JPH0650990B2 - トロンビン阻害剤の製造方法 - Google Patents
トロンビン阻害剤の製造方法Info
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- JPH0650990B2 JPH0650990B2 JP61293558A JP29355886A JPH0650990B2 JP H0650990 B2 JPH0650990 B2 JP H0650990B2 JP 61293558 A JP61293558 A JP 61293558A JP 29355886 A JP29355886 A JP 29355886A JP H0650990 B2 JPH0650990 B2 JP H0650990B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵母宿主によるデスルファトヒルジンの製造方
法に関する。
法に関する。
ヒルジンは天然にはヒルすなわちヒルド・メディシナリ
ス(Hirudo medicinalis)中に存在する抗凝血物質であ
る。ヒルジンは単一の蛋白質種ではなく、少なくとも3
種の、ヒルジン変形体1(HV1)、ヒルジン変形体2
(HV2)(欧州特許出願第158,564号明細書を参照さ
れたい)および「デス−(Val)2−ヒルジン」(欧州特許
出願第158,986号明細書を参照されたい)と命名された
成分から成っている。これ等の変形体は構造が互いに幾
つかのアミノ酸において異なっている(特にHV1のN
−末端配列がVal−Val−Tyrであり、HV2の
N−末端配列がIle−Thr−Tyrであり、「デス
−(Val)2−ヒルジン」のN−末端配列がThr−Tyr
である)が、N−末端の疎水性アミノ酸、C−末端の極
性アミノ酸、スルフェート・モノエステルとして存在す
るチロシン残基(Tyr63)、3個のジスルフィド・ブリッ
ジおよび抗凝血活性を共通に有する。
ス(Hirudo medicinalis)中に存在する抗凝血物質であ
る。ヒルジンは単一の蛋白質種ではなく、少なくとも3
種の、ヒルジン変形体1(HV1)、ヒルジン変形体2
(HV2)(欧州特許出願第158,564号明細書を参照さ
れたい)および「デス−(Val)2−ヒルジン」(欧州特許
出願第158,986号明細書を参照されたい)と命名された
成分から成っている。これ等の変形体は構造が互いに幾
つかのアミノ酸において異なっている(特にHV1のN
−末端配列がVal−Val−Tyrであり、HV2の
N−末端配列がIle−Thr−Tyrであり、「デス
−(Val)2−ヒルジン」のN−末端配列がThr−Tyr
である)が、N−末端の疎水性アミノ酸、C−末端の極
性アミノ酸、スルフェート・モノエステルとして存在す
るチロシン残基(Tyr63)、3個のジスルフィド・ブリッ
ジおよび抗凝血活性を共通に有する。
Ki値(複合体解離定数)が6×10-11Mであるヒルジン
は、既知の最も強力なトロンビン阻害剤であり、トロン
ビンへの特異的な親和性を特徴とする。血液凝固カスケ
ートのその他の酵素は、ヒルジンによって阻害されな
い。通常の抗凝血治療における好ましい抗凝血剤である
ヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直接にトロンビンに
対して阻害作用を行い、前者とは異なりアンチトロンビ
ンIIIを介して作用するものではない。精製したヒルジ
ンの唯一の薬理学的に検出し得る効果は、血液凝固の阻
害と血栓症の予防である。犬に静脈内に投与した場合に
は、多量に投与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する効果
は観察されなかった。ラット、豚および犬での試験で
は、ヒルジンは、(鬱血によってまたはトロンビンの注
射によって誘発される)実験的血栓症、内毒素ショック
およびDIC(散在性脈管内凝血)において有効である
ことが証明されている。直接比較試験を行った場合には
何時でも、ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが
証明されている。また、ヒルジンの毒性は極めて低く、
非抗原性であり且つ生物学的に活性な形で腎臓からのほ
ぼ完全なクリアランスを示す。
は、既知の最も強力なトロンビン阻害剤であり、トロン
ビンへの特異的な親和性を特徴とする。血液凝固カスケ
ートのその他の酵素は、ヒルジンによって阻害されな
い。通常の抗凝血治療における好ましい抗凝血剤である
ヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直接にトロンビンに
対して阻害作用を行い、前者とは異なりアンチトロンビ
ンIIIを介して作用するものではない。精製したヒルジ
ンの唯一の薬理学的に検出し得る効果は、血液凝固の阻
害と血栓症の予防である。犬に静脈内に投与した場合に
は、多量に投与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する効果
は観察されなかった。ラット、豚および犬での試験で
は、ヒルジンは、(鬱血によってまたはトロンビンの注
射によって誘発される)実験的血栓症、内毒素ショック
およびDIC(散在性脈管内凝血)において有効である
ことが証明されている。直接比較試験を行った場合には
何時でも、ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが
証明されている。また、ヒルジンの毒性は極めて低く、
非抗原性であり且つ生物学的に活性な形で腎臓からのほ
ぼ完全なクリアランスを示す。
ヒルジンはかなり以前から知られてはいたが、その優れ
た生物学的特性から期待される広汎な治療的利用は未だ
達成されていない。その極端に限定された入手可能性
は、医薬における広汎に使用する上での重要な欠点であ
る。従来は、ヒルジン製剤は本質的には天然物質(ヒル
抽出液)から得られており、入手には費用が掛かり且つ
困難であり、またこの方法は時間が掛かり且つ費用が掛
かる分離および精製法を用いている(P.WalsmannらのPh
armazie、第36巻、653頁(1981年);欧州特許出願第
158,986号明細書を参照されたい)。アミノ酸配列が6
5と比較的長という観点からも、従来のペプチド合成で
は経済的理由から成功の望みが少ない。それ故、ヒルジ
ンの治療効果の詳細な臨床試験及びその広汎な抗凝血治
療での使用を可能にする適当な量のヒルジンを製造する
には、新規な方法を用いなければならない。
た生物学的特性から期待される広汎な治療的利用は未だ
達成されていない。その極端に限定された入手可能性
は、医薬における広汎に使用する上での重要な欠点であ
る。従来は、ヒルジン製剤は本質的には天然物質(ヒル
抽出液)から得られており、入手には費用が掛かり且つ
困難であり、またこの方法は時間が掛かり且つ費用が掛
かる分離および精製法を用いている(P.WalsmannらのPh
armazie、第36巻、653頁(1981年);欧州特許出願第
158,986号明細書を参照されたい)。アミノ酸配列が6
5と比較的長という観点からも、従来のペプチド合成で
は経済的理由から成功の望みが少ない。それ故、ヒルジ
ンの治療効果の詳細な臨床試験及びその広汎な抗凝血治
療での使用を可能にする適当な量のヒルジンを製造する
には、新規な方法を用いなければならない。
かかる方法は、特に組換DNA技術によって提供され
る。この技術によれば、非常に多種の生理学的に活性な
ポリペプチドは対応する遺伝学的に変性された宿主生物
を培養することによって製造することが可能である。こ
れに関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸化されるデ
スルファトヒルジンを介してヒルによって製造されるも
のといわなければならない。ヒル以外の宿主は特異的な
スルフェート転移酵素系を欠いており、それゆえヒルジ
ンではなくデスルファトヒルジンを生成するものと予想
される。しかしながら、対応するヒルジン蛋白質のTyr6
3残基のフェノール性ヒドロキシルからのスルフェート
基の酵素による除去によって得られるデスルファトヒル
ジンタンパクによって明らかなように、その生物活性は
スルフェート基の不在によっては損なわれない(欧州特
許出願第142,860号明細書を参照されたい)。
る。この技術によれば、非常に多種の生理学的に活性な
ポリペプチドは対応する遺伝学的に変性された宿主生物
を培養することによって製造することが可能である。こ
れに関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸化されるデ
スルファトヒルジンを介してヒルによって製造されるも
のといわなければならない。ヒル以外の宿主は特異的な
スルフェート転移酵素系を欠いており、それゆえヒルジ
ンではなくデスルファトヒルジンを生成するものと予想
される。しかしながら、対応するヒルジン蛋白質のTyr6
3残基のフェノール性ヒドロキシルからのスルフェート
基の酵素による除去によって得られるデスルファトヒル
ジンタンパクによって明らかなように、その生物活性は
スルフェート基の不在によっては損なわれない(欧州特
許出願第142,860号明細書を参照されたい)。
近年に公開された欧州特許出願第158,564号明細書に
は、それぞれのデスルファトヒルジン変形体のための構
造遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されE.コリ
(E.coli)細胞によるデスルファトヒルジン変形体および
2、並びにそれ等の類似体の製造が開示されている。培
養されたE.コリ細胞の細胞抽出液によって測定され且
つ抗トロンビン単位(「ATU」)量で与えられる抗凝
血活性は、3.000〜4,000ATU/0D600/培養液であり、
これは(純粋なヒルジン1mgの理論的比活性を15,000
〜20,000ATUとして)0.2mgヒルジン/OD/の濃度
に相当する。
は、それぞれのデスルファトヒルジン変形体のための構
造遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されE.コリ
(E.coli)細胞によるデスルファトヒルジン変形体および
2、並びにそれ等の類似体の製造が開示されている。培
養されたE.コリ細胞の細胞抽出液によって測定され且
つ抗トロンビン単位(「ATU」)量で与えられる抗凝
血活性は、3.000〜4,000ATU/0D600/培養液であり、
これは(純粋なヒルジン1mgの理論的比活性を15,000
〜20,000ATUとして)0.2mgヒルジン/OD/の濃度
に相当する。
形質転換されたE.コリ細胞から得られる低収率のヒル
ジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の不正確な折り
畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不活性な形で蓄
積されることに起因するものと考えられる。正確な折り
畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジン分子内の3個
のジスルフィドブリッジの形成によるものである(P.Wa
lsmannらの上記文献を参照されたい)。その他の天然に
分泌される哺乳類の蛋白質、例えば子牛の成長ホルモ
ン、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子およびヒト
γ−インターフェロンも、微生物の細胞質中に生産され
且つ蓄積された場合には本質的には不活性である〔R.A.
Smithら、Science、第229巻、1219頁(1985年)を参照
されたい〕。ジスルフィドブリッジを有するほとんどの
蛋白質は細胞外性であるので、その分泌経路はジスルフ
ィド結合の形成に有利であろう。分泌を非常に好ましく
するその他の特徴がある。すなわち、分泌された蛋白質
は、一般的に細胞内に蓄積された生成物よりも容易に検
出され且つ精製され、所望の生成物が培地中に分泌され
ることにより、生成物を回収するために宿主生物を破壊
する必要がなく;幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対し
て毒性効果を有し、分泌されると、それ等は正状な細胞
機能を余り妨害しなくなり;分泌された蛋白質は、細胞
の崩壊時に蛋白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積
された蛋白質よりもこれ等の酵素によって消化されにく
い。
ジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の不正確な折り
畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不活性な形で蓄
積されることに起因するものと考えられる。正確な折り
畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジン分子内の3個
のジスルフィドブリッジの形成によるものである(P.Wa
lsmannらの上記文献を参照されたい)。その他の天然に
分泌される哺乳類の蛋白質、例えば子牛の成長ホルモ
ン、ヒトの組織プラスミノーゲン活性化因子およびヒト
γ−インターフェロンも、微生物の細胞質中に生産され
且つ蓄積された場合には本質的には不活性である〔R.A.
Smithら、Science、第229巻、1219頁(1985年)を参照
されたい〕。ジスルフィドブリッジを有するほとんどの
蛋白質は細胞外性であるので、その分泌経路はジスルフ
ィド結合の形成に有利であろう。分泌を非常に好ましく
するその他の特徴がある。すなわち、分泌された蛋白質
は、一般的に細胞内に蓄積された生成物よりも容易に検
出され且つ精製され、所望の生成物が培地中に分泌され
ることにより、生成物を回収するために宿主生物を破壊
する必要がなく;幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対し
て毒性効果を有し、分泌されると、それ等は正状な細胞
機能を余り妨害しなくなり;分泌された蛋白質は、細胞
の崩壊時に蛋白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積
された蛋白質よりもこれ等の酵素によって消化されにく
い。
ほとんどの分泌される蛋白質は、成熟アミノ酸配列に附
随するアミノ末端伸長部としてのシグナルペプチドを有
するプレ蛋白質としてDNA上にコードされている。シ
グナルペプチドは、小泡体(ER)の膜中への蛋白質の
翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な役割を演じ
る。シグナルペプチダーゼはERの管腔側で早期にシグ
ナルペプチドを開裂させる。外側細胞膜へのその後の輸
送はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白質はペリプ
ラズム空間(例えば、酸性ホスファターゼ、インベルタ
ーゼ)中へも、または培地(例えばα−ファクター、キ
ラー・トキシン)中へも分泌される。
随するアミノ末端伸長部としてのシグナルペプチドを有
するプレ蛋白質としてDNA上にコードされている。シ
グナルペプチドは、小泡体(ER)の膜中への蛋白質の
翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な役割を演じ
る。シグナルペプチダーゼはERの管腔側で早期にシグ
ナルペプチドを開裂させる。外側細胞膜へのその後の輸
送はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白質はペリプ
ラズム空間(例えば、酸性ホスファターゼ、インベルタ
ーゼ)中へも、または培地(例えばα−ファクター、キ
ラー・トキシン)中へも分泌される。
総ての真核生物は遺伝情報を発現しそして発現された蛋
白質を分別する機構を共有すると思われるので、真核生
物宿主ではE.コリよりもはるかに効率的に真核遺伝子
の発現が進行する。真核生物の中では、酵母が最初に操
作され且つ培養されるようになったものである。多数の
異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてきた。しかしな
がら、付加されたシグナルペプチドの場合を除き、媒質
中に効率的に分泌させることができる蛋白質の本質的な
特徴を定義することは今までのところは不可能であっ
た。それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かについて確実
に予測することは可能になっていない。例えば、(プレ
ーグルコアミラーゼについての遺伝子情報を有する)形
質転換された酵母によって産生される総グルコアミラー
ゼの90%は培地中に分泌され(特許協力条約に基づく
特許出願第84/2921号明細書)、高力価の表皮成長因子
(EGF)が附随するαファクター・シグナルペプチド
を有するEGFの遺伝子を含む培養酵母の培地中に見い
出されるが(欧州特許出願第116,201号明細書)、β−
エンドルフィン(α因子シグナルペプチド、特許協力条
約に基づく特許出願第84/4330号明細書)、真核生物の
インターフェロンA(インベルターゼシグナルペプチ
ド、欧州特許出願第127,304号明細書)、ヒトγ−イン
ターフェロン、ヒト血清アルブミン、ウシインターフェ
ロンα1およびα2、組織プラスミノーゲン活性化因
子、レニンおよびヒトインシュリン様成長因子(α−フ
ァクター・シグナルペプチド、欧州特許出願第123,544
号明細書)、白血球インターフェロンDおよびA、γ−
インターフェロンおよびヒト成長ホルモン(MGH)
(それぞれインターフェロンおよびMGHシグナルペプ
チド、欧州特許出願第88,632号明細書)は少量または痕
跡量しか培地中に検出されず、形質転換された酵母で
は、シュドモナス・カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)
〔G2(CPG2)シグナルペプチド、欧州特許出願第121,352
号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子(PH
05シグナルペプチド、欧州特許出願第143,081号明細
書)の媒質中への分泌は見られない。したがって、附随
のシグナルペプチドを有する所定の蛋白質が酵母によっ
て分泌されるか否かは予測不可能であり、結局のところ
選択される蛋白質によって異る。また、付随のシグナル
ペプチドを有するヒルジンの様な選択された蛋白質が酵
母のような形質転換された宿主生物によって少なくとも
ある程度まで分泌されるかどうかについては、不確実で
あった。
白質を分別する機構を共有すると思われるので、真核生
物宿主ではE.コリよりもはるかに効率的に真核遺伝子
の発現が進行する。真核生物の中では、酵母が最初に操
作され且つ培養されるようになったものである。多数の
異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてきた。しかしな
がら、付加されたシグナルペプチドの場合を除き、媒質
中に効率的に分泌させることができる蛋白質の本質的な
特徴を定義することは今までのところは不可能であっ
た。それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かについて確実
に予測することは可能になっていない。例えば、(プレ
ーグルコアミラーゼについての遺伝子情報を有する)形
質転換された酵母によって産生される総グルコアミラー
ゼの90%は培地中に分泌され(特許協力条約に基づく
特許出願第84/2921号明細書)、高力価の表皮成長因子
(EGF)が附随するαファクター・シグナルペプチド
を有するEGFの遺伝子を含む培養酵母の培地中に見い
出されるが(欧州特許出願第116,201号明細書)、β−
エンドルフィン(α因子シグナルペプチド、特許協力条
約に基づく特許出願第84/4330号明細書)、真核生物の
インターフェロンA(インベルターゼシグナルペプチ
ド、欧州特許出願第127,304号明細書)、ヒトγ−イン
ターフェロン、ヒト血清アルブミン、ウシインターフェ
ロンα1およびα2、組織プラスミノーゲン活性化因
子、レニンおよびヒトインシュリン様成長因子(α−フ
ァクター・シグナルペプチド、欧州特許出願第123,544
号明細書)、白血球インターフェロンDおよびA、γ−
インターフェロンおよびヒト成長ホルモン(MGH)
(それぞれインターフェロンおよびMGHシグナルペプ
チド、欧州特許出願第88,632号明細書)は少量または痕
跡量しか培地中に検出されず、形質転換された酵母で
は、シュドモナス・カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)
〔G2(CPG2)シグナルペプチド、欧州特許出願第121,352
号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子(PH
05シグナルペプチド、欧州特許出願第143,081号明細
書)の媒質中への分泌は見られない。したがって、附随
のシグナルペプチドを有する所定の蛋白質が酵母によっ
て分泌されるか否かは予測不可能であり、結局のところ
選択される蛋白質によって異る。また、付随のシグナル
ペプチドを有するヒルジンの様な選択された蛋白質が酵
母のような形質転換された宿主生物によって少なくとも
ある程度まで分泌されるかどうかについては、不確実で
あった。
驚くべきことには、デスルファトヒルジンの構造遺伝子
及びその上流にありそしてそれとリーディングフレーム
が合っているシグナルペプチドをコードするDNA配列
を含んで成るDNAを含有する真核宿主生物によって、
ヒルジン活性を有する蛋白質が培地中に分泌されること
が見い出された。
及びその上流にありそしてそれとリーディングフレーム
が合っているシグナルペプチドをコードするDNA配列
を含んで成るDNAを含有する真核宿主生物によって、
ヒルジン活性を有する蛋白質が培地中に分泌されること
が見い出された。
本発明の目的は、真核宿主生物においてヒルジン活性を
有する蛋白質の生産および分泌のための方法を提供する
ことである。
有する蛋白質の生産および分泌のための方法を提供する
ことである。
本発明のもう一つの目的は、デスルファトヒルジンの構
造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードするD
NA配列を含有するハイブリッドベクター、並びに上記
ハイブリッド・ベクターにより形質転換された真核宿主
生物を提供することである。
造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードするD
NA配列を含有するハイブリッドベクター、並びに上記
ハイブリッド・ベクターにより形質転換された真核宿主
生物を提供することである。
具体的な説明 1.デスルファトヒルジンの製造法。
本発明は、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であ
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のDNA配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のDNA配列から成るDNA
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るD
NA配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタンパクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のDNA配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のDNA配列から成るDNA
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るD
NA配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタンパクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
「成熟デスルファトヒルジンをコードするDNA配列」
という用語は、ヒルゲノムに存在することが知られてお
り、そして/または上記ゲノムから分離することができ
る、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコードする総て
の構造遺伝子、例えば、成熟デスルファトヒルジン変形
体HV1、HV2、PA、およびデス−(Val)2−デスル
ファトヒルジン(HV1遺伝子の発現の単なる人工産物
ではない場合)の構造遺伝子を包含することを意図す
る。「成熟デスルファトヒルジン」という用語は、プレ
−配列およびプロ−配列を欠いているデスルファトヒル
ジンを指す。
という用語は、ヒルゲノムに存在することが知られてお
り、そして/または上記ゲノムから分離することができ
る、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコードする総て
の構造遺伝子、例えば、成熟デスルファトヒルジン変形
体HV1、HV2、PA、およびデス−(Val)2−デスル
ファトヒルジン(HV1遺伝子の発現の単なる人工産物
ではない場合)の構造遺伝子を包含することを意図す
る。「成熟デスルファトヒルジン」という用語は、プレ
−配列およびプロ−配列を欠いているデスルファトヒル
ジンを指す。
「ヒルジン活性を有する蛋白質」とは、トロンビン阻害
作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を有し、そして
デスルファトヒルジンの一次構造を有する分泌宿主細胞
から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸化の様な修飾
がなされた対応するヒルジン化合物、および短縮された
それ等の誘導体、例えばC−末端の1〜7個のアミノ酸
を欠いているデスルファトヒルジンであると理解すべき
である。
作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を有し、そして
デスルファトヒルジンの一次構造を有する分泌宿主細胞
から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸化の様な修飾
がなされた対応するヒルジン化合物、および短縮された
それ等の誘導体、例えばC−末端の1〜7個のアミノ酸
を欠いているデスルファトヒルジンであると理解すべき
である。
上記の蛋白質は、具体的には次の式(I): 〔式中、Xはジペプチド残基Val−Val−(HV
1)またはThr〔デス−(Val)2−ヒルジン〕であり、
そしてRはTyrのフェノール性ヒドロキシル基または
式−O−SO3Hで表わされる基である〕、で表わされる蛋
白質、並びにC−末端アミノ酸Gln、C−末端ジペプ
チド−Leu−Gln、C−末端トリペプチド−Tyr
(R)−Leu−GlnまたはC−末端テトラペプチド
−Glu−Tyr(R)−Leu−Glnを欠いている誘導体;あるい
は、 次の式(II): (HV2)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わ
される蛋白質;あるいは、ヒルジンPAと命名され、ヒ
ルによって産生され(J.Dodt、博士論文、ミュンヘン大
学、西ドイツ、1984年)、そして次の式(III): (PA)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わさ
れるもう一つのヒルジン変形体である。
1)またはThr〔デス−(Val)2−ヒルジン〕であり、
そしてRはTyrのフェノール性ヒドロキシル基または
式−O−SO3Hで表わされる基である〕、で表わされる蛋
白質、並びにC−末端アミノ酸Gln、C−末端ジペプ
チド−Leu−Gln、C−末端トリペプチド−Tyr
(R)−Leu−GlnまたはC−末端テトラペプチド
−Glu−Tyr(R)−Leu−Glnを欠いている誘導体;あるい
は、 次の式(II): (HV2)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わ
される蛋白質;あるいは、ヒルジンPAと命名され、ヒ
ルによって産生され(J.Dodt、博士論文、ミュンヘン大
学、西ドイツ、1984年)、そして次の式(III): (PA)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わさ
れるもう一つのヒルジン変形体である。
ヒルジン活性を有する好ましい蛋白質は、式I(但し、
Xは残基Val−Val−であり、RはTyrのフェノ
ール性ヒドロキシル基である)を有する蛋白質、および
C−末端においてアミノ酸が1〜7個、特に1〜4個だ
け短縮されているその誘導体である。
Xは残基Val−Val−であり、RはTyrのフェノ
ール性ヒドロキシル基である)を有する蛋白質、および
C−末端においてアミノ酸が1〜7個、特に1〜4個だ
け短縮されているその誘導体である。
好適な真核宿主生物は、高等生物、特に、哺乳類の細
胞、特にVEROもしくはHera細胞またはチャイニーズハム
スターの卵巣(CHO)セルラインのような樹立された
ヒトまたは動物セルラインおよびサッカロミセス・セレ
ビシエー(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母であ
る。本発明の好ましい宿主生物は、酵母、特にサッカロ
ミセス・セレビシエーの株である。
胞、特にVEROもしくはHera細胞またはチャイニーズハム
スターの卵巣(CHO)セルラインのような樹立された
ヒトまたは動物セルラインおよびサッカロミセス・セレ
ビシエー(Saccharomyces cerevisiae)のような酵母であ
る。本発明の好ましい宿主生物は、酵母、特にサッカロ
ミセス・セレビシエーの株である。
上記DNA配列を有する真核宿主生物、特に酵母は、当
業界において既知の方法を用いて培養される。
業界において既知の方法を用いて培養される。
本発明により形質転換された酵母株は、資化可能な炭素
源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で培養
される。
源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で培養
される。
各種の炭素源が利用できる。好ましい炭素源の例は、グ
リコース、マルトースまたはラクトースのような資化性
炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢酸塩であり、
単独でまたは適当な混合物として用いることができる。
好適な窒素源としては、例えカザミノ酸のようなアミノ
酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等の分解生成物、
例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エキス、更に酵母
エキス、マルトエキス、コーンスティープリカー、ある
いはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあり、単独でもま
たは適当な混合物としても用いられる。使用することが
できる無機塩には例えば、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩
および炭酸塩がある。また、培地は成長促進物質を含ん
でいてもよい。成長を促進する物質には、例えば鉄、亜
鉛、マグネシウムなどのような痕跡量の元素またはアミ
ノ酸がある。
リコース、マルトースまたはラクトースのような資化性
炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢酸塩であり、
単独でまたは適当な混合物として用いることができる。
好適な窒素源としては、例えカザミノ酸のようなアミノ
酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等の分解生成物、
例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エキス、更に酵母
エキス、マルトエキス、コーンスティープリカー、ある
いはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあり、単独でもま
たは適当な混合物としても用いられる。使用することが
できる無機塩には例えば、ナトリウム、カリウム、マグ
ネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩
および炭酸塩がある。また、培地は成長促進物質を含ん
でいてもよい。成長を促進する物質には、例えば鉄、亜
鉛、マグネシウムなどのような痕跡量の元素またはアミ
ノ酸がある。
自律複製プラスミド、例えば酵母2μプラスミドDNA
(後記)で形質転換された酵母細胞は、導入されたハイ
ブリッドプラスミドを、種々の程度で失いやすい。この
ため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、すなわち増殖
のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現を要す
る条件下で生育させねばならない。一般に用いられ、そ
して本発明のハイブリッドベクターに存在するほとんど
の選択マーカー(後述)は、アミノ酸またはプリン生合
成の酵素をコードする遺伝子である。これにより、対応
するアミノ酸またはプリン塩基を欠いている合成最少培
地を用いることが必要になる。しかしながら、適当な殺
生物剤に対する耐性を付与する遺伝子(例えば、シクロ
ヘキシミド、アミノグルコシドG418、重金属などに対す
る耐性を付与する遺伝子)も同様に用いられる。抗生物
質耐性遺伝子を有するベクターで形質転換された酵母細
胞を、対応する抗生物質を含む複合培地中で生育させる
ことにより、増殖速度を速め、細胞密度を高くする。
(後記)で形質転換された酵母細胞は、導入されたハイ
ブリッドプラスミドを、種々の程度で失いやすい。この
ため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、すなわち増殖
のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現を要す
る条件下で生育させねばならない。一般に用いられ、そ
して本発明のハイブリッドベクターに存在するほとんど
の選択マーカー(後述)は、アミノ酸またはプリン生合
成の酵素をコードする遺伝子である。これにより、対応
するアミノ酸またはプリン塩基を欠いている合成最少培
地を用いることが必要になる。しかしながら、適当な殺
生物剤に対する耐性を付与する遺伝子(例えば、シクロ
ヘキシミド、アミノグルコシドG418、重金属などに対す
る耐性を付与する遺伝子)も同様に用いられる。抗生物
質耐性遺伝子を有するベクターで形質転換された酵母細
胞を、対応する抗生物質を含む複合培地中で生育させる
ことにより、増殖速度を速め、細胞密度を高くする。
染色体に組み込まれるDNAにより形質転換された酵母
細胞は、選択的増殖条件を必要としない。これ等の形質
転換細胞は十分に安定であり、選択圧なしで増殖を行う
ことができる。これらの細胞は、複合培地中で有利に増
殖する。
細胞は、選択的増殖条件を必要としない。これ等の形質
転換細胞は十分に安定であり、選択圧なしで増殖を行う
ことができる。これらの細胞は、複合培地中で有利に増
殖する。
構成的プロモーター(例えばADH I、GAPDH)を有するハ
イブリッドプラスミドを含む酵母細胞は、誘導なしに上
記プロモーターによって制御されたたデスルファトヒル
ジン遺伝子を発現する。しかしながら、このデスルファ
トヒルジン遺伝子が調節されるプロモーター(例えばPG
KまたはPH05)の制御下にある場合には、mRNA転写
物の水準を最高にするような増殖培地の組成を採用しな
ければならない。すなわち、PH05プロモーターを用いる
ときには、増殖培地はこのプロモーターを抑制解除する
ための低濃度の無機リン酸塩を含んでいなければならな
い。
イブリッドプラスミドを含む酵母細胞は、誘導なしに上
記プロモーターによって制御されたたデスルファトヒル
ジン遺伝子を発現する。しかしながら、このデスルファ
トヒルジン遺伝子が調節されるプロモーター(例えばPG
KまたはPH05)の制御下にある場合には、mRNA転写
物の水準を最高にするような増殖培地の組成を採用しな
ければならない。すなわち、PH05プロモーターを用いる
ときには、増殖培地はこのプロモーターを抑制解除する
ための低濃度の無機リン酸塩を含んでいなければならな
い。
培養は、常用技術を用いることによって行う。温度、培
地のpHおよび醗酵時間のような培養条件は、最高水準の
デスルファトヒルジンが産生されるように選択される。
選択された酵母株を、約25℃〜35℃、好ましくは約30
℃の温度で、4〜8のpH値、例えば約7のpHで、約4〜
約20時間、好ましくは最大収量の蛋白質が得られるま
で、振盪または攪拌を行いながら、好気性条件下で液内
培養で生育させるのが好ましい。
地のpHおよび醗酵時間のような培養条件は、最高水準の
デスルファトヒルジンが産生されるように選択される。
選択された酵母株を、約25℃〜35℃、好ましくは約30
℃の温度で、4〜8のpH値、例えば約7のpHで、約4〜
約20時間、好ましくは最大収量の蛋白質が得られるま
で、振盪または攪拌を行いながら、好気性条件下で液内
培養で生育させるのが好ましい。
意外なことには、宿主生物および使用されるシグナルペ
プチドとは無関係に、ほとんどの産生されたヒルジン化
合物は培地中に分泌され、極一部分だけ細胞に結合した
まま残ることが見い出された。分泌された化合物/細胞
に結合した化合物の正確な比率は、醗酵条件および用い
た回収法によって変化する。一般的には、その比率は約
9:1以上になる。したがって、分泌されたヒルジンが
常に圧倒的な割合を占める。
プチドとは無関係に、ほとんどの産生されたヒルジン化
合物は培地中に分泌され、極一部分だけ細胞に結合した
まま残ることが見い出された。分泌された化合物/細胞
に結合した化合物の正確な比率は、醗酵条件および用い
た回収法によって変化する。一般的には、その比率は約
9:1以上になる。したがって、分泌されたヒルジンが
常に圧倒的な割合を占める。
ヒルジン化合物は、通常の方法によって培地から分離す
ることができる。例えば、第一の段階は、遠心分離によ
って細胞を培地から分離することにある。生ずる上澄液
をポリエチレンイミンで処理して大部分の非蛋白質性物
質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウムまたはトリ
クロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を沈澱せしめる
ことによって、ヒルジン化合物の濃度を高くする。宿主
蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性にすることによ
って、例えば、0.1%、pH4〜5)それを沈澱させるこ
ともできる。酢酸上澄液をn−ブタノールで抽出するこ
とによって、ヒルジン化合物の濃度を更に高くすること
ができる。他の精製工程は、例えば、脱塩、イオン交換
クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、分配ク
ロマトグラフィ、HPLC、逆相クロマトグラフィ法などの
クロマトグラフィ法である。混合物の成分の分離は、透
析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法による荷電に従
って、適当なセファデックスカラムによる分子サイズに
従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用いるアフィニ
ティークロマトグラフィにより、あるいは適当な担体に
結合したトロンビンを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィにより、あるいはその他の方法、特に文献公知の
方法によって行うこともできる。
ることができる。例えば、第一の段階は、遠心分離によ
って細胞を培地から分離することにある。生ずる上澄液
をポリエチレンイミンで処理して大部分の非蛋白質性物
質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウムまたはトリ
クロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を沈澱せしめる
ことによって、ヒルジン化合物の濃度を高くする。宿主
蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性にすることによ
って、例えば、0.1%、pH4〜5)それを沈澱させるこ
ともできる。酢酸上澄液をn−ブタノールで抽出するこ
とによって、ヒルジン化合物の濃度を更に高くすること
ができる。他の精製工程は、例えば、脱塩、イオン交換
クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、分配ク
ロマトグラフィ、HPLC、逆相クロマトグラフィ法などの
クロマトグラフィ法である。混合物の成分の分離は、透
析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法による荷電に従
って、適当なセファデックスカラムによる分子サイズに
従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用いるアフィニ
ティークロマトグラフィにより、あるいは適当な担体に
結合したトロンビンを用いるアフィニティークロマトグ
ラフィにより、あるいはその他の方法、特に文献公知の
方法によって行うこともできる。
細胞に結合しているヒルジン化合物、すなわち細胞内ま
たはペリプラズマ空間に蓄積した化合物をも分離するこ
とが所望ならば、幾つかの補足的精製工程を必要とす
る。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している場合には、
目的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞内部から蛋
白質を遊離させることである。ほとんどの処理において
は、最初に、グルコシダーゼ(後述)を用いる酵素的消
化によって細胞壁を取り除く。次いで、生成するスペロ
プラストをTritonのような洗剤で処理する。また、剪断
力(例えば、X−プレス、フレンチ−プレス)またはガ
ラス玉との振盪のような機械的力も、細胞を破壊するの
に好適である。ヒルジン化合物が宿主、特に酵母細胞に
よってペリプラズマ空間中に分泌される場合には、単純
化された方法を用いることができる。すなわち、蛋白質
は、細胞壁を酵素的に除去することにより、または化学
的薬剤、例えばチオール試薬もしくはEDTAを用いて処理
し、細胞壁に損傷を与えて産生した蛋白質が放出される
ようにすることによって、細胞を溶解することなく回収
される。
たはペリプラズマ空間に蓄積した化合物をも分離するこ
とが所望ならば、幾つかの補足的精製工程を必要とす
る。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している場合には、
目的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞内部から蛋
白質を遊離させることである。ほとんどの処理において
は、最初に、グルコシダーゼ(後述)を用いる酵素的消
化によって細胞壁を取り除く。次いで、生成するスペロ
プラストをTritonのような洗剤で処理する。また、剪断
力(例えば、X−プレス、フレンチ−プレス)またはガ
ラス玉との振盪のような機械的力も、細胞を破壊するの
に好適である。ヒルジン化合物が宿主、特に酵母細胞に
よってペリプラズマ空間中に分泌される場合には、単純
化された方法を用いることができる。すなわち、蛋白質
は、細胞壁を酵素的に除去することにより、または化学
的薬剤、例えばチオール試薬もしくはEDTAを用いて処理
し、細胞壁に損傷を与えて産生した蛋白質が放出される
ようにすることによって、細胞を溶解することなく回収
される。
意外なことには、「成熟デスルファトヒルジンをコード
するDNA配列」に対応するデスルファトヒルジン化合
物とは別に、予想される化合物とはC−末端においてア
ミノ酸が1〜4個欠けている点において異なる幾つかの
その他のデスルファトヒルジン化合物を培養液から単離
することができることが見出された。例えば、デスルフ
ァトヒルジン変形体HV1をコードする遺伝子を有する
酵母細胞を培養すると、この化合物と共に、C−末端ア
ミノ酸Glnを欠いているデスルファトヒルジン化合物
〔デス−(Gln65)−デスルファトヒルジン〕、C−末端
のジペプチド残基−Leu−Glnを欠いているデスル
ファトヒルジン化合物〔デス−(Leu64,Gln65)−デスル
ファトヒルジン〕、C−末端のトリペプチド残基−Ty
r−Leu−Glnを欠いているデスルファトヒルジン
化合物〔デス−(Tyr63,Leu64,Gln65)−デスルファト
ヒルジン〕、およびC−末端テトラペプチド残基−Glu
−Tyr−Leu−Glnを欠いているデスルファトヒルジン化
合物〔デス−(Glu62,Tyr63,Leu64,Gln65)−デスルフ
ァトヒルジン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの
化合物は、一次発現生成物デスルファトヒルジンの(部
分的)蛋白質分解的な分解によって形成されたものと思
われ、用いた酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関
係に、総ての培溶液中に置いて同定された。
するDNA配列」に対応するデスルファトヒルジン化合
物とは別に、予想される化合物とはC−末端においてア
ミノ酸が1〜4個欠けている点において異なる幾つかの
その他のデスルファトヒルジン化合物を培養液から単離
することができることが見出された。例えば、デスルフ
ァトヒルジン変形体HV1をコードする遺伝子を有する
酵母細胞を培養すると、この化合物と共に、C−末端ア
ミノ酸Glnを欠いているデスルファトヒルジン化合物
〔デス−(Gln65)−デスルファトヒルジン〕、C−末端
のジペプチド残基−Leu−Glnを欠いているデスル
ファトヒルジン化合物〔デス−(Leu64,Gln65)−デスル
ファトヒルジン〕、C−末端のトリペプチド残基−Ty
r−Leu−Glnを欠いているデスルファトヒルジン
化合物〔デス−(Tyr63,Leu64,Gln65)−デスルファト
ヒルジン〕、およびC−末端テトラペプチド残基−Glu
−Tyr−Leu−Glnを欠いているデスルファトヒルジン化
合物〔デス−(Glu62,Tyr63,Leu64,Gln65)−デスルフ
ァトヒルジン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの
化合物は、一次発現生成物デスルファトヒルジンの(部
分的)蛋白質分解的な分解によって形成されたものと思
われ、用いた酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関
係に、総ての培溶液中に置いて同定された。
デス−(Gln65)−デスルファトヒルジン、デス−(Ty
r63,Leu64,Gln65)−デスルファトヒルジン〕、および
デス−(Gln62,Tyr63,Leu64,Gln65)−デスルファトヒ
ルジンは新規であり、そしてやはり本発明の目的であ
る。
r63,Leu64,Gln65)−デスルファトヒルジン〕、および
デス−(Gln62,Tyr63,Leu64,Gln65)−デスルファトヒ
ルジンは新規であり、そしてやはり本発明の目的であ
る。
抗ヒルジン抗体または抗デスルファトヒルジン抗体(例
えば、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル
抗体)を用いる試験、トロンビン試験〔M.U.Bergmeyer
監修、Methods in Enzymatic Analysis、第II巻、314〜
316頁、Verlag Chemie、Weinheim(西ドイツ)、1983
年〕、または凝血試験〔F.Markwardtら、Thromb.Haemos
t.、第47巻、226頁(1982年)〕を用いてヒルジン活
性を検出することができる。
えば、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル
抗体)を用いる試験、トロンビン試験〔M.U.Bergmeyer
監修、Methods in Enzymatic Analysis、第II巻、314〜
316頁、Verlag Chemie、Weinheim(西ドイツ)、1983
年〕、または凝血試験〔F.Markwardtら、Thromb.Haemos
t.、第47巻、226頁(1982年)〕を用いてヒルジン活
性を検出することができる。
本発明の方法によってえられるヒルジン化合物は、それ
自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ変換すること
ができる。
自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ変換すること
ができる。
例えば、式(I)〜(III)の化合物(但し、RはTy
rのフェノール性ヒドロキシル基である)は硫酸二ナト
リウムのような硫酸塩および例えばヒル細胞からえられ
るチロシンスルホトランスフェラーゼと反応させて、式
(I)〜(III)(但し、Rは式−OSO3Hで表わされる基
である)を有する化合物へ変換することができる。
rのフェノール性ヒドロキシル基である)は硫酸二ナト
リウムのような硫酸塩および例えばヒル細胞からえられ
るチロシンスルホトランスフェラーゼと反応させて、式
(I)〜(III)(但し、Rは式−OSO3Hで表わされる基
である)を有する化合物へ変換することができる。
得られたデスルファトヒルジン化合物、例えばデスルフ
ァトヒルジン変形体HV1を、例えば好適なカルボキシ
ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼYの作用
によってC−末端において1〜7このアミノ酸を欠いて
いる誘導体へ変換することも可能である。
ァトヒルジン変形体HV1を、例えば好適なカルボキシ
ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼYの作用
によってC−末端において1〜7このアミノ酸を欠いて
いる誘導体へ変換することも可能である。
本発明によって形質転換された真核宿主生物は、次の工
程を含んで成る組換DNA技術によって調製することが
できる。すなわち、 ◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンを
コードする第二のDNA配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームがあっているシグナルペプ
チドをコードする第一のDNA配列からなるDNAセグ
メントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるも
のと、真核生物の転写終止シグナルを有するDNA配列
とを含有するDNA造成物を調製し; ◎上記DNA造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し; ◎調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し;そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する; 工程を含んで成る。
程を含んで成る組換DNA技術によって調製することが
できる。すなわち、 ◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンを
コードする第二のDNA配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームがあっているシグナルペプ
チドをコードする第一のDNA配列からなるDNAセグ
メントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるも
のと、真核生物の転写終止シグナルを有するDNA配列
とを含有するDNA造成物を調製し; ◎上記DNA造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し; ◎調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し;そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する; 工程を含んで成る。
2.シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンのコー
ド領域を含んで成るDNA造成物 本発明は、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のDNA配列からなるD
NAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るDNA配列と含有するDNA造成物に関する。
ド領域を含んで成るDNA造成物 本発明は、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のDNA配列からなるD
NAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るDNA配列と含有するDNA造成物に関する。
シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンをコード
するDNA配列の発現を制御するために数種類の発現制
御配列を用いることができる。詳細には、形質転換され
る宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が用い
られる。
するDNA配列の発現を制御するために数種類の発現制
御配列を用いることができる。詳細には、形質転換され
る宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が用い
られる。
哺乳類の細胞に用いるには、発現制御配列は好ましくは
ウイルスに由来する。例えば、哺乳類の細胞に用いるの
に好適な発現制御配列は、シミアン・ウイルス(Simian
Virus)40(SV40)の初期および後記プロモーター、ワクシ
ニアプロモーター、HTLVプロモーター、またはポリオー
マもしくはアデノウイルス2に由来するプロモーターで
ある。
ウイルスに由来する。例えば、哺乳類の細胞に用いるの
に好適な発現制御配列は、シミアン・ウイルス(Simian
Virus)40(SV40)の初期および後記プロモーター、ワクシ
ニアプロモーター、HTLVプロモーター、またはポリオー
マもしくはアデノウイルス2に由来するプロモーターで
ある。
本発明による最も好ましい宿主生物である酵母の発現制
御配列は、酵母、特にサッカロミセス・セレビシエーの
ゲノムDNAに由来する。好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファトヒルジンの
発現のために用いられる。例えば、TRP1遺伝子、ADH I
またはADH II遺伝子、酸性ホスファターゼ(PH05)遺伝
子、イソチトクロームc遺伝子のプロモータ、あるいは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ(GAPDH)、3−ホスホグリセレートキ
ナーゼ(PGK)、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカル
ボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−
6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレー
トムターゼピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはa−または
α−ファクターをコードする酵母に適合するフェロモン
遺伝子のプロモーターを用いることができる。一つの酵
母遺伝子の上流活性化配列(UAS)ともう一つの酵母
遺伝子の機能性TATAボックスを含有する下流プロモータ
ー要素とを含んで成るハイブリッドプロモーター、例え
ば酵母PH05遺伝子のUASと酵母GAPDH遺伝子の機能的T
ATAボックスを含有する下流プロモーター要素とを含有
するハイブリッドプロモーターを用いることもできる。
本発明の好ましいベクターは、転写調節を伴うプロモー
ターを含有する。この型のプロモーター、例えばPH05遺
伝子のプロモーターおよびPH05−GAPDHハイブリッドプ
ロモーターは、増殖条件を変えることによってターンオ
ン又はターンオフすることができる。例えば、PH05プロ
モーターは、単に培地中の無機リン酸塩の濃度を増減さ
せることによって、自由に抑制したりまたは抑制を解除
したりすることができる。本発明の他の好ましいプロモ
ーターは、GAPDH遺伝子のプロモーター、特にヌクレオ
チド−300〜180、特にヌクレオチド−263〜−199から始
まり、そしてGAPDH遺伝子のヌクレオチド−5で終了す
る機能性フラグメントである。
御配列は、酵母、特にサッカロミセス・セレビシエーの
ゲノムDNAに由来する。好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファトヒルジンの
発現のために用いられる。例えば、TRP1遺伝子、ADH I
またはADH II遺伝子、酸性ホスファターゼ(PH05)遺伝
子、イソチトクロームc遺伝子のプロモータ、あるいは
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ(GAPDH)、3−ホスホグリセレートキ
ナーゼ(PGK)、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカル
ボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−
6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレー
トムターゼピルベートキナーゼ、トリセホスフェートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはa−または
α−ファクターをコードする酵母に適合するフェロモン
遺伝子のプロモーターを用いることができる。一つの酵
母遺伝子の上流活性化配列(UAS)ともう一つの酵母
遺伝子の機能性TATAボックスを含有する下流プロモータ
ー要素とを含んで成るハイブリッドプロモーター、例え
ば酵母PH05遺伝子のUASと酵母GAPDH遺伝子の機能的T
ATAボックスを含有する下流プロモーター要素とを含有
するハイブリッドプロモーターを用いることもできる。
本発明の好ましいベクターは、転写調節を伴うプロモー
ターを含有する。この型のプロモーター、例えばPH05遺
伝子のプロモーターおよびPH05−GAPDHハイブリッドプ
ロモーターは、増殖条件を変えることによってターンオ
ン又はターンオフすることができる。例えば、PH05プロ
モーターは、単に培地中の無機リン酸塩の濃度を増減さ
せることによって、自由に抑制したりまたは抑制を解除
したりすることができる。本発明の他の好ましいプロモ
ーターは、GAPDH遺伝子のプロモーター、特にヌクレオ
チド−300〜180、特にヌクレオチド−263〜−199から始
まり、そしてGAPDH遺伝子のヌクレオチド−5で終了す
る機能性フラグメントである。
シグナルペプチドをコードするDNA配列(「シグナル
配列」)は、真核細胞性の、例えば酵母の通常に分泌さ
れるポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。好
適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノムDNAから得
られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナル配列、例え
ば酵母インベルターゼ、a−ファクター、α−ファクタ
ー、フェロモンペプチダーゼ、「キラートキシン」およ
び抑制性酸性ホスファターゼ(PH05)遺伝子のシグナル
およびプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ
からグルコミラーゼシグナル配列である。また、融合シ
グナル配列は(存在するとすれば)用いるプロモーター
に天然に結合している遺伝子のシグナル配列の部分をヒ
ルジンシグナル配列の部分に連結することによって造成
することができる。これらの組み合わせは、シグナル配
列と成熟デスルファトヒルジンアミノ酸配列との間で正
確に開裂できるものが好ましい。追加の配列、例えば特
異的なプロセシングシグナルを担持するか又は担持しな
いプロ配列又はスペーサー配列をも造成物中に含ぬるこ
とによって前駆体分子の正確なプロセシングを容易にす
ることもできる。また、生体内または生体外での適切な
成熟を可能にする内部プロセシングシグナルを含有する
融合蛋白質を生成させることができる。例えば、プロセ
シングシグナルは、Lys−Arg残基を含有し、これ
はゴルジ体膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼによ
って認識される。本発明の好ましいシグナル配列は、次
の式: Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Se
r Leu Ala Asn Ala, で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PH05遺
伝子のシグナル配列、および次の式: Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ph
e Ala Ala Lys Ile Ser Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
配列」)は、真核細胞性の、例えば酵母の通常に分泌さ
れるポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。好
適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノムDNAから得
られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナル配列、例え
ば酵母インベルターゼ、a−ファクター、α−ファクタ
ー、フェロモンペプチダーゼ、「キラートキシン」およ
び抑制性酸性ホスファターゼ(PH05)遺伝子のシグナル
およびプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワモリ
からグルコミラーゼシグナル配列である。また、融合シ
グナル配列は(存在するとすれば)用いるプロモーター
に天然に結合している遺伝子のシグナル配列の部分をヒ
ルジンシグナル配列の部分に連結することによって造成
することができる。これらの組み合わせは、シグナル配
列と成熟デスルファトヒルジンアミノ酸配列との間で正
確に開裂できるものが好ましい。追加の配列、例えば特
異的なプロセシングシグナルを担持するか又は担持しな
いプロ配列又はスペーサー配列をも造成物中に含ぬるこ
とによって前駆体分子の正確なプロセシングを容易にす
ることもできる。また、生体内または生体外での適切な
成熟を可能にする内部プロセシングシグナルを含有する
融合蛋白質を生成させることができる。例えば、プロセ
シングシグナルは、Lys−Arg残基を含有し、これ
はゴルジ体膜中に存在する酵母エンドペプチダーゼによ
って認識される。本発明の好ましいシグナル配列は、次
の式: Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Se
r Leu Ala Asn Ala, で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PH05遺
伝子のシグナル配列、および次の式: Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ph
e Ala Ala Lys Ile Ser Ala で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列である。
成熟デスルファトヒルジンをコードするDNA配列は、
具体的には上記定義のデスルファトヒルジンの構造遺伝
子から選択される。好ましいDNA配列は、デスルファ
トヒルジン変形体1(HV1)をコードし、そして次の
式: で表わされる。
具体的には上記定義のデスルファトヒルジンの構造遺伝
子から選択される。好ましいDNA配列は、デスルファ
トヒルジン変形体1(HV1)をコードし、そして次の
式: で表わされる。
真核性の転写停止シグナルを有するDNA配列は、好ま
しくは転写停止およびポリアデニル化のための適当なシ
グナルを含有する真核性の遺伝子の3′−フランキング
(flanking)配列である。好適な3′−フランキング配列
は、例えば用いられる発現制御配列に天然に結合してい
る配列である。酵母が宿主生物として用いられる場合に
は、好ましいフランキング配列は酵母PH05遺伝子の配列
である。好ましくは、本発明のDNA造成物は、クロー
ニングベクターへの造成物挿入及びクローニングを可能
にする合成デオキシヌクレオチドリンカーを両端に備え
ている。
しくは転写停止およびポリアデニル化のための適当なシ
グナルを含有する真核性の遺伝子の3′−フランキング
(flanking)配列である。好適な3′−フランキング配列
は、例えば用いられる発現制御配列に天然に結合してい
る配列である。酵母が宿主生物として用いられる場合に
は、好ましいフランキング配列は酵母PH05遺伝子の配列
である。好ましくは、本発明のDNA造成物は、クロー
ニングベクターへの造成物挿入及びクローニングを可能
にする合成デオキシヌクレオチドリンカーを両端に備え
ている。
真核性発現制御配列、シグナルペプチドをコードするD
NA配列、成熟デスルファトヒルジンをコードするDN
A配列および真核性転写停止シグナルを互いに作用可能
に連結される。すなわち、それらの正常な機能が維持さ
れるように併置される。すなわち、この配置において
は、発現制御配列がシグナルペプチド−デスルファトヒ
ルジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転写停止シグ
ナルが転写およびポリアデニル化の適切な停止を行い、
そしてデスルファトヒルジンの分泌が起るようにシグナ
ル配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結合される。
したがって、好ましくは、発現制御配列およびシグナル
配列が異なる遺伝子に由来するものであるときには、発
現制御配列は大mRNA開始部位と発現制御配列に天然
に連結されている遺伝子のATGとの間でシグナル配列
に結合している。シグナル配列は、翻訳開始のためのそ
れ自身のATGを有するべきである。これらの配列は、
好ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配列を有するこ
とができる合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーに
よって連結されている。他方、シグナル配列の最後のコ
ドンはデスルファトヒルジンの遺伝子の最初のコドンに
直接連結される。
NA配列、成熟デスルファトヒルジンをコードするDN
A配列および真核性転写停止シグナルを互いに作用可能
に連結される。すなわち、それらの正常な機能が維持さ
れるように併置される。すなわち、この配置において
は、発現制御配列がシグナルペプチド−デスルファトヒ
ルジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転写停止シグ
ナルが転写およびポリアデニル化の適切な停止を行い、
そしてデスルファトヒルジンの分泌が起るようにシグナ
ル配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結合される。
したがって、好ましくは、発現制御配列およびシグナル
配列が異なる遺伝子に由来するものであるときには、発
現制御配列は大mRNA開始部位と発現制御配列に天然
に連結されている遺伝子のATGとの間でシグナル配列
に結合している。シグナル配列は、翻訳開始のためのそ
れ自身のATGを有するべきである。これらの配列は、
好ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配列を有するこ
とができる合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーに
よって連結されている。他方、シグナル配列の最後のコ
ドンはデスルファトヒルジンの遺伝子の最初のコドンに
直接連結される。
本発明のDNA造成物は、当業界において公知の方法、
例えば真核性発現制御配列、デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のDNA配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグメ
ント、および真核性転写停止シグナルを含有するDNA
配列を、DNAセグメントの適切な発現と生成したデス
ルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物において行われ
るような態様で連結することにより調製される。
例えば真核性発現制御配列、デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のDNA配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグメ
ント、および真核性転写停止シグナルを含有するDNA
配列を、DNAセグメントの適切な発現と生成したデス
ルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物において行われ
るような態様で連結することにより調製される。
各種DNA配列を連結して本発明のDNA造成物を形成
する場合、この連結は平滑末端連結によって、または適
当な共通の制限部位によって、あるいは合成リンカー分
子を介して、正確な連結が生じてこれらのDNA配列の
正常な機能が維持されるように特別の注意を払いながら
行う。すなわち、シグナル配列およびデスルファトヒル
ジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合させることが
できる。シグナル配列とデスルファトヒルジン遺伝子と
を正しく連結するためのもう一つの方法においては、可
能ならば、シグナル配列をその3′末端近くで制限酵素
切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝子をその5′
末端近くで制限酵素切断して各配列が所定数の塩基対を
欠くようにする。次に、制限切断されたシグナル配列と
制限切断されたデスルファトヒルジン遺伝子とを連結用
オリゴデオキシヌクレオチドを介して連結した場合に、
欠損した塩基対が修復されてデスルファトヒルジン遺伝
子がシグナル配列に関して適切なリーディンフレームに
なるように、合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカー
を造成することができる。
する場合、この連結は平滑末端連結によって、または適
当な共通の制限部位によって、あるいは合成リンカー分
子を介して、正確な連結が生じてこれらのDNA配列の
正常な機能が維持されるように特別の注意を払いながら
行う。すなわち、シグナル配列およびデスルファトヒル
ジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合させることが
できる。シグナル配列とデスルファトヒルジン遺伝子と
を正しく連結するためのもう一つの方法においては、可
能ならば、シグナル配列をその3′末端近くで制限酵素
切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝子をその5′
末端近くで制限酵素切断して各配列が所定数の塩基対を
欠くようにする。次に、制限切断されたシグナル配列と
制限切断されたデスルファトヒルジン遺伝子とを連結用
オリゴデオキシヌクレオチドを介して連結した場合に、
欠損した塩基対が修復されてデスルファトヒルジン遺伝
子がシグナル配列に関して適切なリーディンフレームに
なるように、合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカー
を造成することができる。
デスルファトヒルジンをコードするDNA配列はヒルの
ゲノムDNAから単離することができ、または相補的二
本鎖デスルファトヒルジンDNA(デスルファトヒルジ
ンds cDNA)をデスルファトヒルジンmRNAか
ら調製するか、またはデスルファトヒルジンのアミノ酸
配列をコードする遺伝子を化学的または酵素的方法によ
って調製することができる。例えば、それ自体公知の方
法によって、ゲノム性デスルファトヒルジンDNA、お
よびデスルファトヒルジンds cDNAが得られる。
例えば、ゲノム性デスルファトヒルジンDNAは、デス
ルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺伝子バンクか
ら、ヒルDNAフラグメントを微生物中でクローン化
し、デスルファトヒルジンDNAを含有するクローン
を、少なくとも15個の、好ましくは15〜30個のデオキ
シヌクレオチドを含有する放射性ラベル化デスルファト
ヒルジンDNA−特異的オリゴデオキシヌクレオチドを
用いるコロニーハイブリダイゼーションによって同定す
ることによって得られる。得られるDNAフラグメント
は、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の他に不所望の
その他のDNA成分を含むが、これらは適当なエキソヌ
クレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処理することに
よって除去することができる。
ゲノムDNAから単離することができ、または相補的二
本鎖デスルファトヒルジンDNA(デスルファトヒルジ
ンds cDNA)をデスルファトヒルジンmRNAか
ら調製するか、またはデスルファトヒルジンのアミノ酸
配列をコードする遺伝子を化学的または酵素的方法によ
って調製することができる。例えば、それ自体公知の方
法によって、ゲノム性デスルファトヒルジンDNA、お
よびデスルファトヒルジンds cDNAが得られる。
例えば、ゲノム性デスルファトヒルジンDNAは、デス
ルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺伝子バンクか
ら、ヒルDNAフラグメントを微生物中でクローン化
し、デスルファトヒルジンDNAを含有するクローン
を、少なくとも15個の、好ましくは15〜30個のデオキ
シヌクレオチドを含有する放射性ラベル化デスルファト
ヒルジンDNA−特異的オリゴデオキシヌクレオチドを
用いるコロニーハイブリダイゼーションによって同定す
ることによって得られる。得られるDNAフラグメント
は、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の他に不所望の
その他のDNA成分を含むが、これらは適当なエキソヌ
クレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処理することに
よって除去することができる。
二本鎖デスルファトヒルジンcDNAは、例えば、ヒル
ジンを産生するように適切に誘導された適当なヒルの細
胞からmRNAを分離し、それ自体公知の方法で、生成
するmRNA混合物中のデスルファトヒルジンmRNA
を濃縮し、このmRNAを1本鎖cDNAを調製する場
合の鋳型として用い、こうしてRNA依存性のDNAポ
リメラーゼによってds cDNAを合成し、これを適
当なベクター中にクローン化することによって調製する
ことができる。デスルファトヒルジンcDNAを含むク
ローンは、例えば上記の方法で、放射性物質の標識を有
するデスルファトヒルジンDNA特異的オリゴデオキシ
ヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーション
によって同定される。
ジンを産生するように適切に誘導された適当なヒルの細
胞からmRNAを分離し、それ自体公知の方法で、生成
するmRNA混合物中のデスルファトヒルジンmRNA
を濃縮し、このmRNAを1本鎖cDNAを調製する場
合の鋳型として用い、こうしてRNA依存性のDNAポ
リメラーゼによってds cDNAを合成し、これを適
当なベクター中にクローン化することによって調製する
ことができる。デスルファトヒルジンcDNAを含むク
ローンは、例えば上記の方法で、放射性物質の標識を有
するデスルファトヒルジンDNA特異的オリゴデオキシ
ヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーション
によって同定される。
デスルファトヒルジン遺伝子は、化学的合成によっても
製造することができる。この方法は、上記遺伝子のコー
ド鎖および相補鎖のセグメントを化学的に合成して、生
成するセグメントを酵素的にデスルファトヒルジンの構
造遺伝子へと変換することを特徴とする。
製造することができる。この方法は、上記遺伝子のコー
ド鎖および相補鎖のセグメントを化学的に合成して、生
成するセグメントを酵素的にデスルファトヒルジンの構
造遺伝子へと変換することを特徴とする。
DNAの化学的合成は、当業界におて周知であり、常用
技術を用いる。適当な方法は、S.A.Narang(Tetrahedro
n,第39巻、3頁、1983年)によってまとめられてい
る。詳細には、欧州特許第146,785号明細書記載の方法
が用いられ、詳細は上記明細書を参照されたい。
技術を用いる。適当な方法は、S.A.Narang(Tetrahedro
n,第39巻、3頁、1983年)によってまとめられてい
る。詳細には、欧州特許第146,785号明細書記載の方法
が用いられ、詳細は上記明細書を参照されたい。
同様な方法でシグナル配列は化学的合成によって調製す
ることができ、または適当な真核生物の染色体DNAか
ら単離することもできる。
ることができ、または適当な真核生物の染色体DNAか
ら単離することもできる。
3.シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンのコー
ド領域を有するDNA造成物を含むハイブリッドベクタ
ー 本発明によれば、真核性発現制御配列と、成熟デスルフ
ァトヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から
成るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上の
DNAインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
ド領域を有するDNA造成物を含むハイブリッドベクタ
ー 本発明によれば、真核性発現制御配列と、成熟デスルフ
ァトヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から
成るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上の
DNAインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
本発明のハイブリッドベクターはハイブリッドプラスミ
ドおよび線状DNAベクターからなる群から選択され、
そして更に形質転換しようとする宿主生物に依存して選
択される。
ドおよび線状DNAベクターからなる群から選択され、
そして更に形質転換しようとする宿主生物に依存して選
択される。
本発明は特に、真核性発現制御配列と、成熟デスルファ
トヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームが合っている
シグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成
るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含ん
で成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上のD
NAインサートを含んで成る線形DNAベクターであっ
て、上記発現制御配列と上記転写停止シグナルを含んで
成る配列とが同じ真核細胞の遺伝子に由来する上記ベク
ターに関する。特に、本発明は、酵母PH05プロモータ
ー、上記DNAセグメントおよびPH05の3′フランキン
グ領域を含んで成る線状DNAベクターに関する。
トヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームが合っている
シグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成
るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含ん
で成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上のD
NAインサートを含んで成る線形DNAベクターであっ
て、上記発現制御配列と上記転写停止シグナルを含んで
成る配列とが同じ真核細胞の遺伝子に由来する上記ベク
ターに関する。特に、本発明は、酵母PH05プロモータ
ー、上記DNAセグメントおよびPH05の3′フランキン
グ領域を含んで成る線状DNAベクターに関する。
相同な3′フランキング配列および5′フランキング配
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状DNAベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母PH05プロモータ
ーおよび酵母PH05遺伝子の3′フランキング配列の場合
には、酵母染色体IIのPH05座に組み込まれる。
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状DNAベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母PH05プロモータ
ーおよび酵母PH05遺伝子の3′フランキング配列の場合
には、酵母染色体IIのPH05座に組み込まれる。
本発明はまた特に、発現制御配列、上記DNA配列、お
よび転写停止シグナルを含む配列とは別に、プロモータ
の機能、すなわちデスルファトヒルジン遺伝子の発現に
は本質的ではないかまたは余り重要でないが、例えば上
記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に
おいては重要な機能を行うDNA配列を有するハイブリ
ッドプラスミドに関する。この追加のDNA配列は、原
核生物および/または真核生物の細胞に由来するもので
もよく、染色体DNA配列および/または染色体外DN
A配列を含有するものでもよい。例えば、この追加のD
NA配列はプラスミドDNA、例えば細菌または真核生
物のプラスミドDNA、ウイルスのDNA、および/ま
たは染色体DNA、例えば細菌、酵母または高等真核生
物の染色体DNAに由来する(またはこれらから成る)
ものでもよい。好ましいハイブリッドプラスミドは、細
菌性プラスミド、特にE.コリプラスミドpBR322、また
は関連するプラスミド、バクテリオファージλ、酵母2
μプラスミドおよび/または酵母染色体DNAに由来す
るDNA配列も含む。
よび転写停止シグナルを含む配列とは別に、プロモータ
の機能、すなわちデスルファトヒルジン遺伝子の発現に
は本質的ではないかまたは余り重要でないが、例えば上
記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に
おいては重要な機能を行うDNA配列を有するハイブリ
ッドプラスミドに関する。この追加のDNA配列は、原
核生物および/または真核生物の細胞に由来するもので
もよく、染色体DNA配列および/または染色体外DN
A配列を含有するものでもよい。例えば、この追加のD
NA配列はプラスミドDNA、例えば細菌または真核生
物のプラスミドDNA、ウイルスのDNA、および/ま
たは染色体DNA、例えば細菌、酵母または高等真核生
物の染色体DNAに由来する(またはこれらから成る)
ものでもよい。好ましいハイブリッドプラスミドは、細
菌性プラスミド、特にE.コリプラスミドpBR322、また
は関連するプラスミド、バクテリオファージλ、酵母2
μプラスミドおよび/または酵母染色体DNAに由来す
るDNA配列も含む。
本発明による好ましいハイブリッドプラスミドにおいて
は、これらの追加のDNA配列は酵母複製開始点および
酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵母複製開始
点、例えば自律複製セグメント(ars)を含有するハ
イブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母細胞内で染
色体外に維持され、有糸***の際に自律複製する。酵母
2μプラスミドDNAと相同な配列を有するハイブリッ
ドプラスミドも、同様に用いられる。これらのハイブリ
ッドプラスミドは組換によって既に存在している2μプ
ラスミドに組み込まれ、または自律複製を行う。
は、これらの追加のDNA配列は酵母複製開始点および
酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵母複製開始
点、例えば自律複製セグメント(ars)を含有するハ
イブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母細胞内で染
色体外に維持され、有糸***の際に自律複製する。酵母
2μプラスミドDNAと相同な配列を有するハイブリッ
ドプラスミドも、同様に用いられる。これらのハイブリ
ッドプラスミドは組換によって既に存在している2μプ
ラスミドに組み込まれ、または自律複製を行う。
酵母の選択遺伝子マーカーについては、マーカーの表現
型発現により形質転換体の選択を容易にするものであれ
ば、いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。
酵母に好適なマーカーは特に、抗生物質耐性を発現する
ものであるか、または栄養要求酵母変異株の場合には、
宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロヘキサミドに対する耐性を
付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例えばURA1、UR
A3、ARG4、UEU2、HIS4、HIS3、TRP5またはTRP1遺伝子に
原栄養性を付与する。
型発現により形質転換体の選択を容易にするものであれ
ば、いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。
酵母に好適なマーカーは特に、抗生物質耐性を発現する
ものであるか、または栄養要求酵母変異株の場合には、
宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロヘキサミドに対する耐性を
付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例えばURA1、UR
A3、ARG4、UEU2、HIS4、HIS3、TRP5またはTRP1遺伝子に
原栄養性を付与する。
本発明のハイブリッドプラスミドに存在するその他のD
NA配列はまた、細菌宿主、特にE.コリの複製開始点
および選択遺伝子マーカーを含有するのが有利である。
酵母ハイブリッドプラスミド中にE.コリ複製開始点お
よびE.コリマーカーが存在することに関連する有用な
特徴がある。第一に、E.コリにおける増殖及び増幅に
より多量のハイブリッドプラスミドDNAを得ることが
でき、第二に、E.コリに基礎を置くクローン化技術の
全レパートリーを用いてE.コリ中でハイブリッドプラ
スミドを便利に造成することである。pBR322などのE.
コリプラスミドは、E.コリ複製開始点、並びに例えば
テトラサイクリンおよびアンピシリンのような抗生物質
に対する耐性を付与するE.コリ遺伝子マーカーを含
み、酵母ハイブリッドベクターの一部分として有利に用
いられる。
NA配列はまた、細菌宿主、特にE.コリの複製開始点
および選択遺伝子マーカーを含有するのが有利である。
酵母ハイブリッドプラスミド中にE.コリ複製開始点お
よびE.コリマーカーが存在することに関連する有用な
特徴がある。第一に、E.コリにおける増殖及び増幅に
より多量のハイブリッドプラスミドDNAを得ることが
でき、第二に、E.コリに基礎を置くクローン化技術の
全レパートリーを用いてE.コリ中でハイブリッドプラ
スミドを便利に造成することである。pBR322などのE.
コリプラスミドは、E.コリ複製開始点、並びに例えば
テトラサイクリンおよびアンピシリンのような抗生物質
に対する耐性を付与するE.コリ遺伝子マーカーを含
み、酵母ハイブリッドベクターの一部分として有利に用
いられる。
酵母および細菌宿主(上記参照のこと)の複製開始点お
よび遺伝子マーカーを含有する追加のDNA配列は、こ
れ以後は「ベクターDNA」と称し、特に発現制御配列
およびデスルファトヒルジン遺伝子を含む上記DNA造
成物と共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成して
いる。
よび遺伝子マーカーを含有する追加のDNA配列は、こ
れ以後は「ベクターDNA」と称し、特に発現制御配列
およびデスルファトヒルジン遺伝子を含む上記DNA造
成物と共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成して
いる。
本発明のハイブリッドベクターは1個以上のDNAイン
サートを含有し、これらのインサートのそれぞれは特
に、発現制御配列、シグナルペプチドをコードするDN
A配列、および成熟デスルファトヒルジンをコードする
DNA配列を含有するであろう。ハイブリッドベクター
が複製のDNAインサート、好ましくは2〜4個のDN
Aインサートを含有する場合には、これらは縦列(tande
m)に並んでいてもよくまたはハイブリッドベクターの異
なる部位に存在することもできる。好ましいハイブリッ
ドベクターは1個のDNAインサートまたは縦列(tande
m)に並んだDNAインサートを含む。DNAインサート
は、特に頭対尾に配置される。
サートを含有し、これらのインサートのそれぞれは特
に、発現制御配列、シグナルペプチドをコードするDN
A配列、および成熟デスルファトヒルジンをコードする
DNA配列を含有するであろう。ハイブリッドベクター
が複製のDNAインサート、好ましくは2〜4個のDN
Aインサートを含有する場合には、これらは縦列(tande
m)に並んでいてもよくまたはハイブリッドベクターの異
なる部位に存在することもできる。好ましいハイブリッ
ドベクターは1個のDNAインサートまたは縦列(tande
m)に並んだDNAインサートを含む。DNAインサート
は、特に頭対尾に配置される。
本発明によりハイブリッドプラスミドは、当業界におい
て公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの調
製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファト
ヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成る
DNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御
下にあるものと、真核生物の転写停止シグナルを含有す
るDNA配列とを含有する1個又は複数個のDNA造成
物をベクターDNAに導入するか、あるいは上記DNA
造成物の構成成分を所定の順序でベクターDNA中に逐
次的に導入することから成っている。本発明のハイブリ
ッドプラスミドは常用の連結技術を用いて造成される。
プラスミドの成分は、共通の制限部位を介して、および
/または合成リンカー分子により、および/またはプラ
ント末端連結によって連結される。
て公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの調
製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファト
ヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成る
DNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御
下にあるものと、真核生物の転写停止シグナルを含有す
るDNA配列とを含有する1個又は複数個のDNA造成
物をベクターDNAに導入するか、あるいは上記DNA
造成物の構成成分を所定の順序でベクターDNA中に逐
次的に導入することから成っている。本発明のハイブリ
ッドプラスミドは常用の連結技術を用いて造成される。
プラスミドの成分は、共通の制限部位を介して、および
/または合成リンカー分子により、および/またはプラ
ント末端連結によって連結される。
本発明の線形DNAベクターは、本質的に第2節に記載
のDNA造成物に対応し、そして同様な方法で調製され
る。
のDNA造成物に対応し、そして同様な方法で調製され
る。
4.形質転換された真核宿主生物 本発明のもう一つの観点は、真核生物の発現制御配列
と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のDN
A配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフ
レームが合っているシグナルペプチドをコードする第一
のDNA配列から成るDNAセグメントであって上記発
現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写
停止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが含
有する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイブ
リッドベクターで形質転換された真核生物およびそれら
の変異株に関する。
と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のDN
A配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフ
レームが合っているシグナルペプチドをコードする第一
のDNA配列から成るDNAセグメントであって上記発
現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写
停止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが含
有する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイブ
リッドベクターで形質転換された真核生物およびそれら
の変異株に関する。
好適な真核宿主生物は、特に上記のものであり、特に、
クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンディダ(Candid
a)、ピヒア(Pichia)、ヤロウイア(Yarrowia)、サッカロ
ミセス(Saccharomyces)、シツオサッカロミセス(Schizo
saccharomyces)、トルロプシス(Torulopsis)属および関
連の属(J.Lodder、The Yeasts、アムステルダム、1971
年を参照されたい)であり、特にサッカロミセス・セレ
ビシエー(Saccharomyces cerevisiae)の株がある。
クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンディダ(Candid
a)、ピヒア(Pichia)、ヤロウイア(Yarrowia)、サッカロ
ミセス(Saccharomyces)、シツオサッカロミセス(Schizo
saccharomyces)、トルロプシス(Torulopsis)属および関
連の属(J.Lodder、The Yeasts、アムステルダム、1971
年を参照されたい)であり、特にサッカロミセス・セレ
ビシエー(Saccharomyces cerevisiae)の株がある。
形質転換された真核宿主細胞は、真核生物の発現制御配
列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のD
NA配列及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードする第
一のDNA配列から成るDNAセグメントであって上記
発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転
写停止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが
含有する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイ
ブリッドプラスミドで形質転換された真核宿主生物、並
びに宿主の染色体に安定に組み込まれた上記DNAイン
サートを有する真核宿主生物から選択される。
列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のD
NA配列及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードする第
一のDNA配列から成るDNAセグメントであって上記
発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転
写停止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが
含有する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイ
ブリッドプラスミドで形質転換された真核宿主生物、並
びに宿主の染色体に安定に組み込まれた上記DNAイン
サートを有する真核宿主生物から選択される。
上記形質転換された真核宿主生物の製造法は、真核生物
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のDNA配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のDNA配列から成るDNAセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るDNA配列と
をそれぞれが含有する1個以上のDNAインサートを含
んで成るハイブリッドベクターにより真核宿主生物を形
質転換することを含んで成る。
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のDNA配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のDNA配列から成るDNAセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るDNA配列と
をそれぞれが含有する1個以上のDNAインサートを含
んで成るハイブリッドベクターにより真核宿主生物を形
質転換することを含んで成る。
真核宿主細胞の形質転換は、当業界において知られてい
る方法によって行われる。例えば、酵母のハイブリッド
ベクターを用いる形質転換は、Hinnenらの記載の方法に
より行うことができる〔Proc.Natl.Acad.Sci,.、USA、
第75巻、1929頁(1978年)〕。この方法は、3段階に
分けることができる。
る方法によって行われる。例えば、酵母のハイブリッド
ベクターを用いる形質転換は、Hinnenらの記載の方法に
より行うことができる〔Proc.Natl.Acad.Sci,.、USA、
第75巻、1929頁(1978年)〕。この方法は、3段階に
分けることができる。
(1)カタツムリ消化管汁〔例えばGlusulase(登録商
標)またはHelicase(登録商標)〕のような各種グルコ
シダーゼ製剤、または微生物から得られる酵素混合物
〔例えばZymolyase(登録商標)〕を、浸透圧的に安定
した溶液(例えば1Mソルビトール)において用いる酵
母細胞壁またはその部分の除去。
標)またはHelicase(登録商標)〕のような各種グルコ
シダーゼ製剤、または微生物から得られる酵素混合物
〔例えばZymolyase(登録商標)〕を、浸透圧的に安定
した溶液(例えば1Mソルビトール)において用いる酵
母細胞壁またはその部分の除去。
(2)PEG(ポリエチレングリコール)およびCa2+イ
オンの存在での、DNAベクターによる「裸の」酵母細
胞(スフェロプラスト)の処理。
オンの存在での、DNAベクターによる「裸の」酵母細
胞(スフェロプラスト)の処理。
(3)寒天の固相における細胞壁の再生および形質転換
された細胞の選定。この再生は、スフェロプラストを寒
天中に埋め込むことによって好都合に行われる。例え
ば、溶融した寒天(50℃)をスフェロプラストと混合
する。溶液を酵母の増殖温度(約30℃)にまで冷却す
ることにより固層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須の高分子の速やかな拡散と損失を防止
するためのものであり、それにより細胞壁の再生が促進
される。しかしながら、細胞壁の再生は、予め形成して
おいた寒天層の表面にスフェロプラストをプレートする
ことによっても(効率は低いが)得ることができる。
された細胞の選定。この再生は、スフェロプラストを寒
天中に埋め込むことによって好都合に行われる。例え
ば、溶融した寒天(50℃)をスフェロプラストと混合
する。溶液を酵母の増殖温度(約30℃)にまで冷却す
ることにより固層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須の高分子の速やかな拡散と損失を防止
するためのものであり、それにより細胞壁の再生が促進
される。しかしながら、細胞壁の再生は、予め形成して
おいた寒天層の表面にスフェロプラストをプレートする
ことによっても(効率は低いが)得ることができる。
再生寒天は、形質転換された細胞の再生と選定が同時に
起るような方法で調製するのが好ましい。一般的には選
定マーカー(上述)としてアミノ酸生合成経路の酵素を
コードする酵母遺伝子が用いられるので、再生は好まし
くは酵母の最少寒天中で行われる。極めて高効率の再生
が必要とされる場合には、次の2段階処理が有利であ
る。すなわち、(1)高濃度の複合培地中での細胞壁の
再生、および(2)選択寒天平板上に細胞層をレプリカ
プレートすることによる形質転換された細胞の選定。
起るような方法で調製するのが好ましい。一般的には選
定マーカー(上述)としてアミノ酸生合成経路の酵素を
コードする酵母遺伝子が用いられるので、再生は好まし
くは酵母の最少寒天中で行われる。極めて高効率の再生
が必要とされる場合には、次の2段階処理が有利であ
る。すなわち、(1)高濃度の複合培地中での細胞壁の
再生、および(2)選択寒天平板上に細胞層をレプリカ
プレートすることによる形質転換された細胞の選定。
上記線状DNAベクターを用いて真核宿主細胞を形質転
換する場合には、形質転換は好ましくは、酵母の選択マ
ーカーを有する第二のベクターの存在下で行われる。こ
の同時形質転換によると、直接的には選択することがで
きないDNAを取り込んだ宿主細胞を濃縮することがで
きる。コンピテント細胞はいかなる型のDNAをも取り
込むので、選択ベクターで形質転換された細胞はその他
のDNA(例えば上記線形DNAベクター)をも高い比
率で担持するであろう。
換する場合には、形質転換は好ましくは、酵母の選択マ
ーカーを有する第二のベクターの存在下で行われる。こ
の同時形質転換によると、直接的には選択することがで
きないDNAを取り込んだ宿主細胞を濃縮することがで
きる。コンピテント細胞はいかなる型のDNAをも取り
込むので、選択ベクターで形質転換された細胞はその他
のDNA(例えば上記線形DNAベクター)をも高い比
率で担持するであろう。
形質転換された真核宿主生物、特に形質転換された酵母
株であって、本発明のハイブリッドプラスミドを含有す
るか、または宿主染色体に安定に組み込まれたデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を含んで成る線状DNAベクターを
有するものは、当業界において知られている方法を用い
て変異および選択によってデスルファトヒルジンの産生
を向上させることができる。突然変異は、例えば、紫外
線照射または適当な化合物によって行うことができる。
特に好ましいものは、プロテアーゼを欠損した変異体、
特に酵母変異体であって、細胞内で生成したデスルファ
トヒルジン蛋白質の分解を避けるようにしたものであ
る。好適な変異体は、常用の手段で選定して単離するこ
とができる。
株であって、本発明のハイブリッドプラスミドを含有す
るか、または宿主染色体に安定に組み込まれたデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を含んで成る線状DNAベクターを
有するものは、当業界において知られている方法を用い
て変異および選択によってデスルファトヒルジンの産生
を向上させることができる。突然変異は、例えば、紫外
線照射または適当な化合物によって行うことができる。
特に好ましいものは、プロテアーゼを欠損した変異体、
特に酵母変異体であって、細胞内で生成したデスルファ
トヒルジン蛋白質の分解を避けるようにしたものであ
る。好適な変異体は、常用の手段で選定して単離するこ
とができる。
本発明は、特に、デスルファトヒルジン遺伝子を含有す
るDNA造成物、ハイブリッドベクター、形質転換され
た真核宿主生物およびそれらの調製法、並びに実施例に
記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋白質の製造方
法に関する。
るDNA造成物、ハイブリッドベクター、形質転換され
た真核宿主生物およびそれらの調製法、並びに実施例に
記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋白質の製造方
法に関する。
以下の実験の部では、本発明の各種態様を添附図面に言
及しながら説明する。
及しながら説明する。
次の実施例は本発明を説明するためのものであり、発明
の範囲を制限することを意図するものではない。
の範囲を制限することを意図するものではない。
実験の部 実施例に用いた略号の意味は次の通りである。
TNE:100mMNaCl、50mMトリス・HCl(pH7.5)お
よび5mMEDTAを含む溶液、 SDS:ドデシル硫酸ナトリウム、 EDTA:エチレンジアミン四酢酸、 DTT:1,4−ジチオスレイトール(1,4−ジメルカ
プト−2,3−ブタンジオール)、 BSA:ウシ血清アルブミン、 EtBr:エチジウムブロミド、 tris:トリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタン、 tris・HCl:トリス・一塩酸塩。
よび5mMEDTAを含む溶液、 SDS:ドデシル硫酸ナトリウム、 EDTA:エチレンジアミン四酢酸、 DTT:1,4−ジチオスレイトール(1,4−ジメルカ
プト−2,3−ブタンジオール)、 BSA:ウシ血清アルブミン、 EtBr:エチジウムブロミド、 tris:トリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタン、 tris・HCl:トリス・一塩酸塩。
実施例1.保護されたヌクレオシド−ポリスチレン樹脂の
製造 無水コハク酸750mgおよび4−ジメチルアミノピリジ
ン910mgを、5′−(4−メトキシトリチル)−チミ
ジン(MMT−O−T−OH)2.57g(5ミリモル)を
無水ピリジン20mlに溶解したものに加え、混合物を
室温で16時間放置する。ピリジン溶液を濃縮した後、
酢酸エチル200mlに入れ、0.1Mリン酸緩衝液200ml
ずつに10mlの飽和塩化ナトリウム溶液を加えたもの
で2回振盪することによって抽出し、飽和塩化ナトリウ
ムで再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてヘキサンを滴
下して加える。沈澱した生成物を分離して、エーテルと
共に2回すりつぶした後、0℃で0.1M硫酸水素カリウ
ム(pH2.5)180mlと共に振盪して抽出する。水で2回洗
浄した後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾過して、ピリジン0.5mlを加え、混合物を濃縮し、
ヘキサンを滴下して加えることによって希釈する。沈澱
したコハク酸誘導体を濾別する。この化合物1.0gをN
−ヒドロキシスクシンイミド190mgと共に酢酸エチル
4mlおよびジメチルホルムアミド2mlに溶解し、37
0mgのN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドを
0℃で加える。冷蔵庫に一晩放置した後、沈澱したN,
N′−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液を酢酸エチ
ルで希釈し、0.1M重炭酸ナトリウムと水で抽出して、
乾燥し、真空で蒸発させて濃縮乾固する。残渣をシリカ
ゲル上で酢酸エチルによりクロマトグラフ処理する。
製造 無水コハク酸750mgおよび4−ジメチルアミノピリジ
ン910mgを、5′−(4−メトキシトリチル)−チミ
ジン(MMT−O−T−OH)2.57g(5ミリモル)を
無水ピリジン20mlに溶解したものに加え、混合物を
室温で16時間放置する。ピリジン溶液を濃縮した後、
酢酸エチル200mlに入れ、0.1Mリン酸緩衝液200ml
ずつに10mlの飽和塩化ナトリウム溶液を加えたもの
で2回振盪することによって抽出し、飽和塩化ナトリウ
ムで再度洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてヘキサンを滴
下して加える。沈澱した生成物を分離して、エーテルと
共に2回すりつぶした後、0℃で0.1M硫酸水素カリウ
ム(pH2.5)180mlと共に振盪して抽出する。水で2回洗
浄した後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾過して、ピリジン0.5mlを加え、混合物を濃縮し、
ヘキサンを滴下して加えることによって希釈する。沈澱
したコハク酸誘導体を濾別する。この化合物1.0gをN
−ヒドロキシスクシンイミド190mgと共に酢酸エチル
4mlおよびジメチルホルムアミド2mlに溶解し、37
0mgのN,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミドを
0℃で加える。冷蔵庫に一晩放置した後、沈澱したN,
N′−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液を酢酸エチ
ルで希釈し、0.1M重炭酸ナトリウムと水で抽出して、
乾燥し、真空で蒸発させて濃縮乾固する。残渣をシリカ
ゲル上で酢酸エチルによりクロマトグラフ処理する。
TLC:Rf=0.45(ジクロロメタン/メタノール=
9:1)。
9:1)。
このN−スクシンイミドイルコハク酸エステル(100m
g)を、アミノメチルポリスチレン(1g、アミン含量
110μM/g)をジクロロメタン2mlおよびジメチル
ホルムアミド4mlに入れたものと共に20時間攪拌す
る。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルムアミド、メタ
ノール、ジクロロメタンおよびメタノールで洗浄するこ
とによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリジン6ml中
で無水酢酸1mlおよび4−ジメチルアミノピリジン10
0mgと共に30分間攪拌することによって、反応しな
かったアミノ基をアセチル化する。ポリマー樹脂を、ジ
クロロメタン、ジメチルホルムアミド、メタノールおよ
びジクロロメタンで洗浄することによって抽出し、恒量
に達するまで乾燥する。メトキシトリチル(MMT)の
分光分析によれば57μM/gの付加量である。
g)を、アミノメチルポリスチレン(1g、アミン含量
110μM/g)をジクロロメタン2mlおよびジメチル
ホルムアミド4mlに入れたものと共に20時間攪拌す
る。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルムアミド、メタ
ノール、ジクロロメタンおよびメタノールで洗浄するこ
とによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリジン6ml中
で無水酢酸1mlおよび4−ジメチルアミノピリジン10
0mgと共に30分間攪拌することによって、反応しな
かったアミノ基をアセチル化する。ポリマー樹脂を、ジ
クロロメタン、ジメチルホルムアミド、メタノールおよ
びジクロロメタンで洗浄することによって抽出し、恒量
に達するまで乾燥する。メトキシトリチル(MMT)の
分光分析によれば57μM/gの付加量である。
実施例2. 次の保護されたヌクレオシド/ポリスチレン樹脂を、実
施例1と同様の方法で製造する。
施例1と同様の方法で製造する。
5′−(4−メトキシトリチル)−N−イソブチリル−
デオキシグアノシンから。32μM/gの付加量。
デオキシグアノシンから。32μM/gの付加量。
実施例3.トリヌクレオチドの合成 (a)ジヌクレオチドの合成 5′−(4−メトキシトリチル)−チミジン(MMT−
O−T−OH)7.73g(15mモル)を無水ピリジンと
共に蒸発させることによって2回濃縮する。残渣を無水
テトラヒドロフラン20mlに溶解し、0.2Mの2−ク
ロロフェニル−ジ−(1−ベンゾトリアゾリル)−ホス
フェート/テトラヒドロフラン溶液80mlに、攪拌し
そして水分を除きながら滴下して加え、反応混合物を1
時間室温で攪拌する。生成する2−クロロフェニル−1
−ベンゾトリアゾリル−5′−(4−メトキシトリチ
ル)−チミジン3′−ホスフェートを3つの部分に分解
する。
O−T−OH)7.73g(15mモル)を無水ピリジンと
共に蒸発させることによって2回濃縮する。残渣を無水
テトラヒドロフラン20mlに溶解し、0.2Mの2−ク
ロロフェニル−ジ−(1−ベンゾトリアゾリル)−ホス
フェート/テトラヒドロフラン溶液80mlに、攪拌し
そして水分を除きながら滴下して加え、反応混合物を1
時間室温で攪拌する。生成する2−クロロフェニル−1
−ベンゾトリアゾリル−5′−(4−メトキシトリチ
ル)−チミジン3′−ホスフェートを3つの部分に分解
する。
(α)トリエチルアンモニウム−2−クロロフェニル−
5′−(4−メトキシトリチル)−チミジン3′−ホス
フェートへの加水分解 0.5M重炭酸トリエチルアンモニウム100mlを上記2−
クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5′−(4
−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホスフェート
の溶液の3分の1に、冷却しながら加える。15分後
に、ジクロロメタンで抽出を行う。ジクロロメタン溶液
を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しながら
加える。生成する沈澱を吸引濾別し、エーテル/石油エ
ーテル=1:1で洗浄し、真空で乾燥する。
5′−(4−メトキシトリチル)−チミジン3′−ホス
フェートへの加水分解 0.5M重炭酸トリエチルアンモニウム100mlを上記2−
クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5′−(4
−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホスフェート
の溶液の3分の1に、冷却しながら加える。15分後
に、ジクロロメタンで抽出を行う。ジクロロメタン溶液
を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しながら
加える。生成する沈澱を吸引濾別し、エーテル/石油エ
ーテル=1:1で洗浄し、真空で乾燥する。
TLC:Rf0.35(ジクロロメタン・メタノール/水=
75:22:3)。
75:22:3)。
(β)4−メトキシトリチル保護基の除去及び2−シア
ノエチル−2−クロロフェニル−5′−(4−メトキシ
トリチル)−チミジン−3′−ホスフェートへのエステ
ル化 2−シアノエタノール1.3mlおよびピリジン2ml
を、2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−
5′−(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホ
スフェートの溶液の3分の1に加える。混合物を室温で
一晩放置する。溶媒を真空で留去し、残渣は酢酸エチル
に溶解し、0.1Mリン酸緩衝液(pH7)と水で振盪する
ことによって繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮
して、ヘキサンに滴下して加える。沈澱を濾別して、ジ
クロロメタン/メタノール(7:3)50mlに溶解
し、0℃でp−トルエン−スルホン酸−水和物3.8gを
ジクロロメタン/メタノール(7:3)75mlに溶解
した溶液を加える。2時間後、反応溶液をジクロロメタ
ンで希釈して、冷重炭酸ナトリウム溶液と共に振盪して
抽出する。有機相を濃縮し、そしてヘキサンを加える。
沈澱した2−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミ
ジン−3′−ホスフェートを、シリガゲル上でジクロロ
メタン/メタノール(96:4)を用いてクロマトグラ
フ処理する。
ノエチル−2−クロロフェニル−5′−(4−メトキシ
トリチル)−チミジン−3′−ホスフェートへのエステ
ル化 2−シアノエタノール1.3mlおよびピリジン2ml
を、2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−
5′−(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホ
スフェートの溶液の3分の1に加える。混合物を室温で
一晩放置する。溶媒を真空で留去し、残渣は酢酸エチル
に溶解し、0.1Mリン酸緩衝液(pH7)と水で振盪する
ことによって繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮
して、ヘキサンに滴下して加える。沈澱を濾別して、ジ
クロロメタン/メタノール(7:3)50mlに溶解
し、0℃でp−トルエン−スルホン酸−水和物3.8gを
ジクロロメタン/メタノール(7:3)75mlに溶解
した溶液を加える。2時間後、反応溶液をジクロロメタ
ンで希釈して、冷重炭酸ナトリウム溶液と共に振盪して
抽出する。有機相を濃縮し、そしてヘキサンを加える。
沈澱した2−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミ
ジン−3′−ホスフェートを、シリガゲル上でジクロロ
メタン/メタノール(96:4)を用いてクロマトグラ
フ処理する。
TLC:Rf0.45(ジクロロメタン・メタノール=9:
1)。
1)。
(γ)5′−(4−メトキシトリチル)−3′−シアノ
エチル−ビス−チミジンジヌクレオチドへの縮合 2−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミジン−
3′−ホスフェート2.2gを、無水ピリジンで2回蒸発
させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テト
ラヒドロフラン20mlに溶解して、残りの3分の1の
2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5′−
(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホスフェ
ートに加える。室温にて18時間後に、水10mlおよ
び酢酸エチル200mlを、氷冷しながら反応溶液に加え
る。有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと水とで洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃縮する。
ホスフェート残渣と5′−および3−末端が保護された
ジヌクレオチドを、エーテル/ヘキサン=1:1に滴下
して加えることによって沈澱せせる。
エチル−ビス−チミジンジヌクレオチドへの縮合 2−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミジン−
3′−ホスフェート2.2gを、無水ピリジンで2回蒸発
させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テト
ラヒドロフラン20mlに溶解して、残りの3分の1の
2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5′−
(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホスフェ
ートに加える。室温にて18時間後に、水10mlおよ
び酢酸エチル200mlを、氷冷しながら反応溶液に加え
る。有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと水とで洗
浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃縮する。
ホスフェート残渣と5′−および3−末端が保護された
ジヌクレオチドを、エーテル/ヘキサン=1:1に滴下
して加えることによって沈澱せせる。
TLC:Rf0.48(ジクロロメタン・メタノール=9:
1)。
1)。
(b)トリヌクレオチドの合成 上記の完全に保護されたジヌクレオチド1.17g(1mモ
ル)をジクロロメタン/メタノール(7:3)30ml
に氷冷しながら溶解し、p−トルエンスルホン酸・一水
和物1.9gをジクロロメタン/メタノール(7:3)2
0mlに溶解したものを加える。2時間後に、氷冷した
重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を
行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに滴下して
加える。沈澱した遊離の5′−ヒドロキシ基を有する粗
製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で2〜8%のメタ
ノール/ジクロロメタンのグラジエントによりクロマト
グラフ処理する。
ル)をジクロロメタン/メタノール(7:3)30ml
に氷冷しながら溶解し、p−トルエンスルホン酸・一水
和物1.9gをジクロロメタン/メタノール(7:3)2
0mlに溶解したものを加える。2時間後に、氷冷した
重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタンで抽出を
行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに滴下して
加える。沈澱した遊離の5′−ヒドロキシ基を有する粗
製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で2〜8%のメタ
ノール/ジクロロメタンのグラジエントによりクロマト
グラフ処理する。
TLC:Rf0.33(ジクロロメタン・メタノール=9:
1)。
1)。
この5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド850mgとトリ
エチルアンモニウム−2−クロロフェニル−5′−(4
−メトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェート1.
06g〔(a)(α)節を参照されたい〕をピリジンと共
に蒸発させて2回濃縮し、次いで無水ピリジン10ml
に溶解し、1−メシチレンスルホニル−3−ニトロ−
1,2,4−トリアゾール(MSNT)560mgを加える。2
時間後に、氷冷水2mlを加え、更に1時間後にジクロ
ロメタンを用いて抽出を行う。有機相を飽和の重炭酸ナ
トリウムと水とで洗浄し、乾燥して、濃縮し、エーテル
を加える。沈澱したトリヌクレオチドを、シリカゲル上
でクロマトグラフィによって精製する。
エチルアンモニウム−2−クロロフェニル−5′−(4
−メトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェート1.
06g〔(a)(α)節を参照されたい〕をピリジンと共
に蒸発させて2回濃縮し、次いで無水ピリジン10ml
に溶解し、1−メシチレンスルホニル−3−ニトロ−
1,2,4−トリアゾール(MSNT)560mgを加える。2
時間後に、氷冷水2mlを加え、更に1時間後にジクロ
ロメタンを用いて抽出を行う。有機相を飽和の重炭酸ナ
トリウムと水とで洗浄し、乾燥して、濃縮し、エーテル
を加える。沈澱したトリヌクレオチドを、シリカゲル上
でクロマトグラフィによって精製する。
Rf0.45(ジクロロメタン・メタノール=9:1)。
実施例4. 実施例3と同様にして、下記の一般式 を有し、B1B2B3と略記される保護されたトリヌク
レオチドを製造する。以下の略号をヌクレオシドB1、
B2、B3に用いる。すなわち、 A=N−ベンゾイル−デオキシアデノシン、 C=N−ベンゾイル−デオキシシチジン、 G=N−イソブチリル−デオキシグアノシン、 T=チミジン。
レオチドを製造する。以下の略号をヌクレオシドB1、
B2、B3に用いる。すなわち、 A=N−ベンゾイル−デオキシアデノシン、 C=N−ベンゾイル−デオキシシチジン、 G=N−イソブチリル−デオキシグアノシン、 T=チミジン。
実施例5.DNA鎖96/97の第96番目の塩基から第162
番目の塩基までの67個の塩基の長さのDNAフラグメ
ントの合成 (a)トリヌクレオチドからの2−シアノエチル保護基
の除去 実施例3または4からのトリヌクレオチド10μモル
を、水分を除いて、ピリジン/アセトニトリル/トリエ
チルアミン(1:1:1)60μlに溶解する。室温で
1時間後に過酸化物のないエーテル0.7mlを滴下して
加え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエ
チルアンモニウム塩をピリジン50μlに溶解し、エー
テル0.5mlで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で1
5時間乾燥する。
番目の塩基までの67個の塩基の長さのDNAフラグメ
ントの合成 (a)トリヌクレオチドからの2−シアノエチル保護基
の除去 実施例3または4からのトリヌクレオチド10μモル
を、水分を除いて、ピリジン/アセトニトリル/トリエ
チルアミン(1:1:1)60μlに溶解する。室温で
1時間後に過酸化物のないエーテル0.7mlを滴下して
加え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエ
チルアンモニウム塩をピリジン50μlに溶解し、エー
テル0.5mlで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で1
5時間乾燥する。
(b)部分的に保護されたトリヌクレオチドとポリスチ
レン樹脂に結合したオリゴヌクレオチドとのカップリン
グ 総ての操作を、容量が220μlの反応容器中でマイクロ
プロセッサーで制御して溶媒および試薬を添加すること
により水分を除いて行う。チミジン/ポリスチレン樹脂
(実施例1)13mg(0.74μモル)を反応容器に入れ
て、次の操作を行う。
レン樹脂に結合したオリゴヌクレオチドとのカップリン
グ 総ての操作を、容量が220μlの反応容器中でマイクロ
プロセッサーで制御して溶媒および試薬を添加すること
により水分を除いて行う。チミジン/ポリスチレン樹脂
(実施例1)13mg(0.74μモル)を反応容器に入れ
て、次の操作を行う。
1.塩化メチレン、2ml/分、4分間、 2.塩化メチレン/イソプロパノール(85:15)、2ml
/分、2分間、 3.塩化メチレン/イソプロパノール(85:15)中に臭化
亜鉛1Mおよび1,2,4−トリアゾール0.02M、2m
l/分、2〜3.5分間、 4.塩化メチレン/イソプロパノール(85:15)、2ml
/分、4分間、 5. 0.5M酢酸トリエチルアンモニウム/DMF、2ml
/分、5分間、 6.モレキュラージーブ乾燥ピリジン、2ml/分、3分
間、 7.テトラヒドロフラン(過酸化物なし、モレキュラーシ
ーブ乾燥)、2ml/分、3分間、 8.窒素気流、10分間、 9.10μモルのトリヌクレオチドGTC((a)節から
のトリメチレンアンモニウム塩)および8.9mg(30
μモル)の1−メシチレンスルホニル−3−ニトロ−
1,2,4−トリアゾール(MSNT)を150μlのピリジン
に溶解したものを注入、 10.45℃、20分間、 11.ピリジン、2ml/分、4分間、 12.ピリジン中に無水酢酸5%および4−ジメチレンア
ミノピリジン2.5%、2ml/分、4分間、 13.ピリジン、2ml/分、4分間、 14.ピリジン/イソプロパノール(1:1)、2ml/
分、3分間、 14段階の総ての操作を21回繰り返すが、9段階目の
操作では、GTCの代わりに次のようなトリヌクレオチ
ドをそれぞれトリエチルアンモニム塩〔(a)節〕の形
で次のような順序で用いる。
/分、2分間、 3.塩化メチレン/イソプロパノール(85:15)中に臭化
亜鉛1Mおよび1,2,4−トリアゾール0.02M、2m
l/分、2〜3.5分間、 4.塩化メチレン/イソプロパノール(85:15)、2ml
/分、4分間、 5. 0.5M酢酸トリエチルアンモニウム/DMF、2ml
/分、5分間、 6.モレキュラージーブ乾燥ピリジン、2ml/分、3分
間、 7.テトラヒドロフラン(過酸化物なし、モレキュラーシ
ーブ乾燥)、2ml/分、3分間、 8.窒素気流、10分間、 9.10μモルのトリヌクレオチドGTC((a)節から
のトリメチレンアンモニウム塩)および8.9mg(30
μモル)の1−メシチレンスルホニル−3−ニトロ−
1,2,4−トリアゾール(MSNT)を150μlのピリジン
に溶解したものを注入、 10.45℃、20分間、 11.ピリジン、2ml/分、4分間、 12.ピリジン中に無水酢酸5%および4−ジメチレンア
ミノピリジン2.5%、2ml/分、4分間、 13.ピリジン、2ml/分、4分間、 14.ピリジン/イソプロパノール(1:1)、2ml/
分、3分間、 14段階の総ての操作を21回繰り返すが、9段階目の
操作では、GTCの代わりに次のようなトリヌクレオチ
ドをそれぞれトリエチルアンモニム塩〔(a)節〕の形
で次のような順序で用いる。
GCA,ACC,GAA,CCC,TAC,AGG,TGA,CGC,TAC,CGT,GTG,CCA,AA
A,AAA,TGA,CGG,TGA,TTC,GGG,CCT,CAT. 平均カップリング収率は97%である。最終生成物は次
のような構造を有する。
A,AAA,TGA,CGG,TGA,TTC,GGG,CCT,CAT. 平均カップリング収率は97%である。最終生成物は次
のような構造を有する。
MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAA
GGTACCCCGAAACCGCAGTCT-ポリスチレン (c)担体からのDNAフラグメントの切り離しおよび
保護基の除去 40.0mg(約0.60μモル)のDNA合成樹脂96/67を、
66mg(0.40ミリモル)のo−ニトロベンズアルドキ
シムおよび50μl(0.40ミリモル)の1,1,3,3
−テトラメチルグアニジンを400μlの95%ピリジン
に溶解したものと共に50℃で3時間および室温で12
時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛ばして除去した後、
残渣に1.6mlのアンモニア水(33%)を加え、混合
物を閉鎖容器中で50℃で24時間保つ。
GGTACCCCGAAACCGCAGTCT-ポリスチレン (c)担体からのDNAフラグメントの切り離しおよび
保護基の除去 40.0mg(約0.60μモル)のDNA合成樹脂96/67を、
66mg(0.40ミリモル)のo−ニトロベンズアルドキ
シムおよび50μl(0.40ミリモル)の1,1,3,3
−テトラメチルグアニジンを400μlの95%ピリジン
に溶解したものと共に50℃で3時間および室温で12
時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛ばして除去した後、
残渣に1.6mlのアンモニア水(33%)を加え、混合
物を閉鎖容器中で50℃で24時間保つ。
分離した液相から真空でアンモニアを除去し、過酸化物
を含まないジエチルエーテルそれぞれ3mlを用いて3
回洗浄する。Biogel P6カラム〔100〜200メッシュ、3
×66cm、0.01モル重炭酸トリメチルアンモニウム(pH7.
5)1.5ml/分〕上で低分子量成分を除去した後、2850D
s(260nm)のDNAが単離される。
を含まないジエチルエーテルそれぞれ3mlを用いて3
回洗浄する。Biogel P6カラム〔100〜200メッシュ、3
×66cm、0.01モル重炭酸トリメチルアンモニウム(pH7.
5)1.5ml/分〕上で低分子量成分を除去した後、2850D
s(260nm)のDNAが単離される。
60ODの全量をHPLCカラム(PRP−1/Hamilton、250×4.
6mm)上で分離する。グラジエント〔溶液A:0.05M酢
酸トリエチルアンモニウム(pH7.0);溶液B:溶液A/
アセトニトリル=1:1〕:30%B/A、60%B/
A、50℃および2ml/分で20分間。親油性の主ピ
ーク(保持時間、約14分間)を集め、DE52セルロース
(Whatman)カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエタノ
ールで沈澱させる。4−メトキシトリチル保護基を外す
ために、沈澱を50μlの酢酸/H2O(4:1)に溶解
し、室温で45分間維持する。反応生成物を凍結乾燥
し、エタノールで沈澱させ、そして精製のため8%ポリ
アクリルアミドゲル(7M尿素)上で電気泳動によって
分離する。所望のDNAの大きさに対応するバンドを切
り取り、生成物を電気溶出し、DE52セルロース上で濃縮
し、下記の構造: 5′-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGA
AGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-3′ を有するDNA96/97をエタノールで沈澱させる。
6mm)上で分離する。グラジエント〔溶液A:0.05M酢
酸トリエチルアンモニウム(pH7.0);溶液B:溶液A/
アセトニトリル=1:1〕:30%B/A、60%B/
A、50℃および2ml/分で20分間。親油性の主ピ
ーク(保持時間、約14分間)を集め、DE52セルロース
(Whatman)カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエタノ
ールで沈澱させる。4−メトキシトリチル保護基を外す
ために、沈澱を50μlの酢酸/H2O(4:1)に溶解
し、室温で45分間維持する。反応生成物を凍結乾燥
し、エタノールで沈澱させ、そして精製のため8%ポリ
アクリルアミドゲル(7M尿素)上で電気泳動によって
分離する。所望のDNAの大きさに対応するバンドを切
り取り、生成物を電気溶出し、DE52セルロース上で濃縮
し、下記の構造: 5′-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGA
AGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-3′ を有するDNA96/97をエタノールで沈澱させる。
実施例6. 下記のDNAフラグメント(5′−3′)を、実施例5
と同様に製造する。
と同様に製造する。
1/58 CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCT
GTGCCTGT 46/64相補体 CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCG
CACAGGCACAGGTT 154/64相補体 CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCG
TTGTGACACTGCGG 実施例7.フラグメント1/58、相補体46/64、相補体
96/67および154/65のリン酸化 5′−末端のリン酸化および放射能標識を、Molecular Cloning Alaboratory Manual (T.Maniatisら編集)、Cold Spring Harbor Lab.、198
2年、125頁に記載の方法で〔γ−32P〕ATPおよびT
4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boeringer)を用いて行
う。
GTGCCTGT 46/64相補体 CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCG
CACAGGCACAGGTT 154/64相補体 CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCG
TTGTGACACTGCGG 実施例7.フラグメント1/58、相補体46/64、相補体
96/67および154/65のリン酸化 5′−末端のリン酸化および放射能標識を、Molecular Cloning Alaboratory Manual (T.Maniatisら編集)、Cold Spring Harbor Lab.、198
2年、125頁に記載の方法で〔γ−32P〕ATPおよびT
4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boeringer)を用いて行
う。
実施例8.デュプレックスII(デスルファトヒルジンHV
1遺伝子のフラグメントF2)への重合 キナーゼ処理したフラグメント96/67およびキナーゼ処
理したフラグメント154/64それぞれ50pモルを、水
24μlに溶解し、溶液を90℃で3分間加熱し、5分
以内に12℃まで冷却する。4μlのエンド−R緩衝液
(0.1Mトリス・HCl、pH7.5、66mM MgCl2、6
6mMのβ−メルカプトエタノール、0.6M NaCl)、
10μlのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合
物(dATP、dCTP、dGTP、TTPであって、それぞれ2×10
-3Mで、NH3でpH7.0に調整)、および2μl(10単
位)のDNAポリメラーゼI、Klenowフラグメント(Boe
ringer)を添加した後、12℃で30分間インキュベー
トする。90℃で3分間加熱して反応を停止させ、更に
処理するまで−80℃で貯蔵する。
1遺伝子のフラグメントF2)への重合 キナーゼ処理したフラグメント96/67およびキナーゼ処
理したフラグメント154/64それぞれ50pモルを、水
24μlに溶解し、溶液を90℃で3分間加熱し、5分
以内に12℃まで冷却する。4μlのエンド−R緩衝液
(0.1Mトリス・HCl、pH7.5、66mM MgCl2、6
6mMのβ−メルカプトエタノール、0.6M NaCl)、
10μlのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合
物(dATP、dCTP、dGTP、TTPであって、それぞれ2×10
-3Mで、NH3でpH7.0に調整)、および2μl(10単
位)のDNAポリメラーゼI、Klenowフラグメント(Boe
ringer)を添加した後、12℃で30分間インキュベー
トする。90℃で3分間加熱して反応を停止させ、更に
処理するまで−80℃で貯蔵する。
同様にして、キナーゼ処理されたフラグメント1/58お
よび46/64を反応させてデュプレックス(デスルファト
ヒルジン遺伝子のフラグメントF1)を形成させる。
よび46/64を反応させてデュプレックス(デスルファト
ヒルジン遺伝子のフラグメントF1)を形成させる。
デュプレックスIおよびIIは、下記の構造を有する。
デスルファトヒルジン遺伝子のフラグメントF1 およびF2の製造を、下記のスキーム1に示す。
スキーム1. デスルファトヒルジン遺伝子HV1のフラグメントF1およ
びF2並びにF1-F2DNAの製造 実施例9 フラグメント1/58、キナーゼ処理した46
/64、キナーゼ処理した96/67、および154/64の重合
および連結;デスルファトヒルジンHV1遺伝子の製造 フラグメント1/58、キナーゼ処理したフラグメント
46/64、キナーゼ処理した96/67、および154/64をそ
れぞれ50pモルを、水48μlに溶解し、溶液を90
℃で3分間加熱し、5分以内に12°まで冷却する。8
μlのエンド−R緩衝液(実施例8参照のこと)、20
μlのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合物
(dATP、dCTP、dGTP、TTPであって、それぞれ2×10-3M
で、NH3でpH7.0に調整)および2μl(10単位)
のDNAポリメラーゼI,Klenowフラグメント(Boeringe
r)を添加した後、12℃で30分間インキュベートす
る。90℃で3分間加熱して反応を停止させ、フェノー
ル/クロロホルムで抽出した後、エタノールで沈澱させ
てDNAを単離する。生成するDNA混合物を100μl
のリガーゼ/緩衝液〔66mMトリス・HCl(pH7.5)
6.6mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、5mM
ATP〕に溶解し、50単位(2μl)のT4 DNAリ
ガーゼ(Biolabs)を加え、全量を20℃で20時間イン
キュベートする。70℃で5分間加熱することにより、
反応を停止させ、フェノール/クロロホルムで抽出した
後、エタノールで沈澱させることによりDNAを単離す
る。混合物を8%ポリアクリルアミドゲル(変性)上で
電気泳動によって分離した後、217個の塩基対を有する
連結生成物を電気溶出させ、DE52セルロースカラム上で
濃縮し、溶出後にエタノールで沈澱させることによって
単離する。
びF2並びにF1-F2DNAの製造 実施例9 フラグメント1/58、キナーゼ処理した46
/64、キナーゼ処理した96/67、および154/64の重合
および連結;デスルファトヒルジンHV1遺伝子の製造 フラグメント1/58、キナーゼ処理したフラグメント
46/64、キナーゼ処理した96/67、および154/64をそ
れぞれ50pモルを、水48μlに溶解し、溶液を90
℃で3分間加熱し、5分以内に12°まで冷却する。8
μlのエンド−R緩衝液(実施例8参照のこと)、20
μlのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合物
(dATP、dCTP、dGTP、TTPであって、それぞれ2×10-3M
で、NH3でpH7.0に調整)および2μl(10単位)
のDNAポリメラーゼI,Klenowフラグメント(Boeringe
r)を添加した後、12℃で30分間インキュベートす
る。90℃で3分間加熱して反応を停止させ、フェノー
ル/クロロホルムで抽出した後、エタノールで沈澱させ
てDNAを単離する。生成するDNA混合物を100μl
のリガーゼ/緩衝液〔66mMトリス・HCl(pH7.5)
6.6mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、5mM
ATP〕に溶解し、50単位(2μl)のT4 DNAリ
ガーゼ(Biolabs)を加え、全量を20℃で20時間イン
キュベートする。70℃で5分間加熱することにより、
反応を停止させ、フェノール/クロロホルムで抽出した
後、エタノールで沈澱させることによりDNAを単離す
る。混合物を8%ポリアクリルアミドゲル(変性)上で
電気泳動によって分離した後、217個の塩基対を有する
連結生成物を電気溶出させ、DE52セルロースカラム上で
濃縮し、溶出後にエタノールで沈澱させることによって
単離する。
デスルファトヒルジン遺伝子は、次のような構造を有す
る。
る。
4個のフラグメントからのデスルファトヒルジン遺伝子
の製造を、下記のスキーム2に示す。
の製造を、下記のスキーム2に示す。
スキーム2. 4個の合成フラグメントからのヒルジン遺伝子の製造 実施例10.デスルファトヒルジンHV1遺伝子のF1−
DNAを有するプラスミドpML300の造成(第1図) (a)線状化したベクターpBR322/EcoR I/Pvu IIの製
造 pBR322プラスミドDNA(5μg)を、5単位のPvu II
制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を100μg/mlゼラ
チンの溶液200mlとしたもので、37℃で1時間消化
する。次いで、この溶液を100mMのトリス・HCl(pH
7.5)および50mMのNaClに調整し、そしてこのDNA
をEcoRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)30単位で3
7℃で2時間消化する。次いで、この溶液を50mMト
リス・HCl(pH8)に調整し、10μg/μlのDNA
濃度において、2単位のウシ腸アルカリホスファターゼ
(Boeringer)を用いて、37℃で30分間インキュベー
トする。この溶液を65℃で60分間加熱することによ
って、酵素を不活性化する。次いで、この溶液をTNE
で標準化して、1容量のフェノールおよびクロロホルム
で抽出し、消化されたDNAを−20℃で2容量のアル
コールを用いて一晩沈澱させる。
DNAを有するプラスミドpML300の造成(第1図) (a)線状化したベクターpBR322/EcoR I/Pvu IIの製
造 pBR322プラスミドDNA(5μg)を、5単位のPvu II
制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を100μg/mlゼラ
チンの溶液200mlとしたもので、37℃で1時間消化
する。次いで、この溶液を100mMのトリス・HCl(pH
7.5)および50mMのNaClに調整し、そしてこのDNA
をEcoRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)30単位で3
7℃で2時間消化する。次いで、この溶液を50mMト
リス・HCl(pH8)に調整し、10μg/μlのDNA
濃度において、2単位のウシ腸アルカリホスファターゼ
(Boeringer)を用いて、37℃で30分間インキュベー
トする。この溶液を65℃で60分間加熱することによ
って、酵素を不活性化する。次いで、この溶液をTNE
で標準化して、1容量のフェノールおよびクロロホルム
で抽出し、消化されたDNAを−20℃で2容量のアル
コールを用いて一晩沈澱させる。
pBR322のDNAから切り取られたベクター(pBR322/Ec
oR I/Pvu II、2297塩基対)を、1%低融点アガロース
(Biorad)/トリス−アセテート−EDTA緩衝液(pH8)上で
ゲル電気泳動を行うことによって小DNAフラグメント
(2067個の塩基対)から分離する。アガロースゲル中の
DNAをEtBrで染色した後、pBR322/EcoR I/Pvu IIベ
クター(=2297塩基対)のDNAバンドを含むゲルの領
域をゲルから切り取り、65℃で10分間液化する。2
0容量のTNEをこのDNA溶液に加えて、Mueller
ら、〔J.Mol.Biol.,第124巻、343頁、1978年〕の方法に
準じて、DE−52クロマトグラフィを行ってDNAを精製
し、フェノール/クロロホルムで抽出し、DNAをアル
コールで−20℃において一晩沈澱させる。
oR I/Pvu II、2297塩基対)を、1%低融点アガロース
(Biorad)/トリス−アセテート−EDTA緩衝液(pH8)上で
ゲル電気泳動を行うことによって小DNAフラグメント
(2067個の塩基対)から分離する。アガロースゲル中の
DNAをEtBrで染色した後、pBR322/EcoR I/Pvu IIベ
クター(=2297塩基対)のDNAバンドを含むゲルの領
域をゲルから切り取り、65℃で10分間液化する。2
0容量のTNEをこのDNA溶液に加えて、Mueller
ら、〔J.Mol.Biol.,第124巻、343頁、1978年〕の方法に
準じて、DE−52クロマトグラフィを行ってDNAを精製
し、フェノール/クロロホルムで抽出し、DNAをアル
コールで−20℃において一晩沈澱させる。
DNAの沈澱を50μlの0.01Mトリス・HCl(pH
8),0.1mMEDTAに溶解し、使用するまで−20℃で貯
蔵する。1.4μg(=3.2pモルの末端)のDNAを得
る。
8),0.1mMEDTAに溶解し、使用するまで−20℃で貯
蔵する。1.4μg(=3.2pモルの末端)のDNAを得
る。
(b)F1−DNA/EcoR Iの製造 化学的に合成されたF1−DNA(実施例8を参照)2
4ng(=1.3pモルの末端)を、50μl100mMトリ
ス・HCl(pH7.5),50mM NaClおよび100μg/m
lのゼラチン中で5単位のEcoR I制限エンドヌクレアー
ゼ(Biolabs)を用いて37℃で30分間消化する。次
に、線状化したベクターpBR322/EcoR I/Pvu II(実施
例10a)0.06μg(=0.14pモルの末端)を溶液に加え
る。次いで、酵素を65℃で加熱することにより10分
後に不活性化し、溶液をTNEで標準化して、フェノー
ル/クロロホルムで抽出する。沈澱したDNAを、更に
処理するまで、−20℃で貯蔵する。
4ng(=1.3pモルの末端)を、50μl100mMトリ
ス・HCl(pH7.5),50mM NaClおよび100μg/m
lのゼラチン中で5単位のEcoR I制限エンドヌクレアー
ゼ(Biolabs)を用いて37℃で30分間消化する。次
に、線状化したベクターpBR322/EcoR I/Pvu II(実施
例10a)0.06μg(=0.14pモルの末端)を溶液に加え
る。次いで、酵素を65℃で加熱することにより10分
後に不活性化し、溶液をTNEで標準化して、フェノー
ル/クロロホルムで抽出する。沈澱したDNAを、更に
処理するまで、−20℃で貯蔵する。
(c)pBR322/EcoR I/Pvu IIベクターDNAとF1−
DNA/EcoR Iとの連結およびプラスミドpML300の造成 2個の上記DNAフラグメントを含有する、実施例10
(b)で得られたDNA沈澱を、20μLの50mMト
リス・HCl(pH、7.8),10mM MgCl2,10mM
DTT,0.5mM ATPおよび100μg/のゼラチ
ンの溶液に溶解し、20単位/μlT4 DNAリガー
ゼ(Biolabs)で15℃で3時間処理する。この方法で、
F1−DNAを含む組み換えプラスミドpML300が、溶液
中に得られる。
DNA/EcoR Iとの連結およびプラスミドpML300の造成 2個の上記DNAフラグメントを含有する、実施例10
(b)で得られたDNA沈澱を、20μLの50mMト
リス・HCl(pH、7.8),10mM MgCl2,10mM
DTT,0.5mM ATPおよび100μg/のゼラチ
ンの溶液に溶解し、20単位/μlT4 DNAリガー
ゼ(Biolabs)で15℃で3時間処理する。この方法で、
F1−DNAを含む組み換えプラスミドpML300が、溶液
中に得られる。
(d)プラスミドpML300を用いるE.コリHN101の形質
転換 形質転換に必要なカルシウム前処理したE.コリHB101
細胞を、Mandelら〔J.Mol.Biol.、第53巻、159頁、19
70年〕により記載された方法で調製する。
転換 形質転換に必要なカルシウム前処理したE.コリHB101
細胞を、Mandelら〔J.Mol.Biol.、第53巻、159頁、19
70年〕により記載された方法で調製する。
組み換えプラスミドpML300を含む(c)で得られた溶液
を65℃で10分間加熱して、T4DNAリガーゼを不
活性化して、そして次に37℃に冷却する。この反応混
合物10μlを、カルシウム処理したE.コリHB101/1
0mMMgCl2および10mMのトリス・HCl(pH7.5)150
μlに加えて全量を200μlとする。
を65℃で10分間加熱して、T4DNAリガーゼを不
活性化して、そして次に37℃に冷却する。この反応混
合物10μlを、カルシウム処理したE.コリHB101/1
0mMMgCl2および10mMのトリス・HCl(pH7.5)150
μlに加えて全量を200μlとする。
次いで、この混合物を30分間氷冷し、42℃で2分間
加熱した後、L−培地(実施例18を参照されたい)1
ml中で37℃で50分間放置する。この混合物を60
μ/mlのアンピシリン(Serva)を含む5個の寒天平板
(McConkey Agar、Difco)上に0.2mlずつ塗布する。次
に、寒天平板を37℃で16〜18時間保持する。形質転換
されたE.コリHB101の484個のアンピシリン耐性コロニ
ーが得られる。
加熱した後、L−培地(実施例18を参照されたい)1
ml中で37℃で50分間放置する。この混合物を60
μ/mlのアンピシリン(Serva)を含む5個の寒天平板
(McConkey Agar、Difco)上に0.2mlずつ塗布する。次
に、寒天平板を37℃で16〜18時間保持する。形質転換
されたE.コリHB101の484個のアンピシリン耐性コロニ
ーが得られる。
(e)F1−DNAを含むコロニーのスクリーニング 470個の形質転換されたコロニー(実施例10d)を、ニ
トロセルロールフィルターB85(Schleicher and Schul
l)に押圧する。M.Grunstein and D.S.Hogness〔Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA、第72巻、3961頁、1979年〕の方法
に準じて、コロニーを溶解し、そして変性したDNAを
フィルター上に固定する。次いで、フィルターのプレハ
イブリダイゼーションを、20ml(フィルター当た
り)の4×SET〔30mMトリス・HCl(pH8),150m
MNaClおよび1mMEDTAの溶液〕,0.1%(w/v)Fic
o11400(Pharmacia),0.5%SDS,50μg/ml変性
したウシ胸腺DNA中で64℃で4時間行う。次いで、
ニトロセルロースフィルターを20ml(フィルター当
たり)の5×SET(W/v)Ficoll 400,0.2%SDSお
よび50μg/ml変性したウシ胸腺DNA中で、32P
放射能標識したプローブ(フィルター当たり約103〜104
セーレンコフcpm)を用いて処理する。相補的なオリ
ゴヌクレオチド46/64(実施例6参照)をプローブとし
て使用する。
トロセルロールフィルターB85(Schleicher and Schul
l)に押圧する。M.Grunstein and D.S.Hogness〔Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA、第72巻、3961頁、1979年〕の方法
に準じて、コロニーを溶解し、そして変性したDNAを
フィルター上に固定する。次いで、フィルターのプレハ
イブリダイゼーションを、20ml(フィルター当た
り)の4×SET〔30mMトリス・HCl(pH8),150m
MNaClおよび1mMEDTAの溶液〕,0.1%(w/v)Fic
o11400(Pharmacia),0.5%SDS,50μg/ml変性
したウシ胸腺DNA中で64℃で4時間行う。次いで、
ニトロセルロースフィルターを20ml(フィルター当
たり)の5×SET(W/v)Ficoll 400,0.2%SDSお
よび50μg/ml変性したウシ胸腺DNA中で、32P
放射能標識したプローブ(フィルター当たり約103〜104
セーレンコフcpm)を用いて処理する。相補的なオリ
ゴヌクレオチド46/64(実施例6参照)をプローブとし
て使用する。
次いで、フィルターを2×SET,0.2%SDSで2回室温
で洗浄し、次いで2×SET,0.5%SDSで2回60℃で
洗浄する。(最初は30分間、次に60分間)。次に、
フィルターを3MM紙(Whatman)の間で乾燥し、−80
℃で強調用スクリーン(I1ford)を有するXフィルム(フ
ジ)上に1〜2日間置く。
で洗浄し、次いで2×SET,0.5%SDSで2回60℃で
洗浄する。(最初は30分間、次に60分間)。次に、
フィルターを3MM紙(Whatman)の間で乾燥し、−80
℃で強調用スクリーン(I1ford)を有するXフィルム(フ
ジ)上に1〜2日間置く。
得られるオートラジオグラムは、その後の処理に用いる
ことができる71個の陽性のコロニーを示し、その一つ
をpML300を命名する。
ことができる71個の陽性のコロニーを示し、その一つ
をpML300を命名する。
実施例11.デスルファトヒルジンHV1遺伝子のF2−
DNAを含むプラスミドpML305の造成(第2図) (a)線状化したベクターpBR322/BamH I/Nru Iの造
成 pBR322プラスミドDNA(5μg)を、30単位のBamH
I制限エンドヌクレアーゼで、100mM NaCl,6mM
トリス・HCl(pH7.9),6mM MgCl2および100μg
/mlゼラチンの溶液中で、37℃で30分間消化す
る。次いで、Pvu II制限エンドヌクレアーゼ15単位を
溶液を加え、37℃で2時間消化する。
DNAを含むプラスミドpML305の造成(第2図) (a)線状化したベクターpBR322/BamH I/Nru Iの造
成 pBR322プラスミドDNA(5μg)を、30単位のBamH
I制限エンドヌクレアーゼで、100mM NaCl,6mM
トリス・HCl(pH7.9),6mM MgCl2および100μg
/mlゼラチンの溶液中で、37℃で30分間消化す
る。次いで、Pvu II制限エンドヌクレアーゼ15単位を
溶液を加え、37℃で2時間消化する。
反応混合物を70℃で10分間加熱し、酵素を不活性化
する。次いで、1%低融点アガロース/トリス−アセテ
ート−EDTA緩衝液(pH8)上でゲル電気泳動を行うことに
よって2つのDNAフラグメントを互いに分離する(実
施例10a参照)。pBR322 BamH I/Pvu IIベクター(=2
672塩基対)のDNAバンドを含むゲルの領域をゲルか
ら切り取り、液化し、そして、Muellerら(上記)の方
法に準じて、DE−52クロマトグラフィを行ってDNAを
精製する。0.75μg(1.5pモルの末端)のDNAが得
られる。
する。次いで、1%低融点アガロース/トリス−アセテ
ート−EDTA緩衝液(pH8)上でゲル電気泳動を行うことに
よって2つのDNAフラグメントを互いに分離する(実
施例10a参照)。pBR322 BamH I/Pvu IIベクター(=2
672塩基対)のDNAバンドを含むゲルの領域をゲルか
ら切り取り、液化し、そして、Muellerら(上記)の方
法に準じて、DE−52クロマトグラフィを行ってDNAを
精製する。0.75μg(1.5pモルの末端)のDNAが得
られる。
(b)F2−DNA/BamH Iの製造 化学的に合成されたF2−DNA(実施例8を参照)2
5μg(=1.3pモルの末端)を、20μlの150mM
NaCl,6mMトリス・HCl(pH7.9),6mMのMgCl2お
よび100μg/mlのゼラチン中で16単位のBamH I制
限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を用いて37℃で30
分間消化する。次に、線状化したベクターpBR322/BamH
I/Pvu II(実施例11a)60ng(=96nモルの末
端)を溶液に加え、全溶液をTNEで標準化して、フェ
ノール/クロロホルムで抽出し、DNAを2容量のアル
コールで沈澱させる。沈澱したDNAを、更に処理する
まで、−20℃でアルコール中に貯蔵する。
5μg(=1.3pモルの末端)を、20μlの150mM
NaCl,6mMトリス・HCl(pH7.9),6mMのMgCl2お
よび100μg/mlのゼラチン中で16単位のBamH I制
限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を用いて37℃で30
分間消化する。次に、線状化したベクターpBR322/BamH
I/Pvu II(実施例11a)60ng(=96nモルの末
端)を溶液に加え、全溶液をTNEで標準化して、フェ
ノール/クロロホルムで抽出し、DNAを2容量のアル
コールで沈澱させる。沈澱したDNAを、更に処理する
まで、−20℃でアルコール中に貯蔵する。
(c)pBR322/BamH I/Pvu IIベクターDNAとF2−
DNA/BamH Iとの連結およびプラスミドpML305の造成 2個の上記DNAフラグメントを含有する実施例11
(b)で得られたDNA沈澱を、20μlの50mMト
リス・HCl(pH、7.8),10mM MgCl2,10mM
DTT,0.5mMATPおよび100μg/1mlのゼラ
チンの溶液に溶解し、15単位/μlのT4 DNAリ
ガーゼ(Biolabs)で15℃で3時間処理する。この方法
で、F2−DNAを含む組み替えプラスミドpML305が溶
液中に得られる。
DNA/BamH Iとの連結およびプラスミドpML305の造成 2個の上記DNAフラグメントを含有する実施例11
(b)で得られたDNA沈澱を、20μlの50mMト
リス・HCl(pH、7.8),10mM MgCl2,10mM
DTT,0.5mMATPおよび100μg/1mlのゼラ
チンの溶液に溶解し、15単位/μlのT4 DNAリ
ガーゼ(Biolabs)で15℃で3時間処理する。この方法
で、F2−DNAを含む組み替えプラスミドpML305が溶
液中に得られる。
(d)プラスミドpML305を用いるE.コリ HB101の形
質転換 カルシウム処理されたE.コリ HB101細胞の形質転換
はは、実施例10(d)に記載のようにして行う。実施
例11(c)で得られる反応混合物10μlを用いる。
313個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
質転換 カルシウム処理されたE.コリ HB101細胞の形質転換
はは、実施例10(d)に記載のようにして行う。実施
例11(c)で得られる反応混合物10μlを用いる。
313個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
(e)F2−DNAを含むコロニーのスクリーニング 65個の形質転換されたコロニー(実施例11d)を、実
施例10(e)に記載の方法でF2−DNAについて試
験する。相補的オリゴヌクレオチド154/64(実施例6
を参照されたい)を、放射能プローブとして用いる。オ
ートラジオグラムにおいて2個の陽性のコロニーが得ら
れ、その一つをpML305と命名する。
施例10(e)に記載の方法でF2−DNAについて試
験する。相補的オリゴヌクレオチド154/64(実施例6
を参照されたい)を、放射能プローブとして用いる。オ
ートラジオグラムにおいて2個の陽性のコロニーが得ら
れ、その一つをpML305と命名する。
実施例12.クローンpML300およびpML305の特性決定 組換プラスミドpML300およびpML305のDNAを、Ish−H
orowitz〔Molecular Cloning,ALaboratory Manual(T.M
aniatisら編),Cold Spring Harbor Lab.,1982年,368
頁〕の方法に準じて単離する。F1−DNAおよびF2
−DNAインサートのヌクレオチド配列を、Maxamおよ
びGilbert〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,第74巻,560
頁,1977年;Meth.Enzym.,第65巻,499頁,1980年も
参照されたい〕の方法に準じて確認する。
orowitz〔Molecular Cloning,ALaboratory Manual(T.M
aniatisら編),Cold Spring Harbor Lab.,1982年,368
頁〕の方法に準じて単離する。F1−DNAおよびF2
−DNAインサートのヌクレオチド配列を、Maxamおよ
びGilbert〔Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,第74巻,560
頁,1977年;Meth.Enzym.,第65巻,499頁,1980年も
参照されたい〕の方法に準じて確認する。
このためには、それぞれの場合に、10μgのpML300の
プラスミドDNAをEcoR I制限エンドヌクレアーゼで開
裂し、そして10μgのpML305のプラスミドDNAをBa
mH I制限エンドヌクレアーゼで開裂し、線状化されたD
NAをアガロースゲル〔実施例10(a)参照〕からゲ
ル溶出によって単離する。次に、単離されたDNAをア
ルカリ性ホスファターゼで消化して、そしてDE−52上で
クロマトグラフィを行う(実施例11aを参照された
い)。次に、DNAを5′−末端で〔γ−32〕ATP
(比活性、5000Ci/mモル、Amersham)およびT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(P−L−Biochemicals)を用
いて、放射能標識する。放射能標識したDNAを、次い
で第二の制限エンドヌクレアーゼ(EcoR II)を用いて開
裂する。生成するDNAフラグメントを、アガロースか
らゲル溶出によって単離する。pML300の場合には、F1
−DNAのヌクレオチド配列をEcoR II−EcoR I*フラ
グメント(約109塩基対)から決定し、pML300の場合に
は、F2−DNAのヌクレオチド配列をEcoR II−BamH
I*フラグメント(約122塩基対)において決定する(*
は放射能標識されているDNA末端を意味する)。
プラスミドDNAをEcoR I制限エンドヌクレアーゼで開
裂し、そして10μgのpML305のプラスミドDNAをBa
mH I制限エンドヌクレアーゼで開裂し、線状化されたD
NAをアガロースゲル〔実施例10(a)参照〕からゲ
ル溶出によって単離する。次に、単離されたDNAをア
ルカリ性ホスファターゼで消化して、そしてDE−52上で
クロマトグラフィを行う(実施例11aを参照された
い)。次に、DNAを5′−末端で〔γ−32〕ATP
(比活性、5000Ci/mモル、Amersham)およびT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(P−L−Biochemicals)を用
いて、放射能標識する。放射能標識したDNAを、次い
で第二の制限エンドヌクレアーゼ(EcoR II)を用いて開
裂する。生成するDNAフラグメントを、アガロースか
らゲル溶出によって単離する。pML300の場合には、F1
−DNAのヌクレオチド配列をEcoR II−EcoR I*フラ
グメント(約109塩基対)から決定し、pML300の場合に
は、F2−DNAのヌクレオチド配列をEcoR II−BamH
I*フラグメント(約122塩基対)において決定する(*
は放射能標識されているDNA末端を意味する)。
F1−DNAおよびF2−DNAについて決定されるヌ
クレオチド配列は、実施例8に示したものと同じであ
る。
クレオチド配列は、実施例8に示したものと同じであ
る。
実施例13.発現プラスミドpML310の造成 (a)trpプロモーター−オペレーターを有する線状化
されたベクターpHRi148/EcoR I/BamH Iの造成(第3
図及び第4図) A.プラスミドp159の造成 10μgのプラスミドpBRHtrp〔DE−OS3111405〕を50
単位のEcoR I(Biolabs)を用いて37℃で60分間開裂
させ、消化混合物をフェノール抽出した後、TST41(Kont
ron AG)ローター中で50mMトリス・HCl(pH8.0)お
よび1mMのEDTAにおいて、サッカロース密度勾配(5
〜23%)で分画する。遠心分離は、40,000rpm、1
5℃で14時間継続する。0.3mlずつの画分を、ISC0
勾配コレクターを用いて1ml/分で集める。小さなフ
ラグメントを含む画分をまとめ、この溶液をTNEで標
準化し、−20℃で2容量のエタノールを用いて沈澱さ
せる。
されたベクターpHRi148/EcoR I/BamH Iの造成(第3
図及び第4図) A.プラスミドp159の造成 10μgのプラスミドpBRHtrp〔DE−OS3111405〕を50
単位のEcoR I(Biolabs)を用いて37℃で60分間開裂
させ、消化混合物をフェノール抽出した後、TST41(Kont
ron AG)ローター中で50mMトリス・HCl(pH8.0)お
よび1mMのEDTAにおいて、サッカロース密度勾配(5
〜23%)で分画する。遠心分離は、40,000rpm、1
5℃で14時間継続する。0.3mlずつの画分を、ISC0
勾配コレクターを用いて1ml/分で集める。小さなフ
ラグメントを含む画分をまとめ、この溶液をTNEで標
準化し、−20℃で2容量のエタノールを用いて沈澱さ
せる。
Eppendorf遠心分離機中で遠心分離した後、DNAを100
μlの10mMトリス・HCl(pH7.5)および0.5mM
EDTAに溶解する。このDNAフラグメント5μgを5単
位のBg1 II(Bilabs)を用いて、37℃で60分間開裂さ
せる。反応混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽
出し、DNAを2容量のエタノールと共に−80℃で1
0分間インキュベートし、DNAを遠心分離によって集
めて、50μlの50mMトリス・HCl(pH8.0)に再
度溶解させる。この溶液の2μlを採取して(DNA0.
2μg)、50mMトリス・HCl(pH8.0)中で10ng
/μlのDNA濃度で1単位のウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ(Boeringer)と共に37℃で30分間インキュ
ベートする。溶液を65℃で60分間加熱することによ
って酵素を不活性化する。0.04μgのDNAを採取し、
そして5′−末端を、50mMのトリス・HCl(pH9.
5),10mMのMgCl2および5mMのDTTの反応容積
20μl中10μCi〔γ−32P〕−ATP(5000Ci/mM,A
mercham、およびで5単位のT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ(P−LBilchemicals)と共に37℃で30分間イ
ンキュベートして標識する。放射性試料を非標識試料
(上記参照)と混合して、DNAフラグメントをTST60
ローター中で50mMトリス・HCl(pH8.0)および1
mM EDTA中で5〜23%サッカロース密度勾配によっ
て分画する。遠心分離を、60,000rpm、15℃で5時
間行う。0.2mlずつの画分を集める。それぞれの画分
の放射能活性をセレンコフ放射線を測定することによっ
て計測し、それによってフラグメントを同定する。小さ
なDNAフラグメントを含む所望のフラグメントをまと
めて、DNAを2容量のエタノールを用いて沈澱させ、
遠心分離した後、20μlの10mMトリス・HCl(p
H7.5)および0.5mM EDTAに再度溶解する。32 P−標識されたEcoR I−Bg1 IIDNAフラグメント
を、50μlの容量中で0.2単位のTaq I(Billabs)を用
いて、37℃で10分間部分的に開裂させる。反応混合
物を、0.2%SDS,10%グリセリン,10mM EDT
A,0.05%ブロモフェノール−ブルーに調整し、そして
DNAフラグメントをトリス−ホウ酸−EDTA中で6%ポ
リアクリルアミド上で分離する〔A.C.Peacockら、Bioch
emistry、第6巻、1818頁、1967年〕。所望のEcoR I−T
aq I(最大の部分消化フラグメント)を含むバンドをオ
ートラジオグラム上で同定する。このフラグメント
(L.,第3図参照)をゲルから抽出して、精製し(W.Mue
llerら、上記)、そして10μlの10mMトリス・H
Cl(pH7.5)および1mM EDTAに溶解する。
μlの10mMトリス・HCl(pH7.5)および0.5mM
EDTAに溶解する。このDNAフラグメント5μgを5単
位のBg1 II(Bilabs)を用いて、37℃で60分間開裂さ
せる。反応混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽
出し、DNAを2容量のエタノールと共に−80℃で1
0分間インキュベートし、DNAを遠心分離によって集
めて、50μlの50mMトリス・HCl(pH8.0)に再
度溶解させる。この溶液の2μlを採取して(DNA0.
2μg)、50mMトリス・HCl(pH8.0)中で10ng
/μlのDNA濃度で1単位のウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ(Boeringer)と共に37℃で30分間インキュ
ベートする。溶液を65℃で60分間加熱することによ
って酵素を不活性化する。0.04μgのDNAを採取し、
そして5′−末端を、50mMのトリス・HCl(pH9.
5),10mMのMgCl2および5mMのDTTの反応容積
20μl中10μCi〔γ−32P〕−ATP(5000Ci/mM,A
mercham、およびで5単位のT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ(P−LBilchemicals)と共に37℃で30分間イ
ンキュベートして標識する。放射性試料を非標識試料
(上記参照)と混合して、DNAフラグメントをTST60
ローター中で50mMトリス・HCl(pH8.0)および1
mM EDTA中で5〜23%サッカロース密度勾配によっ
て分画する。遠心分離を、60,000rpm、15℃で5時
間行う。0.2mlずつの画分を集める。それぞれの画分
の放射能活性をセレンコフ放射線を測定することによっ
て計測し、それによってフラグメントを同定する。小さ
なDNAフラグメントを含む所望のフラグメントをまと
めて、DNAを2容量のエタノールを用いて沈澱させ、
遠心分離した後、20μlの10mMトリス・HCl(p
H7.5)および0.5mM EDTAに再度溶解する。32 P−標識されたEcoR I−Bg1 IIDNAフラグメント
を、50μlの容量中で0.2単位のTaq I(Billabs)を用
いて、37℃で10分間部分的に開裂させる。反応混合
物を、0.2%SDS,10%グリセリン,10mM EDT
A,0.05%ブロモフェノール−ブルーに調整し、そして
DNAフラグメントをトリス−ホウ酸−EDTA中で6%ポ
リアクリルアミド上で分離する〔A.C.Peacockら、Bioch
emistry、第6巻、1818頁、1967年〕。所望のEcoR I−T
aq I(最大の部分消化フラグメント)を含むバンドをオ
ートラジオグラム上で同定する。このフラグメント
(L.,第3図参照)をゲルから抽出して、精製し(W.Mue
llerら、上記)、そして10μlの10mMトリス・H
Cl(pH7.5)および1mM EDTAに溶解する。
アクセプタープラスミドとして、Cla IおよびEcoR Iで
消化されるpBR322を用いる。2μgのpBR322を20μl
の反応容量中で4単位のCla I(Biolabs)を用いて37℃
で60分間消化される。蛋白質をフェノールで抽出し、
次いでDNAを2容量のエタノールを用いて−80℃で
10分間沈澱させる。DNAを遠心分離によって集め、
次いで20μlの反応容積において37℃で10単位の
EcoR I(Biolabs)を用いて30分間消化する。次いで、
0.1Mトリス・HCl(pH8.7)2容量を溶液に加え、全量
を1単位のアルカリ性ウシホスファターゼ(Boeringer)
と共に37℃で30分間インキュベートする。次いで、
65℃で60分間インキュベートすることによってホス
ファターゼを不活性化する。アクセプタープラスミド10
0ngを、10mM MgCl2,20mMトリス・HCl(p
H7.8),10mM DTT,0.5mM ATP中、15μ
lの反応容積中で、5μlのフラグメントL−DNAと
共に、1μlの反応容積当たり30単位のT4DNAリ
ガーゼ(Biolabs)を用いて、2時間インキュベートす
る。
消化されるpBR322を用いる。2μgのpBR322を20μl
の反応容量中で4単位のCla I(Biolabs)を用いて37℃
で60分間消化される。蛋白質をフェノールで抽出し、
次いでDNAを2容量のエタノールを用いて−80℃で
10分間沈澱させる。DNAを遠心分離によって集め、
次いで20μlの反応容積において37℃で10単位の
EcoR I(Biolabs)を用いて30分間消化する。次いで、
0.1Mトリス・HCl(pH8.7)2容量を溶液に加え、全量
を1単位のアルカリ性ウシホスファターゼ(Boeringer)
と共に37℃で30分間インキュベートする。次いで、
65℃で60分間インキュベートすることによってホス
ファターゼを不活性化する。アクセプタープラスミド10
0ngを、10mM MgCl2,20mMトリス・HCl(p
H7.8),10mM DTT,0.5mM ATP中、15μ
lの反応容積中で、5μlのフラグメントL−DNAと
共に、1μlの反応容積当たり30単位のT4DNAリ
ガーゼ(Biolabs)を用いて、2時間インキュベートす
る。
この溶液5μlを、10mM MgCl2,10mM CaCl2
および10mMトリス・HCl(pH7.5)中塩化カルシウ
ムで処理したE.コリHB101を含む150mlの混合物に加
て全体を200μlとする。この混合物を20分間氷冷
し、42℃で1分間加熱し、20℃で10分間インキュ
ベートする。トリプトン培地〔蒸留水1リットル中に、
10gのバクト−トリプトン(Difco)、1gの酵母エキ
ス(Difco)、1gのグルコース、8gのNaClおよび294m
gのCaCl2・2H2Oを含む〕1mlを加えて、混合物を300
rpmで攪拌しながら37℃で30分間インキュベート
する。混合物を、2個の50μg/mlのアンピシリン
(Sigma)を加えた寒天平板(McConkey Agar、Difco;0.6
ml/平板)に塗布した。これらの平板を37℃で12〜
17時間インキュベートする。
および10mMトリス・HCl(pH7.5)中塩化カルシウ
ムで処理したE.コリHB101を含む150mlの混合物に加
て全体を200μlとする。この混合物を20分間氷冷
し、42℃で1分間加熱し、20℃で10分間インキュ
ベートする。トリプトン培地〔蒸留水1リットル中に、
10gのバクト−トリプトン(Difco)、1gの酵母エキ
ス(Difco)、1gのグルコース、8gのNaClおよび294m
gのCaCl2・2H2Oを含む〕1mlを加えて、混合物を300
rpmで攪拌しながら37℃で30分間インキュベート
する。混合物を、2個の50μg/mlのアンピシリン
(Sigma)を加えた寒天平板(McConkey Agar、Difco;0.6
ml/平板)に塗布した。これらの平板を37℃で12〜
17時間インキュベートする。
10個の異なるコロニーのプラスミドDNAを、次のよ
うにして単離する。
うにして単離する。
上記のコロニーを、25mlの三角フラスコ中50μg
/mlのアンピシリンを補填したトリプトン培地10m
lに接種するのに用いる。培地を37℃、300rpmで1
5〜18時間攪拌する。細胞を遠心分離(Sorval、HS−
4ローター、4℃、4000rpmで10分間)によって回
収する。約0.1gの細胞が得られ、これらを1mlの5
0mMのトリス・HCl(pH8.0)に再分散する。0.25m
lのリゾチーム溶液〔50mMのトリス・HCl(pH8.
0)1ml当たり10mg、リゾチームはSigma社より発
売されている〕を加え、0℃で10分間インキュベート
した後、0.5mM EDTA(pH7.5)0.15mlを加える。0℃
でさらに10分置いた後に、60μlの2%TritonX−1
00(Merck)を加える。0℃で30分後に、試料をSorval
SA−600ローター中で4℃で15,000rpmで30分
間遠心分離する。上澄液を、1容量のフェノール(TN
Eで飽和)で脱蛋白する。4℃で5000rpmで、遠心分
離(Sorval HB−4ローター)することによって、相
を分離する。上相を1容量のクロロホルムで抽出する。
スイ臓RNAアーゼA(Sigma;10mg/1ml T
NE、85℃で10分間前加熱)を加えて最終濃度を2
5μg/mlとして、混合物を37℃で40分間インキ
ュベートする。次いで、溶液を1M NaClおよび10%
ポリエチレングリコール6000(Fluka、オートクレーブ中
で120℃で20分間処理)に調整して、−10℃で2時
間インキュベートする。沈澱をSorval HB−4ロータ
ー(0℃、10,000rpmで20分間)中で集め、100μ
lのTNEに再度溶解する。DNA溶液を1容量のフェ
ノールで抽出し、DNAを2容量のエタノールにより−
80℃で10分間沈澱させる。沈澱をEppendorf遠心分
離機で遠心分離によって集め、DNAを20μlの10
mMトリス・HCl(pH7.5)および0.5mM EDTAに再溶
解する。10mlの培養液から、8〜10μgのプラス
ミドDNAが得られる。
/mlのアンピシリンを補填したトリプトン培地10m
lに接種するのに用いる。培地を37℃、300rpmで1
5〜18時間攪拌する。細胞を遠心分離(Sorval、HS−
4ローター、4℃、4000rpmで10分間)によって回
収する。約0.1gの細胞が得られ、これらを1mlの5
0mMのトリス・HCl(pH8.0)に再分散する。0.25m
lのリゾチーム溶液〔50mMのトリス・HCl(pH8.
0)1ml当たり10mg、リゾチームはSigma社より発
売されている〕を加え、0℃で10分間インキュベート
した後、0.5mM EDTA(pH7.5)0.15mlを加える。0℃
でさらに10分置いた後に、60μlの2%TritonX−1
00(Merck)を加える。0℃で30分後に、試料をSorval
SA−600ローター中で4℃で15,000rpmで30分
間遠心分離する。上澄液を、1容量のフェノール(TN
Eで飽和)で脱蛋白する。4℃で5000rpmで、遠心分
離(Sorval HB−4ローター)することによって、相
を分離する。上相を1容量のクロロホルムで抽出する。
スイ臓RNAアーゼA(Sigma;10mg/1ml T
NE、85℃で10分間前加熱)を加えて最終濃度を2
5μg/mlとして、混合物を37℃で40分間インキ
ュベートする。次いで、溶液を1M NaClおよび10%
ポリエチレングリコール6000(Fluka、オートクレーブ中
で120℃で20分間処理)に調整して、−10℃で2時
間インキュベートする。沈澱をSorval HB−4ロータ
ー(0℃、10,000rpmで20分間)中で集め、100μ
lのTNEに再度溶解する。DNA溶液を1容量のフェ
ノールで抽出し、DNAを2容量のエタノールにより−
80℃で10分間沈澱させる。沈澱をEppendorf遠心分
離機で遠心分離によって集め、DNAを20μlの10
mMトリス・HCl(pH7.5)および0.5mM EDTAに再溶
解する。10mlの培養液から、8〜10μgのプラス
ミドDNAが得られる。
プラスミドDNAは以下の制限酵素を用いる消化の後、
分析する。
分析する。
それぞれの場合に、酵素業者の指示に従い、標準的方法
によってHpal(Billabs)およびHpa I(Biolabs)とEcoR I
(Biolabs)およびCla I(Biolabs)を用いて切断する。D
NAを、40mMトリス・HCl(pH7.8),1mM EDT
Aおよび0.5μg/mlの臭化エチジウム中1%アガロー
ルゲル上で分画する。所望のプラスミドはHpal部位を含
み、3回消化した後、大きなDNAフラグメントの他に
2種類の小さなフラグメントであってpBR322の小さなEc
oR I−Cla Iフラグメントよりも大きなフラグメントを
生じる。これらのプラスミドの一つをp159と命名する
(第3図参照)。
によってHpal(Billabs)およびHpa I(Biolabs)とEcoR I
(Biolabs)およびCla I(Biolabs)を用いて切断する。D
NAを、40mMトリス・HCl(pH7.8),1mM EDT
Aおよび0.5μg/mlの臭化エチジウム中1%アガロー
ルゲル上で分画する。所望のプラスミドはHpal部位を含
み、3回消化した後、大きなDNAフラグメントの他に
2種類の小さなフラグメントであってpBR322の小さなEc
oR I−Cla Iフラグメントよりも大きなフラグメントを
生じる。これらのプラスミドの一つをp159と命名する
(第3図参照)。
B.プラスミドpHRi145の造成 2μgのp159DNAを、10単位のEcoR I(Biolabs)を
用いて37℃で30分間消化する。DNAをフェノール
で抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心分離の後、10
μlの10mMトリス・HCl(pH7.5)および0.5mM
EDTAに溶解する。EcoR Iで消化されたDNAを、更に1
0mMMgCl2,10mM β−メルカプトエタノール,5
0mM NaCl,0.1mM dATP(P&LBilchemicals),
0.1mM dTTP(P&L Bioche-micals)中5単位のD
NAポリメラーゼ(Klenowフラグメント)(Boeringer)
で12℃で15分間処理する。次いで、85℃で5分間
インキュベートしてポリメラーゼを不活性化する。反応
混合物を、20mMトリス・HCl(pH7.8),10mM
のMgCl2,10mMのDTT,0.5mMのATP(Sigma)
で10倍に希釈し、1μlの反応混合物当たり30単位
のT4DNAリガーゼを用いて、15℃で1時間インキ
ュベートする。50ngのDNAを(上記方法で)E.
コリ中に形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを
補填したMcConkey寒天平板上に塗布する。
用いて37℃で30分間消化する。DNAをフェノール
で抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心分離の後、10
μlの10mMトリス・HCl(pH7.5)および0.5mM
EDTAに溶解する。EcoR Iで消化されたDNAを、更に1
0mMMgCl2,10mM β−メルカプトエタノール,5
0mM NaCl,0.1mM dATP(P&LBilchemicals),
0.1mM dTTP(P&L Bioche-micals)中5単位のD
NAポリメラーゼ(Klenowフラグメント)(Boeringer)
で12℃で15分間処理する。次いで、85℃で5分間
インキュベートしてポリメラーゼを不活性化する。反応
混合物を、20mMトリス・HCl(pH7.8),10mM
のMgCl2,10mMのDTT,0.5mMのATP(Sigma)
で10倍に希釈し、1μlの反応混合物当たり30単位
のT4DNAリガーゼを用いて、15℃で1時間インキ
ュベートする。50ngのDNAを(上記方法で)E.
コリ中に形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを
補填したMcConkey寒天平板上に塗布する。
10個の異なるコロニーのプラスミドDNAを上記の方
法で単離する。プラスミドDNAをEcoR Iで消化するこ
とによって分析する。所望のプラスミドはEcoR I耐性で
ある。分析は、上記の方法で行う。所望のプラスミド1
つをHRi145と命名する(第3図参照)。
法で単離する。プラスミドDNAをEcoR Iで消化するこ
とによって分析する。所望のプラスミドはEcoR I耐性で
ある。分析は、上記の方法で行う。所望のプラスミド1
つをHRi145と命名する(第3図参照)。
C.プラスミドpHRi148の造成 2μgのpHRi145−DNAを、5単位のCla I(Boeringe
r)を用いて37℃で60分間処理し、次いでフェノール
抽出によって脱蛋白する。DNAをエタノールで沈澱さ
せた後、20μlの10mMトリス・HCl(pH7.5)お
よび0.5mM EDTAに溶解する。突出した末端を、dATP
およびdTTPの代りにdCTP(P&L Biochemicals)およ
びdGTP(P&L Biochemicals)を用いることを除き、
上記と同様にしてDNAポリメラーゼI(Klenowフラグ
メント)で処理する。85℃で5分間インキュベートす
ることによってポリメラーゼを不活性化する。2容量の
0.1Mトリス・HCl(pH8.7)を反応混合物に加え、0.5
単位のウシホスファターゼ(Boeringer)と共に37℃で
30分間インキュベートする。反応混合物をフェノール
で抽出することによって脱蛋白する。DNAをエタノー
ルで沈澱させ、8μlの10mMトリス・HCl(pH7.
5)および0.5mM EDTAに溶解する。
r)を用いて37℃で60分間処理し、次いでフェノール
抽出によって脱蛋白する。DNAをエタノールで沈澱さ
せた後、20μlの10mMトリス・HCl(pH7.5)お
よび0.5mM EDTAに溶解する。突出した末端を、dATP
およびdTTPの代りにdCTP(P&L Biochemicals)およ
びdGTP(P&L Biochemicals)を用いることを除き、
上記と同様にしてDNAポリメラーゼI(Klenowフラグ
メント)で処理する。85℃で5分間インキュベートす
ることによってポリメラーゼを不活性化する。2容量の
0.1Mトリス・HCl(pH8.7)を反応混合物に加え、0.5
単位のウシホスファターゼ(Boeringer)と共に37℃で
30分間インキュベートする。反応混合物をフェノール
で抽出することによって脱蛋白する。DNAをエタノー
ルで沈澱させ、8μlの10mMトリス・HCl(pH7.
5)および0.5mM EDTAに溶解する。
次の式: 5′−GAATTCCATGGTACCATGGAATTC−3′ を有する化学的に合成したDNAリンカーを、0.1mM
rATP(Sigma)、50mMトリス・HCl(pH9.5)、10
mM MgCl2、5mM DTTおよび2単位のT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(P&L Biochemicals)を含む
反応容積8μl中で、8pモルのリンカーを5μCi
〔γ−32P−ATP(5500Ci・mM-1、Amersham〕と
共に37℃で30分間インキュベートすることによって
5′−末端をリン酸化する。−80℃で凍結することに
よって反応を停止させる。
rATP(Sigma)、50mMトリス・HCl(pH9.5)、10
mM MgCl2、5mM DTTおよび2単位のT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(P&L Biochemicals)を含む
反応容積8μl中で、8pモルのリンカーを5μCi
〔γ−32P−ATP(5500Ci・mM-1、Amersham〕と
共に37℃で30分間インキュベートすることによって
5′−末端をリン酸化する。−80℃で凍結することに
よって反応を停止させる。
放射能標識したリンカーを次に1μgのCla Iおよびホ
スファターゼで処理し、そして0.5mM rATP(Sigma)、
10mM DTT(Calbiochem)、20mMトリス・HC
l(pH7.8)、1mM MgCl2および800単位のT4DNA
リガーゼ(Biolabs)を含む20μlの反応容積中でpHRi1
45−DNA(上記を参照されたい)と連結する。インキ
ュベーションを15℃で2時間行う。85℃で10分間
インキュベートすることによってリガーゼを不活性化す
る。次に、2容量の水を加え、塩化ナトリウム濃度を1
0mMに調整し、20単位のKpn I(Biolabs)を37℃で
30分間にわたって加える。フェノールおよびクロロホ
ルムで抽出した後、混合物を、40mMトリス・酢酸(p
H7.8),1mM EDTAおよび0.5μg/mlの臭化エチジ
ウム中0.9%の低融点アガロースゲル(Biorad)を通して
分画する。紫外線照射によって目視出来且つ同じ大きさ
のマーカーDNAと同じ移動度を示すバンドを小刀で切
り取る。ゲルの部分を65℃で5分間溶融した後、37
℃に冷却する。約20μlの容量が得られる。この溶液
5μlを採取して、0.5mM ATP,10mM DT
T,10mM MgCl2,20mMトリス・HCl(pH7.8)
に調整しておいた10μlの反応容積中400単位のT4
リガーゼ(Biolabs)と共に15℃で12時間インキュベ
ートする。100mMトリス・HCl(pH7.8),100mM C
aCl2および100mM MgCl2から成る溶液1/10容量
を、リガーゼ混合物(15℃で固化)に加え、全量を6
5℃で5分間インキュベートする。次に、この溶液を、
上記と同様にして、カルシウム処理したE.コリHB101
細胞を形質転換するのに用いる。50μg/mlのアン
ピシリンを加えたMcConkey寒天平板上に塗布する。
スファターゼで処理し、そして0.5mM rATP(Sigma)、
10mM DTT(Calbiochem)、20mMトリス・HC
l(pH7.8)、1mM MgCl2および800単位のT4DNA
リガーゼ(Biolabs)を含む20μlの反応容積中でpHRi1
45−DNA(上記を参照されたい)と連結する。インキ
ュベーションを15℃で2時間行う。85℃で10分間
インキュベートすることによってリガーゼを不活性化す
る。次に、2容量の水を加え、塩化ナトリウム濃度を1
0mMに調整し、20単位のKpn I(Biolabs)を37℃で
30分間にわたって加える。フェノールおよびクロロホ
ルムで抽出した後、混合物を、40mMトリス・酢酸(p
H7.8),1mM EDTAおよび0.5μg/mlの臭化エチジ
ウム中0.9%の低融点アガロースゲル(Biorad)を通して
分画する。紫外線照射によって目視出来且つ同じ大きさ
のマーカーDNAと同じ移動度を示すバンドを小刀で切
り取る。ゲルの部分を65℃で5分間溶融した後、37
℃に冷却する。約20μlの容量が得られる。この溶液
5μlを採取して、0.5mM ATP,10mM DT
T,10mM MgCl2,20mMトリス・HCl(pH7.8)
に調整しておいた10μlの反応容積中400単位のT4
リガーゼ(Biolabs)と共に15℃で12時間インキュベ
ートする。100mMトリス・HCl(pH7.8),100mM C
aCl2および100mM MgCl2から成る溶液1/10容量
を、リガーゼ混合物(15℃で固化)に加え、全量を6
5℃で5分間インキュベートする。次に、この溶液を、
上記と同様にして、カルシウム処理したE.コリHB101
細胞を形質転換するのに用いる。50μg/mlのアン
ピシリンを加えたMcConkey寒天平板上に塗布する。
10個の異なるプラスミドDNAが上記と同様に単離さ
れ、このDNAを次の制限酵素分析に付する。すなわ
ち、それぞれの場合に、0.5μgのプラスミドDNA
を、酵素製造業者の指示にしたがってKpn I(Biolabs)、
Nco I(Biolabs)およびEcoR I(Biolabs)を用いて次々と
切断する。開裂生成物を、40mMトリス・酢酸(pH7.
8)、1mM EDTA、0.5μg/mlの臭化エチジウム中
1%アガロースゲル上で分画する。総てのプラスミド
は、それぞれ所望なようにこれらの酵素切断部位の1つ
を示す。1つをHRi148と命名する。
れ、このDNAを次の制限酵素分析に付する。すなわ
ち、それぞれの場合に、0.5μgのプラスミドDNA
を、酵素製造業者の指示にしたがってKpn I(Biolabs)、
Nco I(Biolabs)およびEcoR I(Biolabs)を用いて次々と
切断する。開裂生成物を、40mMトリス・酢酸(pH7.
8)、1mM EDTA、0.5μg/mlの臭化エチジウム中
1%アガロースゲル上で分画する。総てのプラスミド
は、それぞれ所望なようにこれらの酵素切断部位の1つ
を示す。1つをHRi148と命名する。
このプラスミドHRi148は、トリプトファンプロモーター
−オペレーターおびATG(これも含む)までのリボゾ
ーム結合部位を含む。ヒルジンおよびその他の異種遺伝
子も、このプラスミド中に1個存在するEcoR I、Nco
I、Kpn I部位を介して直接にカップリングすることがで
きる。また、この構造は、対応する遺伝子上に存在なけ
ればならない翻訳の開始に必要なATGを伴わない異種
遺伝子の直接のカップリングおよび発現を行うことが可
能である。これは、上記のように、Nco Iで切断しそし
てDNAポリメラーゼで突出する末端を修復することに
より、またはKpn Iで切断してヌクレアーゼS1によっ
て突出末端を除去することにより容易に達成することが
できる。したがって、プラスミドHRi148は、広い用途を
有する発現プラスミドである。
−オペレーターおびATG(これも含む)までのリボゾ
ーム結合部位を含む。ヒルジンおよびその他の異種遺伝
子も、このプラスミド中に1個存在するEcoR I、Nco
I、Kpn I部位を介して直接にカップリングすることがで
きる。また、この構造は、対応する遺伝子上に存在なけ
ればならない翻訳の開始に必要なATGを伴わない異種
遺伝子の直接のカップリングおよび発現を行うことが可
能である。これは、上記のように、Nco Iで切断しそし
てDNAポリメラーゼで突出する末端を修復することに
より、またはKpn Iで切断してヌクレアーゼS1によっ
て突出末端を除去することにより容易に達成することが
できる。したがって、プラスミドHRi148は、広い用途を
有する発現プラスミドである。
D.線状化ベクターpHRi148/EcoR I/BamH Iの製造 5μgのpHRi148のプラスミドDNAを、制限エンドヌ
クレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化する。切り取られ
たベクターpHRi148/EcoR I/BamH Iを、密度勾配遠心
分離によって単離する。
クレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化する。切り取られ
たベクターpHRi148/EcoR I/BamH Iを、密度勾配遠心
分離によって単離する。
(b)F1−DNA/EcoR I/EcoR IIおよびF2−D
NA/BamH I/EcoR IIの製造 I.F1−DNA/EcoR I/EcoR IIの製造 5μgのpML300のプラスミドDNAを、最初に100mM
トリス・HCl(pH7.5),50mM NaClおよび100μg
/mlのゼラチンの溶液50μl中で、10単位のEcoR
I制限エンドヌクレアーゼを用いて、37℃で1時間消
化する。この線状化したプラスミドDNA/EcoR Iの一
部(0.5μg)をアガロースゲル(実施例10a参照)か
らゲル溶出によって単離し、そして〔γ−32P〕ATP
放射能標識する(実施例12参照)。次に、主要量のプ
ラスミドDNA/EcoR Iをこの放射能標識したDNAと
混合して、EcoR II制御エンドヌクレアーゼを用いて消
化し、EcoR II−EcoR I*DNAフラグメント(109塩基
対)を8%ポリアクリルアミド上でゲル電気泳動によっ
て分離する。200μgのF1−DNA/EcoR I*/Ec
oR IIを、ゲル溶出によって単離する。
NA/BamH I/EcoR IIの製造 I.F1−DNA/EcoR I/EcoR IIの製造 5μgのpML300のプラスミドDNAを、最初に100mM
トリス・HCl(pH7.5),50mM NaClおよび100μg
/mlのゼラチンの溶液50μl中で、10単位のEcoR
I制限エンドヌクレアーゼを用いて、37℃で1時間消
化する。この線状化したプラスミドDNA/EcoR Iの一
部(0.5μg)をアガロースゲル(実施例10a参照)か
らゲル溶出によって単離し、そして〔γ−32P〕ATP
放射能標識する(実施例12参照)。次に、主要量のプ
ラスミドDNA/EcoR Iをこの放射能標識したDNAと
混合して、EcoR II制御エンドヌクレアーゼを用いて消
化し、EcoR II−EcoR I*DNAフラグメント(109塩基
対)を8%ポリアクリルアミド上でゲル電気泳動によっ
て分離する。200μgのF1−DNA/EcoR I*/Ec
oR IIを、ゲル溶出によって単離する。
II.F2−DNA/BamH I/EcoR IIの製造 5μgのpML305のプラスミドDNAを、BamH I制限エン
ドヌクレアーゼ10単位を用いて切断する。この線状化
したプラスミドDNA/BamH Iをアガロースゲル(実施
例10a参照)からゲル溶出することによって単離し、
〔γ−32P〕(実施例12参照)を用いて放射能標識す
る。次に、主要量のプラスミドDNA/BamH Iをこの放
射能標識したDNAと混合し、EcoR II制限エンドヌク
レアーゼで消化し、EcoR II−BamH I*DNAフラグメ
ント(122塩基対)を8%ポリアクリルアミド上でゲル
電気泳動によって分離する。250μgのF2−DNA/B
amH I*/EcoR IIが単離される。
ドヌクレアーゼ10単位を用いて切断する。この線状化
したプラスミドDNA/BamH Iをアガロースゲル(実施
例10a参照)からゲル溶出することによって単離し、
〔γ−32P〕(実施例12参照)を用いて放射能標識す
る。次に、主要量のプラスミドDNA/BamH Iをこの放
射能標識したDNAと混合し、EcoR II制限エンドヌク
レアーゼで消化し、EcoR II−BamH I*DNAフラグメ
ント(122塩基対)を8%ポリアクリルアミド上でゲル
電気泳動によって分離する。250μgのF2−DNA/B
amH I*/EcoR IIが単離される。
(c)F1−DNAとF2−DNAとの連結および発現
プラスミドpML310の造成 実施例10cに既に記載の方法で、10ng(=473nモ
ルの末端)のF1−DNA/EcoR I/EcoR IIおよび9
ng(=495nモルの末端)のF2−DNA/BamH I/E
coR IIを、20μlの容量中でT4DNAリガーゼで処
理する。次に、この混合物をフェノール/クロロホルム
で抽出し、そしてDNAをアルコールで沈澱させる。次
いで、このDNA沈澱を実施例10cに記載のように溶解
させ、EcoR IおよびBamH I制限エンドヌクレアーゼで消
化させる。次いで、この溶液をTNEで標準化して、3
0ng(=50nモルの末端)のベクターDNA pHRi
148/EcoR I/BamH I(実施例13aD参照)を加える。
次に、この溶液をフェノール/クロロホルムで再度抽出
し、そしてDNAをアルコールで沈澱させる。沈澱した
DNA混合物を実施例10cに記載の方法でT4DNAリ
ガーゼ(Biolabs)で処理する。この方法で、インサート
としてF1−F2−DNA(デスルファトヒルジン遺伝
子)を含む組み替えプラスミドが溶液中に生成する。
プラスミドpML310の造成 実施例10cに既に記載の方法で、10ng(=473nモ
ルの末端)のF1−DNA/EcoR I/EcoR IIおよび9
ng(=495nモルの末端)のF2−DNA/BamH I/E
coR IIを、20μlの容量中でT4DNAリガーゼで処
理する。次に、この混合物をフェノール/クロロホルム
で抽出し、そしてDNAをアルコールで沈澱させる。次
いで、このDNA沈澱を実施例10cに記載のように溶解
させ、EcoR IおよびBamH I制限エンドヌクレアーゼで消
化させる。次いで、この溶液をTNEで標準化して、3
0ng(=50nモルの末端)のベクターDNA pHRi
148/EcoR I/BamH I(実施例13aD参照)を加える。
次に、この溶液をフェノール/クロロホルムで再度抽出
し、そしてDNAをアルコールで沈澱させる。沈澱した
DNA混合物を実施例10cに記載の方法でT4DNAリ
ガーゼ(Biolabs)で処理する。この方法で、インサート
としてF1−F2−DNA(デスルファトヒルジン遺伝
子)を含む組み替えプラスミドが溶液中に生成する。
(d)プラスミドpML310によるE.コリHB101の形質転
換 カルシウムで処理したE.コリHB101細胞の形質転換
を、実施例10dに記載の方法で行う。実施例13cで得ら
れた反応混合物10μlを用いる。420個のアンピシリ
ン耐性のコロニーが得られる。
換 カルシウムで処理したE.コリHB101細胞の形質転換
を、実施例10dに記載の方法で行う。実施例13cで得ら
れた反応混合物10μlを用いる。420個のアンピシリ
ン耐性のコロニーが得られる。
(e)F1−F2−DNAを含むコロニーのスクリーニ
ング 18個の形質転換されたコロニー(実施例13d)を実施
例10eに記載の方法でF1−F2−DNA含有について
検討する。実施例5および6において記載したオリゴデ
オキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとして用
いる。オートラジオグムにおいて、12個のコロニーが
得られ、そのうちの5個をpML310、pML311、pML312、pM
L313およびpML314と命名する。
ング 18個の形質転換されたコロニー(実施例13d)を実施
例10eに記載の方法でF1−F2−DNA含有について
検討する。実施例5および6において記載したオリゴデ
オキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとして用
いる。オートラジオグムにおいて、12個のコロニーが
得られ、そのうちの5個をpML310、pML311、pML312、pM
L313およびpML314と命名する。
実施例14.クローンpML310の特性決定 Maxam及びGilbert(上記)にしたがってF1−F2−D
NAを配列決定することによって、実施例12に記載の
方法で組換プラスミドpML310に於けるF1−F2−DN
A配列の特性決定を行う。10μgのF1−F2−DN
Aを検討する。F1−F2−DNAのヌクレオチドの配
列は、合成デスルファトヒルジン遺伝子について記載さ
れた配列と同一である。
NAを配列決定することによって、実施例12に記載の
方法で組換プラスミドpML310に於けるF1−F2−DN
A配列の特性決定を行う。10μgのF1−F2−DN
Aを検討する。F1−F2−DNAのヌクレオチドの配
列は、合成デスルファトヒルジン遺伝子について記載さ
れた配列と同一である。
実施例15.酵母におけるデスルファトヒルジンHV1の
発現 ヒルジンについて化学的に合成された遺伝子を、プラス
ミドpML310に於ける206bpEcoR I−BamH Iインサートと
して増幅する。この遺伝子をプラスミドから切除して、
制御可能なPH05プロモータの制御下に酵母において発現
せしめる。この造成物は、欧州特許出願第143,081号明
細書に記載のように、541bpPH05プロモータ配列および
完全なPH05シグナル配列(17個のアミノ酸をコードす
る51個のヌクレオチド)を含有する。この配列は、天
然の成熟ヒルジンのNH2−末端アミノ酸としてのバリン
のコドンから始まるヒルジンの成熟コード配列にインフ
レーム融合している。ヒルジン遺伝子は、その3′−末
端にPH05転写停止シグナルを提供するDNAフラグメン
トを有する。この発現プラスミドのベクター部分は酵母
2μ配列、酵母における選択用酵母LEU2遺伝子および
E.コリにおける選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝
子およびE.コリの複製開始点を含む。方法は、第5、
6および7図に示す。
発現 ヒルジンについて化学的に合成された遺伝子を、プラス
ミドpML310に於ける206bpEcoR I−BamH Iインサートと
して増幅する。この遺伝子をプラスミドから切除して、
制御可能なPH05プロモータの制御下に酵母において発現
せしめる。この造成物は、欧州特許出願第143,081号明
細書に記載のように、541bpPH05プロモータ配列および
完全なPH05シグナル配列(17個のアミノ酸をコードす
る51個のヌクレオチド)を含有する。この配列は、天
然の成熟ヒルジンのNH2−末端アミノ酸としてのバリン
のコドンから始まるヒルジンの成熟コード配列にインフ
レーム融合している。ヒルジン遺伝子は、その3′−末
端にPH05転写停止シグナルを提供するDNAフラグメン
トを有する。この発現プラスミドのベクター部分は酵母
2μ配列、酵母における選択用酵母LEU2遺伝子および
E.コリにおける選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝
子およびE.コリの複製開始点を含む。方法は、第5、
6および7図に示す。
デスルファトヒルジン遺伝子の5′末端のヌクレオチド
配列の調整 デスルファトヒルジンをコードするヌクレオチド配列
は、最終の遺伝子生成物においては、NH2−末端バリン
のためのGTTから始まる。E.コリにおけるサブクロ
ーン化および発現を好都合にするため、コード配列は
5′末端においてEcoR I制限部位およびATG開始コド
ンを含む8個のヌクレオチドにより延長されている。ヒ
ルジンコード配列をPH05シグナルペプチドをコードする
配列に正確にインフレーム融合させるためには、これら
の追加のヌクレオチドを除去しなければならない。これ
は、EcoR I制限部位を平滑末端部位に変換し、Hga Iに
よるその後の切断がGTTコドンの直ぐ上流に起こるよ
うな位置にHga I認識部位を含有する合成オリゴヌクレ
オチドを付加することによって達成される。
配列の調整 デスルファトヒルジンをコードするヌクレオチド配列
は、最終の遺伝子生成物においては、NH2−末端バリン
のためのGTTから始まる。E.コリにおけるサブクロ
ーン化および発現を好都合にするため、コード配列は
5′末端においてEcoR I制限部位およびATG開始コド
ンを含む8個のヌクレオチドにより延長されている。ヒ
ルジンコード配列をPH05シグナルペプチドをコードする
配列に正確にインフレーム融合させるためには、これら
の追加のヌクレオチドを除去しなければならない。これ
は、EcoR I制限部位を平滑末端部位に変換し、Hga Iに
よるその後の切断がGTTコドンの直ぐ上流に起こるよ
うな位置にHga I認識部位を含有する合成オリゴヌクレ
オチドを付加することによって達成される。
デスルファトヒルジン遺伝子の前のHga I認識部位の導
入(第5図参照) 8μgのプラスミドpML310(実施例13c参照)を、制限
エンドヌクレアーゼEcoR Iで完全に消化する。DNA
(pML310/EcoR I)をフェノール/クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱させる。ヌクレアーゼS1によっ
て、5′突出末端を除去する。4μgのpML310/EcoR I
DNAを、100μlの250mM NaCl,1mM ZnSO4,
30mM酢酸ナトリウム(pH4.6)および20単位/ml
のヌクレオチドS1(Sigma)中で、37℃で45分間消
化する。
入(第5図参照) 8μgのプラスミドpML310(実施例13c参照)を、制限
エンドヌクレアーゼEcoR Iで完全に消化する。DNA
(pML310/EcoR I)をフェノール/クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱させる。ヌクレアーゼS1によっ
て、5′突出末端を除去する。4μgのpML310/EcoR I
DNAを、100μlの250mM NaCl,1mM ZnSO4,
30mM酢酸ナトリウム(pH4.6)および20単位/ml
のヌクレオチドS1(Sigma)中で、37℃で45分間消
化する。
DNAをフェノール/クロロホルムで抽出して、エタノ
ールを用いて沈澱させる。DNA(pML310/EcoR I/S
1)を100μlの50mMトリス・HCl(pH8.0)に再分
散させ、2単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CIA
P、Boeringer)と共に37℃で1時間インキュベートす
る。酵素を、65℃で1.5時間インキュベートして不活
性化する。
ールを用いて沈澱させる。DNA(pML310/EcoR I/S
1)を100μlの50mMトリス・HCl(pH8.0)に再分
散させ、2単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CIA
P、Boeringer)と共に37℃で1時間インキュベートす
る。酵素を、65℃で1.5時間インキュベートして不活
性化する。
培養混合物中のNaCl濃度を150mMに調整する。デスル
ファトヒルジンDNA(pML310/EcoR I/S1/CIAP)
を、低塩緩衝液〔150mM NaCl,10mMトリス・H
Cl(pH8.0),1mM EDTA〕中でDE52(Whatman)イオン
交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝溶液〔1.
5M NaCl,10mMトリス・HCl(pH8.0),1mM
EDTA〕を用いて溶出させる。DNAをエタノールで沈澱
させ、水に再分散させて0.8mg/mlの濃度にする。
ファトヒルジンDNA(pML310/EcoR I/S1/CIAP)
を、低塩緩衝液〔150mM NaCl,10mMトリス・H
Cl(pH8.0),1mM EDTA〕中でDE52(Whatman)イオン
交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝溶液〔1.
5M NaCl,10mMトリス・HCl(pH8.0),1mM
EDTA〕を用いて溶出させる。DNAをエタノールで沈澱
させ、水に再分散させて0.8mg/mlの濃度にする。
次の式: 5′−AGCGTCGACGCT−3′ を有するオリゴヌクレオチドを、ホスホトリエステル法
[板倉ら、J.Am.Chem.Soc.、第103巻、706頁(1981
年)]によって合成する。オリゴヌクレオチドの配列は
制限エンドヌクレアーゼHga Iの認識部位−GACGC−を有
する自己相補性である。2本の単鎖をアニーリングする
ことにより、12個の塩基対を有する2本鎖DNAリン
カーになる。
[板倉ら、J.Am.Chem.Soc.、第103巻、706頁(1981
年)]によって合成する。オリゴヌクレオチドの配列は
制限エンドヌクレアーゼHga Iの認識部位−GACGC−を有
する自己相補性である。2本の単鎖をアニーリングする
ことにより、12個の塩基対を有する2本鎖DNAリン
カーになる。
1.2μgの合成の単鎖オリゴデオキシヌクレチオドを、
10μlの60mMトリス・HCl(pH7.5),10mM
MgCl2,5mM DTT,30μCiの[γ−32p]AT
P(3000Ci・mM-1、Amersham)および6単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中で37℃で30
分間、次いで0.5mM ATPの存在下で37℃で15
分間リン酸化する。混合者を75℃で10分間更にイン
キュベートして酵素を不活性化して、次いで室温に冷却
してアニーリングする。0.6μg(170pモル)の32pで
標識したリンカーDNAを2.4μg(1.75pモル末端)
のpML310/EcoR I/S1/CIAPと混合し、20μlの6
0mMトリス・HCl(pH7.5),10mMのMgCl2,5m
M DTT,3.5mM ATP,800単位のT4DNAリ
ガーゼ(Biolabs)中で15℃で20時間連結する。リガ
ーゼを85℃で10分間で不活性化し、過剰のリンカー
分子を10mM EDTA(pH7.5),300mM酢酸ナトリウム
(pH6.0)および0.54容のイソプロパノールの存在でDN
Aを沈澱させることによって除去する。室温で30分後
にDNAをペレットにして、45μlの連結混合物(上
述)に再分散し、15℃で6時間連結させて、環状のD
NAを形成させる。
10μlの60mMトリス・HCl(pH7.5),10mM
MgCl2,5mM DTT,30μCiの[γ−32p]AT
P(3000Ci・mM-1、Amersham)および6単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中で37℃で30
分間、次いで0.5mM ATPの存在下で37℃で15
分間リン酸化する。混合者を75℃で10分間更にイン
キュベートして酵素を不活性化して、次いで室温に冷却
してアニーリングする。0.6μg(170pモル)の32pで
標識したリンカーDNAを2.4μg(1.75pモル末端)
のpML310/EcoR I/S1/CIAPと混合し、20μlの6
0mMトリス・HCl(pH7.5),10mMのMgCl2,5m
M DTT,3.5mM ATP,800単位のT4DNAリ
ガーゼ(Biolabs)中で15℃で20時間連結する。リガ
ーゼを85℃で10分間で不活性化し、過剰のリンカー
分子を10mM EDTA(pH7.5),300mM酢酸ナトリウム
(pH6.0)および0.54容のイソプロパノールの存在でDN
Aを沈澱させることによって除去する。室温で30分後
にDNAをペレットにして、45μlの連結混合物(上
述)に再分散し、15℃で6時間連結させて、環状のD
NAを形成させる。
1μlおよび3μlの連結混合物を、100μlのカルシ
ウム処理した形質転換コンピテントE.コリHB101細胞
[D.Hanahanの方法(J.Biol.Chem.、第166巻、557頁、1
983年)によって調製]に加える。細胞を氷上で30分
間放置し、次いで42℃で3分間インキュベートし、氷
上で2分間冷却した後、400μlのSOC培地中で37
℃で1時間インキュベートする。細胞をそれぞれ100μ
lに濃縮し、50μg/mlのアンピシリンを有するL
B寒天平板に塗布する。
ウム処理した形質転換コンピテントE.コリHB101細胞
[D.Hanahanの方法(J.Biol.Chem.、第166巻、557頁、1
983年)によって調製]に加える。細胞を氷上で30分
間放置し、次いで42℃で3分間インキュベートし、氷
上で2分間冷却した後、400μlのSOC培地中で37
℃で1時間インキュベートする。細胞をそれぞれ100μ
lに濃縮し、50μg/mlのアンピシリンを有するL
B寒天平板に塗布する。
12個の形質転換したampRコロニーを、それぞれ100μ
g/mlのアンピシリンを含むLB培地で増殖させる。
プラスミドDNAをD.S.Holmesらの方法[Anal.Bioche
m.、第114巻、193頁、1981年]にしたがって調製する。
合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は、プライマー
としてヒルジンのコード鎖にハイブリダイズする単鎖D
NAフラグメントを用いるDNA配列決定によって確か
められる。ヒルジン遺伝子の前の正確な位置にリンカー
DNAを含有するクローンを、pML310Lと称する。
g/mlのアンピシリンを含むLB培地で増殖させる。
プラスミドDNAをD.S.Holmesらの方法[Anal.Bioche
m.、第114巻、193頁、1981年]にしたがって調製する。
合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は、プライマー
としてヒルジンのコード鎖にハイブリダイズする単鎖D
NAフラグメントを用いるDNA配列決定によって確か
められる。ヒルジン遺伝子の前の正確な位置にリンカー
DNAを含有するクローンを、pML310Lと称する。
実施例16.PH05シグナル配列とデスルファトヒルジン
構造遺伝子の融合 (a)0.2kbデスルファトヒルジンフラグメントの単
離(第5図) 12μgのプラスミドpML310Lを、制限エンドヌクレア
ーゼBamH Iを用いて完全に消化する。DNAをフェノー
ル/クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈澱さ
せた後、2つの制限フラグメントをトリス−ホウ酸−ED
TA緩衝液(pH8.3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。
臭化エチジウム染色した0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメ
ントをゲルスライス中で単離する。DNAを3mlの0.
2×TBE緩衝液を満たした透析ベッドで電気溶出する。閉
じたバッグをTBE緩衝液(pH8.3)(90mMトリス−
塩基、90mMホウ酸、2.5mMのEDTA)中に浸漬す
る。100mAで30分間電流を通じた後、電流の極性を
45秒間反転させ、DNAを透析膜から剥離させる。透
析バッグのゲルスライスを取り巻く緩衝液を回収して、
150mM NaClに調整し、DE52(Whatman)イオン交換カラ
ムを通過させる。DNAを高塩緩衝液[1.5M NaCl,
10mMトリス・HCl(pH8.0),1mM EDTA)を用
いて溶出させ、エタノールで沈澱させ、水に再溶解させ
て0.1mg/mlの濃度にする。
構造遺伝子の融合 (a)0.2kbデスルファトヒルジンフラグメントの単
離(第5図) 12μgのプラスミドpML310Lを、制限エンドヌクレア
ーゼBamH Iを用いて完全に消化する。DNAをフェノー
ル/クロロホルムを用いて抽出し、エタノールで沈澱さ
せた後、2つの制限フラグメントをトリス−ホウ酸−ED
TA緩衝液(pH8.3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。
臭化エチジウム染色した0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメ
ントをゲルスライス中で単離する。DNAを3mlの0.
2×TBE緩衝液を満たした透析ベッドで電気溶出する。閉
じたバッグをTBE緩衝液(pH8.3)(90mMトリス−
塩基、90mMホウ酸、2.5mMのEDTA)中に浸漬す
る。100mAで30分間電流を通じた後、電流の極性を
45秒間反転させ、DNAを透析膜から剥離させる。透
析バッグのゲルスライスを取り巻く緩衝液を回収して、
150mM NaClに調整し、DE52(Whatman)イオン交換カラ
ムを通過させる。DNAを高塩緩衝液[1.5M NaCl,
10mMトリス・HCl(pH8.0),1mM EDTA)を用
いて溶出させ、エタノールで沈澱させ、水に再溶解させ
て0.1mg/mlの濃度にする。
pML310Lの0.84kb Pvu I−BamH Iフラグメントを、制限
エンドヌクレアーゼHga Iで更に消化する。この消化に
より、成熟デスルファトヒルジンの完全なコード配列を
含有する198kb Hga I−BamH Iフラグメントが生じる。
次のAlu Iによる消化では、198bp Hga I−BamH Iフラグ
メントには触れないが、同様な大きさのその他のHga I
フラグメントを除去する。
エンドヌクレアーゼHga Iで更に消化する。この消化に
より、成熟デスルファトヒルジンの完全なコード配列を
含有する198kb Hga I−BamH Iフラグメントが生じる。
次のAlu Iによる消化では、198bp Hga I−BamH Iフラグ
メントには触れないが、同様な大きさのその他のHga I
フラグメントを除去する。
0.2kb Hga I−BamH IフラグメントはTBE緩衝液中1.5
%アガロースゲル上で他のフグメントから分離され、
(上記のように)電気溶出によって単離される。DNA
はDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール沈
澱によって精製される。DNAを水に再分散して、30
μg/ml(0.2pモル/μl)の濃度にする。
%アガロースゲル上で他のフグメントから分離され、
(上記のように)電気溶出によって単離される。DNA
はDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール沈
澱によって精製される。DNAを水に再分散して、30
μg/ml(0.2pモル/μl)の濃度にする。
(b)PH05シグナル配列の一部分を有するPH05プロモー
ター領域の単離 プラスミドp31/PH05−TPA18(欧州特許出願第143,081
号明細書参照)は、PH05プロモーターおよび外来構造遺
伝子(t−PA)にインフレーム融合したPH05シグナル
配列を有する。584bp BamH I−Bal IフラグメントはPH0
5、および3′末端の8個のヌクレオチドを除くPH05シ
グナル配列の総てを含有する。
ター領域の単離 プラスミドp31/PH05−TPA18(欧州特許出願第143,081
号明細書参照)は、PH05プロモーターおよび外来構造遺
伝子(t−PA)にインフレーム融合したPH05シグナル
配列を有する。584bp BamH I−Bal IフラグメントはPH0
5、および3′末端の8個のヌクレオチドを除くPH05シ
グナル配列の総てを含有する。
8μgのp31/PH05−TPA18DNAを制限エンドヌクレア
ーゼBal Iで消化する(37℃で16時間)。DNAを
フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈澱に
よって精製する。
ーゼBal Iで消化する(37℃で16時間)。DNAを
フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈澱に
よって精製する。
DNAを水に再分散させ、0.7mg/mlの濃度にす
る。PH05 シグナル配列とデスルファトヒルジンをコード領域
との間の正確な連結は、次の式: (1)5′−CCAATGCA−3′ (2)3′−GGTTACGTCAACA−5′ の合成リンカーによって行われる。
る。PH05 シグナル配列とデスルファトヒルジンをコード領域
との間の正確な連結は、次の式: (1)5′−CCAATGCA−3′ (2)3′−GGTTACGTCAACA−5′ の合成リンカーによって行われる。
リンカー(5′−CCAATGCA)の5′末端の8個のヌクレ
オチドはBal I部位からプロセシング部位へのPH05シグ
ナル配列の一部分を表す。オリゴヌクレオチド(2)の
5′一の突出している5個のヌクレオチドは、デスルフ
ァトヒルジンコード配列の5′末端のHga I切断部位に
対合する。
オチドはBal I部位からプロセシング部位へのPH05シグ
ナル配列の一部分を表す。オリゴヌクレオチド(2)の
5′一の突出している5個のヌクレオチドは、デスルフ
ァトヒルジンコード配列の5′末端のHga I切断部位に
対合する。
個々の単鎖オリゴヌクレオチド(1)および(2)は、
ホスホトリエステル法(板倉ら、上記)によって合成さ
れる。オリゴヌクレオチド(1)および(2)のそれぞ
れ1.1μgおよび1.8μgを、実施例15に記載のように
それらの5′未満でリン酸化し、等量を混合して、そし
てアニーリングする。
ホスホトリエステル法(板倉ら、上記)によって合成さ
れる。オリゴヌクレオチド(1)および(2)のそれぞ
れ1.1μgおよび1.8μgを、実施例15に記載のように
それらの5′未満でリン酸化し、等量を混合して、そし
てアニーリングする。
1.3μg(200pモル)のリン酸化した2本鎖リンカーD
NAを、40μlの60mMトリス・HCl(pH7.5)1
0mM MgCl2,3.5mM ATP,5mM DTTおよ
び1400単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で7μg
(1.8pM)のBal I開裂p31/PH05−TPA18に、15℃で
16時間で連結する。リガーゼを、85℃で10分間不
活性化する。過剰のリンカーを、10mMEDTA,300m
M酢酸ナトリウム(pH6.0)および0.54容のイソプロパノ
ールの存在でDNAを沈澱させることによって除去す
る。DNAを再分散して、制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで更に消化する。DNAをフェノール/クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱させた後、2個の制限フラグ
メントをトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2%ア
ガロースゲル上に分離させる。DNAを電気溶出させ、
DE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール沈澱
によって更に精製する。0.6kbのBamH I−Hga 9DNAフ
ラグメントを水に再分散し、40μg/mlの濃度にす
る。
NAを、40μlの60mMトリス・HCl(pH7.5)1
0mM MgCl2,3.5mM ATP,5mM DTTおよ
び1400単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で7μg
(1.8pM)のBal I開裂p31/PH05−TPA18に、15℃で
16時間で連結する。リガーゼを、85℃で10分間不
活性化する。過剰のリンカーを、10mMEDTA,300m
M酢酸ナトリウム(pH6.0)および0.54容のイソプロパノ
ールの存在でDNAを沈澱させることによって除去す
る。DNAを再分散して、制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで更に消化する。DNAをフェノール/クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱させた後、2個の制限フラグ
メントをトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2%ア
ガロースゲル上に分離させる。DNAを電気溶出させ、
DE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール沈澱
によって更に精製する。0.6kbのBamH I−Hga 9DNAフ
ラグメントを水に再分散し、40μg/mlの濃度にす
る。
(c)pJDB207酵母ベクターフラグメントの単離(第6
図) 9μgのプラスミドpJDB207R/PH05−TRA(12−2)
DNA(欧州特許出願第143,081号明細書参照)を、制
限エンドヌクレアーゼBamH Iで消化する。完全に消化し
終わった後、DNAをフェノール/クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱せしめる。DNAを50mMのト
リス・HCl(pH8.0)に再分散し、そして0.1mg/ml
の濃度にして、7単位のウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼで37℃で1時間消化する。ホスファターゼを63℃
にて1.5時間で不活性化して、DNAをDE52イオン交換
クロマトグラフィ(実施例13参照)およびエタノール
沈澱によって精製する。6.8kbの大きなBamH Iフラグメ
ントを、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2%ア
ガロースゲル上で分離する。DNAを、電気溶出し、そ
してDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール
沈澱によって精製する。DNAを水に溶解し、そして0.
4mg/ml(0.1pM/μl)の濃度にする。
図) 9μgのプラスミドpJDB207R/PH05−TRA(12−2)
DNA(欧州特許出願第143,081号明細書参照)を、制
限エンドヌクレアーゼBamH Iで消化する。完全に消化し
終わった後、DNAをフェノール/クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱せしめる。DNAを50mMのト
リス・HCl(pH8.0)に再分散し、そして0.1mg/ml
の濃度にして、7単位のウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼで37℃で1時間消化する。ホスファターゼを63℃
にて1.5時間で不活性化して、DNAをDE52イオン交換
クロマトグラフィ(実施例13参照)およびエタノール
沈澱によって精製する。6.8kbの大きなBamH Iフラグメ
ントを、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2%ア
ガロースゲル上で分離する。DNAを、電気溶出し、そ
してDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタノール
沈澱によって精製する。DNAを水に溶解し、そして0.
4mg/ml(0.1pM/μl)の濃度にする。
(d)PH05プロモータフラグメントおよびデスルファト
ヒルジン構造遺伝子のpJDB207酵母ベクターフラグメン
トへの連結(第6図) pJDB207酵母ベクター、PH05シグナル配列を有するPH05
プロモータフラグメント、およびデスルファトヒルジン
構造遺伝子は、総て連結されて発現プラスミドを形成す
るDNAフラグメント(実施例16a〜c参照)として単
離される。
ヒルジン構造遺伝子のpJDB207酵母ベクターフラグメン
トへの連結(第6図) pJDB207酵母ベクター、PH05シグナル配列を有するPH05
プロモータフラグメント、およびデスルファトヒルジン
構造遺伝子は、総て連結されて発現プラスミドを形成す
るDNAフラグメント(実施例16a〜c参照)として単
離される。
p31/PH05−TPA18の0.6kb BamH I−Hga Iフラグメント
0.3pモル、およびpML310Lの0.2kb Hga I−BamH Iフラ
グメント0.3pモルを、10μlの60mMトリス・H
Cl(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1m
M ATPおよび400単位のT4DNAリガーゼ中で、
0.1pモルのpJDB207R/PH05−TPA(12−2)の6.8kb
BamH Iフラグメントに15℃で20時間連結させる。
0.3pモル、およびpML310Lの0.2kb Hga I−BamH Iフラ
グメント0.3pモルを、10μlの60mMトリス・H
Cl(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1m
M ATPおよび400単位のT4DNAリガーゼ中で、
0.1pモルのpJDB207R/PH05−TPA(12−2)の6.8kb
BamH Iフラグメントに15℃で20時間連結させる。
連結混合物1μlを、Hanahan(上記)により調製した
形質転換可能なE.コリHB101細胞100μlに加える。形
質転換の処理法も、上記文献から採用する。細胞を、5
0μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天平板状に塗
布する。
形質転換可能なE.コリHB101細胞100μlに加える。形
質転換の処理法も、上記文献から採用する。細胞を、5
0μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天平板状に塗
布する。
24個のampRコロニーを、別々に100μg/mlのアン
ピシリンを有するLB培地で増殖させる。プラスミドD
NAを、制限エンドヌクレアーゼPst Iで切断すること
によって、インサートの大きさおよび方向について分析
する。インサートの正確な方向を有する単一クローン
を、pJDB207/PH05−HIRと称する。
ピシリンを有するLB培地で増殖させる。プラスミドD
NAを、制限エンドヌクレアーゼPst Iで切断すること
によって、インサートの大きさおよび方向について分析
する。インサートの正確な方向を有する単一クローン
を、pJDB207/PH05−HIRと称する。
実施例17.サッカロミセス・セレビシエー株GRF18の
形質転換 プラスミドpHDB207/PH05−HIRを、Hinnenら(上記)に
より記載された形質転換法を用いて、サッカロミセス・
セレビシエー株GRF18(α,his3−11,his3−15,leu
2−3,leu2−112,canR)に導入する。5μgのプラ
スミドDNAを100μlのスフェロプラスト懸濁液に加
え、この混合物をポリエチレングリコールで処理する。
スフェロプラストを10mlの再生寒天と混合して、ロ
イシンを欠く酵母最少培地平板上に塗布する。
形質転換 プラスミドpHDB207/PH05−HIRを、Hinnenら(上記)に
より記載された形質転換法を用いて、サッカロミセス・
セレビシエー株GRF18(α,his3−11,his3−15,leu
2−3,leu2−112,canR)に導入する。5μgのプラ
スミドDNAを100μlのスフェロプラスト懸濁液に加
え、この混合物をポリエチレングリコールで処理する。
スフェロプラストを10mlの再生寒天と混合して、ロ
イシンを欠く酵母最少培地平板上に塗布する。
形質転換した単一酵母コロニーを取り出し、そしてロイ
シンを欠く酵母最少培地中で増殖させる。このコロニー
を、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207/PH
05−HIRと称する。
シンを欠く酵母最少培地中で増殖させる。このコロニー
を、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207/PH
05−HIRと称する。
実施例18.S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−
HIRの培養 S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−HIRの細胞
を、20mlの酵母最少培地(Difco Yeast Nitrogenベ
ース、2%グルコースおよび20mg/のL−ヒスチ
ジンを添加し、アミノ酸なし)中で30℃で攪拌し、細
胞密度3×107個/mlまで培養する。細胞を0.9%N
aClで洗浄した後、低Pi−最少培地中に50ml培養
液を接種するのに用いる。低Pi−最低培地は、Difco
Yeast Nitrogen Base培地(アミノ酸なし)の組成に対
応して調製されるが、(NH4)2SO4、2%のグルコースお
よび1g/のL−ヒスチジンの代わりに0.03g/の
KH2PO4、1g/のKClおよび10g/のL−アス
パラギンを含む。培養液を4×106個/mlの細胞密
度まで接種して、30℃で200rpmで42時間まで攪
拌する。
HIRの培養 S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−HIRの細胞
を、20mlの酵母最少培地(Difco Yeast Nitrogenベ
ース、2%グルコースおよび20mg/のL−ヒスチ
ジンを添加し、アミノ酸なし)中で30℃で攪拌し、細
胞密度3×107個/mlまで培養する。細胞を0.9%N
aClで洗浄した後、低Pi−最少培地中に50ml培養
液を接種するのに用いる。低Pi−最低培地は、Difco
Yeast Nitrogen Base培地(アミノ酸なし)の組成に対
応して調製されるが、(NH4)2SO4、2%のグルコースお
よび1g/のL−ヒスチジンの代わりに0.03g/の
KH2PO4、1g/のKClおよび10g/のL−アス
パラギンを含む。培養液を4×106個/mlの細胞密
度まで接種して、30℃で200rpmで42時間まで攪
拌する。
実施例19.S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−
HIRからのデスルファトヒルジン化合物の単離 (a)培養液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 A.RP−C18カラム上でのヒルジン化合物の濃縮 それぞれ18時間、26時間および42時間の醗酵時間
の後に、それぞれ10mlの10個の試料を培養液から
採取して、脱塩およびBond Elut C−18カラム((1
ml、Analytichem International)上での濃縮により
富化する。試料をカラムに入れ、そして液体を真空で除
去した後、カラムを1.5mlの水−アセトニトリル
(9:1)−0.1%トリフルオロ酢酸(9:1)で2回
洗浄する。ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニト
リル−0.1%トリフルオロ酢酸(6:4)で溶出する。
2mlの溶出液を、Speed Vac濃縮機(Savant)で400μl
の最終濃度まで濃縮する。ヒルジン化合物をHPLC分析で
標準デスルファトヒルジンと比較することにより、及び
トロンビン阻害測定法により同定する。試料には、約0.
2〜2μg/mlのヒルジン化合物が含まれる。
HIRからのデスルファトヒルジン化合物の単離 (a)培養液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 A.RP−C18カラム上でのヒルジン化合物の濃縮 それぞれ18時間、26時間および42時間の醗酵時間
の後に、それぞれ10mlの10個の試料を培養液から
採取して、脱塩およびBond Elut C−18カラム((1
ml、Analytichem International)上での濃縮により
富化する。試料をカラムに入れ、そして液体を真空で除
去した後、カラムを1.5mlの水−アセトニトリル
(9:1)−0.1%トリフルオロ酢酸(9:1)で2回
洗浄する。ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニト
リル−0.1%トリフルオロ酢酸(6:4)で溶出する。
2mlの溶出液を、Speed Vac濃縮機(Savant)で400μl
の最終濃度まで濃縮する。ヒルジン化合物をHPLC分析で
標準デスルファトヒルジンと比較することにより、及び
トロンビン阻害測定法により同定する。試料には、約0.
2〜2μg/mlのヒルジン化合物が含まれる。
B.DEAEセルロースカラム上でのイオン交換クロマ
トグラフィ 42時間の醗酵時間の後に1リットルの培養液を回収
し、そして遠心分離する。上澄液を、pH7.5で、DE53セ
ルロース(Whatman)のアニオン交換カラムに入れる。
[条件:カラム2.5×15.5cm(76ml);溶出緩衝液
A:20mM酢酸アンモニウム、100mM NaCl(pH7.
5);溶出緩衝液B:20mM酢酸アンモニウム、4M
NaCl(pH5.0);流速:66ml/時間]。カラムを228m
l緩衝液Aで洗浄した後、緩衝液Aおよび緩衝液Bのそ
れぞれ228mlの線形塩勾配で溶出する。22mlずつ
の画分を集める。ヒルジン化合物は、分画71〜74(88
ml)に溶出し、トロンビン阻害分析法によって同定す
る。活性な画分を、一晩4℃で20mM酢酸アンモニウ
ムに対して透析する。次いで、透析物を、2回凍結乾燥
する。凍結乾燥生成物は、逆相HPLCによれば、デスルフ
ァトヒルジン化合物を含む。
トグラフィ 42時間の醗酵時間の後に1リットルの培養液を回収
し、そして遠心分離する。上澄液を、pH7.5で、DE53セ
ルロース(Whatman)のアニオン交換カラムに入れる。
[条件:カラム2.5×15.5cm(76ml);溶出緩衝液
A:20mM酢酸アンモニウム、100mM NaCl(pH7.
5);溶出緩衝液B:20mM酢酸アンモニウム、4M
NaCl(pH5.0);流速:66ml/時間]。カラムを228m
l緩衝液Aで洗浄した後、緩衝液Aおよび緩衝液Bのそ
れぞれ228mlの線形塩勾配で溶出する。22mlずつ
の画分を集める。ヒルジン化合物は、分画71〜74(88
ml)に溶出し、トロンビン阻害分析法によって同定す
る。活性な画分を、一晩4℃で20mM酢酸アンモニウ
ムに対して透析する。次いで、透析物を、2回凍結乾燥
する。凍結乾燥生成物は、逆相HPLCによれば、デスルフ
ァトヒルジン化合物を含む。
C.Sephadex G−50上でのゲル濾過およびHPLCによる
最終的精製 トロンビン阻害試験で活性な主分画(80mlの溶出
液)を、20mM酢酸アンモニウム(pH7.5)に対して4
℃で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレーター
を用いて35℃で濃縮して、最終容積を5mlとする。
最終的精製 トロンビン阻害試験で活性な主分画(80mlの溶出
液)を、20mM酢酸アンモニウム(pH7.5)に対して4
℃で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレーター
を用いて35℃で濃縮して、最終容積を5mlとする。
得られる透明な水溶液を、ベッド容積が160mlのSepha
dex G−50精密カラム(Pharmacia)であって、カラム
(2.5×64cm、Biorad)を5%酢酸で予備平衡化させて
おいたものに加える。50mlの溶出液(分画5〜7、
流量50ml/時間、25分/分画)に含まれる主活性
成分をロータリー・エバポレーターを用いて濃縮して、
次いで逆相HPLC分離を行う。各分画の一部分(500μ
l)を、「Speed vac」濃縮機(Savant)を用いて10分
の1に濃縮して、逆相HPLCによってそのデスルファトヒ
ルジン化合物の含量を分析する。溶液は、デスルファト
ヒルジン化合物を含む。分画6(18ml)は極めて少
量の第二の成分を含み、半調製用逆相HPLCによって更に
精製する。
dex G−50精密カラム(Pharmacia)であって、カラム
(2.5×64cm、Biorad)を5%酢酸で予備平衡化させて
おいたものに加える。50mlの溶出液(分画5〜7、
流量50ml/時間、25分/分画)に含まれる主活性
成分をロータリー・エバポレーターを用いて濃縮して、
次いで逆相HPLC分離を行う。各分画の一部分(500μ
l)を、「Speed vac」濃縮機(Savant)を用いて10分
の1に濃縮して、逆相HPLCによってそのデスルファトヒ
ルジン化合物の含量を分析する。溶液は、デスルファト
ヒルジン化合物を含む。分画6(18ml)は極めて少
量の第二の成分を含み、半調製用逆相HPLCによって更に
精製する。
実験条件:Vydac 218TP510RP−HPLCカラム、10×250m
m;分離毎の分画6の一部(200μl、1:10に濃
縮);220nmで0.5以下(AUFS);流速:2ml/分;溶
出液:A:0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリ
ル/水(8:2)+0.07%トリフルオロ酢酸、1分間1
6%のB、次いで40分間に64%のBまで増加。得ら
れる画分を水で1:1に希釈して、凍結乾燥する。残渣
は、純粋なデスルファトヒルジン化合物から成る。
m;分離毎の分画6の一部(200μl、1:10に濃
縮);220nmで0.5以下(AUFS);流速:2ml/分;溶
出液:A:0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリ
ル/水(8:2)+0.07%トリフルオロ酢酸、1分間1
6%のB、次いで40分間に64%のBまで増加。得ら
れる画分を水で1:1に希釈して、凍結乾燥する。残渣
は、純粋なデスルファトヒルジン化合物から成る。
(b)S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−HIRの
細胞抽出液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 細胞は、常法に従い破壊する(欧州特許出願第100,561
号明細書参照)。2%酢酸で処理した上澄液を遠心分離
する(12,000rpm、10℃)。アンモニアを加えて最終pH
を7.5として、僅かに不透明な溶液(50ml)を更に
上記の様に処理する(実施例19a)。ヒルジン化合物は
上記のようにして、すなわちトロンビン阻害法および逆
相HPLCによって同定する。
細胞抽出液からのデスルファトヒルジン化合物の単離 細胞は、常法に従い破壊する(欧州特許出願第100,561
号明細書参照)。2%酢酸で処理した上澄液を遠心分離
する(12,000rpm、10℃)。アンモニアを加えて最終pH
を7.5として、僅かに不透明な溶液(50ml)を更に
上記の様に処理する(実施例19a)。ヒルジン化合物は
上記のようにして、すなわちトロンビン阻害法および逆
相HPLCによって同定する。
実施例20 S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−
HIRの醗酵からの生成混合物の分析 (a)上記のように(実施例19b参照)調製した上澄液
2mlを、高真空下で「Speed Vac」濃縮機上で乾燥す
る。試料をそれぞれ100μlの水に溶解し、HPLC分析を
行う(実験条件1、下記を参照されたい)。個々の画分
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が16.5分および
17.7分の画分が、トロンビン阻害を示す。これらの2分
画の比率(発現収率)は、約4:1である。アミノ酸組
成によれば、これらの画分はデスルファトヒルジンであ
る。
HIRの醗酵からの生成混合物の分析 (a)上記のように(実施例19b参照)調製した上澄液
2mlを、高真空下で「Speed Vac」濃縮機上で乾燥す
る。試料をそれぞれ100μlの水に溶解し、HPLC分析を
行う(実験条件1、下記を参照されたい)。個々の画分
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が16.5分および
17.7分の画分が、トロンビン阻害を示す。これらの2分
画の比率(発現収率)は、約4:1である。アミノ酸組
成によれば、これらの画分はデスルファトヒルジンであ
る。
(b)トロンビン阻害試験で活性である、実施例19aに
記載の方法で得られる分画を、異なる2種類の条件下で
HPLC分析にかける。
記載の方法で得られる分画を、異なる2種類の条件下で
HPLC分析にかける。
実験条件1:ヌクレオシル(MN)C18,5μmRP−HPLC
カラム、4.6×120mm:50μlヒルジン化合物/分離、
214nmでatt.6;流速1.2ml/分;溶出液:A:0.1
%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル/水(8:
2)+0.08%トリフルオロ酢酸、2分間は16%のB、
次いで50分間を要して64%のBへの増加。逆圧:6
6バール。
カラム、4.6×120mm:50μlヒルジン化合物/分離、
214nmでatt.6;流速1.2ml/分;溶出液:A:0.1
%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル/水(8:
2)+0.08%トリフルオロ酢酸、2分間は16%のB、
次いで50分間を要して64%のBへの増加。逆圧:6
6バール。
実験条件2:2分間20%のBで、それ以後40分間を
要して80%のBへ増加する勾配であることを除いて、
上記と同じ条件。
要して80%のBへ増加する勾配であることを除いて、
上記と同じ条件。
分画は1分間の間隔で採取し(全部で45)、そしてト
ロンビン阻害試験を行う。画分17〜19は、活性である。
更に、アミノ酸組成、N−末端基およびN−末端配列
を、画分17および18の活性なヒルジン化合物につい
て決定する。一つの画分(第17)は、更に、ヒルから
の天然のヒルジンを酵素アリールスルファターゼと反応
させることによって得られる標準のデスルファトヒルジ
ンと比較する。これらの結果を、以下の表1にまとめ
る。
ロンビン阻害試験を行う。画分17〜19は、活性である。
更に、アミノ酸組成、N−末端基およびN−末端配列
を、画分17および18の活性なヒルジン化合物につい
て決定する。一つの画分(第17)は、更に、ヒルから
の天然のヒルジンを酵素アリールスルファターゼと反応
させることによって得られる標準のデスルファトヒルジ
ンと比較する。これらの結果を、以下の表1にまとめ
る。
分画17および18の収量の比率は、約4:1である。
(c)上記(実施例19a参照)と同様に調製した上澄液
200mlについて、HPLC分析(条件3、以下を参照)お
よびFPLC分離(条件4)を行う。個々の分画のトロンビ
ン阻害を試験する。保持時間が8.0分(ピーク1)、11.
1分(ピーク2)および12.1分(ピーク3)である分画
は、強力なトロンビン阻害を示す。これらの3種類の化
合物の比率(発現収率)は、約1:4:1である。HPLC
分析によれば、ピーク2および3に対応する化合物は実
施例20b(分画17および18)に記載したヒルジン化
合物と同一である。結果を表2に示す。
200mlについて、HPLC分析(条件3、以下を参照)お
よびFPLC分離(条件4)を行う。個々の分画のトロンビ
ン阻害を試験する。保持時間が8.0分(ピーク1)、11.
1分(ピーク2)および12.1分(ピーク3)である分画
は、強力なトロンビン阻害を示す。これらの3種類の化
合物の比率(発現収率)は、約1:4:1である。HPLC
分析によれば、ピーク2および3に対応する化合物は実
施例20b(分画17および18)に記載したヒルジン化
合物と同一である。結果を表2に示す。
実験条件3:Vydac 218TP−B5RP−HPLCカラム、4.0×12
0mm、15μgのヒルジン化合物/分離、214nmでatt.
7、流速1.2ml/分;溶出液:A:0.1%トリフルオロ
酢酸、B:アセトニトリル+0.08%トリフルオロ酢酸、
2分間は16%のB、次いで20分間を要して40%の
Bへ増加。逆圧:80バール。
0mm、15μgのヒルジン化合物/分離、214nmでatt.
7、流速1.2ml/分;溶出液:A:0.1%トリフルオロ
酢酸、B:アセトニトリル+0.08%トリフルオロ酢酸、
2分間は16%のB、次いで20分間を要して40%の
Bへ増加。逆圧:80バール。
実験条件4:Pharmacia MonoQ FPLCアニオン交換カラ
ム、5.0×50mm、15μgヒルジン化合物/分離、280n
mでAUFS0.01、流速1.0ml/分、勾配溶出緩衝液A:
20mMのトリス・HCl(pH7.5)、緩衝液B:緩衝液
A+1MのNaCl(pH7.5)、9分間は15%のBで、次い
で21分間を要して70%のBに増加。
ム、5.0×50mm、15μgヒルジン化合物/分離、280n
mでAUFS0.01、流速1.0ml/分、勾配溶出緩衝液A:
20mMのトリス・HCl(pH7.5)、緩衝液B:緩衝液
A+1MのNaCl(pH7.5)、9分間は15%のBで、次い
で21分間を要して70%のBに増加。
実施例21.S.セレビシエーGRF18/pJDB207/PH05−
HIR株の醗酵からのデスルファトヒルジン化合物の特性
決定 HPLC分析によれば、培地(実施例20、表1および2参
照)から単離される分画17(またはピーク)および1
8(またはピーク2)のヒルジン化合物は、細胞抽出液
から単離された対応する化合物(細胞内ヒルジン化合
物)と同じである。これらの化合物およびピーク3(表
2を参照)は、次のようにして特性決定する。
HIR株の醗酵からのデスルファトヒルジン化合物の特性
決定 HPLC分析によれば、培地(実施例20、表1および2参
照)から単離される分画17(またはピーク)および1
8(またはピーク2)のヒルジン化合物は、細胞抽出液
から単離された対応する化合物(細胞内ヒルジン化合
物)と同じである。これらの化合物およびピーク3(表
2を参照)は、次のようにして特性決定する。
a.アミノ酸組成の決定 約2.5μgの純粋なヒルジン化合物を、6NのHClを
用いて110℃で24時間加水分解し、次いでChangらの記
載の方法[DABS−Cl法;Method in Enzymology、第91
巻、41頁、(1983年)]と同様にして分析する。加水
分解物は、次のような組成を有する。
用いて110℃で24時間加水分解し、次いでChangらの記
載の方法[DABS−Cl法;Method in Enzymology、第91
巻、41頁、(1983年)]と同様にして分析する。加水
分解物は、次のような組成を有する。
(b)部分配列の分析 18μg(2.5nM)の純粋なヒルジン化合物を、Edman
の方法による通常の配列分析を行い、N−末端フェニル
チオヒダントイン(PTH)−アミノ酸をRP−HPLCによ
って決定する。
の方法による通常の配列分析を行い、N−末端フェニル
チオヒダントイン(PTH)−アミノ酸をRP−HPLCによ
って決定する。
結果 ピーク1(表2を参照されたい) 上記のサイクル1からサイクル29までの配列。
ピーク3(分画18、表1および2を参照されたい) 上記のサイクル1からサイクル27までの配列。
したがって、検討した生合成ヒルジン化合物のN−末端
配列は、標準(真正)試料の配列と同じである。
配列は、標準(真正)試料の配列と同じである。
C.C−末端分析 ヒルジン化合物をカルボキシペプチダーゼYで消化し、
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する(J.Y.
Chang、R.Knedel、及びD.G.Braun、Biochem.J.、第199
巻、547頁を参照されたい)。
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する(J.Y.
Chang、R.Knedel、及びD.G.Braun、Biochem.J.、第199
巻、547頁を参照されたい)。
結果 ピーク1(表2を参照) C−末端アミノ酸:−Glu−Tyr、 ピーク2(分画17、表1および2参照) C−末端アミノ酸:−Glu−Tyr−Leu−Gln、 ピーク3(分画18、表1および2参照) C−末端アミノ酸:−Glu−Tyr−Leu。
(d)見掛けの分子量 デスルファトヒルジン化合物(30μg)を、SDS尿
素ゲル上で分析する[SUDSゲル、Kyteら、Anal.Bioche
m.、第133巻、515頁、(1983年)参照]。クマシーブル
ー染色の前に、12%のトリフルオロ酢酸で固定を行
う。見掛けの分子量が6000〜7000ダルトンに相当する単
一バンドが観察される。
素ゲル上で分析する[SUDSゲル、Kyteら、Anal.Bioche
m.、第133巻、515頁、(1983年)参照]。クマシーブル
ー染色の前に、12%のトリフルオロ酢酸で固定を行
う。見掛けの分子量が6000〜7000ダルトンに相当する単
一バンドが観察される。
(e)FAB−MSによる分子量決定 デスルファトヒルジン化合物を、迅速原子衝撃陽イオン
マススペクトル分析法(FAB−MS)に付す。分析機器:Z
AB−HBマススペクトル分析計(VG−Analytical Ltd.、
マンチェスター)、マトリックス:チオグリセロール・
キセノン衝撃;イオンエネルギー; 10KeV、外部標準:Cs26J25(分子量:6887.9)およびCs
28J27(7147.76)。
マススペクトル分析法(FAB−MS)に付す。分析機器:Z
AB−HBマススペクトル分析計(VG−Analytical Ltd.、
マンチェスター)、マトリックス:チオグリセロール・
キセノン衝撃;イオンエネルギー; 10KeV、外部標準:Cs26J25(分子量:6887.9)およびCs
28J27(7147.76)。
結果 ピーク1(表2参照) 実験式:C276H421N77O107S6 分子量(計算値):6722.23 分子量(実測値):6719.3。
ピーク2(分画17、表1および2参照) 実験式:C287H440N80O110S6 分子量(計算値):6963.518 分子量(実測値):6963.44 分子量は2つの異なる測定値の平均である。
ピーク2(分画18、表1および2参照) 実験式:C282H432N78O108S6 分子量(計算値):6835.39 分子量(実測値):6832.9。
上記のデーターに基づき、ピーク1の化合物はデスルフ
ァトヒルジン(1−63)であり、ピーク2の化合物は標
準デスルファトヒルジン(1−65)と同一であり、ピー
ク3の化合物は新規なデスルファトヒルジン(1−64)
である。
ァトヒルジン(1−63)であり、ピーク2の化合物は標
準デスルファトヒルジン(1−65)と同一であり、ピー
ク3の化合物は新規なデスルファトヒルジン(1−64)
である。
(f)ヒト・トロンビン−ヒルジン解離定数 ヒト・トロンビン−デスルファトヒルジン複合体の解離
定数KDは、S.R.Stone及びJ.Hofsteengeの方法[Bioch
emistry、第25巻、4622〜4628頁、(1986年)]にし
たがって決定され、下記の表にまとめてある。表には、
3種類の得られたデスルファトヒルジン化合物の比活性
(ATU/mgで表した)も示している。
定数KDは、S.R.Stone及びJ.Hofsteengeの方法[Bioch
emistry、第25巻、4622〜4628頁、(1986年)]にし
たがって決定され、下記の表にまとめてある。表には、
3種類の得られたデスルファトヒルジン化合物の比活性
(ATU/mgで表した)も示している。
(g)形質転換した酵母から得られるその他のデスルフ
ァトヒルジン化合物 実施例19に記載の方法で醗酵を行い、精製したデスル
ファトヒルジン化合物の混合物を、更に分離して、詳細
に特性決定する。
ァトヒルジン化合物 実施例19に記載の方法で醗酵を行い、精製したデスル
ファトヒルジン化合物の混合物を、更に分離して、詳細
に特性決定する。
Vydac 218 TP 510 RP−HPLCカラム上で、半調製的分離
を行うと、上記デスルファトヒルジン化合物(実施例21
e参照)の他に、保持時間が8.1分でカラムから溶出す
るデスルファトヒルジン様化合物が生じる。
を行うと、上記デスルファトヒルジン化合物(実施例21
e参照)の他に、保持時間が8.1分でカラムから溶出す
るデスルファトヒルジン様化合物が生じる。
この物質は迅速原子衝撃マススペクトル分析法(FAB−M
S)およびアミノ酸分析、部分配列決定法およびC−末
端分析によって特性決定される。
S)およびアミノ酸分析、部分配列決定法およびC−末
端分析によって特性決定される。
FAB−MSは、この物質が、分子量がそれぞれ6429.5およ
び6556.8である2種類の化合物の混合物であることを示
している。
び6556.8である2種類の化合物の混合物であることを示
している。
アミノ酸組成は、次のようである。
これらのデーターによれば、この混合物は、デスルファ
トヒルジン(1−61)とデスルファトヒルジン(1−
62)とから成る。
トヒルジン(1−61)とデスルファトヒルジン(1−
62)とから成る。
実施例22.シグナル配列のないデスルファトヒルジン
遺伝子を有する酵母におけるデスルファトヒルジン化合
物の発現(第7図) (a)pJDB207ベクターフラグメントの単離 6μgのプラスミドpJDB207R−IF(α−3)(EP 100,5
61)を、制限エンドヌクレアーゼBamH Iを用いて完全に
消化する。生成するDNAフラグメント(6.85Kbおよ
び1.15kb)をエタノールで沈澱させ、400μlの50
mMのトリス・HCl(pH8.0)中で処理する。4.5単位の
ウシ腸ホスファターゼ(Boehringer、マンハイム)を加
える。混合物を37℃で1時間インキュベーションした
後、ホスファターゼを65℃で1.5時間で不活性化す
る。溶液を150mM NaClに調整した後、10mMトリ
ス・HCl(pH7.5)、150mM NaClおよび1mM EDTA
で予め平衡にしておいたDE52(Whatman)アニオン交換カ
ラム(100μl容量)に適用する。同じ緩衝液で洗浄操
作を行った後、DNAを400μlの1.5M NaCl,10m
Mトリス・HCl(pH7.5)、1mM EDTAで溶出させ、
エタノールで沈澱させる。6.85kbの大きなBamH Iフラ
グメントが、トリス・ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2
%アガロースゲル上で小さなフラグメントから分離され
る。
遺伝子を有する酵母におけるデスルファトヒルジン化合
物の発現(第7図) (a)pJDB207ベクターフラグメントの単離 6μgのプラスミドpJDB207R−IF(α−3)(EP 100,5
61)を、制限エンドヌクレアーゼBamH Iを用いて完全に
消化する。生成するDNAフラグメント(6.85Kbおよ
び1.15kb)をエタノールで沈澱させ、400μlの50
mMのトリス・HCl(pH8.0)中で処理する。4.5単位の
ウシ腸ホスファターゼ(Boehringer、マンハイム)を加
える。混合物を37℃で1時間インキュベーションした
後、ホスファターゼを65℃で1.5時間で不活性化す
る。溶液を150mM NaClに調整した後、10mMトリ
ス・HCl(pH7.5)、150mM NaClおよび1mM EDTA
で予め平衡にしておいたDE52(Whatman)アニオン交換カ
ラム(100μl容量)に適用する。同じ緩衝液で洗浄操
作を行った後、DNAを400μlの1.5M NaCl,10m
Mトリス・HCl(pH7.5)、1mM EDTAで溶出させ、
エタノールで沈澱させる。6.85kbの大きなBamH Iフラ
グメントが、トリス・ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中1.2
%アガロースゲル上で小さなフラグメントから分離され
る。
(b)534bp PH05プロモーターフラグメントの単離 6μgのプラスミドp31/R(EP100,561)を、制限エン
ドヌクレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化する。生成す
る3種のDNAフラグメントを、トリス−ホウ酸−EDTA
緩衝液(pH8.3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。53
4bp BamH I−EcoR Iフラグメントが単離される。このフ
ラグメントは、転写開始部位を有するPH05プロモーター
を含んでいる。
ドヌクレアーゼEcoR IおよびBamH Iで消化する。生成す
る3種のDNAフラグメントを、トリス−ホウ酸−EDTA
緩衝液(pH8.3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。53
4bp BamH I−EcoR Iフラグメントが単離される。このフ
ラグメントは、転写開始部位を有するPH05プロモーター
を含んでいる。
(c)デスルファトヒルジンをコードする配列を有する
206bp DNAフラグメントの単離 9μgのプラスミドpML310(実施例13c参照)を、制限
酵素BamH IおよびEcoR Iで完全に消化する。生成する2
種類のDNAフラグメントを、トリス−ホウ酸−EDTA緩
衝液(pH8.3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。206b
p EcoR I−BamH Iフラグメントが、単離される。
206bp DNAフラグメントの単離 9μgのプラスミドpML310(実施例13c参照)を、制限
酵素BamH IおよびEcoR Iで完全に消化する。生成する2
種類のDNAフラグメントを、トリス−ホウ酸−EDTA緩
衝液(pH8.3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。206b
p EcoR I−BamH Iフラグメントが、単離される。
(d)DNAフラグメントの連結 第a〜c項で述べた3種類のDNAフラグメント(上記
参照)を、電気溶出によってアガロースゲルから得、DE
52(Whatman)アニオン交換体上で精製し、エタノールで
沈澱し、水に再分散する。
参照)を、電気溶出によってアガロースゲルから得、DE
52(Whatman)アニオン交換体上で精製し、エタノールで
沈澱し、水に再分散する。
0.1pモル(0.45μg)の6.85kb BamH Iベクターフラグ
メント、0.3pモル(0.1μg)の534bp BamH I−EcoR I
PH05プロモーターフラグメントおよび0.25pモル(3
4ng)のpML310の206bp EcoR I−BamH Iフラグメント
を、15μlの60mMトリス・HCl(pH7.5),10
mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATTおよ
び600単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で15℃で
16時間連結させる。
メント、0.3pモル(0.1μg)の534bp BamH I−EcoR I
PH05プロモーターフラグメントおよび0.25pモル(3
4ng)のpML310の206bp EcoR I−BamH Iフラグメント
を、15μlの60mMトリス・HCl(pH7.5),10
mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATTおよ
び600単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で15℃で
16時間連結させる。
24個の形質転換したampRコロニーを、100μg/ml
のアンピシリンを含むLB培地中で別々に培養する。プ
ラスミドDNAをHolmesら(上記)の方法によって単離
し、Hind III−EcoR I二重消化によって分析する。約60
0bpの大きなEcoR I−Hind IIIフラグメントの出現は、
関連するクローンではPH05プロモーター−ヒルジンDN
Aフラグメントがベクター上に転写停止シグナルに対し
て正確な方向にあることを示している。予想されるよう
に、約50%のクローンはインサートの正確な方向を有
する。これらのクローンの一つをpJDB207R/PH05−HIR
と命名する。
のアンピシリンを含むLB培地中で別々に培養する。プ
ラスミドDNAをHolmesら(上記)の方法によって単離
し、Hind III−EcoR I二重消化によって分析する。約60
0bpの大きなEcoR I−Hind IIIフラグメントの出現は、
関連するクローンではPH05プロモーター−ヒルジンDN
Aフラグメントがベクター上に転写停止シグナルに対し
て正確な方向にあることを示している。予想されるよう
に、約50%のクローンはインサートの正確な方向を有
する。これらのクローンの一つをpJDB207R/PH05−HIR
と命名する。
(e)サッカロミセス・セレビシエーGRF18の形質転換 サッカロミセス・セレビシエーGRF18の株(α,his3−1
1,his3−15,leu2−3,leu2−112,canR)を、Hinnen
ら(上記)の方法にしたがってプラスミドpJDB207R/PH
05−HIRを用いて形質転換する。形質転換された酵母細
胞の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天
平板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離さ
れ、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207R/P
H05−HIRと命名する。
1,his3−15,leu2−3,leu2−112,canR)を、Hinnen
ら(上記)の方法にしたがってプラスミドpJDB207R/PH
05−HIRを用いて形質転換する。形質転換された酵母細
胞の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天
平板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離さ
れ、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207R/P
H05−HIRと命名する。
(f)S.セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH05−HIRの
培養 S.セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH05−HIRの細胞
を、20mlの酵母最低培地(Difco Yeast Nitrogen培
養基、アミノ酸なし、2%グルコースおよび20mg/
のL−ヒスチジンを添加)中で30℃で攪拌し、細胞
密度が3×107個/mlになるまで培養する。細胞を0.9
%NaClで洗浄し、次いで低Pi−最低培地中に50ml
の培養液を接種するのに用いる。低Pi−最低培地は、
Difco Yeast Nitrogen Base培地(アミノ酸なし)の組
成に対応して調製されるが、(NH4)2SO4、2%グルコー
スおよび1g/のL−ヒスチジンの代わりに0.03g/
のKH2PO4、1g/のKCl、および10g/のL
−アスパラギンを含む。培養液を接種して細胞密度を4
×106個/mlとし、30℃で42時間200rpmで攪拌す
る。
培養 S.セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH05−HIRの細胞
を、20mlの酵母最低培地(Difco Yeast Nitrogen培
養基、アミノ酸なし、2%グルコースおよび20mg/
のL−ヒスチジンを添加)中で30℃で攪拌し、細胞
密度が3×107個/mlになるまで培養する。細胞を0.9
%NaClで洗浄し、次いで低Pi−最低培地中に50ml
の培養液を接種するのに用いる。低Pi−最低培地は、
Difco Yeast Nitrogen Base培地(アミノ酸なし)の組
成に対応して調製されるが、(NH4)2SO4、2%グルコー
スおよび1g/のL−ヒスチジンの代わりに0.03g/
のKH2PO4、1g/のKCl、および10g/のL
−アスパラギンを含む。培養液を接種して細胞密度を4
×106個/mlとし、30℃で42時間200rpmで攪拌す
る。
(g)S.セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH05−HIRの
醗酵からの生成混合物の分析 細胞(実施例22f参照)を、通常の方法にしたがって破
壊する(例えば、欧州特許出願第100,561号明細書参
照)。1.5%酢酸で処理した上澄液を遠心分離し、そし
てそれぞれ2mlの透明な溶液を「Speed Vac」濃縮機
上で高真空で乾燥する。試料をそれぞれ100μlの水に
溶解して、HPLC分析を行う(条件は実施例20と同
じ)。それぞれの分画のトロンビン阻害を試験する。保
持時間が16.5分の分画がトロンビン阻害活性を有する。
アミノ酸組成によれば、この分画はデスルファトヒルジ
ンである。HPLC分析によれば、この力価は約10μg/
リットルである。培地には、ヒルジン活性は検出されな
い。
醗酵からの生成混合物の分析 細胞(実施例22f参照)を、通常の方法にしたがって破
壊する(例えば、欧州特許出願第100,561号明細書参
照)。1.5%酢酸で処理した上澄液を遠心分離し、そし
てそれぞれ2mlの透明な溶液を「Speed Vac」濃縮機
上で高真空で乾燥する。試料をそれぞれ100μlの水に
溶解して、HPLC分析を行う(条件は実施例20と同
じ)。それぞれの分画のトロンビン阻害を試験する。保
持時間が16.5分の分画がトロンビン阻害活性を有する。
アミノ酸組成によれば、この分画はデスルファトヒルジ
ンである。HPLC分析によれば、この力価は約10μg/
リットルである。培地には、ヒルジン活性は検出されな
い。
付帯のシグナル配列を持たないかまたは有するデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を担持する酵母株から得られる細胞
内および細胞外ヒルジン活性の収量を、表3にまとめて
ある。ヒルジン活性はトロンビン阻害法によって測定す
る。
ァトヒルジン遺伝子を担持する酵母株から得られる細胞
内および細胞外ヒルジン活性の収量を、表3にまとめて
ある。ヒルジン活性はトロンビン阻害法によって測定す
る。
実施例23.PH05プロモーター欠落体の造成 (a)Bal31消化 第8図に示されるPH05のBamH I−Sal Iフラグメントを
含有する組換ファージM13mp9/PH05 Bam−Salを、PH05
プロモーター源として用いる(欧州特許出願第143,081
号明細書参照)。
含有する組換ファージM13mp9/PH05 Bam−Salを、PH05
プロモーター源として用いる(欧州特許出願第143,081
号明細書参照)。
20μgのファージDNA(RF:複製形)を制限エン
ドヌクレアーゼSal Iで消化して、約9kbの線状DN
Aを生成せしめる。フェノール/クロロホルムで抽出の
後、DNAをエタノールで沈澱せしめる。DNAを、1
0mMのトリス(pH8.0)に再分散させて、濃度を0.5μg
/mlとする。16μgのSal I開裂したDNAを、100
μlの20mMトリス(pH8.0)、199mM NaCl,12m
M MgCl2,12mM CaCl2および1mMのEDTA中で2
単位のエキソヌクレアーゼBal31(BRL)で消化す
る。30℃で1、2、3、4、5および6分間インキュ
ベートした後に2μgずつのDNAを採取して、直ちに
50μlのフェノールおよび60μlのTNEと混合す
る。フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱した後、DNAを100μg/mlの濃度で10mMの
トリス(pH8.0)に再分散する。Bal31によるエンドヌクレ
アーゼ切断の程度を分析するため、それぞれの時間に採
取した0.5μgずつのDNAをエキソヌクレアーゼで消
化して、トリス−ホウ酸緩衝液(pH8.3)〔90mMトリ
ス・HCl(pH8.3),90mホウ酸、2.5mM EDTA〕
中、1.5%アガロースゲル上で分析する。
ドヌクレアーゼSal Iで消化して、約9kbの線状DN
Aを生成せしめる。フェノール/クロロホルムで抽出の
後、DNAをエタノールで沈澱せしめる。DNAを、1
0mMのトリス(pH8.0)に再分散させて、濃度を0.5μg
/mlとする。16μgのSal I開裂したDNAを、100
μlの20mMトリス(pH8.0)、199mM NaCl,12m
M MgCl2,12mM CaCl2および1mMのEDTA中で2
単位のエキソヌクレアーゼBal31(BRL)で消化す
る。30℃で1、2、3、4、5および6分間インキュ
ベートした後に2μgずつのDNAを採取して、直ちに
50μlのフェノールおよび60μlのTNEと混合す
る。フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱した後、DNAを100μg/mlの濃度で10mMの
トリス(pH8.0)に再分散する。Bal31によるエンドヌクレ
アーゼ切断の程度を分析するため、それぞれの時間に採
取した0.5μgずつのDNAをエキソヌクレアーゼで消
化して、トリス−ホウ酸緩衝液(pH8.3)〔90mMトリ
ス・HCl(pH8.3),90mホウ酸、2.5mM EDTA〕
中、1.5%アガロースゲル上で分析する。
(b)Bal31で処理したDNAへのEcoR Iリンカーの付
加 2個のA260単位のEcoR Iリンカー(5−GGAATTCC−3)
を、250μlの10mMトリス(pH8)および1mM EDTA
に再分散する。2μgのEcoR Iリンカーを75μlの6
0mMのトリス(pH7.5),10mM MgCl2、15mM
DDDT,10μM ATPおよび33単位のT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理す
る。37℃で1時間後に、混合物を室温に冷却して、次
いで−20℃で貯蔵する。
加 2個のA260単位のEcoR Iリンカー(5−GGAATTCC−3)
を、250μlの10mMトリス(pH8)および1mM EDTA
に再分散する。2μgのEcoR Iリンカーを75μlの6
0mMのトリス(pH7.5),10mM MgCl2、15mM
DDDT,10μM ATPおよび33単位のT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理す
る。37℃で1時間後に、混合物を室温に冷却して、次
いで−20℃で貯蔵する。
アニールした2本鎖EcoR Iリンカーを、それらの平滑端
により、Bal31で処理したDNAフラグメントに連結す
る。0.5μgのBal31で処理したDNA(実施例23a参
照)を、20μlの60mMトリス(pH7.5),10mM
MgCl2,10mM DDT、4mM ATPおよび600
単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で、50倍過剰
量のキナーゼ処理したEcoR Iリンカーと共に室温で16
時間インキュベートする。T4DNAリガーゼを不活性
化した後(65℃、10分間)、過剰のEcoR Iリンカー
を、50μlの容量中でEcoR I(Boehringer)50単位で
切断する。DNAをフェノール/クロロホルムで抽出し
て、エタノールで沈澱させ、10mMトリスおよび1m
M EDTA(=TE)中に再分散する。次いで、DNAを5
単位のBamH I(Biolabs)で切断し、混合物を1.5%の低融
点アガロースゲル(Sigma)トリス−ホウ酸緩衝液(上記
参照)に適用する。バンドを臭化エチジウムで染色し、
366nmの長波長紫外線下で可視化する。約100bp〜600p
bの幅広い拡散バンドパターンをゲルから切り取り、D
NAを次のようにして抽出する。すなわち、アガロース
の切片を65℃で液化し、そして500 mMNaClに調整
し、そして65℃で20分間インキュベートする。1容
のフェノール〔10mMトリス・HCl(pH7.5),1m
M EDTAおよび500mM NaClで平衡にしたもの〕を加
える。水相をフェノールで2回再抽出し、クロロホルム
で1回抽出する。DNAを2.5容の冷無水エタノールで
沈澱させ、遠心分離によって集める。DNAのペレット
を冷80%エタノールで洗浄し、次いで真空で乾燥す
る。DNAを10μlのTEに再分散する。
により、Bal31で処理したDNAフラグメントに連結す
る。0.5μgのBal31で処理したDNA(実施例23a参
照)を、20μlの60mMトリス(pH7.5),10mM
MgCl2,10mM DDT、4mM ATPおよび600
単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で、50倍過剰
量のキナーゼ処理したEcoR Iリンカーと共に室温で16
時間インキュベートする。T4DNAリガーゼを不活性
化した後(65℃、10分間)、過剰のEcoR Iリンカー
を、50μlの容量中でEcoR I(Boehringer)50単位で
切断する。DNAをフェノール/クロロホルムで抽出し
て、エタノールで沈澱させ、10mMトリスおよび1m
M EDTA(=TE)中に再分散する。次いで、DNAを5
単位のBamH I(Biolabs)で切断し、混合物を1.5%の低融
点アガロースゲル(Sigma)トリス−ホウ酸緩衝液(上記
参照)に適用する。バンドを臭化エチジウムで染色し、
366nmの長波長紫外線下で可視化する。約100bp〜600p
bの幅広い拡散バンドパターンをゲルから切り取り、D
NAを次のようにして抽出する。すなわち、アガロース
の切片を65℃で液化し、そして500 mMNaClに調整
し、そして65℃で20分間インキュベートする。1容
のフェノール〔10mMトリス・HCl(pH7.5),1m
M EDTAおよび500mM NaClで平衡にしたもの〕を加
える。水相をフェノールで2回再抽出し、クロロホルム
で1回抽出する。DNAを2.5容の冷無水エタノールで
沈澱させ、遠心分離によって集める。DNAのペレット
を冷80%エタノールで洗浄し、次いで真空で乾燥す
る。DNAを10μlのTEに再分散する。
(c)M13p9中への連結 3μgのM13mp9のRFを、50μlの容積中、15単位
のEcoR I(Biolabs)および15単位の、BamH I(Boehring
er)を用いて消化する。フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱の後、DNAを50μlのTEに再分散する。5
μlの切断されたベクターDNA(約200ng)を10
μlの上記試料(実施例23bに記載の方法で各種のBal3
1消化物から得られるDNAフラグメント)と混合し
て、60mMトリス・HCl(pH7.5),6mM MgCl2,
10mM DTT,1mM ATPおよび200単位のT
4DNAリガーゼの存在で総量20μl中で15時間リ
ガーゼ処理する。E.コリJM101株のコンピテント細胞
の形質導入は、New England Biolabs発行のマニュアル
「M13 cloning and sequencing system」に準じて
行う。多数の白色プラークからのファージを増殖させ、
制限酵素EcoR IおよびBamH Iで切断することによって、
DNAインサートの大きさを分析する。
のEcoR I(Biolabs)および15単位の、BamH I(Boehring
er)を用いて消化する。フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱の後、DNAを50μlのTEに再分散する。5
μlの切断されたベクターDNA(約200ng)を10
μlの上記試料(実施例23bに記載の方法で各種のBal3
1消化物から得られるDNAフラグメント)と混合し
て、60mMトリス・HCl(pH7.5),6mM MgCl2,
10mM DTT,1mM ATPおよび200単位のT
4DNAリガーゼの存在で総量20μl中で15時間リ
ガーゼ処理する。E.コリJM101株のコンピテント細胞
の形質導入は、New England Biolabs発行のマニュアル
「M13 cloning and sequencing system」に準じて
行う。多数の白色プラークからのファージを増殖させ、
制限酵素EcoR IおよびBamH Iで切断することによって、
DNAインサートの大きさを分析する。
(d)Sanger配列決定法によるBal31欠失末端の決定(S
al I部位からの欠失) 配列決定は、上記のマニュアルに記載のようにSangerら
のジデオキシDNA配列決定方式[Proc.Natl.Acad.Sc
i.、米国、第74巻、5463頁(1977年)]を用いて行
う。欠失末端部を、以下に示す。
al I部位からの欠失) 配列決定は、上記のマニュアルに記載のようにSangerら
のジデオキシDNA配列決定方式[Proc.Natl.Acad.Sc
i.、米国、第74巻、5463頁(1977年)]を用いて行
う。欠失末端部を、以下に示す。
(e)Sanger配列決定法によるBal31欠失末端の決定(B
amH1部位からの欠失) M13mp9 PH05 Bam−SalをBamH Iによって切断することを
除いて、同様なセットのBal31欠失を、前記(a)〜
(c)に記載したのと同様に行う。Bal31で消化された
分子を、EcoR IおよびSal Iによって切断し、生成した
フラグメントをEcoR IおよびSal Iで消化したM13mp9中
にクローン化する。欠失末端点を、以下に示す。
amH1部位からの欠失) M13mp9 PH05 Bam−SalをBamH Iによって切断することを
除いて、同様なセットのBal31欠失を、前記(a)〜
(c)に記載したのと同様に行う。Bal31で消化された
分子を、EcoR IおよびSal Iによって切断し、生成した
フラグメントをEcoR IおよびSal Iで消化したM13mp9中
にクローン化する。欠失末端点を、以下に示す。
(f)内部PH05プロモータ欠失の構成 (d)に記載のBal31欠失セットはEcoR Iで終わる「左
腕」PH05プロモーターフラグメントを生成し、(e)に
記載のBal31欠失セットはEcoR Iで終わる「右腕」PH05
プロモーターフラグメントを生成する。各種位置の「左
腕」と「右腕」を組み合わせることにより、欠失したD
NAの位置にEcoR Iリンカーセグメントを含む内部欠失
が生成される。それぞれの内部欠失は、制限エンドヌク
レアーゼEcoR IおよびBamH I(左腕)、またはEcoR Iお
よびSal I(右腕)によってM13mp9から「左腕」および
「右腕」を切断し、(b)に記載したのと同様にソフト
アガロース電気泳動法により対応するフラグメントを単
離することによって構成される。等モル量の「左腕」、
「右腕」、および200ngのBamH IおよびSal I消化した
M13mp9ベクターDNAを(c)に記載したのと同様に連
結する。E.コリJM101に形質導入した後、白色プラグ
を採取して、RFを生成させて、制限分析(BamH I、Sa
l I、EcoR I)によって分析する。次の腕を組み合わせ
て、(ヌクレオチドの番号に対する、第8図参照)特異
的内部欠失を形成する。
腕」PH05プロモーターフラグメントを生成し、(e)に
記載のBal31欠失セットはEcoR Iで終わる「右腕」PH05
プロモーターフラグメントを生成する。各種位置の「左
腕」と「右腕」を組み合わせることにより、欠失したD
NAの位置にEcoR Iリンカーセグメントを含む内部欠失
が生成される。それぞれの内部欠失は、制限エンドヌク
レアーゼEcoR IおよびBamH I(左腕)、またはEcoR Iお
よびSal I(右腕)によってM13mp9から「左腕」および
「右腕」を切断し、(b)に記載したのと同様にソフト
アガロース電気泳動法により対応するフラグメントを単
離することによって構成される。等モル量の「左腕」、
「右腕」、および200ngのBamH IおよびSal I消化した
M13mp9ベクターDNAを(c)に記載したのと同様に連
結する。E.コリJM101に形質導入した後、白色プラグ
を採取して、RFを生成させて、制限分析(BamH I、Sa
l I、EcoR I)によって分析する。次の腕を組み合わせ
て、(ヌクレオチドの番号に対する、第8図参照)特異
的内部欠失を形成する。
(g)PH05プロモータの内部欠失の生体内分析 野生型のPH05 Bam−Salフラグメントを欠失した対応物
に置き換えることによって、実施例23(f)に記載の
各種欠失を、プラスミドpJDB207/PH05[R.Haguenauer
−Tsapis及びA.HinnenのMoleculer and Cellular Biolo
gy、第4巻、2668〜1675頁(1984年)]中にクローン化
する。酵母S.セレビシエAH216株を形質転換した後
(欧州特許出願第143,081号明細書参照)、酸性ホスフ
ァターゼ活性をToh−eらにより記載された方法[J.Bac
teriol.、第113巻、727頁、(1973年)]によって決定
する。欠失△11および△12は、PH05活性の約10分
の1への低下を示し、PH05発現に本質的な上流領域
(「上流活性化部位」、UAS)を定義してる。同様な
低下効果は、欠失△17(約5分の1へ低下)およびTA
TAボックス欠失△23〜△26(約30分の1へ低下)で観
察される。総てのその他の欠失は、ほぼ野生株の水準の
活性を示す。これらの結果は、PH05の発現に本質的な情
報の3種類の部分は次の位置に配置されていることを示
唆する。
に置き換えることによって、実施例23(f)に記載の
各種欠失を、プラスミドpJDB207/PH05[R.Haguenauer
−Tsapis及びA.HinnenのMoleculer and Cellular Biolo
gy、第4巻、2668〜1675頁(1984年)]中にクローン化
する。酵母S.セレビシエAH216株を形質転換した後
(欧州特許出願第143,081号明細書参照)、酸性ホスフ
ァターゼ活性をToh−eらにより記載された方法[J.Bac
teriol.、第113巻、727頁、(1973年)]によって決定
する。欠失△11および△12は、PH05活性の約10分
の1への低下を示し、PH05発現に本質的な上流領域
(「上流活性化部位」、UAS)を定義してる。同様な
低下効果は、欠失△17(約5分の1へ低下)およびTA
TAボックス欠失△23〜△26(約30分の1へ低下)で観
察される。総てのその他の欠失は、ほぼ野生株の水準の
活性を示す。これらの結果は、PH05の発現に本質的な情
報の3種類の部分は次の位置に配置されていることを示
唆する。
1.−349〜−383の位置(UAS1)、 2.−225〜−263の位置(UAS2)、 3.−87〜−125の位置(TATAボックス)。PH05 のUAS1またはUAS2またはUAS1およびUAS2を含むDN
Aフラグメントは、組換ファージM13mp9/PH05 Bam−Sa
l(上記参照)から適当な制限エンドヌクレアーゼで切
断することによって生成させることができる。UAS1は、
次の式: を有する268bp BamH I−Cla Iフラグメントに含まれ
る。
Aフラグメントは、組換ファージM13mp9/PH05 Bam−Sa
l(上記参照)から適当な制限エンドヌクレアーゼで切
断することによって生成させることができる。UAS1は、
次の式: を有する268bp BamH I−Cla Iフラグメントに含まれ
る。
UAS2は、次の式: を有する100bp Cla I−BstE IIフラグメントに含まれ、
そしてUAS1およびUAS2は共に、次の式: を有する368bp BamH I−BstE IIフラグメントに存在す
る。
そしてUAS1およびUAS2は共に、次の式: を有する368bp BamH I−BstE IIフラグメントに存在す
る。
実施例24.融合したPH05−GAPDHハイブリッドプロモ
ーターの制御下でのデスルファトヒルジンの発現 実施例23は、PH05遺伝子の位置−365付近の領域[UAS
1(PH05)]、および位置−180付近のもう一つの領域[UA
S2(PH05)]を、調節機能を有するUASの可能な候補と
する。UAS1(PH05)は、268bp BamH I−Cla Iフラグメン
トに含まれ、他方UAS1(PH05)およびUAS2(PH05)は共に36
8bp BamH I−BstE IIフラグメントに含まれる。これら
の2種類のフラグメントはそれぞれ、TATAボックスおよ
びGAPDHの転写開始部位を含む2種類の異なるGAPDH下流
のプロモーター要素に融合する。
ーターの制御下でのデスルファトヒルジンの発現 実施例23は、PH05遺伝子の位置−365付近の領域[UAS
1(PH05)]、および位置−180付近のもう一つの領域[UA
S2(PH05)]を、調節機能を有するUASの可能な候補と
する。UAS1(PH05)は、268bp BamH I−Cla Iフラグメン
トに含まれ、他方UAS1(PH05)およびUAS2(PH05)は共に36
8bp BamH I−BstE IIフラグメントに含まれる。これら
の2種類のフラグメントはそれぞれ、TATAボックスおよ
びGAPDHの転写開始部位を含む2種類の異なるGAPDH下流
のプロモーター要素に融合する。
(a)酵母遺伝子ライブラリーの構成 野生型サッカロミセス・セレビシエーS228C株から得ら
れる総量が30μgの高分子量酵母DNA[M.V.Olsen
ら、J.Mol.Biol.、第132巻、387頁(1979年)]を、2
単位のEcoR Iメチラーゼ(New England Biolabs)を用い
て、供給業者が勧める方法に従って、250μlのEcoR1 u
チル化緩衝液中で37℃で30分間インキュベートす
る。DNAをエタノールで沈澱させ、500μlの25m
Mトリス・HCl(pH8.5),2.5mM MgCl2(EcoR I*
緩衝液)[H.Meyer、FEBS Lett.、第90巻、341頁(197
9年)]に再分散し、そしてEcoR I(Boehringer)で消化
して、DNAフラグメントの分布が30〜50kbの範囲に
最大値を有するようにする(λDNAのXho I消化は適
当な33kbおよび17kbマーカーを提供する)。Ec
oR I*条件下で消化される酵母DNAはシュークロース
勾配〔5〜20%シュークロース/10mMトリス・H
Cl(pH7.5)および1mM EDTA〕で、SW40ローター中
で38,000rpmにて6時間サイズ分画する。0.4mlず
つの30個の分画を、勾配の上部から集める。分画16
は、大きさが30〜40kbのDNAフラグメントを含む。
この分画のDNA(3μg)をエタノールで沈澱させ、
EcoR Iで線状化された1μgのコスミドベクターpYcl
[B.Hohnら、「Genetic Engineering」、第2巻、169
頁、ニューヨーク、1980年]に、合計容量15μl中
で、15℃で16時間連結させる。連結は、300単位の
T4DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いて、
業者により記載されている緩衝液系を使用して行う。D
NAを生体外でバクテリオファージλ[B.Hohn、「Meth
ods in Enzymology」、第68巻、299頁、ニューヨー
ク、1979年]にパッケージし、そして集成されたファー
ジを用いてE.コリHB101株を形質導入する(r K -、
m K -、leu -、pro -、recA)。形質導入の効率は、1μg
のpYclベクター当たり約5000個のアンピシリン耐性コロ
ニーである。3000個のampRコロニーを採取し、そして10
0μg/mlのアンピシリンを含むLB培地[10gのB
acto−Tryptone(Difco)、5gのBacto Yeast Extract(D
ifco)および10gのNaCl]中でマイクロタイター・デ
ィッシュのウェルでそれぞれ増殖させる。
れる総量が30μgの高分子量酵母DNA[M.V.Olsen
ら、J.Mol.Biol.、第132巻、387頁(1979年)]を、2
単位のEcoR Iメチラーゼ(New England Biolabs)を用い
て、供給業者が勧める方法に従って、250μlのEcoR1 u
チル化緩衝液中で37℃で30分間インキュベートす
る。DNAをエタノールで沈澱させ、500μlの25m
Mトリス・HCl(pH8.5),2.5mM MgCl2(EcoR I*
緩衝液)[H.Meyer、FEBS Lett.、第90巻、341頁(197
9年)]に再分散し、そしてEcoR I(Boehringer)で消化
して、DNAフラグメントの分布が30〜50kbの範囲に
最大値を有するようにする(λDNAのXho I消化は適
当な33kbおよび17kbマーカーを提供する)。Ec
oR I*条件下で消化される酵母DNAはシュークロース
勾配〔5〜20%シュークロース/10mMトリス・H
Cl(pH7.5)および1mM EDTA〕で、SW40ローター中
で38,000rpmにて6時間サイズ分画する。0.4mlず
つの30個の分画を、勾配の上部から集める。分画16
は、大きさが30〜40kbのDNAフラグメントを含む。
この分画のDNA(3μg)をエタノールで沈澱させ、
EcoR Iで線状化された1μgのコスミドベクターpYcl
[B.Hohnら、「Genetic Engineering」、第2巻、169
頁、ニューヨーク、1980年]に、合計容量15μl中
で、15℃で16時間連結させる。連結は、300単位の
T4DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いて、
業者により記載されている緩衝液系を使用して行う。D
NAを生体外でバクテリオファージλ[B.Hohn、「Meth
ods in Enzymology」、第68巻、299頁、ニューヨー
ク、1979年]にパッケージし、そして集成されたファー
ジを用いてE.コリHB101株を形質導入する(r K -、
m K -、leu -、pro -、recA)。形質導入の効率は、1μg
のpYclベクター当たり約5000個のアンピシリン耐性コロ
ニーである。3000個のampRコロニーを採取し、そして10
0μg/mlのアンピシリンを含むLB培地[10gのB
acto−Tryptone(Difco)、5gのBacto Yeast Extract(D
ifco)および10gのNaCl]中でマイクロタイター・デ
ィッシュのウェルでそれぞれ増殖させる。
(b)酵母GAPDH遺伝子の単離 上記の遺伝子ライブラリーを、次の構造: 5′-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3′ を有する合成オリゴヌクレオチド[ホスホトリエステル
法を用いて調製:K.Itakuraら、Recl.Trav.Chim.、Pays-
Bas 、98,537(1979)]によりスクリーニングする。10μ
gのオリゴヌクレオチドを、Maniatisらにより記載され
た方法[「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor
Lab.、1982年、125頁]により、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(Boehringer)と共に10μlのγ−32P−ATP
(3000Ci/mM、10μCi/μl Amersham)を用いて
全容積50μl中ででキナーゼ処理をする。コロニーハ
イブリダイゼーションは、上記文献(312頁)に記載の
方法で行う。Kodak K−5X線フィルムを用いるオー
トラジオグラフィにより、陽性クローンを検出する。プ
ラスミドDNAを単離して、GAPDHをコードする2100bp
Hind IIIフラグメントを含むハイブリッドクローンを得
る[J.P.Hollandら、J.Biol.Chem. 254,9839(1979)]。
クローン化されたDNAが真性であることは、2本鎖D
NAについてG.F.Hong[Bioscience Reports 1,243(198
1)]により記載されたジデオキシ配列決定法との組み合
わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるDNA
配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化GA
PDH遺伝子(第9図参照)は、Hollandらが報告している
g a p491と同じ配列を有する[J.Biol.Chem. 255,2596
(1980)]。
法を用いて調製:K.Itakuraら、Recl.Trav.Chim.、Pays-
Bas 、98,537(1979)]によりスクリーニングする。10μ
gのオリゴヌクレオチドを、Maniatisらにより記載され
た方法[「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor
Lab.、1982年、125頁]により、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(Boehringer)と共に10μlのγ−32P−ATP
(3000Ci/mM、10μCi/μl Amersham)を用いて
全容積50μl中ででキナーゼ処理をする。コロニーハ
イブリダイゼーションは、上記文献(312頁)に記載の
方法で行う。Kodak K−5X線フィルムを用いるオー
トラジオグラフィにより、陽性クローンを検出する。プ
ラスミドDNAを単離して、GAPDHをコードする2100bp
Hind IIIフラグメントを含むハイブリッドクローンを得
る[J.P.Hollandら、J.Biol.Chem. 254,9839(1979)]。
クローン化されたDNAが真性であることは、2本鎖D
NAについてG.F.Hong[Bioscience Reports 1,243(198
1)]により記載されたジデオキシ配列決定法との組み合
わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるDNA
配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化GA
PDH遺伝子(第9図参照)は、Hollandらが報告している
g a p491と同じ配列を有する[J.Biol.Chem. 255,2596
(1980)]。
(c)GAPDH下流プロモーター要素の調製 GAPDH遺伝子のATGからの位置−27〜−675を含む649b
p Taq Iフラグメント(第9図参照)を、Taq I(New Eng
land Biolabs)で上記ハイブリッドプラスミドを消化
し、DNAフラグメントを1.2%ソフト・アガロースゲ
ル上で分離し、そして熱フェノールによりDNAを抽出
することにより単離する(実施例23参照)。Taq Iフ
ラグメントのクローン化はpBR322のCla I部位中に為さ
れる。すなわち、1μgのpBR322を3単位のCla I(New
England Biolabs)を用いて、業者により記載された方法
で切断する。300ngのフェノール処理されそして切断
されたベクターを200単位のT4DNAリガーゼを用い
て、約300ngのインサートDNA(649bp Taqフラグメ
ント)に全容積20μl中で連結する。E.コリHB101
を形質転換してアンピシリン耐性にし、プラスミドDN
Aを調製し、そして制限分析によって分析する。[Taq
I,Dra I]。Taq Iフラグメントの方向は、制限エンドヌ
クレアーゼDra IをプラスミドのBamH I部位と組み合わ
せて用いることにより確立され、pBR322のHind III部位
の近くに位置−675の部位を有するTaq Iプラスミドを選
択する。pBR322/GAPDHと命名されるこのプラスミド
を、BamH I(New England Biolabs)を用いて線状化し、
そしてBal31を用いる消化を、Bal IIリンカー(5−CAG
ATCTG−3、New England Biolabs)を用いることを除
き、実施例23と同様にして行い、そして消化されたプ
ラスミドを5μg/mlの濃度で、全容量20μl中で
直接環状化する。Bal31で短縮されたTaq Iフラグメント
の大きさを、(Bgl IIおよびHind IIIを用いる)制限分
析により決定する。2つのクローンが選択され、これら
はそれぞれATG上流からGAPDHプロモータへと200bpお
よび265pb伸びるDNAフラグメントを含む。これらの
フラグメントは、約−140bpに仮定のTATAボックスを有
する。これらのクローンはなお、DNAのpBR322由来部
分に複製開始点を含み、それぞれpGAPDH−FおよびpGAP
DH−Eと命名される。
p Taq Iフラグメント(第9図参照)を、Taq I(New Eng
land Biolabs)で上記ハイブリッドプラスミドを消化
し、DNAフラグメントを1.2%ソフト・アガロースゲ
ル上で分離し、そして熱フェノールによりDNAを抽出
することにより単離する(実施例23参照)。Taq Iフ
ラグメントのクローン化はpBR322のCla I部位中に為さ
れる。すなわち、1μgのpBR322を3単位のCla I(New
England Biolabs)を用いて、業者により記載された方法
で切断する。300ngのフェノール処理されそして切断
されたベクターを200単位のT4DNAリガーゼを用い
て、約300ngのインサートDNA(649bp Taqフラグメ
ント)に全容積20μl中で連結する。E.コリHB101
を形質転換してアンピシリン耐性にし、プラスミドDN
Aを調製し、そして制限分析によって分析する。[Taq
I,Dra I]。Taq Iフラグメントの方向は、制限エンドヌ
クレアーゼDra IをプラスミドのBamH I部位と組み合わ
せて用いることにより確立され、pBR322のHind III部位
の近くに位置−675の部位を有するTaq Iプラスミドを選
択する。pBR322/GAPDHと命名されるこのプラスミド
を、BamH I(New England Biolabs)を用いて線状化し、
そしてBal31を用いる消化を、Bal IIリンカー(5−CAG
ATCTG−3、New England Biolabs)を用いることを除
き、実施例23と同様にして行い、そして消化されたプ
ラスミドを5μg/mlの濃度で、全容量20μl中で
直接環状化する。Bal31で短縮されたTaq Iフラグメント
の大きさを、(Bgl IIおよびHind IIIを用いる)制限分
析により決定する。2つのクローンが選択され、これら
はそれぞれATG上流からGAPDHプロモータへと200bpお
よび265pb伸びるDNAフラグメントを含む。これらの
フラグメントは、約−140bpに仮定のTATAボックスを有
する。これらのクローンはなお、DNAのpBR322由来部
分に複製開始点を含み、それぞれpGAPDH−FおよびpGAP
DH−Eと命名される。
(d)PH05のUAS1(PH05)を伴う下流GAPDHプロモーター
要素とデスルファトヒルジン蛋白質コード領域との結合 I)GAPDH要素 −27の位置のTaq I部位からGAPDH遺伝子のATGに直
接隣接する位置までGAPDHプロモーター要素を延長する
ため、次の構造を有する2個の合成相補的オリゴヌクレ
オチドを合成する。
要素とデスルファトヒルジン蛋白質コード領域との結合 I)GAPDH要素 −27の位置のTaq I部位からGAPDH遺伝子のATGに直
接隣接する位置までGAPDHプロモーター要素を延長する
ため、次の構造を有する2個の合成相補的オリゴヌクレ
オチドを合成する。
5′CGAATAAACACACATAAATAAAG 3′ 3′ TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5′ これらのオリゴヌクレオチドは、位置−26から位置−
5への純粋なGAPDHプロモータを提供し、末端EcoR I部
位を生じさせる。2μgの2種類のBal31単離体(実施
例24cから)(プラスミドpGAPDH−Eおよび−F)を6
単位のTap Iを用いて50μl中で消化し、生成する混
合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そして1
0μlの水に再分散する。合成オリゴヌクレオチドを、
10mMトリス・HCl(pH7.5),10mM MgCl2,5
0mM NaClを含有する100μl溶液中で各単鎖2μl
を混合し、90℃で3分間加熱し、溶液を徐々に室温に
まで冷却することにより(約3時間以内)アニールす
る。Taq I消化された各プラスミド1μgを約20倍モ
ル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレオチドと、80
0単位のT4DNAリガーゼを用いて、20μlの容積
中で18時間混合する。全混合物を3単位のBal II(New
England Biolabs)で消化し、DNAフラグメントを1.5
%ソフトアガロースゲル上で分離する。約200bpおよび2
65bpのBal II−EcoR Iフラグメントをゲルから切り取
り、抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
5への純粋なGAPDHプロモータを提供し、末端EcoR I部
位を生じさせる。2μgの2種類のBal31単離体(実施
例24cから)(プラスミドpGAPDH−Eおよび−F)を6
単位のTap Iを用いて50μl中で消化し、生成する混
合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そして1
0μlの水に再分散する。合成オリゴヌクレオチドを、
10mMトリス・HCl(pH7.5),10mM MgCl2,5
0mM NaClを含有する100μl溶液中で各単鎖2μl
を混合し、90℃で3分間加熱し、溶液を徐々に室温に
まで冷却することにより(約3時間以内)アニールす
る。Taq I消化された各プラスミド1μgを約20倍モ
ル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレオチドと、80
0単位のT4DNAリガーゼを用いて、20μlの容積
中で18時間混合する。全混合物を3単位のBal II(New
England Biolabs)で消化し、DNAフラグメントを1.5
%ソフトアガロースゲル上で分離する。約200bpおよび2
65bpのBal II−EcoR Iフラグメントをゲルから切り取
り、抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
プラスミドpGAPDH−EをBgl IIおよびEcoR Iを用いて消
化し、大きな(約3.5kb)フラグメントを単離する。
このフラグメントをベクターとして用いて、上記のよう
な連結、形質転換およびプラスミド単離条件を用いなが
ら、前記265bpおよび200bpのBal II−EcoR Iフラグメン
トをクローン化する。生成したプラスミドは、pGAPDH−
ELおよびpGAPDH−FLと命名される。プラスミドpGAPDH−
ELおよびpGAPDH−FL中のクローン化Bgl II−EcoR Iフラ
グメントのDNA配列を第11図に示す。フラグメント
の正確な大きさはそれぞれ66bpおよび201bpである。
化し、大きな(約3.5kb)フラグメントを単離する。
このフラグメントをベクターとして用いて、上記のよう
な連結、形質転換およびプラスミド単離条件を用いなが
ら、前記265bpおよび200bpのBal II−EcoR Iフラグメン
トをクローン化する。生成したプラスミドは、pGAPDH−
ELおよびpGAPDH−FLと命名される。プラスミドpGAPDH−
ELおよびpGAPDH−FL中のクローン化Bgl II−EcoR Iフラ
グメントのDNA配列を第11図に示す。フラグメント
の正確な大きさはそれぞれ66bpおよび201bpである。
II)UAS1(PH05)制御要素 3μgのプラスミドp31/Y(欧州特許出願第100,56
1号明細書参照)を6単位のCla I(New England Biolab
s)を用いて消化する。3′の欠損端を、Maniatis(上
記)の方法に従い、E.コリDNAポリメラーゼIのKl
enowフラグメント(Bethedsa Research Laboratories)を
用いてフィルインする。Bal IIリンカー(5′−CAGATC
TG−3′)を、例23に記載したのと同様に付加する。
DNAをSal IおよびBgl II((New England Biolabs)で
消化し、1%ソフトアガロースゲル上で処理する。548b
pフラグメントをゲルから切り取り、フェノール抽出し
て、上記のようにエタノール沈澱する。
1号明細書参照)を6単位のCla I(New England Biolab
s)を用いて消化する。3′の欠損端を、Maniatis(上
記)の方法に従い、E.コリDNAポリメラーゼIのKl
enowフラグメント(Bethedsa Research Laboratories)を
用いてフィルインする。Bal IIリンカー(5′−CAGATC
TG−3′)を、例23に記載したのと同様に付加する。
DNAをSal IおよびBgl II((New England Biolabs)で
消化し、1%ソフトアガロースゲル上で処理する。548b
pフラグメントをゲルから切り取り、フェノール抽出し
て、上記のようにエタノール沈澱する。
III)デスルファトヒルジンをコードするDNA プラスミドpJDB207/PH05(Eco)−HIRの造成(第12図
参照) USA(PH05)−GAPDHハイブリッドプロモーター要素をP
H05シグナル配列を含むデスルファトヒルジンのコード
領域に好都合に接続するため(プラスミドpJDB207/PH0
5−HIRのように)、EcoR I制限部位を、mRNA開始部
位とコード領域のATGとの間の5′非翻訳領域に導入
する。
参照) USA(PH05)−GAPDHハイブリッドプロモーター要素をP
H05シグナル配列を含むデスルファトヒルジンのコード
領域に好都合に接続するため(プラスミドpJDB207/PH0
5−HIRのように)、EcoR I制限部位を、mRNA開始部
位とコード領域のATGとの間の5′非翻訳領域に導入
する。
15μgのプラスミドpJDB207/PH05−HIR(16d参
照)を、制限エンドヌクレアーゼDraI(Boehringer)で消
化する。生成する4個のフラグメントを0.8%アガロー
スゲル上トリス・ホウ酸・EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離
する。ゲルから4.2kbのDNAフラグメントを回収
し、電気溶出し、エタノール沈澱する。DNAを水に再
分散して、0.6mg/mlの濃度にする。
照)を、制限エンドヌクレアーゼDraI(Boehringer)で消
化する。生成する4個のフラグメントを0.8%アガロー
スゲル上トリス・ホウ酸・EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離
する。ゲルから4.2kbのDNAフラグメントを回収
し、電気溶出し、エタノール沈澱する。DNAを水に再
分散して、0.6mg/mlの濃度にする。
次の式: 5′−AATTCGATTACCAATGTTT−3′ 3′− GCTAATGGTTACAAA−5′ の2種類の合成オリゴヌクレオチド(2.3μgおよび2.9
μg)をそれぞれ20μlの60mMトリス(pH7.5),
10mM MgCl2,5mM DTT,0.5mM ATPお
よび20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehrin
ger)中でキナーゼ処理をする。37℃で45分後に、こ
れらの反応混合物を一緒にし、75℃で10分間加熱
し、そして室温に放冷する。アニールしたオリゴヌクレ
オチドリンカーを−20℃で貯蔵する。
μg)をそれぞれ20μlの60mMトリス(pH7.5),
10mM MgCl2,5mM DTT,0.5mM ATPお
よび20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehrin
ger)中でキナーゼ処理をする。37℃で45分後に、こ
れらの反応混合物を一緒にし、75℃で10分間加熱
し、そして室温に放冷する。アニールしたオリゴヌクレ
オチドリンカーを−20℃で貯蔵する。
6.5μg(2.3pモル)の4.2kb DraI DNAフラグ
メントを70倍過剰量のキナーゼ処理してアニーリング
したオリゴヌクレオチドリンカーと共に50μlの60
mMトリス(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DT
T,3.5mM ATPおよび800単位のT4DNAリガー
ゼ(Biolabs)中でインキュベートする。T4DNAリガ
ーゼを85℃で10分間不活性化した後、過剰のリンカ
ーを10mM EDTA,300mM酢酸ナトリウム(pH6.0)お
よび0.5容のイソプロパノールの存在でDNAを沈澱さ
せることにより除去する。DNAをEcoR IとHind IIIと
で消化する。生成するフラグメントを1%アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離す
る。643bpフラグメントを、電気溶出およびエタノール
沈澱によりゲルから回収する。DNAを再分散させて、
濃度を0.1pM/μlにする。EcoR I−Hind IIIフラグ
メントはPH05シグナル配列、デスルファトヒルジンのコ
ード配列およびPH05転写ターミーネーターを含む。
メントを70倍過剰量のキナーゼ処理してアニーリング
したオリゴヌクレオチドリンカーと共に50μlの60
mMトリス(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DT
T,3.5mM ATPおよび800単位のT4DNAリガー
ゼ(Biolabs)中でインキュベートする。T4DNAリガ
ーゼを85℃で10分間不活性化した後、過剰のリンカ
ーを10mM EDTA,300mM酢酸ナトリウム(pH6.0)お
よび0.5容のイソプロパノールの存在でDNAを沈澱さ
せることにより除去する。DNAをEcoR IとHind IIIと
で消化する。生成するフラグメントを1%アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離す
る。643bpフラグメントを、電気溶出およびエタノール
沈澱によりゲルから回収する。DNAを再分散させて、
濃度を0.1pM/μlにする。EcoR I−Hind IIIフラグ
メントはPH05シグナル配列、デスルファトヒルジンのコ
ード配列およびPH05転写ターミーネーターを含む。
534bp PH05プロモーターフラグメントをプラスミドp31
/R(欧州特許出願第100,561号明細書)から単離す
る。
/R(欧州特許出願第100,561号明細書)から単離す
る。
10μgのp31/Rを制限エンドヌクレアーゼEcoR Iと
BamH Iとで消化する。生成する3個のフラグメントを0.
6%の低融点アガロースゲル上トリス−ホウ酸EDTA緩衝
液(pH8.3)中で分離する。534bp BamH I−EcoR Iフラグ
メントを分離する。これはmRNA開始部位を含むPH05
プロモーターを含有する。
BamH Iとで消化する。生成する3個のフラグメントを0.
6%の低融点アガロースゲル上トリス−ホウ酸EDTA緩衝
液(pH8.3)中で分離する。534bp BamH I−EcoR Iフラグ
メントを分離する。これはmRNA開始部位を含むPH05
プロモーターを含有する。
ベクターフラグメントをプラスミドpJDB207/PH05−HIR
から単離する(実施例16d)。このプラスミド6μgを
BamH IとHind IIIとで消化する。大きな6.5kbのBamH
I−Hind IIIフラグメントを、0.65低融点アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で小さなフ
ラグメントから分離する。
から単離する(実施例16d)。このプラスミド6μgを
BamH IとHind IIIとで消化する。大きな6.5kbのBamH
I−Hind IIIフラグメントを、0.65低融点アガロースゲ
ル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で小さなフ
ラグメントから分離する。
適切な接着末端を有する上記の3個のDNAフラグメン
トを以下の反応で連結する。0.2pモル(70ng)の5
34bp BamH I−EcoR I PH05プロモーターフラグメント、
0.2pモル(85ng)の643bp EcoR I−Hind IIIフラ
グメント、0.2pモル(85ng)の643bp EcoR I−Hin
d IIIフラグメント(ヒルジンコード配列)、および0.1
pモル(0.4μg)の6.5kb BamH I−Hind IIIベクター
フラグメントを、10μlの60mMトリス(pH7.5),
10mM MgCl2,5mM DTT、1mM ATPお
よび400単位のT4DNAリガーゼ中で15℃で6時間
連結する。連結混合物1μlを100μlのカルシウム処
理した形質転換コンピテントE.コリHB101細胞に加え
る。12個の形質転換したampRコロニーをそれぞれ100
μg/mlアンピシリンを含むLB培地で増殖させる。
プラスミドDNAをHolmesらの方法により調製し[Ana
l.Biochem.114,(1981)193]、EcoR I及びBamH I制限酵
素により分析する。予想される制限フラグメントを有す
るクローンを単離し、そしてpJDB207/PH05(Eco)−HIR
と命名する。
トを以下の反応で連結する。0.2pモル(70ng)の5
34bp BamH I−EcoR I PH05プロモーターフラグメント、
0.2pモル(85ng)の643bp EcoR I−Hind IIIフラ
グメント、0.2pモル(85ng)の643bp EcoR I−Hin
d IIIフラグメント(ヒルジンコード配列)、および0.1
pモル(0.4μg)の6.5kb BamH I−Hind IIIベクター
フラグメントを、10μlの60mMトリス(pH7.5),
10mM MgCl2,5mM DTT、1mM ATPお
よび400単位のT4DNAリガーゼ中で15℃で6時間
連結する。連結混合物1μlを100μlのカルシウム処
理した形質転換コンピテントE.コリHB101細胞に加え
る。12個の形質転換したampRコロニーをそれぞれ100
μg/mlアンピシリンを含むLB培地で増殖させる。
プラスミドDNAをHolmesらの方法により調製し[Ana
l.Biochem.114,(1981)193]、EcoR I及びBamH I制限酵
素により分析する。予想される制限フラグメントを有す
るクローンを単離し、そしてpJDB207/PH05(Eco)−HIR
と命名する。
IV)UAS1(PH05)−GAPDHハイブリッドプロモーターのデ
スルファトヒルジン蛋白質コード領域への連結 15μgのプラスミドpJDB207/PH05(Eco)(−HIR(実
施例24dIII参照)を、EcoR IとHind IIIとで消化す
る。DNAフラグメントを1%アガロースゲル上トリス
−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離する。643bpフラ
グメントをゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノ
ールで沈澱される。DNAを水に再分散し、0.1pM/
μlの濃度とする。
スルファトヒルジン蛋白質コード領域への連結 15μgのプラスミドpJDB207/PH05(Eco)(−HIR(実
施例24dIII参照)を、EcoR IとHind IIIとで消化す
る。DNAフラグメントを1%アガロースゲル上トリス
−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離する。643bpフラ
グメントをゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノ
ールで沈澱される。DNAを水に再分散し、0.1pM/
μlの濃度とする。
6μgのプラスミドpHDB207/PH05−HIRを、制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIとSal Iとで完全に消化する。6.3
kbフラグメント(ベクター部分)をソフトアガロース
ゲル電気泳動、フェノール抽出、およびエタノール沈澱
により単離する。ベクターDNAフラグメントを水に再
分散し、0.05pモル/μlの濃度にする。
ヌクレアーゼHind IIIとSal Iとで完全に消化する。6.3
kbフラグメント(ベクター部分)をソフトアガロース
ゲル電気泳動、フェノール抽出、およびエタノール沈澱
により単離する。ベクターDNAフラグメントを水に再
分散し、0.05pモル/μlの濃度にする。
10μgのプラスミドpGAPDH−EL(実施例24d I参
照)をBal IIとEcoR Iとで消化する。266bp Bal II−Ec
oR Iフラグメントを1.2%アガロースゲル上トリス−ホ
ウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離し、ゲルから電気溶
出し、そしてエタノールで沈澱させる。DNAを水に再
分散され、0.3pモル/μlの濃度にする。
照)をBal IIとEcoR Iとで消化する。266bp Bal II−Ec
oR Iフラグメントを1.2%アガロースゲル上トリス−ホ
ウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離し、ゲルから電気溶
出し、そしてエタノールで沈澱させる。DNAを水に再
分散され、0.3pモル/μlの濃度にする。
0.3pモルのUAS1(PH05)(実施例24dII)を含んで成る5
48bp Sal I−Bal IIフラグメント、0.3pモルのpGAPDH
−ELの266bp Bal II−EcoR Iフラグメント、0.3pモル
のpJDB207/PH05(Ec0)−HIRの643bp EcoR I−Hind III
フラグメント、および0.12pモルの6.3kbSal I−Hind
IIIベクターフラグメントを、20μlの50mMトリ
ス(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1mM
ATPおよび400単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)
中で15℃で6時間連結させる。連結混合物1μlおよ
び3μlを100μlのカルシウム処理したE.コリHB101
細胞に加える。ampRコロニーからのプラスミドの単離お
よびSal I、Bal I、EcoR IおよびHind IIIを用いる制限
分析を、上記のように行う(実施例24dIII参照)。1
個の陽性クローンを選択し、pJDB207/PAPEL−HIR(UAS
1)と命名する。
48bp Sal I−Bal IIフラグメント、0.3pモルのpGAPDH
−ELの266bp Bal II−EcoR Iフラグメント、0.3pモル
のpJDB207/PH05(Ec0)−HIRの643bp EcoR I−Hind III
フラグメント、および0.12pモルの6.3kbSal I−Hind
IIIベクターフラグメントを、20μlの50mMトリ
ス(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1mM
ATPおよび400単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)
中で15℃で6時間連結させる。連結混合物1μlおよ
び3μlを100μlのカルシウム処理したE.コリHB101
細胞に加える。ampRコロニーからのプラスミドの単離お
よびSal I、Bal I、EcoR IおよびHind IIIを用いる制限
分析を、上記のように行う(実施例24dIII参照)。1
個の陽性クローンを選択し、pJDB207/PAPEL−HIR(UAS
1)と命名する。
同様な造成を、pGAPDH−FLから分離される201bp Bal II
−EcoR Iフラグメントを用いて行う。1個の選択された
プラスミドをpJDB207/PAPFL−HIR(UAS1)と命名する。
−EcoR Iフラグメントを用いて行う。1個の選択された
プラスミドをpJDB207/PAPFL−HIR(UAS1)と命名する。
(V)UAS1(PH05)−UAS2(PH05)−GAPDHハイブリッドプ
ロモーターのデスルファトヒルジン蛋白質コード領域へ
の連結 3μgずつのプラスミドpHDB207/PAPEL−HIR(UAS1)お
よびpJDB207/PAPFL−HIR(UAS1)を、それぞれBag IIで
消化する。フェノール抽出およびエノタール沈澱の後、
Maniatisらの方法に従い、DNAの3′の欠損末端を、
E.コリDNAポリメラーゼ(Klenowフラグメント、Be
thesda Research Laboratories)との反応によりフィル
インする(上記)。酵素を70℃で10分間不活性化さ
せる。DNAを更にSal Iで消化して、大きな7.2kbフ
ラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱により単離する。各フラグ
メントを水に再分散させ、0.05pモル/μlの濃度にす
る。フラグメントはヒルジンコード領域、ほとんどのベ
クター配列およびpGAPDH−ELまたはpGAPDH−FLから単離
される2種類の異なるGAPDHプロモーター要素を含む。
ロモーターのデスルファトヒルジン蛋白質コード領域へ
の連結 3μgずつのプラスミドpHDB207/PAPEL−HIR(UAS1)お
よびpJDB207/PAPFL−HIR(UAS1)を、それぞれBag IIで
消化する。フェノール抽出およびエノタール沈澱の後、
Maniatisらの方法に従い、DNAの3′の欠損末端を、
E.コリDNAポリメラーゼ(Klenowフラグメント、Be
thesda Research Laboratories)との反応によりフィル
インする(上記)。酵素を70℃で10分間不活性化さ
せる。DNAを更にSal Iで消化して、大きな7.2kbフ
ラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フェノー
ル抽出およびエタノール沈澱により単離する。各フラグ
メントを水に再分散させ、0.05pモル/μlの濃度にす
る。フラグメントはヒルジンコード領域、ほとんどのベ
クター配列およびpGAPDH−ELまたはpGAPDH−FLから単離
される2種類の異なるGAPDHプロモーター要素を含む。
プラスミドp31/Y(欧州特許出願第100,561号明細
書)を、上記のようにBstE IIで消化し、E.コリDN
Aポリメラーゼ(Klenowフラグメント)と共にインキュ
ベートし、そしてSal Iで切断する。649bpフラグメント
をソフトアガロースゲル上で分離し、フェノール抽出お
よびエタノール沈澱により回収する。
書)を、上記のようにBstE IIで消化し、E.コリDN
Aポリメラーゼ(Klenowフラグメント)と共にインキュ
ベートし、そしてSal Iで切断する。649bpフラグメント
をソフトアガロースゲル上で分離し、フェノール抽出お
よびエタノール沈澱により回収する。
UAS1−UAS2(PH05)プロモーター要素を含んで成るp31/
Yの649bpフラグメント0.3pモル、および0.15pモルの
7.2kbフラグメントの一方を、上記のように連結し
て、E・コリHB101中に形質転換する。プラスミドをamp
Rコロニーから調製し、そして制限酵素により分析す
る。単一クローンを選択し、それらのプラスミドDNA
をpJDB207/PAPEL−HIR(UAS1+UAS2)およびpJDB207/PAP
FL−HIR(UAS1+UAS2)と命名する。
Yの649bpフラグメント0.3pモル、および0.15pモルの
7.2kbフラグメントの一方を、上記のように連結し
て、E・コリHB101中に形質転換する。プラスミドをamp
Rコロニーから調製し、そして制限酵素により分析す
る。単一クローンを選択し、それらのプラスミドDNA
をpJDB207/PAPEL−HIR(UAS1+UAS2)およびpJDB207/PAP
FL−HIR(UAS1+UAS2)と命名する。
実施例25.デスルファトヒルジン蛋白質コード配列に
融合されるGAPDHプロモーター要素 (実施例24d Iに記載のように)異なる長さの2個のGAP
DHプロモーター要素をPH05シグナル配列を含むデスルフ
ァトヒルジン蛋白質コード領域に連結する。
融合されるGAPDHプロモーター要素 (実施例24d Iに記載のように)異なる長さの2個のGAP
DHプロモーター要素をPH05シグナル配列を含むデスルフ
ァトヒルジン蛋白質コード領域に連結する。
2個の要素(266bpおよび201bp)は、それぞれGAPDH TA
TAボックス、mRNA開始部位およびATに富む5′非
翻訳領域を含んで成る。これらの要素のヌクレオチド配
列を、第10図に示す。
TAボックス、mRNA開始部位およびATに富む5′非
翻訳領域を含んで成る。これらの要素のヌクレオチド配
列を、第10図に示す。
これらの要素の3′末端はいずれも、GAPDH遺伝子のA
TG(これにEcoR I認識部位(実施例24d Iにおいて導
入されるオリゴヌクレオチドリンカー参照)が続く)か
らの位置−5にあり、5′末端はそれぞれATGから位
置−198および−263にありこれらの位置でBal IIリンカ
ーが付加されている。
TG(これにEcoR I認識部位(実施例24d Iにおいて導
入されるオリゴヌクレオチドリンカー参照)が続く)か
らの位置−5にあり、5′末端はそれぞれATGから位
置−198および−263にありこれらの位置でBal IIリンカ
ーが付加されている。
Bal II−EcoR Iプロモーターフラグメントを、PH05シグ
ナル配列およびデスルファトヒルジンをコードする配列
を有するEcoR I−Hind IIIフラグメント、およびHind I
II−BamH Iベクターフラグメントに連結する。
ナル配列およびデスルファトヒルジンをコードする配列
を有するEcoR I−Hind IIIフラグメント、およびHind I
II−BamH Iベクターフラグメントに連結する。
6μgのプラスミドpHDB207/PH05−HIRを制限エンドヌ
クレアーゼHind IIIおよびBamH Iで完全に消化する。大
きな6.5kbフラグメント(ベクター部)を0.8%アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分
離し、ゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、そして
エタノール沈澱する。ベクターDNAフラグメントを水
に再分散して、0.05pモル/μlの濃度にする。
クレアーゼHind IIIおよびBamH Iで完全に消化する。大
きな6.5kbフラグメント(ベクター部)を0.8%アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分
離し、ゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、そして
エタノール沈澱する。ベクターDNAフラグメントを水
に再分散して、0.05pモル/μlの濃度にする。
0.3pモルのpGAPDH−ELの266bp Bg1 II−EcoR Iフラグ
メント(実施例24d IV)、0.3pモルのpJDB207/PH05(E
co)−HIRの643bp EcoR I−Hind IIIフラグメント(実施
例24d III)、および0.1pモルの6.5kb Hind III−B
amH Iベクターフラグメントを、10μlの60mMト
リス(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1m
M ATPおよび400単位のT4DNAリガーゼ(Biolab
s)中で15℃で6時間連結させる。連結混合物1μl
を、100μlのカルシウム処理したE.コリHB101細胞に
加える。ampRコロニーからのプロモーターの単離および
EcoR Iを用いる制限分析を、実施例24d IIIに記載した
のと同様に行う。一つの陽性クローンを選択して、その
プラスミドDNAをpHDB207/GAPEL−HIRと称する。
メント(実施例24d IV)、0.3pモルのpJDB207/PH05(E
co)−HIRの643bp EcoR I−Hind IIIフラグメント(実施
例24d III)、および0.1pモルの6.5kb Hind III−B
amH Iベクターフラグメントを、10μlの60mMト
リス(pH7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1m
M ATPおよび400単位のT4DNAリガーゼ(Biolab
s)中で15℃で6時間連結させる。連結混合物1μl
を、100μlのカルシウム処理したE.コリHB101細胞に
加える。ampRコロニーからのプロモーターの単離および
EcoR Iを用いる制限分析を、実施例24d IIIに記載した
のと同様に行う。一つの陽性クローンを選択して、その
プラスミドDNAをpHDB207/GAPEL−HIRと称する。
同様な造成をpGAPDH−FLから単離した210bp Bgl II−Ec
oR Iフラグメントを用いて行う。一つの選択されたクロ
ーンのプラスミドDNAをpJDB207/GAPFL−HIRと呼
ぶ。
oR Iフラグメントを用いて行う。一つの選択されたクロ
ーンのプラスミドDNAをpJDB207/GAPFL−HIRと呼
ぶ。
実施例26.分泌されるデスルファトヒルジンのコード
配列の2本鎖インサートを有する発現プラスミドの造成 以下の造成は、直列(タンデム)の頭と尾の配置で重複
されたDNAフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、(それぞれ実施例24および25に記載の
ように)GAPDHプロモーターまたはハイブリッドPH05−G
APDHプロモーター、POH5シグナル配列、デスルファトヒ
ルジンのコード配列、およびPH05転写ターナミネーター
からなる。
配列の2本鎖インサートを有する発現プラスミドの造成 以下の造成は、直列(タンデム)の頭と尾の配置で重複
されたDNAフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、(それぞれ実施例24および25に記載の
ように)GAPDHプロモーターまたはハイブリッドPH05−G
APDHプロモーター、POH5シグナル配列、デスルファトヒ
ルジンのコード配列、およびPH05転写ターナミネーター
からなる。
7μgのプラスミドpHDB207/GAPEL−HIRを、制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIで消化する。3′欠損末端を、
Maniatis(上記)の方法によりE.コリDNAポリメラ
ーゼI(Klenowフラグメント、Bethesda Research Labo
ratory)との反応によりフィルインする。1.85μgのSa
l Iリンカー5′−HGGTCGACC−3′(Biolabs)を、50
μlの60mMトリス(pH7.5),10mM MgCl2,5m
M DTT,0.5mM ATPおよび50単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理
する。37℃で45分間処理の後、混合物を75℃で1
0分間加熱し、室温に放冷する。7μg(1.5pモル)
の平滑末端(上記)に変換されたHind III部位を有する
線状化したプラスミドpJDB pJDB207/GAPEL−HIRを、8
0倍過剰量のキナーゼ処理されそしてアニーリルされた
Salリンカーと共に、30μlの60mMトリス(pH7.
5),10mM MgCl2,5mM DTT,3.5mMのAT
Pおよび800単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で1
5℃で16時間インキュベートする。T4DNAリガー
ゼを75℃で10分間不活性化した、後過剰のリンカー
を10mM EDTA,300mM酢酸ナトリウム(pH6.0)およ
び0.54容のイソプロパノールの存在下でDNAを沈澱さ
せることにより除去する。DNAをSal Iで消化する。
生成するフラグメントを1%アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離する。1.1kbのSa
l Iフラグメントを、ゲルからの電気溶出、フェノール
抽出およびエタノール沈澱により回収する。DNAを0.
1pモル/μlの濃度で再分散させる。
ドヌクレアーゼHind IIIで消化する。3′欠損末端を、
Maniatis(上記)の方法によりE.コリDNAポリメラ
ーゼI(Klenowフラグメント、Bethesda Research Labo
ratory)との反応によりフィルインする。1.85μgのSa
l Iリンカー5′−HGGTCGACC−3′(Biolabs)を、50
μlの60mMトリス(pH7.5),10mM MgCl2,5m
M DTT,0.5mM ATPおよび50単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理
する。37℃で45分間処理の後、混合物を75℃で1
0分間加熱し、室温に放冷する。7μg(1.5pモル)
の平滑末端(上記)に変換されたHind III部位を有する
線状化したプラスミドpJDB pJDB207/GAPEL−HIRを、8
0倍過剰量のキナーゼ処理されそしてアニーリルされた
Salリンカーと共に、30μlの60mMトリス(pH7.
5),10mM MgCl2,5mM DTT,3.5mMのAT
Pおよび800単位のT4DNAリガーゼ(Biolabs)中で1
5℃で16時間インキュベートする。T4DNAリガー
ゼを75℃で10分間不活性化した、後過剰のリンカー
を10mM EDTA,300mM酢酸ナトリウム(pH6.0)およ
び0.54容のイソプロパノールの存在下でDNAを沈澱さ
せることにより除去する。DNAをSal Iで消化する。
生成するフラグメントを1%アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で分離する。1.1kbのSa
l Iフラグメントを、ゲルからの電気溶出、フェノール
抽出およびエタノール沈澱により回収する。DNAを0.
1pモル/μlの濃度で再分散させる。
5μgのプラスミドpJDB207/GAPEL−HIRをSal Iで完全
に消化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、DNAを100μlの50mMのトリス(pH8.0)中に再
分散させる。4.6単位のウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼ(Boehringer)を加える。37℃で1時間置いた後、ホ
スファターゼを、100mM NaCl、5mM EDTAおよび
0.5%のSDSの存在下で68℃にて15分間不活性化
する。DNA溶液を、10mMトリス(pH7.5),150mM
NaCl,および1mM EDTAで平衡化したDE52アニオン
交換体(Whatman)の100μlのベッドに加える。カラムを
同じ緩衝液で洗浄した後、DNAを400μlの1.5M Na
Cl,10mMトリス(pH7.5),1mM EDTAで溶出し、
エタノールで沈澱せしめる。線状化したプラスミドを0.
6%のアガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断
されていないDNAから分離する。ゲルから線状の7.3
kb DNAフラグメントを回収し、電気溶出し、フェ
ノール抽出し、エタノールで沈澱させ、そして0.1pモ
ル/μlの濃度で再分散させる。
に消化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の
後、DNAを100μlの50mMのトリス(pH8.0)中に再
分散させる。4.6単位のウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼ(Boehringer)を加える。37℃で1時間置いた後、ホ
スファターゼを、100mM NaCl、5mM EDTAおよび
0.5%のSDSの存在下で68℃にて15分間不活性化
する。DNA溶液を、10mMトリス(pH7.5),150mM
NaCl,および1mM EDTAで平衡化したDE52アニオン
交換体(Whatman)の100μlのベッドに加える。カラムを
同じ緩衝液で洗浄した後、DNAを400μlの1.5M Na
Cl,10mMトリス(pH7.5),1mM EDTAで溶出し、
エタノールで沈澱せしめる。線状化したプラスミドを0.
6%のアガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断
されていないDNAから分離する。ゲルから線状の7.3
kb DNAフラグメントを回収し、電気溶出し、フェ
ノール抽出し、エタノールで沈澱させ、そして0.1pモ
ル/μlの濃度で再分散させる。
0.2pモルの1.1kb Sal Iフラグメントおよび0.1pモ
ルの線状化したベクターを10μlの60mMトリス(p
H7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1mM A
TPおよび200単位のT4DNAリガーゼ中15℃で1
6時間連結させる。連結混合物1μlを、100μlのカ
ルシウム処理し形質転換コンピテントE.コリ細胞に加
える。
ルの線状化したベクターを10μlの60mMトリス(p
H7.5),10mM MgCl2,5mM DTT,1mM A
TPおよび200単位のT4DNAリガーゼ中15℃で1
6時間連結させる。連結混合物1μlを、100μlのカ
ルシウム処理し形質転換コンピテントE.コリ細胞に加
える。
24個の形質転換したampRコロニーを、別々に100μg
/mlのアンピシリンを含むLB培地中で増殖させる。
Holmesらの方法[Anal.Biochem.114(1981)193]に従
い、プラスミドDNAを調製し、そしてEcoR I制限消化
によって分析する。予想される制限フラグメントを有す
る一つのクローンを単離し、そしてpJDB207/[GAPEL−
HIR]Dと命名する。
/mlのアンピシリンを含むLB培地中で増殖させる。
Holmesらの方法[Anal.Biochem.114(1981)193]に従
い、プラスミドDNAを調製し、そしてEcoR I制限消化
によって分析する。予想される制限フラグメントを有す
る一つのクローンを単離し、そしてpJDB207/[GAPEL−
HIR]Dと命名する。
同様な造成を、プラスミドpJDB207/GAPFL−HIRおよびp
JDB207/PAPFL/IER(UAS1+UAS2)を用いて行う。一つの
選択されたクローンの得られるプラスミドDNAは、そ
れぞれpJDB207/[FAPFL−HIR]DおよびpJDB207/[PA
PFL−HIR(UAS1+UAS2)]Dと呼ばれる。
JDB207/PAPFL/IER(UAS1+UAS2)を用いて行う。一つの
選択されたクローンの得られるプラスミドDNAは、そ
れぞれpJDB207/[FAPFL−HIR]DおよびpJDB207/[PA
PFL−HIR(UAS1+UAS2)]Dと呼ばれる。
実施例27.分泌されるデスルファトヒルジンのコード
配列の4個のインサートを有する発現プラスミドの造成 GAPDH−プロモーター、PH05シグナル配列、デスルファ
トヒルジンのコード配列、およびPH05転写ターミネータ
ーを含んで成るDNAフラグメントの4個のコピーを、
直列(タンデム)の頭と尾の配置で酵母発現ベクターに
挿入する。
配列の4個のインサートを有する発現プラスミドの造成 GAPDH−プロモーター、PH05シグナル配列、デスルファ
トヒルジンのコード配列、およびPH05転写ターミネータ
ーを含んで成るDNAフラグメントの4個のコピーを、
直列(タンデム)の頭と尾の配置で酵母発現ベクターに
挿入する。
10μgのプラスミドpHDB207/[GAPFL−HIR]D(実
施例26参照)をSal Iで消化する。生成する線状フラ
グメントの接着末端を、Maniatiesら(上記)の方法に
より、E・コリDNAポリメラーゼI(Klenowフラグメ
ント、BRL)との反応においてフィルインする。0.94
μgのHind IIIリンカー[5′−CAAGCTTG−3′、Biol
abs]をキナーゼ処理し、セルフアニーリングし、そし
て平滑末端へ変換されたSal I部位を有する線状化した
プラスミドpJDB207/[GAPFL−HIR]Dに連結する。リ
ンカーの連結およびイソプロパノールによる沈澱は、実
施例26に記載されているのと同様である。次に、DN
AをHind IIIを用いて切断し、そして生成する2.2kb
のフラグメントを電気溶出し、そしてフェノール抽出お
よびエタノール沈澱により単離する。DNAを0.1pモ
ル/μlの濃度に再分散する。
施例26参照)をSal Iで消化する。生成する線状フラ
グメントの接着末端を、Maniatiesら(上記)の方法に
より、E・コリDNAポリメラーゼI(Klenowフラグメ
ント、BRL)との反応においてフィルインする。0.94
μgのHind IIIリンカー[5′−CAAGCTTG−3′、Biol
abs]をキナーゼ処理し、セルフアニーリングし、そし
て平滑末端へ変換されたSal I部位を有する線状化した
プラスミドpJDB207/[GAPFL−HIR]Dに連結する。リ
ンカーの連結およびイソプロパノールによる沈澱は、実
施例26に記載されているのと同様である。次に、DN
AをHind IIIを用いて切断し、そして生成する2.2kb
のフラグメントを電気溶出し、そしてフェノール抽出お
よびエタノール沈澱により単離する。DNAを0.1pモ
ル/μlの濃度に再分散する。
5μgのプラスミドpJDB207/[GAPFL−HIR]Dを、Hin
d IIIを用いて完全に消化する。DNAをウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼ(Boehringer)を用いて脱リン酸化
し、DE52イオン交換クロマトグラフィによって精製し、
実施例26に記載のように電気溶出によって0.6%アガ
ロースゲルから単離する。
d IIIを用いて完全に消化する。DNAをウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼ(Boehringer)を用いて脱リン酸化
し、DE52イオン交換クロマトグラフィによって精製し、
実施例26に記載のように電気溶出によって0.6%アガ
ロースゲルから単離する。
0.2pモルの2.2kb Hind IIIフラグメントおよび0.1
pモルの線状化したベクターを上記のように連結する。
1μlの連結混合物を、100μlのコルシウム処理した
形質転換コンピテントE.コリHB101細胞に加える。
pモルの線状化したベクターを上記のように連結する。
1μlの連結混合物を、100μlのコルシウム処理した
形質転換コンピテントE.コリHB101細胞に加える。
12個の形質転換したampRコロニーを、100μg/ml
のアンピシリンを含むLB培地で別々に生育させる。プ
ラスミドDNAを調製し、そしてSal I+Xba IおよびAv
a I+Xba Iの二重消化およびBamH I消化によって分析す
る。1.1kb BamH I−連結フラグメントは、インサー
トがプラスミド上に既存の2個のコピーに対して頭と尾
の配置で存在することを示唆している。インサートのこ
の方向を有する一つのクローンを、pJDB207/[GAPFL−
HIR]Tと称する。
のアンピシリンを含むLB培地で別々に生育させる。プ
ラスミドDNAを調製し、そしてSal I+Xba IおよびAv
a I+Xba Iの二重消化およびBamH I消化によって分析す
る。1.1kb BamH I−連結フラグメントは、インサー
トがプラスミド上に既存の2個のコピーに対して頭と尾
の配置で存在することを示唆している。インサートのこ
の方向を有する一つのクローンを、pJDB207/[GAPFL−
HIR]Tと称する。
実施例28.PH05プロモーター、インベルターゼシグナ
ル配列およびデスルファトヒルジンコード領域を含む酵
母発現ベクターの造成 (A)インベルターゼシグナル配列のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの合成 4種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド(I−1、I
−2、I−3、I−4)を、DNA合成機(380B型、A
pplied Biosystems)によって合成する。脱ブロッキン
グの後、合成フラグメントを8M尿素含有する12%ポ
リアクリルアミドゲルで精製する。塩を含有しない純粋
なオリゴデオキシリボヌクレオチドが、Sep.Pak(Waters
Associates)を用いて得られる。これらのフラグメント
は、頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルター
ゼシグナル配列をコードするデュープレックスを構成す
る。
ル配列およびデスルファトヒルジンコード領域を含む酵
母発現ベクターの造成 (A)インベルターゼシグナル配列のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの合成 4種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド(I−1、I
−2、I−3、I−4)を、DNA合成機(380B型、A
pplied Biosystems)によって合成する。脱ブロッキン
グの後、合成フラグメントを8M尿素含有する12%ポ
リアクリルアミドゲルで精製する。塩を含有しない純粋
なオリゴデオキシリボヌクレオチドが、Sep.Pak(Waters
Associates)を用いて得られる。これらのフラグメント
は、頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルター
ゼシグナル配列をコードするデュープレックスを構成す
る。
(B)インベルターゼシグナル配列のサブクローン化 (a)ベクターの調製 1.5μgのp31R/SS−TPAΔ2(欧州特許出願第143,081
号明細書)を、50μlの10mMトリス・HCl(pH
7.5),6mM MgCl2,100mM NaCl,6mMメルカプ
トエタノール中で、10単位のEcoR I(Boehringer)を用
いて、37℃で1時間消化する。1μlの2.5M NaCl
を加えた後、10単位のXho I(Boehringer)を加え、3
7℃で1時間インキュベートする。4.2kbベクター
を、0.8%調製用アガロースゲル上で単離する。ゲルス
ライスをMicro Colloidorチューブ(Sartorius GmbH)に
写して、200μlのTEで覆い、そして電気溶出する(9
0mAで50分間電気泳動する)。TE溶液を集めて、
0.1容の10×TENを添加した後、2.5容の無水エタノー
ル中で沈澱させる。DNAペレットを冷80%エタノー
ルで洗浄し、そして真空中で乾燥する。DNAを、6μ
lのTEに再分散する(40pモル/μl)。
号明細書)を、50μlの10mMトリス・HCl(pH
7.5),6mM MgCl2,100mM NaCl,6mMメルカプ
トエタノール中で、10単位のEcoR I(Boehringer)を用
いて、37℃で1時間消化する。1μlの2.5M NaCl
を加えた後、10単位のXho I(Boehringer)を加え、3
7℃で1時間インキュベートする。4.2kbベクター
を、0.8%調製用アガロースゲル上で単離する。ゲルス
ライスをMicro Colloidorチューブ(Sartorius GmbH)に
写して、200μlのTEで覆い、そして電気溶出する(9
0mAで50分間電気泳動する)。TE溶液を集めて、
0.1容の10×TENを添加した後、2.5容の無水エタノー
ル中で沈澱させる。DNAペレットを冷80%エタノー
ルで洗浄し、そして真空中で乾燥する。DNAを、6μ
lのTEに再分散する(40pモル/μl)。
(b)オリゴデオキシリボヌクレオチド(I−1、I−
2、I−3、I−4)のアニーリング、キナーゼ処理お
よびベクターとの連結 10μlの0.5Mトリス・HCl(pH8)中にそれぞれ10
pモルの4種類のデオキシリボヌクレオチドを含む溶液
を、水浴上で95℃で5分間インキュベートする。水浴
を、5時間にわたって30℃まで徐々に冷却する。この
アニーリング混合物に、それぞれ2μlの0.1M NaC
l2,0.1M NaCl,30mM DTT,4mM ATP
および8単位(1μl)のポリヌクレオチドキナーゼ(B
oehringer)を加える。キナーゼ処理は、37℃で1時間
行う。アニーリングし、キナーゼ処理されたオリゴデオ
キシリボヌクレオチド、および60pモルのEcoR I−Xh
o I切断ベクター(1.5μl)を、400単位(1μl)の
T4DNAリガーゼ(Biolabs)を用いて14℃で17時
間連結させる。65℃で10分間インキュベートするこ
とによって、反応を停止させる。10mlのこの連結混
合物を、E.コリHB101 Ca++細胞の形質転換に用いる
[M.DagertおよびS.D.Ehrlich、Gene,56,23-28(197
9)]。20個のampRコロニーを採取する。DNAを迅速
単離法により調製する[D.S.HolmesおよびM.Quigley、An
al.Biochem.114,193-197(1981)]。DNAをEcoR Iおよ
びXho Iを用いて消化し、EcoR I末端で放射能標識を行
い、放射能標識されたpBr322 Hae III切断DNAをマー
カーとして用いて、8M尿素を含む6%ポリアクリルア
ミドゲル上で分析する。総ての20個のコロニーから得
られるDNAについて、正確な大きさのバンドが観察さ
れる。1個のクローンを100μg/mlのアンピシリン
を含む100mlのLB培地で増殖させる。プラスミドD
NAを単離して、p31RIT−12と称する。
2、I−3、I−4)のアニーリング、キナーゼ処理お
よびベクターとの連結 10μlの0.5Mトリス・HCl(pH8)中にそれぞれ10
pモルの4種類のデオキシリボヌクレオチドを含む溶液
を、水浴上で95℃で5分間インキュベートする。水浴
を、5時間にわたって30℃まで徐々に冷却する。この
アニーリング混合物に、それぞれ2μlの0.1M NaC
l2,0.1M NaCl,30mM DTT,4mM ATP
および8単位(1μl)のポリヌクレオチドキナーゼ(B
oehringer)を加える。キナーゼ処理は、37℃で1時間
行う。アニーリングし、キナーゼ処理されたオリゴデオ
キシリボヌクレオチド、および60pモルのEcoR I−Xh
o I切断ベクター(1.5μl)を、400単位(1μl)の
T4DNAリガーゼ(Biolabs)を用いて14℃で17時
間連結させる。65℃で10分間インキュベートするこ
とによって、反応を停止させる。10mlのこの連結混
合物を、E.コリHB101 Ca++細胞の形質転換に用いる
[M.DagertおよびS.D.Ehrlich、Gene,56,23-28(197
9)]。20個のampRコロニーを採取する。DNAを迅速
単離法により調製する[D.S.HolmesおよびM.Quigley、An
al.Biochem.114,193-197(1981)]。DNAをEcoR Iおよ
びXho Iを用いて消化し、EcoR I末端で放射能標識を行
い、放射能標識されたpBr322 Hae III切断DNAをマー
カーとして用いて、8M尿素を含む6%ポリアクリルア
ミドゲル上で分析する。総ての20個のコロニーから得
られるDNAについて、正確な大きさのバンドが観察さ
れる。1個のクローンを100μg/mlのアンピシリン
を含む100mlのLB培地で増殖させる。プラスミドD
NAを単離して、p31RIT−12と称する。
(C)GAPFLプロモータ要素のインベルターゼシグナル
配列への連結 5μgのプラスミドp31RIT−12を、Sal IおよびEcoR I
を用いて完全に消化する。大きな3.3kb Sal I−EcoR
Iフラグメントを、0.6%アガロースゲル上トリス−酢
酸緩衝液(pH8.2)中で単離する。DNAをゲルから電気
溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱さ
せる。10μgのプラスミドpJDB207/GAPFL−HIR(実
施例25参照)をSal IおよびEcoR Iを用いて消化す
る。477bp Sal I−EcoR Iフラグメントを、0.8%アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で単
離する。DNAを電気溶出し、フェノール抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。これらの単離されたDNA
フラグメントを連結する。連結混合物の一部を用いて、
適当なE・コリHB101細胞を形質転換する。ampRコロニ
ーを増殖せしめ、プラスミドDNAをHind III Sal I二
重消化によって分析する。正確なインサートを有するプ
ラスミドを、p31/GAPFL−ITと命名する。
配列への連結 5μgのプラスミドp31RIT−12を、Sal IおよびEcoR I
を用いて完全に消化する。大きな3.3kb Sal I−EcoR
Iフラグメントを、0.6%アガロースゲル上トリス−酢
酸緩衝液(pH8.2)中で単離する。DNAをゲルから電気
溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱さ
せる。10μgのプラスミドpJDB207/GAPFL−HIR(実
施例25参照)をSal IおよびEcoR Iを用いて消化す
る。477bp Sal I−EcoR Iフラグメントを、0.8%アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8.3)中で単
離する。DNAを電気溶出し、フェノール抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。これらの単離されたDNA
フラグメントを連結する。連結混合物の一部を用いて、
適当なE・コリHB101細胞を形質転換する。ampRコロニ
ーを増殖せしめ、プラスミドDNAをHind III Sal I二
重消化によって分析する。正確なインサートを有するプ
ラスミドを、p31/GAPFL−ITと命名する。
(D)プラスミドpJDB207/GAPFL−I−HIRの造成(第
15図参照) 25μgのプラスミドp35/GAPFL−ITを、Pst Iおよ
びSal Iを用いて完全に消化する。生成する676bpフラグ
メントを、10%調製用アガロースゲル上トリス−ホウ
酸−EDTA衝液(pH8.3)中で単離する。DNAをゲルから
電気溶出し、DE52イオン交換クロマトグラフィによって
精製し、エタノールで沈澱させ、そしてHga I酵素に好
適な緩衝液に再分散して0.1μg/μlの濃度にする。S
al I−Pst I DNAフラグメントを、0.5単位/μgD
NAの存在でHga Iを用いて37℃で60分間部分的に
消化する。EDTAを添加して最終濃度を10mMにするこ
とによって、反応を停止させる。534bp Sal I−Hga Iフ
ラグメントを1%調製用アガロースゲル上で単離する。
DNAをゲルから電気溶出し、DE52クロマトグラフィに
よって精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分散さ
せて、約0.1pモル/μlの濃度にする。
15図参照) 25μgのプラスミドp35/GAPFL−ITを、Pst Iおよ
びSal Iを用いて完全に消化する。生成する676bpフラグ
メントを、10%調製用アガロースゲル上トリス−ホウ
酸−EDTA衝液(pH8.3)中で単離する。DNAをゲルから
電気溶出し、DE52イオン交換クロマトグラフィによって
精製し、エタノールで沈澱させ、そしてHga I酵素に好
適な緩衝液に再分散して0.1μg/μlの濃度にする。S
al I−Pst I DNAフラグメントを、0.5単位/μgD
NAの存在でHga Iを用いて37℃で60分間部分的に
消化する。EDTAを添加して最終濃度を10mMにするこ
とによって、反応を停止させる。534bp Sal I−Hga Iフ
ラグメントを1%調製用アガロースゲル上で単離する。
DNAをゲルから電気溶出し、DE52クロマトグラフィに
よって精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分散さ
せて、約0.1pモル/μlの濃度にする。
10μgのプラスミドpJDB207/PH05−HIR(実施例16
参照)を、Bal IおよびHind IIIを用いて消化する。生
成する587 bpBal I−Hind IIフラグメントを、調製用1
%アガロースゲル上で単離する。DNAを電気溶出し、
エタノール沈澱し、更にHinf Iで消化する。
参照)を、Bal IおよびHind IIIを用いて消化する。生
成する587 bpBal I−Hind IIフラグメントを、調製用1
%アガロースゲル上で単離する。DNAを電気溶出し、
エタノール沈澱し、更にHinf Iで消化する。
下記のオリゴデオキシヌクレオチド 5′-CTGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCG-3′ 3′-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTA-5′ のそれぞれ1.3μg(160pM)を実施例24d IIIに記載のよ
うにしてキナーゼ処理し、そしてアニーリングする。0.
6μg(1.6pモル)のHinf Iで消化した。Bal I−Hind
IIIフラグメント(上記参照)および160pモルのキナー
ゼ処理されアニーリングしたリンカーを、83μlの1
0mMトリス−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,5m
M DTT,3.5mM ATPおよび400単位のT4DN
Aリガーゼ中で、15℃で16時間連結させる。85℃
にて10分間の後、DNAをイソプロパノールで沈澱さ
せることによって過剰のリンカーを除去する(実施例24
d III参照)。584bp Hga I−Hind IIIフラグメントを、
1%調製用アガロースゲル上で単離する。電気溶出し、
精製し、そしてエタノール沈澱させたDNAを水に再分
散して、0.1pモル/μlの濃度にする。
うにしてキナーゼ処理し、そしてアニーリングする。0.
6μg(1.6pモル)のHinf Iで消化した。Bal I−Hind
IIIフラグメント(上記参照)および160pモルのキナー
ゼ処理されアニーリングしたリンカーを、83μlの1
0mMトリス−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,5m
M DTT,3.5mM ATPおよび400単位のT4DN
Aリガーゼ中で、15℃で16時間連結させる。85℃
にて10分間の後、DNAをイソプロパノールで沈澱さ
せることによって過剰のリンカーを除去する(実施例24
d III参照)。584bp Hga I−Hind IIIフラグメントを、
1%調製用アガロースゲル上で単離する。電気溶出し、
精製し、そしてエタノール沈澱させたDNAを水に再分
散して、0.1pモル/μlの濃度にする。
5μgのpJDB207/PH05−HIRをHind IIIおよびSal Iで
消化し、そして大きな6.2kbフラブメントを単離す
る。
消化し、そして大きな6.2kbフラブメントを単離す
る。
0.2pモルの534bp Sal I−Hga Iフラグメント,0.2pモ
ルの584bp Hga I−Hind IIIフラグメント、および0.1p
モルの6.2kb Sal I−Hind IIIベクターフラグメント
を、10μlの10mMトリス・HCl(pH7.5),10
mM MgCl2,5mM DTT,1mM ATPおよび4
00単位のT4リガーゼ中で15℃で5時間連結させる。
連結混合物の1μlを用いて、コンピテントE.コリHB
101細胞を形質転換させる。
ルの584bp Hga I−Hind IIIフラグメント、および0.1p
モルの6.2kb Sal I−Hind IIIベクターフラグメント
を、10μlの10mMトリス・HCl(pH7.5),10
mM MgCl2,5mM DTT,1mM ATPおよび4
00単位のT4リガーゼ中で15℃で5時間連結させる。
連結混合物の1μlを用いて、コンピテントE.コリHB
101細胞を形質転換させる。
24個の形質転換されたアンピシリン耐性のコロニー
を、100μg/mlアンピシリンを含むLB培地で別々
に増殖させる。プラスミドDNAを調製して、Hind III
およびSal I二重消化によって分析する。正確な制限パ
ターンを有する単一クローンを単離し、pJDB207/GAPFL
−I−HIRと表す。
を、100μg/mlアンピシリンを含むLB培地で別々
に増殖させる。プラスミドDNAを調製して、Hind III
およびSal I二重消化によって分析する。正確な制限パ
ターンを有する単一クローンを単離し、pJDB207/GAPFL
−I−HIRと表す。
インベルターゼシグナル配列の同一性およびヒルジンコ
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
実施例29. (a)サッカロミセス・セレビシエーGRF18の形質転換 サッカロミセス・セレビシエーCFR18株(α,his3−11,
his3−15,leu2−3,leu2−12,canR)を、Hinnenらの
報告による形質転換法[Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 、75,1
929(1978)]を用いて、次のようなプラスミドを用いて
形質転換する。
his3−15,leu2−3,leu2−12,canR)を、Hinnenらの
報告による形質転換法[Proc.Natl.Acad.Sci.、USA 、75,1
929(1978)]を用いて、次のようなプラスミドを用いて
形質転換する。
pJDB207/PAPEL−HIR(UAS1), pJDB207/PAPFL−HIR(UAS1), pJDB207/PAPEL−HIR(UAS1+UAS2), pJDB207/PAPFL−HIR(UAS1+UAS2), pJDB207/GAPEL−HIR, pJDB207/GAPFL−HIR, pJDB207/[GAPEL−HIR]D, pJDB207/[GAPFL−HIR]D, pJDB207/[PAPFL−HIR](UAS1+UAS2)D, pJDB207/[GAPFL−HIR]T, pJDB207/GAPFL−I−HIR 形質転換した酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地
平板上で選択する。単一の形質転換した酵母コロニーを
単離して、次のように命名する。サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS
2),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS
2),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR](UAS1+UAS
2)]D,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR. (b)形質転換体の醗酵 S.セレビシエーGRF18形質転換体の細胞をそれぞれ、
50ml三角フラスコ中で、10mlの酵母最少培地
(2%グルコースおよび20mg/のL−ヒスチジン
を加えた、アミノ酸を含有しないDifco Yeast Nitrogen
Base)中で、30℃で24時間振盪しながら培養し
て、3×107個/mlの細胞密度とする。ハイブリッ
ドPH05−GAPDHプロモーターを有するプラスミドを含む
酵母形質転換体は、デスルファトヒルジンの発現にはプ
ロモーターの抑制解除を必要とする。細胞を0.9%NaCl
で洗浄し、これを(NH4)2SO4、2%グルコースおよび1
g/のL−ヒスチジンの代わりに0.03g/のKH2P
O4、10g/のL−アスパラギンを含むほか、Difco
Yeast Nitrogen Base培地(アミノ酸なし)の処方にし
たがって調製した50mlの低Pi最少培地に接種す
る。培養物は、4×106個/ml以下の細胞密度で接種
し、30℃、200rpmで24時間攪拌する。最終的密
度は、1×108個/mlとなる。GAPDH プロモーターを有するプラスミドを含有する酵母
形質転換体は、構成的にデスルファトヒルジンを発現す
る。細胞をペプトン(5g/)、酵母エキス(10g
/)、グルコース(20g/)、シュークロース
(40g/)、硫酸アンモニウム(3g/)、KH2S
O4(2g/)、MgSO4(0.5g/)、NaCl(0.1g/
)、CaCl2(0.1g/)、ビオチン(10μg/)
から成る複合培地(g/)中で培養する。30℃、20
0rpmで48時間培養した後に、約1×109個/mlの
細胞が得られる。
平板上で選択する。単一の形質転換した酵母コロニーを
単離して、次のように命名する。サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS
2),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS
2),サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR](UAS1+UAS
2)]D,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,サッカロミセル・セレビシエ - GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR. (b)形質転換体の醗酵 S.セレビシエーGRF18形質転換体の細胞をそれぞれ、
50ml三角フラスコ中で、10mlの酵母最少培地
(2%グルコースおよび20mg/のL−ヒスチジン
を加えた、アミノ酸を含有しないDifco Yeast Nitrogen
Base)中で、30℃で24時間振盪しながら培養し
て、3×107個/mlの細胞密度とする。ハイブリッ
ドPH05−GAPDHプロモーターを有するプラスミドを含む
酵母形質転換体は、デスルファトヒルジンの発現にはプ
ロモーターの抑制解除を必要とする。細胞を0.9%NaCl
で洗浄し、これを(NH4)2SO4、2%グルコースおよび1
g/のL−ヒスチジンの代わりに0.03g/のKH2P
O4、10g/のL−アスパラギンを含むほか、Difco
Yeast Nitrogen Base培地(アミノ酸なし)の処方にし
たがって調製した50mlの低Pi最少培地に接種す
る。培養物は、4×106個/ml以下の細胞密度で接種
し、30℃、200rpmで24時間攪拌する。最終的密
度は、1×108個/mlとなる。GAPDH プロモーターを有するプラスミドを含有する酵母
形質転換体は、構成的にデスルファトヒルジンを発現す
る。細胞をペプトン(5g/)、酵母エキス(10g
/)、グルコース(20g/)、シュークロース
(40g/)、硫酸アンモニウム(3g/)、KH2S
O4(2g/)、MgSO4(0.5g/)、NaCl(0.1g/
)、CaCl2(0.1g/)、ビオチン(10μg/)
から成る複合培地(g/)中で培養する。30℃、20
0rpmで48時間培養した後に、約1×109個/mlの
細胞が得られる。
幾つかの代表的な形質転換した酵母株によって分泌され
るデスルファトヒルジンの量(トロンビン阻害法によっ
て測定)を、以下の表にまとめてある。
るデスルファトヒルジンの量(トロンビン阻害法によっ
て測定)を、以下の表にまとめてある。
また、酵母形質転換体によって発現されたデスルファト
ヒルジン化合物の少なくとも90%は培養液中に分泌さ
れることも決定される。回収の時間の関数としての培養
液中および細胞内におけるデスルファトヒルジンの分布
を決定するため、3リットルのMBRバイオリアクター
(MBR Bioreactor AG、Wetzikon、スイス)中で醗酵を行
う。サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207/GA
PFL−HIR株を3リットルの複合培地(上記参照)に接種
して、30℃で、攪拌速度500rpmおよび通気量200リ
ットル/時間で培養する。最終密度5×109個/mlが
達成される。試料をそれぞれ、18、24および42時間目
に採取し培溶液中および細胞内(崩壊後、実施例22参
照)のデスルファトヒルジンの含量をトロンビン阻害法
およびHPLCによって測定する。
ヒルジン化合物の少なくとも90%は培養液中に分泌さ
れることも決定される。回収の時間の関数としての培養
液中および細胞内におけるデスルファトヒルジンの分布
を決定するため、3リットルのMBRバイオリアクター
(MBR Bioreactor AG、Wetzikon、スイス)中で醗酵を行
う。サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207/GA
PFL−HIR株を3リットルの複合培地(上記参照)に接種
して、30℃で、攪拌速度500rpmおよび通気量200リ
ットル/時間で培養する。最終密度5×109個/mlが
達成される。試料をそれぞれ、18、24および42時間目
に採取し培溶液中および細胞内(崩壊後、実施例22参
照)のデスルファトヒルジンの含量をトロンビン阻害法
およびHPLCによって測定する。
実施例30.300リットル規模での形質転換体の培養 サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207/GAPFL
−HIR株の細胞を含む深冷凍結アンプルから多数の寒天
斜面に接種を行う。1個以上の寒天斜面を28〜30℃で3
〜5日間培養する。1つの寒天斜面の内容物を、邪魔板
がなく、前培養培地100mlを収容する単一の500ml三
角フラスコに無菌的に接種する。フラスコを、振幅が5
0mmで250rpmのロータリー・シェイカーで、培養温
度28℃で振盪する。48時間後に、これらのフラスコ
の内容物(一次前培養物)2%(v/v)を、600ml
の前培養培地を収容する2リットルの三角フラスコに無
菌的に接種する。これらのフラスコ(二次前培養物)
を、28℃で、ロータリー・シェイカー上で120rpm
で振幅を50mmとして48時間振盪する。二次前培養物
のフラスコ(2%v/v)の内容物を、30リットルの
前培養培地(プラント前培養物)を収容する50リット
ルのステンレススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。
プラント前培養液の醗酵条件は次のようである。600r
pm(単一の6枚羽根のタービン攪拌機、直径115m
m)、4枚の邪魔板、ヘッド圧:03バール、通気量:
1リットルの空気/1リットルの培地/分、温度:28
℃、48時間。
−HIR株の細胞を含む深冷凍結アンプルから多数の寒天
斜面に接種を行う。1個以上の寒天斜面を28〜30℃で3
〜5日間培養する。1つの寒天斜面の内容物を、邪魔板
がなく、前培養培地100mlを収容する単一の500ml三
角フラスコに無菌的に接種する。フラスコを、振幅が5
0mmで250rpmのロータリー・シェイカーで、培養温
度28℃で振盪する。48時間後に、これらのフラスコ
の内容物(一次前培養物)2%(v/v)を、600ml
の前培養培地を収容する2リットルの三角フラスコに無
菌的に接種する。これらのフラスコ(二次前培養物)
を、28℃で、ロータリー・シェイカー上で120rpm
で振幅を50mmとして48時間振盪する。二次前培養物
のフラスコ(2%v/v)の内容物を、30リットルの
前培養培地(プラント前培養物)を収容する50リット
ルのステンレススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。
プラント前培養液の醗酵条件は次のようである。600r
pm(単一の6枚羽根のタービン攪拌機、直径115m
m)、4枚の邪魔板、ヘッド圧:03バール、通気量:
1リットルの空気/1リットルの培地/分、温度:28
℃、48時間。
寒天培地および前培養液は、寒天の有無を除けば同じで
ある。同じ前培養液を総ての前培養工程で用いた。前培
地の組成(g/): イーストニトロゲンベース(Difco) 8.4 L−アスパラギン・H2O 11.6 L−ヒスチジン 1.0 グルコース(別途に殺菌) 2.0 寒天培地の組成: 前培地に1リットル当たり20gの寒天を加えたもの。
ある。同じ前培養液を総ての前培養工程で用いた。前培
地の組成(g/): イーストニトロゲンベース(Difco) 8.4 L−アスパラギン・H2O 11.6 L−ヒスチジン 1.0 グルコース(別途に殺菌) 2.0 寒天培地の組成: 前培地に1リットル当たり20gの寒天を加えたもの。
(b)生産醗酵(300リットル規模) 5%(v/v,15リットル)の培養したプラント前培
養液を300リットルの無菌醗酵生産培地を収容する600リ
ットルの醗酵機に無菌的に導入する。300リットル生産
培地の醗酵条件は、次の通りである。
養液を300リットルの無菌醗酵生産培地を収容する600リ
ットルの醗酵機に無菌的に導入する。300リットル生産
培地の醗酵条件は、次の通りである。
450rpm(単一の6枚羽根攪拌機、直径230mm)、4枚
の邪魔板、ヘッド圧:0.3バール、通気量:0〜9時
間:0.25リットル空気/1リットルの培地/分、 9時間〜回収時:1リットル空気/1リットルの培地/
分、温度28℃、時間24〜48時間、 OD600:15〜20、収量:15〜25mg/(試験法:HPLC
およびトロンビン試験)生産培地の組成(g/) ペプトン 5 酵母エキス 10 シュークロース 40 (NH4)2SO4 6 MgSO4・7H2O 1 NaCl 0.1 KH2PO4 2 CaCl2・2H2O 0.013 殺菌前のpH〜6.0 消泡剤:必要な場合にはUCON LB625。
の邪魔板、ヘッド圧:0.3バール、通気量:0〜9時
間:0.25リットル空気/1リットルの培地/分、 9時間〜回収時:1リットル空気/1リットルの培地/
分、温度28℃、時間24〜48時間、 OD600:15〜20、収量:15〜25mg/(試験法:HPLC
およびトロンビン試験)生産培地の組成(g/) ペプトン 5 酵母エキス 10 シュークロース 40 (NH4)2SO4 6 MgSO4・7H2O 1 NaCl 0.1 KH2PO4 2 CaCl2・2H2O 0.013 殺菌前のpH〜6.0 消泡剤:必要な場合にはUCON LB625。
実施例31.300リットルの培養液からのデスルファト
ヒルジンの単離 pH値3.3を有する培養液(実施例30参照)を17℃に
冷却する。細胞を、Westfalia SA−14スラッジ除去装
置(400〜600リットル/時間)により分離する。濃いス
ラッジは廃棄する。僅かに濁りを有する上澄液を、一連
のSkanフィルターカートリッジ(第一:孔径5μm;第
二:孔径1μm:第三:孔径0.22μm)を通して濾過
し、NaOHでpH7.5にしてDEAE陰イオン交換カラムに適用
する。カラムを酢酸ナトリウム(20mM,pH4.5)で
洗浄し、酢酸ナトリウム(20mM,pH3.1)で溶出す
る。溶液(15リットル)をNaOHでpH7.5に調整して、
循環蒸発装置で濃縮して最終容積を1.8リットルにす
る。1リットルをSephadex G−25カラム(ベッド容
積:8リットル、カラムは水で平衡にする)に充填す
る。デスルファトヒルジンを含む分画をHPLCで同定す
る。デスルファトヒルジン分画(2.5リットル)を高真
空のローターバップで濃縮して最終容積を200mlとし
て、凍結乾燥する。
ヒルジンの単離 pH値3.3を有する培養液(実施例30参照)を17℃に
冷却する。細胞を、Westfalia SA−14スラッジ除去装
置(400〜600リットル/時間)により分離する。濃いス
ラッジは廃棄する。僅かに濁りを有する上澄液を、一連
のSkanフィルターカートリッジ(第一:孔径5μm;第
二:孔径1μm:第三:孔径0.22μm)を通して濾過
し、NaOHでpH7.5にしてDEAE陰イオン交換カラムに適用
する。カラムを酢酸ナトリウム(20mM,pH4.5)で
洗浄し、酢酸ナトリウム(20mM,pH3.1)で溶出す
る。溶液(15リットル)をNaOHでpH7.5に調整して、
循環蒸発装置で濃縮して最終容積を1.8リットルにす
る。1リットルをSephadex G−25カラム(ベッド容
積:8リットル、カラムは水で平衡にする)に充填す
る。デスルファトヒルジンを含む分画をHPLCで同定す
る。デスルファトヒルジン分画(2.5リットル)を高真
空のローターバップで濃縮して最終容積を200mlとし
て、凍結乾燥する。
2gの原料を50mlの水に溶解し、NaOHでpH7.5に調
整し、Q Sepharose迅速硫下カラム(ベッド容積:200
ml)に適用する。カラムをギ酸アンモニウム(100m
M、pH3.9)で洗浄する。25mlの画分を採取してHPL
Cによってデスルファトヒルジンを試験する。デスルフ
ァトヒルジンを含む分画(1〜65)をまとめて(125
ml)高真空のロータバップで最終容積を10mlまで
濃縮する。濃縮した溶液をSephadex G−25カラム(Am
icon、カラムを水で平衡にしてある)に適用し、そして
脱塩する。得られる透明な溶液(25ml)を凍結乾燥
する。精製する固形物は、純粋なデスルファトヒルジン
から成る。
整し、Q Sepharose迅速硫下カラム(ベッド容積:200
ml)に適用する。カラムをギ酸アンモニウム(100m
M、pH3.9)で洗浄する。25mlの画分を採取してHPL
Cによってデスルファトヒルジンを試験する。デスルフ
ァトヒルジンを含む分画(1〜65)をまとめて(125
ml)高真空のロータバップで最終容積を10mlまで
濃縮する。濃縮した溶液をSephadex G−25カラム(Am
icon、カラムを水で平衡にしてある)に適用し、そして
脱塩する。得られる透明な溶液(25ml)を凍結乾燥
する。精製する固形物は、純粋なデスルファトヒルジン
から成る。
実施例32.プラスミドpJDB207/PH05−EGLの造成 ヒルに由来する70個のアミノ酸から成るポリペプチド
であるエグリンCをコードするヌクレオチド配列は、試
験管内で合成されており、欧州特出願第146,785号明細
書記載のようにE.コリでサブクローン化され、発現さ
れている。エグリンコード配列のPH05シグナルペプチド
をコードする配列への正確なインフレーム融合は、実施
例15および16におけるヒルジンについて記載したの
と全く同様に行われる。ベクター中のインサートの正確
な方向を有する単一クローンを、pJDB207/PH05−EGLと
称する。サッカロミセス・セレビシエーGRF18株を、通
常の方法で形質転換する。形質転換体を、実施例29に
記載のように選択し、そして培養する。エグリンCは、
培養液中には、検出されない。
であるエグリンCをコードするヌクレオチド配列は、試
験管内で合成されており、欧州特出願第146,785号明細
書記載のようにE.コリでサブクローン化され、発現さ
れている。エグリンコード配列のPH05シグナルペプチド
をコードする配列への正確なインフレーム融合は、実施
例15および16におけるヒルジンについて記載したの
と全く同様に行われる。ベクター中のインサートの正確
な方向を有する単一クローンを、pJDB207/PH05−EGLと
称する。サッカロミセス・セレビシエーGRF18株を、通
常の方法で形質転換する。形質転換体を、実施例29に
記載のように選択し、そして培養する。エグリンCは、
培養液中には、検出されない。
第1図および第2図は、それぞれプラスミドpML300およ
びpML305の造成を示す模式図である。 第3図は、trpプロモーターを有するプラスミドpHRi
148の造成を示す。 第4図は、発現プラスミドpML310の造成を示す。 第5図は、成熟デスルファトヒルジンをコードするDN
Aフラグメントの単離を示す模式図である。 第6図は、デスルファトヒルジンを分泌する発現プラス
ミドの造成を模式的に示す。 第7図は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を行う発
現プラスミドの造成を模式的に示す。 第8図は、PH05プロモータ領域を含有するPH05のBamH I
−Sal I制限フラグメントのDNA配列を示す。 第9図は、GAPDH遺伝子のプロモーター領域のDNA配
列を示す。 第10図は、プラスミドpGAPDH−ELの造成を示す模式図
である。 第11図は、プラスミドpGAPDH−FLおよびpGAPDH−EL中
に存在するGAPDHプロモーターフラグメントの配列を示
す。 第12図は、プラスミドpJDB207/PH05(Eco)−HIRの造
成を示す。 第13図は、プラスミドpJDB207/PAPEL−HIR(UAS1+UA
S2)の造成を示す。 第14図は、プラスミドpJDB207/〔GAPEL−HIR〕Dの
造成を示す。 第15図は、プラスミドpJDB207/GAPFL−I−HIRの造
成を示す模式図である。 図面では、次の略号を用いる。 p:プロモーター、SS:シグナル配列、 t:ターミネーター、L:リンカー。
びpML305の造成を示す模式図である。 第3図は、trpプロモーターを有するプラスミドpHRi
148の造成を示す。 第4図は、発現プラスミドpML310の造成を示す。 第5図は、成熟デスルファトヒルジンをコードするDN
Aフラグメントの単離を示す模式図である。 第6図は、デスルファトヒルジンを分泌する発現プラス
ミドの造成を模式的に示す。 第7図は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を行う発
現プラスミドの造成を模式的に示す。 第8図は、PH05プロモータ領域を含有するPH05のBamH I
−Sal I制限フラグメントのDNA配列を示す。 第9図は、GAPDH遺伝子のプロモーター領域のDNA配
列を示す。 第10図は、プラスミドpGAPDH−ELの造成を示す模式図
である。 第11図は、プラスミドpGAPDH−FLおよびpGAPDH−EL中
に存在するGAPDHプロモーターフラグメントの配列を示
す。 第12図は、プラスミドpJDB207/PH05(Eco)−HIRの造
成を示す。 第13図は、プラスミドpJDB207/PAPEL−HIR(UAS1+UA
S2)の造成を示す。 第14図は、プラスミドpJDB207/〔GAPEL−HIR〕Dの
造成を示す。 第15図は、プラスミドpJDB207/GAPFL−I−HIRの造
成を示す模式図である。 図面では、次の略号を用いる。 p:プロモーター、SS:シグナル配列、 t:ターミネーター、L:リンカー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:865) (C12N 1/19 C12R 1:865) (72)発明者 バルター メルキ スイス国,4313 メーリン,ブレーメンシ ュタールシュトラーセ 30 (72)発明者 ユッタ ハイム スイス国,4133 プラッテルン,ランクア ッカーベーク 18 (56)参考文献 特開 昭60−137286(JP,A) 特開 昭60−136597(JP,A) 特表 昭60−501140(JP,A) 特表 昭62−502661(JP,A) 国際公開85/4418(WO,A) 欧州特許出願公開143081(EP,A)
Claims (12)
- 【請求項1】デスルファトヒルジンの製造方法であっ
て、酵母性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジン
をコードする第二のDNA配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームが合っている酵母PH05又は
インベルターゼのシグナルペプチドをコードする第一の
DNA配列から成るDNAセグメントであって上記発現制御配
列の転写制御下にあるものと、酵母の転写終止シグナル
を含んで成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上
のDNAインサートを含んで成るハイブリッドベクターで
形質転換された酵母細胞を適当な栄養条件下で培養し、 培地からデスルファトヒルジンを単離することを特徴と
する方法。 - 【請求項2】発現制御配列が一つの酵母の遺伝子の上流
活性化配列、およびもう一つの酵母遺伝子の機能性TATA
ボックスを含む下流プロモーター要素から成るハイブリ
ッドプロモーターである、特許請求の範囲第1項記載の
方法。 - 【請求項3】PH05プロモーターと、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードするDNA配列及びその上流にありそれと
リーディングフレームが合っているPH05シグナル配列か
ら成るDNAセグメントであって前記PH05プロモーターの
転写制御下にあるものと、PH05遺伝子の3′フランキン
グ配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAインサー
トを有するハイブリッドベクターで形質転換した酵母を
使用する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項4】GAPDHプロモーターと、成熟デスルファト
ヒルジンをコードするDNA配列及びその上流にありそれ
とリーディングフレームが合っているPH05シグナル配列
から成るDNAセグメントであって前記GAPDHプロモーター
の転写制御下にあるものと、PH05遺伝子の3′フランキ
ング配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAインサ
ートを有するハイブリッドベクターで形質転換した酵母
を使用する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項5】酵母PH05遺伝子の上流活性化部位及び酵母
GAPDH遺伝子のTATAボックスを含む下流プロモーター要
素を含んで成るハイブリッドプロモーターと、成熟デス
ルファトヒルジンをコードするDNA配列及びその上流に
あってそれとリーディングフレームが合っているPH05シ
グナル配列を含んで成るDNAセグメントであって前記ハ
イブリッド・プロモーターの転写制御下にあるものと、
PH05遺伝子の3′フランキング配列とをそれぞれ含んで
成る1個以上のDNAインサートを有するハイブリッドベ
クターで形質転換した酵母を使用する、特許請求の範囲
第1項記載の方法。 - 【請求項6】PH05プロモーターと、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードするDNA配列及びその上流にあってそれ
とリーディングフレームが合っているインベルターゼ・
シグナル配列を含んで成るDNAセグメントであって前記P
H05プロモーターの転写制御下にあるものと、PH05遺伝
子の3′フランキング配列とをそれぞれが含んで成る1
個以上のDNAインサートを有するハイブリッド・ベクタ
ーで形質転換した酵母を使用する、特許請求の範囲第1
項記載の方法。 - 【請求項7】次の式: Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser
His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
r を有するデス−(Leu64,Gln65)−デスルファトヒルジン
変形体HV1を製造するための、特許請求の範囲第1項記
載の方法。 - 【請求項8】次の式: Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser
His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
r Leu を有するデス−(Gln65)−デスルファトヒルジン変形体H
V1を製造するための、特許請求の範囲第1項記載の方
法。 - 【請求項9】次の式: Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser
His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
r Leu Gln を有するデスルファトヒルジン変形体HV1の製造のため
の、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項10】次の式: Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser
His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Ty
r Leu Gln を有するデスルファトヒルジン変形体HV2の製造のため
の、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項11】次の式: Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Le
u Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly
Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gl
n Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser
His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Al
a Tyr Asp Glu を有するデスルファトヒルジン変形体PAの製造のため
の、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項12】デス−(Val)2−デスルファトヒルジンの
製造のための、特許請求の範囲第1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858530631A GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1985-12-12 | Thrombin inhibitors |
GB868613088A GB8613088D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-05-29 | Thrombin inhibitors |
GB8530631 | 1986-05-29 | ||
GB8613088 | 1986-05-29 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5282983A Division JPH0787791B2 (ja) | 1985-12-12 | 1993-11-12 | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62208296A JPS62208296A (ja) | 1987-09-12 |
JPH0650990B2 true JPH0650990B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=26290108
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61293558A Expired - Lifetime JPH0650990B2 (ja) | 1985-12-12 | 1986-12-11 | トロンビン阻害剤の製造方法 |
JP5282983A Expired - Lifetime JPH0787791B2 (ja) | 1985-12-12 | 1993-11-12 | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5282983A Expired - Lifetime JPH0787791B2 (ja) | 1985-12-12 | 1993-11-12 | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0225633B1 (ja) |
JP (2) | JPH0650990B2 (ja) |
AT (1) | ATE79403T1 (ja) |
AU (1) | AU615413B2 (ja) |
CA (1) | CA1341496C (ja) |
DE (1) | DE3686399T2 (ja) |
DK (1) | DK175492B1 (ja) |
ES (1) | ES2051688T3 (ja) |
FI (1) | FI94773C (ja) |
GR (1) | GR3006248T3 (ja) |
HU (1) | HU209146B (ja) |
IE (1) | IE57859B1 (ja) |
IL (1) | IL80932A (ja) |
MY (1) | MY101203A (ja) |
NO (1) | NO178035C (ja) |
PH (1) | PH31277A (ja) |
PT (1) | PT83898B (ja) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
CA1341032C (en) * | 1987-01-23 | 2000-06-20 | John L. Krstenansky | Anticoagulant peptides |
US6005071A (en) * | 1987-01-23 | 1999-12-21 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
US5789540A (en) * | 1987-01-23 | 1998-08-04 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
GB8809860D0 (en) * | 1988-04-26 | 1988-06-02 | Ciba Geigy Ag | Process for production of polypeptides |
GB8907110D0 (en) * | 1988-05-04 | 1989-05-10 | Ciba Geigy Ag | Improvements in the production of polypeptides |
US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
ATE196927T1 (de) * | 1992-09-04 | 2000-10-15 | Novartis Ag | Verfahren zur herstellung von proteaseinhibitoren |
DE69616276T2 (de) | 1995-02-09 | 2002-12-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur produktion von proteinen |
US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
JP7284955B2 (ja) * | 2020-07-20 | 2023-06-01 | フォーデイズ株式会社 | 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP0138111B1 (en) * | 1983-10-03 | 1991-11-21 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms |
PT79518B (pt) * | 1983-11-21 | 1986-12-12 | Ciba Geigy Ag | 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr |
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