−ホスフェートを３つの部分に分解
する。
（α）トリエチルアンモニウム−２−クロロフェニル−
５′−（４−メトキシトリチル）−チミジン３′−ホス
フェートへの加水分解 0.5Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム100ｍｌを上記２−
クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−（４
−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフェート
の溶液の３分の１に、冷却しながら加える。１５分後
に、ジクロロメタンで抽出を行う。ジクロロメタン溶液
を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しながら
加える。生成する沈澱を吸引濾別し、エーテル／石油エ
ーテル＝１：１で洗浄し、真空で乾燥する。
ＴＬＣ：Ｒｆ0.35（ジクロロメタン・メタノール／水＝
75：22：３）。
（β）４−メトキシトリチル保護基の除去及び２−シア
ノエチル−２−クロロフェニル−５′−（４−メトキシ
トリチル）−チミジン−３′−ホスフェートへのエステ
ル化 ２−シアノエタノール1.3ｍｌおよびピリジン２ｍｌ
を、２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−
５′−（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホ
スフェートの溶液の３分の１に加える。混合物を室温で
一晩放置する。溶媒を真空で留去し、残渣は酢酸エチル
に溶解し、0.1Ｍリン酸緩衝液（pH７）と水で振盪する
ことによって繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮
して、ヘキサンに滴下して加える。沈澱を濾別して、ジ
クロロメタン／メタノール（７：３）５０ｍｌに溶解
し、０℃でｐ−トルエン−スルホン酸−水和物3.8ｇを
ジクロロメタン／メタノール（７：３）７５ｍｌに溶解
した溶液を加える。２時間後、反応溶液をジクロロメタ
ンで希釈して、冷重炭酸ナトリウム溶液と共に振盪して
抽出する。有機相を濃縮し、そしてヘキサンを加える。
沈澱した２−シアノエチル−２−クロロフェニル−チミ
ジン−３′−ホスフェートを、シリガゲル上でジクロロ
メタン／メタノール（９６：４）を用いてクロマトグラ
フ処理する。
ＴＬＣ：Ｒｆ0.45（ジクロロメタン・メタノール＝９：
１）。
（γ）５′−（４−メトキシトリチル）−３′−シアノ
エチル−ビス−チミジンジヌクレオチドへの縮合 ２−シアノエチル−２−クロロフェニル−チミジン−
３′−ホスフェート2.2ｇを、無水ピリジンで２回蒸発
させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テト
ラヒドロフラン２０ｍｌに溶解して、残りの３分の１の
２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５′−
（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフェ
ートに加える。室温にて１８時間後に、水１０ｍｌおよ
び酢酸エチル200ｍｌを、氷冷しながら反応溶液に加え
る。有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと水とで洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃縮する。
ホスフェート残渣と５′−および３−末端が保護された
ジヌクレオチドを、エーテル／ヘキサン＝１：１に滴下
して加えることによって沈澱せせる。
ＴＬＣ：Ｒｆ0.48（ジクロロメタン・メタノール＝９：
１）。
（ｂ）トリヌクレオチドの合成 上記の完全に保護されたジヌクレオチド1.17ｇ（１ｍモ
ル）をジクロロメタン／メタノール（７：３）３０ｍｌ
に氷冷しながら溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸・一水
和物1.9ｇをジクロロメタン／メタノール（７：３）２
０ｍｌに溶解したものを加える。２時間後に、氷冷した
重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を
行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに滴下して
加える。沈澱した遊離の５′−ヒドロキシ基を有する粗
製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で２〜８％のメタ
ノール／ジクロロメタンのグラジエントによりクロマト
グラフ処理する。
ＴＬＣ：Ｒｆ0.33（ジクロロメタン・メタノール＝９：
１）。
この５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド850ｍｇとトリ
エチルアンモニウム−２−クロロフェニル−５′−（４
−メトキシトリチル）−チミジン３′−ホスフェート1.
06ｇ〔（ａ）（α）節を参照されたい〕をピリジンと共
に蒸発させて２回濃縮し、次いで無水ピリジン１０ｍｌ
に溶解し、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−
１，２，４−トリアゾール(MSNT)560ｍｇを加える。２
時間後に、氷冷水２ｍｌを加え、更に１時間後にジクロ
ロメタンを用いて抽出を行う。有機相を飽和の重炭酸ナ
トリウムと水とで洗浄し、乾燥して、濃縮し、エーテル
を加える。沈澱したトリヌクレオチドを、シリカゲル上
でクロマトグラフィによって精製する。
Ｒｆ0.45（ジクロロメタン・メタノール＝９：１）。
実施例4. 実施例３と同様にして、下記の一般式 を有し、Ｂ１Ｂ２Ｂ３と略記される保護されたトリヌク
レオチドを製造する。以下の略号をヌクレオシドＢ１、
Ｂ２、Ｂ３に用いる。すなわち、 Ａ＝Ｎ−ベンゾイル−デオキシアデノシン、 Ｃ＝Ｎ−ベンゾイル−デオキシシチジン、 Ｇ＝Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシン、 Ｔ＝チミジン。
実施例5.ＤＮＡ鎖96／97の第９６番目の塩基から第162
番目の塩基までの６７個の塩基の長さのＤＮＡフラグメ
ントの合成 （ａ）トリヌクレオチドからの２−シアノエチル保護基
の除去 実施例３または４からのトリヌクレオチド１０μモル
を、水分を除いて、ピリジン／アセトニトリル／トリエ
チルアミン（１：１：１）６０μｌに溶解する。室温で
１時間後に過酸化物のないエーテル0.7ｍｌを滴下して
加え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエ
チルアンモニウム塩をピリジン５０μｌに溶解し、エー
テル0.5ｍｌで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で１
５時間乾燥する。
（ｂ）部分的に保護されたトリヌクレオチドとポリスチ
レン樹脂に結合したオリゴヌクレオチドとのカップリン
グ 総ての操作を、容量が220μｌの反応容器中でマイクロ
プロセッサーで制御して溶媒および試薬を添加すること
により水分を除いて行う。チミジン／ポリスチレン樹脂
（実施例１）１３ｍｇ（0.74μモル）を反応容器に入れ
て、次の操作を行う。
1.塩化メチレン、２ｍｌ／分、４分間、 2.塩化メチレン／イソプロパノール（85：15）、２ｍｌ
／分、２分間、 3.塩化メチレン／イソプロパノール（85：15）中に臭化
亜鉛１Ｍおよび１，２，４−トリアゾール0.02Ｍ、２ｍ
ｌ／分、２〜3.5分間、 4.塩化メチレン／イソプロパノール（85：15）、２ｍｌ
／分、４分間、 5. 0.5Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム／ＤＭＦ、２ｍｌ
／分、５分間、 6.モレキュラージーブ乾燥ピリジン、２ｍｌ／分、３分
間、 7.テトラヒドロフラン（過酸化物なし、モレキュラーシ
ーブ乾燥）、２ｍｌ／分、３分間、 8.窒素気流、１０分間、 9.１０μモルのトリヌクレオチドＧＴＣ（（ａ）節から
のトリメチレンアンモニウム塩）および8.9ｍｇ（３０
μモル）の１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−
１，２，４−トリアゾール(MSNT)を150μｌのピリジン
に溶解したものを注入、 10.４５℃、２０分間、 11.ピリジン、２ｍｌ／分、４分間、 12.ピリジン中に無水酢酸５％および４−ジメチレンア
ミノピリジン2.5％、２ｍｌ／分、４分間、 13.ピリジン、２ｍｌ／分、４分間、 14.ピリジン／イソプロパノール（１：１）、２ｍｌ／
分、３分間、 １４段階の総ての操作を２１回繰り返すが、９段階目の
操作では、ＧＴＣの代わりに次のようなトリヌクレオチ
ドをそれぞれトリエチルアンモニム塩〔（ａ）節〕の形
で次のような順序で用いる。
GCA,ACC,GAA,CCC,TAC,AGG,TGA,CGC,TAC,CGT,GTG,CCA,AA
A,AAA,TGA,CGG,TGA,TTC,GGG,CCT,CAT. 平均カップリング収率は９７％である。最終生成物は次
のような構造を有する。
MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAA
GGTACCCCGAAACCGCAGTCT-ポリスチレン （ｃ）担体からのＤＮＡフラグメントの切り離しおよび
保護基の除去 40.0ｍｇ（約0.60μモル）のＤＮＡ合成樹脂96／67を、
６６ｍｇ（0.40ミリモル）のｏ−ニトロベンズアルドキ
シムおよび５０μｌ（0.40ミリモル）の１，１，３，３
−テトラメチルグアニジンを400μｌの９５％ピリジン
に溶解したものと共に５０℃で３時間および室温で１２
時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛ばして除去した後、
残渣に1.6ｍｌのアンモニア水（３３％）を加え、混合
物を閉鎖容器中で５０℃で２４時間保つ。
分離した液相から真空でアンモニアを除去し、過酸化物
を含まないジエチルエーテルそれぞれ３ｍｌを用いて３
回洗浄する。Biogel P6カラム〔100〜200メッシュ、３
×66cm、0.01モル重炭酸トリメチルアンモニウム(pH7.
5)1.5ｍｌ／分〕上で低分子量成分を除去した後、2850D
s（260ｎｍ）のＤＮＡが単離される。
60ODの全量をHPLCカラム（PRP−１／Hamilton、250×4.
6mm）上で分離する。グラジエント〔溶液Ａ：0.05Ｍ酢
酸トリエチルアンモニウム(pH7.0)；溶液Ｂ：溶液Ａ／
アセトニトリル＝１：１〕：３０％Ｂ／Ａ、６０％Ｂ／
Ａ、５０℃および２ｍｌ／分で２０分間。親油性の主ピ
ーク（保持時間、約１４分間）を集め、DE52セルロース
(Whatman)カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエタノ
ールで沈澱させる。４−メトキシトリチル保護基を外す
ために、沈澱を５０μｌの酢酸／H2O（４：１）に溶解
し、室温で４５分間維持する。反応生成物を凍結乾燥
し、エタノールで沈澱させ、そして精製のため８％ポリ
アクリルアミドゲル（７Ｍ尿素）上で電気泳動によって
分離する。所望のＤＮＡの大きさに対応するバンドを切
り取り、生成物を電気溶出し、DE52セルロース上で濃縮
し、下記の構造： ５′-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGA
AGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-3′ を有するＤＮＡ96／97をエタノールで沈澱させる。
実施例6. 下記のＤＮＡフラグメント（５′−３′）を、実施例５
と同様に製造する。
１／５８ CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCT
GTGCCTGT 46／64相補体 CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCG
CACAGGCACAGGTT 154／64相補体 CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCG
TTGTGACACTGCGG 実施例7.フラグメント１／５８、相補体46／64、相補体
96／67および154／65のリン酸化 ５′−末端のリン酸化および放射能標識を、Molecular Cloning Alaboratory Manual （T.Maniatisら編集）、Cold Spring Harbor Lab.、198
2年、125頁に記載の方法で〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰおよびＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ(Boeringer)を用いて行
う。
実施例8.デュプレックスII（デスルファトヒルジンＨＶ
１遺伝子のフラグメントＦ２）への重合 キナーゼ処理したフラグメント96／67およびキナーゼ処
理したフラグメント154／64それぞれ５０ｐモルを、水
２４μｌに溶解し、溶液を９０℃で３分間加熱し、５分
以内に１２℃まで冷却する。４μｌのエンド−Ｒ緩衝液
（0.1Ｍトリス・ＨＣｌ、pH7.5、６６ｍＭ MgCl2、６
６ｍＭのβ−メルカプトエタノール、0.6Ｍ NaCl）、
１０μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合
物（dATP、dCTP、dGTP、TTPであって、それぞれ２×10
-3Mで、ＮＨ３でpH7.0に調整）、および２μｌ（１０単
位）のＤＮＡポリメラーゼＩ、Klenowフラグメント(Boe
ringer)を添加した後、１２℃で３０分間インキュベー
トする。９０℃で３分間加熱して反応を停止させ、更に
処理するまで−８０℃で貯蔵する。
同様にして、キナーゼ処理されたフラグメント１／58お
よび46／64を反応させてデュプレックス（デスルファト
ヒルジン遺伝子のフラグメントＦ１）を形成させる。
デュプレックスＩおよびIIは、下記の構造を有する。
デスルファトヒルジン遺伝子のフラグメントＦ１ およびＦ２の製造を、下記のスキーム１に示す。
スキーム1. デスルファトヒルジン遺伝子HV1のフラグメントF1およ
びF2並びにF1-F2DNAの製造 実施例９ フラグメント１／５８、キナーゼ処理した46
／64、キナーゼ処理した96／67、および154／64の重合
および連結；デスルファトヒルジンＨＶ１遺伝子の製造 フラグメント１／５８、キナーゼ処理したフラグメント
46／64、キナーゼ処理した96／67、および154／64をそ
れぞれ５０ｐモルを、水４８μｌに溶解し、溶液を９０
℃で３分間加熱し、５分以内に１２°まで冷却する。８
μｌのエンド−Ｒ緩衝液（実施例８参照のこと）、２０
μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合物
（dATP、dCTP、dGTP、TTPであって、それぞれ２×10-3M
で、ＮＨ３でpH7.0に調整）および２μｌ（１０単位）
のＤＮＡポリメラーゼI,Klenowフラグメント(Boeringe
r)を添加した後、１２℃で３０分間インキュベートす
る。９０℃で３分間加熱して反応を停止させ、フェノー
ル／クロロホルムで抽出した後、エタノールで沈澱させ
てＤＮＡを単離する。生成するＤＮＡ混合物を100μｌ
のリガーゼ／緩衝液〔６６ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)
6.6ｍＭ MgCl2、１０ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ
ATP〕に溶解し、５０単位（２μｌ）のＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ(Biolabs)を加え、全量を２０℃で２０時間イン
キュベートする。７０℃で５分間加熱することにより、
反応を停止させ、フェノール／クロロホルムで抽出した
後、エタノールで沈澱させることによりＤＮＡを単離す
る。混合物を８％ポリアクリルアミドゲル（変性）上で
電気泳動によって分離した後、217個の塩基対を有する
連結生成物を電気溶出させ、DE52セルロースカラム上で
濃縮し、溶出後にエタノールで沈澱させることによって
単離する。
デスルファトヒルジン遺伝子は、次のような構造を有す
る。
４個のフラグメントからのデスルファトヒルジン遺伝子
の製造を、下記のスキーム２に示す。
スキーム2. ４個の合成フラグメントからのヒルジン遺伝子の製造 実施例10.デスルファトヒルジンＨＶ１遺伝子のＦ１−
ＤＮＡを有するプラスミドpML300の造成（第１図） （ａ）線状化したベクターpBR322／EcoR I／Pvu IIの製
造 pBR322プラスミドＤＮＡ（５μｇ）を、５単位のPvu II
制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を100μｇ／ｍｌゼラ
チンの溶液200ｍｌとしたもので、３７℃で１時間消化
する。次いで、この溶液を100ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH
7.5)および５０ｍＭのNaClに調整し、そしてこのＤＮＡ
をEcoRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)３０単位で３
７℃で２時間消化する。次いで、この溶液を５０ｍＭト
リス・ＨＣｌ(pH8)に調整し、１０μｇ／μｌのＤＮＡ
濃度において、２単位のウシ腸アルカリホスファターゼ
(Boeringer)を用いて、３７℃で３０分間インキュベー
トする。この溶液を６５℃で６０分間加熱することによ
って、酵素を不活性化する。次いで、この溶液をＴＮＥ
で標準化して、１容量のフェノールおよびクロロホルム
で抽出し、消化されたＤＮＡを−２０℃で２容量のアル
コールを用いて一晩沈澱させる。
pBR322のＤＮＡから切り取られたベクター（pBR322／Ec
oR I／Pvu II、2297塩基対）を、１％低融点アガロース
(Biorad)／トリス−アセテート−EDTA緩衝液(pH8)上で
ゲル電気泳動を行うことによって小ＤＮＡフラグメント
（2067個の塩基対）から分離する。アガロースゲル中の
ＤＮＡをEtBrで染色した後、pBR322／EcoR I／Pvu IIベ
クター（＝2297塩基対）のＤＮＡバンドを含むゲルの領
域をゲルから切り取り、６５℃で１０分間液化する。２
０容量のＴＮＥをこのＤＮＡ溶液に加えて、Mueller
ら、〔J.Mol.Biol.,第124巻、343頁、1978年〕の方法に
準じて、DE−52クロマトグラフィを行ってＤＮＡを精製
し、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをアル
コールで−２０℃において一晩沈澱させる。
ＤＮＡの沈澱を５０μｌの0.01Ｍトリス・ＨＣｌ(pH
8)，0.1ｍＭEDTAに溶解し、使用するまで−２０℃で貯
蔵する。1.4μｇ（＝3.2ｐモルの末端）のＤＮＡを得
る。
（ｂ）Ｆ１−ＤＮＡ／EcoR Iの製造 化学的に合成されたＦ１−ＤＮＡ（実施例８を参照）２
４ｎｇ（＝1.3ｐモルの末端）を、５０μｌ100ｍＭトリ
ス・ＨＣｌ(pH7.5)，５０ｍＭ NaClおよび100μｇ／ｍ
ｌのゼラチン中で５単位のEcoR I制限エンドヌクレアー
ゼ(Biolabs)を用いて３７℃で３０分間消化する。次
に、線状化したベクターpBR322／EcoR I／Pvu II（実施
例10a）0.06μｇ（＝0.14ｐモルの末端）を溶液に加え
る。次いで、酵素を６５℃で加熱することにより１０分
後に不活性化し、溶液をＴＮＥで標準化して、フェノー
ル／クロロホルムで抽出する。沈澱したＤＮＡを、更に
処理するまで、−２０℃で貯蔵する。
（ｃ）pBR322／EcoR I／Pvu IIベクターＤＮＡとＦ１−
ＤＮＡ／EcoR Iとの連結およびプラスミドpML300の造成 ２個の上記ＤＮＡフラグメントを含有する、実施例１０
（ｂ）で得られたＤＮＡ沈澱を、２０μＬの５０ｍＭト
リス・ＨＣｌ（pH、7.8），１０ｍＭ MgCl2，１０ｍＭ
ＤＴＴ，0.5ｍＭ ＡＴＰおよび100μｇ／のゼラチ
ンの溶液に溶解し、２０単位／μｌＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ(Biolabs)で１５℃で３時間処理する。この方法で、
Ｆ１−ＤＮＡを含む組み換えプラスミドpML300が、溶液
中に得られる。
（ｄ）プラスミドpML300を用いるＥ．コリHN101の形質
転換 形質転換に必要なカルシウム前処理したＥ．コリHB101
細胞を、Mandelら〔J.Mol.Biol.、第５３巻、159頁、19
70年〕により記載された方法で調製する。
組み換えプラスミドpML300を含む（ｃ）で得られた溶液
を６５℃で１０分間加熱して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを不
活性化して、そして次に３７℃に冷却する。この反応混
合物１０μｌを、カルシウム処理したＥ．コリHB101／1
0ｍＭMgCl2および１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH7.5)150
μｌに加えて全量を200μｌとする。
次いで、この混合物を３０分間氷冷し、４２℃で２分間
加熱した後、Ｌ−培地（実施例１８を参照されたい）１
ｍｌ中で３７℃で５０分間放置する。この混合物を６０
μ／ｍｌのアンピシリン(Serva)を含む５個の寒天平板
(McConkey Agar、Difco)上に0.2ｍｌずつ塗布する。次
に、寒天平板を３７℃で16〜18時間保持する。形質転換
されたＥ．コリHB101の484個のアンピシリン耐性コロニ
ーが得られる。
（ｅ）Ｆ１−ＤＮＡを含むコロニーのスクリーニング 470個の形質転換されたコロニー（実施例10ｄ）を、ニ
トロセルロールフィルターＢ85(Schleicher and Schul
l)に押圧する。M.Grunstein and D.S.Hogness〔Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA、第７２巻、3961頁、1979年〕の方法
に準じて、コロニーを溶解し、そして変性したＤＮＡを
フィルター上に固定する。次いで、フィルターのプレハ
イブリダイゼーションを、２０ｍｌ（フィルター当た
り）の４×SET〔３０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8)，150ｍ
ＭNaClおよび１ｍＭEDTAの溶液〕，0.1％（ｗ／ｖ）Fic
o11400(Pharmacia)，0.5％ＳＤＳ，５０μｇ／ｍｌ変性
したウシ胸腺ＤＮＡ中で６４℃で４時間行う。次いで、
ニトロセルロースフィルターを２０ｍｌ（フィルター当
たり）の５×SET（Ｗ／ｖ）Ficoll 400，0.2％ＳＤＳお
よび５０μｇ／ｍｌ変性したウシ胸腺ＤＮＡ中で、32P
放射能標識したプローブ（フィルター当たり約103〜104
セーレンコフｃｐｍ）を用いて処理する。相補的なオリ
ゴヌクレオチド46／64（実施例６参照）をプローブとし
て使用する。
次いで、フィルターを２×SET,0.2％ＳＤＳで２回室温
で洗浄し、次いで２×SET,0.5％ＳＤＳで２回６０℃で
洗浄する。（最初は３０分間、次に６０分間）。次に、
フィルターを３ＭＭ紙(Whatman)の間で乾燥し、−８０
℃で強調用スクリーン(I1ford)を有するＸフィルム（フ
ジ）上に１〜２日間置く。
得られるオートラジオグラムは、その後の処理に用いる
ことができる７１個の陽性のコロニーを示し、その一つ
をpML300を命名する。
実施例11.デスルファトヒルジンＨＶ１遺伝子のＦ２−
ＤＮＡを含むプラスミドpML305の造成（第２図） （ａ）線状化したベクターpBR322／BamH I／Nru Iの造
成 pBR322プラスミドＤＮＡ（５μｇ）を、３０単位のBamH
I制限エンドヌクレアーゼで、100ｍＭ NaCl，６ｍＭ
トリス・ＨＣｌ(pH7.9)，６ｍＭ MgCl2および100μｇ
／ｍｌゼラチンの溶液中で、３７℃で３０分間消化す
る。次いで、Pvu II制限エンドヌクレアーゼ１５単位を
溶液を加え、３７℃で２時間消化する。
反応混合物を７０℃で１０分間加熱し、酵素を不活性化
する。次いで、１％低融点アガロース／トリス−アセテ
ート−EDTA緩衝液(pH8)上でゲル電気泳動を行うことに
よって２つのＤＮＡフラグメントを互いに分離する（実
施例10ａ参照）。pBR322 BamH I／Pvu IIベクター（＝2
672塩基対）のＤＮＡバンドを含むゲルの領域をゲルか
ら切り取り、液化し、そして、Muellerら（上記）の方
法に準じて、DE−52クロマトグラフィを行ってＤＮＡを
精製する。0.75μｇ（1.5ｐモルの末端）のＤＮＡが得
られる。
（ｂ）Ｆ２−ＤＮＡ／BamH Iの製造 化学的に合成されたＦ２−ＤＮＡ（実施例８を参照）２
５μｇ（＝1.3ｐモルの末端）を、２０μｌの150ｍＭ
NaCl，６ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.9)，６ｍＭのMgCl2お
よび100μｇ／ｍｌのゼラチン中で１６単位のBamH I制
限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を用いて３７℃で３０
分間消化する。次に、線状化したベクターpBR322／BamH
I／Pvu II（実施例11ａ）６０ｎｇ（＝９６ｎモルの末
端）を溶液に加え、全溶液をＴＮＥで標準化して、フェ
ノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡを２容量のアル
コールで沈澱させる。沈澱したＤＮＡを、更に処理する
まで、−２０℃でアルコール中に貯蔵する。
（ｃ）pBR322／BamH I／Pvu IIベクターＤＮＡとＦ２−
ＤＮＡ／BamH Iとの連結およびプラスミドpML305の造成 ２個の上記ＤＮＡフラグメントを含有する実施例１１
（ｂ）で得られたＤＮＡ沈澱を、２０μｌの５０ｍＭト
リス・ＨＣｌ（pH、7.8），１０ｍＭ MgCl2，１０ｍＭ
ＤＴＴ，0.5ｍＭＡＴＰおよび100μｇ／１ｍｌのゼラ
チンの溶液に溶解し、１５単位／μｌのＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ(Biolabs)で１５℃で３時間処理する。この方法
で、Ｆ２−ＤＮＡを含む組み替えプラスミドpML305が溶
液中に得られる。
（ｄ）プラスミドpML305を用いるＥ．コリ HB101の形
質転換 カルシウム処理されたＥ．コリ HB101細胞の形質転換
はは、実施例１０（ｄ）に記載のようにして行う。実施
例１１（ｃ）で得られる反応混合物１０μｌを用いる。
313個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
（ｅ）Ｆ２−ＤＮＡを含むコロニーのスクリーニング ６５個の形質転換されたコロニー（実施例11ｄ）を、実
施例１０（ｅ）に記載の方法でＦ２−ＤＮＡについて試
験する。相補的オリゴヌクレオチド154／64（実施例６
を参照されたい）を、放射能プローブとして用いる。オ
ートラジオグラムにおいて２個の陽性のコロニーが得ら
れ、その一つをpML305と命名する。
実施例12.クローンpML300およびpML305の特性決定 組換プラスミドpML300およびpML305のＤＮＡを、Ish−H
orowitz〔Molecular Cloning,ALaboratory Manual（T.M
aniatisら編），Cold Spring Harbor Lab.,1982年，368
頁〕の方法に準じて単離する。Ｆ１−ＤＮＡおよびＦ２
−ＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を、Maxamおよ
びGilbert〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，第７４巻，560
頁，1977年；Meth.Enzym.，第６５巻，499頁，1980年も
参照されたい〕の方法に準じて確認する。
このためには、それぞれの場合に、１０μｇのpML300の
プラスミドＤＮＡをEcoR I制限エンドヌクレアーゼで開
裂し、そして１０μｇのpML305のプラスミドＤＮＡをBa
mH I制限エンドヌクレアーゼで開裂し、線状化されたＤ
ＮＡをアガロースゲル〔実施例１０（ａ）参照〕からゲ
ル溶出によって単離する。次に、単離されたＤＮＡをア
ルカリ性ホスファターゼで消化して、そしてDE−52上で
クロマトグラフィを行う（実施例11ａを参照された
い）。次に、ＤＮＡを５′−末端で〔γ−32〕ＡＴＰ
（比活性、5000Ｃｉ／ｍモル、Amersham）およびＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌ−Biochemicals）を用
いて、放射能標識する。放射能標識したＤＮＡを、次い
で第二の制限エンドヌクレアーゼ(EcoR II)を用いて開
裂する。生成するＤＮＡフラグメントを、アガロースか
らゲル溶出によって単離する。pML300の場合には、Ｆ１
−ＤＮＡのヌクレオチド配列をEcoR II−EcoR I＊フラ
グメント（約109塩基対）から決定し、pML300の場合に
は、Ｆ２−ＤＮＡのヌクレオチド配列をEcoR II−BamH
I＊フラグメント（約122塩基対）において決定する（＊
は放射能標識されているＤＮＡ末端を意味する）。
Ｆ１−ＤＮＡおよびＦ２−ＤＮＡについて決定されるヌ
クレオチド配列は、実施例８に示したものと同じであ
る。
実施例13.発現プラスミドpML310の造成 （ａ）trpプロモーター−オペレーターを有する線状化
されたベクターpHRi148／EcoR I／BamH Iの造成（第３
図及び第４図） Ａ．プラスミドp159の造成 １０μｇのプラスミドpBRHtrp〔DE−OS3111405〕を５０
単位のEcoR I(Biolabs)を用いて３７℃で６０分間開裂
させ、消化混合物をフェノール抽出した後、TST41(Kont
ron AG)ローター中で５０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)お
よび１ｍＭのEDTAにおいて、サッカロース密度勾配（５
〜２３％）で分画する。遠心分離は、40,000ｒｐｍ、１
５℃で１４時間継続する。0.3ｍｌずつの画分を、ISC0
勾配コレクターを用いて１ｍｌ／分で集める。小さなフ
ラグメントを含む画分をまとめ、この溶液をＴＮＥで標
準化し、−２０℃で２容量のエタノールを用いて沈澱さ
せる。
Eppendorf遠心分離機中で遠心分離した後、ＤＮＡを100
μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)および0.5ｍＭ
EDTAに溶解する。このＤＮＡフラグメント５μｇを５単
位のBg1 II(Bilabs)を用いて、３７℃で６０分間開裂さ
せる。反応混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽
出し、ＤＮＡを２容量のエタノールと共に−８０℃で１
０分間インキュベートし、ＤＮＡを遠心分離によって集
めて、５０μｌの５０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)に再
度溶解させる。この溶液の２μｌを採取して（ＤＮＡ0.
2μｇ）、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)中で１０ｎｇ
／μｌのＤＮＡ濃度で１単位のウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ(Boeringer)と共に３７℃で３０分間インキュ
ベートする。溶液を６５℃で６０分間加熱することによ
って酵素を不活性化する。0.04μｇのＤＮＡを採取し、
そして５′−末端を、５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH9.
5)，１０ｍＭのMgCl2および５ｍＭのＤＴＴの反応容積
２０μｌ中１０μＣｉ〔γ−32Ｐ〕−ATP(5000Ci／mM,A
mercham、およびで５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Ｐ−ＬBilchemicals）と共に３７℃で３０分間イ
ンキュベートして標識する。放射性試料を非標識試料
（上記参照）と混合して、ＤＮＡフラグメントをTST60
ローター中で５０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)および１
ｍＭ EDTA中で５〜２３％サッカロース密度勾配によっ
て分画する。遠心分離を、60,000ｒｐｍ、１５℃で５時
間行う。0.2ｍｌずつの画分を集める。それぞれの画分
の放射能活性をセレンコフ放射線を測定することによっ
て計測し、それによってフラグメントを同定する。小さ
なＤＮＡフラグメントを含む所望のフラグメントをまと
めて、ＤＮＡを２容量のエタノールを用いて沈澱させ、
遠心分離した後、２０μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(p
H7.5)および0.5ｍＭ EDTAに再度溶解する。32 Ｐ−標識されたEcoR I−Bg1 IIＤＮＡフラグメント
を、５０μｌの容量中で0.2単位のTaq I(Billabs)を用
いて、３７℃で１０分間部分的に開裂させる。反応混合
物を、0.2％ＳＤＳ，１０％グリセリン，１０ｍＭ EDT
A，0.05％ブロモフェノール−ブルーに調整し、そして
ＤＮＡフラグメントをトリス−ホウ酸−EDTA中で６％ポ
リアクリルアミド上で分離する〔A.C.Peacockら、Bioch
emistry、第６巻、1818頁、1967年〕。所望のEcoR I−T
aq I（最大の部分消化フラグメント）を含むバンドをオ
ートラジオグラム上で同定する。このフラグメント
（L.,第３図参照）をゲルから抽出して、精製し（W.Mue
llerら、上記）、そして１０μｌの１０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃｌ(pH7.5)および１ｍＭ EDTAに溶解する。
アクセプタープラスミドとして、Cla IおよびEcoR Iで
消化されるpBR322を用いる。２μｇのpBR322を２０μｌ
の反応容量中で４単位のCla I(Biolabs)を用いて３７℃
で６０分間消化される。蛋白質をフェノールで抽出し、
次いでＤＮＡを２容量のエタノールを用いて−８０℃で
１０分間沈澱させる。ＤＮＡを遠心分離によって集め、
次いで２０μｌの反応容積において３７℃で１０単位の
EcoR I(Biolabs)を用いて３０分間消化する。次いで、
0.1Ｍトリス・ＨＣｌ(pH8.7)２容量を溶液に加え、全量
を１単位のアルカリ性ウシホスファターゼ(Boeringer)
と共に３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、
６５℃で６０分間インキュベートすることによってホス
ファターゼを不活性化する。アクセプタープラスミド10
0ｎｇを、１０ｍＭ MgCl2，２０ｍＭトリス・ＨＣｌ(p
H7.8)，１０ｍＭ ＤＴＴ，0.5ｍＭ ＡＴＰ中、１５μ
ｌの反応容積中で、５μｌのフラグメントＬ−ＤＮＡと
共に、１μｌの反応容積当たり３０単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ(Biolabs)を用いて、２時間インキュベートす
る。
この溶液５μｌを、１０ｍＭ MgCl2，１０ｍＭ CaCl2
および１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)中塩化カルシウ
ムで処理したＥ．コリHB101を含む150ｍｌの混合物に加
て全体を200μｌとする。この混合物を２０分間氷冷
し、４２℃で１分間加熱し、２０℃で１０分間インキュ
ベートする。トリプトン培地〔蒸留水１リットル中に、
１０ｇのバクト−トリプトン(Difco)、１ｇの酵母エキ
ス(Difco)、１ｇのグルコース、８ｇのNaClおよび294ｍ
ｇのCaCl2・2H2Oを含む〕１ｍｌを加えて、混合物を300
ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で３０分間インキュベート
する。混合物を、２個の５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
(Sigma)を加えた寒天平板（McConkey Agar、Difco；0.6
ｍｌ／平板）に塗布した。これらの平板を３７℃で12〜
17時間インキュベートする。
１０個の異なるコロニーのプラスミドＤＮＡを、次のよ
うにして単離する。
上記のコロニーを、２５ｍｌの三角フラスコ中５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを補填したトリプトン培地１０ｍ
ｌに接種するのに用いる。培地を３７℃、300ｒｐｍで1
5〜18時間攪拌する。細胞を遠心分離（Sorval、ＨＳ−
４ローター、４℃、4000ｒｐｍで１０分間）によって回
収する。約0.1ｇの細胞が得られ、これらを１ｍｌの５
０ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH8.0)に再分散する。0.25ｍ
ｌのリゾチーム溶液〔５０ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH8.
0)１ｍｌ当たり１０ｍｇ、リゾチームはSigma社より発
売されている〕を加え、０℃で１０分間インキュベート
した後、0.5ｍＭ EDTA(pH7.5)0.15ｍｌを加える。０℃
でさらに１０分置いた後に、６０μｌの２％TritonX−1
00(Merck)を加える。０℃で３０分後に、試料をSorval
ＳＡ−600ローター中で４℃で15,000ｒｐｍで３０分
間遠心分離する。上澄液を、１容量のフェノール（ＴＮ
Ｅで飽和）で脱蛋白する。４℃で5000ｒｐｍで、遠心分
離（Sorval ＨＢ−４ローター）することによって、相
を分離する。上相を１容量のクロロホルムで抽出する。
スイ臓ＲＮＡアーゼＡ（Sigma；１０ｍｇ／１ｍｌ Ｔ
ＮＥ、８５℃で１０分間前加熱）を加えて最終濃度を２
５μｇ／ｍｌとして、混合物を３７℃で４０分間インキ
ュベートする。次いで、溶液を１Ｍ NaClおよび１０％
ポリエチレングリコール6000(Fluka、オートクレーブ中
で120℃で２０分間処理）に調整して、−１０℃で２時
間インキュベートする。沈澱をSorval ＨＢ−４ロータ
ー（０℃、10,000ｒｐｍで２０分間）中で集め、100μ
ｌのＴＮＥに再度溶解する。ＤＮＡ溶液を１容量のフェ
ノールで抽出し、ＤＮＡを２容量のエタノールにより−
８０℃で１０分間沈澱させる。沈澱をEppendorf遠心分
離機で遠心分離によって集め、ＤＮＡを２０μｌの１０
ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)および0.5ｍＭ EDTAに再溶
解する。１０ｍｌの培養液から、８〜１０μｇのプラス
ミドＤＮＡが得られる。
プラスミドＤＮＡは以下の制限酵素を用いる消化の後、
分析する。
それぞれの場合に、酵素業者の指示に従い、標準的方法
によってHpal(Billabs)およびHpa I(Biolabs)とEcoR I
(Biolabs)およびCla I(Biolabs)を用いて切断する。Ｄ
ＮＡを、４０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.8)，１ｍＭ EDT
Aおよび0.5μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中１％アガロー
ルゲル上で分画する。所望のプラスミドはHpal部位を含
み、３回消化した後、大きなＤＮＡフラグメントの他に
２種類の小さなフラグメントであってpBR322の小さなEc
oR I−Cla Iフラグメントよりも大きなフラグメントを
生じる。これらのプラスミドの一つをｐ159と命名する
（第３図参照）。
Ｂ．プラスミドpHRi145の造成 ２μｇのｐ159ＤＮＡを、１０単位のEcoR I(Biolabs)を
用いて３７℃で３０分間消化する。ＤＮＡをフェノール
で抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心分離の後、１０
μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)および0.5ｍＭ
EDTAに溶解する。EcoR Iで消化されたＤＮＡを、更に１
０ｍＭMgCl2,１０ｍＭ β−メルカプトエタノール，５
０ｍＭ NaCl,0.1ｍＭ dATP（Ｐ＆ＬBilchemicals），
0.1ｍＭ dTTP（Ｐ＆Ｌ Bioche-micals）中５単位のＤ
ＮＡポリメラーゼ（Klenowフラグメント）(Boeringer)
で１２℃で１５分間処理する。次いで、８５℃で５分間
インキュベートしてポリメラーゼを不活性化する。反応
混合物を、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.8)，１０ｍＭ
のMgCl2，１０ｍＭのＤＴＴ，0.5ｍＭのＡＴＰ(Sigma)
で１０倍に希釈し、１μｌの反応混合物当たり３０単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、１５℃で１時間インキ
ュベートする。５０ｎｇのＤＮＡを（上記方法で）Ｅ．
コリ中に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
補填したMcConkey寒天平板上に塗布する。
１０個の異なるコロニーのプラスミドＤＮＡを上記の方
法で単離する。プラスミドＤＮＡをEcoR Iで消化するこ
とによって分析する。所望のプラスミドはEcoR I耐性で
ある。分析は、上記の方法で行う。所望のプラスミド１
つをHRi145と命名する（第３図参照）。
Ｃ．プラスミドpHRi148の造成 ２μｇのpHRi145−ＤＮＡを、５単位のCla I(Boeringe
r)を用いて３７℃で６０分間処理し、次いでフェノール
抽出によって脱蛋白する。ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せた後、２０μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)お
よび0.5ｍＭ EDTAに溶解する。突出した末端を、dATP
およびdTTPの代りにdCTP（Ｐ＆Ｌ Biochemicals）およ
びdGTP（Ｐ＆Ｌ Biochemicals）を用いることを除き、
上記と同様にしてＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenowフラグ
メント）で処理する。８５℃で５分間インキュベートす
ることによってポリメラーゼを不活性化する。２容量の
0.1Ｍトリス・ＨＣｌ(pH8.7)を反応混合物に加え、0.5
単位のウシホスファターゼ(Boeringer)と共に３７℃で
３０分間インキュベートする。反応混合物をフェノール
で抽出することによって脱蛋白する。ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、８μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.
5)および0.5ｍＭ EDTAに溶解する。
次の式： ５′−GAATTCCATGGTACCATGGAATTC−３′ を有する化学的に合成したＤＮＡリンカーを、0.1ｍＭ
rATP(Sigma)、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH9.5)、１０
ｍＭ MgCl2、５ｍＭ ＤＴＴおよび２単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｐ＆Ｌ Biochemicals）を含む
反応容積８μｌ中で、８ｐモルのリンカーを５μＣｉ
〔γ−32Ｐ−ＡＴＰ（5500Ｃｉ・ｍＭ-1、Amersham〕と
共に３７℃で３０分間インキュベートすることによって
５′−末端をリン酸化する。−８０℃で凍結することに
よって反応を停止させる。
放射能標識したリンカーを次に１μｇのCla Iおよびホ
スファターゼで処理し、そして0.5ｍＭ rATP(Sigma)、
１０ｍＭ ＤＴＴ(Calbiochem)、２０ｍＭトリス・ＨＣ
ｌ(pH7.8)、１ｍＭ MgCl2および800単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼ(Biolabs)を含む２０μｌの反応容積中でpHRi1
45−ＤＮＡ（上記を参照されたい）と連結する。インキ
ュベーションを１５℃で２時間行う。８５℃で１０分間
インキュベートすることによってリガーゼを不活性化す
る。次に、２容量の水を加え、塩化ナトリウム濃度を１
０ｍＭに調整し、２０単位のKpn I(Biolabs)を３７℃で
３０分間にわたって加える。フェノールおよびクロロホ
ルムで抽出した後、混合物を、４０ｍＭトリス・酢酸(p
H7.8)，１ｍＭ EDTAおよび0.5μｇ／ｍｌの臭化エチジ
ウム中0.9％の低融点アガロースゲル(Biorad)を通して
分画する。紫外線照射によって目視出来且つ同じ大きさ
のマーカーＤＮＡと同じ移動度を示すバンドを小刀で切
り取る。ゲルの部分を６５℃で５分間溶融した後、３７
℃に冷却する。約２０μｌの容量が得られる。この溶液
５μｌを採取して、0.5ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＤＴ
Ｔ，１０ｍＭ MgCl2，２０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.8)
に調整しておいた１０μｌの反応容積中400単位のＴ４
リガーゼ(Biolabs)と共に１５℃で１２時間インキュベ
ートする。100ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.8)，100ｍＭ C
aCl2および100ｍＭ MgCl2から成る溶液１／１０容量
を、リガーゼ混合物（１５℃で固化）に加え、全量を６
５℃で５分間インキュベートする。次に、この溶液を、
上記と同様にして、カルシウム処理したＥ．コリHB101
細胞を形質転換するのに用いる。５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを加えたMcConkey寒天平板上に塗布する。
１０個の異なるプラスミドＤＮＡが上記と同様に単離さ
れ、このＤＮＡを次の制限酵素分析に付する。すなわ
ち、それぞれの場合に、0.5μｇのプラスミドＤＮＡ
を、酵素製造業者の指示にしたがってKpn I(Biolabs)、
Nco I(Biolabs)およびEcoR I(Biolabs)を用いて次々と
切断する。開裂生成物を、４０ｍＭトリス・酢酸(pH7.
8)、１ｍＭ EDTA、0.5μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中
１％アガロースゲル上で分画する。総てのプラスミド
は、それぞれ所望なようにこれらの酵素切断部位の１つ
を示す。１つをHRi148と命名する。
このプラスミドHRi148は、トリプトファンプロモーター
−オペレーターおびＡＴＧ（これも含む）までのリボゾ
ーム結合部位を含む。ヒルジンおよびその他の異種遺伝
子も、このプラスミド中に１個存在するEcoR I、Nco
I、Kpn I部位を介して直接にカップリングすることがで
きる。また、この構造は、対応する遺伝子上に存在なけ
ればならない翻訳の開始に必要なＡＴＧを伴わない異種
遺伝子の直接のカップリングおよび発現を行うことが可
能である。これは、上記のように、Nco Iで切断しそし
てＤＮＡポリメラーゼで突出する末端を修復することに
より、またはKpn Iで切断してヌクレアーゼＳ１によっ
て突出末端を除去することにより容易に達成することが
できる。したがって、プラスミドHRi148は、広い用途を
有する発現プラスミドである。
Ｄ．線状化ベクターpHRi148／EcoR I／BamH Iの製造 ５μｇのpHRi148のプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌ
クレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化する。切り取られ
たベクターpHRi148／EcoR I／BamH Iを、密度勾配遠心
分離によって単離する。
（ｂ）Ｆ１−ＤＮＡ／EcoR I／EcoR IIおよびＦ２−Ｄ
ＮＡ／BamH I／EcoR IIの製造 Ｉ．Ｆ１−ＤＮＡ／EcoR I／EcoR IIの製造 ５μｇのpML300のプラスミドＤＮＡを、最初に100ｍＭ
トリス・ＨＣｌ(pH7.5)，５０ｍＭ NaClおよび100μｇ
／ｍｌのゼラチンの溶液５０μｌ中で、１０単位のEcoR
I制限エンドヌクレアーゼを用いて、３７℃で１時間消
化する。この線状化したプラスミドＤＮＡ／EcoR Iの一
部（0.5μｇ）をアガロースゲル（実施例10ａ参照）か
らゲル溶出によって単離し、そして〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ
放射能標識する（実施例１２参照）。次に、主要量のプ
ラスミドＤＮＡ／EcoR Iをこの放射能標識したＤＮＡと
混合して、EcoR II制御エンドヌクレアーゼを用いて消
化し、EcoR II−EcoR I＊ＤＮＡフラグメント（109塩基
対）を８％ポリアクリルアミド上でゲル電気泳動によっ
て分離する。２００μｇのＦ１−ＤＮＡ／EcoR I＊／Ec
oR IIを、ゲル溶出によって単離する。
II．Ｆ２−ＤＮＡ／BamH I／EcoR IIの製造 ５μｇのpML305のプラスミドＤＮＡを、BamH I制限エン
ドヌクレアーゼ１０単位を用いて切断する。この線状化
したプラスミドＤＮＡ／BamH Iをアガロースゲル（実施
例10ａ参照）からゲル溶出することによって単離し、
〔γ−32Ｐ〕（実施例１２参照）を用いて放射能標識す
る。次に、主要量のプラスミドＤＮＡ／BamH Iをこの放
射能標識したＤＮＡと混合し、EcoR II制限エンドヌク
レアーゼで消化し、EcoR II−BamH I＊ＤＮＡフラグメ
ント（122塩基対）を８％ポリアクリルアミド上でゲル
電気泳動によって分離する。250μｇのＦ２−ＤＮＡ／B
amH I＊／EcoR IIが単離される。
（ｃ）Ｆ１−ＤＮＡとＦ２−ＤＮＡとの連結および発現
プラスミドpML310の造成 実施例10ｃに既に記載の方法で、１０ｎｇ（＝473ｎモ
ルの末端）のＦ１−ＤＮＡ／EcoR I／EcoR IIおよび９
ｎｇ（＝495ｎモルの末端）のＦ２−ＤＮＡ／BamH I／E
coR IIを、２０μｌの容量中でＴ４ＤＮＡリガーゼで処
理する。次に、この混合物をフェノール／クロロホルム
で抽出し、そしてＤＮＡをアルコールで沈澱させる。次
いで、このＤＮＡ沈澱を実施例10ｃに記載のように溶解
させ、EcoR IおよびBamH I制限エンドヌクレアーゼで消
化させる。次いで、この溶液をＴＮＥで標準化して、３
０ｎｇ（＝５０ｎモルの末端）のベクターＤＮＡ pHRi
148／EcoR I／BamH I（実施例13ａＤ参照）を加える。
次に、この溶液をフェノール／クロロホルムで再度抽出
し、そしてＤＮＡをアルコールで沈澱させる。沈澱した
ＤＮＡ混合物を実施例10ｃに記載の方法でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ(Biolabs)で処理する。この方法で、インサート
としてＦ１−Ｆ２−ＤＮＡ（デスルファトヒルジン遺伝
子）を含む組み替えプラスミドが溶液中に生成する。
（ｄ）プラスミドpML310によるＥ．コリHB101の形質転
換 カルシウムで処理したＥ．コリHB101細胞の形質転換
を、実施例10ｄに記載の方法で行う。実施例13ｃで得ら
れた反応混合物１０μｌを用いる。420個のアンピシリ
ン耐性のコロニーが得られる。
（ｅ）Ｆ１−Ｆ２−ＤＮＡを含むコロニーのスクリーニ
ング １８個の形質転換されたコロニー（実施例13ｄ）を実施
例10ｅに記載の方法でＦ１−Ｆ２−ＤＮＡ含有について
検討する。実施例５および６において記載したオリゴデ
オキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとして用
いる。オートラジオグムにおいて、１２個のコロニーが
得られ、そのうちの５個をpML310、pML311、pML312、pM
L313およびpML314と命名する。
実施例14.クローンpML310の特性決定 Maxam及びGilbert（上記）にしたがってＦ１−Ｆ２−Ｄ
ＮＡを配列決定することによって、実施例１２に記載の
方法で組換プラスミドpML310に於けるＦ１−Ｆ２−ＤＮ
Ａ配列の特性決定を行う。１０μｇのＦ１−Ｆ２−ＤＮ
Ａを検討する。Ｆ１−Ｆ２−ＤＮＡのヌクレオチドの配
列は、合成デスルファトヒルジン遺伝子について記載さ
れた配列と同一である。
実施例15.酵母におけるデスルファトヒルジンＨＶ１の
発現 ヒルジンについて化学的に合成された遺伝子を、プラス
ミドpML310に於ける206bpEcoR I−BamH Iインサートと
して増幅する。この遺伝子をプラスミドから切除して、
制御可能なPH05プロモータの制御下に酵母において発現
せしめる。この造成物は、欧州特許出願第143,081号明
細書に記載のように、541bpPH05プロモータ配列および
完全なPH05シグナル配列（１７個のアミノ酸をコードす
る５１個のヌクレオチド）を含有する。この配列は、天
然の成熟ヒルジンのNH2−末端アミノ酸としてのバリン
のコドンから始まるヒルジンの成熟コード配列にインフ
レーム融合している。ヒルジン遺伝子は、その３′−末
端にPH05転写停止シグナルを提供するＤＮＡフラグメン
トを有する。この発現プラスミドのベクター部分は酵母
２μ配列、酵母における選択用酵母LEU２遺伝子および
Ｅ．コリにおける選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝
子およびＥ．コリの複製開始点を含む。方法は、第５、
６および７図に示す。
デスルファトヒルジン遺伝子の５′末端のヌクレオチド
配列の調整 デスルファトヒルジンをコードするヌクレオチド配列
は、最終の遺伝子生成物においては、NH2−末端バリン
のためのＧＴＴから始まる。Ｅ．コリにおけるサブクロ
ーン化および発現を好都合にするため、コード配列は
５′末端においてEcoR I制限部位およびＡＴＧ開始コド
ンを含む８個のヌクレオチドにより延長されている。ヒ
ルジンコード配列をPH05シグナルペプチドをコードする
配列に正確にインフレーム融合させるためには、これら
の追加のヌクレオチドを除去しなければならない。これ
は、EcoR I制限部位を平滑末端部位に変換し、Hga Iに
よるその後の切断がＧＴＴコドンの直ぐ上流に起こるよ
うな位置にHga I認識部位を含有する合成オリゴヌクレ
オチドを付加することによって達成される。
デスルファトヒルジン遺伝子の前のHga I認識部位の導
入（第５図参照） ８μｇのプラスミドpML310（実施例13c参照）を、制限
エンドヌクレアーゼEcoR Iで完全に消化する。ＤＮＡ
（pML310／EcoR I）をフェノール／クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱させる。ヌクレアーゼＳ１によっ
て、５′突出末端を除去する。４μｇのpML310／EcoR I
ＤＮＡを、100μｌの250ｍＭ NaCl，１ｍＭ ZnSO4，
３０ｍＭ酢酸ナトリウム(pH4.6)および２０単位／ｍｌ
のヌクレオチドＳ１(Sigma)中で、３７℃で４５分間消
化する。
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノ
ールを用いて沈澱させる。ＤＮＡ（pML310／EcoR I／Ｓ
１）を100μｌの５０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)に再分
散させ、２単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CIA
P、Boeringer)と共に３７℃で１時間インキュベートす
る。酵素を、６５℃で1.5時間インキュベートして不活
性化する。
培養混合物中のNaCl濃度を150ｍＭに調整する。デスル
ファトヒルジンＤＮＡ（pML310／EcoR I／Ｓ１／CIAP）
を、低塩緩衝液〔150ｍＭ NaCl，１０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃｌ(pH8.0)，１ｍＭ EDTA〕中でDE52(Whatman)イオン
交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝溶液〔1.
5Ｍ NaCl，１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)，１ｍＭ
EDTA〕を用いて溶出させる。ＤＮＡをエタノールで沈澱
させ、水に再分散させて0.8ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
次の式： ５′−AGCGTCGACGCT−３′ を有するオリゴヌクレオチドを、ホスホトリエステル法
［板倉ら、J.Am.Chem.Soc.、第103巻、706頁（1981
年）］によって合成する。オリゴヌクレオチドの配列は
制限エンドヌクレアーゼHga Iの認識部位−GACGC−を有
する自己相補性である。２本の単鎖をアニーリングする
ことにより、１２個の塩基対を有する２本鎖ＤＮＡリン
カーになる。
1.2μｇの合成の単鎖オリゴデオキシヌクレチオドを、
１０μｌの６０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，１０ｍＭ
MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，３０μCiの［γ−32p］ＡＴ
Ｐ（3000Ci・ｍＭ-1、Amersham）および６単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中で３７℃で３０
分間、次いで0.5ｍＭ ＡＴＰの存在下で３７℃で１５
分間リン酸化する。混合者を７５℃で１０分間更にイン
キュベートして酵素を不活性化して、次いで室温に冷却
してアニーリングする。0.6μｇ（170ｐモル）の32ｐで
標識したリンカーＤＮＡを2.4μｇ（1.75ｐモル末端）
のpML310／EcoR I／Ｓ１／CIAPと混合し、２０μｌの６
０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，１０ｍＭのMgCl2，５ｍ
Ｍ ＤＴＴ，3.5ｍＭ ＡＴＰ，800単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ(Biolabs)中で１５℃で２０時間連結する。リガ
ーゼを８５℃で１０分間で不活性化し、過剰のリンカー
分子を１０ｍＭ EDTA(pH7.5)，300ｍＭ酢酸ナトリウム
(pH6.0)および0.54容のイソプロパノールの存在でＤＮ
Ａを沈澱させることによって除去する。室温で３０分後
にＤＮＡをペレットにして、４５μｌの連結混合物（上
述）に再分散し、１５℃で６時間連結させて、環状のＤ
ＮＡを形成させる。
１μｌおよび３μｌの連結混合物を、100μｌのカルシ
ウム処理した形質転換コンピテントＥ．コリHB101細胞
［D.Hanahanの方法（J.Biol.Chem.、第166巻、557頁、1
983年）によって調製］に加える。細胞を氷上で３０分
間放置し、次いで４２℃で３分間インキュベートし、氷
上で２分間冷却した後、400μｌのＳＯＣ培地中で３７
℃で１時間インキュベートする。細胞をそれぞれ100μ
ｌに濃縮し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬ
Ｂ寒天平板に塗布する。
１２個の形質転換したampRコロニーを、それぞれ100μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で増殖させる。
プラスミドＤＮＡをD.S.Holmesらの方法［Anal.Bioche
m.、第114巻、193頁、1981年］にしたがって調製する。
合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は、プライマー
としてヒルジンのコード鎖にハイブリダイズする単鎖Ｄ
ＮＡフラグメントを用いるＤＮＡ配列決定によって確か
められる。ヒルジン遺伝子の前の正確な位置にリンカー
ＤＮＡを含有するクローンを、pML310Lと称する。
実施例１６．PH05シグナル配列とデスルファトヒルジン
構造遺伝子の融合 （ａ）0.2ｋｂデスルファトヒルジンフラグメントの単
離（第５図） １２μｇのプラスミドpML310Lを、制限エンドヌクレア
ーゼBamH Iを用いて完全に消化する。ＤＮＡをフェノー
ル／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈澱さ
せた後、２つの制限フラグメントをトリス−ホウ酸−ED
TA緩衝液(pH8.3)中1.2％アガロースゲル上で分離する。
臭化エチジウム染色した0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメ
ントをゲルスライス中で単離する。ＤＮＡを３ｍｌの0.
2×TBE緩衝液を満たした透析ベッドで電気溶出する。閉
じたバッグをＴＢＥ緩衝液(pH8.3)（９０ｍＭトリス−
塩基、９０ｍＭホウ酸、2.5ｍＭのEDTA）中に浸漬す
る。100ｍＡで３０分間電流を通じた後、電流の極性を
４５秒間反転させ、ＤＮＡを透析膜から剥離させる。透
析バッグのゲルスライスを取り巻く緩衝液を回収して、
150ｍＭ NaClに調整し、DE52(Whatman)イオン交換カラ
ムを通過させる。ＤＮＡを高塩緩衝液［1.5Ｍ NaCl，
１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH8.0)，１ｍＭ EDTA）を用
いて溶出させ、エタノールで沈澱させ、水に再溶解させ
て0.1ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
pML310Lの0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメントを、制限
エンドヌクレアーゼHga Iで更に消化する。この消化に
より、成熟デスルファトヒルジンの完全なコード配列を
含有する198kb Hga I−BamH Iフラグメントが生じる。
次のAlu Iによる消化では、198bp Hga I−BamH Iフラグ
メントには触れないが、同様な大きさのその他のHga I
フラグメントを除去する。
0.2kb Hga I−BamH IフラグメントはＴＢＥ緩衝液中1.5
％アガロースゲル上で他のフグメントから分離され、
（上記のように）電気溶出によって単離される。ＤＮＡ
はDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール沈
澱によって精製される。ＤＮＡを水に再分散して、３０
μｇ／ｍｌ（0.2ｐモル／μｌ）の濃度にする。
（ｂ）PH05シグナル配列の一部分を有するPH05プロモー
ター領域の単離 プラスミドp31／PH05−TPA18（欧州特許出願第143,081
号明細書参照）は、PH05プロモーターおよび外来構造遺
伝子（ｔ−ＰＡ）にインフレーム融合したPH05シグナル
配列を有する。584bp BamH I−Bal IフラグメントはPH0
5、および３′末端の８個のヌクレオチドを除くPH05シ
グナル配列の総てを含有する。
８μｇのp31／PH05−TPA18ＤＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼBal Iで消化する（３７℃で１６時間）。ＤＮＡを
フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱に
よって精製する。
ＤＮＡを水に再分散させ、0.7ｍｇ／ｍｌの濃度にす
る。PH05 シグナル配列とデスルファトヒルジンをコード領域
との間の正確な連結は、次の式： （１）５′−CCAATGCA−３′ （２）３′−GGTTACGTCAACA−５′ の合成リンカーによって行われる。
リンカー（５′−CCAATGCA）の５′末端の８個のヌクレ
オチドはBal I部位からプロセシング部位へのPH05シグ
ナル配列の一部分を表す。オリゴヌクレオチド（２）の
５′一の突出している５個のヌクレオチドは、デスルフ
ァトヒルジンコード配列の５′末端のHga I切断部位に
対合する。
個々の単鎖オリゴヌクレオチド（１）および（２）は、
ホスホトリエステル法（板倉ら、上記）によって合成さ
れる。オリゴヌクレオチド（１）および（２）のそれぞ
れ1.1μｇおよび1.8μｇを、実施例１５に記載のように
それらの５′未満でリン酸化し、等量を混合して、そし
てアニーリングする。
1.3μｇ（200pモル）のリン酸化した２本鎖リンカーＤ
ＮＡを、４０μｌの６０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)１
０ｍＭ MgCl2，3.5ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭ ＤＴＴおよ
び1400単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)中で７μｇ
（1.8ｐＭ）のBal I開裂p31／PH05−TPA18に、１５℃で
１６時間で連結する。リガーゼを、８５℃で１０分間不
活性化する。過剰のリンカーを、１０ｍＭEDTA，300ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム(pH6.0)および0.54容のイソプロパノ
ールの存在でＤＮＡを沈澱させることによって除去す
る。ＤＮＡを再分散して、制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで更に消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱させた後、２個の制限フラグ
メントをトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2％ア
ガロースゲル上に分離させる。ＤＮＡを電気溶出させ、
DE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール沈澱
によって更に精製する。0.6kbのBamH I−Hga 9ＤＮＡフ
ラグメントを水に再分散し、４０μｇ／ｍｌの濃度にす
る。
（ｃ）pJDB207酵母ベクターフラグメントの単離（第６
図） ９μｇのプラスミドpJDB207R／PH05−TRA（１２−２）
ＤＮＡ（欧州特許出願第143,081号明細書参照）を、制
限エンドヌクレアーゼBamH Iで消化する。完全に消化し
終わった後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡを５０ｍＭのト
リス・ＨＣｌ(pH8.0)に再分散し、そして0.1ｍｇ／ｍｌ
の濃度にして、７単位のウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼで３７℃で１時間消化する。ホスファターゼを６３℃
にて1.5時間で不活性化して、ＤＮＡをDE52イオン交換
クロマトグラフィ（実施例１３参照）およびエタノール
沈澱によって精製する。6.8kbの大きなBamH Iフラグメ
ントを、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2％ア
ガロースゲル上で分離する。ＤＮＡを、電気溶出し、そ
してDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール
沈澱によって精製する。ＤＮＡを水に溶解し、そして0.
4ｍｇ／ｍｌ（0.1ｐＭ／μｌ）の濃度にする。
（ｄ）PH05プロモータフラグメントおよびデスルファト
ヒルジン構造遺伝子のpJDB207酵母ベクターフラグメン
トへの連結（第６図） pJDB207酵母ベクター、PH05シグナル配列を有するPH05
プロモータフラグメント、およびデスルファトヒルジン
構造遺伝子は、総て連結されて発現プラスミドを形成す
るＤＮＡフラグメント（実施例16ａ〜ｃ参照）として単
離される。
ｐ31／PH05−TPA18の0.6kb BamH I−Hga Iフラグメント
0.3ｐモル、およびpML310Lの0.2kb Hga I−BamH Iフラ
グメント0.3ｐモルを、１０μｌの６０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃｌ(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，１ｍ
Ｍ ＡＴＰおよび400単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ中で、
0.1ｐモルのpJDB207R／PH05−TPA（１２−２）の6.8kb
BamH Iフラグメントに１５℃で２０時間連結させる。
連結混合物１μｌを、Hanahan（上記）により調製した
形質転換可能なＥ．コリHB101細胞100μｌに加える。形
質転換の処理法も、上記文献から採用する。細胞を、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板状に塗
布する。
２４個のampRコロニーを、別々に100μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを有するＬＢ培地で増殖させる。プラスミドＤ
ＮＡを、制限エンドヌクレアーゼPst Iで切断すること
によって、インサートの大きさおよび方向について分析
する。インサートの正確な方向を有する単一クローン
を、pJDB207／PH05−HIRと称する。
実施例１７．サッカロミセス・セレビシエー株GRF18の
形質転換 プラスミドpHDB207／PH05−HIRを、Hinnenら（上記）に
より記載された形質転換法を用いて、サッカロミセス・
セレビシエー株GRF18（α，his３−11，his３−15，leu
２−３，leu２−112，canR）に導入する。５μｇのプラ
スミドＤＮＡを100μｌのスフェロプラスト懸濁液に加
え、この混合物をポリエチレングリコールで処理する。
スフェロプラストを１０ｍｌの再生寒天と混合して、ロ
イシンを欠く酵母最少培地平板上に塗布する。
形質転換した単一酵母コロニーを取り出し、そしてロイ
シンを欠く酵母最少培地中で増殖させる。このコロニー
を、サッカロミセス・セレビシエーGRF18／pJDB207／PH
05−HIRと称する。
実施例１８．Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207／PH05−
HIRの培養 Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207／PH05−HIRの細胞
を、２０ｍｌの酵母最少培地（Difco Yeast Nitrogenベ
ース、２％グルコースおよび２０ｍｇ／のＬ−ヒスチ
ジンを添加し、アミノ酸なし）中で３０℃で攪拌し、細
胞密度３×１０７個／ｍｌまで培養する。細胞を0.9％N
aClで洗浄した後、低Ｐｉ−最少培地中に５０ｍｌ培養
液を接種するのに用いる。低Ｐｉ−最低培地は、Difco
Yeast Nitrogen Base培地（アミノ酸なし）の組成に対
応して調製されるが、(NH4)2SO4、２％のグルコースお
よび１ｇ／のＬ−ヒスチジンの代わりに0.03ｇ／の
KH2PO4、１ｇ／のＫＣｌおよび１０ｇ／のＬ−アス
パラギンを含む。培養液を４×１０６個／ｍｌの細胞密
度まで接種して、３０℃で200ｒｐｍで４２時間まで攪
拌する。
実施例１９．Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207／PH05−
HIRからのデスルファトヒルジン化合物の単離 （ａ）培養液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 Ａ．RP−C18カラム上でのヒルジン化合物の濃縮 それぞれ１８時間、２６時間および４２時間の醗酵時間
の後に、それぞれ１０ｍｌの１０個の試料を培養液から
採取して、脱塩およびBond Elut Ｃ−18カラム（（１
ｍｌ、Analytichem International）上での濃縮により
富化する。試料をカラムに入れ、そして液体を真空で除
去した後、カラムを1.5ｍｌの水−アセトニトリル
（９：１）−0.1％トリフルオロ酢酸（９：１）で２回
洗浄する。ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニト
リル−0.1％トリフルオロ酢酸（６：４）で溶出する。
２ｍｌの溶出液を、Speed Vac濃縮機(Savant)で400μｌ
の最終濃度まで濃縮する。ヒルジン化合物をHPLC分析で
標準デスルファトヒルジンと比較することにより、及び
トロンビン阻害測定法により同定する。試料には、約0.
2〜２μｇ／ｍｌのヒルジン化合物が含まれる。
Ｂ．ＤＥＡＥセルロースカラム上でのイオン交換クロマ
トグラフィ ４２時間の醗酵時間の後に１リットルの培養液を回収
し、そして遠心分離する。上澄液を、pH7.5で、DE53セ
ルロース(Whatman)のアニオン交換カラムに入れる。
［条件：カラム2.5×15.5cm（７６ｍｌ）；溶出緩衝液
Ａ：２０ｍＭ酢酸アンモニウム、100ｍＭ NaCl(pH7.
5)；溶出緩衝液Ｂ：２０ｍＭ酢酸アンモニウム、４Ｍ
NaCl(pH5.0)；流速：６６ｍｌ／時間］。カラムを228ｍ
ｌ緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂのそ
れぞれ228ｍｌの線形塩勾配で溶出する。２２ｍｌずつ
の画分を集める。ヒルジン化合物は、分画71〜74（８８
ｍｌ）に溶出し、トロンビン阻害分析法によって同定す
る。活性な画分を、一晩４℃で２０ｍＭ酢酸アンモニウ
ムに対して透析する。次いで、透析物を、２回凍結乾燥
する。凍結乾燥生成物は、逆相HPLCによれば、デスルフ
ァトヒルジン化合物を含む。
Ｃ．Sephadex Ｇ−50上でのゲル濾過およびHPLCによる
最終的精製 トロンビン阻害試験で活性な主分画（８０ｍｌの溶出
液）を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム(pH7.5)に対して４
℃で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレーター
を用いて３５℃で濃縮して、最終容積を５ｍｌとする。
得られる透明な水溶液を、ベッド容積が160ｍｌのSepha
dex Ｇ−50精密カラム(Pharmacia)であって、カラム
（2.5×64cm、Biorad）を５％酢酸で予備平衡化させて
おいたものに加える。５０ｍｌの溶出液（分画５〜７、
流量５０ｍｌ／時間、２５分／分画）に含まれる主活性
成分をロータリー・エバポレーターを用いて濃縮して、
次いで逆相HPLC分離を行う。各分画の一部分（500μ
ｌ）を、「Speed vac」濃縮機(Savant)を用いて１０分
の１に濃縮して、逆相HPLCによってそのデスルファトヒ
ルジン化合物の含量を分析する。溶液は、デスルファト
ヒルジン化合物を含む。分画６（１８ｍｌ）は極めて少
量の第二の成分を含み、半調製用逆相HPLCによって更に
精製する。
実験条件：Vydac 218TP510RP−HPLCカラム、10×250m
m；分離毎の分画６の一部（200μｌ、１：１０に濃
縮）；220ｎｍで0.5以下(AUFS)；流速：２ｍｌ／分；溶
出液：Ａ：0.1％トリフルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリ
ル／水（８：２）＋0.07％トリフルオロ酢酸、１分間１
６％のＢ、次いで４０分間に６４％のＢまで増加。得ら
れる画分を水で１：１に希釈して、凍結乾燥する。残渣
は、純粋なデスルファトヒルジン化合物から成る。
（ｂ）Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207／PH05−HIRの
細胞抽出液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 細胞は、常法に従い破壊する（欧州特許出願第100,561
号明細書参照）。２％酢酸で処理した上澄液を遠心分離
する（12,000rpm、10℃）。アンモニアを加えて最終pH
を7.5として、僅かに不透明な溶液（５０ｍｌ）を更に
上記の様に処理する（実施例19ａ）。ヒルジン化合物は
上記のようにして、すなわちトロンビン阻害法および逆
相HPLCによって同定する。
実施例２０ Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207／PH05−
HIRの醗酵からの生成混合物の分析 （ａ）上記のように（実施例19ｂ参照）調製した上澄液
２ｍｌを、高真空下で「Speed Vac」濃縮機上で乾燥す
る。試料をそれぞれ100μｌの水に溶解し、HPLC分析を
行う（実験条件１、下記を参照されたい）。個々の画分
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が16.5分および
17.7分の画分が、トロンビン阻害を示す。これらの２分
画の比率（発現収率）は、約４：１である。アミノ酸組
成によれば、これらの画分はデスルファトヒルジンであ
る。
（ｂ）トロンビン阻害試験で活性である、実施例19ａに
記載の方法で得られる分画を、異なる２種類の条件下で
HPLC分析にかける。
実験条件１：ヌクレオシル（ＭＮ）Ｃ18,5μｍRP−HPLC
カラム、4.6×120mm：５０μｌヒルジン化合物／分離、
214ｎｍでatt.６；流速1.2ｍｌ／分；溶出液：Ａ：0.1
％トリフルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリル／水（８：
２）＋0.08％トリフルオロ酢酸、２分間は１６％のＢ、
次いで５０分間を要して６４％のＢへの増加。逆圧：６
６バール。
実験条件２：２分間２０％のＢで、それ以後４０分間を
要して８０％のＢへ増加する勾配であることを除いて、
上記と同じ条件。
分画は１分間の間隔で採取し（全部で４５）、そしてト
ロンビン阻害試験を行う。画分17〜19は、活性である。
更に、アミノ酸組成、Ｎ−末端基およびＮ−末端配列
を、画分１７および１８の活性なヒルジン化合物につい
て決定する。一つの画分（第１７）は、更に、ヒルから
の天然のヒルジンを酵素アリールスルファターゼと反応
させることによって得られる標準のデスルファトヒルジ
ンと比較する。これらの結果を、以下の表１にまとめ
る。
分画１７および１８の収量の比率は、約４：１である。
（ｃ）上記（実施例19ａ参照）と同様に調製した上澄液
200ｍｌについて、HPLC分析（条件３、以下を参照）お
よびFPLC分離（条件４）を行う。個々の分画のトロンビ
ン阻害を試験する。保持時間が8.0分（ピーク１）、11.
1分（ピーク２）および12.1分（ピーク３）である分画
は、強力なトロンビン阻害を示す。これらの３種類の化
合物の比率（発現収率）は、約１：４：１である。HPLC
分析によれば、ピーク２および３に対応する化合物は実
施例20ｂ（分画１７および１８）に記載したヒルジン化
合物と同一である。結果を表２に示す。
実験条件３：Vydac 218TP−B5RP−HPLCカラム、4.0×12
0mm、１５μｇのヒルジン化合物／分離、214ｎｍでatt.
７、流速1.2ｍｌ／分；溶出液：Ａ：0.1％トリフルオロ
酢酸、Ｂ：アセトニトリル＋0.08％トリフルオロ酢酸、
２分間は１６％のＢ、次いで２０分間を要して４０％の
Ｂへ増加。逆圧：８０バール。
実験条件４：Pharmacia MonoQ FPLCアニオン交換カラ
ム、5.0×50mm、１５μｇヒルジン化合物／分離、280ｎ
ｍでAUFS0.01、流速1.0ｍｌ／分、勾配溶出緩衝液Ａ：
２０ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH7.5)、緩衝液Ｂ：緩衝液
Ａ＋１ＭのNaCl(pH7.5)、９分間は１５％のＢで、次い
で２１分間を要して７０％のＢに増加。
実施例２１．Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207／PH05−
HIR株の醗酵からのデスルファトヒルジン化合物の特性
決定 HPLC分析によれば、培地（実施例２０、表１および２参
照）から単離される分画１７（またはピーク）および１
８（またはピーク２）のヒルジン化合物は、細胞抽出液
から単離された対応する化合物（細胞内ヒルジン化合
物）と同じである。これらの化合物およびピーク３（表
２を参照）は、次のようにして特性決定する。
ａ．アミノ酸組成の決定 約2.5μｇの純粋なヒルジン化合物を、６ＮのＨＣｌを
用いて110℃で２４時間加水分解し、次いでChangらの記
載の方法［DABS−Cl法；Method in Enzymology、第９１
巻、４１頁、（1983年）］と同様にして分析する。加水
分解物は、次のような組成を有する。
（ｂ）部分配列の分析 １８μｇ（2.5ｎＭ）の純粋なヒルジン化合物を、Edman
の方法による通常の配列分析を行い、Ｎ−末端フェニル
チオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸をRP−HPLCによ
って決定する。
結果 ピーク１（表２を参照されたい） 上記のサイクル１からサイクル２９までの配列。
ピーク３（分画１８、表１および２を参照されたい） 上記のサイクル１からサイクル２７までの配列。
したがって、検討した生合成ヒルジン化合物のＮ−末端
配列は、標準（真正）試料の配列と同じである。
Ｃ．Ｃ−末端分析 ヒルジン化合物をカルボキシペプチダーゼＹで消化し、
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する（J.Y.
Chang、R.Knedel、及びD.G.Braun、Biochem.J.、第199
巻、547頁を参照されたい）。
結果 ピーク１（表２を参照） Ｃ−末端アミノ酸：−Glu−Tyr、 ピーク２（分画１７、表１および２参照） Ｃ−末端アミノ酸：−Glu−Tyr−Leu−Gln、 ピーク３（分画１８、表１および２参照） Ｃ−末端アミノ酸：−Glu−Tyr−Leu。
（ｄ）見掛けの分子量 デスルファトヒルジン化合物（３０μｇ）を、ＳＤＳ尿
素ゲル上で分析する［SUDSゲル、Kyteら、Anal.Bioche
m.、第133巻、515頁、（1983年）参照］。クマシーブル
ー染色の前に、１２％のトリフルオロ酢酸で固定を行
う。見掛けの分子量が6000〜7000ダルトンに相当する単
一バンドが観察される。
（ｅ）FAB−MSによる分子量決定 デスルファトヒルジン化合物を、迅速原子衝撃陽イオン
マススペクトル分析法（FAB−MS）に付す。分析機器：Z
AB−HBマススペクトル分析計（VG−Analytical Ltd.、
マンチェスター）、マトリックス：チオグリセロール・
キセノン衝撃；イオンエネルギー； 10KeV、外部標準：Cs26J25（分子量：6887.9）およびCs
28J27(7147.76)。
結果 ピーク１（表２参照） 実験式：C276H421N77O107S6 分子量（計算値）：6722.23 分子量（実測値）：6719.3。
ピーク２（分画１７、表１および２参照） 実験式：C287H440N80O110S6 分子量（計算値）：6963.518 分子量（実測値）：6963.44 分子量は２つの異なる測定値の平均である。
ピーク２（分画１８、表１および２参照） 実験式：C282H432N78O108S6 分子量（計算値）：6835.39 分子量（実測値）：6832.9。
上記のデーターに基づき、ピーク１の化合物はデスルフ
ァトヒルジン（１−63）であり、ピーク２の化合物は標
準デスルファトヒルジン（１−65）と同一であり、ピー
ク３の化合物は新規なデスルファトヒルジン（１−64）
である。
（ｆ）ヒト・トロンビン−ヒルジン解離定数 ヒト・トロンビン−デスルファトヒルジン複合体の解離
定数ＫＤは、S.R.Stone及びJ.Hofsteengeの方法［Bioch
emistry、第２５巻、4622〜4628頁、（1986年）］にし
たがって決定され、下記の表にまとめてある。表には、
３種類の得られたデスルファトヒルジン化合物の比活性
（ＡＴＵ／ｍｇで表した）も示している。
（ｇ）形質転換した酵母から得られるその他のデスルフ
ァトヒルジン化合物 実施例１９に記載の方法で醗酵を行い、精製したデスル
ファトヒルジン化合物の混合物を、更に分離して、詳細
に特性決定する。
Vydac 218 TP 510 RP−HPLCカラム上で、半調製的分離
を行うと、上記デスルファトヒルジン化合物（実施例21
ｅ参照）の他に、保持時間が8.1分でカラムから溶出す
るデスルファトヒルジン様化合物が生じる。
この物質は迅速原子衝撃マススペクトル分析法（FAB−M
S）およびアミノ酸分析、部分配列決定法およびＣ−末
端分析によって特性決定される。
FAB−MSは、この物質が、分子量がそれぞれ6429.5およ
び6556.8である２種類の化合物の混合物であることを示
している。
アミノ酸組成は、次のようである。
これらのデーターによれば、この混合物は、デスルファ
トヒルジン（１−６１）とデスルファトヒルジン（１−
６２）とから成る。
実施例２２．シグナル配列のないデスルファトヒルジン
遺伝子を有する酵母におけるデスルファトヒルジン化合
物の発現（第７図） （ａ）pJDB207ベクターフラグメントの単離 ６μｇのプラスミドpJDB207R−IF（α−３）（EP 100,5
61)を、制限エンドヌクレアーゼBamH Iを用いて完全に
消化する。生成するＤＮＡフラグメント（6.85Ｋｂおよ
び1.15ｋｂ）をエタノールで沈澱させ、400μｌの５０
ｍＭのトリス・ＨＣｌ(pH8.0)中で処理する。4.5単位の
ウシ腸ホスファターゼ（Boehringer、マンハイム）を加
える。混合物を３７℃で１時間インキュベーションした
後、ホスファターゼを６５℃で1.5時間で不活性化す
る。溶液を150ｍＭ NaClに調整した後、１０ｍＭトリ
ス・ＨＣｌ(pH7.5)、150ｍＭ NaClおよび１ｍＭ EDTA
で予め平衡にしておいたDE52(Whatman)アニオン交換カ
ラム（100μｌ容量）に適用する。同じ緩衝液で洗浄操
作を行った後、ＤＮＡを400μｌの1.5Ｍ NaCl，１０ｍ
Ｍトリス・ＨＣｌ(pH7.5)、１ｍＭ EDTAで溶出させ、
エタノールで沈澱させる。6.85ｋｂの大きなBamH Iフラ
グメントが、トリス・ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2
％アガロースゲル上で小さなフラグメントから分離され
る。
（ｂ）534bp PH05プロモーターフラグメントの単離 ６μｇのプラスミドｐ31／Ｒ(EP100,561)を、制限エン
ドヌクレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化する。生成す
る３種のＤＮＡフラグメントを、トリス−ホウ酸−EDTA
緩衝液(pH8.3)中1.2％アガロースゲル上で分離する。53
4bp BamH I−EcoR Iフラグメントが単離される。このフ
ラグメントは、転写開始部位を有するPH05プロモーター
を含んでいる。
（ｃ）デスルファトヒルジンをコードする配列を有する
206bp DNAフラグメントの単離 ９μｇのプラスミドpML310（実施例13ｃ参照）を、制限
酵素BamH IおよびEcoR Iで完全に消化する。生成する２
種類のＤＮＡフラグメントを、トリス−ホウ酸−EDTA緩
衝液(pH8.3)中1.2％アガロースゲル上で分離する。206b
p EcoR I−BamH Iフラグメントが、単離される。
（ｄ）ＤＮＡフラグメントの連結 第ａ〜ｃ項で述べた３種類のＤＮＡフラグメント（上記
参照）を、電気溶出によってアガロースゲルから得、DE
52(Whatman)アニオン交換体上で精製し、エタノールで
沈澱し、水に再分散する。
0.1ｐモル（0.45μｇ）の6.85kb BamH Iベクターフラグ
メント、0.3ｐモル（0.1μｇ）の534bp BamH I−EcoR I
PH05プロモーターフラグメントおよび0.25ｐモル（３
４ｎｇ）のpML310の206bp EcoR I−BamH Iフラグメント
を、１５μｌの６０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，１０
ｍＭ MgCl2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＴおよ
び600単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)中で１５℃で
１６時間連結させる。
２４個の形質転換したampRコロニーを、100μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含むＬＢ培地中で別々に培養する。プ
ラスミドＤＮＡをHolmesら（上記）の方法によって単離
し、Hind III−EcoR I二重消化によって分析する。約60
0bpの大きなEcoR I−Hind IIIフラグメントの出現は、
関連するクローンではPH05プロモーター−ヒルジンＤＮ
Ａフラグメントがベクター上に転写停止シグナルに対し
て正確な方向にあることを示している。予想されるよう
に、約５０％のクローンはインサートの正確な方向を有
する。これらのクローンの一つをpJDB207R／PH05−HIR
と命名する。
（ｅ）サッカロミセス・セレビシエーGRF18の形質転換 サッカロミセス・セレビシエーGRF18の株（α，his3−1
1，his3−15，leu2−３，leu2−112，canR）を、Hinnen
ら（上記）の方法にしたがってプラスミドpJDB207R／PH
05−HIRを用いて形質転換する。形質転換された酵母細
胞の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天
平板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離さ
れ、サッカロミセス・セレビシエーGRF18／pJDB207R／P
H05−HIRと命名する。
（ｆ）Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207R／PH05−HIRの
培養 Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207R／PH05−HIRの細胞
を、２０ｍｌの酵母最低培地（Difco Yeast Nitrogen培
養基、アミノ酸なし、２％グルコースおよび２０ｍｇ／
のＬ−ヒスチジンを添加）中で３０℃で攪拌し、細胞
密度が３×107個／ｍｌになるまで培養する。細胞を0.9
％NaClで洗浄し、次いで低Ｐｉ−最低培地中に５０ｍｌ
の培養液を接種するのに用いる。低Ｐｉ−最低培地は、
Difco Yeast Nitrogen Base培地（アミノ酸なし）の組
成に対応して調製されるが、(NH4)2SO4、２％グルコー
スおよび１ｇ／のＬ−ヒスチジンの代わりに0.03ｇ／
のKH2PO4、１ｇ／のＫＣｌ、および１０ｇ／のＬ
−アスパラギンを含む。培養液を接種して細胞密度を４
×106個／ｍｌとし、３０℃で４２時間200rpmで攪拌す
る。
（ｇ）Ｓ．セレビシエーGRF18／pJDB207R／PH05−HIRの
醗酵からの生成混合物の分析 細胞（実施例22ｆ参照）を、通常の方法にしたがって破
壊する（例えば、欧州特許出願第100,561号明細書参
照）。1.5％酢酸で処理した上澄液を遠心分離し、そし
てそれぞれ２ｍｌの透明な溶液を「Speed Vac」濃縮機
上で高真空で乾燥する。試料をそれぞれ100μｌの水に
溶解して、HPLC分析を行う（条件は実施例２０と同
じ）。それぞれの分画のトロンビン阻害を試験する。保
持時間が16.5分の分画がトロンビン阻害活性を有する。
アミノ酸組成によれば、この分画はデスルファトヒルジ
ンである。HPLC分析によれば、この力価は約１０μｇ／
リットルである。培地には、ヒルジン活性は検出されな
い。
付帯のシグナル配列を持たないかまたは有するデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を担持する酵母株から得られる細胞
内および細胞外ヒルジン活性の収量を、表３にまとめて
ある。ヒルジン活性はトロンビン阻害法によって測定す
る。
実施例２３．PH05プロモーター欠落体の造成 （ａ）Bal31消化 第８図に示されるPH05のBamH I−Sal Iフラグメントを
含有する組換ファージM13mp9／PH05 Bam−Salを、PH05
プロモーター源として用いる（欧州特許出願第143,081
号明細書参照）。
２０μｇのファージＤＮＡ（ＲＦ：複製形）を制限エン
ドヌクレアーゼSal Iで消化して、約９ｋｂの線状ＤＮ
Ａを生成せしめる。フェノール／クロロホルムで抽出の
後、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡを、１
０ｍＭのトリス(pH8.0)に再分散させて、濃度を0.5μｇ
／ｍｌとする。１６μｇのSal I開裂したＤＮＡを、100
μｌの２０ｍＭトリス(pH8.0)、199ｍＭ NaCl，１２ｍ
Ｍ MgCl2，１２ｍＭ CaCl2および１ｍＭのEDTA中で２
単位のエキソヌクレアーゼBal31（ＢＲＬ）で消化す
る。３０℃で１、２、３、４、５および６分間インキュ
ベートした後に２μｇずつのＤＮＡを採取して、直ちに
５０μｌのフェノールおよび６０μｌのＴＮＥと混合す
る。フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱した後、ＤＮＡを100μｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭの
トリス(pH8.0)に再分散する。Bal31によるエンドヌクレ
アーゼ切断の程度を分析するため、それぞれの時間に採
取した0.5μｇずつのＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消
化して、トリス−ホウ酸緩衝液(pH8.3)〔９０ｍＭトリ
ス・ＨＣｌ(pH8.3)，９０ｍホウ酸、2.5ｍＭ EDTA〕
中、1.5％アガロースゲル上で分析する。
（ｂ）Bal31で処理したＤＮＡへのEcoR Iリンカーの付
加 ２個のA260単位のEcoR Iリンカー（５−GGAATTCC−３）
を、250μｌの１０ｍＭトリス(pH8)および１ｍＭ EDTA
に再分散する。２μｇのEcoR Iリンカーを７５μｌの６
０ｍＭのトリス(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2、１５ｍＭ
ＤＤＤＴ，１０μＭ ＡＴＰおよび３３単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理す
る。３７℃で１時間後に、混合物を室温に冷却して、次
いで−２０℃で貯蔵する。
アニールした２本鎖EcoR Iリンカーを、それらの平滑端
により、Bal31で処理したＤＮＡフラグメントに連結す
る。0.5μｇのBal31で処理したＤＮＡ（実施例23ａ参
照）を、２０μｌの６０ｍＭトリス(pH7.5)，１０ｍＭ
MgCl2，１０ｍＭ ＤＤＴ、４ｍＭ ＡＴＰおよび600
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)中で、５０倍過剰
量のキナーゼ処理したEcoR Iリンカーと共に室温で１６
時間インキュベートする。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを不活性
化した後（６５℃、１０分間）、過剰のEcoR Iリンカー
を、５０μｌの容量中でEcoR I(Boehringer)５０単位で
切断する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し
て、エタノールで沈澱させ、１０ｍＭトリスおよび１ｍ
Ｍ EDTA（＝TE）中に再分散する。次いで、ＤＮＡを５
単位のBamH I(Biolabs)で切断し、混合物を1.5％の低融
点アガロースゲル(Sigma)トリス−ホウ酸緩衝液（上記
参照）に適用する。バンドを臭化エチジウムで染色し、
366ｎｍの長波長紫外線下で可視化する。約100bp〜600p
bの幅広い拡散バンドパターンをゲルから切り取り、Ｄ
ＮＡを次のようにして抽出する。すなわち、アガロース
の切片を６５℃で液化し、そして500 ｍＭNaClに調整
し、そして６５℃で２０分間インキュベートする。１容
のフェノール〔１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，１ｍ
Ｍ EDTAおよび500ｍＭ NaClで平衡にしたもの〕を加
える。水相をフェノールで２回再抽出し、クロロホルム
で１回抽出する。ＤＮＡを2.5容の冷無水エタノールで
沈澱させ、遠心分離によって集める。ＤＮＡのペレット
を冷８０％エタノールで洗浄し、次いで真空で乾燥す
る。ＤＮＡを１０μｌのＴＥに再分散する。
（ｃ）M13p9中への連結 ３μｇのM13mp9のＲＦを、５０μｌの容積中、１５単位
のEcoR I(Biolabs)および１５単位の、BamH I(Boehring
er)を用いて消化する。フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱の後、ＤＮＡを５０μｌのＴＥに再分散する。５
μｌの切断されたベクターＤＮＡ（約200ｎｇ）を１０
μｌの上記試料（実施例23ｂに記載の方法で各種のBal3
1消化物から得られるＤＮＡフラグメント）と混合し
て、６０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，６ｍＭ MgCl2，
１０ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰおよび200単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼの存在で総量２０μｌ中で１５時間リ
ガーゼ処理する。Ｅ．コリJM101株のコンピテント細胞
の形質導入は、New England Biolabs発行のマニュアル
「Ｍ１３ cloning and sequencing system」に準じて
行う。多数の白色プラークからのファージを増殖させ、
制限酵素EcoR IおよびBamH Iで切断することによって、
ＤＮＡインサートの大きさを分析する。
（ｄ）Sanger配列決定法によるBal31欠失末端の決定（S
al I部位からの欠失） 配列決定は、上記のマニュアルに記載のようにSangerら
のジデオキシＤＮＡ配列決定方式［Proc.Natl.Acad.Sc
i.、米国、第７４巻、5463頁（1977年）］を用いて行
う。欠失末端部を、以下に示す。
（ｅ）Sanger配列決定法によるBal31欠失末端の決定（B
amH1部位からの欠失） M13mp9 PH05 Bam−SalをBamH Iによって切断することを
除いて、同様なセットのBal31欠失を、前記（ａ）〜
（ｃ）に記載したのと同様に行う。Bal31で消化された
分子を、EcoR IおよびSal Iによって切断し、生成した
フラグメントをEcoR IおよびSal Iで消化したM13mp9中
にクローン化する。欠失末端点を、以下に示す。
（ｆ）内部PH05プロモータ欠失の構成 （ｄ）に記載のBal31欠失セットはEcoR Iで終わる「左
腕」PH05プロモーターフラグメントを生成し、（ｅ）に
記載のBal31欠失セットはEcoR Iで終わる「右腕」PH05
プロモーターフラグメントを生成する。各種位置の「左
腕」と「右腕」を組み合わせることにより、欠失したＤ
ＮＡの位置にEcoR Iリンカーセグメントを含む内部欠失
が生成される。それぞれの内部欠失は、制限エンドヌク
レアーゼEcoR IおよびBamH I（左腕）、またはEcoR Iお
よびSal I（右腕）によってM13mp9から「左腕」および
「右腕」を切断し、（ｂ）に記載したのと同様にソフト
アガロース電気泳動法により対応するフラグメントを単
離することによって構成される。等モル量の「左腕」、
「右腕」、および200ｎｇのBamH IおよびSal I消化した
M13mp9ベクターＤＮＡを（ｃ）に記載したのと同様に連
結する。Ｅ．コリJM101に形質導入した後、白色プラグ
を採取して、ＲＦを生成させて、制限分析（BamH I、Sa
l I、EcoR I）によって分析する。次の腕を組み合わせ
て、（ヌクレオチドの番号に対する、第８図参照）特異
的内部欠失を形成する。
（ｇ）PH05プロモータの内部欠失の生体内分析 野生型のPH05 Bam−Salフラグメントを欠失した対応物
に置き換えることによって、実施例２３（ｆ）に記載の
各種欠失を、プラスミドpJDB207／PH05［R.Haguenauer
−Tsapis及びA.HinnenのMoleculer and Cellular Biolo
gy、第４巻、2668〜1675頁（1984年）］中にクローン化
する。酵母Ｓ．セレビシエAH216株を形質転換した後
（欧州特許出願第143,081号明細書参照）、酸性ホスフ
ァターゼ活性をToh−ｅらにより記載された方法［J.Bac
teriol.、第113巻、727頁、（1973年）］によって決定
する。欠失△１１および△１２は、PH05活性の約１０分
の１への低下を示し、PH05発現に本質的な上流領域
（「上流活性化部位」、ＵＡＳ）を定義してる。同様な
低下効果は、欠失△１７（約５分の１へ低下）およびTA
TAボックス欠失△23〜△26（約３０分の１へ低下）で観
察される。総てのその他の欠失は、ほぼ野生株の水準の
活性を示す。これらの結果は、PH05の発現に本質的な情
報の３種類の部分は次の位置に配置されていることを示
唆する。
１．−349〜−383の位置(UAS1)、 ２．−225〜−263の位置(UAS2)、 ３．−87〜−125の位置（TATAボックス）。PH05 のUAS1またはUAS2またはUAS1およびUAS2を含むＤＮ
Ａフラグメントは、組換ファージM13mp9／PH05 Bam−Sa
l（上記参照）から適当な制限エンドヌクレアーゼで切
断することによって生成させることができる。UAS1は、
次の式： を有する268bp BamH I−Cla Iフラグメントに含まれ
る。
UAS2は、次の式： を有する100bp Cla I−BstE IIフラグメントに含まれ、
そしてUAS1およびUAS2は共に、次の式： を有する368bp BamH I−BstE IIフラグメントに存在す
る。
実施例２４．融合したPH05−GAPDHハイブリッドプロモ
ーターの制御下でのデスルファトヒルジンの発現 実施例２３は、PH05遺伝子の位置−365付近の領域［UAS
1(PH05)］、および位置−180付近のもう一つの領域［UA
S2(PH05)］を、調節機能を有するＵＡＳの可能な候補と
する。UAS1(PH05)は、268bp BamH I−Cla Iフラグメン
トに含まれ、他方UAS1(PH05)およびUAS2(PH05)は共に36
8bp BamH I−BstE IIフラグメントに含まれる。これら
の２種類のフラグメントはそれぞれ、TATAボックスおよ
びGAPDHの転写開始部位を含む２種類の異なるGAPDH下流
のプロモーター要素に融合する。
（ａ）酵母遺伝子ライブラリーの構成 野生型サッカロミセス・セレビシエーS228C株から得ら
れる総量が３０μｇの高分子量酵母ＤＮＡ［M.V.Olsen
ら、J.Mol.Biol.、第132巻、387頁（1979年）］を、２
単位のEcoR Iメチラーゼ(New England Biolabs)を用い
て、供給業者が勧める方法に従って、250μｌのEcoR1 u
チル化緩衝液中で３７℃で３０分間インキュベートす
る。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、500μｌの２５ｍ
Ｍトリス・ＨＣｌ(pH8.5)，2.5ｍＭ MgCl2（EcoR I＊
緩衝液）［H.Meyer、FEBS Lett.、第９０巻、341頁（197
9年）］に再分散し、そしてEcoR I(Boehringer)で消化
して、ＤＮＡフラグメントの分布が30〜50ｋｂの範囲に
最大値を有するようにする（λＤＮＡのXho I消化は適
当な３３ｋｂおよび１７ｋｂマーカーを提供する）。Ec
oR I＊条件下で消化される酵母ＤＮＡはシュークロース
勾配〔５〜２０％シュークロース／１０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃｌ(pH7.5)および１ｍＭ EDTA〕で、SW40ローター中
で38,000ｒｐｍにて６時間サイズ分画する。0.4ｍｌず
つの３０個の分画を、勾配の上部から集める。分画１６
は、大きさが30〜40ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。
この分画のＤＮＡ（３μｇ）をエタノールで沈澱させ、
EcoR Iで線状化された１μｇのコスミドベクターpYcl
［B.Hohnら、「Genetic Engineering」、第２巻、169
頁、ニューヨーク、1980年］に、合計容量１５μｌ中
で、１５℃で１６時間連結させる。連結は、300単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を用いて、
業者により記載されている緩衝液系を使用して行う。Ｄ
ＮＡを生体外でバクテリオファージλ［B.Hohn、「Meth
ods in Enzymology」、第６８巻、299頁、ニューヨー
ク、1979年］にパッケージし、そして集成されたファー
ジを用いてＥ．コリHB101株を形質導入する（r K -、
m K -、leu -、pro -、recA）。形質導入の効率は、１μｇ
のpYclベクター当たり約5000個のアンピシリン耐性コロ
ニーである。3000個のampRコロニーを採取し、そして10
0μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地［１０ｇのB
acto−Tryptone(Difco)、５ｇのBacto Yeast Extract(D
ifco)および１０ｇのNaCl］中でマイクロタイター・デ
ィッシュのウェルでそれぞれ増殖させる。
（ｂ）酵母GAPDH遺伝子の単離 上記の遺伝子ライブラリーを、次の構造： ５′-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-３′ を有する合成オリゴヌクレオチド［ホスホトリエステル
法を用いて調製：K.Itakuraら、Recl.Trav.Chim.、Pays-
Bas 、98,537(1979)］によりスクリーニングする。１０μ
ｇのオリゴヌクレオチドを、Maniatisらにより記載され
た方法［「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor
Lab.、1982年、125頁］により、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(Boehringer)と共に１０μｌのγ−32Ｐ−ＡＴＰ
（3000Ci／ｍＭ、１０μCi／μｌ Amersham）を用いて
全容積５０μｌ中ででキナーゼ処理をする。コロニーハ
イブリダイゼーションは、上記文献（312頁）に記載の
方法で行う。Kodak Ｋ−５Ｘ線フィルムを用いるオー
トラジオグラフィにより、陽性クローンを検出する。プ
ラスミドＤＮＡを単離して、GAPDHをコードする2100bp
Hind IIIフラグメントを含むハイブリッドクローンを得
る［J.P.Hollandら、J.Biol.Chem. 254,9839(1979)］。
クローン化されたＤＮＡが真性であることは、２本鎖Ｄ
ＮＡについてG.F.Hong［Bioscience Reports 1,243(198
1)］により記載されたジデオキシ配列決定法との組み合
わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ
配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化GA
PDH遺伝子（第９図参照）は、Hollandらが報告している
g a p491と同じ配列を有する［J.Biol.Chem. 255,2596
(1980)］。
（ｃ）GAPDH下流プロモーター要素の調製 GAPDH遺伝子のＡＴＧからの位置−27〜−675を含む649b
p Taq Iフラグメント（第９図参照）を、Taq I(New Eng
land Biolabs)で上記ハイブリッドプラスミドを消化
し、ＤＮＡフラグメントを1.2％ソフト・アガロースゲ
ル上で分離し、そして熱フェノールによりＤＮＡを抽出
することにより単離する（実施例２３参照）。Taq Iフ
ラグメントのクローン化はpBR322のCla I部位中に為さ
れる。すなわち、１μｇのpBR322を３単位のCla I(New
England Biolabs)を用いて、業者により記載された方法
で切断する。300ｎｇのフェノール処理されそして切断
されたベクターを200単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て、約300ｎｇのインサートＤＮＡ（649bp Taqフラグメ
ント）に全容積２０μｌ中で連結する。Ｅ．コリHB101
を形質転換してアンピシリン耐性にし、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、そして制限分析によって分析する。［Taq
I,Dra I］。Taq Iフラグメントの方向は、制限エンドヌ
クレアーゼDra IをプラスミドのBamH I部位と組み合わ
せて用いることにより確立され、pBR322のHind III部位
の近くに位置−675の部位を有するTaq Iプラスミドを選
択する。pBR322／GAPDHと命名されるこのプラスミド
を、BamH I(New England Biolabs)を用いて線状化し、
そしてBal31を用いる消化を、Bal IIリンカー（５−CAG
ATCTG−３、New England Biolabs)を用いることを除
き、実施例２３と同様にして行い、そして消化されたプ
ラスミドを５μｇ／ｍｌの濃度で、全容量２０μｌ中で
直接環状化する。Bal31で短縮されたTaq Iフラグメント
の大きさを、（Bgl IIおよびHind IIIを用いる）制限分
析により決定する。２つのクローンが選択され、これら
はそれぞれＡＴＧ上流からGAPDHプロモータへと200bpお
よび265pb伸びるＤＮＡフラグメントを含む。これらの
フラグメントは、約−140bpに仮定のTATAボックスを有
する。これらのクローンはなお、ＤＮＡのpBR322由来部
分に複製開始点を含み、それぞれpGAPDH−ＦおよびpGAP
DH−Ｅと命名される。
（ｄ）PH05のUAS1(PH05)を伴う下流GAPDHプロモーター
要素とデスルファトヒルジン蛋白質コード領域との結合 Ｉ）GAPDH要素 −２７の位置のTaq I部位からGAPDH遺伝子のＡＴＧに直
接隣接する位置までGAPDHプロモーター要素を延長する
ため、次の構造を有する２個の合成相補的オリゴヌクレ
オチドを合成する。
５′CGAATAAACACACATAAATAAAG ３′ ３′ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA ５′ これらのオリゴヌクレオチドは、位置−２６から位置−
５への純粋なGAPDHプロモータを提供し、末端EcoR I部
位を生じさせる。２μｇの２種類のBal31単離体（実施
例24ｃから）（プラスミドpGAPDH−Ｅおよび−Ｆ）を６
単位のTap Iを用いて５０μｌ中で消化し、生成する混
合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そして１
０μｌの水に再分散する。合成オリゴヌクレオチドを、
１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５
０ｍＭ NaClを含有する100μｌ溶液中で各単鎖２μｌ
を混合し、９０℃で３分間加熱し、溶液を徐々に室温に
まで冷却することにより（約３時間以内）アニールす
る。Taq I消化された各プラスミド１μｇを約２０倍モ
ル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレオチドと、80
0単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、２０μｌの容積
中で１８時間混合する。全混合物を３単位のBal II(New
England Biolabs)で消化し、ＤＮＡフラグメントを1.5
％ソフトアガロースゲル上で分離する。約200bpおよび2
65bpのBal II−EcoR Iフラグメントをゲルから切り取
り、抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
プラスミドpGAPDH−ＥをBgl IIおよびEcoR Iを用いて消
化し、大きな（約3.5ｋｂ）フラグメントを単離する。
このフラグメントをベクターとして用いて、上記のよう
な連結、形質転換およびプラスミド単離条件を用いなが
ら、前記265bpおよび200bpのBal II−EcoR Iフラグメン
トをクローン化する。生成したプラスミドは、pGAPDH−
ELおよびpGAPDH−FLと命名される。プラスミドpGAPDH−
ELおよびpGAPDH−FL中のクローン化Bgl II−EcoR Iフラ
グメントのＤＮＡ配列を第１１図に示す。フラグメント
の正確な大きさはそれぞれ66bpおよび201bpである。
II）UAS1(PH05)制御要素 ３μｇのプラスミドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願第100,56
1号明細書参照）を６単位のCla I(New England Biolab
s)を用いて消化する。３′の欠損端を、Maniatis（上
記）の方法に従い、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのKl
enowフラグメント(Bethedsa Research Laboratories)を
用いてフィルインする。Bal IIリンカー（５′−CAGATC
TG−３′）を、例２３に記載したのと同様に付加する。
ＤＮＡをSal IおよびBgl II((New England Biolabs)で
消化し、１％ソフトアガロースゲル上で処理する。548b
pフラグメントをゲルから切り取り、フェノール抽出し
て、上記のようにエタノール沈澱する。
III）デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ プラスミドpJDB207／PH05(Eco)−HIRの造成（第１２図
参照） ＵＳＡ(PH05)−GAPDHハイブリッドプロモーター要素をP
H05シグナル配列を含むデスルファトヒルジンのコード
領域に好都合に接続するため（プラスミドpJDB207／PH0
5−HIRのように）、EcoR I制限部位を、ｍＲＮＡ開始部
位とコード領域のＡＴＧとの間の５′非翻訳領域に導入
する。
１５μｇのプラスミドpJDB207／PH05−HIR（１６ｄ参
照）を、制限エンドヌクレアーゼDraI(Boehringer)で消
化する。生成する４個のフラグメントを0.8％アガロー
スゲル上トリス・ホウ酸・EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離
する。ゲルから4.2ｋｂのＤＮＡフラグメントを回収
し、電気溶出し、エタノール沈澱する。ＤＮＡを水に再
分散して、0.6ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
次の式： ５′−AATTCGATTACCAATGTTT−３′ ３′− GCTAATGGTTACAAA−５′ の２種類の合成オリゴヌクレオチド（2.3μｇおよび2.9
μｇ）をそれぞれ２０μｌの６０ｍＭトリス(pH7.5)，
１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，0.5ｍＭ ＡＴＰお
よび２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehrin
ger)中でキナーゼ処理をする。３７℃で４５分後に、こ
れらの反応混合物を一緒にし、７５℃で１０分間加熱
し、そして室温に放冷する。アニールしたオリゴヌクレ
オチドリンカーを−２０℃で貯蔵する。
6.5μｇ（2.3ｐモル）の4.2ｋｂ DraI ＤＮＡフラグ
メントを７０倍過剰量のキナーゼ処理してアニーリング
したオリゴヌクレオチドリンカーと共に５０μｌの６０
ｍＭトリス(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴ
Ｔ，3.5ｍＭ ＡＴＰおよび800単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼ(Biolabs)中でインキュベートする。Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを８５℃で１０分間不活性化した後、過剰のリンカ
ーを１０ｍＭ EDTA，300ｍＭ酢酸ナトリウム(pH6.0)お
よび0.5容のイソプロパノールの存在でＤＮＡを沈澱さ
せることにより除去する。ＤＮＡをEcoR IとHind IIIと
で消化する。生成するフラグメントを１％アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離す
る。643bpフラグメントを、電気溶出およびエタノール
沈澱によりゲルから回収する。ＤＮＡを再分散させて、
濃度を0.1ｐＭ／μｌにする。EcoR I−Hind IIIフラグ
メントはPH05シグナル配列、デスルファトヒルジンのコ
ード配列およびPH05転写ターミーネーターを含む。
534bp PH05プロモーターフラグメントをプラスミドｐ31
／Ｒ（欧州特許出願第100,561号明細書）から単離す
る。
１０μｇのｐ31／Ｒを制限エンドヌクレアーゼEcoR Iと
BamH Iとで消化する。生成する３個のフラグメントを0.
6％の低融点アガロースゲル上トリス−ホウ酸EDTA緩衝
液(pH8.3)中で分離する。534bp BamH I−EcoR Iフラグ
メントを分離する。これはｍＲＮＡ開始部位を含むPH05
プロモーターを含有する。
ベクターフラグメントをプラスミドpJDB207／PH05−HIR
から単離する（実施例16ｄ）。このプラスミド６μｇを
BamH IとHind IIIとで消化する。大きな6.5ｋｂのBamH
I−Hind IIIフラグメントを、0.65低融点アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で小さなフ
ラグメントから分離する。
適切な接着末端を有する上記の３個のＤＮＡフラグメン
トを以下の反応で連結する。0.2ｐモル（７０ｎｇ）の5
34bp BamH I−EcoR I PH05プロモーターフラグメント、
0.2ｐモル（８５ｎｇ）の643bp EcoR I−Hind IIIフラ
グメント、0.2ｐモル（８５ｎｇ）の643bp EcoR I−Hin
d IIIフラグメント（ヒルジンコード配列）、および0.1
ｐモル（0.4μｇ）の6.5kb BamH I−Hind IIIベクター
フラグメントを、１０μｌの６０ｍＭトリス(pH7.5)，
１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰお
よび400単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ中で１５℃で６時間
連結する。連結混合物１μｌを100μｌのカルシウム処
理した形質転換コンピテントＥ．コリHB101細胞に加え
る。１２個の形質転換したampRコロニーをそれぞれ100
μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で増殖させる。
プラスミドＤＮＡをHolmesらの方法により調製し［Ana
l.Biochem.114,(1981)193］、EcoR I及びBamH I制限酵
素により分析する。予想される制限フラグメントを有す
るクローンを単離し、そしてpJDB207／PH05(Eco)−HIR
と命名する。
IV）UAS1(PH05)−GAPDHハイブリッドプロモーターのデ
スルファトヒルジン蛋白質コード領域への連結 １５μｇのプラスミドpJDB207／PH05(Eco)（−HIR（実
施例24ｄIII参照）を、EcoR IとHind IIIとで消化す
る。ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上トリス
−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離する。643bpフラ
グメントをゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノ
ールで沈澱される。ＤＮＡを水に再分散し、0.1ｐＭ／
μｌの濃度とする。
６μｇのプラスミドpHDB207／PH05−HIRを、制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIとSal Iとで完全に消化する。6.3
ｋｂフラグメント（ベクター部分）をソフトアガロース
ゲル電気泳動、フェノール抽出、およびエタノール沈澱
により単離する。ベクターＤＮＡフラグメントを水に再
分散し、0.05ｐモル／μｌの濃度にする。
１０μｇのプラスミドpGAPDH−EL（実施例24ｄ Ｉ参
照）をBal IIとEcoR Iとで消化する。266bp Bal II−Ec
oR Iフラグメントを1.2％アガロースゲル上トリス−ホ
ウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離し、ゲルから電気溶
出し、そしてエタノールで沈澱させる。ＤＮＡを水に再
分散され、0.3ｐモル／μｌの濃度にする。
0.3ｐモルのUAS1(PH05)（実施例24ｄII）を含んで成る5
48bp Sal I−Bal IIフラグメント、0.3ｐモルのpGAPDH
−ELの266bp Bal II−EcoR Iフラグメント、0.3ｐモル
のpJDB207／PH05(Ec0)−HIRの643bp EcoR I−Hind III
フラグメント、および0.12ｐモルの6.3ｋｂSal I−Hind
IIIベクターフラグメントを、２０μｌの５０ｍＭトリ
ス(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ
ＡＴＰおよび400単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)
中で１５℃で６時間連結させる。連結混合物１μｌおよ
び３μｌを100μｌのカルシウム処理したＥ．コリHB101
細胞に加える。ampRコロニーからのプラスミドの単離お
よびSal I、Bal I、EcoR IおよびHind IIIを用いる制限
分析を、上記のように行う（実施例24ｄIII参照）。１
個の陽性クローンを選択し、pJDB207／PAPEL−HIR(UAS
1)と命名する。
同様な造成を、pGAPDH−FLから分離される201bp Bal II
−EcoR Iフラグメントを用いて行う。１個の選択された
プラスミドをpJDB207／PAPFL−HIR(UAS1)と命名する。
（Ｖ）UAS1(PH05)−UAS2(PH05)−GAPDHハイブリッドプ
ロモーターのデスルファトヒルジン蛋白質コード領域へ
の連結 ３μｇずつのプラスミドpHDB207／PAPEL−HIR(UAS1)お
よびpJDB207／PAPFL−HIR(UAS1)を、それぞれBag IIで
消化する。フェノール抽出およびエノタール沈澱の後、
Maniatisらの方法に従い、ＤＮＡの３′の欠損末端を、
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ（Klenowフラグメント、Be
thesda Research Laboratories）との反応によりフィル
インする（上記）。酵素を７０℃で１０分間不活性化さ
せる。ＤＮＡを更にSal Iで消化して、大きな7.2ｋｂフ
ラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱により単離する。各フラグ
メントを水に再分散させ、0.05pモル／μｌの濃度にす
る。フラグメントはヒルジンコード領域、ほとんどのベ
クター配列およびpGAPDH−ELまたはpGAPDH−FLから単離
される２種類の異なるGAPDHプロモーター要素を含む。
プラスミドｐ31／Ｙ（欧州特許出願第100,561号明細
書）を、上記のようにBstE IIで消化し、Ｅ．コリＤＮ
Ａポリメラーゼ（Klenowフラグメント）と共にインキュ
ベートし、そしてSal Iで切断する。649bpフラグメント
をソフトアガロースゲル上で分離し、フェノール抽出お
よびエタノール沈澱により回収する。
UAS1−UAS2(PH05)プロモーター要素を含んで成るｐ31／
Ｙの649bpフラグメント0.3ｐモル、および0.15ｐモルの
7.2ｋｂフラグメントの一方を、上記のように連結し
て、Ｅ・コリHB101中に形質転換する。プラスミドをamp
Rコロニーから調製し、そして制限酵素により分析す
る。単一クローンを選択し、それらのプラスミドＤＮＡ
をpJDB207／PAPEL−HIR(UAS1+UAS2)およびpJDB207／PAP
FL−HIR(UAS1+UAS2)と命名する。
実施例２５．デスルファトヒルジン蛋白質コード配列に
融合されるGAPDHプロモーター要素 （実施例24d Iに記載のように）異なる長さの２個のGAP
DHプロモーター要素をPH05シグナル配列を含むデスルフ
ァトヒルジン蛋白質コード領域に連結する。
２個の要素（266bpおよび201bp）は、それぞれGAPDH TA
TAボックス、ｍＲＮＡ開始部位およびＡＴに富む５′非
翻訳領域を含んで成る。これらの要素のヌクレオチド配
列を、第１０図に示す。
これらの要素の３′末端はいずれも、GAPDH遺伝子のＡ
ＴＧ（これにEcoR I認識部位（実施例24d Iにおいて導
入されるオリゴヌクレオチドリンカー参照）が続く）か
らの位置−５にあり、５′末端はそれぞれＡＴＧから位
置−198および−263にありこれらの位置でBal IIリンカ
ーが付加されている。
Bal II−EcoR Iプロモーターフラグメントを、PH05シグ
ナル配列およびデスルファトヒルジンをコードする配列
を有するEcoR I−Hind IIIフラグメント、およびHind I
II−BamH Iベクターフラグメントに連結する。
６μｇのプラスミドpHDB207／PH05−HIRを制限エンドヌ
クレアーゼHind IIIおよびBamH Iで完全に消化する。大
きな6.5ｋｂフラグメント（ベクター部）を0.8％アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分
離し、ゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、そして
エタノール沈澱する。ベクターＤＮＡフラグメントを水
に再分散して、0.05ｐモル／μｌの濃度にする。
0.3ｐモルのpGAPDH−ELの266bp Bg1 II−EcoR Iフラグ
メント（実施例24d IV）、0.3ｐモルのpJDB207／PH05(E
co)−HIRの643bp EcoR I−Hind IIIフラグメント（実施
例24d III）、および0.1ｐモルの6.5ｋｂ Hind III−B
amH Iベクターフラグメントを、１０μｌの６０ｍＭト
リス(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，１ｍ
Ｍ ＡＴＰおよび400単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolab
s)中で１５℃で６時間連結させる。連結混合物１μｌ
を、100μｌのカルシウム処理したＥ．コリHB101細胞に
加える。ampRコロニーからのプロモーターの単離および
EcoR Iを用いる制限分析を、実施例24d IIIに記載した
のと同様に行う。一つの陽性クローンを選択して、その
プラスミドＤＮＡをpHDB207／GAPEL−HIRと称する。
同様な造成をpGAPDH−FLから単離した210bp Bgl II−Ec
oR Iフラグメントを用いて行う。一つの選択されたクロ
ーンのプラスミドＤＮＡをpJDB207／GAPFL−HIRと呼
ぶ。
実施例２６．分泌されるデスルファトヒルジンのコード
配列の２本鎖インサートを有する発現プラスミドの造成 以下の造成は、直列（タンデム）の頭と尾の配置で重複
されたＤＮＡフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、（それぞれ実施例２４および２５に記載の
ように）GAPDHプロモーターまたはハイブリッドPH05−G
APDHプロモーター、POH5シグナル配列、デスルファトヒ
ルジンのコード配列、およびPH05転写ターナミネーター
からなる。
７μｇのプラスミドpHDB207／GAPEL−HIRを、制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIで消化する。３′欠損末端を、
Maniatis（上記）の方法によりＥ．コリＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（Klenowフラグメント、Bethesda Research Labo
ratory）との反応によりフィルインする。1.85μｇのSa
l Iリンカー５′−HGGTCGACC−３′(Biolabs)を、５０
μｌの６０ｍＭトリス(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍ
Ｍ ＤＴＴ，0.5ｍＭ ＡＴＰおよび５０単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理
する。３７℃で４５分間処理の後、混合物を７５℃で１
０分間加熱し、室温に放冷する。７μｇ（1.5ｐモル）
の平滑末端（上記）に変換されたHind III部位を有する
線状化したプラスミドpJDB pJDB207／GAPEL−HIRを、８
０倍過剰量のキナーゼ処理されそしてアニーリルされた
Salリンカーと共に、３０μｌの６０ｍＭトリス(pH7.
5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，3.5ｍＭのＡＴ
Ｐおよび800単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)中で１
５℃で１６時間インキュベートする。Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを７５℃で１０分間不活性化した、後過剰のリンカー
を１０ｍＭ EDTA，300ｍＭ酢酸ナトリウム(pH6.0)およ
び0.54容のイソプロパノールの存在下でＤＮＡを沈澱さ
せることにより除去する。ＤＮＡをSal Iで消化する。
生成するフラグメントを１％アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離する。1.1ｋｂのSa
l Iフラグメントを、ゲルからの電気溶出、フェノール
抽出およびエタノール沈澱により回収する。ＤＮＡを0.
1ｐモル／μｌの濃度で再分散させる。
５μｇのプラスミドpJDB207／GAPEL−HIRをSal Iで完全
に消化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、ＤＮＡを100μｌの５０ｍＭのトリス(pH8.0)中に再
分散させる。4.6単位のウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼ(Boehringer)を加える。３７℃で１時間置いた後、ホ
スファターゼを、100ｍＭ NaCl、５ｍＭ EDTAおよび
0.5％のＳＤＳの存在下で６８℃にて１５分間不活性化
する。ＤＮＡ溶液を、１０ｍＭトリス(pH7.5)，150ｍＭ
NaCl，および１ｍＭ EDTAで平衡化したDE52アニオン
交換体(Whatman)の100μｌのベッドに加える。カラムを
同じ緩衝液で洗浄した後、ＤＮＡを400μｌの1.5Ｍ Na
Cl，１０ｍＭトリス(pH7.5)，１ｍＭ EDTAで溶出し、
エタノールで沈澱せしめる。線状化したプラスミドを0.
6％のアガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断
されていないＤＮＡから分離する。ゲルから線状の7.3
ｋｂ ＤＮＡフラグメントを回収し、電気溶出し、フェ
ノール抽出し、エタノールで沈澱させ、そして0.1ｐモ
ル／μｌの濃度で再分散させる。
0.2ｐモルの1.1ｋｂ Sal Iフラグメントおよび0.1ｐモ
ルの線状化したベクターを１０μｌの６０ｍＭトリス(p
H7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ Ａ
ＴＰおよび200単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ中１５℃で１
６時間連結させる。連結混合物１μｌを、100μｌのカ
ルシウム処理し形質転換コンピテントＥ．コリ細胞に加
える。
２４個の形質転換したampRコロニーを、別々に100μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖させる。
Holmesらの方法［Anal.Biochem.114(1981)193］に従
い、プラスミドＤＮＡを調製し、そしてEcoR I制限消化
によって分析する。予想される制限フラグメントを有す
る一つのクローンを単離し、そしてpJDB207／［GAPEL−
HIR］Ｄと命名する。
同様な造成を、プラスミドpJDB207／GAPFL−HIRおよびp
JDB207／PAPFL／IER(UAS1+UAS2)を用いて行う。一つの
選択されたクローンの得られるプラスミドＤＮＡは、そ
れぞれpJDB207／［FAPFL−HIR］ＤおよびpJDB207／［PA
PFL−HIR(UAS1+UAS2)］Ｄと呼ばれる。
実施例２７．分泌されるデスルファトヒルジンのコード
配列の４個のインサートを有する発現プラスミドの造成 GAPDH−プロモーター、PH05シグナル配列、デスルファ
トヒルジンのコード配列、およびPH05転写ターミネータ
ーを含んで成るＤＮＡフラグメントの４個のコピーを、
直列（タンデム）の頭と尾の配置で酵母発現ベクターに
挿入する。
１０μｇのプラスミドpHDB207／［GAPFL−HIR］Ｄ（実
施例２６参照）をSal Iで消化する。生成する線状フラ
グメントの接着末端を、Maniatiesら（上記）の方法に
より、Ｅ・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenowフラグメ
ント、ＢＲＬ）との反応においてフィルインする。0.94
μｇのHind IIIリンカー［５′−CAAGCTTG−３′、Biol
abs］をキナーゼ処理し、セルフアニーリングし、そし
て平滑末端へ変換されたSal I部位を有する線状化した
プラスミドpJDB207／［GAPFL−HIR］Ｄに連結する。リ
ンカーの連結およびイソプロパノールによる沈澱は、実
施例２６に記載されているのと同様である。次に、ＤＮ
ＡをHind IIIを用いて切断し、そして生成する2.2ｋｂ
のフラグメントを電気溶出し、そしてフェノール抽出お
よびエタノール沈澱により単離する。ＤＮＡを0.1ｐモ
ル／μｌの濃度に再分散する。
５μｇのプラスミドpJDB207／［GAPFL−HIR］Ｄを、Hin
d IIIを用いて完全に消化する。ＤＮＡをウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼ(Boehringer)を用いて脱リン酸化
し、DE52イオン交換クロマトグラフィによって精製し、
実施例２６に記載のように電気溶出によって0.6％アガ
ロースゲルから単離する。
0.2ｐモルの2.2ｋｂ Hind IIIフラグメントおよび0.1
ｐモルの線状化したベクターを上記のように連結する。
１μｌの連結混合物を、100μｌのコルシウム処理した
形質転換コンピテントＥ．コリHB101細胞に加える。
１２個の形質転換したampRコロニーを、100μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含むＬＢ培地で別々に生育させる。プ
ラスミドＤＮＡを調製し、そしてSal I＋Xba IおよびAv
a I＋Xba Iの二重消化およびBamH I消化によって分析す
る。1.1ｋｂ BamH I−連結フラグメントは、インサー
トがプラスミド上に既存の２個のコピーに対して頭と尾
の配置で存在することを示唆している。インサートのこ
の方向を有する一つのクローンを、pJDB207／［GAPFL−
HIR］Ｔと称する。
実施例２８．PH05プロモーター、インベルターゼシグナ
ル配列およびデスルファトヒルジンコード領域を含む酵
母発現ベクターの造成 （Ａ）インベルターゼシグナル配列のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの合成 ４種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉ−１、Ｉ
−２、Ｉ−３、Ｉ−４）を、ＤＮＡ合成機（380Ｂ型、A
pplied Biosystems）によって合成する。脱ブロッキン
グの後、合成フラグメントを８Ｍ尿素含有する１２％ポ
リアクリルアミドゲルで精製する。塩を含有しない純粋
なオリゴデオキシリボヌクレオチドが、Sep.Pak(Waters
Associates)を用いて得られる。これらのフラグメント
は、頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルター
ゼシグナル配列をコードするデュープレックスを構成す
る。
（Ｂ）インベルターゼシグナル配列のサブクローン化 （ａ）ベクターの調製 1.5μｇのp31R／SS−TPAΔ２（欧州特許出願第143,081
号明細書）を、５０μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH
7.5)，６ｍＭ MgCl2，100ｍＭ NaCl，６ｍＭメルカプ
トエタノール中で、１０単位のEcoR I(Boehringer)を用
いて、３７℃で１時間消化する。１μｌの2.5Ｍ NaCl
を加えた後、１０単位のXho I(Boehringer)を加え、３
７℃で１時間インキュベートする。4.2ｋｂベクター
を、0.8％調製用アガロースゲル上で単離する。ゲルス
ライスをMicro Colloidorチューブ(Sartorius GmbH)に
写して、200μｌのＴＥで覆い、そして電気溶出する（9
0ｍＡで５０分間電気泳動する）。ＴＥ溶液を集めて、
0.1容の１０×TENを添加した後、2.5容の無水エタノー
ル中で沈澱させる。ＤＮＡペレットを冷８０％エタノー
ルで洗浄し、そして真空中で乾燥する。ＤＮＡを、６μ
ｌのＴＥに再分散する（４０ｐモル／μｌ）。
（ｂ）オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｉ−１、Ｉ−
２、Ｉ−３、Ｉ−４）のアニーリング、キナーゼ処理お
よびベクターとの連結 １０μｌの0.5Ｍトリス・ＨＣｌ(pH8)中にそれぞれ１０
ｐモルの４種類のデオキシリボヌクレオチドを含む溶液
を、水浴上で９５℃で５分間インキュベートする。水浴
を、５時間にわたって３０℃まで徐々に冷却する。この
アニーリング混合物に、それぞれ２μｌの0.1Ｍ NaC
l2，0.1Ｍ NaCl，３０ｍＭ ＤＴＴ，４ｍＭ ＡＴＰ
および８単位（１μｌ）のポリヌクレオチドキナーゼ(B
oehringer)を加える。キナーゼ処理は、３７℃で１時間
行う。アニーリングし、キナーゼ処理されたオリゴデオ
キシリボヌクレオチド、および６０ｐモルのEcoR I−Xh
o I切断ベクター（1.5μｌ）を、400単位（１μｌ）の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)を用いて１４℃で１７時
間連結させる。６５℃で１０分間インキュベートするこ
とによって、反応を停止させる。１０ｍｌのこの連結混
合物を、Ｅ．コリHB101 Ca++細胞の形質転換に用いる
［M.DagertおよびS.D.Ehrlich、Gene,56,23-28(197
9)］。２０個のampRコロニーを採取する。ＤＮＡを迅速
単離法により調製する［D.S.HolmesおよびM.Quigley、An
al.Biochem.114,193-197(1981)］。ＤＮＡをEcoR Iおよ
びXho Iを用いて消化し、EcoR I末端で放射能標識を行
い、放射能標識されたpBr322 Hae III切断ＤＮＡをマー
カーとして用いて、８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルア
ミドゲル上で分析する。総ての２０個のコロニーから得
られるＤＮＡについて、正確な大きさのバンドが観察さ
れる。１個のクローンを100μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む100ｍｌのＬＢ培地で増殖させる。プラスミドＤ
ＮＡを単離して、p31RIT−12と称する。
（Ｃ）GAPFLプロモータ要素のインベルターゼシグナル
配列への連結 ５μｇのプラスミドp31RIT−12を、Sal IおよびEcoR I
を用いて完全に消化する。大きな3.3ｋｂ Sal I−EcoR
Iフラグメントを、0.6％アガロースゲル上トリス−酢
酸緩衝液(pH8.2)中で単離する。ＤＮＡをゲルから電気
溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱さ
せる。１０μｇのプラスミドpJDB207／GAPFL−HIR（実
施例２５参照）をSal IおよびEcoR Iを用いて消化す
る。477bp Sal I−EcoR Iフラグメントを、0.8％アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で単
離する。ＤＮＡを電気溶出し、フェノール抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。これらの単離されたＤＮＡ
フラグメントを連結する。連結混合物の一部を用いて、
適当なＥ・コリHB101細胞を形質転換する。ampRコロニ
ーを増殖せしめ、プラスミドＤＮＡをHind III Sal I二
重消化によって分析する。正確なインサートを有するプ
ラスミドを、ｐ31／GAPFL−ＩＴと命名する。
（Ｄ）プラスミドpJDB207／GAPFL−Ｉ−HIRの造成（第
１５図参照） ２５μｇのプラスミドｐ35／GAPFL−ＩＴを、Pst Iおよ
びSal Iを用いて完全に消化する。生成する676bpフラグ
メントを、１０％調製用アガロースゲル上トリス−ホウ
酸−EDTA衝液(pH8.3)中で単離する。ＤＮＡをゲルから
電気溶出し、DE52イオン交換クロマトグラフィによって
精製し、エタノールで沈澱させ、そしてHga I酵素に好
適な緩衝液に再分散して0.1μｇ／μｌの濃度にする。S
al I−Pst I ＤＮＡフラグメントを、0.5単位／μｇＤ
ＮＡの存在でHga Iを用いて３７℃で６０分間部分的に
消化する。EDTAを添加して最終濃度を１０ｍＭにするこ
とによって、反応を停止させる。534bp Sal I−Hga Iフ
ラグメントを１％調製用アガロースゲル上で単離する。
ＤＮＡをゲルから電気溶出し、DE52クロマトグラフィに
よって精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分散さ
せて、約0.1ｐモル／μｌの濃度にする。
１０μｇのプラスミドpJDB207／PH05−HIR（実施例１６
参照）を、Bal IおよびHind IIIを用いて消化する。生
成する587 bpBal I−Hind IIフラグメントを、調製用１
％アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出し、
エタノール沈澱し、更にHinf Iで消化する。
下記のオリゴデオキシヌクレオチド ５′-CTGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCG-３′ ３′-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTA-５′ のそれぞれ1.3μｇ(160pM)を実施例24d IIIに記載のよ
うにしてキナーゼ処理し、そしてアニーリングする。0.
6μｇ（1.6ｐモル）のHinf Iで消化した。Bal I−Hind
IIIフラグメント（上記参照）および160ｐモルのキナー
ゼ処理されアニーリングしたリンカーを、８３μｌの１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ(pH7.5)，１０ｍＭ MgCl2，５ｍ
Ｍ ＤＴＴ，3.5ｍＭ ＡＴＰおよび400単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ中で、１５℃で１６時間連結させる。８５℃
にて１０分間の後、ＤＮＡをイソプロパノールで沈澱さ
せることによって過剰のリンカーを除去する（実施例24
d III参照）。584bp Hga I−Hind IIIフラグメントを、
１％調製用アガロースゲル上で単離する。電気溶出し、
精製し、そしてエタノール沈澱させたＤＮＡを水に再分
散して、0.1ｐモル／μｌの濃度にする。
５μｇのpJDB207／PH05−HIRをHind IIIおよびSal Iで
消化し、そして大きな6.2ｋｂフラブメントを単離す
る。
0.2ｐモルの534bp Sal I−Hga Iフラグメント，0.2ｐモ
ルの584bp Hga I−Hind IIIフラグメント、および0.1ｐ
モルの6.2kb Sal I−Hind IIIベクターフラグメント
を、１０μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣｌ(pH7.5)，１０
ｍＭ MgCl2，５ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰおよび4
00単位のＴ４リガーゼ中で１５℃で５時間連結させる。
連結混合物の１μｌを用いて、コンピテントＥ．コリHB
101細胞を形質転換させる。
２４個の形質転換されたアンピシリン耐性のコロニー
を、100μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で別々
に増殖させる。プラスミドＤＮＡを調製して、Hind III
およびSal I二重消化によって分析する。正確な制限パ
ターンを有する単一クローンを単離し、pJDB207／GAPFL
−Ｉ−HIRと表す。
インベルターゼシグナル配列の同一性およびヒルジンコ
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
実施例２９． （ａ）サッカロミセス・セレビシエーGRF18の形質転換 サッカロミセス・セレビシエーCFR18株（α，his3−11,
his3−15，leu2−３，leu2−12，canR）を、Hinnenらの
報告による形質転換法［Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 、75,1
929(1978)］を用いて、次のようなプラスミドを用いて
形質転換する。
pJDB207／PAPEL−HIR(UAS1)， pJDB207／PAPFL−HIR(UAS1)， pJDB207／PAPEL−HIR(UAS1＋UAS2)， pJDB207／PAPFL−HIR(UAS1＋UAS2)， pJDB207／GAPEL−HIR， pJDB207／GAPFL−HIR， pJDB207／[GAPEL−HIR]D， pJDB207／[GAPFL−HIR]D， pJDB207／[PAPFL−HIR](UAS1＋UAS2)D， pJDB207／[GAPFL−HIR]T， pJDB207／GAPFL−Ｉ−HIR 形質転換した酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地
平板上で選択する。単一の形質転換した酵母コロニーを
単離して、次のように命名する。サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1)，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1)，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS
2)，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS
2)，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR](UAS1+UAS
2)]D，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T，サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR． （ｂ）形質転換体の醗酵 Ｓ．セレビシエーGRF18形質転換体の細胞をそれぞれ、
５０ｍｌ三角フラスコ中で、１０ｍｌの酵母最少培地
（２％グルコースおよび２０ｍｇ／のＬ−ヒスチジン
を加えた、アミノ酸を含有しないDifco Yeast Nitrogen
Base）中で、３０℃で２４時間振盪しながら培養し
て、３×１０７個／ｍｌの細胞密度とする。ハイブリッ
ドPH05−GAPDHプロモーターを有するプラスミドを含む
酵母形質転換体は、デスルファトヒルジンの発現にはプ
ロモーターの抑制解除を必要とする。細胞を0.9％NaCl
で洗浄し、これを(NH4)2SO4、２％グルコースおよび１
ｇ／のＬ−ヒスチジンの代わりに0.03ｇ／のKH2P
O4、１０ｇ／のＬ−アスパラギンを含むほか、Difco
Yeast Nitrogen Base培地（アミノ酸なし）の処方にし
たがって調製した５０ｍｌの低Ｐｉ最少培地に接種す
る。培養物は、４×106個／ｍｌ以下の細胞密度で接種
し、３０℃、200ｒｐｍで２４時間攪拌する。最終的密
度は、１×108個／ｍｌとなる。GAPDH プロモーターを有するプラスミドを含有する酵母
形質転換体は、構成的にデスルファトヒルジンを発現す
る。細胞をペプトン（５ｇ／）、酵母エキス（１０ｇ
／）、グルコース（２０ｇ／）、シュークロース
（４０ｇ／）、硫酸アンモニウム（３ｇ／）、KH2S
O4（２ｇ／）、MgSO4（0.5ｇ／）、NaCl（0.1ｇ／
）、CaCl2（0.1ｇ／）、ビオチン（１０μｇ／）
から成る複合培地（ｇ／）中で培養する。３０℃、20
0ｒｐｍで４８時間培養した後に、約１×109個／ｍｌの
細胞が得られる。
幾つかの代表的な形質転換した酵母株によって分泌され
るデスルファトヒルジンの量（トロンビン阻害法によっ
て測定）を、以下の表にまとめてある。
また、酵母形質転換体によって発現されたデスルファト
ヒルジン化合物の少なくとも９０％は培養液中に分泌さ
れることも決定される。回収の時間の関数としての培養
液中および細胞内におけるデスルファトヒルジンの分布
を決定するため、３リットルのＭＢＲバイオリアクター
（MBR Bioreactor AG、Wetzikon、スイス）中で醗酵を行
う。サッカロミセス・セレビシエーGRF18／pJDB207／GA
PFL−HIR株を３リットルの複合培地（上記参照）に接種
して、３０℃で、攪拌速度500ｒｐｍおよび通気量200リ
ットル／時間で培養する。最終密度５×109個／ｍｌが
達成される。試料をそれぞれ、18、24および４２時間目
に採取し培溶液中および細胞内（崩壊後、実施例２２参
照）のデスルファトヒルジンの含量をトロンビン阻害法
およびHPLCによって測定する。
実施例３０．300リットル規模での形質転換体の培養 サッカロミセス・セレビシエーGRF18／pJDB207／GAPFL
−HIR株の細胞を含む深冷凍結アンプルから多数の寒天
斜面に接種を行う。１個以上の寒天斜面を28〜30℃で３
〜５日間培養する。１つの寒天斜面の内容物を、邪魔板
がなく、前培養培地100ｍｌを収容する単一の500ｍｌ三
角フラスコに無菌的に接種する。フラスコを、振幅が５
０mmで250ｒｐｍのロータリー・シェイカーで、培養温
度２８℃で振盪する。４８時間後に、これらのフラスコ
の内容物（一次前培養物）２％（ｖ／ｖ）を、600ｍｌ
の前培養培地を収容する２リットルの三角フラスコに無
菌的に接種する。これらのフラスコ（二次前培養物）
を、２８℃で、ロータリー・シェイカー上で120ｒｐｍ
で振幅を５０mmとして４８時間振盪する。二次前培養物
のフラスコ（２％ｖ／ｖ）の内容物を、３０リットルの
前培養培地（プラント前培養物）を収容する５０リット
ルのステンレススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。
プラント前培養液の醗酵条件は次のようである。600ｒ
ｐｍ（単一の６枚羽根のタービン攪拌機、直径115m
m）、４枚の邪魔板、ヘッド圧：０３バール、通気量：
１リットルの空気／１リットルの培地／分、温度：２８
℃、４８時間。
寒天培地および前培養液は、寒天の有無を除けば同じで
ある。同じ前培養液を総ての前培養工程で用いた。前培
地の組成（ｇ／）： イーストニトロゲンベース(Difco) 8.4 Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ 11.6 Ｌ−ヒスチジン 1.0 グルコース（別途に殺菌） 2.0 寒天培地の組成： 前培地に１リットル当たり２０ｇの寒天を加えたもの。
（ｂ）生産醗酵（300リットル規模） ５％（ｖ／ｖ，１５リットル）の培養したプラント前培
養液を300リットルの無菌醗酵生産培地を収容する600リ
ットルの醗酵機に無菌的に導入する。300リットル生産
培地の醗酵条件は、次の通りである。
450ｒｐｍ（単一の６枚羽根攪拌機、直径230mm）、４枚
の邪魔板、ヘッド圧：0.3バール、通気量：０〜９時
間：0.25リットル空気／１リットルの培地／分、 ９時間〜回収時：１リットル空気／１リットルの培地／
分、温度２８℃、時間24〜48時間、 OD600：15〜20、収量：15〜25ｍｇ／（試験法：HPLC
およびトロンビン試験）生産培地の組成（ｇ／） ペプトン ５ 酵母エキス 10 シュークロース 40 (NH4)2SO4 ６ MgSO4・7H2O １ NaCl 0.1 KH2PO4 ２ CaCl2・2H2O 0.013 殺菌前のpH〜6.0 消泡剤：必要な場合にはUCON LB625。
実施例３１．300リットルの培養液からのデスルファト
ヒルジンの単離 pH値3.3を有する培養液（実施例３０参照）を１７℃に
冷却する。細胞を、Westfalia SA−１４スラッジ除去装
置（400〜600リットル／時間）により分離する。濃いス
ラッジは廃棄する。僅かに濁りを有する上澄液を、一連
のSkanフィルターカートリッジ（第一：孔径５μｍ；第
二：孔径１μｍ：第三：孔径0.22μｍ）を通して濾過
し、NaOHでpH7.5にしてDEAE陰イオン交換カラムに適用
する。カラムを酢酸ナトリウム（２０ｍＭ，pH4.5）で
洗浄し、酢酸ナトリウム（２０ｍＭ，pH3.1）で溶出す
る。溶液（１５リットル）をNaOHでpH7.5に調整して、
循環蒸発装置で濃縮して最終容積を1.8リットルにす
る。１リットルをSephadex Ｇ−25カラム（ベッド容
積：８リットル、カラムは水で平衡にする）に充填す
る。デスルファトヒルジンを含む分画をHPLCで同定す
る。デスルファトヒルジン分画（2.5リットル）を高真
空のローターバップで濃縮して最終容積を200ｍｌとし
て、凍結乾燥する。
２ｇの原料を５０ｍｌの水に溶解し、NaOHでpH7.5に調
整し、Ｑ Sepharose迅速硫下カラム（ベッド容積：200
ｍｌ）に適用する。カラムをギ酸アンモニウム（100ｍ
Ｍ、pH3.9）で洗浄する。２５ｍｌの画分を採取してHPL
Cによってデスルファトヒルジンを試験する。デスルフ
ァトヒルジンを含む分画（１〜６５）をまとめて（125
ｍｌ）高真空のロータバップで最終容積を１０ｍｌまで
濃縮する。濃縮した溶液をSephadex Ｇ−25カラム（Am
icon、カラムを水で平衡にしてある）に適用し、そして
脱塩する。得られる透明な溶液（２５ｍｌ）を凍結乾燥
する。精製する固形物は、純粋なデスルファトヒルジン
から成る。
実施例３２．プラスミドpJDB207／PH05−EGLの造成 ヒルに由来する７０個のアミノ酸から成るポリペプチド
であるエグリンＣをコードするヌクレオチド配列は、試
験管内で合成されており、欧州特出願第146,785号明細
書記載のようにＥ．コリでサブクローン化され、発現さ
れている。エグリンコード配列のPH05シグナルペプチド
をコードする配列への正確なインフレーム融合は、実施
例１５および１６におけるヒルジンについて記載したの
と全く同様に行われる。ベクター中のインサートの正確
な方向を有する単一クローンを、pJDB207／PH05−EGLと
称する。サッカロミセス・セレビシエーGRF18株を、通
常の方法で形質転換する。形質転換体を、実施例２９に
記載のように選択し、そして培養する。エグリンＣは、
培養液中には、検出されない。
【図面の簡単な説明】
第１図および第２図は、それぞれプラスミドpML300およ
びpML305の造成を示す模式図である。 第３図は、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドpHRi
148の造成を示す。 第４図は、発現プラスミドpML310の造成を示す。 第５図は、成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮ
Ａフラグメントの単離を示す模式図である。 第６図は、デスルファトヒルジンを分泌する発現プラス
ミドの造成を模式的に示す。 第７図は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を行う発
現プラスミドの造成を模式的に示す。 第８図は、PH05プロモータ領域を含有するPH05のBamH I
−Sal I制限フラグメントのＤＮＡ配列を示す。 第９図は、GAPDH遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ配
列を示す。 第１０図は、プラスミドpGAPDH−ELの造成を示す模式図
である。 第１１図は、プラスミドpGAPDH−FLおよびpGAPDH−EL中
に存在するGAPDHプロモーターフラグメントの配列を示
す。 第１２図は、プラスミドpJDB207／PH05(Eco)−HIRの造
成を示す。 第１３図は、プラスミドpJDB207／PAPEL−HIR(UAS1＋UA
S2)の造成を示す。 第１４図は、プラスミドpJDB207／〔GAPEL−HIR〕Ｄの
造成を示す。 第１５図は、プラスミドpJDB207／GAPFL−Ｉ−HIRの造
成を示す模式図である。 図面では、次の略号を用いる。 ｐ：プロモーター、ＳＳ：シグナル配列、 ｔ：ターミネーター、Ｌ：リンカー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 バルター メルキ スイス国，4313 メーリン，ブレーメンシ ュタールシュトラーセ 30 (72)発明者 ユッタ ハイム スイス国，4133 プラッテルン，ランクア ッカーベーク 18 (56)参考文献 特開 昭60−137286（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−136597（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−501140（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−502661（ＪＰ，Ａ) 国際公開85／4418（ＷＯ，Ａ) 欧州特許出願公開143081（ＥＰ，Ａ)

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】デスルファトヒルジンの製造方法であっ
    て、酵母性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジン
    をコードする第二のDNA配列及びその上流にありそして
    それとリーディングフレームが合っている酵母PH05又は
    インベルターゼのシグナルペプチドをコードする第一の
    DNA配列から成るDNAセグメントであって上記発現制御配
    列の転写制御下にあるものと、酵母の転写終止シグナル
    を含んで成るDNA配列とをそれぞれが含有する１個以上
    のDNAインサートを含んで成るハイブリッドベクターで
    形質転換された酵母細胞を適当な栄養条件下で培養し、 培地からデスルファトヒルジンを単離することを特徴と
    する方法。
  2. 【請求項２】発現制御配列が一つの酵母の遺伝子の上流
    活性化配列、およびもう一つの酵母遺伝子の機能性TATA
    ボックスを含む下流プロモーター要素から成るハイブリ
    ッドプロモーターである、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  3. 【請求項３】PH05プロモーターと、成熟デスルファトヒ
    ルジンをコードするDNA配列及びその上流にありそれと
    リーディングフレームが合っているPH05シグナル配列か
    ら成るDNAセグメントであって前記PH05プロモーターの
    転写制御下にあるものと、PH05遺伝子の３′フランキン
    グ配列とをそれぞれが含有する１個以上のDNAインサー
    トを有するハイブリッドベクターで形質転換した酵母を
    使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】GAPDHプロモーターと、成熟デスルファト
    ヒルジンをコードするDNA配列及びその上流にありそれ
    とリーディングフレームが合っているPH05シグナル配列
    から成るDNAセグメントであって前記GAPDHプロモーター
    の転写制御下にあるものと、PH05遺伝子の３′フランキ
    ング配列とをそれぞれが含有する１個以上のDNAインサ
    ートを有するハイブリッドベクターで形質転換した酵母
    を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】酵母PH05遺伝子の上流活性化部位及び酵母
    GAPDH遺伝子のTATAボックスを含む下流プロモーター要
    素を含んで成るハイブリッドプロモーターと、成熟デス
    ルファトヒルジンをコードするDNA配列及びその上流に
    あってそれとリーディングフレームが合っているPH05シ
    グナル配列を含んで成るDNAセグメントであって前記ハ
    イブリッド・プロモーターの転写制御下にあるものと、
    PH05遺伝子の３′フランキング配列とをそれぞれ含んで
    成る１個以上のDNAインサートを有するハイブリッドベ
    クターで形質転換した酵母を使用する、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】PH05プロモーターと、成熟デスルファトヒ
    ルジンをコードするDNA配列及びその上流にあってそれ
    とリーディングフレームが合っているインベルターゼ・
    シグナル配列を含んで成るDNAセグメントであって前記P
    H05プロモーターの転写制御下にあるものと、PH05遺伝
    子の３′フランキング配列とをそれぞれが含んで成る１
    個以上のDNAインサートを有するハイブリッド・ベクタ
    ーで形質転換した酵母を使用する、特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  7. 【請求項７】次の式： Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
    u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly
    Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gl
    n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser
    His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
    r を有するデス−(Leu64,Gln65)−デスルファトヒルジン
    変形体HV1を製造するための、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  8. 【請求項８】次の式： Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
    u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly
    Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gl
    n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser
    His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
    r Leu を有するデス−(Gln65)−デスルファトヒルジン変形体H
    V1を製造するための、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  9. 【請求項９】次の式： Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
    u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly
    Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gl
    n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser
    His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
    r Leu Gln を有するデスルファトヒルジン変形体HV1の製造のため
    の、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】次の式： Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
    u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly
    Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gl
    n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser
    His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
    r Leu Gln を有するデスルファトヒルジン変形体HV2の製造のため
    の、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】次の式： Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
    u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly
    Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gl
    n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser
    His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Al
    a Tyr Asp Glu を有するデスルファトヒルジン変形体PAの製造のため
    の、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】デス−(Val)2−デスルファトヒルジンの
    製造のための、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
JP61293558A 1985-12-12 1986-12-11 トロンビン阻害剤の製造方法 Expired - Lifetime JPH0650990B2 (ja)

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A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
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