JPS62208296A - トロンビン阻害剤の製造方法 - Google Patents

トロンビン阻害剤の製造方法

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JPS62208296A
JPS62208296A JP61293558A JP29355886A JPS62208296A JP S62208296 A JPS62208296 A JP S62208296A JP 61293558 A JP61293558 A JP 61293558A JP 29355886 A JP29355886 A JP 29355886A JP S62208296 A JPS62208296 A JP S62208296A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換ＤＮＡ技術の分野に関し、そして遺伝子操
作が行われた真核細胞によるトロンビン阻害剤デスルフ
ァトヒルジンの製造方法、この遺伝子操作が行われた真
核細胞、デスルファトヒルジンの遺伝子を担持するバイ
ブリドベクター、並びに上記真核細胞および上記ハイブ
リッドベクターの製造方法に関する。
〔従来の技術〕
ヒルジンは天然にはヒルすなわちヒルド・メディシナリ
ス（ｌｌｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）中に存
在する抗凝血物質である。ヒルジンは単一の蛋白質種で
はなく、少なくとも３種の、ヒルジン変形体１（１ｆＶ
１）、ヒルジン変形体２　（ＨＶ２）（欧州特許出願第
１５８．５６４号明細書を参照されたい）および「デス
−（ＶａｌＬ−ヒルジン」　（欧州特許出願第１５８，
９８６号明細書を参照されたい）と命名された成分から
成っている。これ等の変形体は構造が互いに幾つかのア
ミノ酸において異なっている（特にＨＶＩのＮ−末端配
列がＶａ　１−Ｖａ　ｌ　−Ｔｙｒであり、ＨＶ２のＮ
−末端配列がｌ１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒであり、「デス゛
　（Ｖａｌ）ｚ−ヒルジン」のＮ−末端配列がＴｈｒ−
Ｔｙｒである）が、Ｎ−末端の疎水性アミノ酸、Ｃ−末
端の極性アミノ酸、スルフェート・モノエステルとして
存在するチロシン残基（Ｔｙｒｂ３）、３個のジスルフ
ィド・ブリッジおよび抗凝血活性を共通に有する。
Ｋｉ値（複合体解離定数）が６ｘｌＯ−”　Ｍであるヒ
ルジンは、既知の最も強力なトロンビン阻害剤であり、
トロンビンへの侍異的な親和性を特徴とする。血液凝固
カスケードのその他の酵素は、ヒルジンによって阻害さ
れない。通常の抗凝血治療における好ましい抗凝血剤で
あるヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直接にトロンビ
ンに対して阻害作用を行い、前者とは異なりアンチトロ
ンビン■を介して作用するものではない。精製したヒル
ジンの唯一の薬理学的に検出し得る効果は、血液凝固の
阻害と血栓症の予防である。犬に静脈内に投与した場合
には、多量に投与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する効果
は観察されなかった。ラット、豚および犬での試験では
、ヒルジンは、（欝血によってまたはトロンビンの注射
によって誘発される）実験的血栓症、内毒素ショックお
よびＤＩＣ（散在性腺管内凝血）において有効であるこ
とが証明されている。直接比較試験を行った場合には何
時でも、ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが証
明されている。また、ヒルジンの毒性は極めて低（、非
抗原性であり且つ生物学的に活性な形で腎臓からのほぼ
完全なりリアランスを示す。
〔発明が解決しようとする問題点〕
ヒルジンはかなり以前から知られてはいたが、その優れ
た生物学的特性から期待される広汎な治療的利用は未だ
達成されていない。その極端に限定された利用性は、医
薬における広汎に使用する上での重要な欠点である。従
来は、ヒルジン製剤は本質的には天然物質（ヒル抽出液
）から得られており、入手には費用が掛かり且つ困難で
あり、またこの方法は時間が掛かり且つ費用が掛かる分
離および精製法を用いている（Ｐ、Ｗａｌｓｍａｎｎら
のＰｈａｒ＋ｗａｚｉｅ　、第３６巻、６５３頁（’１
９８１年）；欧州特許出願第１５８．９８６号明細書を
参照されたい）。
アミノ酸配列が６５と比較的長という観点からも、従来
のペプチド合成では経済的理由から成功の望みが少ない
。それ故、ヒルジンの治療効果の詳細な臨床試験及びそ
の広汎な抗凝血治療での使用を可能にする適当な量のヒ
ルジンを製造するには、新規な方法を用いなければなら
ない。
かかる方法は、特に組換ＤＮＡ技術によって提供される
。個の技術によれば、非常に多種の生理学的に活性なポ
リペプチドは対応する遺伝学的に変性された宿主生物を
培養することによって製造することが可能である。これ
に関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸化されるデス
ルファトヒルジンを介してヒルによって製造されるもの
といわなければならない。ヒル以外の宿主は特異的なス
ルフェート転移酵素系を欠いており、それゆえヒルジン
ではなくデスルファトヒルジンを生成するものと予想さ
れる。しかしながら、対応するヒルジン蛋白質のＴｙｒ
６３残基のフェノール性ヒドロキシルカラのスルフェー
ト基の酵素による除去によって得られるデスルファトヒ
ルジンタンパクによって明らかなように、その生物活性
はスルフェート基の不在によっては損なわれない（欧州
特許出願第１４２，８６０号明細書を参照されたい）。
近年に公開された欧州特許出願第１５８，５６４号明細
書には、それぞれのデスルファトヒルジン変形体のため
の構造遺伝子を含をするプラスミドで形質転換されＥ、
コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｔ）細胞によるデスルファトヒル
ジン変種１および２、並びにそれ等の類似体の調製が開
示されている。培養されたＥ。
コリ細胞の細胞抽出液によって測定され且つ抗トロンビ
ン単位（ｒＡＴＵＪ）ｆｉｔで与えられる抗凝血活性は
、３．０００〜４．０００ＡＴ口１０Ｄ、。。／１培養
液であり、これは（純粋なヒルジン１ｍｇの理論的比活
性を１５，０００〜２０．０００ＡＴｔｌとして）０．
２ｍｇヒルジン１０Ｄ／１の濃度に相当する。
形質転換されたＥ、コリ細胞から得られる低収率のヒル
ジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の不正確な折り
畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不活性な形で蓄
積されることに起因するものと考えられる。正確な折り
畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジン分子内の３個
のジスルフィドブリッジの形成によるものである（Ｐ、
Ｗａｌｓｍａｎｎらの上記文献を参照されたい）。その
他の天然に分泌される哺乳類の蛋白質、例えば子牛の成
長ホルモン、ヒトの！１１１１ｍプラスミノーゲン活性
化因子およびヒトγ−インターフェロンも、微生物の細
胞質中に生産され且つ蓄積された場合には本質的には不
活性である（Ｒ，Ａ、　Ｓｍ１ｔｈら、５ｃｉｅｎｃｅ
　％第２２９巻、１２１９頁（１９８５年）を参照され
たい〕。
ジスルフィドブリッジを有するほとんどの蛋白質は細胞
外性であるので、その分泌経路はジスルフィド結合の形
成に有利であろう。分泌を非常に好ましくするその他の
特徴がある。すなわち、分泌された蛋白質は、一般的に
細胞内に蓄積された生酸物よりも容易に検出され且つ精
製され、所望の生成物が培地中に分泌されることにより
、生成物を回収するために宿主生物を破壊する必要がな
く；幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対して毒性効果を
有し、分泌されると、それ等は圧伏な細胞機能を余り妨
害しなくなり；分泌された蛋白質は、細胞の崩壊時に蛋
白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積された蛋白質
よりもこれ等の酵素によって消化されにくい。
はとんどの分泌される蛋白質は、成熟アミノ酸配列に付
随するアミノ末端伸長部としてのシグナルペプチドを有
するプレ蛋白質としてＤＮＡ上にコードされている。シ
グナルペプチドは、小泡体（ＥＲ）の膜中への蛋白質の
翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な役割を演じる
。シグナルペプチダーゼはＥＲの管腔側で早期にシグナ
ルペプチドを開裂させる。外側細胞膜へのその後の輸送
はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白質はべりプラ
ズム空間（例えば、酸性ホスファターゼ、インベルター
ゼ）中へも、または培地（例えばα−ファクター、キラ
ー・トキシン）中へも分泌される。
総ての真核生物は遺伝情報を発現しそして発現された蛋
白質を分別する機構を共有すると思われるので、真核生
物宿主ではＥ、コリよりもはるかに効率的に真核遺伝子
の発現が進行する。真核生物の中では、酵母が最初に操
作され且つ培養されるようになったものである。多数の
異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてきた。しかしな
がら、付加されたシグナルペプチドの場合を除き、媒質
中に効率的に分泌させることができる蛋白質の本質的な
特徴を定義することは今までのところは不可能であった
。それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かについて確実に
予測することは可能になっていない。例えば、（プレー
グルコアミラーゼについての遺伝子情報を有する）形質
転換された酵母によって産生される総グルコアミラーゼ
の９０％は培地中に分泌され（特許協力条約に基づく特
許出願第８４／２９２１号明細書）、高力価の表皮成長
因子（ＥＧＦ）が付随するαファクター・シグナルペプ
チドを有するＥＧＦの遺伝子を含む培養酵母の培地中に
見い出されるが（欧州特許出願第１１６．２０１号明細
書）、β−エンドルフィン（α因子シグナルペプチド、
特許協力条約に基づく特許出願第８４／４３３０号明細
書）、真核生物のインターフェロンＡ（インベルターゼ
シグナルペプチド、欧州特許出願第１２７．３０４号明
細書）、ヒトγ−インターフェロン、ヒト血清アルブミ
ン、ウシインターフェロンα１およびα２、Ｍｌ織プラ
スミノーゲン活性化因子、レニンおよびヒトインシュリ
ン様成長因子（α−ファクター・シグナルペプチド、欧
州特許出願第１２３．５４４号明細書）、白血球インタ
ーフェロンＤおよびＡ、γ−インターフェロンおよびヒ
ト成長ホルモン（ＭＧＨ）（それぞれインターフェロン
およびＭＧＨシグナルペプチド、欧州特許出願第８８．
６３２号明細書）′は少量または痕跡量しか培地中に検
出されず、形質転換された酵母では、シュドモナス・カ
ルボキシペプチダーゼＧｚ（ＣＰＧｚ）ＣＧｚ（ＣＰＧ
ｚ）シグナルペプチド、欧州特許出願第１２１．３５２
号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｐ
　ＩＩ　Ｏ５シグナルペプチド、欧州特許出願第１４３
．０８１号明細書）の媒質中への分泌は見られない。し
たがって、付随のシグナルペプチドを有する所定の蛋白
質が酵母によって分泌されるか否かは予測不可能であり
、結局のところ選択される蛋白質によって異る。また、
付随のシグナルペプチドを有するヒルジンの様な選択さ
れた蛋白質が酵母のような形質転換された宿主生物によ
って少なくともある程度まで分泌されるかどうかについ
ては、不確実であった。
驚くべきことには、デスルファトヒルジンの構造遺伝子
及びそのにありそしてそれとリーディングフレームが合
っているシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
んで成るＤＮＡを含有する真核宿主生物によって、ヒル
ジン活性を有する蛋白質が培地中に分泌されることが見
い出された。
本発明の目的は、真核宿主生物においてヒルジン活性を
有する蛋白質の生産および分泌のための方法を提供・す
ることである。
本発明のもう一つの目的は、デスルファトヒルジンの構
造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を含有するハイブリッドベクター、並びに上記
ハイブリッド・ベクターにより形質転換された真核宿主
生物を提供することである。
ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明は、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であ
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡ
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るＤ
ＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタゾバクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
「成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列」
という用語は、ヒルゲノムに存在することが知られてお
り、そして／または上記ゲノムから分離することができ
る、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコードする総て
の構造遺伝子、例えば、成熟デスルファトヒルジン変形
体ＨＶＩ、ＨＶ　２、ＰＡ、およびデス−（Ｖａｌ）、
−デスルファトヒルジン（ＨＶＩ遺伝子の発現の単なる
人工産物ではない場合）の構造遺伝子を包含することを
意図する。［成熟デスルファトヒルジン」という用語は
、プレー配列およびブロー配列を欠いているデスルファ
トヒルジンを指す。
「ヒルジン活性を有する蛋白質」とは、トロンビン阻害
作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を有し、そして
デスルファトヒルジンの一次構造を有する分泌宿主細胞
から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸化の様な修飾
がなされた対応するヒルジン化合物、および短縮された
それ等の誘導体、例えばＣ−末端の１〜７個のアミノ酸
を欠いているデスルファトヒルジンであると理解すべき
である。
上記の蛋白質は、具体的には次の式（■）：Ｘ　Ｔｙｒ
　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　
Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＡｓｎＬｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙ
ｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ
　ＧｌｙＧｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌ
ｉｅ　Ｌｅｕ　Ｇｔｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＧｌｙＧｌｕ
　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＰｒｏ　　Ｌｙｓ　　
Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｉｓ　　Ａｓｎ　
　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　ｒ’ｈｅＧｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｉｎ（Ｉ） 〔式中、Ｘはジペプチド残基Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−（
ＨＶＩ）またはＴｈｒ（デス−（Ｖａｌ）ｚ−ヒルジン
〕であり、そしてＲはＴｙｒのフェノール性ヒドロキシ
ル基または式−〇−３０，３１１で表わされる基である
〕、で表わされる蛋白質、並びにＣ−末端アミノ酸Ｇ　
１　ｎ　ｓ　Ｃ−末端ジペプチド−Ｌｅｕ−ＧｌｎＳＣ
−末端トリペプチド−Ｔｙｒ　　（Ｒ）−Ｌ　ｅ　ｕ　
−Ｑ　Ｉ　ＨまたはＣ−末端テトラペプチド−Ｇｌｕ−
Ｔｙｒ（Ｒ）　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを欠いている誘導体；
あるいは、 次の式（■）： ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＡｓｎ　Ｌｅｕ
　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　
Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＣｙｓＧｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　
　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　
　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ
　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｕ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ
Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ（ＩＩ） （ＨＶ２）（式中、Ｒは上記定義の通りである）で表わ
される蛋白質：あるいは、ヒルジンＰＡと命名され、ヒ
ルによって産生されり、　Ｄｏｄｔ　、博士論文、ミュ
ンヘン大学、西ドイツ、１９８４年）、そして次の式（
■）： １１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＡｓｎ　　Ｌｅ
ｕ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　ＣｙｓＧｌｙ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＧｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ａ
ｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｎ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｔ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　ＧｌｙＴｈｒ　Ｐｒｏ　
Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　１ｌｉｓ　Ａｓｎ　
Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌ
ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ
　Ｇｌｕ（ＩＩＩ） （ＰＡ）（式中、Ｒは上記定義の通りである）で表わさ
れるもう一つのヒルジン変形体である。
ヒルジン活性を有する好ましい蛋白質は、式Ｉ（但し、
Ｘは残基Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ−であり、ＲはＴｙｒのフ
ェノール性ヒドロキシル基である）を有する蛋白質、お
よびＣ−末端においてアミノ酸が１〜７個、特に１〜４
個だけ短縮されているその誘導体である。
好適な真核宿主生物は、高等生物、特に、哺乳類の細胞
、特にＶＥＲＯもしくはＩＩ　ｅ　ｒ　ａ細胞またはチ
ャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）セルラインのよ
うな樹立されたヒトまたは動物セルラインおよびサツカ
ロミセス・セレビシェ一旦ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母である。本発明の好
ましい宿主生物は、酵母、特にサツカロミセス・セレビ
シェ−の株である。
上記ＤＮＡ配列を有する真核宿主生物、特に酵母は、当
業界において既知の方法を用いて培養される。
本発明により形質転換された酵母株は、資化可能な炭素
源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で培養
される。
各種の炭素源が利用できる。好ましい炭素源の例は、グ
リコース、マルトースまたはラクトースのような資化性
炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢酸塩であり、
単独でまたは適当な混合物として用いることができる。
好適な窒素源としては、例えばカザミノ酸のようなアミ
ノ酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等の分解生成物
、例えばトリプトン、ペプトン、または肉エキス、更に
酵母エキス、マルトエキス、コーンステイープリカー、
あるいはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあり、単独で
もまたは適当な混合物としても用いられる。使用するこ
とができる無機塩には例えば、ナトリウム、カリウム、
マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン
酸塩および炭酸塩がある。また、培地は成長促進物質を
含んでいてもよい。成長を促進する物質には１、例えば
鉄、亜鉛、マグネシウムなどのような痕跡量の元素また
はアミノ酸がある。
自律複製プラスミド、例えば酵母２μプラスミドＤＮＡ
　（後記）で形質転換された酵母細胞は、導入されたハ
イブリッドプラスミドを、種々の程度で失いやすい。こ
のため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、すなわち増
殖のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現を要
する条件下で生育させねばならない。一般に用いられ、
そして本発明のハイブリッドベクターに存在するほとん
どの選択マーカー（後述）は、アミノ酸またはプリン生
合成の酵素をコードする遺伝子である。これにより、対
応するアミノ酸またはプリン塩基を欠いている合成最少
培地を用いることが必要になる。
しかしながら、適当な殺生物剤ｒに対する耐性を付与す
る遺伝子（例えば、シクロへキシミド、アミノグルコシ
ドＧ４１Ｂ　、重金属などに対する耐性を付与する遺伝
子）も同様に用いられる。抗生物質耐性遺伝子を有する
ベクターで形質転換された酵母細胞を、対応する抗生物
質を含む複合培地中で生育させることにより、増殖速度
を速め、細胞密度を高くする。
染色体に組み込まれるＤＮＡにより形質転換された酵母
細胞は、選択的増殖条件を必要としない。
これ等の形質転換細胞は十分に安定であり、選択圧なし
で増殖を行うことができる。これらの細胞は、複合培地
中で有利に増殖する。
構成的プロモーター（例えばＡＤＩＩ　ｒ　５ＧＡＰＤ
Ｈ）を有するハイブリッドプラスミドを含む酵母細胞は
、誘導なしに上記プロモーターによって制御されたたデ
スルファトヒルジン遺伝子を発現する。しかしながら、
このデスルファトヒルジン遺伝子が調節されるプロモー
ター（例えばＰＧＫ−または皿的）の制御下にある場合
には、ｍＲＮＡ転写物の水準を最高にするような増殖培
地の組成を採用しなければならない。すなわち、ＰＨ０
５プロモーターを用いるときには、増殖培地はこのプロ
モーターを抑、制解除するための低濃度の無機リン酸塩
を含んでいなければならない。
培養は、常用技術を用いることによって行う。
温度、培地のｐＨおよび醗酵時間のような培養条件は、
最高水準のデスルファトヒルジンが産生されるように選
択される。選択された酵母株を、約２５℃〜３５℃、好
ましくは約３０℃の温度で、４〜８のｐＨ値、例えば約
７のｐＨで、約４〜約２０時間、好ましくは最大収量の
蛋白質が得られるまで、振盪または攪拌を行いながら、
好気性条件下で液内培養で生育させるのが好ましい。
意外なことには、宿主生物および使用されるシグナルペ
プチドとは無関係に、はとんどの産生されたヒルジン化
合物は培地中に分泌され、極一部分だけが細胞に結合し
たまま残ることが見い出された。分泌された化合物／細
胞に結合した化合物の正確な比率は、醗酵条件および用
いた回収法によって変化する。一般的には、その比率は
約９：１以上になる。したがって、分泌されたヒルジン
が常に圧倒的な割合を占める。
ヒルジン化合物は、通常の方法によって培地から分離す
ることができる。例えば、第一の段階は、遠心分離によ
って細胞を培地から分離することにある。生ずる上澄液
をポリエチレンイミンで処理して大部分の非蛋白質性物
質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウムまたはトリ
クロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を沈澱せしめる
ことによって、ヒルジン化合物の濃度を高くする。宿主
蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性にすることによ
って（例えば、０．１％、ｐ）１４〜５）それを沈澱さ
せることもできる。酢酸上澄液をｎ−ブタノールで抽出
することによって、ヒルジン化合物の濃度を更に高くす
ることができる。他の精製工程は、例えば、脱塩、イオ
ン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、
分配クロマトグラフィ、ＩＩＰＬＣ１逆相クロマ逆相ク
ロマトグラフィロマトグラフィ法である。混合物の成分
の分離は、透析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法に
よる荷電に従って、適当なセファデックスカラムによる
分子サイズに従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用
いるアフィニティークロマトグラフィにより、あるいは
適当な担体に結合したトロンビンを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィにより、あるいはその他の方法、特
に文献公知の方法によって行うこともできる。
細胞に結合しているヒルジン化合物、すなわち細胞内ま
たはべりプラズマ空間に蓄積した化合物をも分離するこ
とが所望ならば、幾つかの補足的精製工程を必要とする
。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している場合には、目
的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞内部から蛋白
質を遊離させることである。はとんどの処理においては
、最初に、グルコシダーゼ（後述）を用いる酵素的消化
によって細胞壁を取り除く。次いで、生成するスベロブ
ラストをＴｒ　ｉ　ｔｏｎのような洗剤で処理する。
また、剪断力（例えば、Ｘ−プレス、フレンチ−ブレス
）またはガラス玉との振盪のような機械的力も、細胞を
破壊するのに好適である。ヒルジン化合物プーラ宿主、
特に酵母細胞によってペリプラズマ空間中に分泌される
場合には、単純化された方法を用いることができる。す
なわち、蛋白質は、細胞壁を酵素的に除去することによ
り、または化学的薬剤、例えばチオール試薬もしくはＥ
ＤＴＡを用いて処理し、細胞壁に損傷を与えて産生じた
蛋白質が放出されるようにすることによって、細胞を溶
解することなく回収される。
意外なことには、「成熟デスルファトヒルジンをコード
するＤＮＡ配列」に対応するデスルファトヒルジン化合
物とは別に、予想される化合物とはＣ−末端においてア
ミノ酸が１〜４個欠けている点において異なる幾つかの
その他のデスルファトヒルジン化合物を培養液から単離
することができることが、見出された。例えば、デスル
ファトヒルジン変形体Ｈｖ１をコードする遺伝子を有す
る酵母細胞を培養すると、この化合物と共に、Ｃ−末端
アミノ酸Ｇｌｎを欠いているデスルファトヒルジン化合
物〔デス−（Ｇ　１　ｎ　”　）−デスルファトヒルジ
ン〕、Ｃ−末端のジペプチド残基−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−（Ｌｅｕ
”　＊　Ｇｉｎ”）−デスルファトヒルジン〕、Ｃ−末
端のトリペプチド残基−７’ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−（Ｔｙｒ
６３＋　Ｌｅｕ”　＋　Ｇｉｎ”）−デスルファトヒル
ジン〕、およびＣ−末端テトラペプチド残基−Ｇｌｕ　
−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｉｎを欠いているデスルファト
ヒルジン化合物〔デス−（Ｇｌｕ”　。
Ｔｙｒ６３．　Ｌｅｕ”　、　Ｇｉｎ”）−デスルファ
トヒルジン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの化
合物は、−次発現生成物デスルファトヒルジンの（部分
的）蛋白質分解的な分解によって形成されたものと思わ
れ、用いた酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関係
に、総ての培溶液中に置いて同定された。
デス−（Ｇｌｎ”）−デスルファトヒルジン、デス（Ｔ
ｙｒ”、　Ｌｅｕ６４．　Ｇｉｎ”）−デスルファトヒ
ルジン〕、およびデス−（Ｇｉｎ”　、　Ｔｙｒ”　、
　Ｌｅｕ”　。
Ｇｉｎ”　）−デスルファトヒルジンは新規であり、そ
してやはり本発明の目的である。
抗ヒルジン抗体または抗デスルファトヒルジン抗体（例
えば、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル
抗体）を用いる試験、トロンビン試験ＣＭ、Ｕ、Ｂｅｒ
ｇｍｅｙｅｒ監修、Ｍｅｔｈｏｄｓユｎ　Ｅｎｚ　ｍａ
ｔｉｃハ旦ハｎ１第■巻、３１４〜３１６頁、Ｖｅｒｌ
ａｇＣｈｅｓ＋ｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　（西ドイツ
）　、１９８３年〕、または凝血試験ＣＦ、Ｍａｒｋｗ
ａｒｄｔら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、、第４７
巻、２２６頁（１９８２年）〕を用いてヒルジン活性を
検出することができる。
本発明の方法によってえられるヒルジン化合物は、それ
自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ変換すること
ができる。
例えば、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物（但し、ＲはＴ
ｙｒのフェノール性ヒドロキシル基である）は硫酸二ナ
トリウムのような硫酸塩および例えばヒル細胞からえら
れるチロシンスルホトランスフェラーゼと反応させて、
式（Ｉ）〜（■）（但し、Ｒは式−０ＳＯ，１１で表わ
される基である）を有する化合物へ変換することができ
る。
得られたデスルファトヒルジン化合物、例えばデスルフ
ァトヒルジン変形体ＨＶＩを、例えば好適なカルボキシ
ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＹの作用
によってＣ−末端において１〜７このアミノ酸を欠いて
いる誘導体へ変換することも可能である。
本発明によって形質転換された真核宿主生物は、次の工
程を含んで成る組換ＤＮ人技術によって調製することが
で告る。すなわち、 ◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンを
コードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームがあっているシグナルペプ
チドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグ
メントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるも
のと、真核生物の転写終止シグナルを有するＤＮＡ配列
とを含有するＤＮＡ造成物を調製し； ■上記ＤＮＡ造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し： ■調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し；そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する； 工程を含んで成る。
本発明は、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤ
ＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るＤＮＡ配列と含有するＤＮＡ造成物に関する。
シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンをコード
するＤＮＡ配列の発現を制御するために数種類の発現制
御配列を用いることができる。詳細には、形質転換され
る宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が用い
られる。
哺乳類の細胞に用いるには、発現制御配列は好ましくは
ウィルスに由来する。例えば、哺乳類の細胞に用いるの
に好適な発現制御配列は、シミアン・ウィルス（Ｓｉｎ
＋ｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ）４０（Ｓ　Ｖ２Ｏ）の初期およ
び後記プロモーター、ワタシニアプロモーター、ＩＩ　
Ｔ　ＬＶプロモーター、またはポリオーマもしくはアデ
ノウィルス２に由来するプロモーターである。
本発明による最も好ましい宿主生物である酵母の発現制
御配列は、酵母、特にサツカロミセス・セレビシェ−の
ゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファトヒルジンの
発現のために用いられる。例えば、１肚１遺伝子、ＡＤ
Ｈ！または」Ｕ↓遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０
５）遺伝子、イソチトクロームＣ遺伝子のプロモータ、
あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ口ＩＩ　’）　、３−
ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）　、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフエートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはａ−または
α−ファクターをコードする酵母に適合するフェロモン
遺伝子のプロモーターを用いることができる。一つの酵
母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）ともう一つの酵母
遺伝子の機能性ＴＡＴＡボックスを含有する下流プロモ
ータ要素とを含んで成るハイブリッドプロモーター、例
えば酵母■躯遺伝子のＵＡＳと酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子の
機能的ＴＡＴＡボックスを含有する下流プロモーター要
素とを含有するハイブリッドプロモーターを用いること
もできる０本発明の好ましいベクターは、転写調節を伴
うプロモーターを含有する。
この型のプロモーター、例えばＰＨ０５遺伝子のプロモ
ーターおよびＰＨ０５−ＧＡＰＤ１１ハイブリッドプロ
モーターは、増殖条件を変えることによってターンオン
又はターンオフすることができる。例えば、Ｐ　ＩＩ　
０５プロモーターは、単に培地中の無機リン酸塩の濃度
を増減させることによって、自由に抑制したりまたは抑
制を解除したりすることができる。
本発明の他の好ましいプロモーターは、ＧＡＰＤＨ遺伝
子のプロモーター、特にヌクレオチド−３００〜−１８
０、特にヌクレオチド−２６３〜−１９９から始まり、
そしてＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　ＩＩ遺伝子のヌクレオチド−５
で、終了する機能性フラグメントである。
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（「シグナル
配列」）は、真核細胞性の、例えば酵母の通常に分泌さ
れるポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。好
適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノムＤＮＡから得
られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナル配列、例え
ば酵母インベルターゼ、ａ−ファクター、α−ファクタ
ー、フェロモンペプチダーゼ、「キラートキシン」およ
び抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のシグ
ナルおよびプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワ
モリからのゲルコミラーゼシグナル配列である。また、
融合シグナル配列は（存在するとすれば）用いるプロモ
ーターに天然に結合している遺伝子のシグナル配列の部
分をヒルジンシグナル配列の部分に連結することによっ
て造成することができる。これらの組み合わせは、シグ
ナル配列と成熟デスルファトヒルジンアミノ酸配列との
間で正確に開裂できるものが好ましい。追加の配列、例
えば特異的なプロセシングシグナルを担持するか又は担
持しないプロ配列又はスペーサー配列をも造成物中に含
ぬることによって前駆体分子の正確なプロセシングを容
易にすることもできる。また、生体内または生体外での
適切な成熟を可能にする内部プロセシングシグナルを含
有する融合蛋白質を生成させることができる。例えば、
プロセシングシグナルは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ残基を含有し
、これはゴルジ体膜中に存在する酵母エンドペプチダー
ゼによって認識される。本発明の好ましいシグナル配列
は、次の式： ％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母ＰＩＩ
０５遺伝子のシグナル配列、および次の式：Ｍｅｔ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　
Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　ＡｌａＧｌ
ｙ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌ
ｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａで表わされるシグナルペプチド
をコードする酵母インベルターゼ遺伝子のシグナル配列
である。
成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列は、
具体的には上記定義のデスルファトヒルジンの構造遺伝
子から選択される。好ましいＤＮＡ配列は、デスルファ
トヒルジン変形体１　　（ＨＶｌ）をコードし、そして
次の式： ％式％ 真核性の転写停止シグナルを有するＤＮＡ配列は、好ま
しくは転写停止およびポリアデニル化の以下余白 ための適当なシグナルを含有する真核性の遺伝子の３′
−フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列である。好適
な３′−フランキング配列は、例えば用いられる発現制
御配列に天然に結合し゛ている配列である。
酵母が宿主生物として用いられる場合には、好ましいフ
ランキング配列は酵母Ｐ１１０５遺伝子の配列である。
好ましくは、本発明のＤＮＡ造成物は、クローニングベ
クターへの造成物挿入及びクローニングを可能にする合
成デオキシヌクレオチドリンカーを両端に備えている。
真核性発現制御配列、シグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列、成熟デスルファトヒルジンをコードするＤＮ
Ａ配列および真核性転写停止シグナルは互いに作用可能
に連結される。すなわら、それらの正常な機能が維持さ
れるように併置される。すなわち、この配置においては
、発現制御配列がシグナルペプチド−デスルファトヒル
ジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転写停止シグナ
ルが転写およびポリアデニル化の適切な停止を行い、そ
してデスルファトヒルジンの分泌が起るようにシグナル
配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結合される。し
たがって、好ましくは、発現制御配列およびシグナル配
列が異なる遺伝子に由来するものであるときには、発現
制御配列は大ｍＲＮＡ開始部位と発現制御配列に天然に
連結されている遺伝子のＡＴＧとの間でシグナル配列に
結合している。シグナル配列は、翻訳開始のためのそれ
自身のＡＴＧを有するべきである。これらの配列は、好
ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配列を有すること
ができる合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーによ
って連結されている。
他方、シグナル配列の最後のコドンはデスルファトヒル
ジンの遺伝子の最初のコドンに直接連結される。
本発明のＤＮＡ造成物は、当業界において公知の方法、
例えば真核性発現制御配列、デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメ
ント、および真核性転写停止シグナルを含有するＤＮＡ
配列を、ＤＮＡセグメントの適切な発現と生成したデス
ルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物において行われ
るような態様で連結するすることにより調製される。
各種ＤＮＡ配列を連結して本発明のＤＮＡ造成物を形成
する場合、この連結は平滑末端連結によって、または適
当な共通の制限部位によって、あるいは合成リンカ−分
子を介して、正確な連結が生じてこれらのＤＮＡ配列の
正常な機能が維持されるように特別の注意を払いながら
行う、すなわち、シグナル配列およびデスルファトヒル
ジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合させることが
できる。シグナル配列とデスルファトヒルジン遺伝子と
を正しく連結するためのもう一つの方法においては、可
能ならば、シグナル配列をその３′末端近くで制限酵素
切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝子をその５′
末端近くで制限酵素切断して各配列が所定数の塩基対を
欠くようにする。
次に、制限切断されたシグナル配列と制限切断されたデ
スルファトヒルジン遺伝子とを連結用オリゴデオキシヌ
クレオチドを介して連結した場合に、欠損した塩基対が
修復されてデスルファトヒルジン遺伝子がシグナル配列
に関して適切なリープインフレームになるように、合成
オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを造成することが
できる。
デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列はヒルの
ゲノムＤＮＡから単離することができ、または相補的二
本鎖デスルファトヒルジンＤＮＡ（デスルファトヒルジ
ンｄｓｃＤＮＡ）をデスルファトヒルジンｍＲＮＡから
調製するか、またはデスルファトヒルジンのアミノ酸配
列をコードする遺伝子を化学的または酵素的方法によっ
て調製することができる。例えば、それ自体公知の方法
によって、ゲノム性デスルファトヒルジンＤＮＡ。
およびデスルファトヒルジンｄｓｃＤＮＡが得られる。
例えば、ゲノム性デスルファトヒルジンＤＮＡは、デス
ルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺伝子バンクか
ら、ヒルＤＮＡフラグメントを微生物中でクローン化し
、デスルファトヒルジンＤＮＡを含有するクローンを、
少なくとも１５個の、好ましくは１５〜３０個のデオキ
シヌクレオチドを含有する放射性ラベル化デスルファト
ヒルジンＤＮＡ−特異的オリゴデオキシヌクレオチドを
用いるコロニーハイブリダイゼーションによって同定す
ることによって得られる。得られるＤＮＡフラグメント
は、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の他に不所望の
その他のＤＮＡ成分を含むが、これらは適当なエキソヌ
クレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処理することに
よって除去することができる。
二本鎖デスルファトヒルジンｃＤＮＡは、例えば、ヒル
ジンを産生ずるように適切に誘導された適当なヒルの細
胞からｍＲＮＡを分離し、それ自体公知の方法で、生成
するｍＲＮＡ混合物中のデスルファトヒルジンｍＲＮＡ
を濃縮し、このｍＲＮＡを１末鎖ｃＤＮＡを調製する場
合の鋳型として用い、こうしてＲＮＡ依存性のＤＮＡポ
リメラーゼによってｄｓｃＤＮＡを合成し、これを適当
なベクター中にクローン化することによって調製するこ
とができる。デスルファトヒルジンｃＤＮＡを含むクロ
ーンは、例えば上記の方法で、放射性物質の標識を有す
るデスルファトヒルジンＤＮＡ特異的オリゴデオキシヌ
クレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーションに
よって同定される。
デスルファトヒルジン遺伝子は、化学的合成によっても
製造することができる。この方法は、上記遺伝子のコー
ド鎖および相補鎖のセグメントを化学的に合成して、生
成するセグメントを酵素的にデスルファトヒルジンの構
造遺伝子へと変換することを特徴とする。
ＤＮＡの化学的合成は、当業界において周知であり、常
用技術を用いる。適当な方法は、Ｓ、Ａ。
Ｎａｒａｎｇ　（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　、第３９巻
、３頁、１９８３年）によってまとめられている。詳細
には、欧州特許第１４６．７８５号明細書記載の方法が
用いられ、詳細は上記明細書を参照されたい。
同様な方法でシグナル配列は化学的合成によって調製す
ることができ、または適当な真核生物の染色体ＤＮＡか
ら単離することもできる。
本発明によれば、真核性発現制御配列と、成熟デスルフ
ァトヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から
成るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上の
ＤＮＡインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
本発明のハイブリッドベクターはハイブリッドプラスミ
ドおよび線状ＤＮＡベクターからなる群から選択され、
そして更に形質転換しようとする宿主生物に依存して選
択される。
本発明は特に、真核性発現制御配列と、成熟デスルファ
トヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームが合っている
シグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成
るＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含ん
で成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤ
ＮＡインサートを含んで成る線形ＤＮＡベクターであっ
て、上記発現制御配列と上記転写停止シグナルを含んで
成る配列とが同じ真核細胞の遺伝子に由来する上記ベク
ターに関する。特に、本発明は、酵母ＰＩ＋０５プロモ
ーター、上記ＤＮＡセグメントおよび鷹の３′フランキ
ング領域を含んで成る線状ＤＮＡベクターに関する。
相同な３′フランキング配列および５′フランキング配
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状ＤＮＡベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母ＰＩＩ０５プロ
モーターおよび酵母ＰＨ０５遺伝子の３′フランキング
配列の場合には、酵母染色体■のＰＨ０５座に組み込ま
れる。
本発明はまた特に、発現制御配列、上記ＤＮＡ配列、お
よび転写停止シグナルを含む配列とは別に、プロモータ
の機能、すなわちデスルファトヒルジン遺伝子の発現に
は本質的ではないがまたは余り重要でないが、例えば上
記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に
おいては重要な機能を行うＤＮＡ配列を有するハイブリ
ッドプラスミドに関する。この追加のＤＮＡ配列は、原
核生物および／または真核生物の細胞に由来するもので
もよく、染色体ＤＮＡ配列および／または染色体外ＤＮ
Ａ配列を含有するものでもよい。例えば、この追加のＤ
ＮＡ配列はプラスミドＤＮＡ、例えば細菌または真核生
物のプラスミドＤＮＡ、ウィルスのＤＮＡ、および／ま
たは染色体ＤＮＡ。
例えば細菌、酵母または高等真核生物の染色体ＤＮＡに
由来する（またはこれらから成る）ものでもよい。好ま
しいハイブリッドプラスミドは、細菌性プラスミド、特
にＥ、コリプラスミドｐＢＲ３２２、または関連するプ
ラスミド、バクテリオファージλ・酵母２μプラスミド
および／または酵母染色体ＤＮＡに由来するＤＮＡ配列
も含む。
本発明による好ましいハイブリッドプラスミドにおいて
は、これらの追加のＤＮＡ配列は酵母複製開始点および
酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵母複製開始点
、例えば自律複製セグメント（ａｒｓ）を含有するハイ
ブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母細胞内で染色
体外に維持され、有余***の際に自律複製する。酵母２
μプラスミドＤＮＡと相同な配列を有するハイブリッド
プラスミドも、同様に用いられる。これらのハイブリ、
ドブラスミドは組換によって既に存在している２μプラ
スミドに組み込まれ、または自律複製を行う。
酵母の選択遺伝子マーカーについては、マーカーの表現
型発現により形質転換体の選択を容易にするものであれ
ば、いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。
酵母に好適なマーカーは特に、抗生物質耐性を発現する
ものであるか、または栄養要求酵母変異株の場合には、
宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロへキサミドに対する耐性を
付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例えば０ＲＡＬ
、ＵＲＡ３、ＡＲＧ４．　ＵＥＵ２、ＨＩＳ４、ＨＩＳ
３、ＴＲＰ５または里遺伝子に原栄養性を付与する。
本発明のハイブリッドプラスミドに存在するその他のＤ
ＮＡ配列はまた、細菌宿主、特にＥ、コリの複製開始点
および選択遺伝子マーカーを含有するのが有利である。
酵母ハイブリッドプラスミド中にＥ、コリ複製開始点お
よびＥ、コリマーカーが存在することに関連する有用な
特徴がある。
第一に、Ｅ、コリにおける増殖及び増幅により多量のハ
イブリッドプラスミドＤＮＡを得ることができ、第二に
、Ｅ、コリに基礎を置くクローン化技術の全レパートリ
−を用いてＥ、コリ中でハイブリッドプラスミドを便利
に造成することである。
ｐＢＲ３２２などのＥ、コリプラスミドは、Ｅ、コリ複
製開始点、並びに例えばテトラサイクリンおよびアンピ
シリンのような抗生物質に対する耐性を付与するＥ、コ
リ遺伝子マーカーを含み、酵母ハイブリッドベクターの
一部分として有利に用いられる。
酵母および細菌宿主（上記参照のこと）の複製開始点お
よび遺伝子マーカーを含有する追加のＤＮＡ配列は、こ
れ以後は［ベクターＤＮＡＪと称し、特に発現制御配列
およびデスルファトヒルジン遺伝子を含む上記ＤＮＡ造
成物と共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成して
いる。
本発明のハイブリッドベクターは１個以上のＤＮＡイン
サートを含有し、これらのインサートのそれぞれは特に
、発現制御配列、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列、および成熟デスルファトヒルジンをコードするＤ
ＮＡ配列を含有するであろう。ハイブリッドベクターが
複数のＤＮＡインサート、好ましくは２〜４個のＤＮＡ
インサートを含有する場合には、これらは縦列（ｔａｎ
ｄｅ＋ｗ）に並んでいてもよくまたはハイブリッドベク
ターの異なる部位に存在することもできる。好ましいハ
イブリッドベクターは１個のＤＮＡインサートまたは縦
列（ｔａｎｄｅａ＋）に並んだＤＮＡインサートを含む
。ＤＮＡインサートは、特に頭対尾に配置される。
本発明によりハイブリッドプラスミドは、当業界におい
て公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの調
製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファト
ヒルジンをコードする第二のＤＮＡ配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成る
ＤＮＡセグメントであって上記発現制御配列の転写制御
下にあるものと、真核生物の転写停止シグナルを含有す
るＤＮＡ配列とを含有する１個又は複数個のＤＮＡ造成
物をベクターＤＮＡに導入するか、あるいは上記ＤＮＡ
造成物の構成成分を所定の順序でベクターＤＮＡ中に逐
次的に導入することから成っている。本発明のハイブリ
ッドプラスミドは常用の連結技術を用いて造成される。
プラスミドの成分は、共通の制限部位を介して、および
／または合成リンカ−分子により、および／またはブラ
ーント末・端連結によって連結される。
本発明の線形ＤＮＡベクターは、本質的に第２節に記載
のＤＮＡ造成物に対応し、そして同様な方法で調製され
る。
４、７　−　　れた　ケ 本発明のもう一つの観点は、真核生物の発現制御配列と
、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のＤＮＡ
配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフレ
ームが合っているシグナルペプチドをコードする第一の
ＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであって上記発現
制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写停
止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが含有
する１個以上のＤＮＡインサートを含んで成るハイブリ
ッドベクターで形質転換された真核生物およびそれらの
変異株に関する。
好適な真核宿主生物は、特に上記のものであり、特に、
クルイベロミセス」違１■胚」１特）　、キャンディダ
（Ｃａｎｄｉｄａ）　、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロ
ウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）　、サツカロミセス旦匹吐
肛姐り且）、シッオサッカロミセスーＱ堕１仔ｌ狙勅１
１ジμ狙）、トルロプシス（ハ匹旦■亘）属および関連
の属（Ｊ、Ｌｏｄｄｅｒ　、、　Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔｓ
ｓアムステルダム、１９７１年を参照されたい）であり
、特にサツカロミセス・セＬｚヒシエ−（Ｓａ匹血皿肚
並Ｌ」匹■虹ヤ）ノ株がある。
形質転換された真核宿主細胞は、真核生物の発現制御配
列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のＤ
ＮＡ配列及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードする第
一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメントであって上記
発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転
写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列とをそれぞれが
含有する１個以上のＤＮＡインサートを含んで成るハイ
ブリッドプラスミドで形質転換され真核宿主生物、並び
に宿主の染色体に安定に組み込まれた上記ＤＮＡインサ
ートを有する真核宿主生物がら選択される。
上記形質転換された真核宿主生物の製造法は、真核生物
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列と
をそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡインサートを含
んで成るハイブリッドベクターにより真核宿主生物を形
質転換することを含んで成る。
真核宿主細胞の形質転換は、当業界において知られてい
る方法によって行われる。例えば、酵母のハイブリッド
ベクターを用いる形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎらの記載の
方法により行うことができる（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｅｔ＋　、、ＵＳＡ　、第７５巻、１９２９
頁（１９７８年）〕。この方法は、３段階に分けること
ができる。
（１）カタツムリ消化管汁〔例えばＧｌｕｓｕｌａｓｅ
（登録商標）またはＨｅ１ｉｃａｓｅ　（登録商標）〕
のような各種グルコシダーゼ製剤、または微生物から得
られる酵素混合物〔例えばＺｙｍｏｌｙａｓｅ（登録商
標）〕を、浸透圧的に安定した溶液（例えば１Ｍソルビ
トール）において用いる酵母細胞壁またはその部分の除
去。
（２）ＰＥＧ　（ポリエチレングリコール）およびＣａ
”イオンの存在での、ＤＮＡベクターによる「裸の」酵
母細胞（スフェロプラスト）の処理。
（３）寒天の固相における細胞壁の再生および形質転換
された細胞の選定。この再生は、スフェロプラストを寒
天中に埋め込むことによって好都合に行われる６例えば
、溶融した寒天（５０”ｃ）をスフェロプラストと混合
する。溶液を酵母の増殖温度（約３０℃）にまで冷却す
ることにより固層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須の高分子の速やかな拡散と損失を防止
するためのものであり、それにより細胞壁の再生が促進
される。しかしながら、細胞壁の再生は、予め形成して
おいた寒天層の表面にスフェロプラストをプレートする
ことによっても（効率は低いが）得ることができる。
再生寒天は、形質転換された細胞の再生と選定が同時に
起るような方法で調製するのが好ましい。
一般的には選択マーカー（上述）としてアミノ酸生合成
経路の酵素をコードする酵母遺伝子が用いられるので、
再生は好ましくは酵母の最少寒天中で行われる。極めて
高効率の再生が必要とされる場合には、次の２段階処理
が有利である。すなわち、（１）高濃度の複合培地中で
の細胞壁の再生、および（２）選択寒天平板上に細胞層
をレプリカプレートすることによる形質転換された細胞
の選定。
上記線状ＤＮＡベクターを用いて真核宿主細胞を形質転
換する場合には、形質転換は好ましくは、酵母の選択マ
ーカーを有する第二のベクターの存在下で行われる。こ
の同時形質転換によると、直接的には選択することがで
きないＤＮＡを取り込んだ宿主細胞を濃縮することがで
きる。コンピテント細胞はいかなる型のＤＮＡをも取り
込むので、選択ベクターで形質転換された細胞はその他
のＤＮＡ　（例えば上記線形ＤＮＡベクター）をも高い
比率で担持するであろう。
形質転換された真核宿主生物、特に形質転換された酵母
株であって、本発明のハイブリッドプラスミドを含有す
るか、または宿主染色体に安定に組み込まれたデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を含んで成る線状ＤＮＡベクターを
有するものは、当業界において知られている方法を用い
て変異および選択によってデスルファトヒルジンの産生
を向上させることができる。突然変異は、例えば、紫外
線照射または適当な化合物によって行うことができる。
特に絆ましいものは、プロテアーゼを欠損した変異体、
特に酵母変異体であって、細胞内で生成したデスルファ
トヒルジン蛋白質の分解を避けるようにしたものである
。好適な変異体は、常用の手段で選定して単離すること
ができる。
本発明は、特に、デスルファトヒルジン遺伝子を含有す
るＤＮＡ造成物、ハイブリッドベクター、形質転換され
た真核宿主生物およびそれらの調製法、並びに実施例に
記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋白質の製造方
法に関する。
以下の実験の部では、本発明の各ｌｌ１ｆＬｉ様を添附
図面に言及しながら説明する。
次の実施例は本発明を説明するためのものであり、発明
の範囲を制限することを意図するものではない。
１１１４皿 実施例に用いた略号の意味は次の通りである。
ＴＮＥ　　：　　１００ｍＭＮａＣ１，５０ｍＭ　トリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）および５ｍＭＥＤＴＡを含む
溶液、ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ
　：エチレンジアミン四酢酸、ＤＴＴ　　：　１　、４
−ジチオスレイトール（１，４−ジメルカプト−２，３
−ブタンジオール）、ＢＳ八　二ウシ血清アルブミン、 ＥＬＢｒ　：エチジウムプロミド、 ｔｒｉｓ：）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン、 ｔｒｉｓ−ＨＣｌニドリス・−塩酸塩。
以下余白 〔実施例〕 １間ｌΩ製造 無水コハク酸７５０ｍｇおよび４−ジメチルアミノピリ
ジン９１０ｍ　ｇを、５’−（４−メトキシトリチル）
−チミジン（ＭＭＴ−０−Ｔ−ＯＨ）２．５７ｇ（５ミ
リモル）を無水ピリジン２０　ｍ　ｌに溶解したものに
加え、混合物を室温で１６時間放置する。ピリジン溶液
を濃縮した後、酢酸エチル２００ｍ　ｌに入れ、０．１
　Ｍリン酸緩衝液２００ｍ１ずつにｌＱｍｌの飽和塩化
ナトリウム溶液を加えたもので２回振盪することによっ
て抽出し、飽和塩化ナトリウムで再度洗浄し、乾燥し、
濃縮し、そしてヘキサンを滴下して加える。沈澱した生
成物を分離して、エーテルと共に２回すりつぶした後、
０℃で０．１　Ｍ硫酸水素カリウム（ｐＨ２，５）　１
８０ｍ　ｌと共に振盪して抽出する。水で２回洗浄した
後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し
て、ピリジン０．５ｍｌを加え、混合物を濃縮し、ヘキ
サンを滴下して加えることによって希釈する。
沈澱したコハク酸誘導体を濾別する。この化合物１、Ｏ
ｇｆＮ−ヒドロキシスクシンイミド１９０ｍ　ｇと共に
酢酸エチル４ｍｌおよびジメチルホルムアミド２ｍｌに
溶解し、３７０ｍｇのＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシル功ル
ボジイミドを０℃で加える。冷蔵庫に一晩放置した後、
沈澱したＮ、Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾
液を酢酸エチルで希釈し、Ｏ，’　Ｉ　Ｍ重炭酸ナトリ
ウムと水で抽出して、乾燥し、真空で蒸発させて濃縮乾
固する。残渣をシリカゲル上で酢酸エチルによりクロマ
トグラフ処理する。
ＴＬＣ：　Ｒｆ　＝０．４５　（ジクロロメタン／メタ
ノール＝９　：　１）。
このＮ−スクシンイミドイルコハク酸エステル（１００
ｍｇ）を、アミノメチルポリスチレン（Ｉｇ。
アミン含量１１０＃Ｍ／ｇ）をジクロロメタン２ｍ１お
よびジメチルホルムアミド４ｍｌに入れたものと共に２
０時間攪拌する。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルム
アミド、メタノール、ジクロロメタンおよびメタノール
で洗浄することによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリ
ジン６ｍｌ中で無水酢酸１ｍｌおよび４−ジメチルアミ
ノピリジン１００ｍｇと共に３０分間攪拌することによ
って、反応しなかったアミノ基をアセチル化する。ポリ
マー樹脂を、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、
メタノールおよびジクロロメタンで洗浄することによっ
て抽出し、恒量に達するまで乾燥する。メトキシトリチ
ル（ＭＭＴ）の分光分析によれば５７μＭ／ｇの付加量
である。
１隻■久 次の保護されたヌクレオシド／ポリスチレン樹脂を、実
施例１と同様の方法で製造する。
５’−（４−メトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−
デオキシグアノシンから。３２μＭ／ｇの付加量。
以下余白 ５’−（４−メトキシトリチル）−チミジン（ＭＭＴ−
０−Ｔ−ＯＨ）　７．７３ｇ　（１５ｍモル）を無水ピ
リジンと共に蒸発させることによって２回濃縮する。残
渣を無水テトラヒドロフラン２０ｍ１に溶解し、０．２
　Ｍの２−クロロフェニル−ジー（１−ベンゾトリアゾ
リル）−ホスフェート／テトラヒト・ロフラン溶液８０
ｍ１に、攪拌しそして水分を除きながら滴下して加え、
反応混合物を１時間室温で攪拌する。生成する２−クロ
ロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５’−（４−メ
トキシトリチル）−チミジン３′−ホスフェートを３つ
の部分に分割する。
０．５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム１００ｍ１を上
記２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５’
−（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホスフ
ェートの溶液の３分の１に、冷却しながら加える。１５
分後に、ジクロロメタンで抽出を行う、ジクロロメタン
溶液を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しな
がら加える。
生成する沈澱を吸引濾別し、エーテル／石油エーテル＝
１：１で洗浄し、真空で乾燥する。
Ｔ　Ｌ　Ｃ：　Ｒｒ　Ｏ，３５（ジクロロメタン／メタ
ノール／水＝７５：２２：３）。
（β）４−メトキシド１チル　ｉ・−の７、　　び２−
シアノエチル−２−クロロフェニル−５′−（４−メト
キシ　１チル　−チミジンー２−シアノエタノールｌ、
　３　ｍ　ｌおよびピリジン２ｍｌを、２−クロロフェ
ニル′−１−ベンゾトリアゾリル−５’−（４−メトキ
シトリチル）−チミジン−３′−ホスフェートの溶液の
３分の１に加える。混合物を室温で一晩放置する。溶媒
を真空で留去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐｔ１７）と水で振盪することによって
繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサ
ンに滴下して加える。沈澱を濾別して、ジクロロメタン
／メタノール（７：３）５０ｍｌにｌｊｌ、０℃でｐ−
）ルエンースルホン酸−水和物３，８ｇをジクロロメタ
ン／メタノール（７：　３）７５ｍｌに溶解した溶液を
加える。２時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し
て、冷重炭酸ナトリウム溶液と共に振盪して抽出する。
有機相を濃縮し、そしてヘキサンを加える。沈澱した２
−シアノエチル−２−クロロフェニル−チミジン−以下
余白 ３′−ホスフェートを、シリカゲル上でジクロロメタン
／メタノール（９６：　４）を用いてクロマトグラフ処
理する。
ＴＬＣ：　Ｒｔ　Ｏ，４５（ジクロロメタン／メタノー
ル＝９　：　１）　。
２−シアノエチル−２−クロロフェニル−チミジン−３
′−ホスフェート２．２ｇを、無水ピリジンで２回蒸発
させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テト
ラヒドロフラン２０　ｍ　ｌに溶解して、残りの３分の
１の２−クロロフェニル−１−ベンゾトリアゾリル−５
’−（４−メトキシトリチル）−チミジン−３′−ホス
フェートに加える。室温にて１８時間後に、水１０ｍ１
および酢酸エチル２００ｍ　ｌを、水冷しながら反応溶
液に加える。有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと
水とで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃
縮する。ホスフェート残基と５′−および３−末端が保
護されたジヌクレオチドを、エーテル／ヘキサン＝１：
１に滴下して加えることによって沈澱せせる。
’ｒｔ、ｃ　：　Ｒｔ　Ｏ，４８（ジクロロメタン／メ
タノール９：１）。
（ｂ）　　１ヌクレオチドの合成 上記の完全に保護されたジヌクレオチド１．１７ｇ（１
ｍモル）をジクロロメタン／メタノール（７：３）３０
ｍｌに氷冷しながら溶解し、ｐ−）ルエンスルホン酸・
−水和物１．９ｇをジクロロメタン／メタノール（７：
　３）２０ｍｌに溶解したものを加える。２時間後に、
氷冷した重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタン
で抽出を行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに
滴下して加える。沈澱した遊離の５′−ヒドロキシ基を
有する粗製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で２〜８
％のメタノール／ジクロロメタンのグラジェントにより
クロマトグラフ処理する。
ＴＬＣ：　Ｒｆ　Ｏ，３３（ジクロロメタン／メタノー
ル９：ｌ）。
この５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド８５０ｍｇとト
リエチルアンモニウム−２−クロロフェニル−５’−（
４−メトキシトリチル）−チミジン３′−ホスフェート
１．０６ｇ　（Ｃａ）（α）節を参照されたい〕をピリ
ジンと共に蒸発させて２回濃縮し、次いで無水ピリジン
１０ｍ１に溶解し、１−メシチレンスルホニル−３−二
トロー１，２゜４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）　５６０
ｎｌ　ｇを加える。２時間後に、氷冷水２ｍｌを加え、
更に１時間後にジクロロメタンを用いて抽出を行う。有
機相を飽和の重炭酸ナトリウムと水とで洗浄し、乾燥し
て、濃縮し、エーテルを加える。沈澱したトリヌクレオ
チドを、シリカゲル上でクロマトグラフィによって精製
する。
Ｒ，０，４５（ジクロロメタン／メタノール９；１）。
実１」０ユ 実施例３と同様にして、下記の一般式 を有し、ＢＩ　Ｂ”　Ｂ’と略記される保護されたトリ
ヌクレオチドを製造する。以下の略号をヌクレオシドＢ
ｌ、Ｂ２、Ｂ３に用いる。すなわち、Ａ＝Ｎ−ベンゾイ
ル−デオキシアデノシン、Ｃ＝Ｎ−ベンゾイル−デオキ
シシチジン、Ｇ＝Ｎ−イソブチリル−デオキシグアノシ
ン、Ｔ＝チミジン。
進イ１１−一一−に／−人　　　　　Ｒａ）ＴＴＴ　　
　　　　Ｏ，４５＾ＴＧ　　　　　　Ｏ，４８ＴＴＣＯ
，５５ＡＣＴ　　　　　　Ｏ，５３ＴＣＴ　　　　　　
Ｏ，４６ＡＣＣＯ，４８ム　　　　　Ｒａ）　　　　　
　Ａ　　　　　Ｒげ）ＴＡＣ０，５６ＡＴＴ　　　　　
　　Ｏ，５５ＴＧＣＯ，４４ＡＣＡ　　　　　　　Ｏ，
５３ＴＡＧ　　　　　　　Ｏ，６ＯＡＡＣＯ，４６↑Ｇ
Ｔ　　　　　　　　　　Ｏ，４２八ＡＡ　　　　　　　
　　　Ｏ，５１ＴＧＡ　　　　　　　Ｏ，４４ＡＧＴ　
　　　　　　Ｏ，４５、ＣＴＴ　　　　　　　Ｏ，５３
ＡＧＧ　　　　　　　　Ｏ，３８ＣＴＧ　　　　　　　
Ｏ，４６ＧＴＴ　　　　　　　Ｏ，４５ＣＣＴ　　　　
　　　Ｏ，４５ＧＴＣＯ，４４ＣＣＣＯ，５９ＧＴＧ　
　　　　　　Ｏ，３５ＣＣＧ　　　　　　　Ｏ，４７Ｇ
ＣＡ　　　　　　　Ｏ，４９ＣＣＡ　　　　　　　０．
５１　　　　　　　ＧＣＧ　　　　　　　Ｏ，４８ＣＡ
Ｔ　　　　　　　Ｏ，５５ＧＡＴ　　　　　　　Ｏ，４
４ＣＡＣＯ，５１ＧＡＣＯ，４８ ＣＧＣＯ，４６ＧＡＧ　　　　　　　　Ｏ，４８ＣＧＡ
　　　　　　　　　　Ｏ，３Ｂ　　　　’　　　　　Ｇ
ＡＡ　　　　　　　　　　Ｏ，５０ＣＡＧ　　　　　　
　　Ｏ，４４ＧＧＣＯ，４２ＣＧＧ　　　　　　　　Ｏ
，３８ＧＧＴ　　　　　　　　Ｏ，４６ＣＧＴ　　　　
　　　Ｏ，４９ＧＧＧ　　　　　　　Ｏ，３５ＧＧＡ　
　　　　　　　０．４４ ａ）シリカゲル上でのジクロロメタン／メタノール９：
１での薄層クロマトグラム。
実施例３または４からのトリヌクレオチド１０Ｍモルを
、水分を除いて、ピリジン／アセトニトリル／トリエチ
ルアミン（１：１：１）６０μｌに溶解する。室温で１
時間後に過酸化物のないエーテルＱ０ｍｌを滴下して加
え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエチ
ルアンモニウム塩をピリジン５０μｌに溶解し、エーテ
ル０．５ｍｌで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で１
５時間乾燥する。
総ての操作を、容量が２２０μｌの反応容器中でマイク
ロプロセッサ−で制御して溶媒および試薬を添加するこ
とにより水分を除いて行う。チミジン／ポリスチレン樹
脂（実施例１）１３ｍｇ（０，７４Ｍモル）を反応容器
に入れて、次の操作を行う。
１、塩化メチレン、２ｍ１Ｚ分、４分間、２、塩化メチ
レン／イソプロパツール（８５：　１５）、２ｍ１Ｚ分
、２分間、 ３、塩化メチレン／イソプロパツール（８５：　１５）
中に臭化亜鉛ＩＭおよび１．２．４−１−リアゾール０
．０２Ｍ、　２　ｍ　ｌ　７分、２〜３．５分間、４、
塩化メチレン／イソプロパツール（８５：　１５）、２
ｍ１Ｚ分、４分間、 ５．０．５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム／ＤＭＦ。
２ｍ１Ｚ分、５分間、 ６、　モレキュラーシープ乾燥ピリジン、２ｍ　１７分
、３分間、 ７、テトラヒドロフラン（過酸化物なし、モレキュラー
シーブ乾燥）　、２ｍｌ／分、３分間、８、窒素気流、
１０分間、 ９、１０ＭモルのトリヌクレオチドＧＴＣ（（ａ）節か
らのトリメチレンアンモニウム塩）および８．９ｍｇ（
３０Ｍモル）の１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ
−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）を１５０．μ
ｌのピリジンに溶解したものを注入、 １０．４５℃、２０分間、 １１、ピリジン、２ｍｌ／分、４分間、１２、ピリジン
中に無水酢酸５％および４−ジメチレンアミノピリジン
２．５％、２ｍ１Ｚ分、４分間、 １３、ピリジン、２ｍ１／分、４分間、１４、ピリジン
／イソプロパツール（１：１）、２ｍｌ／分、３分間。
１４段階の総ての操作を２１回繰り返すが、９段階目の
操作では、ＧＴＣの代わりに次のようなトリヌクレオチ
ドをそれぞれトリエチルアンモニウム塩〔（ａ）節〕の
形で次のような順序で用いる。
以下余白 ＣＣＡ、ＡＣＣ，ＧＡＡ、ＣＣＣ，ＴＡＣ，ＡＧＧ、Ｔ
ＧＡ、ＣＧＣ，ＴＡＣ，ＣＧＴ、ＧＴＧ。
ＣＣＡ、ＡＡＡ、ＡＡＡ、ＴＧＡ、ＣＧＧ、ＴＧＡ、Ｔ
ＴＣ，ＧＧＧ、ＣＣＴ、ＣＡＴ。
平均カップリング収率は９７％である。最終生成物は次
のような構造を有する。
ＭＭＴ　−ＣＡＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧ　ＡＣＧＧＴ
ＧＡ　Ａ　Ａ　ＡＡ　Ａ　ＡＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＡＣ
ＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧ
ＴＣＴ−ポリスチレン４０、Ｏｍｇ　（約０．６０Ｍモ
ル）のＤＮＡ合成樹脂９６／６７を、６６　ｍ　ｇ　（
０，４０ミリモル）の０−ニトロベンズアルドキシムお
よび５０μｌ　　（０，４０ミリモル）の１．１．３．
３−テトラメチルグアニジンを４００μｌの９５％ピリ
ジンに溶解したものと共に５０℃で３時間および室温で
１２時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛ばして除去した
後、残渣に１．６ｍｌのアンモニア水（３３％）を加え
、混合物を閉鎖容器中で５０℃で２４時間保つ。
分離した液相から真空でアンモニアを除去し、過酸化物
を含まないジエチルエーテルそれぞれ３ｍｌを用いて３
回洗浄する。Ｂｉｌｇｅｌ　Ｐ６カラム〔１００〜２０
０メツシユ、３Ｘ６６（Ｊ、　０．０１モル重炭酸トリ
メチルアンモニウム（ｐＨ７，５）１．５ｍｌ／分〕上
で低分子量成分を除去した後、２８５００．　（２６０
ｎｍ）のＤＮＡが単離される。
６０００の全量をＩＩＰＬｃカラム（ＰＲＰ　−１／Ｈ
ａｍｉｌｔｏｎ。
２５０ｘ４．６＋＋ｎ）上で分離する。グラジェント〔
溶液Ａ：　０．０５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐ
Ｈ７，０）　；溶液Ｂ：溶液Ａ／アセトニトリル＝１：
１）：３０％Ｂ／Ａ、６０％Ｂ／Ａ、５０℃および２ｍ
ｌ／分で２０分間。親油性の主ピーク（保持時間、約１
４分間）を集め、ＤＥ５２セルロース（Ｗｈａｔ−ｍａ
ｎ）カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエタノールで
沈澱させる。４−メトキシトリチル保護基を外すために
、沈澱を５０μｍの酢酸／ＨｔＯ（４：１）に溶解し、
室温で４５分間維持する。反応生成物を凍結乾燥し、エ
タノールで沈澱させ、そして精製のため８％ポリアクリ
ルアミドゲル（７Ｍ尿素）上で電気泳動によって分離す
る。所望のＤＮＡの大きさに対応するバンドを切り取り
、生成物を電気溶出し、ＤＥ５２セルロース上で濃縮し
、下記の構造： ５　　’　　−ＣＡＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧ
ＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＡＣＣＧＧＴ
ＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴ−
３’を有するＤ　Ｎ　Ａ９６／９７をエタノールで沈澱
させる。
実施１ 下記のＤＮＡフラグメント（５’−３’）を、実施例５
と同様に製造する。
１５８ ＣＴＧＧＡ　Ａ　ＴＴＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＡ　ＣＡ
　ＣＣＧＡ　ＣＴＧ　ＣＡＣＣＧ　Ａ　Ａ　ＴＣＴＧＧ
ＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴ ４６／６４相補体 ＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＧＣＡＴＴＴＧＴＴＡＣＣ
ＣＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＧＴＴＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧ
ＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴ１５４／６４相補体 ＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡｒｒｃｒｔｃ
ｃｃｃＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧ
ＴＴＧＴＧＡＣＡＣＴＧＣＧＧ化 ５′−末端のリン酸化および放射能標識を、Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ　　　　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒ　
　Ｍａｎｕａｌ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら編集）　
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。
１９８２年、１２５頁に記載の方法で〔γ−３２Ｐ）Ａ
ＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｒｉ
ｎｇｅｒ）を用いて行う。
キナーゼ処理したフラグメント９６／６７およびキナー
ゼ処理したフラグメント１５４／６４それぞれ５０ｐモ
ルを、水２４μｌに溶解し、溶液を９０℃で３分間加熱
し、５分以内に１２℃まで冷却する。４μｍのエンド−
ＲＱ街液（０，１Ｍ）リス・ＨＣＩ、ｐＨ７，５，６６
ｍ　Ｍ　Ｍｇ（：Ｉｇ、６６ｍＭのβ−メルカプトエタ
ノール、０．６　Ｍ　ＮａＣ１）、１０μｍのデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート混合物（ｄＡＴＰ、　ｄ
ＣＴＰＳｄＧＴＰ、　ＴＴＰであって、それぞれ２ｘｌ
Ｏ−コＨで、ＮＨ，でｐＨ７，０に調整）、および２μ
ｌ　（・１０単位）のＤＮＡポリメラーゼ■、Ｋｌｅｎ
ｏｗフラグメント（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）を添加した後
、１２℃で３０分間インキュベートする。９０℃で、　
３分間加熱して反応を停止させ、更に処理するまで一８
０℃で貯蔵する。
同様にして、キナーゼ処理されたフラグメント１１５８
および４６／６４を反応させてデュプレックス（デスル
ファトヒルジン遺伝子のフラグメントＦυを形成させる
。
デュプレックス■および■は、下記の構造を有する。
デュプレックス■ デュプレックスＩＩ テ゛スルフ１Ｆ乞ルジンｊ１イ云−）クフラ、７’′）
！、／）　　Ｆ１およびＦ２の製造を、下記のスキーム
１に示す。
（以下余白） スキーム１゜ １１５８　　　　　　　　　　　９６乙７Ｆ、−Ｆ２−
ＤＮＡ　　（デスルファトヒルジン遺伝子）１ｉ缶」に
Ｌβ−フーグメン　　　　　、キ　−ゼ几遺 フラグメント１１５８、キナーゼ処理したフラグメント
４６／６４、キナーゼ処理した９６／６７、および１５
４／６４をそれぞれ５０ｐモルを、水４８μｌに溶解し
、溶液を９０℃で３分間加熱し、５分以内に１２°まで
冷却する。８μｌのエンド−Ｒ緩衝液（実施例８参照の
こと）、２０μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート混合物（ｄＡＴＰ。
ｄＣＴＰ、、ｄＧＴＰＳＴＴＰであって、それぞれ２ｘ
ｌＯ−’Ｍで、ＮＨ，でｐ１１７．０に調整）および２
μ１（１０単位）のＤＮＡポリメラーゼＩ　、　Ｋｌｅ
ｎｏ％４フラグメント（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）を添加し
た後、１２℃で３０分間インキュベートする。９０℃で
３分間加熱して反応を停止させ、フェノール／クロロホ
ルムで抽出した後、エタノ、−ルで沈澱させてＤＮＡを
単離する。
生成するＤＮＡ混合物を１００μｌのリガーゼ／緩衝液
（６６ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５＞　６．６
ｍＭ　Ｍｇｅｔ、、１０ｍＭジチオスレイトール、５ｍ
ＭＡＴＰ　）に溶解し、５０単位（２μｌ）のＴ、　Ｄ
ＮＡリガーゼ（Ｉｌｉｏｌａｂｓ）を加え、全量を２０
℃で２０時間インキュベートする。、す０℃で５分間加
熱することにより、反応を停止させ、フェノール／クロ
ロホルムで抽出した後、エタノールで沈澱させることに
よりＤＮＡを単離する。混合物を８％ポリアクリルアミ
ドゲル（変性）上で電気泳動によって分離した後、２１
７個の塩基対を有する連結生成物を電気溶出させ、ＤＥ
５２セルロースカラム上で濃縮し、溶出後にエタノール
で沈澱させることによって単離する。
デスルファトヒルジン遺伝子は、次のような構造を有す
る。
以下余白 ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＡＣＡＯＣＧ
ＡＣＴＧＣＡＣＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＣＴＴ
ＡＡＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣ；ＡＣＧ
ＴＧＧＣＴＴＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣＣ
ＴＧＴＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＯ
ＴＣＡＧＧＧＴＡＣＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＯ
ＴＴＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＣＣＣ
ＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣ
ＧＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴ
ＴＡＣＧＴＡＧＧＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴ
ＴＴＴＴＴＧＧＴＣＡＣＧＣＡＡＡＣＣＧＯＴＧＡＡＧ
ＧＴＡＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＣＡＡ
ＣＧＡＣ！ＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＡＴＧＧ
ＧＧＣＴＴＴＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＯＴＧＣ
ＣＡＣＴＣＴＴＯＧＡＡＧＡＡＡＴα：Ｘ３ＧＧＡＡＧ
ＡＡＴＡＣＣＴＧＣＡＧ’ｒＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡ
ＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＧＧＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣ
ＯＴＣＡＴＣＣＴＡＧＯＡＣ４個の７ラグメントからの
デスルファトヒルジン遺伝子の製造を、下記のスキーム
２に示す。
スキーム２゜ ４個の合成フラグメントからのヒルノン遺伝子の製造ｔ
／！＋８９ｖ６７ ４　ＤＮＡポリミラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＮＴＰ ↓Ｔ４ＤＮＡリガーゼ １隻■上１１２ユツΔ」」ｄレジンＦ■■１゛　−ｐＢ
Ｒ３２２プラスミドＤＮＡ　（５μｇ）を、５単位のＰ
ｖｕ　Ｕ制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を
１００μｇ　／　ｍ　１ゼラチンの溶液２００ｍ　ｌと
したもので、３７℃で１時間消化する。次いで、この溶
液を１００ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）および
５０ｍＭのＮａＣ１に調整し、そしてこのＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）　　
３０単位で３７℃で２時間消化する。次いで、この溶液
を５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８）に調整し、１
０Ｍｇ／μｌのＤ　Ｎ　Ａ　）１度において、２単位の
ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）
を用いて、３７℃で３０分間インキュベートする。この
溶液を６５℃で６０分間加熱することによって、酵素を
不活性化する。次いで、この溶液をＴＮＥで標準化して
、１容量のフェノールおよびクロロホルムで抽出し、消
化されＤＮＡを一２０℃で２容量のアルコールを用いて
一晩沈澱させる。
ｐＢＲ３２２のＤＮＡから切り取られたベクター（ｐＢ
Ｒ３２２／　ＨｃｏＲＩ　／　Ｐｖｕ　ＩＦ、２２９７
塩基対）を、１％低融点アガロース（Ｂｉｏｒａｄ）／
　トリス−アセテ−）−！ｌ！ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８）
上でゲル電気泳動を行うことによって小ＤＮＡフラグメ
ント（２０６７個の塩基対）から分離する。アガロース
ゲル中のＤＮＡをＥｔＢｒで染色した後、ｐＢＲ３２２
／ＥｃｏＲＩ　／　Ｐｖｕ　Ｕベクター（−２２９７塩
基対）のＤＮＡバンドを含むゲルの領域をゲルから切り
取り、６５℃で１ｏ分間液化する。２０容量のＴＮＥを
このＤＮＡ溶液に加えて、Ｍｕｅｌｌｅｒ　ら、〔ムＭ
ｏ１．Ｂｉｏ１．第１２４巻、３４３頁、１９７８年〕
の方法に準じて、ＤＥ　−５２クロマトグラフイを行っ
てＤＮＡを精製し、フェノール／クロロホルムで抽出し
、ＤＮＡをアルコールで−２０℃において一晩沈澱させ
る。
ＤＮＡの沈澱を５０ｕｌの０．０１Ｍ）リス・ＦＩｃｌ
（ｐＨ８）　、　　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解し、
使用するまで一２０℃で貯蔵する。１．４μｇ（＝３．
２ｐモルの末端）のＤＮＡを得る。
（ｂ）　Ｆ　　−ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩの’ｂ化学的に合
成されたＦ、−ＤＮＡ　（実施例８を参照）２４ｎｇ　
（＝１．３ｐモルの末端）を、５０μｍ１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）　、　　５０ｍＭＮａｃ
ｌおよび１ｏｏμｇ／ｍｌのゼラチン中で５単位のＥｃ
ｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用
いて３７℃で３０分間消化する。次に、線状化したベク
ターｐＢＲ３２２／ＢｃｏＲＩ　／　Ｐｖｕ　Ｕ　（実
施例１０ａ　）　０．０６，１７　ｇ　（＝　０．１４
Ｍモルの末端）を溶液に加える。次いで、酵素を６５℃
で加熱することにより１０分後に不活性化し、溶液をＴ
ＮＥで標準化して、フェノール／クロロホルムで抽出す
る。
沈澱したＤＮＡを、更に処理するまで、−２０”Ｃで貯
蔵する。
２個の上記ＤＮＡフラグメントを含をする、実施例１０
（ｂ）で得られたＤＮＡ沈澱を、２゜μ【の５０ｍＭ）
リス・ＨＣｌ（ｐｔｌ、７．８）。
１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍ
ＭＡＴＰおよび１００μｇ／ｌのゼラチンの溶液に溶解
し、２０単位／μＩＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で１５℃で３時間処理する。この方法で、Ｆ、−Ｄ
ＮＡを含む組み換えプラスミドｐＭＬ３００が、溶液中
に得られる。
形質転換に必要なカルシウム前処理したＥ、コリｌｌＢ
１０１細胞を、Ｍａｎｄｅｌら（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、　、第５３巻、１５９頁、１９７０年）により記載さ
れた方法で調製する。
組み換えプラスミドｐｌ’１Ｌ３００を含む（ｃ）で得
られた溶液を６５℃で１０分間加熱して、Ｔ、ＤＮＡリ
ガーゼを不活性化して、そ叫て次に３７℃に冷却する。
この反応混合物ｌＯμｌを、カルシウム処理したＥ、コ
リ　ｕｎｔｉｌ／１０ミリモノＬ／ＭｇＣ１ｔおよび１
０ミリモルのトリス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）１５０
μＩに加えて全量を２００Ｉ！ｌとする。
次いで、この混合物を３０分間氷冷し、４２°Ｃで２分
間加熱した後、Ｌ−培地（実施例１８を参照されたい）
１ｍｌ中で３７℃で５０分間放置する。この混合物を６
０μ／　ｍ　１のアンピシリン（Ｓｅｒｖａ）を含む５
個の寒天平板（ＭｃＣｏｎｋｅｙ　Ａｇａｒ、Ｄｉｆｃ
ｏ）上に０．２　ｍ　ｌずつ塗布する。次に、寒天平板
を３７℃で１６〜１８時間保持する。形質転換されたＥ
、コリＩＩ　８１０１の４８４個のアンピシリン耐性コ
ロニーが得られる。
（ｅ）Ｆ　　−ＤＮＡを人゛コロニーのスクリーニング ４７０個の形質転換されたコロニー（実施例１０ｄ）を
、ニトロセルロースフィルターＢ　８５（Ｓｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ）に押圧する。Ｍ、Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄＤ。
Ｓ、Ｈｏｇｎｅｓｓ　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔユ、Ａｃ回
、Ｓｃ土ユ旦ＳＡ工、第７２巻、３９６１頁、１９７９
年〕の方法に準じて、コロニーを溶解し、そして変性し
たＤＮＡをフィルター上に固定する０次いで、フィルタ
ーのプレハイブリダイゼーションを、２０ｍ１　　（フ
ィルター当たり）の４ｘＳＥＴ　　（３０ｍＭ）リス・
ＨＣｌ　　（ｐＨ８）、　１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび
１ｍＭＨＤＴＡの溶液）、０．１％（ｗ　／　ｖ　）　
Ｆｉｃｏｌ１４００（Ｐｈａｒ＋ｗａｃｉａ）　、　０
．５％ＳＤ３゜５０μｇ　／　ｍ　１変性したウシ胸腺
ＤＮＡ中で６４℃で４時間行う０次いで、ニトロセルロ
ースフィルターを２０ｍ１　　（フィルター当たり）の
５ｘＳｆ！Ｔ（Ｗ／　ｖ　）　Ｆｉｃｏｌｌ　４００　
、０．２％ＳＤＳおよび５０μｇ　／　ｍ　１変性した
ウシ胸腺ＤＮＡ中で、″Ｐ放射能標識したプローブ（フ
ィルター当たり約ＩＯ３〜１０４セーレンコフｃｐｍ）
を用いて処理する。
相補的なオリゴヌクレオチド４６ン６４　（実施例６参
照）をプローブとして使用する。
次いで、フィルターを２ｘＳＥＴ、　０．２％ＳＤＳで
２回室温で洗浄し、次いで２ｘＳｆ！Ｔ、　０．５％Ｓ
ＤＳで２回６０℃で洗浄する。（最初は３０分間、次に
６０分間）０次に、フィルターを３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｓ
ａｎ）の間で乾燥し、−８０℃で強調用スクリーン（Ｉ
　１ｆｏｒｄ）を有するＸ線フィルム（フジ）上に１〜
２日間°置装。
得られるオートラジオグラムは、その後の処理に用いる
ことができる７１個の陽性のコロニーを示し、その一つ
をｐＭＬ３００と命名する。
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ　（５μｇ）を、３０単
位のＢａ５ａｌ目制限エンドヌクレ、アーゼで、１００
ｍＭＮａＣ１、６ｍＭ　Ｉ−リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７
，９）、６ｍＭ８ｇＣ１ｇおよび１００μｇ　／　ｍ　
１ゼラチンノ溶液中で、３７℃で３０分間消化する。次
いで、Ｐｖｕ　ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ１５単位を
溶液に加え、３７℃で２時間消化する。
反応混合物を７０℃で１０分間加熱して、酵素を不活性
化する０次いで、１％低融点アガロース／トリスーアセ
テート−Ｅｌ）ＴＡ緩衝液（ｐＨ８）上でゲル電気泳動
を行うことによって２つのＤＮＡフラグメントを互いに
分離する（実施例１０ａ参照）。
ｐＢＲ３２２Ｂａａｌｌ　Ｉ　／　Ｐｖｕ　ＩＩベクタ
ー（＝　２６７２塩基対）のＤＮＡバンドを含むゲルの
領域をゲルから切り取り、液化し、そしてＭｕｅｌｌｅ
ｒら（上記）の方法に準じて、ＤＢ−５２クロマトグラ
フイを行ってＤＮＡを精製する。　０．７５μｇ（１，
５ｐモルの末端）のＤＮＡが得られる。
（ｂ　）　Ｆ　　−Ｄ　Ｎ　Ａ　　Ｂａｍ１ｌ　Ｉの一
す゛６化学的に合成されたＦｇ　−ＤＮＡ　（実施例８
を参照）２５μｇ（＝１．３ｐモルの末端）を、２０μ
ｌの１５０ｍ　Ｍ　ＮａＣ１，６ｍ　Ｍ　トリス・ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，９＞、６ｍＭのＭｇＣｂおよび１１００ｕ
／ｍｌのゼラチン中で１６８位のＢａ＋ｍＨｌ制限エン
ドヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で３
０分間消化する。次に、線状化したベクターｐＢＲ３２
２／　Ｂａａ＋ＩＩ　Ｉ／　ＰｖｕＩＩ　（実施例１１
ａ）６０ｎｇ　（＝９６ｎモルの末端）を溶液に加え、
全溶液をＴＮＥで標準化して、フェノール／クロロホル
ムで抽出し、ＤＮＡを２容量のアルコールで沈澱させる
。沈澱したＤＮＡを、更に処理するまで、−２０℃でア
ルコール中に貯蔵する。
以下余白 （ｃ）　Ｌ！且其ム４叶ｎ＋ＨＩル企ヱ叩」ゴ８１久二
Ｊユ（配ζ２個の上記ＤＮＡフラグメントを含有する実
施例１１（ｂ）で得られたＤＮＡ沈澱を、２０μｌの５
０ｍＭ）リス・ＨＣｌ（ｐ）ｌ、７．８）、１０ｍＭ　
ＭｇＣ１ｇ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰお
よび１００μｇ　／　１　ｍ　ｌのゼラチンの溶液に溶
解し、１５単位／μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）で１５℃で３時間処理する。この方法で、Ｆ、
−ＤＮＡを含む組み替えプラスミドｐＭＬ　３０５が溶
液中に得られる。
カルシウム処理されたＥ、コリ１１８１０１細胞の形質
転換はは、実施例１０（ｄ）に記載のようにして行う。
実施例１１（ｃ）で得られる反応混合物ｌＯμｌを用い
る。３１３個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
以下余白 （ｅ）Ｆｚ　　ＤＮＡ　　　むコロニーのスクリーニヱ
久 ６５個の形質転換されたコロニー（実施例１１ｄ）を、
実施例１０（ｅ）に記載の方法でＦ、−ＤＮＡについて
試験する。相補的オリゴヌクレオチド１５４／６４　（
実施例６を参照されたい）を、放射能プローブとして用
いる。オートラジオダラムにおいて２個の陽性のコロニ
ーが得られ、その一つをｐＭＬ３０５と命名する。
組換プラスミドｐＭｔ３００およびｐｌ’１Ｌ３０５の
ＤＮＡを、ｌ５ｈ−１（ｏｒｏ＠ｉｔｚ　（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒＭａ
ｎｕａｌ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら編）、Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ、、　１９８２年
、３６８頁〕の方法に準じて単離する。
Ｆ、−ＤＮＡおよびＦｚ　　ＤＮＡインサートのヌクレ
オチド配列を、ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ　　（
Ｐｒｏｃ。
ｈ且」垣虹とＬＪ鎖、第７４巻、５６０頁、　１９７７
年；ル銭も一ハ互Ｂよ、第６５巻、４９９頁、　１９８
０年も参照されたい〕の方法に準じて確認する。
このためには、それぞれの場合に、１０μｇのｐｌ’１
Ｌ３００のプラスミドＤＮＡをＩＩｃｏＲ１１１１ｐｉ
エンドヌクレアーゼで開裂し、そして１０μｇのｐＭＬ
３０５のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨｌ制限エンドヌク
レアーゼで開裂し、線状化されたＤＮＡをアガロースゲ
ル〔実施例１０（ａ）参照〕からゲル溶出によって単離
する０次に、単離されたＤＮＡをアルカリ性ホスファタ
ーゼで消化して、そして叶−５２上でクロマトグラフィ
を行う（実施例１１ａを参照されたい）０次に、ＤＮＡ
を５′−末端で〔γ−３２〕ＡＴＰ　（比活性、５００
０　Ｃｉ　／　ｍモル、Ａｍｅｒｓｈａ＋ｗ）およびＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼＣＰ　−Ｌ　−Ｂｉｏｃｂ
ｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、放射能標識する。放射能標
識したＤＮＡを、次いで第二の制限エンドヌクレアーゼ
（ＢｃｏＲＩＩ　）を用いて開裂する。生成するＤＮＡ
フラグメントを、アガロースからゲル溶出によって単離
する。ｐｌ’１Ｌ３００の場合には、Ｆ、−ＤＮＡのヌ
クレオチド配列をＥｃｏＲｎ　−ＥｃｏＲＩ　”フラグ
メント（約１０９塩基対）から決定し、ｐＭＬ３００の
場合には、Ｆ、−ＤＮＡのヌクレオチド配列をＥｃｏＲ
Ｉｆ　−Ｂａｍｆｌ　Ｉ　”フラグメント（約１２２塩
基対）において決定する（＊は放射能標識されているＤ
ＮＡ末端を意味する）。
Ｆ、−ＤＮＡおよびＦＺ　−ＤＮＡについて決定される
ヌクレオチド配列は、実施例８に示したものと同じであ
る。
１０＃ｇのプラスミドｐＢＲＨｔｒｐ　　（ＤＩ！−０
５３１１１４０５）を５ａ単位のｆ！ｅｏＲＩ　（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で６０分間開裂させ、消化
混合物をフェノール抽出した後、ＴＳＴ４１（Ｋｏｎｔ
ｒｏｎ　ＡＧ）　Ｏ−ター中で５０ｍＭ）リス・ＨＣｌ
　　（ｐＨ８，０）および１ｍＭのｔ！ＤＴＡにおいて
、サッカロース密度勾配（５〜２３％）で分画する。遠
心分離は、４０．００Ｏｒｐｍ、１５℃で１４時間継続
する。０．３　ｍ　Ｉずつの両分を、ｌ５ＣＯ勾配コレ
クターを用いて１ｍｌ／分で集める。小さなフラグメン
トを含む画分をまとめ、この溶液をＴＮＥで標準化し、
−２０℃で２容量のエタノールを用いて沈澱させる。
ｆ！ｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機中で遠心分離した後、
ＤＮＡを１００．ｃｒｌの１０ｍＭ）リス・ＨＣｌ　（
ｐＨ７，５）および０．５　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡに溶解す
る。このＤＮＡフラグメント５ｔｔｇを５単位のＢｇ　
Ｉ　ＩＩ　（Ｂｉｌａｂｓ）を用いて、３７℃で６０分
間開裂させる。反応混合物をフェノールおよびクロロホ
ルムで抽出し、ＤＮＡを２容量のエタノールと共に一８
０℃で１ａ分間インキエベートし、ＤＮＡを遠心分離に
よって集めて、５０μｌの５０ｍＭ）リス・ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）に再度溶解させる。この溶液の２μｌを採取
して（ＤＮＡ　０．２４　ｇ）　、５０ｍＭ　）リス・
ＨＣｌ　　（ｐＨ１８，０）中で１０ｎｇ／μｌのＤＮ
Ａ濃度で１単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｂ
ｏｅｒｉｎｇｅｔ）と共に３７℃で３０分間インキュベ
ートする。溶液を６５℃で６０分間加熱することによっ
て酵素を不活性化する。０．０４μｇのＤＮＡを採取し
、そして５′−末端を、５０ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐ
Ｈ１９，５）　　、　１０ｍＭのＭｇＣ１ｇおよび５ｍ
ＭのＤＴＴの反応容積２０ｕｌ中１０＃Ｃｉ（ｒ−”Ｐ
）−ＡＴＰ（５０００Ｃｉ　　／ｍＭ　、Ａｍｅｒｃｈ
ａｍ。
およびで５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ　
−Ｌ　Ｂ１１ｃｈｅ＊１ｃａｌｓ）と共に３７℃で３０
分間インキュベートして標識する。放射性試料を非標識
試料（上記参照）と混合して、ＤＮＡフラグメントをＴ
ＳＴ６０ローター中で５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８
，０）および１ｍＭ　　ＥＤＴＡ中で５〜２３％サッカ
ロース密度勾配によって分画する。遠心分離を、６０．
００Ｏｒ　ｐ　ｍ、　１５℃で５時間行う、０．２ｍｌ
ずつの両分を集める。それぞれの百分の放射能活性をセ
レンコツ放射線を測定することによって計測し、それに
よってフラグメントを同定する。
小さなりＮＡフラグメントを含む所望のフラグメントを
まとめて、ＤＮＡを２容量のエタノールを用いて沈澱さ
せ、遠心分離した後、２０μｌの１０ｍＭ）リス−ＨＣ
ｌ　　（ｐＨ７，５）および０．５ｍＭ　　ＨＤＴＡに
再度溶解する。
″′Ｐ−標識されたＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ　ＤＮ
Ａフラグメントを、５０μｌの容量中で０．２単位のＴ
ａｑ　ｒ（Ｂｉｌｌａｂｓ）を用いて、３７℃で１０分
間部分的に開裂させる０反応混合物を、０．２％ＳＤ３
．１０％グリセリン、　１０　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　、　
０．０５％ブロモフェノール−ブルーに調整し、そして
ＤＮＡフラグメントをトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ中で６
％ポリアクリルアミド上で分離する（Ａ、Ｃ，Ｐｅａｃ
ｏｃｋ　ら、…匹蝕紅１■、第６巻、１８１８頁、１９
６７年〕。所望のＥｃｏＲＩ　−Ｔａｑ　Ｉ　　（最大
の部分消化フラグメント）を含むバンドをオートラジオ
グラム上で同定する。
このフラグメント（Ｌ、、第３図参照）をゲルから抽出
して、精製しくＷ、Ｍｕｅｌｌｅｒら、上記）、そして
１０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）お
よび１ｍＭｆ！ＤＴ八に溶解する。
アクセプタープラスミドとして、Ｃ１ａ　ＩおよびＢｃ
ｏＲＩで消化されるｐＢＲ３２２を用いる。２ａｇのｐ
ＢＲ３２２を２０μｌの反応容量中で４単位のＣ１ａ　
Ｉ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で６０分間消化さ
れる。
蛋白質をフェノールで抽出し、次いでＤＮＡを２容量の
エタノールを用いて一８０℃で１０分間沈澱させる。Ｄ
ＮＡを遠心分離によって集め、次いで２０μｌの反応容
積において３７℃で１０単位のＩＥｃｏＲＩ　（Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）を用いて３０分間消化する。
次いで、０．１　Ｍ　）リス・ＨＣＩ　　（ｐＨ８，７
）　２容量を溶液に加え、全量を１単位のアルカリ性ウ
シホスファターゼ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）と共に３７℃
で３０分、間インキュベートする。次いで、６５℃で６
０分間インキュベートすることによってホスファターゼ
を不活性化する。アクセプタープラスミド１１００ｎを
、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　、　２０　ｍＭ　！−リス
・ＨＣＩ　　（ｐＨ７，８）、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、０
．５ｍＭＡＴＰ中、１５μｌの反応容積中で、５μｌの
フラグメントＬ−ＤＮＡと共に、１．ＩＪｌの反応容積
当たり３０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ
）を用いて、２時間インキュベートする。
この溶液５．ｃｚｌを、１０ｍＭ　ＭｇＣｂ、　１０ｍ
ＭＣａＣ１ｚおよび１９ｍＭトリス・ＨＣｌ　　（ｐｌ
＋７．５）生塩化カルシウムで処理したＥ、コリＨＢＩ
ＯＩを含む１５０ｍ　ｌの混合物に加て全体を２００μ
ｍとする。
この混合物を２０分間氷冷し、４２℃で１分間加熱し、
２０℃で１０分間インキュベートする。トリプトン培地
〔蒸留水１リツトル中に、１０ｇのバクトートリプトン
（Ｄｉｒｃｏ）　、１　ｇの酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）
　、１　ｇのグルコース、８ｇのＮａＣ１および２９４
ｍｇのＣａＣ１ｚ　・２　ＨｔＯを含む）１ｍｌを加え
て、混合物を３０Ｏｒ　ｐ　ｍで攪拌しながら３７℃で
３０分間インキュベートする。混合物を、２個の５０ｇ
ｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を加えた
寒天平板（ＭｃＣｏｎｋｅｙ　Ａｇａｒ、　　ロ１ｆｃ
ｏ；０．６ｍｌ／平板）に塗布した。これらの平板を３
７℃で１２〜１７時間インキュベートする。
１０個の異なるコロニーのプラスミドＤＮＡを、次のよ
うにして単離する。
上記のコロニーを、２５ｍ１の三角フラスコ中５０μｇ
　／　ｍ　１のアンピシリンを補填したトリプトン培地
Ｉ　Ｑ　ｍ　ｌに接種するのに用いる。培地を３７℃、
３００　ｒ　ｐ　ｍで１５〜１８時間攪拌する。細胞を
遠心骨１ｉ１ｉ１（Ｓｏｒｖａｌ　、　ＨＳ　−４０−
ター、４℃、４０００　ｒ　ｐ　ｍで１０分間）によっ
て回収する。約０．１ｇの細胞が得られ、これらを１ｍ
ｌの５０ｍＭのトリス・ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）に再
分散する。
０．２５ｍ　ｌのリゾチーム溶液（５ＱｍＭのトリス・
ＨＣ１（ｐＨ８，０）　　１ｍ　ｌ当たり１０　ｍ　ｇ
　ｓ　リゾチームは８１８１１１８社より発売されてい
る〕を加え、０℃で１０分間インキュベートした後、０
．５ｍＭ１！ＤＴＡ　（ｐＨ７，５）　０．１５ｍ　ｌ
を加える。０℃でさらに１０分装いた後に、６０μｌの
２％ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００（Ｍｅｒｃｋ）を加える
。０℃で３０分後に、試料を５ｏｒｖａｌ　　Ｓ　Ａ−
６００ローター中で４℃で１５．００Ｏｒｐｍで３０分
間遠心分離する。上澄液を、１容量のフェノール（ＴＮ
Ｅで飽和）で脱蛋白する。
４℃で５００Ｏｒ　ｐ　ｍで、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ
　ＨＢ　−４０−ター）することによって、相を分離す
る。上相を１容量のクロロホルムで抽出する。スイ臓Ｒ
ＮＡアーゼＡ（Ｓｉｇａ＋ａ；　ｌ　Ｏｍｇ／１ｍ１Ｔ
ＮＥ。
８５℃で１０分間前加熱）を加えて最終濃度を２５μｇ
　／　ｍ　ｌとして、混合物を３７℃で４０分間インキ
ュベートする。次いで、溶液をＩ　Ｍ　ＮａＣ１および
１０％ポリエチレングリコール６０００（Ｆ１４１ｋａ
、オートクレーブ中で１２０℃で２０分間処理）に調整
して、−１０℃で２時間インキュベートする。
沈澱を５ｏｒｖａｌ　　ＨＢ　−４０−ター（０℃、１
０．ＯＱＯｒｐｍで２０分間）中で集め、１００μｌの
ＴＮＥに再度溶解する。ＤＮＡ溶液を１容量のフェノー
ルで抽出して、ＤＮＡを２容量のエタノールにより一８
０℃で１０分間沈澱させる。沈澱をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ
遠心分離機で遠心分離によって集め、ＤＮＡを２０μｌ
の１０ｍＭ）リス・ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）および０．
５　ｍＭ　　ＥＤＴＡに再溶解する。ｌＱｍｌの培養液
から、８〜ｌＯμｇのプラスミド ＤＮＡが得られる。
プラスミドＤＮＡは以下の制限酵素を用いる消化の後、
分析する。
それぞれの場合に、酵素業者の指示に従い、標準的方法
によってｌ１ｐａｌ（Ｂｉｌｌａｂｓ）および１置ｐａ
ｌ（［５ｉｏｌａｂｓ）　とＥｃｏＲＩ　（［１ｉｏｌ
ａｂｓ）およびＣ１ａ　Ｉ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて
切断する。ＤＮＡを、４０ｍＭトリス−ＨＣ１（ｐＨ７
，８）　　、　１ｍＭ　　ＨＤＴＡおよび０．５μｇ　
／　ｍ　ｌの臭化エチジウム中１％アガロースゲル上で
分画する。所望のプラスミドは０ｐａ１部位を含み、３
回消化した後、大きなりＮＡフラグメントの他に２種類
の小さなフラグメントであってｐＢＲ３２２の小さなＩ
！ｃｏＲＩ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントよりも大きなフ
ラグメントを生じる。これらのプラスミドの一つをｐ１
５９と命名する（第３図参照）。
Ｂ、プラスミドｌｌＲ１１４５の ２μｇのｐＬ５９ＤＮＡを、１０単位のＥｃｏＲＩ（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で３０分間消化する。
ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、
遠心分離の後、ｌＯμｌの１０ｍＭ）リス。
）（ＣＩ　　（ｐＨ７，５）および０．５　ｍ　Ｍ　Ｅ
ＤＴＡに溶解する。ＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡを、
更にｌＱｍＭＭｇＣｈ＋　１０　ｍＭ　　β−メルカプ
トエタノール、５０ｍ　Ｍ　ＮａＣ１，０，１ｍ　Ｍ　
ｄＡＴＰ（Ｐ　＆　ｆ、Ｂ１１ｃｈｅｓ＋１ｃａｌｓ）
。
０、１　ｍＭ　ｄＴＴＰ　　（Ｐ　＆　Ｌ　Ｂｉｏｃｈ
ｅ−ｍｉｃａｌｓ）中５単位のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋ
ｔｅｎｏ−フラグメント）（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｔ）で１
２℃で１５分間処理する。次いで、８５℃で５分間イン
キエベートしてポリメラーゼを不活性化する。反応混合
物を、２０ｍＭ）リス・ＨＣ１（ｐＨ７，８）　　、　
１０ｍＭのＭｇＣｌ２１１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭ
のＡ　Ｔ　Ｐ　（Ｓｉｇｍａ）で１０倍に希釈し、１μ
ｌの反応混合胸当たり３０単位のＴ、ＤＮＡリガーゼを
用いて、１５℃で１時間インキエベートする。５０ｎＨ
のＤＮＡを（上記方法で）Ｅ、コリ中に形質転換し、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補填したＭｃＣｏｎｋｅ
ｙ寒天平板上に塗布する。
１０個の異なるコロニーのプラスミドＤＮＡを上記の方
法で単離する。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲ■で消化す
ることによって分析する。所望のプラスミドは［Ｅｃｏ
ＲＩ耐性である。分析は、上記の方法で行う。所望のプ
ラスミド１つをｌｌＲ１１４５と命名する（第３図参照
）。
Ｃ，ブースミドｌｌＲ１１４８の゛告二２ｐｇのｐＨＲ
１１４５−Ｄ　Ｎ　Ａを、５単位のＣ１ａｌ（Ｂｏｅｒ
ｉｎｇｅｒ）を用いて３７℃で６０分間処理し、次いで
フェノール抽出によって脱蛋白する。
ＤＮＡをエタノールで沈澱させた後、２０μｍの１０ｍ
Ｍ）リス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）および０．５ｍＭ
　ＥＤＴＡに溶解する。突出した末端を、ｄＡＴＰおよ
びｄＴＴＰの代りにｄＣＴＰ　（Ｐ　＆　Ｌ　Ｒｉｏｃ
ｈｅｓｉｃａｌｓ）およびｄＧＴＰ　（Ｐ　＆゛Ｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｇ）を用いることを除き、上記と
同様にしてＤＮＡポリメラーゼ■（Ｋｌｅｎｏ−フラグ
メント）で処理する。８５℃で５分間インキエベートす
ることによってポリメラーゼを不活性化する。２容量の
０．１　Ｍ　）リス・ＨＣＩ（ｐＨ８，７）を反応混合
物に加え、０．５単位のウシホスファターゼ（Ｂｏｅｒ
ｉｎｇｅｔ）と共に３７℃で３０分間インキエベートす
る０反応部合物をフェノールで抽出することによって脱
蛋白する。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、８μｌの１
０ｍＭトリス・ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５）および０．５
　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡに溶解する。
次の式： ％式％ を有する化学的に合成したＤＮＡリンカ−を、０、１　
ｍＭ　ｒＡＴＰ（Ｓｉｇｎ＋ａ）、５０ｍＭ）リス・Ｈ
ＣＩ（ａｌｌ　９．５　）　、１０　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ１
ｇ、５ｍＭ　　ＤＴＴおよび２単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（Ｐ＆　Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
を含む反応容積８μｍ中で、８ａモルのリンカ−を５μ
Ｃｉ　　（γ−”Ｐ−ＡＴＰ　（５５００Ｃｉ　−ｍＭ
−’、Ａｍｅｒｓｈａｏ＋）と共に３７℃で３０分間イ
ンキエベートすることによって５′−末端をリン酸化す
る。−８０℃で凍結することによって反応を停止させる
。
放射能標識したリンカ−を次に１ａｇのＣ１ａ　Ｔおよ
びホスファターゼで処理し、そして０．５ｍＭｒＡＴＰ
（Ｓｉｇｍａ）　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ（Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍ）、２０ｍＭ）リス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７，８
）　、１ｍＭＭｇＣＩｇおよび８００単位のＴ、ＤＮＡ
リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む２０μｌの反応容積
中でｐＨＲ１１４５−ＤＮＡ　（上記を参照されたい）
と連結する。インキュベーションを１５℃で２時間行う
。８５℃で１０分間インキエベートすることによってリ
ガーゼを不活性化する。次に、２容量の水を加え、塩化
ナトリウム濃度を１０ｍＭに調整し、２０単位のＫｐｎ
　Ｉ　（［１ｉｏ１ａｂｓ）を３７℃で３０分間にわた
って加える９、フェノールおよびクロロホルムで抽出し
た後、混合物を、４０Ｍトリス・酢酸（ｐＨ７，８）。
ｌ　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡおよび０．５．ｃｒｇ／ｍｌの臭
化エチジウム中０．９％の低融点アガロースゲル（Ｂｉ
ｏｒａｄ）を通して分画する。紫外線照射によって目視
出来且つ同じ大きさのマーカーＤＮＡと同じ移動度を示
すバンドを小力で切り取る。ゲルの部分を６５℃で５分
間溶融した後、３７℃に冷却する。約２０μｌの容量が
得られる。この溶液５μｌを採取して、０．５ｍＭ　　
ＡＴＰ、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、　
　２０　ｍＭ　トリス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７，８）に調
整しておいた１０．ＩＪｌの反応容積中４００単位のＴ
４リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に１５℃で１２時間
インキュベートする。１００ｍＭ）リス・ＨＣＩ（ｐＨ
７、８）　　、　　１００ｍＭ　ＣａＣ１ｇおよび１０
０ｍＭＭｇＣｌ　ｚから成る溶液１／１０容量を、リガ
ーゼ混合物（１５℃で固イいに加え、全量を６５℃で５
分間インキュベートする６次に、この溶液を、上記と同
様にして、カルシウム処理したＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞
を形質転換するのに用いる。５０μｇ／　ｍ　ｌのアン
ピシリンを加えたＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板上に塗布す
る。
１０個の異なるプラスミドＤＮＡが上記と同様に単離さ
れ、このＤＮＡを次の制限酵素分析に付する。すなわち
、それぞれの場合に、０．５μｇのプラスミドＤＮＡを
、酵素製造業者の指示にしたがってＫｐｎ　１　（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）、Ｎｃｏ　Ｉ　（ＩＳｉｏｌａｂｓ）およ
びｎｃｏＲＩ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて次々と切断
する。開裂生成物を、４０ｍＭ）リス・酢酸（ｐＨ７，
８）、１　ｍＭ　［！ＤＴＡ　、、０．５　ｐ　ｇ／ｍ
　ｌの臭化エチジウム中１％アガロースゲル上で分画す
る。総てのプラスミドは、それぞれ所望なようにこれら
の酵素切断部位の１つを示す。１つをＨＲｉ１４Ｂと命
名する。
このプラスミドＨＲｉ１４Ｂは、トリプトファンプロモ
ーター−オペレーターおよびＡＴＧ　（これも含む）ま
でのりボゾーム結合部位を含む。ヒルジンおよびその他
の異種遺伝子も、このプラスミド中に１個存在するＥｃ
ｏＲＩ、Ｎｃｏ　Ｉ　ｓ　　Ｋｐｎ　Ｉ部位を介して直
接にカップリングすることができる。また、この構造は
、対応する遺伝子上に存在なければならない翻訳の開始
に必要なＡＴＧを伴わない異種遺伝子の直接のカップリ
ングおよび発現を行うことが可能である。これは、上記
のように、Ｎｃｏ　Ｉで切断しそしてＤＮＡポリメラー
ゼで突出する末端を修復することにより、またはＫｐｎ
　Ｉで切断してヌクレアーゼＳＩによって突出末端を除
去することにより容易に達成することができる。したが
って、プラスミドＨＲｉ１４Ｂは、広い用途を有する発
現プラスミドである。
５μｇのｐＨＲ１１４８のプラスミドＤＮＡを、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａ５ｇ１ｌ　Ｉで
消化する。切り取られたベクターｐＨＲ１１４８／［Ｂ
ｃｏＲ１／Ｂａｍ１ｌ　Ｉを、密度勾配遠心分離によっ
て単離する。
５μｇのｐｌ’１Ｌ３００のプラスミドＤＮＡを、最初
に１００ｍＭ）リス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）　　、
　５０ｍＭＮａＣ１および１００＃ｇ／ｍｌのゼラチン
の溶液５０μｌ中で、１０単位のＥｃｏＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて、３７℃で１時間消化する。この
線状化したプラスミドＤＮＡ／ＥｃｏＲ１の一部（０，
５μｇ）をアガロースゲル（実施例１０ａ参照）からゲ
ル溶出によって単離し、そしてＣｒ−”Ｐ）ＡＴＰで放
射能標識する（実施例１２参照）。次に、主要量のプラ
スミドＤ　Ｎ　Ａ／ＢｃｏＲＩをこの放射能標識したＤ
ＮＡと混合して、ＢｃｏＲＩＩ制御エンドヌクレアーゼ
を用いて消化し、ＥｃｏＲＩＩ　−１！ｃｏＲＩ　”Ｄ
ＮＡフラグメント（１０９塩基対）を８％ポリアクリル
アミド上でゲル電気泳動によって分離する。
２００μｇのＦ　１−　Ｄ　Ｎ　Ａ　／ＥｃｏＲＩ　”
　／ＥｃｏＲＩｆを、ゲル溶出によって単離する。
Ｉｌ、Ｆ　　−ＤＮＡ／ＢａｍＨＩ　　［！ｃｏＲＩ［
の　６５ｐｇのｐＭＬ３０５のプラスミドＤＮＡを、Ｂ
ａｍ１ｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ１０単位を用いて
切断する。この線状化したプラスミドＤ　Ｎ　Ａ／Ｂａ
ｓ＋ＨＩをアガロースゲル（実施例１０ａ参照）からゲ
ル溶出することによって単離し、Ｃｒ−”Ｐ）（実施例
１２参照）を用いて放射能標識する。次に、主要量のプ
ラスミドＤ　Ｎ　Ａ　／　Ｂａｍ１ｌ　Ｉをこの放射能
標識したＤＮＡと混合し、ＩＩ！ｃｏＲＩＩ制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、ＥｃｏＲＩＩ　−Ｂａｍ＋１目
”　ＤＮＡフラグメント（１２２塩基対）を８％ポリア
クリルアミド上でゲル電気泳動によって分離する。２５
０μｇのＦ２−　Ｄ　Ｎ　Ａ　／Ｂａ５ｌｌ　Ｉ　”　
／ＥｃｏＲＩｆが単離される。
実施例１０Ｃに既に記載の方法で、１０ｎｇ（＝４７３
ｎモルの末端）のＦｌ　−ＤＮＡ／ＥｃｏＲＩ／Ｅｃｏ
ＲＵおよび９　ｎ　ｇ　（＝　４９５ｎモルの末端）の
Ｆ　ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　／Ｂａｍｆｌ　Ｉ　／ＢｃｏＲ
ＩＩを、２０μｌの容量中でＴ４ＤＮＡリガーゼで処理
する。次に、この混合物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、そしてＤＮＡをアルコールで沈澱させる０次い
で、このＤＮＡ沈澱を実施例１０ｃに記載のように溶解
させ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１ｌ　Ｔ制限エンドヌク
レアーゼで消化させる。次いで、この溶液をＴＮＥで標
準化して、３０ｎｇ（−５０ｎモルの末端）のベクター
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｐＨＲ１１４８／ＥｃｏＲＩ　／Ｂａｗｌ
　Ｉ　　（実施例１３ａＤ参照）を加える０次に、この
溶液をフェノール／クロロホルムで再度抽出し、そして
ＤＮＡをアルコールで沈澱させる。沈澱したＤＮＡ混合
物を実施例１０ｃに記載の方法で７４ＤＮＡリガーセ（
Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理する。この方法で、インサート
としてＦ、−Ｆ、−ＤＮＡ　（デスルファトヒルジン遺
伝子）を含む組み替えプラスミドが溶液中に生成する。
カルシウムで処理したＥ、コミ月ＩＢＩＯＩ　！ＩＩ胞
の形質転換を、実施例１０ｄに記載の方法で行う。実施
例１３ｃで得られた反応混合物ｌＯμｌを用いる。
４２０個のアンピシリン耐性のコロニーが得られる。
１８個の形質転換されたコロニー（実施例１３ｄ）を実
施例１０ｅに記載の方法でＦｌ−Ｆ２−ＤＮＡ含有につ
いて検討する。実施例５および６において記載したオリ
ゴデオキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとし
て用いる。オートラジオグムにおいて、１２個のコロニ
ーが得られ、そのうちの５個をｐＭＬ３１０、ｐＭＬ３
１１、ｐＭＬ３１２、ｐＭＬ３１３およびｐＭＬ３１４
と命名する。
！施■上土　クローン札　の　　。
ｌａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ（上記）にしたがってＦ
、−Ｆ、−ＤＮＡを配列決定することによって、実施例
１２に記載の方法で組換プラスミドｐＭＬ３１０に於け
るＦｌ　−Ｆｇ　−ＤＮＡ配列の特性決定を行う。
１０μｇのＦｌ　　Ｆｔ−ＤＮＡを検討する。Ｆｌ−Ｆ
２−ＤＮＡのヌクレオチド配列は、合成デスルファトヒ
ルジン遺伝子について記載された配列と同一である。
ヒルジンについて化学的に合成された遺伝子を、プラス
ミドｐＭＬ３１０に於ける２０６ｂｐＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａａ＋ＨＥインサートとして増幅する。この遺伝子をプ
ラスミドから切除して、制御可能なＰＩＩ０５プロモー
タの制御下に酵母において発現せしめる。この造成物は
、欧州特許出願筒１４３．０８１号明細書に記載のよう
に、５４ｔｂｐ鷹プロモ一タ配列および完全なＰＩＩ０
５シグナル配列（１７個のアミノ酸をコードする５１個
のヌクレオチド）を含有する。この配列は、天然の成熟
ヒルジンのＮＨｔ・−末端アミノ酸としてのバリンのコ
ドンから始まるヒルジンの成熟コード配列にインフレー
ム融合している。ヒルジン遺伝子は、その３′−末端に
Ｐ　ＩＩ　Ｏ５転写停止シグナルを提供するＤＮＡフラ
グメントを有する。
この発現プラスミドのベクタ一部分は酵母２μ配列、酵
母における選択用酵母ＬＥＵ　２遺伝子およびＥ、コリ
における選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝子および
Ｅ、コリの複製開始点を含む。方法は、第５．６および
７図に示す。
デスルファトヒルジンをコードするヌクレオチド配列は
、最終の遺伝子生成物においては、Ｎ１ｈ−末端バリン
のためのＧＴＴから始まる。Ｅ、コリにおけるサブクロ
ーン化および発現を好都合にするため、コード配列は５
′末端においてＵｃｏＲＩ制限部位およびＡＴＧ介しコ
ドンを含む８個のヌクレオチドにより延長されている。
ヒルジンコード配列をＰＩＩ０５＞グナルペブチドをコ
ードする配列に正確にインフレーム融合させるためには
、これらの追加のヌクレオチドを除去しなければならな
い。これは、ＥｃｏＲＩ制限部位を平滑末端部位に変換
し、Ｉｌｇａｌによるその後の切断がＧＴＴコドンの直
ぐ上流に起こるような位置にＨｇａ　Ｉ認識部位を含有
する合成オリゴヌクレオチドを付加することによって達
成される。
一゛スルフ　トヒルジン゛　−の−の１１ａＩ切゛皿位
■星入（第５図参照） ８μｇのプラスミドｐＭＬ３１０　（実施例１３ｃ参照
）を、制限エンドヌクレアーゼｆ！ｃｏＲＩで完全に消
化する。Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＭＬ３１０／ＥｃｏＲＩ　）
をフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノールで
沈澱させる。ヌクレアーゼＳ１によって、５′突出末端
を除去する。４μｇのｐＭＬ３１０／　ＥｃｏＲＩ　　
Ｄ　Ｎ　Ａを、１００μ＋の２５０ｍＭ　ＮａＣ１、１
ｍＭ　Ｚｎ５Ｏｎ　、　３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ａｌ
ｌ　４．６　）および２０単位／ｍｌのヌクレオチドＳ
　ｒ　（Ｓｉｇｍａ）中で、３７℃で４５分間消化する
。
ＤＮＡをフェノール／クロロボルムで抽出して、エタノ
ールを用いて沈澱させる。Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＭＬ３１０
／ｒ！ｃｏＲＩ　／ｓ　＋　）を１００．ｕｌの５０ｍ
Ｍ）リス・ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）に再分散させ、２
単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ％　
Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）と共に３７℃で１時間インキュベ
ートする。酵素を、６５℃で１．５時間インキュベート
して不活性化する。
培養混合物中のＮａＣ１：３３度を１５０ｍＭに調整す
る。
デスルファトヒルジンＤ　Ｎ　Ａ　（ｐＭＬ３１０／ｆ
！ｃｏＲＩ　／Ｓ、　／ＣＩＡＰ）を、低塩緩衝液（１
５０ｍＭ　ＮａＣ１。
１０ｍＭトリス・ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）、　１　ｍ
Ｍ　［１ＤＴＡ　）中でＤＥ５２　（Ｗｈａｔｗ＋ａｎ
）イオン交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝
溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ１。
１０ｍＭ）リス・ＨＣ１（ｐＨ８，Ｏ）、　１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ　）を用いて溶出させる。ＤＮＡをエタノール
で沈澱させ、水に再分散させて０．８　ｍ　ｇ　／　ｍ
　ｌの濃度にする。
次の式： ％式％ を有するオリゴヌクレオチドを、ホスホトリエステル法
［板倉ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、第１０３巻
、７０６頁（１９８１年）］によって合成する。オリゴ
ヌクレオチドの配列は制限エンドヌクレアーゼＨｇａ　
１の認識部位−ＧＡＣＧＣ−を有する自己相補性である
。
２本の単鎖をアニーリングすることにより、１２個の塩
基対を有する２本鎖ＤＮＡリンカ−になる。
１．２μｇの合成の単鎖オリゴデオキシヌクレチオドを
、１０ｕｌの６０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭ　ＭｇＣｂ、５ｍＭ　　ＤＴＴ、３０μＣ１の
Ｃｒ　−”ｐ　］　ＡＴ　Ｐ　（３０００Ｃｉ−ｍＭ−
’、Ａｍｅｒｓｈａｍ）および６単位のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中で３７℃で
３０分間、次いで０．５ｍＭ　　ＡＴＰの存在下で３７
℃で１５分間リン酸化する。混合者を７５℃で１０分間
更にインキュベートして酵素を不活性化して、次いで室
温に冷却してアニーリングする。０．６μｇ　（１７０
ｐモル）の２２ｐで標識したリンカ−ＤＮＡを２６４＃
ｇ　（１，７５ｐモル末端）のｐＭＬ３１０／　Ｅｃｏ
ＲＩ　／　Ｓ　＋／（、ＩＡＰと混合し、２０μｌの６
０ｍＭトリス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７、５）、　１０　ｍ
ＭのＭｇＣ１ｚ、　　５　ｍＭＤＴＴ、３．５ｍＭ　　
ＡＴＰ、　　８００単位の７４ＤＮＡリガーゼ　（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）中で１５℃で２０時間連結する。リガーゼ
を８５℃で１０分間で不活性化し、過剰のリンカ−分子
を１０　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ａｌｌ７．５）、３００
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）および０．５４容の
イソ−プロパツールの存在でＤＮＡを沈澱させることに
よって除去する。室温で３０分後にＤＮＡをベレットに
して、４５μｌの連結混合物（上述）に再分散し、１５
℃で６時間連結させて、環状のＤＮＡを形成させる。
１μｌおよび３μｍの連結混合物を、１００μｌのカル
シウム処理した形質転換コンピテントＥ。
コリＨＢＩＯＩ細胞［口、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、第１６６巻、５５７頁、１９
８３年）によって調製〕に加える。細胞を氷上で３０分
間放置し、次いで４２℃で３分間°インキュベートし、
氷上で２分間冷却した後、４００μｌのＳＯＣ培地中で
３７℃で１時間インキュベートする。細胞をそれぞれ１
００１１１に濃縮し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを
有するＬＢ寒天平板に塗布する。
１２個の形質転換したａａ＋ｐ”コロニーを、それぞれ
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で増殖
させる。プラスミドＤＮＡをＯ，Ｓ。
Ｈｏｌｍｅｓらの方法［Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋
、　、第１１４巻、１９３頁、１９８１年］にしたがっ
て調製する。合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は
、プライマーとしてヒルジンのコード鎖にハイブリダイ
ズする単鎖Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを用いるＤＮＡ配列
決定によって確かめられる。ヒルジン遺伝子の前の正確
な位置にリンカ−ＤＮＡを含有するクローンを、ｐＭＬ
３１０Ｌと称する。
１２μｇのプラスミドｐＭＬ３１０Ｌを、制限エンドヌ
クレアーゼＢａ５ｉｎ　Ｉを用いて完全に消化する。
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、２つの制限フラグメントをト
リス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３＞中１．２
％アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色し
た０、８４ｋ　ｂ　Ｐｖｕ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉフラ
グメントをゲルスライス中で単離する。ＤＮＡを３ｍｌ
の０．２　ｘＴＢＥ緩衝液を満たした透析ベッドで電気
溶出する。閉じたバッグをＴＦ３Ｅ緩衝液（ｐＨ８，３
）（９０ｍＭ）リス−塩基、９０ｍＭホウ酸、２、５　
ｍ　Ｍのｔ！ＤＴＡ）中に浸漬する。１００ｍＡで３０
分間電流を通じた後、電流の極性を４５秒間反転させ、
ＤＮＡを透析膜から剥離させる。透析バッグのゲルスラ
イスを取り巻く緩衝液を回収して、１５０ｍＭ　ＮａＣ
１に調整し、Ｄｎ５２　（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）イオン交
換カラムを通過させる。ＤＮＡを高温緩衝液［１，５Ｍ
　ＮａＣ１，１０ｍＭ　トリス−ＨＣ１（ｐＨ８，Ｏ）
。
１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用いて溶出させ、エタノールで
沈澱させ、水に再溶解させて０．１　ｍ　ｇ　／　ｍ　
ｌの濃度にする。
ｐＭＬ３１０Ｌの０．８４ｋ　ｂ　Ｐｖｕ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼＨｇａ
　Ｉで更に消化する。この消化により、成熟デスルファ
トヒルジンの完全なコード配列を含有する１９８ｋ　ｂ
　Ｈｇａ　ｌ−Ｂａ１ｍ１（Ｉフラグメントが生じる０
次のＡｌｕ　Ｉによる消化では、１９８ｂｐ　　Ｈｇａ
　Ｔ　−Ｂａａ＋ＨＩフラグメントには触れないが、同
様な大きさのその他のＨｇａ　１フラグメントを除去す
る。
０、２　ｋ　ｂ　ｉ（ｇａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメ
ントはＴＢＥ緩衝液中１．５％アガロースゲル上で他の
フラグメントから分離され、（上記のよ゛うに）電気溶
出によって単離される。ＤＮＡは口［５２イオン交換ク
ロマトグラフイおよびエタノール沈澱によって精製され
る。ＤＮＡを水に再分散して、３０μｇ／ｍ１（０，２
ｐモル／μｌ）の濃度にする。
プラスミドｐ３１／ＰＩＩ０５−ＴＰＡ１８（欧州特許
出願筒１４３．０８１号明細書参照）は、皿プロモータ
ーおよび外来構造遺伝子（ｔ−ＰＡ）にインフレーム融
合したＰＩＩ０５シグナル配列を存する。５８４ｂｐＢ
ａｍｌｌ　ｒ　−Ｂａｔ　Ｉフラグメントは１１　ＨＯ
５、および３′末端の８個のヌクレオチドを除（ＰＩ（
０５シグナル配列の総てを含有する。
８μｇのｐ３１／Ｐ１１０５−↑ＰＡ１ＢＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＢａ１Ｉで消化する（３７℃で１６
時間）。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出および
エタノール沈澱によって精製する。
ＤＮＡを水に再分散させ、０．７　ｍ　ｇ　／　ｍ　１
の濃度にする。
ＰＨ０５シグナル配列とデスルファトヒルジンをコード
領域との間の正確な連結は、次の式：％式％ の合成リンカ−によって行われる。
リンカ−（５’−ＣＣＡＡＴＧＣ八）の５′末端の８個
のヌクレオチドはＢａｌ［部位からプロセシング部位へ
のＰＨ０５シグナル配列の一部分を表す。
オリゴヌクレオチド（２）の５′−の突出している５個
のヌクレオチドは、デスルファトヒルジンコード配列の
５′末端のＨｇａ　Ｉ切断部位に対合する。
個々の単鎖オリゴヌクレオチド（１）および（２）は、
ホスホトリエステル法（板金ら、上記）によって合成さ
れる。オリゴヌクレオチド（１）および（２）のそれぞ
れ１．１μｇおよび１．８μｇを、実施例１５に記載の
ようにそれらの５′末端でリン酸化し、等量を混合して
、そしてアニーリングする。
１．３μｇ　（２００ｐモル）のリン酸化した２本鎖リ
ンカ−ＤＮＡを、４０ｐｌの６０ｍＭトリス・ＨＣｌ　
　（ｐＨ７，５）　　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　　、　３
．５ｍＭＡＴＰ、５ｍＭ　　ＤＴＴおよび１４００単位
の７４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で７．ｃ＋
ｇ（１，８μＭ）のＢａ１ｌ開裂ｐ３１／ＰＩＩ０５−
　ＴＰＡ１８に、１５℃で１６時間で連結する。リガー
ゼを、８５℃で１０分間不活性化する。過剰のリンカ−
を、１０ｍＭＥＤＴＡ、　　３００ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ６，０＞および０．５４容のイソプロパツールの
存在でＤＮＡを沈澱させることによって除去する。ＤＮ
Ａを再分散して、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ１ｌ　
Ｉで更に消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱させた後、２個の制限フラグ
メントをトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３
）中１、２％アガロースゲル上に分離させる。ＤＮＡを
電気溶出させ、ＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィお
よびエタノール沈澱によって更に精製する。
０、６　ｋ　ｂのＢａｍ１ｌ　Ｉ　−Ｈｇａ９　Ｄ　Ｎ
　Ａフラグメントを水に再分散し、４０μｇ　／　ｍ　
１の濃度にする。
９μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／　ＰＩ１０５−
　ＴＲＡ　（１２−２）ＤＮＡ　（欧州特許出願第１４
３．０８１号明細書参照）を、制限エンドヌクレアーゼ
Ｂａａ＋ＨＩで消化する。完全に消化し終わった後、Ｄ
ＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈澱せしめる。ＤＮＡを５０ｍＭのトリス・ＨＣ１（
ｐＨ８，０）に再分散し、そしてＯ，ｌ　ｍ　ｇ　／　
ｍ　１の濃度にして、７単位のウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで３７℃で１時間消化する。ホスファターゼを
６３℃にて１．５時間で不活性化して、ＤＮＡをＤＥ５
２イオン交換クロマトグラフィ（実施例１３参照）およ
びエタノール沈澱によって精製する。
６．８に’ｂの大きなりａｍＨＩフラグメントを、トリ
ス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中１．２％
アガロースゲル上で分離する。ＤＮＡを、電気溶出し、
そしてＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィおよびエタ
ノール沈澱によって精製する。ＤＮＡを水に溶解し、そ
して０．４ｍｇ／ｍｌ　　（０，１ｐＭ／ｐ　１）の濃
度にする。
ｐＪＤＢ２０７酵母ベクター、皿シグナル配列を有す、
Ｌ　ＰＨ０５プロモータフラグメント、およびデスルフ
ァトヒルジン構造遺伝子は、総て連結されて発現プラス
ミドを形成するＤＮＡフラグメント（実施例１６ａ−ｃ
参照）として単離される。
ｐ３１／Ｐ１１０５−　ＴＰＡ１８の０．６　ｋ　ｂ　
ＢａｍＨＩ　−１１ｇａ４フラグメント０．３ｐモル、
およびｐｌ’１Ｌ３１０Ｌの０．２ｋ　ｂ　Ｉｌｇａ　
Ｉ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉフラグメント０．３μモルを、１
０．１７１の６０ｍＭ）リス・ＨＣ１（ｐＨ７，５）。
１０ｍＭ　　ＭｇＣｈ　　、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ
ＡＴＰおよび４００単位のＴ、ＤＮＡリガーゼ中で、０
．１μモルのｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＩＩ０５−ＴＰＡ（
１２−２）の６、８　ｋ　ｂ　　Ｂａｍ１ｌ　Ｉフラグ
メントに１５℃で２０時間連結させる。
連結混合物１μｌを、ｌ１ａｎａｈａｎ　（上記）によ
り調製した形質転換可能なＥ、コ月１８１０１細胞１０
０μｉに加える。形質転換の処理法も、上記文献から採
用する。細胞を、５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天平板状に塗布する。
２４個のａｍｐ”コロニーを、別々に１００μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを有するＬＢ培地で増殖させる。プラス
ミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＰｓ口で切断す
ることによって、インサートの大きさおよび方向につい
て分析する。インサートの正確な方向を有する単一クロ
ーンを、ｐＪＤＢ２０７／Ｐ１１０５−１＋１Ｒと称す
る。
ス並貫土工・、サツカロミセス・セレビシェ−硅旦り坐
貝ｌｌ換 プラスミドｐＨＤＢ２０７／　ＰＨ０５−ＨＩＲを、１
ｌｉｎｎｅｎら（上記）により記載された形質転換法を
用いて、サツカロミセス・セレビシェ−株ＧＲＦ１８　
　（α。
ｈｉｓ３−１１．　　ｈ旦３−１５．　ｌｅｕ　２−３
　、　１ｅｕ２−１１２　、　ｃａｎ　”　）に導入す
る。５μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌのスフェロ
プラスト懸濁液に加え、この混合物をポリエチレングリ
コールで処理する。スフェロプラストをｌＱｍｌの再生
寒天と混合して、ロイシンを欠く酵母最少培地゛平板上
に塗布する。
形質変換した単一酵母コロニーを取り出し、そしてロイ
シンを欠く酵母最少培地中で増殖させる。
このコロニーを、サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ
１８／ｐＪＤＢ２０７　／ＰＨ０５−ＨＩＲと称する。
Ｓ、セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤｎ２０７　／ＰＩ
Ｉ０５−ＨＩＲの細胞を、２０ｍ！の酵母最少培地（Ｄ
ｉｆｃ。
Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎベース、２％グルコース
および２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを添加し、アミノ
酸なし）中で３０℃で撹拌し、細胞密度３　ｘ　１０’
個／ｍｌまで培養する。細胞を０．９％ＮａＣ１で洗浄
した後、低Ｐ、−最少培地中に５０ｍ１培養液を接種す
るのに用いる。低Ｐｉ−７８低培地は、Ｄｉｆｃ。
Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ培地（アミノ
酸なし）の組成に対応して調製されるが、（Ｎｎ４）ｔ
ｓｏａ、２％のグルコースおよびＩｇ／ｌのＬ−ヒスチ
ジンの代わりに０．０３ｇ／ｌのＫＩｌｔＰＯ４、Ｉｇ
／ｌのＫＣＩおよび１０ｇ／ｌのＬ−アスパラギンを含
む。培養液を４ｘｌＯ’個／ｍｌの細胞密度まで接種し
て、３０℃で２０Ｏｒ　ｐ　ｍで４２時間まで撹拌する
。
それぞれ１８時間、２６時間および４２時間の醗酵時間
の後に、それぞれｌ　Ｑ　ｍ　ｌの１０個の試料を培養
液から採取して、脱塩およびＢｏｎｄ　ＥｌｕｔＣ−１
８カラム（（１ｍ　ｌ　ｓ　Ａｎａｌｙｔｉｃｈｅｌ＋
　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上での濃縮により富化
する。試料をカラムに入れ、そして液体を真空で除去し
た後、カラムを１．５ｍｌの水−アセトニトリル（９：
１）−０，１％トリフルオロ酢酸（９：　１）で２回洗
浄する。ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニトリ
ル−０，１％トリフルオロ酢酸（６：　４）で溶出する
。
２ｍｌの溶出液を、５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ濃縮機（Ｓａｖ
ａｎｔ）で４００μｌの最終濃度まで濃縮する。ヒルジ
ン化合物をＩ（ＰＬＣ分析で標準デスルファ上ヒルジン
と比較することにより、及びトロンビン阻害測定法によ
り同定する。試料には、約０．２〜２μｇ　／　ｍ　１
のヒルジン化合物が含まれる。
４２時間の醗酵時間の後に１リツトルの培養液を回収し
、そして遠心分離する。上澄液を、ｐＨ？、５で、ＤＥ
５３セルロース（Ｗｈａ　ｔ＋ｗａｎ）のアニ゛オン交
換カラムに入れる［条件：カラム２．５　ｘ　１５．５
ｃｇ＊（７６ｍｌ）；溶出緩衝液Ａ：２０ｍＭ酢酸アン
モニウム、１００ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５）　；溶
出緩衝液Ｂ：２０ｍＭ酢酸アンモニウム、４　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１（ｐＨ５，０）：流速：６６ｍ１／時間］。カラム
を２２８ｍ１緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液Ａおよび緩
衝液Ｂのそれぞれ２２８ｍ１の線形塩勾配で溶出する。
２２ｍ１ずつの両分を集める。ヒルジン化合物は、分画
７１〜７４（８８ｍｌ）に溶出し、トロンビン阻害分析
法によって同定する。活性な両分を、−晩４℃で２０ｍ
Ｍ酢酸アンモニウムに対して透析する。次いで、透析物
を、２回凍結乾燥する。凍結乾燥生成物は、逆相ＨＰＬ
Ｃによれば、デスルファトヒルジン化合物を含む。
トロンビン阻害試験で活性な主分画（８０ｍｌの溶出液
）を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐ１１７．５）に対
して４℃で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレ
ーターを用いて３５℃で濃縮して、最終容積を５　ｍ　
ｌとする。
得られる透明な水溶液を、ベッド容積が１６０ｍｌの５
ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−５０精密カラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）であって、カラム（２，５ｘ６４ｃｍ　、　Ｂ
ｉｏｒａｄ）を５％酢酸で予備平衡化させておいたもの
に加える。５０ｍ１の溶出液（分画５〜７、流ｆｆ１５
０ｍ１／時間、２５分／分画）に含まれる主活性成分を
ロータリー・エバポレーターを用いて濃縮して、次いで
逆、相肝ＬＣ分離を行う。各分画の一部分（５００μｌ
）を、ｒ　５ｐｅｅｄ　　ｖａｃ　Ｊ濃縮機（Ｓａｖａ
ｎｔ）を用いて１０分の１に濃縮して、逆相ＨＰＬＣに
よってそのデスルファトヒルジン化合物の含量を分析す
る。溶液は、デスルファトヒルジン化合物を含む。分画
〇（１８ｍｌ）は極めて少量の第二の成分を含み、半調
製用逆相肝ＬＣによって更に精製する。
実験条件：　　Ｖｙｄａｃ　２１８ＴＰ５１０ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣカラム、１０ｘ２５０ｎ　；分離毎の分画６の一
部（２００μｌ、ｌ；１０に濃縮）；　　２２０ｎｍで
０．５以下（ＡＵＦＳ）　；流速：２ｍｌ／分；溶出液
：　Ａ　：　０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂニアセトニ
トリル／水（８：　２）　＋０．０７％トリフルオロ酢
酸、１分間１６％の８１次いで４０分間に６゛４％のＢ
まで増加。得られる画分を水で１＝１に希釈して、凍結
乾燥する。残渣は、純粋なデスルファトヒルジン化合物
から成る。
細胞は、常法に従い破壊する（欧州特許出願第１００．
５６１号明細書参照）。２％酢酸で処理した上澄液を遠
心分離する（１２．００Ｏｒｐｍ、１０℃）、アンモニ
アを加えて最終ｐｎを７．５として、僅かに不透明な溶
液（５０ｍｌ）を更に上記の様に処理する（実施例１９
ａ）。ヒルジン化合物は上記のようにして、すなわちト
ロンビン阻害法および逆相ＨＰＬＣによって同定する。
（ａ）上記のように（実施例１９ｂ参照）調製した上澄
液２ｍｌを、高真空下でｒＳｐｅｅｄ　　ＶａｃＪ濃縮
機上で乾燥する。試料をそれぞれ１００μｍの水に溶解
し、ＩＩＰＬｃ分析を行う（実験条件１、下記を参照さ
れたい）。個々の両分のトロンビン阻害を試験する。保
持時間が１６．５分および１７．７分の画分が、トロン
ビン阻害を示す。これらの２分画の比率（発現収率）は
、約４：１である。アミノ酸組成によれば、これらの百
分はデスルファトヒルジンである。
（ｂ）トロンビン阻害試験で活性である、実施例１９ａ
に記載の方法で得られる分画を、異なる２種類の条件下
でＩＩＰＬＣ分析にかける。
実１条作よ：ヌクレオシル（ＭＮ）　Ｃ１８，５，ｕｎ
ＲＰ　−ＨＰＬＣカラム、４．６　ｘ１２０ｍ　＝　５
０μｌヒルジン化合物／分離、２１４　ｎ　ｍでａｔｔ
、６；流速１．　’ｌ　ｍ　１／分：溶出液？　Ａ　：
　０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂニアセトニトリル／水
（８：　２）　＋０．０８％トリフルオロ酢酸、２分間
は１６％のＢ、次いで５０分間を要して６４％のＢへ増
加。逆圧：６６バール。
１簾条件叢：２分間２０％のＢで、それ以後４０分間を
要して８０％のＢへ増加する勾配であることを除いて、
上記と同じ条件。
分画は１分間の間隔で採取しく全部で４５）、そしてト
ロンビン阻害試験を行う。画分１７〜１９は、活性であ
る。更に、アミノ酸組成、Ｎ−末端基およびＮ−末端配
列を、画分１７および１８の活性なヒルジン化合物につ
いて決定する。一つの両分（第１７）は、更に、ヒルか
らの天然のヒルジンを酵素アリールスルファターゼと反
応させることによって得られる標準のデスルファトヒル
ジンと比較する。これらの結果を、以ドの表１にまとめ
る。
分画１７および１８の収量の比率は、約４：１である。
（ｃ）上記（実施例１９ａ参照）と同様に調製した上澄
液２００ｍ　ｌについて、ＨＰＬＣ分析（条件３、以下
を参照）およびＦＰＬＣ分離（条件４）を行う。個々の
分画のトロンビン阻害を試験する。保持時間が８．０分
（ピーク１）、１１．１分（ピーク２）および１２．１
分（ピーク３）である分画は、強力なトロンビン阻害を
示す。これらの３種類の化合物の比率（発現収率）は、
約ｔ：ａ：ｔである。ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析によれば、ピー
ク２および３に対応する化合物は実施例２０ｂ（分画１
７および１８）に記載したヒルジン化合物と同一である
。結果を表２に示す。
以下金白 、表−」− ［３：　Ｖｙｄａｃ　　２１８ＴＰ　−Ｂ５ＲＰ　　Ｈ
ＰＬＣカラム、４、　Ｏｘ１２０ｍ、１５μｇのヒルジ
ン化合物／分離、２１４ｎｍでａｔｔ、　７、流速１．
２　ｍ　ｌ　／分；溶出液：Ａ　：　０．１％トリフル
オロ酢酸、Ｂニアセトニトリル＋０．０８％トリフルオ
ロ酢酸、２分間は１６％の８１次いで２０分間を要して
４０％のＢへ増加。
逆圧二８０バール。
１簾条イ！ｉ：　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　ＭｏｎｏＱ　
ＦＰＬＣアニオン交換カラム、５．０ｘ５０ｎ、　１５
μｇヒルジン化合物／分離、２８０ｎｍでＡＵＦＳｏ、
０１．流速１．０　ｍ　ｌ　／分、勾配溶出緩衝液Ａ：
２０ｍＭのトリス・ＨＣＩ（ａｔｔ７．５　”）　、Ｉ
Ｉ衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋ＩＭのＮａＣ１（ｐＨ７，５）　
、９分間は１５％のＢで、次いで２１分間を要して７０
％のＢに増加。
ＨＰＬＣ分析によれば、培地（実施例２０、表１および
２参照）から単離される分画１７（またはピークｌ）お
よび１８（またはピーク２）のヒルジン化合物は、細胞
抽出液から単離された対応する化合物（細胞内ヒルジン
化合物）と同じである。
これらの化合物およびピーク３　（表２を参照）は、次
のようにして特性決定する。
ａ、アミノ　　　のン 約２．５μｇの純粋なヒルジン化合物を、６ＮのＨＣＩ
を用いて１１０℃で２４時間加水分解し、次いでＣｈａ
ｎｇらの記載の方法［ロへＢ５−Ｃｌ法；　Ｍｅｔｈｏ
ｄｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏホー、第９１巻、４１頁、（
１９８３年）］と同様にして分析する。加水分解物は、
次のような組成を有する。
ピーク１　（表２参照） Ａｓｐ　　　　　　　　　９．２（９）Ｔｈｒ　　　　
　　　　　４．１（４）Ｓｅｔ　　　　　　　　　４．
０（４）Ｇｌｕ　　　　　　　　１２．４　（１２）Ｐ
ｒｏ　　　　　　　　　３．１（３）Ｇｌｙ　　　　　
　　　　９．０（９）Ｖａｌ　　　　　　　　　３．４
（４）シスチン　　　　　２．５（３） １１ｅ　　　　　　　　　２．１（２）Ｌｅｕ　　　　
　　　　　３．３（３）Ｔｙｒ　　　　　　　　　１．
９（２）Ｐｈｅ　　　　　　　　　１．２（１）１１ｉ
ｓ　　　　　　　　　１．０　（１）Ｌｙｓ　　　　　
　　　　３．１（３）Ｍｅｔ　　　　　　　　　　０（
０） 合計　　　　（６３） ピーク２　（）百１７、　１お礼ｇＬ先象■Ｌアミノ酸
　　　　　　加水分解物 Ａｓｐ　　　　　　　　　９．９（９）Ｔｈｒ　　　　
　　　　　４．０（４）Ｓｅｒ　　　　　　　　　３．
９（４）Ｇｌｕ　　　　　　　　１２．８　（１３）Ｐ
ｒｏ　　　　　　　　　３．１（３）Ｇｌｙ　　　　　
　　　　９．１（９）Ｖａｌ　　　　　　　　　３．７
（４）シスチン　　　　　　２．８（３） １１ｅ　　　　　　　　　２．１（２）Ｌｅｕ　　　　
　　　　　４．４（４）Ｔｙｒ　　　　　　　　　１．
２（２）Ｐｈｅ　　　　　　　　　１．２（１）Ｈｉｓ
　　　　　　　　　１．２（１）Ｌｙｓ　　　　　　　
　　２．９（３）Ｍｅｔ　　　　　　　　　　０（０） 合計　　　　（６５） ピーク３ユ立亘上８工１」］す」ξ［釦１態り八ｓｐ　
　　　　　　　　　　　　　　　１０．０（９）Ｔｈｒ
　　　　　　　　　　　　　３．９　　（４”）Ｓｅｔ
　　　　　　　　　　　　４．１（４）Ｇｌｕ　　　　
　　　　　　　　１２．５　　（１２）Ｐｒｏ　　　　
　　　　　　　　　３．１（３）Ｇｌｙ　　　　　　　
　　　　　　８．７（９）Ｖａｌ　　　　　　　　　　
　　　３．１（４）シスチン　　　　　２．４（３） ｌｉｅ　　　　　　　　　１．９（２）Ｌｅｕ　　　　
　　　　　３．３（４）Ｔｙｒ　　　　　　　　　１．
８（２）Ｐｈｅ　　　　　　　　　１．１（１）１１ｉ
ｓ　　　　　　　　　１．０　（１）Ｌｙｓ　　　　　
　　　　２，８（３）Ｍｅｔ　　　　　　　　　　０（
０） 合計　　　　（６４） （ｂ）部沿ｍ塞た扼 １８μｇ（２，５ｎＭ）の純粋なヒルジン化合物を、［
Ｅｄｍａｎの方法による通常の配列分析を行い、Ｎ−末
ｆａフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸を
ＲＰ　−１１ＰＬＣによって決定する。
（ｎ、ｄ、　−決定されず） ピー　　（２余、　　こい 上記のサイクル１カラムサイクル２９までの配列。
ピーク３　　１８、　１および２　糸　　れた公り 上記のサイクル１からサイクル２７までの配列。
したがって、検討した生合成ヒルジン化合物のＮ−末端
配列は、標準（真正）試料の配列と同じである。
Ｃ，Ｃ二速１し辷近 ヒルジン化合物をカルボキシペプチダーゼＹで消化し、
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する（Ｊ、
Ｙ、Ｃｈａｎｇ、　Ｒ，Ｋｎｅｄｅｌ、及びり、Ｇ、Ｂ
ｒａｕｎｓＢｉｏｃｈｅｎ＋、Ｊ、、第１９９巻、５４
７頁を参照されたい）。
Ｃ−末端アミノ酸：　−Ｇｌｕ　−Ｔｙｒ　。
ピーク２　（頁１７、−１およゾ１」１Ｏ−Ｃ−末端ア
ミノ酸：　−Ｇｌｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ　
　％ ピーク３　）百１８、　１および２央 Ｃ−末端アミノ酸：　−Ｇｌｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　
。
（ｄ）且ｌ」ゴし辷丑量 デスルファトヒルジン化合物（３０μｇ）を、ＳＤＳ尿
素ゲル上で分析する［５ＵＤＳゲル、Ｋｙｔｅら、Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、第１３３巻、５１５頁、（
１９ｅ３年）参照］、クマシープルー染色の前に、１２
％のトリフルオロ酢酸で固定を行う。見掛けの分子量が
６０００〜７０００ダルトンに相当する単一バンドが観
察される。
（ｅ）　　ＦＡＢ−ＭＳによる　　　。
デスルファトヒルジン化合物を、迅速原子衝撃陽イオン
マススペクトル分析法（ＦＡＢ　−ＭＳ）に付す。
分析機器：　　ＺＡＢ−１１Ｂマススペクトル分析計（
ＶＧ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌｔｄ、　、マンチェス
ター）、マトリックス：チオグリセロール・キセノン衝
撃；イオンエネルギー； １０ＫｅＶ　、外部標準：　Ｃ５ｔｓＪｚｓＣ分子量：
　６Ｂ８７．９）およびＣ５ｔｓＪｚ−Ｉ（７１４７，
７６）。
以下余白 晃り一肢 実験式：　ＣｚｔＪ４ｔ＋Ｎ７ｔＯ＋。？Ｓ＆３６分子
量算値）　　：６７２２．２３分子量（実測値’）　　
：６７１９．３゜ピーク２（ＴＩ？、　　１および２＾
　）実験式：　Ｃ２０？１１４４１１Ｎｌ１００１　＋
　ｏｓ＋分子量（計算値）　　：　６９６３．５１８１
８分子量測値）　　：６９６３．４４分子量は２つの異
なる測定値の平均である。
ピーク２　（）　　１８、　　ｌおよび２　　）実験式
：　ＣｚｍｔＨａｓｔＮｔｓＯ＋ｏｓＳｈ分子量（計算
値）　　：６８３５．３９分子量（実測値’）　　：６
８３２．９゜上記のデーグーに基づき、ピーク１の化合
物はデスルファトヒルジン（１−６３）であり、ピーク
２の化合物は標準デスルファトヒルジン（１−６５）と
同一であり、ピーク３の化合物は新規なデスルファトヒ
ルジン（１−６４）である。
（ｆ）ヒ　・トロンビン−ヒルジン” ヒト・トロンビン−デスルファトヒルジン複合体の解離
定数に０は、Ｓ、Ｒ，５ｔｏｎｅ及びＪ、　Ｉｌｏｆｓ
ｔｅｅｎｇｅの方法［…匹蝕畦■■、第２５巻、４６２
２〜４６２８頁、（１９８６年）］にしたがって決定さ
れ、下記の表にまとめである。表には、３種類の得られ
たデスルファトヒルジン化合物の比活性（ＡＴＵ／ｍｇ
で表した）も示している。
Ｋｅ［Ｍ］　　　　　比活性 ［＾τＵ／■ｇ］ 酵母　デスルファトヒルジン　（１−６５）　　２．９
ｘｌＯ−”　　１１０００酵母　デスルファトヒルジン
　（１−６４）　　３．９ｘｌＯ−”　　９６００酵母
　デスルファトヒルジン　（１−６３）　　３．０Ｘ１
０−”　　８９００実施例１９に記載の方法で醗酵を行
い、精製したデスルファトヒルジン化合物の混合物を、
更に分離して、詳細に特性決定する。
Ｖｙｄａｃ　２１８　ＴＰ　５１０　　ＲＰ−ＩＩＩ”
ＬＣカラム上で、半調製的分離を行うと、上記デスルフ
７）ヒルジン化合物（実施例２１ｅ参照）の他に、保持
時間が８．１分でカラムから溶出するデスルファトヒル
ジン様化合物が生じる。
この物質は迅速原子衝撃マススペクトル分析法（ＦＡＢ
　−ＭＳ）およびアミノ酸分析、部分配列決定法および
Ｃ−末端分析によって特性決定される。
ＦＡＢ　−ＭＳは、この物質が、分子量がそれぞれ６４
２９．５および６５５６．８である２種類の化合物の混
合物であることを示している。
アミノ酸組成は、次のようである。
Ａｓｘ　　　　　　　　　８．９（９）Ｔｈｒ　　　　
　　　　　３．７（４）Ｓｅｔ　　　　　　　　　４．
１（４）Ｇｌｘ　　　　　　　　１０．７　（１１）Ｐ
ｒｏ　　　　　　　　　３．２（３）Ｇｌｙ　　　　　
　　　　９．７　（９）Ｖａｌ　　　　　　　　　３．
３　（４）シスチン　　　　　　３．３（３） １１ｅ　　　　　　　　　２．１（２）Ｌｅｕ　　　　
　　　　　３．６（３）Ｔｙｒ　　　　　　　　　Ｏ，
９（Ｌ）Ｐｈｅ　　　　　　　　　　１．１（１）１１
ｉｓ　　　　　　　　　　１．２　（１）しｙｓ　　　
　　　　　　　　　　　　　　３．２（３）Ｍｅｔ　　
　　　　　　　　　Ｑ（０）合計　　　　（６１） 。配＋（Ｎ−Ｆ”） サイクル　　　１　　　２　　　３ アミノ酸　　Ｖａｌ　　　Ｖａｌ　　　ＴｙｒＣ−ｒ（
２１ｃ参 ５９６０　６１　６２ Ｃ−末端アミノ酸　　　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−（
Ｇｌｕ）これらのデーターによれば、この混合物は、デ
スルファトヒルジン（１−６１）とデスルファトヒルジ
ン（１−６２）とから成る。
」１１皿と （ａ）ＪＤＢ２０７ペタターフー外ＬＺ上互垂里６μｇ
のプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／　ＩＰ　（α−３）（
ＥＰ　１００．５６１）を、制限エンドヌクレアーゼＢ
ａｌ１ｌ目を用いて完全に消化する゛。生成するＤＮＡ
フラグメント（６，８５Ｋｂおよび１．１５ｋｂ）をエ
タノールで沈澱させ、４００μｌの５０ｍＭのトリス・
ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）中で処理する。４．５単位の
ウシ腸ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハ
イム）を加える。混合物を３７℃で１時間インキュベー
ションした後、ホスファターゼを６５℃で１．５時間で
不活性化する。溶液を１５０ｍＭ　ＮａＣ１に調整した
後、１０ｍＭトリス・ＨＣ１（ｐＨ７，５）、１５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１および１ｍＭ　　ＥＤＴＡで予め平衡にし
ておいたＤＩＥ５２　（Ｗｈａｔｍａｎ）アニオン交換
カラム（１００μｌ容量）に適用する。同じ緩衝液で洗
浄操作を行った後、ＤＮＡを４００．ｃａｌの１．５　
Ｍ　　ＮａＣ１゜１０ｍＭトリス・ＨＣＩ　　（ｐｌ＋
７．５　）　、１　ｍＭ　ＥＤＴＡで溶出させ、エタノ
ールで沈澱させる。６．８５ｋｂの大きなりａｎ＋旧フ
ラグメントが、トリス・ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐｉ
ｆ８．３）中１．２％アガロースゲル上で小さなフラグ
メントから分離される。
６μｇのプラスミドｐ　３１／　Ｒ（ＥＰｌｏｏ、５６
１）を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｎ＋ｌ（Ｉで消化する。生成する３種のＤＮＡフラグメ
ントを、トリス−ホウ酸−１！ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，
３）中１．２％アガロースゲル上で分離する。　５３４
ｂｐ　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントが単
離される。このフラグメントは、転写開始部位を有する
鷹プロモーターを含んでいる。
９μｇのプラスミドｐＭＬ３１０　（実施例１３ｃ参照
）を、制限酵素Ｂａｎ＋ＨＩおよび１ＥｃｏＲＩで完全
に消化する。生成する２種類のＤＮＡフラグメントを、
トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐｉｆ　８．３　）
中１．２％アガロースゲル上で分離する。２０６ｂｐ　
ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉフラグメントが、単離さ
れる。
以下余白 （ｄ）ＤＮＡフラグメントの゛′七 第ａ　”−ｃ項で述べた３種類のＤＮＡフラグメント（
上記参照）を、電気溶出によってアガロースゲルから得
、Ｄｔ！５２　（Ｗｈａ　ｔ＋ｍａｎ）アニオン交換体
上で精製し、エタノールで沈澱し、水に再分散する。
０、　Ｌ　ｐモル（０，４５μｇ）の６．８５　ｋ　ｂ
　　Ｂａｍ１ｌ　Ｉベクターフラグメント、０．３ｐモ
ル（０，１μｇ）の５３４ｂｐ　　Ｂａｎ＋ｔｌ　Ｉ　
−ＥｃｏＲＩ　　ＰＩＩ０５プロモーターフラグメント
および０．２５ｐモル（３４ｎ　ｇ）のｐＭＬ３１０の
２０６ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメント
を、１５μｍの６０ｍＭ）リス・ＨＣ１（ｐＨ７、５）
、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍ
Ｍ　　ＡＴＴおよび６００単位のＴ、ＤＮＡリガーゼ（
３ｉｏ１ａｂｓ）中で１５℃で１６時間連結させる。
２４個の形質転換したａｍｐ”コロニーを、１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で別々に培養す
る。プラスミドＤＮＡを１Ｉｏｌｎ＋ｅｓら（上記）の
方法によって単離し、ｌ１ｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲに重
消化によって分析する。約６ｏｏｂｐの大きなＥｃｏＲ
ｌ−ｌ１ｉｎｄＩ［［フラグメントの出現は、関連する
クロ−ンでは展プロモーターーヒルジンＤＮＡフラグメ
ントがベクター上の転写停止シグナルに対して正確な方
向にあることを示している。予想されるように、約５０
％のクローンはインサートの正確な方向を有する。これ
らのクローンの一つをｐＪＤＢ２０７Ｒ／　ＰＩＩ０５
−　Ｉｆ　ＩＲと命名する。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８株（α。
基３−１１．皿３−１５．１赳２−３．ユ肥２−１１２
、　ｃａｎ”　）を、ｌ１ｉｎｎｅｎら（上記）の方法
にしたがってプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／　ＰＨ０５
−旧Ｐを用いて形質転換する。形質転換された酵母細胞
の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天平
板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離され、
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／　ｐＪＤＢ
２０７Ｒ／ＰＨ０５−１１１Ｒと命名する。
Ｓ、セレビシェ−ＧＲＦ　１Ｂ　／　ｐＪＤＢ２０７Ｒ
／　ＰＨ０５−ＩＩ　ＩＲの細胞を、２０ｍ１の酵母最
低培地（Ｄｉｆｃｏ　ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎ培養
基、アミノ酸なし、２％グルコースおよび２０ｍｇ／ｌ
のＬ−ヒスチジンを添加）中で３０℃で攪拌し、細胞密
度が３ｘｌＯ’個／ｍｌになるまで培養する。細胞を０
．９％ＮａＣ１で洗浄し、次いで低Ｐｉ−最低培地中に
５０ｍ１の培養液を接種するのに用いる。低Ｐｉ−最低
培地は、Ｄｉｆｃ。
Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ培地（アミノ
酸なし）の組成に対応して調製されるが、（ＮＨ３）　
！ＳＯ４，２％グルコースおよびＩｇ／ｌのＬ−ヒスチ
ジンの代わりに０．０３ｇ／ｌのに１１□ｐｏ、、１　
ｇ　／　１のＫＣｌ、および１０ｇ／ｌのＬ−アスパラ
ギンを含む。培養液を接種して細胞密度を４ｘｌＯｈ個
／ｍｌとし、３０℃で４２時間２００ｒｐｎ＋で撹拌す
る。
細胞（実施例２２ｆ参照）を、通常の方法にしたがって
破壊する（例えば、欧州特許出願第１００．５６１号明
細書参照）。１．５％酢酸で処理した上澄液を遠心分離
し、そしてそれぞれ２ｍｌの透明な溶液をｒ　５ｐｅｅ
ｄ　　Ｖａｃ　Ｊ濃縮機上で高真空で乾燥する。
試料をそれぞれ１００μｌの水に溶解して、ＨＰＬＣ分
析を行う（条件は実施例２０と同じ）。それぞれの分画
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が１６．５分の
分画がトロンビン阻害活性を有する。アミノ酸組成によ
れば、この分画はデスルファトヒルジンである。　ＨＰ
ＬＣ分析によれば、この力価は約１０μｇ／リットルで
ある。培地には、ヒルジン活性は検出されない。
付帯のシグナル配列を持たないかまたは有するデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を担持する酵母株から得られる細胞
内および細胞外ヒルジン活性の収量を、表３にまとめで
ある。ヒルジン活性はトロンビン阻害法によって測定す
る。
ス＆、母ｙ汐３す［二り二叉ｌ生ｑ遺底（ａ）勤王Ｌｌ
化 第８図に示されるＰＩＩ０５のＢａｍ１ｌ　Ｉ　−Ｓａ
ｌ　Ｉフラグメントを含有する組換ファージＭ１３＋ｍ
ｐ９／贋Ｂａ１１１−Ｓａｌを、ＰＩＩ０５プロモータ
ー源として用いる（欧州特許出願第１４３．０８１号明
細書参照）。
２０μｇのファージＤＮＡＣＲＦ：？ｊ！製形）を制限
エンドヌクレアーゼＳａｌ　Ｉで消化して、約９ｋｂの
線状ＤＮＡを生成せしめる。フェノール／クロロホルム
で抽出の後、ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮ
Ａを、１０ｍＭのトリス（ｐ１１８．０）に再分散させ
て、濃度を０．５μｇ／ｍＩとする。１６／Ｊｇの５ａ
ｌｌ開裂したＤＮＡを、１００μｌの２０ｍＭトリス（
ｐＨ８，Ｏ）、１９９ｍＭ　ＮａＣ１゜１２　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｈ、１２　ｍＭ　ＣａＣｌ２および１ｍＭのＥＤＴ
Ａ中で２単位のエキソヌクレアーゼＢａ１３１（Ｂ　Ｒ
Ｌ）で消化する。３０℃で１．２．３．４．５および６
分間インキュベートした後に２μｇずつのＤＮＡを採取
して、直ちに５０μｌのフェノールおよび６０μｌのＴ
ＮＥと混合する。フェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノール沈澱した後、ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌの濃
度で１０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）に再分散する。Ｂ
ａ１３１によるエンドヌクレアーゼ切断の程度を分析す
るため、それぞれの時間に採取した０、５μｇずつのＤ
ＮＡをエキソヌクレアーゼで消化して、トリス−ホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，３）　　（９０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ
　　（ｐＨ８，３）。
９０ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴ＾〕中、１．５％ア
ガロースゲル上で分析する。
２個のＡ　ｚ　＆　６単位のｆ！ｃｏＲＩリンカ−（５
−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３）を、２５０μｌの１０ｍＭト
リス（ｐＨ８）および１ｍＭＥＤＴＡに再分散する。２
μｇのＥｃｏＲ１リンカ−を７５μｌの６０ｍＭのトリ
ス（ｐＨ７，５”）　。
１０　ｍＭ　ＭｇＣＬｚ、１５ｍＭ　ＤＤＤＴ、１０μ
ＭＡＴＰおよび３３単位のＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中でキナーゼ処理する。３
７℃で１時間後に、混合物を室温に冷却して、次いで一
２０℃で貯蔵する。
アニールした２末鎖ＥｃｏＲＩリンカ−を、それらの平
滑端により、Ｂａ１３１で処理したＤＮＡフラグメント
に連結する。０．５μｇのＢａ１３１で処理したＤＮＡ
　（実施例２３ａ参照）を、２０．ｃｚｌの６０ｍＭＫ
）リス（ｐＨ７，５）、　Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、
　　１０ｍＭ　　ＤＤＴ、４ｍＭ　　ＡＴＰおよび６０
０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で、
５０倍過剰量のキナーゼ処理したＥｃｏＲＩリンカ−と
共に室温で１６時間インキュベートする。Ｔ、ＤＮＡリ
ガーゼを不活性化した後（６５℃、１０分間）、過剰の
ＵｃｏＲＩリンカ−を、５０．ｃｇｌの容量中でＥｃｏ
ＲＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　５０単位で切断する。
ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノ
ールで沈澱させ、１０ｍＭ１−リスおよび１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ（＝ＴＥ）中に再分散する。次いで、ＤＮＡを５
単位のＢａａｌｌ　Ｉ　　（Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断し
、混合物を１．５％の低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍ
ａ）／　トリス−ホウ酸緩衝液（上記参照）に適用する
。バンドを臭化エチジウム、で染色し、３６６ｎｍの長
波長紫外線下で可視化する。約１００ｂ９〜６００ｂ９
の幅広い拡散バンドパターンをゲルから切り取り、ＤＮ
Ａを次のようにして抽出する。すなわち、アガロースの
切片を６５℃で液化し、そして５００ｍＭ　ＮａＣｌに
調整し、そして６５℃で２０分間インキエベートする。
１容のフェノール（１０ｍＭ）リス・ＨＣＩ（ｐＨ７，
５）、　１　ｍ　Ｍ　！！ＤＴＡおよび５００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１で平衡にしたもの〕を加える。水相をフェノール
で２回再抽出し、クロロホルムで１回抽出する。
ＤＮＡを２．５容の冷無水エタノールで沈澱させ、遠心
分離によって集める。ＤＮＡのベレットを冷８０％エタ
ノールで洗浄し、次いで真空で乾燥する。ＤＮＡを１０
μｌのＴＥに再分散する。
（ｃ）Ｍｌ抛飢生立至迷猪 ３μｇのＭ１３ａ＋ｐ９のＲＦを、５０μｌの容積中、
１５単位のＥｃｏＲＩ　（Ｂｉｏｌａｂｓ）および１５
単位のＢａｎ＋ＨＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い
て消化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後
、ＤＮＡを５０μｌのＴＥに再分散する。５μｌの切断
されたベクターＤＮＡ　（約２００ｎｇ）を１０ｕｌの
上記試料（実施例２３ｂに記載の方法で各種のＢａ１３
１消化物から得られるＤＮＡフラグメント）と混合して
、６０ｍＭ）リス・ＨＣｌ（ｐ）％７．５）、　６　ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１，。
１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　Ａ’ｒ’Ｐおよび２０
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在で総１２０μｌ中で
１５時間リガーゼ処理するＩＩＥＴ　コリＪＭＩＯＩ株
のコンピテント細胞の形質導入は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ発行のマニュアル［Ｍ　１３　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｓｙｓｔｅ
ｍＪに準じて行う。多数の白色プラークからのファージ
を増殖させ、制限酵素ＨｃｏＲ１およびＢａｗｌ　Ｉで
切断することによって、ＤＮＡインサートの大きさを分
析する。
配列決定は、上記のマニュアルに記載のようにＳａｎｇ
ｅｒらのジデオキシＤＮＡ配列決定方式［１’ｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、米国、第７４巻、
５４６３頁（１９７７年）］を用いて行う。欠失末端部
を、以下に示す。
以下余白 クローン　ｐＨ０５配列の最後のヌクレオチドの位置（
第８図参照） Ａ　　　　　　　　　　　−５０２ Ｂ　　　　　　　　　　　−４７１ Ｃ−４２２ Ｄ　　　　　　　　　　　−４００ Ｅ　　　　　　　　　　　−３９２ Ｆ　　　　　　　　　　　−３６９ Ｇ　　　　　　　　　　　−３５０ Ｈ−３２８ Ｉ　　　　　　　　　　　−３００ Ｋ　　　　　　　　　　　−２８３ Ｌ　　　　　　　　　　　−２５５ Ｍ　　　　　　　　　　　−２２６ Ｎ　　　　　　　　　　　−２１１ ０−１８７ Ｐ　　　　　　　　　　　−１１１ −８８ −５７ −３３ （ｅ）　Ｓａｎ　ｅｒ　　ＩＬ−’　による［１ａ１３
１　　−ｒのＭ１３ｍｐ９　ｐＨ０５Ｂａｍ−５ａｌを
Ｂａ＋＋＋ｔｌ　１によって切断することを除いて、同
様なセットのＢａ１３１欠失を、前記（ａ）〜（ｃ）に
記載したのと同様に行う。
Ｂａ１３１で消化された分子を、ＥｃｏＲＩおよび５ａ
ｌｔによって切断し、生成したフラグメントをＥｃｏＲ
１および５ａｉｌで消化したＭ１３ｍｐ９中にクローン
化する。欠失末端点を、以下に示す。
ｐＨ０５配列の最後のヌクレオチドの位Ａ’　　　　　
　　　　　　−２４ Ｂ’　　　　　　　　　　　−３５ Ｃ’　　　　　　　　　　　−４１ Ｄ・　　　　　　　　　　−４８ Ｅ’　　　　　　　　　　　−７４ Ｆ・　　　　　　　　　　−８９ Ｇ’　　　　　　　　　　　−９３ Ｈ〆　　　　　　　　　　−９７ １’　　　　　　　　　　　−１２４ に’　　　　　　　　　　　　　　−１６２Ｌ’　　　
　　　　　　　　　　　　−１７４Ｍ’　　　　　　　
　　　　　　　　−２６２Ｎ’　　　　　　　　　　　
　　　　　−２７７０’　　　　　　　　　　　　　　
　−３０６Ｐ’　　　　　　　　　　　　　　　−３３
２Ｑ’　　　　　　　　　　　　　　　−３４６Ｒ’　
　　　　　　　　　　　　　　−３６１Ｓ　’　　　　
　　　　　　　　　　　−３８２Ｔ′−３９３ （ｄ）に記載のＢａ１３１欠失セツトはＨｃｏＲ１で終
わる［左腕Ｊ　ＰＩＩ０５プロモーターフラグメントを
生成し、（０）に記載のＢａ１３１欠失セフ　１−はＨ
ｃｏＲＩで終わる「右腕Ｊ　ＰＩＩ０５プロモーターフ
ラグメントを生成する。各種位置の「左腕」と「右腕」
を組み合わせることにより、欠失したＤＮＡの位置にＥ
ｃｏＲＩリンカ−セグメントを含む内部欠失が生成され
る。それぞれの内部欠失は、制限エンドヌクレアーゼＥ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（左腕）、またはｔ！ｃｏＲ
Ｉおよび５ａｌＩ（右腕）によってＭ１３ｍｐ９から「
左腕」および「右腕」を切断し、（ｂ）に記載したのと
同様にソフトアガロ゛−ス電気泳動法により対応するフ
ラグメントを単離することによって構成される。等モル
量の「左腕」、「右腕」、および２００ＢｇのＢａｍ１
ｌ　ＩおよびＳａｔ　Ｉ消化したＭ１３ｍρ９ベクター
ＤＮＡを（ｃ）に記載したのと同様に連結する。Ｅ、コ
リＪＭＩＯＩに形質導入した後、白色プラクを採取して
、ＲＦを生成させて、制限分析（ＢａｓＨＩ、Ｓａｌ　
Ｉ　ｓ　ｕｃｏＲＩ　）によって分析する。
次の腕を組み合わせて、（ヌクレオチドの番号に対する
、第８図参照）特異的内部欠失を形成する。
Ａ　　　　　Ｔ’　　　△７　−５’０１　ｔｏ　−３
９４１０８Ｂ　　　　　Ｔ’　　　△８　−４７０　ｔ
ｏ　−３９４７７ＣＴ’　　　△９　−４２１　ｔｏ　
−３９４２８Ｄ　　　　　Ｓ’　　　△１０　−３９９
　ｔｏ　−３８３１７Ｅ　　　　　Ｒ’　　　△１１　
−３９１　ｔｏ　−３６２３０Ｆ　　　　　　　Ｑ’　
　　　△１２　　−３６８　　ｔｏ　　−３４７２２Ｃ
Ｐ’　　　　へ１３　　−３４９　　ｔｏ　−３３３１
７ト■　　　　　　　　０　′　　　　　△１４　　　
−３２７　　ｔｏ　　−３０７２１１Ｎ’　　　　△１
５　　−２９９　　ｔｏ　−２７８２２Ｋ　　　　　　
　Ｍ’　　　　△１６　　−２８２　　ｔｏ　−２６３
２０Ｌ　　　　　　　Ｌ’　　　　へ１７　　−２５４
　　ｔｏ　−１７５８０Ｍ　　　　　　　Ｌ’　　　　
△１８　　−２２５　　ｔｏ　　−１７５５１Ｎ　　　
　　　　Ｌ’　　　　Δ１９　　−２１０　ｔｏ　−１
７５３６ＯＬ’　　　　△２０　　−１８６　　ｔｏ　
−１７５１２０Ｋ’　　　　△２１　　−１８６　　ｔ
ｏ　−１６３２４０１’　　　　△２２　　−１８６　
　ｔｏ　−１２５６２０Ｈ’　　　　Δ２３　　−１８
６　　ｔｏ　−９８８９Ｐ　　　　　　　Ｈ’　　　　
△２４　　−１１０　　ｔｏ　−９８１３Ｐ　　　　　
　　Ｃ’　　　　△２５　　−１１０　　ｔｏ　−９４
１７Ｐ　　　　　　　Ｆ’　　　　△２６　　−１１０
　　ｔｏ　　−９０２１Ｑ　　　　　　　Ｅ’　　　　
△２７　　−８７　　ｔｏ　−７５１３ＲＤ’　　　　
△２Ｂ　　　−５６ｔｏ　−４９８ＲＣ’　　　　へ２
９　　−５６　　ｔｏ　−４２１５ＲＢ’　　　　△３
０　　−５６　　ｔｏ　−３６２１（ｇ）ＰＨ０５プロ
モー　の　　　　　の　　　７野生型のＰＩＩ０５　Ｒ
ａｔｓ−３ａｌフラグメントを欠失した対応物に置き換
えることによって、実施例２３（ｆ）に記載の各種欠失
を、プラスミドｐＪＤ［１２０７／ＰＨ０５［Ｒ，Ｈａ
ｇｕｅｎａｕｅｒ−Ｔｓａｐｉｓ及びＡ、ｌ１ｉｎｎｅ
ｎのハｎ匹凰り堕り釦旦虱肛」ｎ旦■、第４巻、２６６
８〜１６７５頁（１９８４年）］中にクローン化する。
酵母Ｓ、セレビシェＡ１１２１６株を形質転換した後（
欧州特許出願第１４３．０８１号明細書参照）、酸性ホ
スファターゼ活性をＴｏｈ　−ｅらにより記載された方
法［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、第１１３巻、７２
７頁、（１９７３年）］によって決定する。欠失△１１
および△１２は、ＰＩ（０５活性の約１０分の１への低
下を示し、ＰＨ０５発現に本質的な上流領域（「上流活
性化部位Ｊ、ＵＡＳ）を定義してる。同様な低下効果は
、欠失△１７（約５分の１へ低下）およびＴＡＴＡボッ
クス欠失△欠失−２３〜（約３０分の１へ低下）で観察
される。総てのその他の欠失は、はぼ野生株の水準の活
性を示す。これらの結果は、Ｐ　Ｈ０５の発現に本質的
な情報の３種類の部分は次の位置に配置されていること
を示唆する。
１、　−３４９〜−３８３の位置（ＵＡＳＩ）、２、　
−２２５〜−２６３の位置（ＵＡＳ２）、３、−８７〜
−１２５の位置（ＴＡＴＡボックス）。
Ｐ１１０５（７）ＵＡＳＩまたはＵＡＳ２またはＵＡＳ
ＩおよびＵＡＳ２を含むＤＮＡフラグメントは、組換フ
ァージＭ１３＋＋＋ｐ９／　ＰＩＩ０５　Ｂａｍ　−Ｓ
ａ　ｌ　（上記参照）から適当な制限エンドヌクレアー
ゼで切断することによって生成させることができる。　
ＵＡＳＩは、次の式：を有する２６８ｂｐ　Ｂａｍ１ｌ
　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメントに含まれる。
ＵＡＳ２は、次の式： を有する１００ｂｐ　Ｃ１ａ　Ｔ　−ＢｓｔＥ　Ｉｆフ
ラグメントに含まれ、そして［ＩＡＳｌおよびＵＡＳ２
は共に、次の式：を有する３６８ｂｐ　Ｂａｎ＋１ＩＩ
−ＢｓｔＥ　ＩＩ７ラグメントニ存在する。
実施例２３は、ＰＨ０５遺伝子の位置−３６５付近の領
域［０ＡＳＬ（Ｐ１１０５）］　、および位置−１８０
付近のもう一つの領域［ＵＡＳ２　（ＰＨ０５）　］を
、調節機能を有するＵＡＳの可能な候補とする。ＵＡＳ
Ｉ　（Ｐ）１０５）は、２６８ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｃ
１ａ　Ｉフラグメントに含まれ、他方ＵＡＳＩ　（ｐＨ
的）およびＵＡＳ２　（皿部）は共に３６８ｂｐＢａｍ
ＨＩ−Ｂｓｔ［Ｉ［フラグメントに含まれる。これらの
２種類のフラグメントはそれぞれ、ＴＡＴＡボックスお
よびＧＡＰＤｌｌの転写開始部位を含む２種類の異なる
ＧＡＰＤ■下流のプロモーター要素に融合する。
（ａ）　　母゛　云　−イフ゛−リーの野生型サツカロ
ミセス・セレビシェ−３２８８Ｃ株から得られる総量が
３０ｇｇの高分子量酵母ＤＮＡ　［Ｍ、Ｖ、０１ｓｅｎ
ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、第１３２巻、３８７頁
（１９７９年）］を、２単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ｌ１ｔｏｌａｂｓ）を用いて
、供給業者が勧める方法に従って、２５０μｌのＥｃｏ
ＲＩ　ｕチル化緩衝液中で３７℃で３０分間インキュベ
ートする。
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、５００μｌの２５ｍＭ
）リス・ＨＣ１（ｐＨ８，５）、　２．５　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｚ（ＢｃｏＲビ緩衝液）　　［Ｈ，Ｍｅｙｅｒ、　
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、第９０巻、３４１頁（１９７９
年）］に再分散し、そしてＥｃｏＲＴ　（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）で消化して、ＤＮＡフラグメントの分布が３
０〜５Ｑｋｂの範囲に最大値を有するようにする（λＤ
ＮＡのＸｈｏ　１消化は適当な３３ｋｂおよび１７ｋｂ
マーカーを提供する）。
ＥｃｏＲビ条件下で消化される酵母ＤＮＡはシェークロ
ース勾配〔５〜２０％シュークロース７１０ｍＭ）リス
−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）および１ｍＭＵＤＴＡ　）
で、５−４０ローター中で３８．００Ｏｒ　ｐ　ｍにて
６時間サイズ分画する。０．４　ｍ　Ｉずつの３０個の
分画を、勾配の上部から集める。分画１６は、大きさが
３０〜４ＱｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。
この分画のＤＮＡ　（３μｇ）をエタノールで沈澱させ
、）ＥｃｏＲＩで線状化された１μｇのコスミドベクタ
ーｐＹｃｌ　［Ｂ、ＩＩｏｈｎら１．ｒＧｅｎｅｔｉｃ
　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｔｎ　　ｌ、第２巻、１６９頁、ニ
ューヨーク、１９８０年］に、合計容１ｆｔ１５μｌ中
で、１５℃で１６時間連結させる。連結は、３０Ｏ単位
のＴ、ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）を用いて、業者により記載されている緩衝液
系を使用して行う。ＤＮＡを生体外でバクテリオファー
ジλ［８，１ｌｏｈｎ　、　　ｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｊ　、第６８巻、２９９頁、ニ
ューヨーク、１９７９年］にパッケージし、そして集成
されたファージを用いてＥ、３１月）［１１０１株を形
質導入する（工に−、工１＋−、旦且−１肛土−１皿荊
）。
形質導入の効率は、１８ｇのｐＹｃ１ベクター当たり約
５０００個のアンピシリン耐性コロニーである。
３０００個のａｅ＊ｐ’コロニーを採取し、そして１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地［１０ｇの
Ｂａｃｔｏ　−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）　、　
５　ｇのＢａｃ　ｔ。
Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）およびＬｏ
ｇのＮａＣ１１中でマイクロタイター・ディッシエのウ
ェルでそれぞれ増殖させる。
（ｂ　）ＧＡＰＤｌｌ　’−〇゛ 上記遺伝子ライブラリーを、次の構造：５　’　−ＧＣ
ＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣ−３’を有する
合成オリゴヌクレオチド［ホスホトリエステル法を用い
て調製：　Ｋ、　Ｉｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃｌ、Ｔｒａ
ｖ。
ｐｈｉＩｌｌ、　、Ｐａ　５−Ｂａｓ　、　９Ｂ　、　
５３７（１９７９）　］によりスクリーニングする。１
０ｇｇのオリゴヌクレオチドを、Ｍａｎｉａｔｉｓらに
より記載された方法［ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ
ｉｎ　　Ｊ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏ
ｒＬａｂ、　、１９８２年、１２５頁］により、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と共
に１０μｍの７−”Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ　（３０００Ｃｉ
／　ｍＭ、１０１Ｊｃｉ／ｐ　ｌ　　Ａａ＋ｅｒｓｈａ
ｍ）を用いて全容積５０μｌ中ででキナーゼ処理をする
。コロニーハイブリダイゼーションは、上記文献（３１
２真）に記載の方法で行う。
Ｋｏｄａｋ　Ｋ　−５Ｘ線フィルムを用いるオートラジ
オグラフィにより、陽性クローンを検出する。プラスミ
ドＤＮＡを単離して、ＧＡＰＤＨをコードする２１００
ｂｐ　　１ｌｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントを含むハイブ
リッドクローンを得る［Ｊ、Ｐ、　Ｈｏ１ｌａｎｄら、
Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅａｐ、　　益［，９８３９（１９７９）　］　、
クローン化されたＤＮＡが真性であることは、２本ｌＤ
ＮＡについてＧ、　Ｆ、’ｌｌｏｎｇ　［Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｉｉｃｅ　Ｒｅ　ｏｒｔｓ　　±、２４３（１９８１
）　］により記載されたジデオキシ配列決定法との組み
合わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるＤＮ
Ａ配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化
ＧＡＰＤＨ遺伝子（第９図参照）は、１ｌｏｌｌａｎｄ
らが報告してい薊ＬＬ１４９１と同じ配列を有する［Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　　２５５　、２５９６（
１９８０）　］。
（ｃ）　　ＧＡＰＤ１１′、ブロモ−−、の言　１ＧＡ
ＰＤＨ遺伝子のＡＴＧからの位置−２７〜−６７５を含
む６４９ｂｐ　　Ｔａｑ　Ｉフラグメント（第９図参照
）を、Ｔａｑ　Ｉ　（Ｎｅｗ　ｌ！ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）で上記ハイブリッドプラスミドを消化し、
ＤＮＡフラグメントを１、２％ソフト・アガロースゲル
上で分離し、そして熱フェノールによりＤＮＡを抽出す
ることによりｕＬ離する（実施例２３参照）。Ｔａｑ　
Ｉフラグメントのクローン化はｐＨＲ３２２のＣ１ａ　
Ｉ部位中に為される。すなわち、ｌμｇのｐＨＲ３２２
を３単位のＣ１ａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）を用いて、業者により記載された方法で
切断する。３００ｇのフェノール処理されそして切断さ
れたベクターを２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て、約３ｏｏｎｇのインサートＤ　Ｎ　Ａ　（６４９ｂ
ｐ　Ｔａｑブラグメント）に全容積２０μｌ中で連結す
る１１Ｅｅ　コリＩＩ　８１０１を形質転換してアンピ
シリン耐性にし１、プラスミドＤＮＡを調製し、そして
制限分析によって分析する。［Ｔａｑ　Ｉ　、　　叶ａ
ｌ］。Ｔａｑ　Ｉフラグメントの方向は、制限エンドヌ
クレアーゼＤｒａ　ＩをプラスミドのＢａｍ１ｌ　１部
位と組み合わせて用いることにより確立され、ｐＨＲ３
２２のｌｌ１ｎｄｌｌ［部位の近くに位置−６７５の部
位を有するａｑｌプラスミドを選択する。　ｐＢＲ３２
２／ＧＡＰＤＨと命名されるこのプラスミドを、Ｂａｍ
１ｌ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｂｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
）を用いて線状化し、そしてＢａ１３１を用いる消化を
、ＢｇｌＩＩリンカ−（５−ＣＡＧＡＴＣＴＧ　−３、
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｅｏｌａｂｓ）を用いるこ
とを除き、実施例２３と同様にして行い、そして消化さ
れたプラスミドを５μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で、全容ｆ
ｆ１２０μｌ中で直接環状化する。
Ｂａ１３１で短縮されたＴａｑ　Ｉフラグメントの大き
さを、（Ｂｇｌ　Ｕおよび旧ｎｄｌ［を用いる）制限分
析により決定する。２つのクローンが選択され、これら
はそれぞれＡＴＣ上流からＧＡＰＤＨプロモータへと２
００ｂｐおよび２６５１）ｂ伸びるＤＮＡフラグメント
を含む。これらのフラグメントは、約−１４０ｂｐに仮
定のＴＡＴＡボックスを有する。これらのクローンはな
お、ＤＮＡのｐ［１Ｒ３２２由来部分に複製開始点を含
み、それぞれｐＧＡＰＤＨ−ＦおよびｐＧＡＰＤＨ−Ｅ
と命名される。
■）皿践り型車 −２７の位置のＴａｑ　Ｉ部位からＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ
遺伝子のＡＴＣに直接隣接する位置までＧＡＰＤＨプロ
モーター要素を延長するため、次の構造を有する２個の
合成相補的オリゴヌクレオチドを合成する。
５’ＣＧＡＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧ
　　　３’３’　　　　　ＴＴＡＴＴＴＧＴＧＴＧＴＡ
ＴＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡ＾　　　５　′これらのオリゴ
ヌクレオチドは、位置−２６から位置−５への純粋なＧ
ＡＰＤＨプロモータを提供し、末端ＵｃｏＲ１部位を生
じさせる。２μｇの２種類のＢａ１３１単離体（実施例
２４ｃから）（プラスミドｐＧＡＰＤ１１−１！および
−Ｆ）を６単位のＴａｑ　Ｉを用いて５０ｕｌ中で消化
し、生成する混合物をフェノール抽出し、エタノール沈
澱し、そして１０μｌの水に再分散する０合成オリゴヌ
クレオチドを、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ　　（ｐＨ７，
５）、　１０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ。
５０　ｍ　Ｍ　ＮａＣ１を含有するｉｏｏμｌ溶液中で
各単鎖２μｌを混合し、９０℃で３分間加熱し、溶液を
徐々に室温にまで冷却することにより（約３時間以内）
アニールする。Ｔａｑｌ消化された各プラスミドｌμｇ
を約２０倍モル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレ
オチドと、８００単位の７４ＤＮＡリガーゼを用いて、
２０μｌの容積中で１８時間混合する。全混合物を３単
位のＢｇｌ　ＩＩ　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）で消化し、ＤＮＡフラグメントを１．５％ソフ
トアガロースゲル上で分離する。約２００ｂｐおよび２
６５ｂｐのＢｇｌ　Ｉｆ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを
ゲルから切り取り、抽出し、そしてエタノール沈澱させ
る。
プラスミドｐＧＡＰＤＩＩ　−ｆ！をＢｇｌ　Ｉｆおよ
びＨｃｏＲＩを用いて消化し、大きな（約３．５ｋｂ）
フラグメントを単離する。このフラグメントをベクター
として用いて、上記のような連結、形質転換およびプラ
スミド単離条件を用いながら、前記２６５ｂｐおよび２
００ｂｐのＢｇｌ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを
クローン化する。生成したプラスミドは、ｐＧＡＰＤＩ
ｌ　−ＥＬおよびｐＧＡＰＤＩＩ　−ＰＬと命名される
。プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＨＬおよびｐＧＡＰＤｌｌ
二ＦＬ中のクローン化Ｂｇｌ　Ｕ　−ＥｃｏＲＩフラグ
メントのＤＮＡ配列を第１１図に示す。フラグメントの
正確な大きさはそれぞれ５ｓｂｐおよび２０１ｂｐであ
る。
以下余白 ■）貼５ｔ（ｐＨ四１１１！索 ３μｇのプラスミドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願第１００
．５６１号明細書参照）を６単位のＣ１ａ　Ｉ　（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化する
。３′の欠損端を、Ｍａｎｉａｔｉｓ　（上記）の方法
に従い、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ−
フラグメント（Ｂｅｔｈｅｄｓａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてフィルインする。
８ｇｌｌｌリンカ−（５’　−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３′
）を、例２３に記載したのと同様に付加する。
ＤＮＡをＳａｌ　ＩおよびＢｇｌＩ［（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で消化し、１％ソフトアガロ
ースゲル上で処理する。５４８ｂｐフラグメントをゲル
から切り取り、フェノール抽出して、上記のようにエタ
ノール沈澱する。
■）デスルフ　トヒルジン　コー′　るＤＮＡプラスミ
ドｐＪＤＢ２０７　／贋（Ｅｃｏ）　−１１１Ｈの造成
（第１２図参照） Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐ１１０５）−ＧＡＰＤＨハイブリッド
プロモーター要素をＰＨ０５シグナル配列を含むデスル
ファトヒルジンのコード領域に好都合に接続するため（
プラスミドｐＪＤＢ２０？　／　ＰＨ０５−ＩＩ　ＩＲ
のように）、ＢｃｏＲＩ制限部位を、ｍ　ＲＮ　Ａ開始
部位とコード領域のＡＴＧとの間の５′非翻訳領域に導
入する。
１５μｇのプラスミドｐＪＤＵ２０７　／　ＰＨ０５−
ＨＩＲ（実施例１６ｄ参照）を、制限エンドヌクレアー
ゼロｒａｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化する。生成
する４個のフラグメントを０．８％アガロースゲル上ト
リス・ホウ酸・ｆ！ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中で分
離する。ゲルから４．２　ｋ　ｂのＤＮＡフラグメント
を回収し、電気溶出し、エタノール沈澱する。ＤＮＡを
水に再分散して、０．６ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
次の式： ％式％ の２種類の合成オリゴヌクレオチド（２，３μｇおよび
２．９ｐｇ）をそれぞれ２０μｌの６０ｍＭトリス（ｐ
ｆ１７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、５ｍＭ　　ＤＴＴ
。
０．５ｍＭ　　ＡＴＰおよび２０単位のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中でキナーゼ
処理をする。３７℃で４５分後に、これらの反応混合物
を一緒にし、７５℃で１０分間加熱し、そして室温に放
冷する。アニールしたオリゴヌクレオチドリンカーを一
２０℃、で貯蔵する。
６．５μｇ（２，３ｐモル）の４．２ｋｂＤｒａｌＤＮ
Ａフラグメントを７０倍過剰量のキナーゼ処理してアニ
ーリングしたオリゴヌクレオチドリンカーと共に５０μ
ｌの６０ｍＭ）リス（ｐｌ［７，５＞　。
１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　．５ｍＭ　　ＤＴＴ、３．５
ｍＭＡＴＰおよび８ａ０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）中でインキユベートする。Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを８５℃で１０分間不活性化した後、過剰のリン
カ−を１０　ｍＭ　ＨＤＴＡ、　３００ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐｉ（６，０）および０．５容のイソプロパツー
ルの存在でＤＮＡを沈澱させることにより除去する。Ｄ
ＮＡをＩ！ｃｏＲＩと１Ｉｉｎｄｌｌ［とで消化する。
生成するフラグメントを１％アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ａｌｌ　８．３　）中で分離
する。
６４３ｂｐフラグメントを、電気溶出およびエタノール
沈澱によりゲルから回収する。ＤＮＡを再分散させて、
濃度を０．１ｐＭ／ｕｌにする。ｆ！ｃｏＲＩ　−Ｈｌ
ｎｄｌ［［フラグメントは鷹シグナル配列、デスルファ
トヒルジンのコード配列およびＰＨ０５転写ターミーネ
ーターを含む。
５３４ｂｐ　ＰＨ１０５プロモーターフラグメントをプ
ラスミドｐ３１／Ｒ（欧州特許出願第１００，５６１号
明細書）から単離する。
１０μｇのｐ３１／Ｒを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩとＢａｍ１ｌ　Ｉとで消化する。生成する３個のフ
ラグメントを０．６％の低融点アガロースゲル上トリス
−ホウ酸ＢＤＴ＾緩衝液（ｐＨ８，３）中で分離する。
５３４ｂｐ　　［ｌａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメン
トを分離する。
これはｍＲＮＡ開始部位を含むＰＨ０５プロモーターを
含有する。
ベクターフラグメントをプラスミドｐＪＤＢ２０？／Ｐ
１１０５−　ＩＩ　ＩＲから単離する（実施例１６ｄ）
。このプラスミド６μｇをＢａａＨＩ　＆１ＩｉｎｄＩ
［［とで消化する。
大きな６．５　ｋ　ｂのＢａｗｌ　Ｉ−旧ｎｄｎｌフラ
グメントを、０．６５低融点アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−ＨＤＴＡＩＩ衝液（ｐＨ８，３）中で小さなフ
ラグメントから分離する。
適切な接着末端を有する上記の３個のＤＮＡフラグメン
トを以下の反応で連結する。０．２ｐモル（７０ｎ　ｇ
）の５３４ｂｐ　　Ｂａａ＋ｌＩ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　
ＰＨ０５プロモーターフラグメント、０．２ｐモル（８
５ｎｇ）の６４３ｂｐ　　ＥｃｏＲｌ−旧ｎｄｎｌフラ
グメント、０．２ｐモル（８５ｎｇ）の６４３ｂｐ　　
ＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｌ［［フラグメント（ヒルジンコー
ド配列）、およヒ０．１ｐモル（０，４μｇ）の６．５
　ｋ　ｂ　　［ｌａｍｌｌ　Ｉ　−Ｈｌｎｄｌｌ［ベク
ターフラグメントを、ｌＯμｌの６０ｍＭトリス（ｐＨ
７，５）　、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ　、　５ｍＭ　Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび４００単位のＴ、ＤＮＡ
リガーゼ中で１５℃で６時間連結する。連結混合物１μ
ｌを１００μｌのカルシウム処理した形質転換コンピテ
ントＥ・コリ■１０１細胞に加える。
１２個の形質転換したａｒａｐ”コロニーをそれぞれ１
００μｇ　／　ｍ　１アンピシリンを含むＬＢ培地で増
殖させる。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅｓらの方法に
より調製し［Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　１１４．
（１９８１）１９３　］、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制
限酵素により分析する。予想される制限フラグメントを
有するクローンを単離し、そしてｐＪＤＩ！２０７／　
ＰＩＩ０５　（Ｅｃｏ）　−ＨＩＲと命名する。
１５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＩ（０５（Ｅ
ｃｏ）（−１１１１（貧施例２４ｄｍ参照）を、Ｅｃｏ
Ｒ１と旧ｎｄｎｌとで消化する。ＤＮＡフラグメントを
１％アガロースゲル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液
（ｐＨ８，３）中で分離する。　　６４３ｂｐフラグメ
ントをゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノール
で沈澱される。ＤＮＡを水に再分散し、０．１μＭ／μ
ｌの濃度とする。
６μｇのプラスミドｐＨＤＢ２０７／ＰＩＩ０５−　Ｈ
ＩＲを、制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩ［Ｉと５ａｌ
ｌとで完全に消化する。５．３　ｋ　ｂフラグメント（
ベクタ一部分）をソフトアガロースゲル電気泳動、フェ
ノール抽出、およびエタノール沈澱により単離する。
ベクターＤＮＡフラグメントを水に再分散し、０．０５
ｐモル／μｌの濃度にする。
１０８ｇのプラスミドｐＧＡｒ’［ｌｌｌ　−ＨＬ　（
実施例２４ｄ■参照）をＢｇＩ　ｎとＦｉｃｏＲＩとで
消化する。　　２６６ｂｇ［１μｌ　ＩＩ　−Ｆｉｃｏ
ＲＩフラグメントを１．２％アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−ＩＩ！ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中で分離し
、ゲルから電気溶出し、そしてエタノールで沈澱させる
。ＤＮＡを水に再分散され、０．３μ９モル／μＩの濃
度にする。
０、３　ｐ　モル（７）ＵＡＳＩ　（ＰＩＩ０５）　　
（実施例２４ｄＩ［）を含んで成る５４８ｂｐ　Ｓａｌ
　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｕフラグメント、０．３μモルのｐＧ
Ａｌ’ＤＩ＋　−８Ｌの２６６ｂｐ　　Ｂｇｌ　ＩＩ　
−ＨｃｏＲＩフラグメント、０．３ｐモルのｐＪＤＢ２
０？　／ＰＨ０５（ＥｃＯ）−ＨＩＲの６４３ｂｐ　　
ＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄＩ［Ｉフラグメント、および
０．ｊ！ｐモルの５．３ｋｂＳａｌｌ　−１１ｉｎｄｌ
［Ｉベクターフラグメントを、２０μｌの５０ｍＭ１−
リス（ｐＨ７，５）、　１０　ｍＭ　　ＭｇＣ１ｇ、　
５　ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび４００単位の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で１５℃で６
時間連結させる。連結混合物１μｍおよび３μｌを１０
０μｌのカルシウム処理したＥ、コリ１１８１０１細胞
に加える。ａｔｌｐ”コロニーからのプラスミドの単離
および５ａｉｌ、Ｂｇｌ　Ｉ　、ＥｃｏＲＩおよびｔｌ
ｉｎｄｕ［を用いる制限分析を、上記のように行う（実
施例２４ｄ■参照）。１個の陽性クローンを選択し、ｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＡＰＩＩ！Ｌ−ＨＩＲ（ＵＡＳＩ）と
命名する。
同様な造成を、ｐＧＡＰＤ！Ｉ　−ＰＬから分離される
２０１ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｕ−ＢｃｏＲＩフラグメントを用
いて行う。１個の選択されたプラスミドをｐＪＤＢ２０
７／ＰＡＰＦＬ　−旧Ｒ（ＵＡＳＩ）　と命名する。。
３μｇずつのプラスミドｐＨＤＢ２０？／ＦＡＩ’ＥＬ
　−１１１Ｒ（ＵＡＳＩ）およびｐＪＤＢ２０？　／　
ＰＡＰＦＬ−１１［Ｒ（［ＩＡＳｌ）を、それぞれＢｇ
ｌＩＩで消化する。フェノール抽出およびエタノール沈
澱の後、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法に従い、ＤＮＡの３
′欠損末端を、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎ
ｏ−フラグメント、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）との反応によりフィルイ
ンする（上記）。酵素を７０℃で１０分間不活性化させ
る。ＤＮＡを更にＳａｌ　Ｉで消化して、大きな７．２
ｋｂフラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フ
ェノール抽出およびエタノール沈澱により単離する。各
フラグメントを水に再分散させ、０．０５ｐモル／μｌ
の濃度にする。フラグメントはヒルジンコード領域、は
とんどのベクター配列およびｐＧＡＰＤＩＩ　−ＥＬま
たはｐＧＡＰＤＩＩ　−ＰＬから単離される２種類の異
なるＧ　Ａ　Ｐ　Ｄ　１１プロモーター要素を含む。
プラスミドｐ３１／Ｙ（欧州特許出願第１００．５６１
号明細書）を、上記のようにＢｓｔ［！ＩＩで消化し、
Ｅ。
コリＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏ−フラグメント）
と共にインキエベートし、そして５ａｉｌで切断する。
６４９ｂｐフラグメントをソフトアガロースゲル上で分
離し、フェノール抽出およびエタノール沈澱により回収
する。
ＵＡＳＩ−ＵＡＳ２　（展）プロモーター要素を含んで
成るｐ３１／Ｙの６４９ｂｐフラグメント０．３ｐモル
、および０．１５ｐモルの７．２　ｋ　ｂフラグメント
の一方を、上記のように連結して、Ｅ・コリｌＩＢ’１
０１中に形質転換する。プラスミドをａｍｐ”コロニー
から調製し、そして制限酵素により分析する。単一クロ
ーンを選択し、それらのプラスミドＤＮＡをｐＪＤＢ２
０？　／ＰＡＰＥＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）お
よびｐＪＤＢ２０７　／ＰＡＰＦＬ　−１１１Ｒ（ＵＡ
Ｓ１＋ＵＡＳ２）　と命名する。
（実施例２４ｄｌに記載のように）異なる長さの２個の
ＧＡＰＤＩＩプロモーター要素をｐＨ０５シグナル配列
を含むデスルファトヒルジン蛋白質コードｐＩ　域に連
結する。
２個の要素（２６６ｂｐおよび２０１ｂｐ）は、それぞ
れＧＡＰＤＩＩ　　ＴＡＴ＾ボックス、ｍＲＮＡ開始部
位およびＡＴに冨む５′非翻訳領域を含んで成る。これ
らの要素のヌクレオチド配列を、第１θ図に示す。
これらの要素の３′末端はいずれも、ＧＡＰＤＩＩ遺伝
子のＡＴＧ　（これにＥｃｏＲＩ認識部位（実施例２４
ｄＩにおいて導入されるオリゴヌクレオチドリンカー参
照）が続く）からの位！−５にあり、５′末端はそれぞ
れＡＴＧから位！−１９８および−２６３にありこれら
の位置でＢｇｌ　ＩＩリンカ−が付加されている。
Ｂａｌ　ＩＩ　　ＥｃｏＲＩプロモーターフラグメント
を、Ｐ１１０５シグナル配列およびデスルファトヒルジ
ンをコードする配列を有するＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌ
ｌｌフラグメント、およびＩｔ　ｉｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ
１ｌ　Ｉベクターフラグメントに連結する。
６μｇのプラスミドｐＨＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＨＩＲ
を制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩ［［およびＢａｍＨ
Ｉで完全に消化される。大きな６．５　ｋ　ｂフラグメ
ント（ベクタ一部）を０．８％アガロースゲル上トリス
−ホウ酸−ＥＤＴ＾緩衝液（ｐＨ８，３）中で分離し、
ゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノ
ール沈澱する。ベクターＤＮＡフラグメントを水に再分
散して、０．０５ｐモル／μｌの濃度にする。
０．３ｐモルのｐＧＡＰＤｉｌ　−ＥＬの２６６ｂｐ　
　Ｂｇｌ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント（実施例２
４ｄｌＶ）　、０．３　ｐモルのｐＪＤＢ２０７／　Ｐ
Ｈ０５（Ｅｃｏ）　−１１１Ｒの６４３ｂｐ　ＥｃｏＲ
ｌ−１１ｉｎｄＩ［［フラグメント（実施例２４ｄｌ［
［）、およびｏ、ｔｐｐモル６．５　ｋ　ｂ　　１ｌｉ
ｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ１ｌ　Ｉベクターフラグメントを、
１０μｌの６０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　
ＭｇＣ１ｇ、５ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰおよび４
θ０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で
１５℃で６時間連結させる。連結混合物１μｌを、１０
０μｌのカルシウム処理したＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞に
加える。　ａｍｐＲコロニーからのプロモーターの単離
およびＥｃｏｌ目を用いる制限分析を、実施例２４６ｍ
に記載したのと同様に行う。
一つの陽性クローンを選択して、そのプラスミドＤＮＡ
をｐＨＤＢ２０７　／ＧＡＰＩ！Ｌ−１１１Ｒと称する
。
同様な造成をｐＧＡＰＤＩＩ　−ＰＬから単離した２０
１ｂｐＢｇｌ　Ｎ　−［ＥｃｏＲＩフラグメントを用い
て行う。一つの選択されたクローンのプラスミドＤＮＡ
をｐＪ［１Ｂ２０？　／ＧＡＰＦＬ−旧Ｒと呼ぶ。
以下の造成は、直列（タンデム）の頭と尾の配置で重複
されたＤＮＡフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、（それぞれ実施例２４および２５に記載の
ように）　ＧＡＰＤＨプロモーターまたはハイブリッド
Ｉ’１１０５−　ＧＡＰＤＩＩプロモーター、皿邦シグ
ナル配列、デスルファトヒルジンのコード配列、および
Ｐ１１０５転写ターナミネーターからなる。
７　μｇ　（７）フラスミ）’ｐ）ＩＤ［１２０７／Ｇ
ＡＰＥＬ−１１１Ｒを、制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄ
ｌｌｌで消化する。３′欠損末端を、Ｍａｎｉａｔｉｓ
　（上記）の方法によりＥ。
コリＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｘｌｅｎｏ−フラグメン
ト、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）との反応によりフィルインする。１．８５
μｇのＳａｌ　Ｉリンカ−５′−＋ＩＧＧＴＣＧＡＣＣ
−３’　（Ｂｉｏｌａｂｓ）を、５０μｌの６０ｍＭ）
リス（ｐＨ７，５）、　１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ　、　５
　ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　ＡＴＰおよび５０単
位のＴ、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎ
ｇｅｒ）中でキナーゼ処理する。３７℃で４５分間処理
の後、混合物を７５℃で１０分間加熱し、室温に放冷す
る。７μｇ（１，５ｐモル）の平滑末端（上記）に変換
された１ｌｉｎｄｌｌｒ部位を有する線状化したブラス
ミ）’ｐＪＤＢ　ｐＪＤＢ２０？／ＧＡＰＯＬ−１！１
Ｒを、８０倍過剰量のキナーゼ処理されそしてアニーリ
ルされたＳａｌリンカ−と共に、３０μｍの６０ｍＭｔ
−リス、（ｐＨ７，５）、　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　
５ｍ、Ｍ　　ＤＴＴ　。
３．５ｍＭのＡＴＰおよび８００単位の７４　Ｄ　Ｎ　
Ａ　ＩＪガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）中で１５℃で１６時
間インキュベートする。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを７５℃で
１０分間不活性化した、後過剰のリンカ−を１０ｍＭＢ
ＤＴＡ、　　３００ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０
＞　および０．５４容のイソプロパツールの存在下でＤ
ＮＡを沈澱させることにより除去する。ＤＮＡを５ａｉ
ｌで消化する。生成するフラグメントを１％アガロース
ゲル上トリス−ホウ酸−〇〇ＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）
中で分離する。１．１　ｋ　ｂのＳａｌ　Ｉフラグメン
トを、ゲルからの電気溶出、フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱により回収する。ＤＮＡを０．１μモル／μ
ｌの濃度で再分散させる。
５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−旧Ｐ
をＳａｌ　Ｉで完全に消化する。フェノール抽出および
エタノ−′ル沈澱の後、ＤＮＡを１００μｌの５０ｍＭ
のトリス（ｐＨ８，０）中に再分散させる。４．６単位
のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）を加える。３７℃で１時間置いた後、ホスファタ
ーゼを、ｌｏｏｍ　Ｍ　　ＮａＣ１，５ｍＭＨＤＴ＾お
よび０．５％のＳＤＳの存在下で６８℃にて１５分間不
活性化する。ＤＮＡ溶液を、１０ｍＭ１−リス（ｐＨ７
，５）、１５０　ｍＭ　　ＮａＣ１，およびｌ　ｍＭ　
ＥＤＴＡで平衡化したＤＥ５２アニオン交換体（Ｗｈａ
ｔｎ＋ａｎ）の１００μｌのベッドに加える。カラムを
同じ緩衝液で洗浄した後、ＤＮＡを４００μｍ（７）１
．５　Ｍ　ＮａＣ１゜１０ｍＭ１−リス（ｐＨ１７，５
）　、　　１ｍＭ　ＥＯＴＡで溶出し、エタノールで沈
澱せしめる。線状化したプラスミドを０．６％のアガロ
ースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断されていない
ＤＮＡから分離する。ゲルから線状の７．３ｋｂ　　Ｄ
ＮＡフラグメントを回収し、電気溶出し、フェノール抽
出し、エタノールで沈澱させ、そしてＯ，ｌ　ｐモル／
μｌの濃度で再分散させる。
０．２ｐモルの１．１ｋｂＳａｌｌフラグメントおよび
０．１　ｐモルの線状化したベクターを１０μｌの６０
ｍＭ）リス（ｐＨ７，５＞　、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ
、、　　５ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび２
００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ中１５℃で１６時間連結
させる。連結混合物１μｌを、１００μｌのカルシウム
処理し形質転換コンピテントＥ、コリ細胞に加える。
２４個の形質転換したａｍｐ”コロニーを、別々に１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中で増殖さ
せる。１１ｏｌｓｅｓらの方法［＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋＋＋。
旦４　（１９８１）　１９３］に従い、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、そして［！ｃｏＲＩ制限消化によって分析
する。
予想される制限フラグメントを有するーっのクローンを
単離し、そしテｐＪＤＢ２０７／　［ＧＡＰＩ！Ｌ−Ｈ
ＩＲ］Ｄと命名する。
同様な造成を、プラスミＦ　ｐＪＤ［１２０７／ＧＡＰ
ＦＬ　−＋１１ＲおよびｐＪＤＢ２０７／　ＰＡＰＦＬ
／ＩＥＲ（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）を用いて行う。一つの
選択されたクローンの得られるプラスミドＤＮＡは、そ
れぞれｐＪＤＢ２０７／［ＦＡＰＦＬ　−＋１１Ｒ］　
ＤオヨびｐＪＤＢ２０？／　［ＰＡＰＦＬ　−１＋１Ｒ
（ＵＡＳ１＋ＵＡＳ２）　］　Ｄと呼ばれる。
以下余白 ｍ工、ノね”、されるデスルファトヒルジン９−〇　Ａ
　Ｐ　Ｄ　１１−プロモーター、■卯シグナル配列、デ
スルファトヒルジンのコード配列、および皿亜転写ター
ミネータ−を含んで成るＤＮＡフラグメントの４個のコ
ピーを、直列（タンデム）の頭と尾の配置で酵母発現ベ
クターに挿入する。
１０μｇのプラスミドｐＨＤＢ２０？／　［ＧＡ’ＰＦ
Ｌ−旧ＲＤ（実施例２６参照）をＳａｌ　ｌで消化する
。生成する線状フラグメントの接着末端を、Ｍａｎｉａ
ｔｉｅｓら（上記）の方法により、Ｅ・コリＤＮＡポリ
メラーゼＴ　　（Ｋｌｅｎｏ−フラグメント、ＢＲＬ）
との反応においてフィルインする。０．９４μｇの旧ｎ
ｄｌｌＩリンカ−［５’　−ＣＡＡＧＣＴＴＧ　−３’
　、Ｂｉｏｌａｂｓ　］をキナーゼ処理し、セルファニ
ーリングし、そして平滑末端へ変換されたＳａｌ１部位
を有する線状化したプラスミドｐＪＤＢ２０？／　［Ｇ
ＡＰＦＬ−旧ＲＩＤに連結する。リンカ−の連結および
イソプロパツールによる沈澱は、実施例２６に記載され
ているのと同様である。次に、ＤＮＡを旧ｎｄｌＩ［を
用いて切断し、そして生成する２、　２　ｋ　ｂのフラ
グメントを電気溶出し、そしてフェノール抽出およびエ
タノール沈澱により単離する。ＤＮＡを０．１μモル／
μｌの濃度に再分散する。
５μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０？／　［ＧＡＰＦＬ−
旧Ｒ］Ｄを、旧ｎｄｌｌｌを用いて完全に消化する。Ｄ
ＮＡをウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）を用いて脱リン酸化し、ＤＥ５２イオン交換
クロマトグラフィによって精製し、実施例２６に記載の
ように電気溶出によって０．６％アガ【１−スゲルから
単離する。
０、２　ｐモルの２．２　ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄ　ｍフラグ
メントおよび０．１　ｐモルの線状化したベクターを上
記のように連結する。１μｌの連結混合物を、１００μ
ｌのコルシウム処理した形質転換コンピテントＥ。
コリＨＢＩＯＩ細胞に加える。
１２個の形質転換したａｔｍｐ”　：１０ニーを、１０
０μｇ　／　ｍ　１のアンピシリンを含むＬＢ培地で別
々に生育させる。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＳ
ａｌ　Ｉ　＋　Ｘｂａ　ＩおよびＡｖａ　Ｉ　＋　Ｘｂ
ａ　Ｉの二重消化およびＢａ５ＨＩ消化によって分析す
る。１．１ｋｂＢａｍｌｌ　Ｉ一連結フラグメントは、
インサートがプラスミド上に既存の２個のコピーに対し
て頭と尾の配置で存在することを示唆している。インサ
ートのこの方向を有する一つのクローンを、ｐＪＤＢ２
０７／　［ＧＡＰＦＬ−ＨｒＲ］　Ｔと称する。
４種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド（■−１、Ｉ
−２、Ｉ−３、■−４）を、ＤＮＡ合成機（３８０Ｂ型
、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって合
成する。脱ブロッキングの後、合成フラグメントを８Ｍ
尿素含有する１２％ポリアクリルアミドゲルで精製する
。塩を含有しない純粋なオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドが、Ｓｅｐ、Ｐａｋ　（ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ）を用いて得られる。これらのフラグメントは、
頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルターゼシ
グナル配列をコードするデユープレックスを構成する。
（ａ）二え久二■ｍ１ １．５μｇのｐ３１Ｒ／ＳＳ　−ＴＰＡΔ２（欧州特許
出願第１４３．０８１号明細書）を、５０μｌの１０ｍ
Ｍ）リス・ＨＣｌ　（ｐＨ７、５）、　６　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｈ、１００ｍＭ　ＮａＣ１゜６ｍＭメルカプトエタノ
ール中で、１０単位の以下余白 ＥｃｏＲＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて、３７
℃で１時間消化する。１μｌの２．５　Ｍ　ＮａＣ１を
加えた後、１０単位のＸｋ＋ｏ　ｆ　（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ）を加え、３７℃で１時間インキュベートする。
４，２ｋｂベクターを、０、８％調製用アガロースゲル
上で単離する。ゲルスライスを旧ｃｒｏ　Ｃｏ１１ｏｉ
ｄｏｒチユーブ（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＧ＋＋＋ｂｌｌ）
に写して、２００μｌのＴＥで覆い、そして電気溶出す
る（９０ｍＡで５０分間電気泳動する）。
ＴＥ溶液を集めて、０．１容の１０ｘＴＨＮを添加した
後、２．５容の無水エタノール中で沈澱させる。
ＤＮＡペレットを冷８０％エタノールで洗浄し、そして
真空中で乾燥する。ＤＮＡを、６μｌのＴＥに再分散す
る（４０μモル／μｌ）。
１０μｍの０．５　Ｍ　トリス・ＨＣｌＣｐＨ８＞中に
それぞれ１０９モルの４種類のデオキシリボヌクレオチ
ドを含む溶液を、水浴上で９５℃で５分間インキュベー
トする。水浴を、５時間にわたって３０℃まで徐々に冷
却する。このアニーリング混合物に、それぞれ２μｌの
０．１　Ｍ　ＭｇＣ１ｚ　、　０．１　ＭＮａＣｌ、３
０ｍＭ　　ＤＴＴ、４ｍＭ　　ＡＴＰおよび８！位（ｌ
μｌ）のポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ）を加える。キナーゼ処理は、３７℃で１時間行う
。アニーリングし、キナーゼ処理されたオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、および６０μモルのＥｃｏＲＩ　−
Ｘｈｏ　Ｉ切断ベクター（１，５μＫ）を、４００単位
（１μｌ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を
用いて１４℃で１７時間連結させる。６５℃で１０分間
インキュベートすることによって、反応を停止させる。
１０ｍ１のこの連結部゛合物を、Ｅ、３１月ＩＢＩＯＩ
　Ｃａ”細胞の形質転換に用いる［Ｍ、Ｄａｇｅｒｔお
よびＳ、Ｄ、Ｅｈｒｌｉｃｈ　５Ｇｅｎｅ。
５６、２３−２８（１９７９）１　、２０個のａａ＋ｐ
”　：Ｉ口二一を採取する。ＤＮＡを迅速単離法により
調製する［Ｄ、Ｓ、Ｈｏ１ｓ＋ｅｓおよび台０口ｕｉｇ
ｌｅｙ　＋、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｊ、１９３−１９７（１９８１）］　、　ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩおよびＸｈｏ　Ｉを用いて消化し、ＢｃｏＲＩ末
端で放射能標識を行い、放射能標識されたｐＢｒ３２２
　ＨａｅＩ［Ｉ切断ＤＮＡをマーカーとして用いて、８
Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル上で分析する
。総ての２０個のコロニーから得られるＤＮＡについて
、正確な大きさのバンドが観察される。１個のクローン
を１００μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含む１００
ｍ！のＬＢ培地で増殖させる。プラスミドＤＮＡを単離
して、ｐ３１ＲＩＴ−１２と称する。
５μｇのプラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２を、Ｓａｌ　Ｉ
およびＥｃｏＲＩを用いて完全に消化する。大きな３．
３ｋ　ｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを、
０．６％アガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８
，２）中で単離する。ＤＮＡをゲルから電気溶出し、フ
ェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。
１０μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ　−
１１１Ｒ（実施例２５参照）をＳａｌおよびＥｃｏＲＩ
を用いて消化する。　　４７７ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−ｆ
！ｃｏＲＩフラグメントを、０、８％アガロースゲル上
トリス−ホウ酸−ｐｏｒＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中で単
離する。ＤＮＡを電気溶出し、フェノール抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。これらの単離されたＤＮＡ
フラグメントを連結する。連結混合物の一部を用いて、
適当なＥ・コリＩＩＢＩＯＩ細胞を形質転換する。ａｌ
ｌＩｐＲコロニーを増殖せしめ、プラスミドＤＮＡをｌ
１ｉｎｄｌｌｌＳａｉｌ二重消化によって分析する。正
確なインサートを有するプラスミドを、ｐ３１／ＧＡＰ
ＦＬ　−Ｉ　Ｔと命名する。
２５μｇのプラスミドｐ３１／ＧＡＰＦＬ　−Ｉ　Ｔを
、ＰｓＬＩおよび５ａｌＩを用いて完全に消化する。生
成する６７６ｂｐフラグメントを、１０％調製用アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ衝液（ｐｌ！　８
．３　）中で単離する。ＤＮＡをゲルから電気溶出し、
０Ｅ５２イオン交換クロマトグラフイによって精製し、
エタノールで沈澱させ、そしてｌＩｇａＩ酵素に好適な
緩衝液に再分散して０．１μｇ／μｌの濃度にする。Ｓ
ａｌ　Ｉ　−Ｐｓｔｌ　　ＤＮＡフラグメントを、０．
５単位／μｇＤＮＡの存在でＩｌｇ、１１を用いて３７
℃で６０分間部分的に消化する。ＥＤＴＡを添加して最
終濃度を１０ｍＭにすることによって、反応を停止させ
る。５３４ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｉｌｇａ　Ｉフラグメ
ントを１％調製用アガロースゲル上で単離する。
ＤＮＡをゲルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフ
ィによって精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分
散させて、約０．１μモル／μｌの濃度にする。
１０μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−１１
１Ｒ（実施例１６参照）を、Ｂａ１ｌおよび旧ｎｄｌ［
Ｉを用いて消化する。生成する５８７　ｂｐＢａｌ　Ｉ
−旧ｎｄＩＩフラグメントを、調製用１％アガロースゲ
ル上で単離する。ＤＮＡを電気溶出し、エタノール沈澱
し、更に旧ｎｆｌで消化する。
下記のオリゴデオキシヌクレオチド ５’　−ＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴ
ＧＣＡＣＣＧ−３’３’　−ＣＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧ
ＣＴＧＡＣＧＴＧＧＣＴＴＡ−５’のそれぞれ１．３μ
ｇ　（１６０μＭ）を実施例２４ｄｌｌＩに記載のよう
にしてキナーゼ処理し、そしてアニーリングする。０．
６μｇ（１，６ｐモル）の旧ｎｆｌで消化したＢａｌ　
ｌ−１１ｉｎｄｎ［フラグメント（上記参照）および１
６０μモルのキナーゼ処理されアニーリングしたリンカ
−を、８３μｌの１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７
，５）、　１０ｍＭ　ＭｇＣｂ、　５ｍＭ　　ＤＴＴ、
３．５ｍＭ　　ＡＴＰおよび４００単位のＴ、ＤＮＡリ
ガーゼ中で、１５℃で１６時間連結させる。
８５℃にて１０分間の後、ＤＮＡをイソプロパツールで
沈澱させることによって過剰のリンカ−を除去する（実
施例２４ｄｌｌｌ参照）。５８４ｂｐ　Ｉｌｇａ　Ｉ　
−１ｌｉｎｄｌ［［フラグメントを、１％調製用アガロ
ースゲル上で単離する。電気溶出し、精製し、そしてエ
タノール沈澱させたＤＮＡを水に再分散して、０、１　
ｐモル／μｌの濃度にする。
５μｇのｐＪＤＢ２０？　／ＰＨ０５−ＩＩ　Ｉｎを旧
ｎｄｎ［および５ａｉｌで消化し、そして大きな６．２
　ｋ　ｂフラグメントを単離する。
０．２ｐモルの５３４ｂｐ　Ｓａｔ　Ｉ　−Ｉｌｇａ　
Ｉフラグメン）、０．２ｐモルの５８４ｂｐ　Ｈｇａ　
Ｔ　−ＩＩｉｎｄｌ［Ｉフラグメント、および０．１μ
モルの６．２　ｋ　ｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄ■ベク
ターフラグメントを、１０μｌの１０ｍＭトリス・ＨＣ
１（ｐＨ７、５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、５ｍＭ　　
ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰおよび４００単位のＴ４リガ
ーゼ中で１５℃で５時間連結させる。連結混合物の１μ
ｌを用いて、コンピテント８．３１月１Ｂｌｏｔ細胞を
形質転換させる。
２４個の形質転換されたアンピシリン耐性のコロニーを
、１００μｇ　／　ｍ　１アンピシリンを含むＬＢ培地
で別々に増殖させる。プラスミドＤＮＡを調製して、旧
ｎｄｌ［［およびＳａｌに重消化によって分析する。正
確な制限パターンを有する単一クローンを単離し、ｐＪ
Ｄ［１２０？／ＧＡＰＰＬ　−１−１１１Ｒと表す。
インベルターゼシグナル配列の同一性およびヒルジンコ
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
サツカロミセス・セレビシェ−ＣＦＲ１８株（α。
１１２、　　ｃａｎ”　）を、１ｌｉｎｎｅｎらの報告
による形質転換法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、　、ＵＳＡ、？５　、１９２９（１９７Ｂ）　］
を用いて、次のようなプラスミドを用いて形質転換する
。
ｐＪＤＢ２０？　／ＰＡＰＥＬ　−１１１Ｒ（ＵＡＳＩ
）。
ｐＪＤＢ２０？　／ＰＡＰＦＬ　−１＋１Ｒ（ＵＡＳＩ
）。
ｐＪＤＢ２０７　　／ＰＡＰＩ！Ｌ　　−１１１Ｒ（Ｕ
ＡＳ１＋ＵＡＳ２）。
ｐＪＤＢ２０？　／ＰＡＰＦＬ　−１１１Ｒ（ＵＡＳ１
＋ＵＡＳ２）。
ｐＪＤＢ２０？　／ＧＡＰＢＬ　−ＩＩＩＲ。
ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ　−１１１Ｒ。
ｐＪＤＢ２０？　　／　　［ＧＡＰＩｌ！Ｌ　　−１＋
１Ｒコ　０゜９ＪＤＢ２０１　／　［ＧＡＰＦＬ　−１
＋１Ｒ］　Ｄ。
ｐＪＤＢ２０７　／　［ＰＡＰＦＬ　−ＨＩＲ］　（Ｕ
ＡＳＩ　＋ＵＡＳ２）Ｄ。
ｐＪＤＢ２０７　／　［ＧＡＰＦＬ　−ＨＩＲ］　Ｔ。
ｐＪＤＢ２０７　　／ＧＡＰＩ？Ｌ　　−１−１１１Ｒ
形質転換した酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地
平板上で選択する。単一の形質転換した酵母コロニーを
単離して、次のように命名する。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１Ｂ／ｐＪＤＢ２
０７／ＰＡＰＥＬ−旧Ｒ（ＩＩＡｓＩ）。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／ｒ’ＡＰＦＬ−ＨＩＲ（ＵＡＳＩ）。
１フｊ１１＋！ｔＸ・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤ
Ｂ２０７／ＰＡＰＥＬ−１１１Ｒ（ＵＡＳＩ　＋　ＵＡ
Ｓ２）。
１フＮ１ミにスーｋｋビ！ｔ’Ｌ−ＧＲＦｔ８／ｐＪＤ
［１２０７／ＰＡＰＦＬ−１＋１Ｒ（ＵＡＳ１＋ＬＩＡ
Ｓ２）。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤ［１
２０７／ＧＡＰＥＬ−ＨＩＲ。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１Ｂ／ｐＪＤ［１
２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＥＲ。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤｎ２
０７／　　　［ＧＡＰＥＬ−１１１ＲＩ　　Ｄ。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１Ｂ／ｐＪＤＢ２
０？／　　　［ＧＡＰＰＬ−ＨＩＲＩ　　Ｄ。
サフＮＪミセス−にレビ’ｒｘ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ
２０７／　　　［ＰＡＰＦＬ−１１１ＲＩ　　（ＩＪＡ
Ｓ１＋ＵＡＳ２）］　　０゜９フカＵミセス・セレビシ
ｘ−ＧＲＦ１Ｂ／ＰＪＩ３８２０７／　　　［ＧＡＰＦ
Ｌ−旧１１１　　？。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／　　ＧＡＰＦＬ−１−旧Ｒ０゛（ｂ）朋ＩｊＪｕ
帖（社）ｉ醒 Ｓ、セレビシェ−ＧＲＦｌＢ形質転換体の細胞をそれぞ
れ、５０ｍ１三角フラスコ中で、１０ｍ１の酵母最少培
地（２％グルコースおよび２０ｍｇ／ｌのＬ−ヒスチジ
ンを加えた、アミノ酸を含有しないＤｉｆｃｏ　Ｙｅａ
ｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ）中で、３０℃で２
４時間振盪しながら培養して、３ＸｌＯ’個／ｍｌの細
胞密度とする。ハイブリγＭ　ＰＨ０５−ＧＡＰＤ１１
プロモーターを有するプラスミドを含む酵母形質転換体
は、デスルファトヒルジンの発現にはプロモーターの抑
制解除を必要とする。細胞を０．９％ＮａＣ１で洗浄し
、これを（Ｎ＋＋ｎ）ｚｓし、２％グルコースおよびＩ
ｇ／ｌのＬ−ヒスチジンの代わりに０．０３ｇ／ｌのＫ
ｌｌ□ｐｏい　１０ｇ／ｌのＬ−アスパラギンを含むほ
か、Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ
５ｅ培　−地（アミノ酸なし）の処方にしたがって調製
した５０ｍ１の低Ｐｔ最少培地に接種する。培養物は、
４ｘ１０６個／ｍ１以下の細胞密度で接種し、３０℃、
２０Ｏｒ　ｐ　ｍで２４時間攪拌する。最終的密度は、
１ｘｌＯ’個／　ｍ　１となる。
［；ＡＰＤＨプロモーターを有するプラスミドを含有す
る酵母形質転換体は、構成的にデスルファトヒルジンを
発現する。細胞をペプトン（５ｇ／ｌ）、酵母エキス（
１０ｇ／ｌ）、グルコース（２０ｇ／ｌ）、シュークロ
ース（４０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（３ｇ／　ｌ　
）　、ＸＩＩｚＳＯ＊　（２ｇ／　１）、Ｍｇ５Ｏ４（
０，５ｇ／　ｌ）　、ＮａＣ１（０，１ｇ／　ｌ）　、
ＣａＣ１ｇ（０，１ｇ／ｌ）、ビオチン（１０μｇ／ｌ
）から成る複合培地（ｇ／ｌ）中で培養する。３０℃、
２０Ｏｒ　ｐ　ｍで４８時間培養した後に、約１ｘｌＯ
’個／　ｍ　ｌの細胞が得られる。
幾つかの代表的な形質転換した酵母株によって分泌され
るデスルファトヒルジンの量（トロンビン阻害法によっ
て測定）を、以下の表にまとめである。
また、酵母形質転換体によって発現されたデスルファト
ヒルジン化合物の少なくとも９０％は培養液中に分泌さ
れることも決定される。回収の時間の関数としての培養
液中および細胞内におけるデスルファトヒルジンの分布
を決定するため、３リツトルのＭＢＲバイオリアクター
（ＭＢＲＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＡＧ、　Ｗｅｔｚｉｋｏ
ｎ、スイス）中で醗酵を行う。サツカロミセス・セレビ
シェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＰＬ−１
＋１Ｒ株を３リツトルの複合培地（上記参照）に接種し
て、３０℃で、攪拌速度５００　ｒ　ｐ　ｍおよび通気
量２００リットル／時間で培養する。最終密度５ｘ１０
９個／　ｍ　１が達成される。試料をそれぞれ、１８．
２４および４２時間目に採取し培溶液中および細胞内（
崩壊後、実施例２２参照）のデスルファトヒルジンの含
量をトロンビン阻害法およびＩＩＰＬＣによって測定す
る。
去旌桝主工・」咀にヒ呂旧Ｕソ」１七且葬豊サツカロミ
セス・セレビシェ−ＧＲＰ１Ｂ／　ｐＪＤＢ２０７／　
ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ株の細胞を含む深冷凍結アンプルか
ら多数の寒天斜面に接種を行う。１個以上の寒天斜面を
２８〜３０℃で３〜５日間培養する。１つの寒天斜面の
内容物を、邪魔板がなく、前培養培地１００ｍ　ｌを収
容する単一の５００ｍ１三角フラスコに無菌的に接種す
る。フラスコを、振幅が５０鶴で２５ｏｒｐｍのロータ
リー・シエイカーで、培養温度２８℃で振盪する。４８
時間後に、これらのフラスコの内容物（−次面培養物）
２％（Ｖ／Ｖ）を、６００ｍ　ｌの前培養培地を収容す
る２リツトルの三角フラスコに無菌的に接種する。これ
らのフラスコ（二次前培養物）を、２８℃で、ロータリ
ー・シュイカ−上で１２Ｏｒｐｍで振幅を５０鳳１とし
て４８時間振盪する。二次前培養物のフラスコ（２％ｖ
　／　ｖ　）の内容物を、３０リツトルの前培養培地（
プラント前培養物）を収容する５０リツトルのステンレ
ススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。プラント前培
養液の醗酵条件は次のようである。６００ｒｐｍ（単一
の６枚羽根のタービン攪拌機、直径１１５Ｍｆｉ）　、
４枚の邪魔板、ヘッド圧：０３バール、通気量：１リツ
トルの空気／１リツトルの培地７分、温度：２８℃、４
８時間。
寒天培地および前培養液は、寒天の有無を除けば同じで
ある。同じ前培養液を総ての前培養工程で用いた。前培
地の組成（ｇ／ｌ）： イーストニトロゲンベース（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　８
．４Ｌ−アスパラギン・Ｈ２０１１，６ Ｌ−ヒスチジン　　　　　　　　　　　　１．０グルコ
ース（別途に殺菌）２．０ 寒天培地の組成： 前培地に１リツトル当たり２０ｇの寒天を加えたもの。
（ｂ　）　　　　　　　（３００リツトル大　　）５％
（ｖ／ｖ　、　１５リツトル）の培養したプラント前培
養液を３００リツトルの無菌醗酵生産培地を収容する６
００リツトルの醗酵機に無菌的に導入する。３００リツ
トル生産培地の醗酵条件は、次の通りである。
４５０ｒｐｍ（単一の６枚羽根撹拌機、直径２３０ｍｍ
）。
４枚の邪魔板、ヘッド圧：０．３バール、通気ｉｌ：０
〜９時間？　０．２５リツトル空気／ｌリツトルの培地
７分、　　　　　　。
９時間〜回収時：１リットル空気７１リットルの培地７
分、温度２８℃、時間２４・〜４Ｂ時間、０口、。。＝
１５〜２０、収量：１５〜２５ふｇ／ｌ（試験法：ＨＰ
　Ｌ　Ｃおよびトロンビン試験）生産培地の組成（ｇ／
ｌ） ペプトン　　　　　　　　　　　　　　５酵母エキス　
　　　　　　　　　　　　１０シエークロース　　　　
　　　　　　　４０（ＮＨ４）２ＳＯ４６ ＭｇＳＯ４・ＩＨｔｏ　　　　　　　　　　　　　　ｌ
ＮａＣ１Ｏ，Ｉ ＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｃ
ａ　Ｃ１ｚ　　”　２１１２０　　　　　　　　　　　
　０．０１３殺菌前のｐＨ〜６．０ 消泡剤：必要な場合にはＵＣＯＮ　ＬＢ６２５゜≦３町
二二Ｓ把ＬＬＬＬ、Ｊｌ！　−ルの量立　′）゛の−゛
スル・ｐ１直３．３を有する培養液（実施例３０参照）
を１７℃に冷却する。細胞を、Ｗｔ＋５ｔｆａｌｉａ　
ＳＡ　　１４スラツジ除去装置（４００〜６００リット
ル／時間）により分離する。濃いスラッジは廃棄する。
僅か幌濁りを有する上澄液を、一連の５ｋａｎフイルタ
ーカートリツジ（第一：孔径５μｍ；第二：孔径１μｍ
：第三：孔径０．２２μｍ）を通して濾過し、ＮａＯＨ
でｐＨ７，５にしてＤｆ！ＡＨ陰イオン交換カラムに適
用する。カラムを酢酸ナトリウム（２０ｍＭ、ｐＨ４，
５）で洗浄し、酢酸ナトリウム（２０ｍＭ　、　ｐＨ１
３、ｌ）で溶出する。溶液（１５リツトル）をＮ　ａ　
ＯＩＩでｐＨ７，５に調整して、循環蒸発装置で？ｌｉ
して最終容積を１．８リツトルにする。１リツトルを５
ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５カラム（ベッド容積；８リ
ツ′トル、カラムは水で平衡にする）に充填する。デス
ルファトヒルジンを含む分画をＩＩＰＬｃで同定する。
デスルファトヒルジン分画（２，５リツトル）を高真空
のローターパップで濃縮して最終容積を２００ｍｌとし
て、凍結乾燥する。
２ｇの原料を５Ｑｍｌの水に溶解し、Ｎ　ａ　ＯＨでｐ
Ｈ７，５に調整し、Ｑ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ迅速硫下カ
ラム（ベッド容積：２００ｍ１）に適用する。カラムを
ギ酸アンモニウム（１００ｍＭ、　ｐＨ３，９）で洗浄
する。
２５ｍ１の画分を採取してＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによってデ
スルファトヒルジンを試験する。デスルファトヒルジン
を含む分画（１〜６５）をまとめて（１２５ｍ　ｌ　＞
　高真空のロータパップで最終容積を１０ｍ１’まで濃
縮する。濃縮した溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５
カラム（Ａｍｉｃｏｎ　％カラムを水で平衡にしである
）に適用し、そして脱塩する。得られる透明な溶液（２
５ｍｌ）を凍結乾燥する。精製する固形物は、純粋なデ
スルファトヒルジンから成る。
ヒルに由来する７０個のアミノ酸から成るポリペプチド
であるニグリンＣをコードするヌクレオチド配列、は、
試験管内で合成されており、欧州時出願第１４６，７８
５号明細書記載のようにＥ、ｃｏｌｉでサブクローン化
され、発現されている。ニグリンコード配列のｌ”１１
０５シグナルペプチドをコードする配列への正確なイン
フレーム融合は、実施例１５および１６におけるヒルジ
″ンについて記載したのと全く同様に行われる。ベクタ
ー中のインサートの正確な方向を有する単一クローンを
、ｐＪＤＢ２０７／ＰＩＩ０５−ＥＧＬと称する。サツ
カロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１Ｂ株を、通常の方法
で形質転換する。
形質転換体を、実施例２９に記載のように選択し、そし
て培養する。ニグリンＣは、培養液中には、検出されな
い。
【図面の簡単な説明】
第１図および第２図は、それぞれプラスミドｐＭＬ３０
０およびｐＭＬ３０５の造成を示す模式図である。 第３図は、ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＨ
Ｒ１１４８の造成を示す。 第４図は、発現プラスミドｐＭＬ３１０の造成を示す。 第°５図は、成熟デスルファトヒルジンをコードするＤ
ＮＡフラグメントの単離を示す模式図である。 第６図は、デスルファトヒルジンを分泌する発現プラス
ミドの造成を模式的に示す。 第７図は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を行う発
現プラスミドの造成を模式的に示す。 第８図は、Ｐ１１０５プロモータ領域を含有す４則邸の
ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ制限フラグメントのＤＮＡ配
列を示す。 第９図は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域のＤＮ
Ａ配列を示す。 第１０図は、プラスミドｐＧＡＰＤＨ−１！Ｌの造成を
示す模式図である。 第１１図は、プラスミドｐＧＡＰＤＨ−ＰＬおよびｐＧ
ＡＰＤＩＩ　−ＥＬ中に存在するＧＡＰＤＩＩプロモー
ターフラグメントの配列を示す。 第１２図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７　／　ＰＨ０５
（Ｅｃｏ）−’ｉ　Ｉ　Ｒの造成を示す。 第１３図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／　ＰＡＩ’Ｅ
Ｌ−１＋１Ｒ（ＵＡＳＩ　＋　ＵＡＳ２）　（７）造成
を示す。 第１４図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／　（ＧＡＰＨ
Ｌ　−＋１１Ｒ）　Ｄの造成を示す。 第１５図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ　
−１−ＨＩＲの造成を示す模式図である。 図面では、次の略号を用いる。 ｐ：プロモーター、　　　ＳＳ：シグナル配列、ｔ：タ
ーミネータ−、Ｌニリンカー。 特許出願人 チバーガイギ−７クチェンゲゼル シャフト（外１名） 特許出願代理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　石　１）　　敬 弁理士　福　本　　　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士西山雅也 ニＭりＪ　プラスミドｌ１ＭＬ３００の造成−】αｔＣ
２プラスミドｐＭＬ　３０５の造成ＪＥＥｉｉ′：４１
　　発現プラスミドｐＭＬ３１０の造成ＪｉＷＨデスル
ファトヒルジンの分泌用発現プラヌミドｐＪＤＬｌ　２
０７／ＰＨ０５−ｔＨｌｔの造成ｐｒｕＩＩｔｕｒｍＢ
−ｒｕｎ ｃ’ｃ −５４０−５３０−５２０−５１０−５００ＡＴＣＣＧ
ＡＡＡＣ；Ｔ　ＴＧＴＡＴＴＣｋＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣ
ＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡ　ＡＣＧＴＡＴＴＴＧ（ｉ−
４９０−４８０−４７０−４６０−４５０ＡＡＧＴＣＡ
ＴＣＴ丁　ＡＴＧＴＧＣＧＣＴＧ　　ＣＴＴτＡＡＴＧ
ＴＴ　　ＴＴＣＴＣＡＴＧＴＡ　ＡＧＩＩＩＣＧＡＣＧ
ＴＣ−４４０−４３０−４２０−４１０−４００ＧＴＣ
ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＣＧＡＡ　ＧＧＴんり端Ｇ
ＧＴ　ＴＣＡＴＡＣ；ＣＧＣＴ　ＴＴＴＴＣＴＴＴＯＴ
−３９０−３８０−３７０−３６０−３５０ＣＴＧＣＡ
ＣＡＡＡＧ　ＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴ　ＴＡＭＴＴＡＧＣ
Ａ　ＣＧＴＴＴＴＣＧＣＡ　ＴＡＧＡＡＣＧＣＡＡ−３
４０−３３０−’＋２０　　　　−３１０　　　　−３
００−２４０　　　　−２３０　　　　−２２０　　　
　−２１０　　　　−２００−１４０　　　　−１３０
　　　　−１２０　　　　−１１０　　　　−１００Ｇ
ＧＡＴＡＡＧＧＧＴ　ＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴ　ＧＡＡＴ
Ｔ（ｉＴｃＧＡ　ＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴ　ＡＴＡＴＡＡ
ＧＣＧＣ−９０’−８０−７０−６０−５０ ＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧ　　Ｃ丁ＡＡＧＴＣＣＡＧ　　Ｇ
ＴＴＡＧＴＡＴＧＧ　　ＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴ　　ＣＡ
ＴＧＡＧＡＡＴＡ−４０−３０−２０−１０−１１０ ＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡ　ＣＡＡＡＴＡＧＡ（ｉＣＡＡＧ
ＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＴＡＣＣＡ醇遠ＴＴＴＡＡＡ
Ｔ２０　　　　　　３０　　　　　　４０　　　　　　
５０　　　　　　６０マ ＣＣＣＴＴＡＧＧＣＡ　　ＭＣ丁ＡＧＣＣＧＡ　　ＴＧ
ＴＣＧＡＣ−ｊαｔＣ＃ＧＡＰＤＩ−Ｉ遺伝子のプロモ
ーター領域−６３０−６２０−６１０−６００−５９０
ＴＡＡＴＴＡＡＴＡＧ　　ＴＡＧＴＧＡ丁ＴＴＴ　　Ｃ
ＣＴＡＡＣＴＴＴＡ　　ＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡ　　ＡＡ
ＡＴＴＡＧＣＣＴ−５８０−５７０−５６０−５５０−
５４０丁ＴＴＡＡＴＴＣＴＧ　　ＣＴＧＴＡＡＣＣＣＧ
　　ＴＡＣＡＴＧＣＣＡＡ　　ＡＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧ
ＧＧＴＴＡＣＡＣＡ−５３０−５２０−５１０−５００
−４９０ＧＡＡＴＡＴＡＴＡＡ　　ＣＡＣＴＧＡ丁ＧＧ
Ｔ　　ＧＣＴＴＧＧＧＴＧＡ　　ＡＣＡＧＧＴＴＴＡＴ
　　ＴＣＣＴＣｉＧＣＡＴＣ−４８０−４７０−４６０
−４５０〜４４０ＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴ　　ＡＡ丁ＧＧ
ＡＧＣＣＣＧＣＴＴＴＴＴＡＡＧ　　ＣＴＧｔｌ：ＣＡ
ＴＣＣＡ　　ＣｉＡＡＡＭＡＡＡＡ−４３０−６２０−
４１０−４００−３９０ＧＡＡ丁ＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡ
ＡＡＡＴＡＴ　　ＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＴＴＣＡＴＡＧＧ−３８０−３７０−３６０
−３５０−３４０ＴＣＣＡＴＴＣＴＣＴ　ＴＡＣ；ＣＧ
ＣＡＡＣＴ　ＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡ　ＧＧＣＣＡＣＡＡ
ＡＣＡＧＧＣＡ〜Ｗ−３３０−３２０−３１０−３００
−２９０ＣＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＧ　
ＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＴ　ＡＡＡＴ
ＧＡＴＧＡＣ−２８０−２７０−２６０−２５０−２４
０ＡＣＭＧＧＣＡＡＴ　　ＴＧＡＣＣＣＡＣＧＣＡＴＧ
ＴＡＴＣＴＡＴ　　Ｃ丁ＣＡＴＴＴＴＣＴ　　ＴＡＣＡ
ＣＣＴＴＣＴ−：！３０　　　　　−２２０　　　　　
−２１０　　　　　−２００　　　　　−１９０ＡＴＴ
ＡＣＣＴＴＣＴ　ＧＣＴＣＴＣＴＣＴＩＩ；　ＡＴＴＴ
ＧＧＡＡＡＡ　ＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＧＧτＴ
（ｉＡＡ−１８０−１７０−１６０−１５０−１４０Ａ
ＣＣＡＧＴＴＣＣＣ’ｒＧＡＡＡＴＴＡＴＴ　ＣＣＣＣ
ＴＡＣＴＴＧ　ＡＣＴＡＡＴＡＡＧＴ　ＡＴＡＴＡＡＡ
ＧＡＣ−１３０−１２０−１１０−１ｏｏ　　　　　　
−９０ヨ１グ１クツＢ　プラスミドｐＯＡＩ’ＤＩＩ−
ＥＬの造成ａ、　　ｐＧＡＰＤＨ−Ｆｌ、 ５’−ＣＡＴＣＴＯＣＴＣＡ〜すＡ　ｋＡＡＱｃττＣ
＾＾ｂ、ｐＧＡＰＤＨ−Ｅｌ ＧＴＴτＣＧＡＡＴＡ　ＡＡＣＡＣＡＣＡＴＡ　ｋｋＴ
ｋＡＡＧ−３”ニ１グｊζＪ２　プラスミドきＩＤｎ２
０７／Ｉ’１１０５（Ｅｃｏ）−＋１１１Ｌの造成−目 ｐｊＤ８２Ｄ７／ＰＡＰＥＬ−Ｈ１１１１１１ＡＳ＋＋
１ａＳ２１ニ１ｉｊりＪ４１　プラスミドｐＪｌ）Ｂ２
０７／（ＯＡＩ’ｒＥＩ、−Ｉｔ　ＩＩＬ）Ｄの造成ｐ
Ｈ１８２０１七駅Ｌ−１１町υ 手続補正書（方式） 昭和６２年３月ノＪ日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２９３５５８号 ２、　発明の名称 トロンビン阻害剤の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　チバーガイギー アクチェンゲゼルシャフト　（外１名）４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｌＯ号−５
、補正命令の日付 昭和６２年２月２４日（発送日） ６、補正の対象 （１）　　願書の「出願人の代表者」の欄（２）委任状 （３）明細書 ７、補正の内容 （１）　（２）　　別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の
目録 （１）訂正願書　　　　１通 （２）　　委任状及び訳文　　　　　　　　各１通（３
）浄書明細書　　　　　　１通

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であって、 真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコ
    ードする第二のＤＮＡ配列及びその上流にありそしてそ
    れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
    ドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメ
    ントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるもの
    と、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るＤＮＡ配
    列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡインサート
    、並びに、 ＵＲＡ１、ＡＲＧ４、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＴＲＰ５お
    よびＴＲＰ１から成る群から選択される選択遺伝子マー
    カーを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換され
    た酵母細胞を適当な栄養条件下で培養し、 培地からヒルジン活性を有する蛋白質を分離して、所望
    により細胞に結合しているヒルジン活性を有する別の蛋
    白質を細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジ
    ン活性を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異な
    る蛋白質ペプチドに変換することを特徴とする方法。 ２、発現制御配列が酵母宿主において用いるために酵母
    のゲノムＤＮＡに由来する、特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ３、発現制御配列が一つの酵母の遺伝子の上流活性化配
    列、およびもう一つの酵母遺伝子の機能性ＴＡＴＡボッ
    クスを含む下流プロモーターから成るハイブリッドプロ
    モーターである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が、酵母
    インベルターゼ、ａ−因子、α−因子、フェロモンペプ
    チダーゼ、「キラー・トキシン」及び抑制性酸性ホスフ
    ァターゼ（ＰＨＯ５）の各遺伝子のシグナル配列、並び
    にアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
    　ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼシグナル配列か
    ら成る群から選択される、特許請求の範囲１項記載に記
    載方法。 ５、ＰＨＯ５プロモーターと、成熟デスルファトヒルジ
    ンをコードするＤＮＡ配列及びその上流にありそれとリ
    ーディングフレームが合っているＰＨＯ５シグナル配列
    から成るＤＮＡセグメントであって前記ＰＨＯ５プロモ
    ーターの転写制御下にあるものと、ＰＨＯ５遺伝子の３
    ′フランキング配列とをそれぞれが含有する１個以上の
    ＤＮＡインサートを有するハイブリッドベクターで形質
    転換した酵母を使用する、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 ６、ＧＡＰＤＨプロモーターと、成熟デスルファトヒル
    ジンをコードするＤＮＡ配列及びその上流にありそれと
    リーディングフレームが合っているＰＨＯ５シグナル配
    列から成るＤＮＡセグメントであって前記ＧＡＰＤＨプ
    ロモーターの転写制御下にあるものと、ＰＨＯ５遺伝子
    の３′フランキング配列とをそれぞれが含有する１個以
    上のＤＮＡインサートを有するハイブリッドベクターで
    形質転換した酵母を使用する、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ７、酵母ＰＨＯ５遺伝子の上流活性化部位及び酵母ＧＡ
    ＰＤＨ遺伝子のＴＡＴＡボックスを含む下流プロモータ
    ー要素を含んで成るハイブリッドプロモーターと、成熟
    デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列及びその
    上流にあってそれとリーディングフレームが合っている
    ＰＨＯ５シグナル配列を含んで成るＤＮＡセグメントで
    あって前記ハイブリッド・プロモーターの転写制御下に
    あるものと、ＰＨＯ５遺伝子の３′フランキング配列と
    をそれぞれが含んで成る１個以上のＤＮＡインサートを
    有するハイブリッドベクターで形質転換した酵母を使用
    する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、ＰＨＯ５プロモーターと、成熟デスルファトヒルジ
    ンをコードするＤＮＡ配列及びその上流にあってそれと
    リーディングフレームが合っているインベルターゼ・シ
    グナル配列を含んで成るＤＮＡセグメントであって前記
    ＰＨＯ５プロモーターの転写制御下にあるものと、ＰＨ
    Ｏ５遺伝子の３′フランキング配列とをそれぞれが含ん
    で成る１個以上のＤＮＡインサートを有するハイブリッ
    ド・ベクターで形質転換した酵母を使用する、特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ９、次の式： 【遺伝子配列があります】 を有するデス−（Ｌｅｕ＾６＾４、Ｇｌｎ＾６＾５）−
    デスルファトヒルジン変形体ＨＶ１を製造するための、
    特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、次の式： 【遺伝子配列があります】 を有するデス−（Ｇｌｎ＾６＾５）−デスルファトヒル
    ジン変形体ＨＶ１を製造するための、特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 １１、次の式： 【遺伝子配列があります】 を有するデスルファトヒルジン変形体ＨＶ１の製造のた
    めの、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、次の式： 【遺伝子配列があります】 を有するデスルファトヒルジン変形体ＨＶ２の製造のた
    めの、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、次の式： 【遺伝子配列があります】 を有するデスルファトヒルジン変形体ＰＡの製造のため
    の、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４、デス−（Ｖａｌ）＿２−デスルファトヒルジンの
    製造のための特許請求の範囲第１項記載の方法。 １５、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
    ンをコードする第二のＤＮＡ配列及びそのの上流にあり
    そしてそれとリーディングフレームが合っているシグナ
    ルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮ
    Ａセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下に
    あるものと、真核生物の転写終止シグナルを含有するＤ
    ＮＡ配列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡイン
    サート、並びにＵＲＡ１、ＡＲＧ４、ＬＥＵ２、ＨＩＳ
    ３、ＴＲＰ５およびＴＲＰ１から成る群から選択される
    選択遺伝子マーカーを含んで成る酵母ハイブリッドベク
    ター。 １６、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
    ンをコードする第二のＤＮＡ配列及びそ上流にありそし
    てそれとリーディングフレームが合っているシグナルペ
    プチドをコードする第一のＤＮＡ配列から成るＤＮＡセ
    グメントであって上記発現制御配列の転写制御下にある
    ものと、真核生物の転写終止シグナルを有するＤＮＡ配
    列とをそれぞれが含有する１個以上のＤＮＡインサート
    、並びにＵＲＡ１、ＡＲＧ４、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、Ｔ
    ＲＰ５およびＴＲＰ１から成る群から選択される選択的
    遺伝子マーカーを含んで成るハイブリッドベクターで形
    質転換した酵母細胞およびその変異株。 １７、デス−（Ｇｌｎ＾６＾５）−デスルファトヒルジ
    ン変形体ＨＶ１。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0213377A (ja) * 1988-04-26 1990-01-17 Ciba Geigy Ag デスルファトヒルジン化合物の製造方法
JP2022020610A (ja) * 2020-07-20 2022-02-01 フォーデイズ株式会社 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3583361D1 (de) * 1984-06-14 1991-08-08 Ucp Gen Pharma Ag Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren.
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
CA1341032C (en) * 1987-01-23 2000-06-20 John L. Krstenansky Anticoagulant peptides
US6005071A (en) * 1987-01-23 1999-12-21 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US5789540A (en) * 1987-01-23 1998-08-04 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
GB8907110D0 (en) * 1988-05-04 1989-05-10 Ciba Geigy Ag Improvements in the production of polypeptides
US5268296A (en) * 1988-06-11 1993-12-07 Ciba-Geigy Corporation DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18
US5112615A (en) * 1988-08-03 1992-05-12 New England Deaconess Hospital Corporation Soluble hirudin conjugates
US5167960A (en) * 1988-08-03 1992-12-01 New England Deaconess Hospital Corporation Hirudin-coated biocompatible substance
GB8826428D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Biopharm Ltd Antithrombin
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
ATE196927T1 (de) * 1992-09-04 2000-10-15 Novartis Ag Verfahren zur herstellung von proteaseinhibitoren
DE69616276T2 (de) 1995-02-09 2002-12-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Verfahren zur produktion von proteinen
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60501140A (ja) * 1983-04-22 1985-07-25 アムジエン 酵母による外因性ポリペプチドの分泌
EP0138111B1 (en) * 1983-10-03 1991-11-21 Chiron Corporation Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
DE3342139A1 (de) * 1983-11-22 1985-05-30 Ciba-Geigy Ag, Basel Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel
CA1341414C (fr) * 1984-03-27 2002-12-31 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
DE3583361D1 (de) * 1984-06-14 1991-08-08 Ucp Gen Pharma Ag Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren.
FR2568891B1 (fr) * 1984-08-09 1988-05-27 Transgene Sa Procede de preparation d'une souche, notamment de levure, transformee par un vecteur d'expression, qui peut etre cultivee sur un milieu complet sans pression de selection et souche ainsi obtenue
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0213377A (ja) * 1988-04-26 1990-01-17 Ciba Geigy Ag デスルファトヒルジン化合物の製造方法
JP2022020610A (ja) * 2020-07-20 2022-02-01 フォーデイズ株式会社 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法

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