JPS62208296A - トロンビン阻害剤の製造方法 - Google Patents
トロンビン阻害剤の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は組換DNA技術の分野に関し、そして遺伝子操
作が行われた真核細胞によるトロンビン阻害剤デスルフ
ァトヒルジンの製造方法、この遺伝子操作が行われた真
核細胞、デスルファトヒルジンの遺伝子を担持するバイ
ブリドベクター、並びに上記真核細胞および上記ハイブ
リッドベクターの製造方法に関する。
作が行われた真核細胞によるトロンビン阻害剤デスルフ
ァトヒルジンの製造方法、この遺伝子操作が行われた真
核細胞、デスルファトヒルジンの遺伝子を担持するバイ
ブリドベクター、並びに上記真核細胞および上記ハイブ
リッドベクターの製造方法に関する。
ヒルジンは天然にはヒルすなわちヒルド・メディシナリ
ス(llirudo medicinalis)中に存
在する抗凝血物質である。ヒルジンは単一の蛋白質種で
はなく、少なくとも3種の、ヒルジン変形体1(1fV
1)、ヒルジン変形体2 (HV2)(欧州特許出願第
158.564号明細書を参照されたい)および「デス
−(ValL−ヒルジン」 (欧州特許出願第158,
986号明細書を参照されたい)と命名された成分から
成っている。これ等の変形体は構造が互いに幾つかのア
ミノ酸において異なっている(特にHVIのN−末端配
列がVa 1−Va l −Tyrであり、HV2のN
−末端配列がl1e−Thr−Tyrであり、「デス゛
(Val)z−ヒルジン」のN−末端配列がThr−
Tyrである)が、N−末端の疎水性アミノ酸、C−末
端の極性アミノ酸、スルフェート・モノエステルとして
存在するチロシン残基(Tyrb3)、3個のジスルフ
ィド・ブリッジおよび抗凝血活性を共通に有する。
ス(llirudo medicinalis)中に存
在する抗凝血物質である。ヒルジンは単一の蛋白質種で
はなく、少なくとも3種の、ヒルジン変形体1(1fV
1)、ヒルジン変形体2 (HV2)(欧州特許出願第
158.564号明細書を参照されたい)および「デス
−(ValL−ヒルジン」 (欧州特許出願第158,
986号明細書を参照されたい)と命名された成分から
成っている。これ等の変形体は構造が互いに幾つかのア
ミノ酸において異なっている(特にHVIのN−末端配
列がVa 1−Va l −Tyrであり、HV2のN
−末端配列がl1e−Thr−Tyrであり、「デス゛
(Val)z−ヒルジン」のN−末端配列がThr−
Tyrである)が、N−末端の疎水性アミノ酸、C−末
端の極性アミノ酸、スルフェート・モノエステルとして
存在するチロシン残基(Tyrb3)、3個のジスルフ
ィド・ブリッジおよび抗凝血活性を共通に有する。
Ki値(複合体解離定数)が6xlO−” Mであるヒ
ルジンは、既知の最も強力なトロンビン阻害剤であり、
トロンビンへの侍異的な親和性を特徴とする。血液凝固
カスケードのその他の酵素は、ヒルジンによって阻害さ
れない。通常の抗凝血治療における好ましい抗凝血剤で
あるヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直接にトロンビ
ンに対して阻害作用を行い、前者とは異なりアンチトロ
ンビン■を介して作用するものではない。精製したヒル
ジンの唯一の薬理学的に検出し得る効果は、血液凝固の
阻害と血栓症の予防である。犬に静脈内に投与した場合
には、多量に投与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する効果
は観察されなかった。ラット、豚および犬での試験では
、ヒルジンは、(欝血によってまたはトロンビンの注射
によって誘発される)実験的血栓症、内毒素ショックお
よびDIC(散在性腺管内凝血)において有効であるこ
とが証明されている。直接比較試験を行った場合には何
時でも、ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが証
明されている。また、ヒルジンの毒性は極めて低(、非
抗原性であり且つ生物学的に活性な形で腎臓からのほぼ
完全なりリアランスを示す。
ルジンは、既知の最も強力なトロンビン阻害剤であり、
トロンビンへの侍異的な親和性を特徴とする。血液凝固
カスケードのその他の酵素は、ヒルジンによって阻害さ
れない。通常の抗凝血治療における好ましい抗凝血剤で
あるヘパリンとは対照的に、ヒルジンは直接にトロンビ
ンに対して阻害作用を行い、前者とは異なりアンチトロ
ンビン■を介して作用するものではない。精製したヒル
ジンの唯一の薬理学的に検出し得る効果は、血液凝固の
阻害と血栓症の予防である。犬に静脈内に投与した場合
には、多量に投与しても心拍数、呼吸数、血圧、血小板
数、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンに対する効果
は観察されなかった。ラット、豚および犬での試験では
、ヒルジンは、(欝血によってまたはトロンビンの注射
によって誘発される)実験的血栓症、内毒素ショックお
よびDIC(散在性腺管内凝血)において有効であるこ
とが証明されている。直接比較試験を行った場合には何
時でも、ヒルジンはヘパリンよりも優れていることが証
明されている。また、ヒルジンの毒性は極めて低(、非
抗原性であり且つ生物学的に活性な形で腎臓からのほぼ
完全なりリアランスを示す。
ヒルジンはかなり以前から知られてはいたが、その優れ
た生物学的特性から期待される広汎な治療的利用は未だ
達成されていない。その極端に限定された利用性は、医
薬における広汎に使用する上での重要な欠点である。従
来は、ヒルジン製剤は本質的には天然物質(ヒル抽出液
)から得られており、入手には費用が掛かり且つ困難で
あり、またこの方法は時間が掛かり且つ費用が掛かる分
離および精製法を用いている(P、Walsmannら
のPhar+wazie 、第36巻、653頁(’1
981年);欧州特許出願第158.986号明細書を
参照されたい)。
た生物学的特性から期待される広汎な治療的利用は未だ
達成されていない。その極端に限定された利用性は、医
薬における広汎に使用する上での重要な欠点である。従
来は、ヒルジン製剤は本質的には天然物質(ヒル抽出液
)から得られており、入手には費用が掛かり且つ困難で
あり、またこの方法は時間が掛かり且つ費用が掛かる分
離および精製法を用いている(P、Walsmannら
のPhar+wazie 、第36巻、653頁(’1
981年);欧州特許出願第158.986号明細書を
参照されたい)。
アミノ酸配列が65と比較的長という観点からも、従来
のペプチド合成では経済的理由から成功の望みが少ない
。それ故、ヒルジンの治療効果の詳細な臨床試験及びそ
の広汎な抗凝血治療での使用を可能にする適当な量のヒ
ルジンを製造するには、新規な方法を用いなければなら
ない。
のペプチド合成では経済的理由から成功の望みが少ない
。それ故、ヒルジンの治療効果の詳細な臨床試験及びそ
の広汎な抗凝血治療での使用を可能にする適当な量のヒ
ルジンを製造するには、新規な方法を用いなければなら
ない。
かかる方法は、特に組換DNA技術によって提供される
。個の技術によれば、非常に多種の生理学的に活性なポ
リペプチドは対応する遺伝学的に変性された宿主生物を
培養することによって製造することが可能である。これ
に関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸化されるデス
ルファトヒルジンを介してヒルによって製造されるもの
といわなければならない。ヒル以外の宿主は特異的なス
ルフェート転移酵素系を欠いており、それゆえヒルジン
ではなくデスルファトヒルジンを生成するものと予想さ
れる。しかしながら、対応するヒルジン蛋白質のTyr
63残基のフェノール性ヒドロキシルカラのスルフェー
ト基の酵素による除去によって得られるデスルファトヒ
ルジンタンパクによって明らかなように、その生物活性
はスルフェート基の不在によっては損なわれない(欧州
特許出願第142,860号明細書を参照されたい)。
。個の技術によれば、非常に多種の生理学的に活性なポ
リペプチドは対応する遺伝学的に変性された宿主生物を
培養することによって製造することが可能である。これ
に関して、ヒルジンは恐らく翻訳後に硫酸化されるデス
ルファトヒルジンを介してヒルによって製造されるもの
といわなければならない。ヒル以外の宿主は特異的なス
ルフェート転移酵素系を欠いており、それゆえヒルジン
ではなくデスルファトヒルジンを生成するものと予想さ
れる。しかしながら、対応するヒルジン蛋白質のTyr
63残基のフェノール性ヒドロキシルカラのスルフェー
ト基の酵素による除去によって得られるデスルファトヒ
ルジンタンパクによって明らかなように、その生物活性
はスルフェート基の不在によっては損なわれない(欧州
特許出願第142,860号明細書を参照されたい)。
近年に公開された欧州特許出願第158,564号明細
書には、それぞれのデスルファトヒルジン変形体のため
の構造遺伝子を含をするプラスミドで形質転換されE、
コリ (E、 colt)細胞によるデスルファトヒル
ジン変種1および2、並びにそれ等の類似体の調製が開
示されている。培養されたE。
書には、それぞれのデスルファトヒルジン変形体のため
の構造遺伝子を含をするプラスミドで形質転換されE、
コリ (E、 colt)細胞によるデスルファトヒル
ジン変種1および2、並びにそれ等の類似体の調製が開
示されている。培養されたE。
コリ細胞の細胞抽出液によって測定され且つ抗トロンビ
ン単位(rATUJ)fitで与えられる抗凝血活性は
、3.000〜4.000AT口10D、。。/1培養
液であり、これは(純粋なヒルジン1mgの理論的比活
性を15,000〜20.000ATtlとして)0.
2mgヒルジン10D/1の濃度に相当する。
ン単位(rATUJ)fitで与えられる抗凝血活性は
、3.000〜4.000AT口10D、。。/1培養
液であり、これは(純粋なヒルジン1mgの理論的比活
性を15,000〜20.000ATtlとして)0.
2mgヒルジン10D/1の濃度に相当する。
形質転換されたE、コリ細胞から得られる低収率のヒル
ジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の不正確な折り
畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不活性な形で蓄
積されることに起因するものと考えられる。正確な折り
畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジン分子内の3個
のジスルフィドブリッジの形成によるものである(P、
Walsmannらの上記文献を参照されたい)。その
他の天然に分泌される哺乳類の蛋白質、例えば子牛の成
長ホルモン、ヒトの!1111mプラスミノーゲン活性
化因子およびヒトγ−インターフェロンも、微生物の細
胞質中に生産され且つ蓄積された場合には本質的には不
活性である(R,A、 Sm1thら、5cience
%第229巻、1219頁(1985年)を参照され
たい〕。
ジン活性は、恐らくヒルジン蛋白質分子の不正確な折り
畳みによりヒルジン蛋白質のほとんどが不活性な形で蓄
積されることに起因するものと考えられる。正確な折り
畳みは、酵素活性にとって必須のヒルジン分子内の3個
のジスルフィドブリッジの形成によるものである(P、
Walsmannらの上記文献を参照されたい)。その
他の天然に分泌される哺乳類の蛋白質、例えば子牛の成
長ホルモン、ヒトの!1111mプラスミノーゲン活性
化因子およびヒトγ−インターフェロンも、微生物の細
胞質中に生産され且つ蓄積された場合には本質的には不
活性である(R,A、 Sm1thら、5cience
%第229巻、1219頁(1985年)を参照され
たい〕。
ジスルフィドブリッジを有するほとんどの蛋白質は細胞
外性であるので、その分泌経路はジスルフィド結合の形
成に有利であろう。分泌を非常に好ましくするその他の
特徴がある。すなわち、分泌された蛋白質は、一般的に
細胞内に蓄積された生酸物よりも容易に検出され且つ精
製され、所望の生成物が培地中に分泌されることにより
、生成物を回収するために宿主生物を破壊する必要がな
く;幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対して毒性効果を
有し、分泌されると、それ等は圧伏な細胞機能を余り妨
害しなくなり;分泌された蛋白質は、細胞の崩壊時に蛋
白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積された蛋白質
よりもこれ等の酵素によって消化されにくい。
外性であるので、その分泌経路はジスルフィド結合の形
成に有利であろう。分泌を非常に好ましくするその他の
特徴がある。すなわち、分泌された蛋白質は、一般的に
細胞内に蓄積された生酸物よりも容易に検出され且つ精
製され、所望の生成物が培地中に分泌されることにより
、生成物を回収するために宿主生物を破壊する必要がな
く;幾つかの異種蛋白質は宿主生物に対して毒性効果を
有し、分泌されると、それ等は圧伏な細胞機能を余り妨
害しなくなり;分泌された蛋白質は、細胞の崩壊時に蛋
白質分解酵素が結合している細胞内に蓄積された蛋白質
よりもこれ等の酵素によって消化されにくい。
はとんどの分泌される蛋白質は、成熟アミノ酸配列に付
随するアミノ末端伸長部としてのシグナルペプチドを有
するプレ蛋白質としてDNA上にコードされている。シ
グナルペプチドは、小泡体(ER)の膜中への蛋白質の
翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な役割を演じる
。シグナルペプチダーゼはERの管腔側で早期にシグナ
ルペプチドを開裂させる。外側細胞膜へのその後の輸送
はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白質はべりプラ
ズム空間(例えば、酸性ホスファターゼ、インベルター
ゼ)中へも、または培地(例えばα−ファクター、キラ
ー・トキシン)中へも分泌される。
随するアミノ末端伸長部としてのシグナルペプチドを有
するプレ蛋白質としてDNA上にコードされている。シ
グナルペプチドは、小泡体(ER)の膜中への蛋白質の
翻訳と同時に行われる挿入の際に、重要な役割を演じる
。シグナルペプチダーゼはERの管腔側で早期にシグナ
ルペプチドを開裂させる。外側細胞膜へのその後の輸送
はゴルジ体および分泌小泡を用いる。蛋白質はべりプラ
ズム空間(例えば、酸性ホスファターゼ、インベルター
ゼ)中へも、または培地(例えばα−ファクター、キラ
ー・トキシン)中へも分泌される。
総ての真核生物は遺伝情報を発現しそして発現された蛋
白質を分別する機構を共有すると思われるので、真核生
物宿主ではE、コリよりもはるかに効率的に真核遺伝子
の発現が進行する。真核生物の中では、酵母が最初に操
作され且つ培養されるようになったものである。多数の
異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてきた。しかしな
がら、付加されたシグナルペプチドの場合を除き、媒質
中に効率的に分泌させることができる蛋白質の本質的な
特徴を定義することは今までのところは不可能であった
。それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かについて確実に
予測することは可能になっていない。例えば、(プレー
グルコアミラーゼについての遺伝子情報を有する)形質
転換された酵母によって産生される総グルコアミラーゼ
の90%は培地中に分泌され(特許協力条約に基づく特
許出願第84/2921号明細書)、高力価の表皮成長
因子(EGF)が付随するαファクター・シグナルペプ
チドを有するEGFの遺伝子を含む培養酵母の培地中に
見い出されるが(欧州特許出願第116.201号明細
書)、β−エンドルフィン(α因子シグナルペプチド、
特許協力条約に基づく特許出願第84/4330号明細
書)、真核生物のインターフェロンA(インベルターゼ
シグナルペプチド、欧州特許出願第127.304号明
細書)、ヒトγ−インターフェロン、ヒト血清アルブミ
ン、ウシインターフェロンα1およびα2、Ml織プラ
スミノーゲン活性化因子、レニンおよびヒトインシュリ
ン様成長因子(α−ファクター・シグナルペプチド、欧
州特許出願第123.544号明細書)、白血球インタ
ーフェロンDおよびA、γ−インターフェロンおよびヒ
ト成長ホルモン(MGH)(それぞれインターフェロン
およびMGHシグナルペプチド、欧州特許出願第88.
632号明細書)′は少量または痕跡量しか培地中に検
出されず、形質転換された酵母では、シュドモナス・カ
ルボキシペプチダーゼGz(CPGz)CGz(CPG
z)シグナルペプチド、欧州特許出願第121.352
号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子(P
II O5シグナルペプチド、欧州特許出願第143
.081号明細書)の媒質中への分泌は見られない。し
たがって、付随のシグナルペプチドを有する所定の蛋白
質が酵母によって分泌されるか否かは予測不可能であり
、結局のところ選択される蛋白質によって異る。また、
付随のシグナルペプチドを有するヒルジンの様な選択さ
れた蛋白質が酵母のような形質転換された宿主生物によ
って少なくともある程度まで分泌されるかどうかについ
ては、不確実であった。
白質を分別する機構を共有すると思われるので、真核生
物宿主ではE、コリよりもはるかに効率的に真核遺伝子
の発現が進行する。真核生物の中では、酵母が最初に操
作され且つ培養されるようになったものである。多数の
異種蛋白質が、酵母で良好に発現されてきた。しかしな
がら、付加されたシグナルペプチドの場合を除き、媒質
中に効率的に分泌させることができる蛋白質の本質的な
特徴を定義することは今までのところは不可能であった
。それゆえ、蛋白質が分泌されるか否かについて確実に
予測することは可能になっていない。例えば、(プレー
グルコアミラーゼについての遺伝子情報を有する)形質
転換された酵母によって産生される総グルコアミラーゼ
の90%は培地中に分泌され(特許協力条約に基づく特
許出願第84/2921号明細書)、高力価の表皮成長
因子(EGF)が付随するαファクター・シグナルペプ
チドを有するEGFの遺伝子を含む培養酵母の培地中に
見い出されるが(欧州特許出願第116.201号明細
書)、β−エンドルフィン(α因子シグナルペプチド、
特許協力条約に基づく特許出願第84/4330号明細
書)、真核生物のインターフェロンA(インベルターゼ
シグナルペプチド、欧州特許出願第127.304号明
細書)、ヒトγ−インターフェロン、ヒト血清アルブミ
ン、ウシインターフェロンα1およびα2、Ml織プラ
スミノーゲン活性化因子、レニンおよびヒトインシュリ
ン様成長因子(α−ファクター・シグナルペプチド、欧
州特許出願第123.544号明細書)、白血球インタ
ーフェロンDおよびA、γ−インターフェロンおよびヒ
ト成長ホルモン(MGH)(それぞれインターフェロン
およびMGHシグナルペプチド、欧州特許出願第88.
632号明細書)′は少量または痕跡量しか培地中に検
出されず、形質転換された酵母では、シュドモナス・カ
ルボキシペプチダーゼGz(CPGz)CGz(CPG
z)シグナルペプチド、欧州特許出願第121.352
号明細書〕および組織プラスミノーゲン活性化因子(P
II O5シグナルペプチド、欧州特許出願第143
.081号明細書)の媒質中への分泌は見られない。し
たがって、付随のシグナルペプチドを有する所定の蛋白
質が酵母によって分泌されるか否かは予測不可能であり
、結局のところ選択される蛋白質によって異る。また、
付随のシグナルペプチドを有するヒルジンの様な選択さ
れた蛋白質が酵母のような形質転換された宿主生物によ
って少なくともある程度まで分泌されるかどうかについ
ては、不確実であった。
驚くべきことには、デスルファトヒルジンの構造遺伝子
及びそのにありそしてそれとリーディングフレームが合
っているシグナルペプチドをコードするDNA配列を含
んで成るDNAを含有する真核宿主生物によって、ヒル
ジン活性を有する蛋白質が培地中に分泌されることが見
い出された。
及びそのにありそしてそれとリーディングフレームが合
っているシグナルペプチドをコードするDNA配列を含
んで成るDNAを含有する真核宿主生物によって、ヒル
ジン活性を有する蛋白質が培地中に分泌されることが見
い出された。
本発明の目的は、真核宿主生物においてヒルジン活性を
有する蛋白質の生産および分泌のための方法を提供・す
ることである。
有する蛋白質の生産および分泌のための方法を提供・す
ることである。
本発明のもう一つの目的は、デスルファトヒルジンの構
造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードするD
NA配列を含有するハイブリッドベクター、並びに上記
ハイブリッド・ベクターにより形質転換された真核宿主
生物を提供することである。
造遺伝子及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードするD
NA配列を含有するハイブリッドベクター、並びに上記
ハイブリッド・ベクターにより形質転換された真核宿主
生物を提供することである。
c問題点を解決するための手段〕
本発明は、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であ
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のDNA配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のDNA配列から成るDNA
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るD
NA配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタゾバクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
って、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のDNA配列及びその上流にありそ
してそれとリーディングフレームが合っているシグナル
ペプチドをコードする第一のDNA配列から成るDNA
セグメントであって上記発現制御配列の転写制御下にあ
るものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るD
NA配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAイン
サートを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換さ
れた真核宿主生物を適当な栄養条件下で培養し、培地か
らヒルジン活性を有する蛋白質を分離し、所望により細
胞に結合しているヒルジン活性を有する別のタゾバクを
細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジン活性
を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異なる蛋白
質ペプチド変換することを特徴とする方法に関する。
「成熟デスルファトヒルジンをコードするDNA配列」
という用語は、ヒルゲノムに存在することが知られてお
り、そして/または上記ゲノムから分離することができ
る、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコードする総て
の構造遺伝子、例えば、成熟デスルファトヒルジン変形
体HVI、HV 2、PA、およびデス−(Val)、
−デスルファトヒルジン(HVI遺伝子の発現の単なる
人工産物ではない場合)の構造遺伝子を包含することを
意図する。[成熟デスルファトヒルジン」という用語は
、プレー配列およびブロー配列を欠いているデスルファ
トヒルジンを指す。
という用語は、ヒルゲノムに存在することが知られてお
り、そして/または上記ゲノムから分離することができ
る、ヒルジン活性を有する成熟蛋白質をコードする総て
の構造遺伝子、例えば、成熟デスルファトヒルジン変形
体HVI、HV 2、PA、およびデス−(Val)、
−デスルファトヒルジン(HVI遺伝子の発現の単なる
人工産物ではない場合)の構造遺伝子を包含することを
意図する。[成熟デスルファトヒルジン」という用語は
、プレー配列およびブロー配列を欠いているデスルファ
トヒルジンを指す。
「ヒルジン活性を有する蛋白質」とは、トロンビン阻害
作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を有し、そして
デスルファトヒルジンの一次構造を有する分泌宿主細胞
から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸化の様な修飾
がなされた対応するヒルジン化合物、および短縮された
それ等の誘導体、例えばC−末端の1〜7個のアミノ酸
を欠いているデスルファトヒルジンであると理解すべき
である。
作用および抗ヒルジン抗体との陽性反応を有し、そして
デスルファトヒルジンの一次構造を有する分泌宿主細胞
から得られる蛋白質、並びに、例えば硫酸化の様な修飾
がなされた対応するヒルジン化合物、および短縮された
それ等の誘導体、例えばC−末端の1〜7個のアミノ酸
を欠いているデスルファトヒルジンであると理解すべき
である。
上記の蛋白質は、具体的には次の式(■):X Tyr
Thr Asp Cys Thr Glu Ser
Gly Gin AsnLeu Cys Leu Cy
s Glu Gly Ser Asn Val Cys
GlyGln Gly Asn Lys Cys l
ie Leu Gty Ser Asp GlyGlu
Lys Asn Gin Cys Val Thr
Gly Glu Gly ThrPro Lys
Pro Gln Ser l1is Asn
Asp Gly Asp r’heGlu G
lu Ile Pro Glu Glu Tyr Le
u Gin(I) 〔式中、Xはジペプチド残基Va 1−Va l −(
HVI)またはThr(デス−(Val)z−ヒルジン
〕であり、そしてRはTyrのフェノール性ヒドロキシ
ル基または式−〇−30,311で表わされる基である
〕、で表わされる蛋白質、並びにC−末端アミノ酸G
1 n s C−末端ジペプチド−Leu−GlnSC
−末端トリペプチド−Tyr (R)−L e u
−Q I HまたはC−末端テトラペプチド−Glu−
Tyr(R) −Leu−Glnを欠いている誘導体;
あるいは、 次の式(■): lie Thr Tyr Thr Asp Cys T
hr Glu Ser Gly GinAsn Leu
Cys Leu Cys Glu Gly Ser
Asn Val CysGly Lys Gly
Asn Lys Cys Ile Leu
Gly Ser AsnGly Lys Gly
Asn Gln Cys Val Thr Gly
Glu GlyThr Pro Asn Pro Gl
u Ser His Asn Asn Gly Asp
Phe Glu Glu Ile Pro Glu G
lu Tyr Leu Gin(II) (HV2)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わ
される蛋白質:あるいは、ヒルジンPAと命名され、ヒ
ルによって産生されり、 Dodt 、博士論文、ミュ
ンヘン大学、西ドイツ、1984年)、そして次の式(
■): 11e Thr Tyr Thr Asp Cys T
hr Glu Ser Gly GinAsn Le
u Cys Leu Cys Glu Gl
y Ser Asn Val CysGly
Lys Gly Asn Lys Cys lie L
eu Gly Ser GlnGly Lys A
sp Asn Gln Cys Vat T
hr Gly Glu GlyThr Pro
Lys Pro Gin Ser 1lis Asn
Gin Gly AspPhe Glu Pro Il
e Pro Glu Asp Ala Tyr Asp
Glu(III) (PA)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わさ
れるもう一つのヒルジン変形体である。
Thr Asp Cys Thr Glu Ser
Gly Gin AsnLeu Cys Leu Cy
s Glu Gly Ser Asn Val Cys
GlyGln Gly Asn Lys Cys l
ie Leu Gty Ser Asp GlyGlu
Lys Asn Gin Cys Val Thr
Gly Glu Gly ThrPro Lys
Pro Gln Ser l1is Asn
Asp Gly Asp r’heGlu G
lu Ile Pro Glu Glu Tyr Le
u Gin(I) 〔式中、Xはジペプチド残基Va 1−Va l −(
HVI)またはThr(デス−(Val)z−ヒルジン
〕であり、そしてRはTyrのフェノール性ヒドロキシ
ル基または式−〇−30,311で表わされる基である
〕、で表わされる蛋白質、並びにC−末端アミノ酸G
1 n s C−末端ジペプチド−Leu−GlnSC
−末端トリペプチド−Tyr (R)−L e u
−Q I HまたはC−末端テトラペプチド−Glu−
Tyr(R) −Leu−Glnを欠いている誘導体;
あるいは、 次の式(■): lie Thr Tyr Thr Asp Cys T
hr Glu Ser Gly GinAsn Leu
Cys Leu Cys Glu Gly Ser
Asn Val CysGly Lys Gly
Asn Lys Cys Ile Leu
Gly Ser AsnGly Lys Gly
Asn Gln Cys Val Thr Gly
Glu GlyThr Pro Asn Pro Gl
u Ser His Asn Asn Gly Asp
Phe Glu Glu Ile Pro Glu G
lu Tyr Leu Gin(II) (HV2)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わ
される蛋白質:あるいは、ヒルジンPAと命名され、ヒ
ルによって産生されり、 Dodt 、博士論文、ミュ
ンヘン大学、西ドイツ、1984年)、そして次の式(
■): 11e Thr Tyr Thr Asp Cys T
hr Glu Ser Gly GinAsn Le
u Cys Leu Cys Glu Gl
y Ser Asn Val CysGly
Lys Gly Asn Lys Cys lie L
eu Gly Ser GlnGly Lys A
sp Asn Gln Cys Vat T
hr Gly Glu GlyThr Pro
Lys Pro Gin Ser 1lis Asn
Gin Gly AspPhe Glu Pro Il
e Pro Glu Asp Ala Tyr Asp
Glu(III) (PA)(式中、Rは上記定義の通りである)で表わさ
れるもう一つのヒルジン変形体である。
ヒルジン活性を有する好ましい蛋白質は、式I(但し、
Xは残基Va 1−Va l−であり、RはTyrのフ
ェノール性ヒドロキシル基である)を有する蛋白質、お
よびC−末端においてアミノ酸が1〜7個、特に1〜4
個だけ短縮されているその誘導体である。
Xは残基Va 1−Va l−であり、RはTyrのフ
ェノール性ヒドロキシル基である)を有する蛋白質、お
よびC−末端においてアミノ酸が1〜7個、特に1〜4
個だけ短縮されているその誘導体である。
好適な真核宿主生物は、高等生物、特に、哺乳類の細胞
、特にVEROもしくはII e r a細胞またはチ
ャイニーズハムスターの卵巣(CHO)セルラインのよ
うな樹立されたヒトまたは動物セルラインおよびサツカ
ロミセス・セレビシェ一旦accharom cesc
erevisiae)のような酵母である。本発明の好
ましい宿主生物は、酵母、特にサツカロミセス・セレビ
シェ−の株である。
、特にVEROもしくはII e r a細胞またはチ
ャイニーズハムスターの卵巣(CHO)セルラインのよ
うな樹立されたヒトまたは動物セルラインおよびサツカ
ロミセス・セレビシェ一旦accharom cesc
erevisiae)のような酵母である。本発明の好
ましい宿主生物は、酵母、特にサツカロミセス・セレビ
シェ−の株である。
上記DNA配列を有する真核宿主生物、特に酵母は、当
業界において既知の方法を用いて培養される。
業界において既知の方法を用いて培養される。
本発明により形質転換された酵母株は、資化可能な炭素
源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で培養
される。
源、窒素源および無機塩源を含有する液体培地中で培養
される。
各種の炭素源が利用できる。好ましい炭素源の例は、グ
リコース、マルトースまたはラクトースのような資化性
炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢酸塩であり、
単独でまたは適当な混合物として用いることができる。
リコース、マルトースまたはラクトースのような資化性
炭水化物または酢酸ナトリウムのような酢酸塩であり、
単独でまたは適当な混合物として用いることができる。
好適な窒素源としては、例えばカザミノ酸のようなアミ
ノ酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等の分解生成物
、例えばトリプトン、ペプトン、または肉エキス、更に
酵母エキス、マルトエキス、コーンステイープリカー、
あるいはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあり、単独で
もまたは適当な混合物としても用いられる。使用するこ
とができる無機塩には例えば、ナトリウム、カリウム、
マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン
酸塩および炭酸塩がある。また、培地は成長促進物質を
含んでいてもよい。成長を促進する物質には1、例えば
鉄、亜鉛、マグネシウムなどのような痕跡量の元素また
はアミノ酸がある。
ノ酸、ペプチドおよび蛋白質並びにそれ等の分解生成物
、例えばトリプトン、ペプトン、または肉エキス、更に
酵母エキス、マルトエキス、コーンステイープリカー、
あるいはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムがあり、単独で
もまたは適当な混合物としても用いられる。使用するこ
とができる無機塩には例えば、ナトリウム、カリウム、
マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン
酸塩および炭酸塩がある。また、培地は成長促進物質を
含んでいてもよい。成長を促進する物質には1、例えば
鉄、亜鉛、マグネシウムなどのような痕跡量の元素また
はアミノ酸がある。
自律複製プラスミド、例えば酵母2μプラスミドDNA
(後記)で形質転換された酵母細胞は、導入されたハ
イブリッドプラスミドを、種々の程度で失いやすい。こ
のため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、すなわち増
殖のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現を要
する条件下で生育させねばならない。一般に用いられ、
そして本発明のハイブリッドベクターに存在するほとん
どの選択マーカー(後述)は、アミノ酸またはプリン生
合成の酵素をコードする遺伝子である。これにより、対
応するアミノ酸またはプリン塩基を欠いている合成最少
培地を用いることが必要になる。
(後記)で形質転換された酵母細胞は、導入されたハ
イブリッドプラスミドを、種々の程度で失いやすい。こ
のため、かかる酵母細胞は、選択的条件下、すなわち増
殖のためにプラスミドにコードされた遺伝子の発現を要
する条件下で生育させねばならない。一般に用いられ、
そして本発明のハイブリッドベクターに存在するほとん
どの選択マーカー(後述)は、アミノ酸またはプリン生
合成の酵素をコードする遺伝子である。これにより、対
応するアミノ酸またはプリン塩基を欠いている合成最少
培地を用いることが必要になる。
しかしながら、適当な殺生物剤rに対する耐性を付与す
る遺伝子(例えば、シクロへキシミド、アミノグルコシ
ドG41B 、重金属などに対する耐性を付与する遺伝
子)も同様に用いられる。抗生物質耐性遺伝子を有する
ベクターで形質転換された酵母細胞を、対応する抗生物
質を含む複合培地中で生育させることにより、増殖速度
を速め、細胞密度を高くする。
る遺伝子(例えば、シクロへキシミド、アミノグルコシ
ドG41B 、重金属などに対する耐性を付与する遺伝
子)も同様に用いられる。抗生物質耐性遺伝子を有する
ベクターで形質転換された酵母細胞を、対応する抗生物
質を含む複合培地中で生育させることにより、増殖速度
を速め、細胞密度を高くする。
染色体に組み込まれるDNAにより形質転換された酵母
細胞は、選択的増殖条件を必要としない。
細胞は、選択的増殖条件を必要としない。
これ等の形質転換細胞は十分に安定であり、選択圧なし
で増殖を行うことができる。これらの細胞は、複合培地
中で有利に増殖する。
で増殖を行うことができる。これらの細胞は、複合培地
中で有利に増殖する。
構成的プロモーター(例えばADII r 5GAPD
H)を有するハイブリッドプラスミドを含む酵母細胞は
、誘導なしに上記プロモーターによって制御されたたデ
スルファトヒルジン遺伝子を発現する。しかしながら、
このデスルファトヒルジン遺伝子が調節されるプロモー
ター(例えばPGK−または皿的)の制御下にある場合
には、mRNA転写物の水準を最高にするような増殖培
地の組成を採用しなければならない。すなわち、PH0
5プロモーターを用いるときには、増殖培地はこのプロ
モーターを抑、制解除するための低濃度の無機リン酸塩
を含んでいなければならない。
H)を有するハイブリッドプラスミドを含む酵母細胞は
、誘導なしに上記プロモーターによって制御されたたデ
スルファトヒルジン遺伝子を発現する。しかしながら、
このデスルファトヒルジン遺伝子が調節されるプロモー
ター(例えばPGK−または皿的)の制御下にある場合
には、mRNA転写物の水準を最高にするような増殖培
地の組成を採用しなければならない。すなわち、PH0
5プロモーターを用いるときには、増殖培地はこのプロ
モーターを抑、制解除するための低濃度の無機リン酸塩
を含んでいなければならない。
培養は、常用技術を用いることによって行う。
温度、培地のpHおよび醗酵時間のような培養条件は、
最高水準のデスルファトヒルジンが産生されるように選
択される。選択された酵母株を、約25℃〜35℃、好
ましくは約30℃の温度で、4〜8のpH値、例えば約
7のpHで、約4〜約20時間、好ましくは最大収量の
蛋白質が得られるまで、振盪または攪拌を行いながら、
好気性条件下で液内培養で生育させるのが好ましい。
最高水準のデスルファトヒルジンが産生されるように選
択される。選択された酵母株を、約25℃〜35℃、好
ましくは約30℃の温度で、4〜8のpH値、例えば約
7のpHで、約4〜約20時間、好ましくは最大収量の
蛋白質が得られるまで、振盪または攪拌を行いながら、
好気性条件下で液内培養で生育させるのが好ましい。
意外なことには、宿主生物および使用されるシグナルペ
プチドとは無関係に、はとんどの産生されたヒルジン化
合物は培地中に分泌され、極一部分だけが細胞に結合し
たまま残ることが見い出された。分泌された化合物/細
胞に結合した化合物の正確な比率は、醗酵条件および用
いた回収法によって変化する。一般的には、その比率は
約9:1以上になる。したがって、分泌されたヒルジン
が常に圧倒的な割合を占める。
プチドとは無関係に、はとんどの産生されたヒルジン化
合物は培地中に分泌され、極一部分だけが細胞に結合し
たまま残ることが見い出された。分泌された化合物/細
胞に結合した化合物の正確な比率は、醗酵条件および用
いた回収法によって変化する。一般的には、その比率は
約9:1以上になる。したがって、分泌されたヒルジン
が常に圧倒的な割合を占める。
ヒルジン化合物は、通常の方法によって培地から分離す
ることができる。例えば、第一の段階は、遠心分離によ
って細胞を培地から分離することにある。生ずる上澄液
をポリエチレンイミンで処理して大部分の非蛋白質性物
質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウムまたはトリ
クロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を沈澱せしめる
ことによって、ヒルジン化合物の濃度を高くする。宿主
蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性にすることによ
って(例えば、0.1%、p)14〜5)それを沈澱さ
せることもできる。酢酸上澄液をn−ブタノールで抽出
することによって、ヒルジン化合物の濃度を更に高くす
ることができる。他の精製工程は、例えば、脱塩、イオ
ン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、
分配クロマトグラフィ、IIPLC1逆相クロマ逆相ク
ロマトグラフィロマトグラフィ法である。混合物の成分
の分離は、透析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法に
よる荷電に従って、適当なセファデックスカラムによる
分子サイズに従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用
いるアフィニティークロマトグラフィにより、あるいは
適当な担体に結合したトロンビンを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィにより、あるいはその他の方法、特
に文献公知の方法によって行うこともできる。
ることができる。例えば、第一の段階は、遠心分離によ
って細胞を培地から分離することにある。生ずる上澄液
をポリエチレンイミンで処理して大部分の非蛋白質性物
質を除去し、そして溶液を硫酸アンモニウムまたはトリ
クロロ酢酸で飽和することにより蛋白質を沈澱せしめる
ことによって、ヒルジン化合物の濃度を高くする。宿主
蛋白質が存在する場合には、酢酸で酸性にすることによ
って(例えば、0.1%、p)14〜5)それを沈澱さ
せることもできる。酢酸上澄液をn−ブタノールで抽出
することによって、ヒルジン化合物の濃度を更に高くす
ることができる。他の精製工程は、例えば、脱塩、イオ
ン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、
分配クロマトグラフィ、IIPLC1逆相クロマ逆相ク
ロマトグラフィロマトグラフィ法である。混合物の成分
の分離は、透析、ゲル電気泳動法または無担体泳動法に
よる荷電に従って、適当なセファデックスカラムによる
分子サイズに従って、抗体、特にモノクロナル抗体を用
いるアフィニティークロマトグラフィにより、あるいは
適当な担体に結合したトロンビンを用いるアフィニティ
ークロマトグラフィにより、あるいはその他の方法、特
に文献公知の方法によって行うこともできる。
細胞に結合しているヒルジン化合物、すなわち細胞内ま
たはべりプラズマ空間に蓄積した化合物をも分離するこ
とが所望ならば、幾つかの補足的精製工程を必要とする
。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している場合には、目
的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞内部から蛋白
質を遊離させることである。はとんどの処理においては
、最初に、グルコシダーゼ(後述)を用いる酵素的消化
によって細胞壁を取り除く。次いで、生成するスベロブ
ラストをTr i tonのような洗剤で処理する。
たはべりプラズマ空間に蓄積した化合物をも分離するこ
とが所望ならば、幾つかの補足的精製工程を必要とする
。ヒルジン蛋白質が細胞内に蓄積している場合には、目
的とする蛋白質の回収の第一の工程は細胞内部から蛋白
質を遊離させることである。はとんどの処理においては
、最初に、グルコシダーゼ(後述)を用いる酵素的消化
によって細胞壁を取り除く。次いで、生成するスベロブ
ラストをTr i tonのような洗剤で処理する。
また、剪断力(例えば、X−プレス、フレンチ−ブレス
)またはガラス玉との振盪のような機械的力も、細胞を
破壊するのに好適である。ヒルジン化合物プーラ宿主、
特に酵母細胞によってペリプラズマ空間中に分泌される
場合には、単純化された方法を用いることができる。す
なわち、蛋白質は、細胞壁を酵素的に除去することによ
り、または化学的薬剤、例えばチオール試薬もしくはE
DTAを用いて処理し、細胞壁に損傷を与えて産生じた
蛋白質が放出されるようにすることによって、細胞を溶
解することなく回収される。
)またはガラス玉との振盪のような機械的力も、細胞を
破壊するのに好適である。ヒルジン化合物プーラ宿主、
特に酵母細胞によってペリプラズマ空間中に分泌される
場合には、単純化された方法を用いることができる。す
なわち、蛋白質は、細胞壁を酵素的に除去することによ
り、または化学的薬剤、例えばチオール試薬もしくはE
DTAを用いて処理し、細胞壁に損傷を与えて産生じた
蛋白質が放出されるようにすることによって、細胞を溶
解することなく回収される。
意外なことには、「成熟デスルファトヒルジンをコード
するDNA配列」に対応するデスルファトヒルジン化合
物とは別に、予想される化合物とはC−末端においてア
ミノ酸が1〜4個欠けている点において異なる幾つかの
その他のデスルファトヒルジン化合物を培養液から単離
することができることが、見出された。例えば、デスル
ファトヒルジン変形体Hv1をコードする遺伝子を有す
る酵母細胞を培養すると、この化合物と共に、C−末端
アミノ酸Glnを欠いているデスルファトヒルジン化合
物〔デス−(G 1 n ” )−デスルファトヒルジ
ン〕、C−末端のジペプチド残基−Leu−Glnを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−(Leu
” * Gin”)−デスルファトヒルジン〕、C−末
端のトリペプチド残基−7’yr−Leu−Glnを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−(Tyr
63+ Leu” + Gin”)−デスルファトヒル
ジン〕、およびC−末端テトラペプチド残基−Glu
−Tyr −Leu−Ginを欠いているデスルファト
ヒルジン化合物〔デス−(Glu” 。
するDNA配列」に対応するデスルファトヒルジン化合
物とは別に、予想される化合物とはC−末端においてア
ミノ酸が1〜4個欠けている点において異なる幾つかの
その他のデスルファトヒルジン化合物を培養液から単離
することができることが、見出された。例えば、デスル
ファトヒルジン変形体Hv1をコードする遺伝子を有す
る酵母細胞を培養すると、この化合物と共に、C−末端
アミノ酸Glnを欠いているデスルファトヒルジン化合
物〔デス−(G 1 n ” )−デスルファトヒルジ
ン〕、C−末端のジペプチド残基−Leu−Glnを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−(Leu
” * Gin”)−デスルファトヒルジン〕、C−末
端のトリペプチド残基−7’yr−Leu−Glnを欠
いているデスルファトヒルジン化合物〔デス−(Tyr
63+ Leu” + Gin”)−デスルファトヒル
ジン〕、およびC−末端テトラペプチド残基−Glu
−Tyr −Leu−Ginを欠いているデスルファト
ヒルジン化合物〔デス−(Glu” 。
Tyr63. Leu” 、 Gin”)−デスルファ
トヒルジン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの化
合物は、−次発現生成物デスルファトヒルジンの(部分
的)蛋白質分解的な分解によって形成されたものと思わ
れ、用いた酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関係
に、総ての培溶液中に置いて同定された。
トヒルジン〕がそれぞれ低収量で生成する。これらの化
合物は、−次発現生成物デスルファトヒルジンの(部分
的)蛋白質分解的な分解によって形成されたものと思わ
れ、用いた酵母宿主および適用した醗酵条件とは無関係
に、総ての培溶液中に置いて同定された。
デス−(Gln”)−デスルファトヒルジン、デス(T
yr”、 Leu64. Gin”)−デスルファトヒ
ルジン〕、およびデス−(Gin” 、 Tyr” 、
Leu” 。
yr”、 Leu64. Gin”)−デスルファトヒ
ルジン〕、およびデス−(Gin” 、 Tyr” 、
Leu” 。
Gin” )−デスルファトヒルジンは新規であり、そ
してやはり本発明の目的である。
してやはり本発明の目的である。
抗ヒルジン抗体または抗デスルファトヒルジン抗体(例
えば、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル
抗体)を用いる試験、トロンビン試験CM、U、Ber
gmeyer監修、Methodsユn Enz ma
ticハ旦ハn1第■巻、314〜316頁、Verl
agChes+ie、 Weinheim (西ドイツ
) 、1983年〕、または凝血試験CF、Markw
ardtら、Thromb、Haemost、、第47
巻、226頁(1982年)〕を用いてヒルジン活性を
検出することができる。
えば、ハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル
抗体)を用いる試験、トロンビン試験CM、U、Ber
gmeyer監修、Methodsユn Enz ma
ticハ旦ハn1第■巻、314〜316頁、Verl
agChes+ie、 Weinheim (西ドイツ
) 、1983年〕、または凝血試験CF、Markw
ardtら、Thromb、Haemost、、第47
巻、226頁(1982年)〕を用いてヒルジン活性を
検出することができる。
本発明の方法によってえられるヒルジン化合物は、それ
自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ変換すること
ができる。
自体公知の方法で異なるヒルジン化合物へ変換すること
ができる。
例えば、式(I)〜(III)の化合物(但し、RはT
yrのフェノール性ヒドロキシル基である)は硫酸二ナ
トリウムのような硫酸塩および例えばヒル細胞からえら
れるチロシンスルホトランスフェラーゼと反応させて、
式(I)〜(■)(但し、Rは式−0SO,11で表わ
される基である)を有する化合物へ変換することができ
る。
yrのフェノール性ヒドロキシル基である)は硫酸二ナ
トリウムのような硫酸塩および例えばヒル細胞からえら
れるチロシンスルホトランスフェラーゼと反応させて、
式(I)〜(■)(但し、Rは式−0SO,11で表わ
される基である)を有する化合物へ変換することができ
る。
得られたデスルファトヒルジン化合物、例えばデスルフ
ァトヒルジン変形体HVIを、例えば好適なカルボキシ
ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼYの作用
によってC−末端において1〜7このアミノ酸を欠いて
いる誘導体へ変換することも可能である。
ァトヒルジン変形体HVIを、例えば好適なカルボキシ
ペプチダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼYの作用
によってC−末端において1〜7このアミノ酸を欠いて
いる誘導体へ変換することも可能である。
本発明によって形質転換された真核宿主生物は、次の工
程を含んで成る組換DN人技術によって調製することが
で告る。すなわち、 ◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンを
コードする第二のDNA配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームがあっているシグナルペプ
チドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグ
メントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるも
のと、真核生物の転写終止シグナルを有するDNA配列
とを含有するDNA造成物を調製し; ■上記DNA造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し: ■調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し;そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する; 工程を含んで成る。
程を含んで成る組換DN人技術によって調製することが
で告る。すなわち、 ◎真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンを
コードする第二のDNA配列及びその上流にありそして
それとリーディングフレームがあっているシグナルペプ
チドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグ
メントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるも
のと、真核生物の転写終止シグナルを有するDNA配列
とを含有するDNA造成物を調製し; ■上記DNA造成物を含んで成るハイブリッドベクター
を調製し: ■調製されたハイブリッドベクターを用いて好適な真核
宿主生物を形質転換し;そして ◎形質転換されない宿主細胞から形質転換された宿主細
胞を選択する; 工程を含んで成る。
本発明は、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒ
ルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成るD
NAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るDNA配列と含有するDNA造成物に関する。
ルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流にあ
りそしてそれとリーディングフレームが合っているシグ
ナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成るD
NAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下
にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含んで成
るDNA配列と含有するDNA造成物に関する。
シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジンをコード
するDNA配列の発現を制御するために数種類の発現制
御配列を用いることができる。詳細には、形質転換され
る宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が用い
られる。
するDNA配列の発現を制御するために数種類の発現制
御配列を用いることができる。詳細には、形質転換され
る宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が用い
られる。
哺乳類の細胞に用いるには、発現制御配列は好ましくは
ウィルスに由来する。例えば、哺乳類の細胞に用いるの
に好適な発現制御配列は、シミアン・ウィルス(Sin
+ian Virus)40(S V2O)の初期およ
び後記プロモーター、ワタシニアプロモーター、II
T LVプロモーター、またはポリオーマもしくはアデ
ノウィルス2に由来するプロモーターである。
ウィルスに由来する。例えば、哺乳類の細胞に用いるの
に好適な発現制御配列は、シミアン・ウィルス(Sin
+ian Virus)40(S V2O)の初期およ
び後記プロモーター、ワタシニアプロモーター、II
T LVプロモーター、またはポリオーマもしくはアデ
ノウィルス2に由来するプロモーターである。
本発明による最も好ましい宿主生物である酵母の発現制
御配列は、酵母、特にサツカロミセス・セレビシェ−の
ゲノムDNAに由来する。好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファトヒルジンの
発現のために用いられる。例えば、1肚1遺伝子、AD
H!または」U↓遺伝子、酸性ホスファターゼ(PH0
5)遺伝子、イソチトクロームC遺伝子のプロモータ、
あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ(GAP口II ’) 、3−
ホスホグリセレートキナーゼ(PGK) 、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフエートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはa−または
α−ファクターをコードする酵母に適合するフェロモン
遺伝子のプロモーターを用いることができる。一つの酵
母遺伝子の上流活性化配列(UAS)ともう一つの酵母
遺伝子の機能性TATAボックスを含有する下流プロモ
ータ要素とを含んで成るハイブリッドプロモーター、例
えば酵母■躯遺伝子のUASと酵母GAPDH遺伝子の
機能的TATAボックスを含有する下流プロモーター要
素とを含有するハイブリッドプロモーターを用いること
もできる0本発明の好ましいベクターは、転写調節を伴
うプロモーターを含有する。
御配列は、酵母、特にサツカロミセス・セレビシェ−の
ゲノムDNAに由来する。好ましくは、高度に発現され
る酵母遺伝子の発現制御配列がデスルファトヒルジンの
発現のために用いられる。例えば、1肚1遺伝子、AD
H!または」U↓遺伝子、酸性ホスファターゼ(PH0
5)遺伝子、イソチトクロームC遺伝子のプロモータ、
あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ(GAP口II ’) 、3−
ホスホグリセレートキナーゼ(PGK) 、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクト
キナーゼ、ピルベートキナーゼ、トリセホスフエートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、あるいはa−または
α−ファクターをコードする酵母に適合するフェロモン
遺伝子のプロモーターを用いることができる。一つの酵
母遺伝子の上流活性化配列(UAS)ともう一つの酵母
遺伝子の機能性TATAボックスを含有する下流プロモ
ータ要素とを含んで成るハイブリッドプロモーター、例
えば酵母■躯遺伝子のUASと酵母GAPDH遺伝子の
機能的TATAボックスを含有する下流プロモーター要
素とを含有するハイブリッドプロモーターを用いること
もできる0本発明の好ましいベクターは、転写調節を伴
うプロモーターを含有する。
この型のプロモーター、例えばPH05遺伝子のプロモ
ーターおよびPH05−GAPD11ハイブリッドプロ
モーターは、増殖条件を変えることによってターンオン
又はターンオフすることができる。例えば、P II
05プロモーターは、単に培地中の無機リン酸塩の濃度
を増減させることによって、自由に抑制したりまたは抑
制を解除したりすることができる。
ーターおよびPH05−GAPD11ハイブリッドプロ
モーターは、増殖条件を変えることによってターンオン
又はターンオフすることができる。例えば、P II
05プロモーターは、単に培地中の無機リン酸塩の濃度
を増減させることによって、自由に抑制したりまたは抑
制を解除したりすることができる。
本発明の他の好ましいプロモーターは、GAPDH遺伝
子のプロモーター、特にヌクレオチド−300〜−18
0、特にヌクレオチド−263〜−199から始まり、
そしてG A P D II遺伝子のヌクレオチド−5
で、終了する機能性フラグメントである。
子のプロモーター、特にヌクレオチド−300〜−18
0、特にヌクレオチド−263〜−199から始まり、
そしてG A P D II遺伝子のヌクレオチド−5
で、終了する機能性フラグメントである。
シグナルペプチドをコードするDNA配列(「シグナル
配列」)は、真核細胞性の、例えば酵母の通常に分泌さ
れるポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。好
適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノムDNAから得
られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナル配列、例え
ば酵母インベルターゼ、a−ファクター、α−ファクタ
ー、フェロモンペプチダーゼ、「キラートキシン」およ
び抑制性酸性ホスファターゼ(PH05)遺伝子のシグ
ナルおよびプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワ
モリからのゲルコミラーゼシグナル配列である。また、
融合シグナル配列は(存在するとすれば)用いるプロモ
ーターに天然に結合している遺伝子のシグナル配列の部
分をヒルジンシグナル配列の部分に連結することによっ
て造成することができる。これらの組み合わせは、シグ
ナル配列と成熟デスルファトヒルジンアミノ酸配列との
間で正確に開裂できるものが好ましい。追加の配列、例
えば特異的なプロセシングシグナルを担持するか又は担
持しないプロ配列又はスペーサー配列をも造成物中に含
ぬることによって前駆体分子の正確なプロセシングを容
易にすることもできる。また、生体内または生体外での
適切な成熟を可能にする内部プロセシングシグナルを含
有する融合蛋白質を生成させることができる。例えば、
プロセシングシグナルは、Lys−Arg残基を含有し
、これはゴルジ体膜中に存在する酵母エンドペプチダー
ゼによって認識される。本発明の好ましいシグナル配列
は、次の式: %式% で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PII
05遺伝子のシグナル配列、および次の式:Met
Leu Leu Gin Ala Phe
Leu Phe Leu Leu AlaGl
y Phe Ala Ala Lys Il
e Ser Alaで表わされるシグナルペプチド
をコードする酵母インベルターゼ遺伝子のシグナル配列
である。
配列」)は、真核細胞性の、例えば酵母の通常に分泌さ
れるポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。好
適なシグナル配列は、例えばヒルのゲノムDNAから得
られるヒルジンシグナル配列、酵母シグナル配列、例え
ば酵母インベルターゼ、a−ファクター、α−ファクタ
ー、フェロモンペプチダーゼ、「キラートキシン」およ
び抑制性酸性ホスファターゼ(PH05)遺伝子のシグ
ナルおよびプレプロ配列、並びにアスペルギルス・アワ
モリからのゲルコミラーゼシグナル配列である。また、
融合シグナル配列は(存在するとすれば)用いるプロモ
ーターに天然に結合している遺伝子のシグナル配列の部
分をヒルジンシグナル配列の部分に連結することによっ
て造成することができる。これらの組み合わせは、シグ
ナル配列と成熟デスルファトヒルジンアミノ酸配列との
間で正確に開裂できるものが好ましい。追加の配列、例
えば特異的なプロセシングシグナルを担持するか又は担
持しないプロ配列又はスペーサー配列をも造成物中に含
ぬることによって前駆体分子の正確なプロセシングを容
易にすることもできる。また、生体内または生体外での
適切な成熟を可能にする内部プロセシングシグナルを含
有する融合蛋白質を生成させることができる。例えば、
プロセシングシグナルは、Lys−Arg残基を含有し
、これはゴルジ体膜中に存在する酵母エンドペプチダー
ゼによって認識される。本発明の好ましいシグナル配列
は、次の式: %式% で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母PII
05遺伝子のシグナル配列、および次の式:Met
Leu Leu Gin Ala Phe
Leu Phe Leu Leu AlaGl
y Phe Ala Ala Lys Il
e Ser Alaで表わされるシグナルペプチド
をコードする酵母インベルターゼ遺伝子のシグナル配列
である。
成熟デスルファトヒルジンをコードするDNA配列は、
具体的には上記定義のデスルファトヒルジンの構造遺伝
子から選択される。好ましいDNA配列は、デスルファ
トヒルジン変形体1 (HVl)をコードし、そして
次の式: %式% 真核性の転写停止シグナルを有するDNA配列は、好ま
しくは転写停止およびポリアデニル化の以下余白 ための適当なシグナルを含有する真核性の遺伝子の3′
−フランキング(flanking)配列である。好適
な3′−フランキング配列は、例えば用いられる発現制
御配列に天然に結合し゛ている配列である。
具体的には上記定義のデスルファトヒルジンの構造遺伝
子から選択される。好ましいDNA配列は、デスルファ
トヒルジン変形体1 (HVl)をコードし、そして
次の式: %式% 真核性の転写停止シグナルを有するDNA配列は、好ま
しくは転写停止およびポリアデニル化の以下余白 ための適当なシグナルを含有する真核性の遺伝子の3′
−フランキング(flanking)配列である。好適
な3′−フランキング配列は、例えば用いられる発現制
御配列に天然に結合し゛ている配列である。
酵母が宿主生物として用いられる場合には、好ましいフ
ランキング配列は酵母P1105遺伝子の配列である。
ランキング配列は酵母P1105遺伝子の配列である。
好ましくは、本発明のDNA造成物は、クローニングベ
クターへの造成物挿入及びクローニングを可能にする合
成デオキシヌクレオチドリンカーを両端に備えている。
クターへの造成物挿入及びクローニングを可能にする合
成デオキシヌクレオチドリンカーを両端に備えている。
真核性発現制御配列、シグナルペプチドをコードするD
NA配列、成熟デスルファトヒルジンをコードするDN
A配列および真核性転写停止シグナルは互いに作用可能
に連結される。すなわら、それらの正常な機能が維持さ
れるように併置される。すなわち、この配置においては
、発現制御配列がシグナルペプチド−デスルファトヒル
ジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転写停止シグナ
ルが転写およびポリアデニル化の適切な停止を行い、そ
してデスルファトヒルジンの分泌が起るようにシグナル
配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結合される。し
たがって、好ましくは、発現制御配列およびシグナル配
列が異なる遺伝子に由来するものであるときには、発現
制御配列は大mRNA開始部位と発現制御配列に天然に
連結されている遺伝子のATGとの間でシグナル配列に
結合している。シグナル配列は、翻訳開始のためのそれ
自身のATGを有するべきである。これらの配列は、好
ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配列を有すること
ができる合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーによ
って連結されている。
NA配列、成熟デスルファトヒルジンをコードするDN
A配列および真核性転写停止シグナルは互いに作用可能
に連結される。すなわら、それらの正常な機能が維持さ
れるように併置される。すなわち、この配置においては
、発現制御配列がシグナルペプチド−デスルファトヒル
ジン遺伝子複合体の適切な発現を行い、転写停止シグナ
ルが転写およびポリアデニル化の適切な停止を行い、そ
してデスルファトヒルジンの分泌が起るようにシグナル
配列がデスルファトヒルジン遺伝子に、結合される。し
たがって、好ましくは、発現制御配列およびシグナル配
列が異なる遺伝子に由来するものであるときには、発現
制御配列は大mRNA開始部位と発現制御配列に天然に
連結されている遺伝子のATGとの間でシグナル配列に
結合している。シグナル配列は、翻訳開始のためのそれ
自身のATGを有するべきである。これらの配列は、好
ましくは、エンドヌクレアーゼの認識配列を有すること
ができる合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーによ
って連結されている。
他方、シグナル配列の最後のコドンはデスルファトヒル
ジンの遺伝子の最初のコドンに直接連結される。
ジンの遺伝子の最初のコドンに直接連結される。
本発明のDNA造成物は、当業界において公知の方法、
例えば真核性発現制御配列、デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のDNA配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグメ
ント、および真核性転写停止シグナルを含有するDNA
配列を、DNAセグメントの適切な発現と生成したデス
ルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物において行われ
るような態様で連結するすることにより調製される。
例えば真核性発現制御配列、デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のDNA配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグメ
ント、および真核性転写停止シグナルを含有するDNA
配列を、DNAセグメントの適切な発現と生成したデス
ルファトヒルジンの分泌が真核宿主生物において行われ
るような態様で連結するすることにより調製される。
各種DNA配列を連結して本発明のDNA造成物を形成
する場合、この連結は平滑末端連結によって、または適
当な共通の制限部位によって、あるいは合成リンカ−分
子を介して、正確な連結が生じてこれらのDNA配列の
正常な機能が維持されるように特別の注意を払いながら
行う、すなわち、シグナル配列およびデスルファトヒル
ジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合させることが
できる。シグナル配列とデスルファトヒルジン遺伝子と
を正しく連結するためのもう一つの方法においては、可
能ならば、シグナル配列をその3′末端近くで制限酵素
切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝子をその5′
末端近くで制限酵素切断して各配列が所定数の塩基対を
欠くようにする。
する場合、この連結は平滑末端連結によって、または適
当な共通の制限部位によって、あるいは合成リンカ−分
子を介して、正確な連結が生じてこれらのDNA配列の
正常な機能が維持されるように特別の注意を払いながら
行う、すなわち、シグナル配列およびデスルファトヒル
ジン遺伝子は、平滑末端連結によって融合させることが
できる。シグナル配列とデスルファトヒルジン遺伝子と
を正しく連結するためのもう一つの方法においては、可
能ならば、シグナル配列をその3′末端近くで制限酵素
切断し、そしてデスルファトヒルジン遺伝子をその5′
末端近くで制限酵素切断して各配列が所定数の塩基対を
欠くようにする。
次に、制限切断されたシグナル配列と制限切断されたデ
スルファトヒルジン遺伝子とを連結用オリゴデオキシヌ
クレオチドを介して連結した場合に、欠損した塩基対が
修復されてデスルファトヒルジン遺伝子がシグナル配列
に関して適切なリープインフレームになるように、合成
オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを造成することが
できる。
スルファトヒルジン遺伝子とを連結用オリゴデオキシヌ
クレオチドを介して連結した場合に、欠損した塩基対が
修復されてデスルファトヒルジン遺伝子がシグナル配列
に関して適切なリープインフレームになるように、合成
オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを造成することが
できる。
デスルファトヒルジンをコードするDNA配列はヒルの
ゲノムDNAから単離することができ、または相補的二
本鎖デスルファトヒルジンDNA(デスルファトヒルジ
ンdscDNA)をデスルファトヒルジンmRNAから
調製するか、またはデスルファトヒルジンのアミノ酸配
列をコードする遺伝子を化学的または酵素的方法によっ
て調製することができる。例えば、それ自体公知の方法
によって、ゲノム性デスルファトヒルジンDNA。
ゲノムDNAから単離することができ、または相補的二
本鎖デスルファトヒルジンDNA(デスルファトヒルジ
ンdscDNA)をデスルファトヒルジンmRNAから
調製するか、またはデスルファトヒルジンのアミノ酸配
列をコードする遺伝子を化学的または酵素的方法によっ
て調製することができる。例えば、それ自体公知の方法
によって、ゲノム性デスルファトヒルジンDNA。
およびデスルファトヒルジンdscDNAが得られる。
例えば、ゲノム性デスルファトヒルジンDNAは、デス
ルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺伝子バンクか
ら、ヒルDNAフラグメントを微生物中でクローン化し
、デスルファトヒルジンDNAを含有するクローンを、
少なくとも15個の、好ましくは15〜30個のデオキ
シヌクレオチドを含有する放射性ラベル化デスルファト
ヒルジンDNA−特異的オリゴデオキシヌクレオチドを
用いるコロニーハイブリダイゼーションによって同定す
ることによって得られる。得られるDNAフラグメント
は、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の他に不所望の
その他のDNA成分を含むが、これらは適当なエキソヌ
クレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処理することに
よって除去することができる。
ルファトヒルジン遺伝子を含有するヒル遺伝子バンクか
ら、ヒルDNAフラグメントを微生物中でクローン化し
、デスルファトヒルジンDNAを含有するクローンを、
少なくとも15個の、好ましくは15〜30個のデオキ
シヌクレオチドを含有する放射性ラベル化デスルファト
ヒルジンDNA−特異的オリゴデオキシヌクレオチドを
用いるコロニーハイブリダイゼーションによって同定す
ることによって得られる。得られるDNAフラグメント
は、一般にデスルファトヒルジン遺伝子の他に不所望の
その他のDNA成分を含むが、これらは適当なエキソヌ
クレアーゼまたはエンドヌクレアーゼで処理することに
よって除去することができる。
二本鎖デスルファトヒルジンcDNAは、例えば、ヒル
ジンを産生ずるように適切に誘導された適当なヒルの細
胞からmRNAを分離し、それ自体公知の方法で、生成
するmRNA混合物中のデスルファトヒルジンmRNA
を濃縮し、このmRNAを1末鎖cDNAを調製する場
合の鋳型として用い、こうしてRNA依存性のDNAポ
リメラーゼによってdscDNAを合成し、これを適当
なベクター中にクローン化することによって調製するこ
とができる。デスルファトヒルジンcDNAを含むクロ
ーンは、例えば上記の方法で、放射性物質の標識を有す
るデスルファトヒルジンDNA特異的オリゴデオキシヌ
クレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーションに
よって同定される。
ジンを産生ずるように適切に誘導された適当なヒルの細
胞からmRNAを分離し、それ自体公知の方法で、生成
するmRNA混合物中のデスルファトヒルジンmRNA
を濃縮し、このmRNAを1末鎖cDNAを調製する場
合の鋳型として用い、こうしてRNA依存性のDNAポ
リメラーゼによってdscDNAを合成し、これを適当
なベクター中にクローン化することによって調製するこ
とができる。デスルファトヒルジンcDNAを含むクロ
ーンは、例えば上記の方法で、放射性物質の標識を有す
るデスルファトヒルジンDNA特異的オリゴデオキシヌ
クレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーションに
よって同定される。
デスルファトヒルジン遺伝子は、化学的合成によっても
製造することができる。この方法は、上記遺伝子のコー
ド鎖および相補鎖のセグメントを化学的に合成して、生
成するセグメントを酵素的にデスルファトヒルジンの構
造遺伝子へと変換することを特徴とする。
製造することができる。この方法は、上記遺伝子のコー
ド鎖および相補鎖のセグメントを化学的に合成して、生
成するセグメントを酵素的にデスルファトヒルジンの構
造遺伝子へと変換することを特徴とする。
DNAの化学的合成は、当業界において周知であり、常
用技術を用いる。適当な方法は、S、A。
用技術を用いる。適当な方法は、S、A。
Narang (Tetrahedron 、第39巻
、3頁、1983年)によってまとめられている。詳細
には、欧州特許第146.785号明細書記載の方法が
用いられ、詳細は上記明細書を参照されたい。
、3頁、1983年)によってまとめられている。詳細
には、欧州特許第146.785号明細書記載の方法が
用いられ、詳細は上記明細書を参照されたい。
同様な方法でシグナル配列は化学的合成によって調製す
ることができ、または適当な真核生物の染色体DNAか
ら単離することもできる。
ることができ、または適当な真核生物の染色体DNAか
ら単離することもできる。
本発明によれば、真核性発現制御配列と、成熟デスルフ
ァトヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から
成るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上の
DNAインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
ァトヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上
流にありそしてそれとリーディングフレームが合ってい
るシグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から
成るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写
制御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含
んで成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上の
DNAインサートを含んで成るハイブリッド・ベクター
も提供される。
本発明のハイブリッドベクターはハイブリッドプラスミ
ドおよび線状DNAベクターからなる群から選択され、
そして更に形質転換しようとする宿主生物に依存して選
択される。
ドおよび線状DNAベクターからなる群から選択され、
そして更に形質転換しようとする宿主生物に依存して選
択される。
本発明は特に、真核性発現制御配列と、成熟デスルファ
トヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームが合っている
シグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成
るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含ん
で成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上のD
NAインサートを含んで成る線形DNAベクターであっ
て、上記発現制御配列と上記転写停止シグナルを含んで
成る配列とが同じ真核細胞の遺伝子に由来する上記ベク
ターに関する。特に、本発明は、酵母PI+05プロモ
ーター、上記DNAセグメントおよび鷹の3′フランキ
ング領域を含んで成る線状DNAベクターに関する。
トヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流
にありそしてそれとリーディングフレームが合っている
シグナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成
るDNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制
御下にあるものと、真核生物の転写終止シグナルを含ん
で成るDNA配列とをそれぞれが含有する1個以上のD
NAインサートを含んで成る線形DNAベクターであっ
て、上記発現制御配列と上記転写停止シグナルを含んで
成る配列とが同じ真核細胞の遺伝子に由来する上記ベク
ターに関する。特に、本発明は、酵母PI+05プロモ
ーター、上記DNAセグメントおよび鷹の3′フランキ
ング領域を含んで成る線状DNAベクターに関する。
相同な3′フランキング配列および5′フランキング配
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状DNAベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母PII05プロ
モーターおよび酵母PH05遺伝子の3′フランキング
配列の場合には、酵母染色体■のPH05座に組み込ま
れる。
列により、シグナルペプチドおよびデスルファトヒルジ
ンのコード領域を含有する全体線状DNAベクターは安
定に対応する宿主染色体、すなわち酵母PII05プロ
モーターおよび酵母PH05遺伝子の3′フランキング
配列の場合には、酵母染色体■のPH05座に組み込ま
れる。
本発明はまた特に、発現制御配列、上記DNA配列、お
よび転写停止シグナルを含む配列とは別に、プロモータ
の機能、すなわちデスルファトヒルジン遺伝子の発現に
は本質的ではないがまたは余り重要でないが、例えば上
記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に
おいては重要な機能を行うDNA配列を有するハイブリ
ッドプラスミドに関する。この追加のDNA配列は、原
核生物および/または真核生物の細胞に由来するもので
もよく、染色体DNA配列および/または染色体外DN
A配列を含有するものでもよい。例えば、この追加のD
NA配列はプラスミドDNA、例えば細菌または真核生
物のプラスミドDNA、ウィルスのDNA、および/ま
たは染色体DNA。
よび転写停止シグナルを含む配列とは別に、プロモータ
の機能、すなわちデスルファトヒルジン遺伝子の発現に
は本質的ではないがまたは余り重要でないが、例えば上
記ハイブリッドプラスミドで形質転換した細胞の増殖に
おいては重要な機能を行うDNA配列を有するハイブリ
ッドプラスミドに関する。この追加のDNA配列は、原
核生物および/または真核生物の細胞に由来するもので
もよく、染色体DNA配列および/または染色体外DN
A配列を含有するものでもよい。例えば、この追加のD
NA配列はプラスミドDNA、例えば細菌または真核生
物のプラスミドDNA、ウィルスのDNA、および/ま
たは染色体DNA。
例えば細菌、酵母または高等真核生物の染色体DNAに
由来する(またはこれらから成る)ものでもよい。好ま
しいハイブリッドプラスミドは、細菌性プラスミド、特
にE、コリプラスミドpBR322、または関連するプ
ラスミド、バクテリオファージλ・酵母2μプラスミド
および/または酵母染色体DNAに由来するDNA配列
も含む。
由来する(またはこれらから成る)ものでもよい。好ま
しいハイブリッドプラスミドは、細菌性プラスミド、特
にE、コリプラスミドpBR322、または関連するプ
ラスミド、バクテリオファージλ・酵母2μプラスミド
および/または酵母染色体DNAに由来するDNA配列
も含む。
本発明による好ましいハイブリッドプラスミドにおいて
は、これらの追加のDNA配列は酵母複製開始点および
酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵母複製開始点
、例えば自律複製セグメント(ars)を含有するハイ
ブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母細胞内で染色
体外に維持され、有余***の際に自律複製する。酵母2
μプラスミドDNAと相同な配列を有するハイブリッド
プラスミドも、同様に用いられる。これらのハイブリ、
ドブラスミドは組換によって既に存在している2μプラ
スミドに組み込まれ、または自律複製を行う。
は、これらの追加のDNA配列は酵母複製開始点および
酵母用選択遺伝子マーカーを担持する。酵母複製開始点
、例えば自律複製セグメント(ars)を含有するハイ
ブリッドプラスミドは、形質転換後に酵母細胞内で染色
体外に維持され、有余***の際に自律複製する。酵母2
μプラスミドDNAと相同な配列を有するハイブリッド
プラスミドも、同様に用いられる。これらのハイブリ、
ドブラスミドは組換によって既に存在している2μプラ
スミドに組み込まれ、または自律複製を行う。
酵母の選択遺伝子マーカーについては、マーカーの表現
型発現により形質転換体の選択を容易にするものであれ
ば、いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。
型発現により形質転換体の選択を容易にするものであれ
ば、いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。
酵母に好適なマーカーは特に、抗生物質耐性を発現する
ものであるか、または栄養要求酵母変異株の場合には、
宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロへキサミドに対する耐性を
付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例えば0RAL
、URA3、ARG4. UEU2、HIS4、HIS
3、TRP5または里遺伝子に原栄養性を付与する。
ものであるか、または栄養要求酵母変異株の場合には、
宿主の損傷部を補完する遺伝子である。対応する遺伝子
は、例えば抗生物質のシクロへキサミドに対する耐性を
付与し、あるいは栄養要求酵母変異株、例えば0RAL
、URA3、ARG4. UEU2、HIS4、HIS
3、TRP5または里遺伝子に原栄養性を付与する。
本発明のハイブリッドプラスミドに存在するその他のD
NA配列はまた、細菌宿主、特にE、コリの複製開始点
および選択遺伝子マーカーを含有するのが有利である。
NA配列はまた、細菌宿主、特にE、コリの複製開始点
および選択遺伝子マーカーを含有するのが有利である。
酵母ハイブリッドプラスミド中にE、コリ複製開始点お
よびE、コリマーカーが存在することに関連する有用な
特徴がある。
よびE、コリマーカーが存在することに関連する有用な
特徴がある。
第一に、E、コリにおける増殖及び増幅により多量のハ
イブリッドプラスミドDNAを得ることができ、第二に
、E、コリに基礎を置くクローン化技術の全レパートリ
−を用いてE、コリ中でハイブリッドプラスミドを便利
に造成することである。
イブリッドプラスミドDNAを得ることができ、第二に
、E、コリに基礎を置くクローン化技術の全レパートリ
−を用いてE、コリ中でハイブリッドプラスミドを便利
に造成することである。
pBR322などのE、コリプラスミドは、E、コリ複
製開始点、並びに例えばテトラサイクリンおよびアンピ
シリンのような抗生物質に対する耐性を付与するE、コ
リ遺伝子マーカーを含み、酵母ハイブリッドベクターの
一部分として有利に用いられる。
製開始点、並びに例えばテトラサイクリンおよびアンピ
シリンのような抗生物質に対する耐性を付与するE、コ
リ遺伝子マーカーを含み、酵母ハイブリッドベクターの
一部分として有利に用いられる。
酵母および細菌宿主(上記参照のこと)の複製開始点お
よび遺伝子マーカーを含有する追加のDNA配列は、こ
れ以後は[ベクターDNAJと称し、特に発現制御配列
およびデスルファトヒルジン遺伝子を含む上記DNA造
成物と共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成して
いる。
よび遺伝子マーカーを含有する追加のDNA配列は、こ
れ以後は[ベクターDNAJと称し、特に発現制御配列
およびデスルファトヒルジン遺伝子を含む上記DNA造
成物と共に本発明のハイブリッドプラスミドを構成して
いる。
本発明のハイブリッドベクターは1個以上のDNAイン
サートを含有し、これらのインサートのそれぞれは特に
、発現制御配列、シグナルペプチドをコードするDNA
配列、および成熟デスルファトヒルジンをコードするD
NA配列を含有するであろう。ハイブリッドベクターが
複数のDNAインサート、好ましくは2〜4個のDNA
インサートを含有する場合には、これらは縦列(tan
de+w)に並んでいてもよくまたはハイブリッドベク
ターの異なる部位に存在することもできる。好ましいハ
イブリッドベクターは1個のDNAインサートまたは縦
列(tandea+)に並んだDNAインサートを含む
。DNAインサートは、特に頭対尾に配置される。
サートを含有し、これらのインサートのそれぞれは特に
、発現制御配列、シグナルペプチドをコードするDNA
配列、および成熟デスルファトヒルジンをコードするD
NA配列を含有するであろう。ハイブリッドベクターが
複数のDNAインサート、好ましくは2〜4個のDNA
インサートを含有する場合には、これらは縦列(tan
de+w)に並んでいてもよくまたはハイブリッドベク
ターの異なる部位に存在することもできる。好ましいハ
イブリッドベクターは1個のDNAインサートまたは縦
列(tandea+)に並んだDNAインサートを含む
。DNAインサートは、特に頭対尾に配置される。
本発明によりハイブリッドプラスミドは、当業界におい
て公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの調
製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファト
ヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成る
DNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御
下にあるものと、真核生物の転写停止シグナルを含有す
るDNA配列とを含有する1個又は複数個のDNA造成
物をベクターDNAに導入するか、あるいは上記DNA
造成物の構成成分を所定の順序でベクターDNA中に逐
次的に導入することから成っている。本発明のハイブリ
ッドプラスミドは常用の連結技術を用いて造成される。
て公知の方法で調製される。ハイブリッドベクターの調
製法は、真核生物の発現制御配列と、成熟デスルファト
ヒルジンをコードする第二のDNA配列及びその上流に
ありそしてそれとリーディングフレームが合っているシ
グナルペプチドをコードする第一のDNA配列から成る
DNAセグメントであって上記発現制御配列の転写制御
下にあるものと、真核生物の転写停止シグナルを含有す
るDNA配列とを含有する1個又は複数個のDNA造成
物をベクターDNAに導入するか、あるいは上記DNA
造成物の構成成分を所定の順序でベクターDNA中に逐
次的に導入することから成っている。本発明のハイブリ
ッドプラスミドは常用の連結技術を用いて造成される。
プラスミドの成分は、共通の制限部位を介して、および
/または合成リンカ−分子により、および/またはブラ
ーント末・端連結によって連結される。
/または合成リンカ−分子により、および/またはブラ
ーント末・端連結によって連結される。
本発明の線形DNAベクターは、本質的に第2節に記載
のDNA造成物に対応し、そして同様な方法で調製され
る。
のDNA造成物に対応し、そして同様な方法で調製され
る。
4、7 − れた ケ
本発明のもう一つの観点は、真核生物の発現制御配列と
、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のDNA
配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフレ
ームが合っているシグナルペプチドをコードする第一の
DNA配列から成るDNAセグメントであって上記発現
制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写停
止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが含有
する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイブリ
ッドベクターで形質転換された真核生物およびそれらの
変異株に関する。
、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のDNA
配列及びその上流にありそしてそれとリーディングフレ
ームが合っているシグナルペプチドをコードする第一の
DNA配列から成るDNAセグメントであって上記発現
制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転写停
止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが含有
する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイブリ
ッドベクターで形質転換された真核生物およびそれらの
変異株に関する。
好適な真核宿主生物は、特に上記のものであり、特に、
クルイベロミセス」違1■胚」1特) 、キャンディダ
(Candida) 、ピヒア(Pichia)、ヤロ
ウイア(Yarrowia) 、サツカロミセス旦匹吐
肛姐り且)、シッオサッカロミセスーQ堕1仔l狙勅1
1ジμ狙)、トルロプシス(ハ匹旦■亘)属および関連
の属(J、Lodder 、、 The Yeasts
sアムステルダム、1971年を参照されたい)であり
、特にサツカロミセス・セLzヒシエ−(Sa匹血皿肚
並L」匹■虹ヤ)ノ株がある。
クルイベロミセス」違1■胚」1特) 、キャンディダ
(Candida) 、ピヒア(Pichia)、ヤロ
ウイア(Yarrowia) 、サツカロミセス旦匹吐
肛姐り且)、シッオサッカロミセスーQ堕1仔l狙勅1
1ジμ狙)、トルロプシス(ハ匹旦■亘)属および関連
の属(J、Lodder 、、 The Yeasts
sアムステルダム、1971年を参照されたい)であり
、特にサツカロミセス・セLzヒシエ−(Sa匹血皿肚
並L」匹■虹ヤ)ノ株がある。
形質転換された真核宿主細胞は、真核生物の発現制御配
列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のD
NA配列及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードする第
一のDNA配列から成るDNAセグメントであって上記
発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転
写停止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが
含有する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイ
ブリッドプラスミドで形質転換され真核宿主生物、並び
に宿主の染色体に安定に組み込まれた上記DNAインサ
ートを有する真核宿主生物がら選択される。
列と、成熟デスルファトヒルジンをコードする第二のD
NA配列及びその上流にありそしてそれとリーディング
フレームが合っているシグナルペプチドをコードする第
一のDNA配列から成るDNAセグメントであって上記
発現制御配列の転写制御下にあるものと、真核生物の転
写停止シグナルを含んで成るDNA配列とをそれぞれが
含有する1個以上のDNAインサートを含んで成るハイ
ブリッドプラスミドで形質転換され真核宿主生物、並び
に宿主の染色体に安定に組み込まれた上記DNAインサ
ートを有する真核宿主生物がら選択される。
上記形質転換された真核宿主生物の製造法は、真核生物
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のDNA配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のDNA配列から成るDNAセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るDNA配列と
をそれぞれが含有する1個以上のDNAインサートを含
んで成るハイブリッドベクターにより真核宿主生物を形
質転換することを含んで成る。
の発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコード
する第二のDNA配列及びその上流にありそしてそれと
リーディングフレームが合っているシグナルペプチドを
コードする第一のDNA配列から成るDNAセグメント
であって上記発現制御配列の転写制御下にあるものと、
真核生物の転写停止シグナルを含んで成るDNA配列と
をそれぞれが含有する1個以上のDNAインサートを含
んで成るハイブリッドベクターにより真核宿主生物を形
質転換することを含んで成る。
真核宿主細胞の形質転換は、当業界において知られてい
る方法によって行われる。例えば、酵母のハイブリッド
ベクターを用いる形質転換は、Hinnenらの記載の
方法により行うことができる(Proc、Natl、A
cad、Set+ 、、USA 、第75巻、1929
頁(1978年)〕。この方法は、3段階に分けること
ができる。
る方法によって行われる。例えば、酵母のハイブリッド
ベクターを用いる形質転換は、Hinnenらの記載の
方法により行うことができる(Proc、Natl、A
cad、Set+ 、、USA 、第75巻、1929
頁(1978年)〕。この方法は、3段階に分けること
ができる。
(1)カタツムリ消化管汁〔例えばGlusulase
(登録商標)またはHe1icase (登録商標)〕
のような各種グルコシダーゼ製剤、または微生物から得
られる酵素混合物〔例えばZymolyase(登録商
標)〕を、浸透圧的に安定した溶液(例えば1Mソルビ
トール)において用いる酵母細胞壁またはその部分の除
去。
(登録商標)またはHe1icase (登録商標)〕
のような各種グルコシダーゼ製剤、または微生物から得
られる酵素混合物〔例えばZymolyase(登録商
標)〕を、浸透圧的に安定した溶液(例えば1Mソルビ
トール)において用いる酵母細胞壁またはその部分の除
去。
(2)PEG (ポリエチレングリコール)およびCa
”イオンの存在での、DNAベクターによる「裸の」酵
母細胞(スフェロプラスト)の処理。
”イオンの存在での、DNAベクターによる「裸の」酵
母細胞(スフェロプラスト)の処理。
(3)寒天の固相における細胞壁の再生および形質転換
された細胞の選定。この再生は、スフェロプラストを寒
天中に埋め込むことによって好都合に行われる6例えば
、溶融した寒天(50”c)をスフェロプラストと混合
する。溶液を酵母の増殖温度(約30℃)にまで冷却す
ることにより固層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須の高分子の速やかな拡散と損失を防止
するためのものであり、それにより細胞壁の再生が促進
される。しかしながら、細胞壁の再生は、予め形成して
おいた寒天層の表面にスフェロプラストをプレートする
ことによっても(効率は低いが)得ることができる。
された細胞の選定。この再生は、スフェロプラストを寒
天中に埋め込むことによって好都合に行われる6例えば
、溶融した寒天(50”c)をスフェロプラストと混合
する。溶液を酵母の増殖温度(約30℃)にまで冷却す
ることにより固層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須の高分子の速やかな拡散と損失を防止
するためのものであり、それにより細胞壁の再生が促進
される。しかしながら、細胞壁の再生は、予め形成して
おいた寒天層の表面にスフェロプラストをプレートする
ことによっても(効率は低いが)得ることができる。
再生寒天は、形質転換された細胞の再生と選定が同時に
起るような方法で調製するのが好ましい。
起るような方法で調製するのが好ましい。
一般的には選択マーカー(上述)としてアミノ酸生合成
経路の酵素をコードする酵母遺伝子が用いられるので、
再生は好ましくは酵母の最少寒天中で行われる。極めて
高効率の再生が必要とされる場合には、次の2段階処理
が有利である。すなわち、(1)高濃度の複合培地中で
の細胞壁の再生、および(2)選択寒天平板上に細胞層
をレプリカプレートすることによる形質転換された細胞
の選定。
経路の酵素をコードする酵母遺伝子が用いられるので、
再生は好ましくは酵母の最少寒天中で行われる。極めて
高効率の再生が必要とされる場合には、次の2段階処理
が有利である。すなわち、(1)高濃度の複合培地中で
の細胞壁の再生、および(2)選択寒天平板上に細胞層
をレプリカプレートすることによる形質転換された細胞
の選定。
上記線状DNAベクターを用いて真核宿主細胞を形質転
換する場合には、形質転換は好ましくは、酵母の選択マ
ーカーを有する第二のベクターの存在下で行われる。こ
の同時形質転換によると、直接的には選択することがで
きないDNAを取り込んだ宿主細胞を濃縮することがで
きる。コンピテント細胞はいかなる型のDNAをも取り
込むので、選択ベクターで形質転換された細胞はその他
のDNA (例えば上記線形DNAベクター)をも高い
比率で担持するであろう。
換する場合には、形質転換は好ましくは、酵母の選択マ
ーカーを有する第二のベクターの存在下で行われる。こ
の同時形質転換によると、直接的には選択することがで
きないDNAを取り込んだ宿主細胞を濃縮することがで
きる。コンピテント細胞はいかなる型のDNAをも取り
込むので、選択ベクターで形質転換された細胞はその他
のDNA (例えば上記線形DNAベクター)をも高い
比率で担持するであろう。
形質転換された真核宿主生物、特に形質転換された酵母
株であって、本発明のハイブリッドプラスミドを含有す
るか、または宿主染色体に安定に組み込まれたデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を含んで成る線状DNAベクターを
有するものは、当業界において知られている方法を用い
て変異および選択によってデスルファトヒルジンの産生
を向上させることができる。突然変異は、例えば、紫外
線照射または適当な化合物によって行うことができる。
株であって、本発明のハイブリッドプラスミドを含有す
るか、または宿主染色体に安定に組み込まれたデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を含んで成る線状DNAベクターを
有するものは、当業界において知られている方法を用い
て変異および選択によってデスルファトヒルジンの産生
を向上させることができる。突然変異は、例えば、紫外
線照射または適当な化合物によって行うことができる。
特に絆ましいものは、プロテアーゼを欠損した変異体、
特に酵母変異体であって、細胞内で生成したデスルファ
トヒルジン蛋白質の分解を避けるようにしたものである
。好適な変異体は、常用の手段で選定して単離すること
ができる。
特に酵母変異体であって、細胞内で生成したデスルファ
トヒルジン蛋白質の分解を避けるようにしたものである
。好適な変異体は、常用の手段で選定して単離すること
ができる。
本発明は、特に、デスルファトヒルジン遺伝子を含有す
るDNA造成物、ハイブリッドベクター、形質転換され
た真核宿主生物およびそれらの調製法、並びに実施例に
記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋白質の製造方
法に関する。
るDNA造成物、ハイブリッドベクター、形質転換され
た真核宿主生物およびそれらの調製法、並びに実施例に
記載する方法でのヒルジン活性を有する蛋白質の製造方
法に関する。
以下の実験の部では、本発明の各ll1fLi様を添附
図面に言及しながら説明する。
図面に言及しながら説明する。
次の実施例は本発明を説明するためのものであり、発明
の範囲を制限することを意図するものではない。
の範囲を制限することを意図するものではない。
1114皿
実施例に用いた略号の意味は次の通りである。
TNE : 100mMNaC1,50mM トリ
ス−HCI(pH7,5)および5mMEDTAを含む
溶液、SDS ニドデシル硫酸ナトリウム、EDTA
:エチレンジアミン四酢酸、DTT : 1 、4
−ジチオスレイトール(1,4−ジメルカプト−2,3
−ブタンジオール)、BS八 二ウシ血清アルブミン、 ELBr :エチジウムプロミド、 tris:)リス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタ
ン、 tris−HClニドリス・−塩酸塩。
ス−HCI(pH7,5)および5mMEDTAを含む
溶液、SDS ニドデシル硫酸ナトリウム、EDTA
:エチレンジアミン四酢酸、DTT : 1 、4
−ジチオスレイトール(1,4−ジメルカプト−2,3
−ブタンジオール)、BS八 二ウシ血清アルブミン、 ELBr :エチジウムプロミド、 tris:)リス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタ
ン、 tris−HClニドリス・−塩酸塩。
以下余白
〔実施例〕
1間lΩ製造
無水コハク酸750mgおよび4−ジメチルアミノピリ
ジン910m gを、5’−(4−メトキシトリチル)
−チミジン(MMT−0−T−OH)2.57g(5ミ
リモル)を無水ピリジン20 m lに溶解したものに
加え、混合物を室温で16時間放置する。ピリジン溶液
を濃縮した後、酢酸エチル200m lに入れ、0.1
Mリン酸緩衝液200m1ずつにlQmlの飽和塩化
ナトリウム溶液を加えたもので2回振盪することによっ
て抽出し、飽和塩化ナトリウムで再度洗浄し、乾燥し、
濃縮し、そしてヘキサンを滴下して加える。沈澱した生
成物を分離して、エーテルと共に2回すりつぶした後、
0℃で0.1 M硫酸水素カリウム(pH2,5) 1
80m lと共に振盪して抽出する。水で2回洗浄した
後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し
て、ピリジン0.5mlを加え、混合物を濃縮し、ヘキ
サンを滴下して加えることによって希釈する。
ジン910m gを、5’−(4−メトキシトリチル)
−チミジン(MMT−0−T−OH)2.57g(5ミ
リモル)を無水ピリジン20 m lに溶解したものに
加え、混合物を室温で16時間放置する。ピリジン溶液
を濃縮した後、酢酸エチル200m lに入れ、0.1
Mリン酸緩衝液200m1ずつにlQmlの飽和塩化
ナトリウム溶液を加えたもので2回振盪することによっ
て抽出し、飽和塩化ナトリウムで再度洗浄し、乾燥し、
濃縮し、そしてヘキサンを滴下して加える。沈澱した生
成物を分離して、エーテルと共に2回すりつぶした後、
0℃で0.1 M硫酸水素カリウム(pH2,5) 1
80m lと共に振盪して抽出する。水で2回洗浄した
後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し
て、ピリジン0.5mlを加え、混合物を濃縮し、ヘキ
サンを滴下して加えることによって希釈する。
沈澱したコハク酸誘導体を濾別する。この化合物1、O
gfN−ヒドロキシスクシンイミド190m gと共に
酢酸エチル4mlおよびジメチルホルムアミド2mlに
溶解し、370mgのN、N’−ジシクロヘキシル功ル
ボジイミドを0℃で加える。冷蔵庫に一晩放置した後、
沈澱したN、N’−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾
液を酢酸エチルで希釈し、O,’ I M重炭酸ナトリ
ウムと水で抽出して、乾燥し、真空で蒸発させて濃縮乾
固する。残渣をシリカゲル上で酢酸エチルによりクロマ
トグラフ処理する。
gfN−ヒドロキシスクシンイミド190m gと共に
酢酸エチル4mlおよびジメチルホルムアミド2mlに
溶解し、370mgのN、N’−ジシクロヘキシル功ル
ボジイミドを0℃で加える。冷蔵庫に一晩放置した後、
沈澱したN、N’−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾
液を酢酸エチルで希釈し、O,’ I M重炭酸ナトリ
ウムと水で抽出して、乾燥し、真空で蒸発させて濃縮乾
固する。残渣をシリカゲル上で酢酸エチルによりクロマ
トグラフ処理する。
TLC: Rf =0.45 (ジクロロメタン/メタ
ノール=9 : 1)。
ノール=9 : 1)。
このN−スクシンイミドイルコハク酸エステル(100
mg)を、アミノメチルポリスチレン(Ig。
mg)を、アミノメチルポリスチレン(Ig。
アミン含量110#M/g)をジクロロメタン2m1お
よびジメチルホルムアミド4mlに入れたものと共に2
0時間攪拌する。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルム
アミド、メタノール、ジクロロメタンおよびメタノール
で洗浄することによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリ
ジン6ml中で無水酢酸1mlおよび4−ジメチルアミ
ノピリジン100mgと共に30分間攪拌することによ
って、反応しなかったアミノ基をアセチル化する。ポリ
マー樹脂を、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、
メタノールおよびジクロロメタンで洗浄することによっ
て抽出し、恒量に達するまで乾燥する。メトキシトリチ
ル(MMT)の分光分析によれば57μM/gの付加量
である。
よびジメチルホルムアミド4mlに入れたものと共に2
0時間攪拌する。ポリマー樹脂を濾別しジメチルホルム
アミド、メタノール、ジクロロメタンおよびメタノール
で洗浄することによって抽出する。乾燥後、樹脂をピリ
ジン6ml中で無水酢酸1mlおよび4−ジメチルアミ
ノピリジン100mgと共に30分間攪拌することによ
って、反応しなかったアミノ基をアセチル化する。ポリ
マー樹脂を、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、
メタノールおよびジクロロメタンで洗浄することによっ
て抽出し、恒量に達するまで乾燥する。メトキシトリチ
ル(MMT)の分光分析によれば57μM/gの付加量
である。
1隻■久
次の保護されたヌクレオシド/ポリスチレン樹脂を、実
施例1と同様の方法で製造する。
施例1と同様の方法で製造する。
5’−(4−メトキシトリチル)−N−イソブチリル−
デオキシグアノシンから。32μM/gの付加量。
デオキシグアノシンから。32μM/gの付加量。
以下余白
5’−(4−メトキシトリチル)−チミジン(MMT−
0−T−OH) 7.73g (15mモル)を無水ピ
リジンと共に蒸発させることによって2回濃縮する。残
渣を無水テトラヒドロフラン20m1に溶解し、0.2
Mの2−クロロフェニル−ジー(1−ベンゾトリアゾ
リル)−ホスフェート/テトラヒト・ロフラン溶液80
m1に、攪拌しそして水分を除きながら滴下して加え、
反応混合物を1時間室温で攪拌する。生成する2−クロ
ロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5’−(4−メ
トキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェートを3つ
の部分に分割する。
0−T−OH) 7.73g (15mモル)を無水ピ
リジンと共に蒸発させることによって2回濃縮する。残
渣を無水テトラヒドロフラン20m1に溶解し、0.2
Mの2−クロロフェニル−ジー(1−ベンゾトリアゾ
リル)−ホスフェート/テトラヒト・ロフラン溶液80
m1に、攪拌しそして水分を除きながら滴下して加え、
反応混合物を1時間室温で攪拌する。生成する2−クロ
ロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5’−(4−メ
トキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェートを3つ
の部分に分割する。
0.5M重炭酸トリエチルアンモニウム100m1を上
記2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5’
−(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホスフ
ェートの溶液の3分の1に、冷却しながら加える。15
分後に、ジクロロメタンで抽出を行う、ジクロロメタン
溶液を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しな
がら加える。
記2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5’
−(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホスフ
ェートの溶液の3分の1に、冷却しながら加える。15
分後に、ジクロロメタンで抽出を行う、ジクロロメタン
溶液を水で洗浄し、濃縮して、石油エーテルを滴下しな
がら加える。
生成する沈澱を吸引濾別し、エーテル/石油エーテル=
1:1で洗浄し、真空で乾燥する。
1:1で洗浄し、真空で乾燥する。
T L C: Rr O,35(ジクロロメタン/メタ
ノール/水=75:22:3)。
ノール/水=75:22:3)。
(β)4−メトキシド1チル i・−の7、 び2−
シアノエチル−2−クロロフェニル−5′−(4−メト
キシ 1チル −チミジンー2−シアノエタノールl、
3 m lおよびピリジン2mlを、2−クロロフェ
ニル′−1−ベンゾトリアゾリル−5’−(4−メトキ
シトリチル)−チミジン−3′−ホスフェートの溶液の
3分の1に加える。混合物を室温で一晩放置する。溶媒
を真空で留去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、0.1M
リン酸緩衝液(pt17)と水で振盪することによって
繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサ
ンに滴下して加える。沈澱を濾別して、ジクロロメタン
/メタノール(7:3)50mlにljl、0℃でp−
)ルエンースルホン酸−水和物3,8gをジクロロメタ
ン/メタノール(7: 3)75mlに溶解した溶液を
加える。2時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し
て、冷重炭酸ナトリウム溶液と共に振盪して抽出する。
シアノエチル−2−クロロフェニル−5′−(4−メト
キシ 1チル −チミジンー2−シアノエタノールl、
3 m lおよびピリジン2mlを、2−クロロフェ
ニル′−1−ベンゾトリアゾリル−5’−(4−メトキ
シトリチル)−チミジン−3′−ホスフェートの溶液の
3分の1に加える。混合物を室温で一晩放置する。溶媒
を真空で留去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、0.1M
リン酸緩衝液(pt17)と水で振盪することによって
繰り返し抽出する。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサ
ンに滴下して加える。沈澱を濾別して、ジクロロメタン
/メタノール(7:3)50mlにljl、0℃でp−
)ルエンースルホン酸−水和物3,8gをジクロロメタ
ン/メタノール(7: 3)75mlに溶解した溶液を
加える。2時間後、反応溶液をジクロロメタンで希釈し
て、冷重炭酸ナトリウム溶液と共に振盪して抽出する。
有機相を濃縮し、そしてヘキサンを加える。沈澱した2
−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミジン−以下
余白 3′−ホスフェートを、シリカゲル上でジクロロメタン
/メタノール(96: 4)を用いてクロマトグラフ処
理する。
−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミジン−以下
余白 3′−ホスフェートを、シリカゲル上でジクロロメタン
/メタノール(96: 4)を用いてクロマトグラフ処
理する。
TLC: Rt O,45(ジクロロメタン/メタノー
ル=9 : 1) 。
ル=9 : 1) 。
2−シアノエチル−2−クロロフェニル−チミジン−3
′−ホスフェート2.2gを、無水ピリジンで2回蒸発
させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テト
ラヒドロフラン20 m lに溶解して、残りの3分の
1の2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5
’−(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホス
フェートに加える。室温にて18時間後に、水10m1
および酢酸エチル200m lを、水冷しながら反応溶
液に加える。有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと
水とで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃
縮する。ホスフェート残基と5′−および3−末端が保
護されたジヌクレオチドを、エーテル/ヘキサン=1:
1に滴下して加えることによって沈澱せせる。
′−ホスフェート2.2gを、無水ピリジンで2回蒸発
させることによって濃縮して脱水し、生成物を無水テト
ラヒドロフラン20 m lに溶解して、残りの3分の
1の2−クロロフェニル−1−ベンゾトリアゾリル−5
’−(4−メトキシトリチル)−チミジン−3′−ホス
フェートに加える。室温にて18時間後に、水10m1
および酢酸エチル200m lを、水冷しながら反応溶
液に加える。有機相を、繰り返して重炭酸ナトリウムと
水とで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、小容積に濃
縮する。ホスフェート残基と5′−および3−末端が保
護されたジヌクレオチドを、エーテル/ヘキサン=1:
1に滴下して加えることによって沈澱せせる。
’rt、c : Rt O,48(ジクロロメタン/メ
タノール9:1)。
タノール9:1)。
(b) 1ヌクレオチドの合成
上記の完全に保護されたジヌクレオチド1.17g(1
mモル)をジクロロメタン/メタノール(7:3)30
mlに氷冷しながら溶解し、p−)ルエンスルホン酸・
−水和物1.9gをジクロロメタン/メタノール(7:
3)20mlに溶解したものを加える。2時間後に、
氷冷した重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタン
で抽出を行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに
滴下して加える。沈澱した遊離の5′−ヒドロキシ基を
有する粗製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で2〜8
%のメタノール/ジクロロメタンのグラジェントにより
クロマトグラフ処理する。
mモル)をジクロロメタン/メタノール(7:3)30
mlに氷冷しながら溶解し、p−)ルエンスルホン酸・
−水和物1.9gをジクロロメタン/メタノール(7:
3)20mlに溶解したものを加える。2時間後に、
氷冷した重炭酸ナトリウム溶液を加え、ジクロロメタン
で抽出を行う。有機相を乾燥し、濃縮して、ヘキサンに
滴下して加える。沈澱した遊離の5′−ヒドロキシ基を
有する粗製のジヌクレオチドを、シリカゲル上で2〜8
%のメタノール/ジクロロメタンのグラジェントにより
クロマトグラフ処理する。
TLC: Rf O,33(ジクロロメタン/メタノー
ル9:l)。
ル9:l)。
この5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド850mgとト
リエチルアンモニウム−2−クロロフェニル−5’−(
4−メトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェート
1.06g (Ca)(α)節を参照されたい〕をピリ
ジンと共に蒸発させて2回濃縮し、次いで無水ピリジン
10m1に溶解し、1−メシチレンスルホニル−3−二
トロー1,2゜4−トリアゾール(MSNT) 560
nl gを加える。2時間後に、氷冷水2mlを加え、
更に1時間後にジクロロメタンを用いて抽出を行う。有
機相を飽和の重炭酸ナトリウムと水とで洗浄し、乾燥し
て、濃縮し、エーテルを加える。沈澱したトリヌクレオ
チドを、シリカゲル上でクロマトグラフィによって精製
する。
リエチルアンモニウム−2−クロロフェニル−5’−(
4−メトキシトリチル)−チミジン3′−ホスフェート
1.06g (Ca)(α)節を参照されたい〕をピリ
ジンと共に蒸発させて2回濃縮し、次いで無水ピリジン
10m1に溶解し、1−メシチレンスルホニル−3−二
トロー1,2゜4−トリアゾール(MSNT) 560
nl gを加える。2時間後に、氷冷水2mlを加え、
更に1時間後にジクロロメタンを用いて抽出を行う。有
機相を飽和の重炭酸ナトリウムと水とで洗浄し、乾燥し
て、濃縮し、エーテルを加える。沈澱したトリヌクレオ
チドを、シリカゲル上でクロマトグラフィによって精製
する。
R,0,45(ジクロロメタン/メタノール9;1)。
実1」0ユ
実施例3と同様にして、下記の一般式
を有し、BI B” B’と略記される保護されたトリ
ヌクレオチドを製造する。以下の略号をヌクレオシドB
l、B2、B3に用いる。すなわち、A=N−ベンゾイ
ル−デオキシアデノシン、C=N−ベンゾイル−デオキ
シシチジン、G=N−イソブチリル−デオキシグアノシ
ン、T=チミジン。
ヌクレオチドを製造する。以下の略号をヌクレオシドB
l、B2、B3に用いる。すなわち、A=N−ベンゾイ
ル−デオキシアデノシン、C=N−ベンゾイル−デオキ
シシチジン、G=N−イソブチリル−デオキシグアノシ
ン、T=チミジン。
進イ11−一一−に/−人 Ra)TTT
O,45^TG O,48TTCO
,55ACT O,53TCT
O,46ACCO,48ム Ra)
A Rげ)TAC0,56ATT
O,55TGCO,44ACA O,
53TAG O,6OAACO,46↑G
T O,42八AA
O,51TGA O,44AGT
O,45、CTT O,53
AGG O,38CTG
O,46GTT O,45CCT
O,45GTCO,44CCCO,59GTG
O,35CCG O,47G
CA O,49CCA 0.
51 GCG O,48CA
T O,55GAT O,4
4CACO,51GACO,48 CGCO,46GAG O,48CGA
O,3B ’ G
AA O,50CAG
O,44GGCO,42CGG O
,38GGT O,46CGT
O,49GGG O,35GGA
0.44 a)シリカゲル上でのジクロロメタン/メタノール9:
1での薄層クロマトグラム。
O,45^TG O,48TTCO
,55ACT O,53TCT
O,46ACCO,48ム Ra)
A Rげ)TAC0,56ATT
O,55TGCO,44ACA O,
53TAG O,6OAACO,46↑G
T O,42八AA
O,51TGA O,44AGT
O,45、CTT O,53
AGG O,38CTG
O,46GTT O,45CCT
O,45GTCO,44CCCO,59GTG
O,35CCG O,47G
CA O,49CCA 0.
51 GCG O,48CA
T O,55GAT O,4
4CACO,51GACO,48 CGCO,46GAG O,48CGA
O,3B ’ G
AA O,50CAG
O,44GGCO,42CGG O
,38GGT O,46CGT
O,49GGG O,35GGA
0.44 a)シリカゲル上でのジクロロメタン/メタノール9:
1での薄層クロマトグラム。
実施例3または4からのトリヌクレオチド10Mモルを
、水分を除いて、ピリジン/アセトニトリル/トリエチ
ルアミン(1:1:1)60μlに溶解する。室温で1
時間後に過酸化物のないエーテルQ0mlを滴下して加
え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエチ
ルアンモニウム塩をピリジン50μlに溶解し、エーテ
ル0.5mlで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で1
5時間乾燥する。
、水分を除いて、ピリジン/アセトニトリル/トリエチ
ルアミン(1:1:1)60μlに溶解する。室温で1
時間後に過酸化物のないエーテルQ0mlを滴下して加
え、沈澱を遠心分離によって取り出す。粗製のトリエチ
ルアンモニウム塩をピリジン50μlに溶解し、エーテ
ル0.5mlで再度沈澱させ、遠心分離し、高真空で1
5時間乾燥する。
総ての操作を、容量が220μlの反応容器中でマイク
ロプロセッサ−で制御して溶媒および試薬を添加するこ
とにより水分を除いて行う。チミジン/ポリスチレン樹
脂(実施例1)13mg(0,74Mモル)を反応容器
に入れて、次の操作を行う。
ロプロセッサ−で制御して溶媒および試薬を添加するこ
とにより水分を除いて行う。チミジン/ポリスチレン樹
脂(実施例1)13mg(0,74Mモル)を反応容器
に入れて、次の操作を行う。
1、塩化メチレン、2m1Z分、4分間、2、塩化メチ
レン/イソプロパツール(85: 15)、2m1Z分
、2分間、 3、塩化メチレン/イソプロパツール(85: 15)
中に臭化亜鉛IMおよび1.2.4−1−リアゾール0
.02M、 2 m l 7分、2〜3.5分間、4、
塩化メチレン/イソプロパツール(85: 15)、2
m1Z分、4分間、 5.0.5M酢酸トリエチルアンモニウム/DMF。
レン/イソプロパツール(85: 15)、2m1Z分
、2分間、 3、塩化メチレン/イソプロパツール(85: 15)
中に臭化亜鉛IMおよび1.2.4−1−リアゾール0
.02M、 2 m l 7分、2〜3.5分間、4、
塩化メチレン/イソプロパツール(85: 15)、2
m1Z分、4分間、 5.0.5M酢酸トリエチルアンモニウム/DMF。
2m1Z分、5分間、
6、 モレキュラーシープ乾燥ピリジン、2m 17分
、3分間、 7、テトラヒドロフラン(過酸化物なし、モレキュラー
シーブ乾燥) 、2ml/分、3分間、8、窒素気流、
10分間、 9、10MモルのトリヌクレオチドGTC((a)節か
らのトリメチレンアンモニウム塩)および8.9mg(
30Mモル)の1−メシチレンスルホニル−3−ニトロ
−1,2,4−トリアゾール(MSNT)を150.μ
lのピリジンに溶解したものを注入、 10.45℃、20分間、 11、ピリジン、2ml/分、4分間、12、ピリジン
中に無水酢酸5%および4−ジメチレンアミノピリジン
2.5%、2m1Z分、4分間、 13、ピリジン、2m1/分、4分間、14、ピリジン
/イソプロパツール(1:1)、2ml/分、3分間。
、3分間、 7、テトラヒドロフラン(過酸化物なし、モレキュラー
シーブ乾燥) 、2ml/分、3分間、8、窒素気流、
10分間、 9、10MモルのトリヌクレオチドGTC((a)節か
らのトリメチレンアンモニウム塩)および8.9mg(
30Mモル)の1−メシチレンスルホニル−3−ニトロ
−1,2,4−トリアゾール(MSNT)を150.μ
lのピリジンに溶解したものを注入、 10.45℃、20分間、 11、ピリジン、2ml/分、4分間、12、ピリジン
中に無水酢酸5%および4−ジメチレンアミノピリジン
2.5%、2m1Z分、4分間、 13、ピリジン、2m1/分、4分間、14、ピリジン
/イソプロパツール(1:1)、2ml/分、3分間。
14段階の総ての操作を21回繰り返すが、9段階目の
操作では、GTCの代わりに次のようなトリヌクレオチ
ドをそれぞれトリエチルアンモニウム塩〔(a)節〕の
形で次のような順序で用いる。
操作では、GTCの代わりに次のようなトリヌクレオチ
ドをそれぞれトリエチルアンモニウム塩〔(a)節〕の
形で次のような順序で用いる。
以下余白
CCA、ACC,GAA、CCC,TAC,AGG、T
GA、CGC,TAC,CGT、GTG。
GA、CGC,TAC,CGT、GTG。
CCA、AAA、AAA、TGA、CGG、TGA、T
TC,GGG、CCT、CAT。
TC,GGG、CCT、CAT。
平均カップリング収率は97%である。最終生成物は次
のような構造を有する。
のような構造を有する。
MMT −CATCCTGGGTTCTG ACGGT
GA A A AA A ACCAGTGCGTTAC
CGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG
TCT−ポリスチレン40、Omg (約0.60Mモ
ル)のDNA合成樹脂96/67を、66 m g (
0,40ミリモル)の0−ニトロベンズアルドキシムお
よび50μl (0,40ミリモル)の1.1.3.
3−テトラメチルグアニジンを400μlの95%ピリ
ジンに溶解したものと共に50℃で3時間および室温で
12時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛ばして除去した
後、残渣に1.6mlのアンモニア水(33%)を加え
、混合物を閉鎖容器中で50℃で24時間保つ。
GA A A AA A ACCAGTGCGTTAC
CGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG
TCT−ポリスチレン40、Omg (約0.60Mモ
ル)のDNA合成樹脂96/67を、66 m g (
0,40ミリモル)の0−ニトロベンズアルドキシムお
よび50μl (0,40ミリモル)の1.1.3.
3−テトラメチルグアニジンを400μlの95%ピリ
ジンに溶解したものと共に50℃で3時間および室温で
12時間保つ。ピリジンを窒素で吹き飛ばして除去した
後、残渣に1.6mlのアンモニア水(33%)を加え
、混合物を閉鎖容器中で50℃で24時間保つ。
分離した液相から真空でアンモニアを除去し、過酸化物
を含まないジエチルエーテルそれぞれ3mlを用いて3
回洗浄する。Bilgel P6カラム〔100〜20
0メツシユ、3X66(J、 0.01モル重炭酸トリ
メチルアンモニウム(pH7,5)1.5ml/分〕上
で低分子量成分を除去した後、28500. (260
nm)のDNAが単離される。
を含まないジエチルエーテルそれぞれ3mlを用いて3
回洗浄する。Bilgel P6カラム〔100〜20
0メツシユ、3X66(J、 0.01モル重炭酸トリ
メチルアンモニウム(pH7,5)1.5ml/分〕上
で低分子量成分を除去した後、28500. (260
nm)のDNAが単離される。
6000の全量をIIPLcカラム(PRP −1/H
amilton。
amilton。
250x4.6++n)上で分離する。グラジェント〔
溶液A: 0.05M酢酸トリエチルアンモニウム(p
H7,0) ;溶液B:溶液A/アセトニトリル=1:
1):30%B/A、60%B/A、50℃および2m
l/分で20分間。親油性の主ピーク(保持時間、約1
4分間)を集め、DE52セルロース(What−ma
n)カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエタノールで
沈澱させる。4−メトキシトリチル保護基を外すために
、沈澱を50μmの酢酸/HtO(4:1)に溶解し、
室温で45分間維持する。反応生成物を凍結乾燥し、エ
タノールで沈澱させ、そして精製のため8%ポリアクリ
ルアミドゲル(7M尿素)上で電気泳動によって分離す
る。所望のDNAの大きさに対応するバンドを切り取り
、生成物を電気溶出し、DE52セルロース上で濃縮し
、下記の構造: 5 ’ −CATCCTGGGTTCTGACGG
TGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGT
GAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT−
3’を有するD N A96/97をエタノールで沈澱
させる。
溶液A: 0.05M酢酸トリエチルアンモニウム(p
H7,0) ;溶液B:溶液A/アセトニトリル=1:
1):30%B/A、60%B/A、50℃および2m
l/分で20分間。親油性の主ピーク(保持時間、約1
4分間)を集め、DE52セルロース(What−ma
n)カラム上で濃縮し、溶出させ、そしてエタノールで
沈澱させる。4−メトキシトリチル保護基を外すために
、沈澱を50μmの酢酸/HtO(4:1)に溶解し、
室温で45分間維持する。反応生成物を凍結乾燥し、エ
タノールで沈澱させ、そして精製のため8%ポリアクリ
ルアミドゲル(7M尿素)上で電気泳動によって分離す
る。所望のDNAの大きさに対応するバンドを切り取り
、生成物を電気溶出し、DE52セルロース上で濃縮し
、下記の構造: 5 ’ −CATCCTGGGTTCTGACGG
TGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGT
GAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT−
3’を有するD N A96/97をエタノールで沈澱
させる。
実施1
下記のDNAフラグメント(5’−3’)を、実施例5
と同様に製造する。
と同様に製造する。
158
CTGGA A TTCATGGTTGTTTA CA
CCGA CTG CACCG A A TCTGG
TCAGAACCTGTGCCTGT 46/64相補体 CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACC
CTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCG
CACAGGCACAGGTT154/64相補体 CAGGATCCTACTGCAGGTArrcrtc
cccGATTTCTTCGAAGTCACCGTCG
TTGTGACACTGCGG化 5′−末端のリン酸化および放射能標識を、Mo1ec
ularC1onin Alaborator
Manual(T、Maniatis ら編集)
、Co1d Spring Harbor Lab。
CCGA CTG CACCG A A TCTGG
TCAGAACCTGTGCCTGT 46/64相補体 CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACC
CTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCG
CACAGGCACAGGTT154/64相補体 CAGGATCCTACTGCAGGTArrcrtc
cccGATTTCTTCGAAGTCACCGTCG
TTGTGACACTGCGG化 5′−末端のリン酸化および放射能標識を、Mo1ec
ularC1onin Alaborator
Manual(T、Maniatis ら編集)
、Co1d Spring Harbor Lab。
1982年、125頁に記載の方法で〔γ−32P)A
TPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boeri
nger)を用いて行う。
TPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boeri
nger)を用いて行う。
キナーゼ処理したフラグメント96/67およびキナー
ゼ処理したフラグメント154/64それぞれ50pモ
ルを、水24μlに溶解し、溶液を90℃で3分間加熱
し、5分以内に12℃まで冷却する。4μmのエンド−
RQ街液(0,1M)リス・HCI、pH7,5,66
m M Mg(:Ig、66mMのβ−メルカプトエタ
ノール、0.6 M NaC1)、10μmのデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート混合物(dATP、 d
CTPSdGTP、 TTPであって、それぞれ2xl
O−コHで、NH,でpH7,0に調整)、および2μ
l (・10単位)のDNAポリメラーゼ■、Klen
owフラグメント(Boeringer)を添加した後
、12℃で30分間インキュベートする。90℃で、
3分間加熱して反応を停止させ、更に処理するまで一8
0℃で貯蔵する。
ゼ処理したフラグメント154/64それぞれ50pモ
ルを、水24μlに溶解し、溶液を90℃で3分間加熱
し、5分以内に12℃まで冷却する。4μmのエンド−
RQ街液(0,1M)リス・HCI、pH7,5,66
m M Mg(:Ig、66mMのβ−メルカプトエタ
ノール、0.6 M NaC1)、10μmのデオキシ
ヌクレオシドトリホスフェート混合物(dATP、 d
CTPSdGTP、 TTPであって、それぞれ2xl
O−コHで、NH,でpH7,0に調整)、および2μ
l (・10単位)のDNAポリメラーゼ■、Klen
owフラグメント(Boeringer)を添加した後
、12℃で30分間インキュベートする。90℃で、
3分間加熱して反応を停止させ、更に処理するまで一8
0℃で貯蔵する。
同様にして、キナーゼ処理されたフラグメント1158
および46/64を反応させてデュプレックス(デスル
ファトヒルジン遺伝子のフラグメントFυを形成させる
。
および46/64を反応させてデュプレックス(デスル
ファトヒルジン遺伝子のフラグメントFυを形成させる
。
デュプレックス■および■は、下記の構造を有する。
デュプレックス■
デュプレックスII
テ゛スルフ1F乞ルジンj1イ云−)クフラ、7’′)
!、/) F1およびF2の製造を、下記のスキーム
1に示す。
!、/) F1およびF2の製造を、下記のスキーム
1に示す。
(以下余白)
スキーム1゜
1158 96乙7F、−F2−
DNA (デスルファトヒルジン遺伝子)1i缶」に
Lβ−フーグメン 、キ −ゼ几遺 フラグメント1158、キナーゼ処理したフラグメント
46/64、キナーゼ処理した96/67、および15
4/64をそれぞれ50pモルを、水48μlに溶解し
、溶液を90℃で3分間加熱し、5分以内に12°まで
冷却する。8μlのエンド−R緩衝液(実施例8参照の
こと)、20μlのデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート混合物(dATP。
DNA (デスルファトヒルジン遺伝子)1i缶」に
Lβ−フーグメン 、キ −ゼ几遺 フラグメント1158、キナーゼ処理したフラグメント
46/64、キナーゼ処理した96/67、および15
4/64をそれぞれ50pモルを、水48μlに溶解し
、溶液を90℃で3分間加熱し、5分以内に12°まで
冷却する。8μlのエンド−R緩衝液(実施例8参照の
こと)、20μlのデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート混合物(dATP。
dCTP、、dGTPSTTPであって、それぞれ2x
lO−’Mで、NH,でp117.0に調整)および2
μ1(10単位)のDNAポリメラーゼI 、 Kle
no%4フラグメント(Boeringer)を添加し
た後、12℃で30分間インキュベートする。90℃で
3分間加熱して反応を停止させ、フェノール/クロロホ
ルムで抽出した後、エタノ、−ルで沈澱させてDNAを
単離する。
lO−’Mで、NH,でp117.0に調整)および2
μ1(10単位)のDNAポリメラーゼI 、 Kle
no%4フラグメント(Boeringer)を添加し
た後、12℃で30分間インキュベートする。90℃で
3分間加熱して反応を停止させ、フェノール/クロロホ
ルムで抽出した後、エタノ、−ルで沈澱させてDNAを
単離する。
生成するDNA混合物を100μlのリガーゼ/緩衝液
(66mM)リス−HCl (pH7,5> 6.6
mM Mget、、10mMジチオスレイトール、5m
MATP )に溶解し、50単位(2μl)のT、 D
NAリガーゼ(Iliolabs)を加え、全量を20
℃で20時間インキュベートする。、す0℃で5分間加
熱することにより、反応を停止させ、フェノール/クロ
ロホルムで抽出した後、エタノールで沈澱させることに
よりDNAを単離する。混合物を8%ポリアクリルアミ
ドゲル(変性)上で電気泳動によって分離した後、21
7個の塩基対を有する連結生成物を電気溶出させ、DE
52セルロースカラム上で濃縮し、溶出後にエタノール
で沈澱させることによって単離する。
(66mM)リス−HCl (pH7,5> 6.6
mM Mget、、10mMジチオスレイトール、5m
MATP )に溶解し、50単位(2μl)のT、 D
NAリガーゼ(Iliolabs)を加え、全量を20
℃で20時間インキュベートする。、す0℃で5分間加
熱することにより、反応を停止させ、フェノール/クロ
ロホルムで抽出した後、エタノールで沈澱させることに
よりDNAを単離する。混合物を8%ポリアクリルアミ
ドゲル(変性)上で電気泳動によって分離した後、21
7個の塩基対を有する連結生成物を電気溶出させ、DE
52セルロースカラム上で濃縮し、溶出後にエタノール
で沈澱させることによって単離する。
デスルファトヒルジン遺伝子は、次のような構造を有す
る。
る。
以下余白
CTGGAATTCATGGTTGTTTACAOCG
ACTGCACCGAATCTGGTCAGACCTT
AAGTACCAACAAATGTGGCTC;ACG
TGGCTTAGACCAGTGAACCTGTGCC
TGTGCGAAGGTTCTAACGTTTGCGO
TCAGGGTACTTGGACACGGACACGO
TTCCAAGATTGCAAACGCCAGTCCC
ATACAAATGCATCCTGGGTTCTGAC
GGTGAAAAAAACCAGTGCGTTTGTT
TACGTAGGACCCAAGACTGCCACTT
TTTTTGGTCACGCAAACCGOTGAAG
GTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAA
CGAC!GGTGATGGCCACTTCCATGG
GGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGOTGC
CACTCTTOGAAGAAATα:X3GGAAG
AATACCTGCAG’rAGGATCCTGGAA
GCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGAC
OTCATCCTAGOAC4個の7ラグメントからの
デスルファトヒルジン遺伝子の製造を、下記のスキーム
2に示す。
ACTGCACCGAATCTGGTCAGACCTT
AAGTACCAACAAATGTGGCTC;ACG
TGGCTTAGACCAGTGAACCTGTGCC
TGTGCGAAGGTTCTAACGTTTGCGO
TCAGGGTACTTGGACACGGACACGO
TTCCAAGATTGCAAACGCCAGTCCC
ATACAAATGCATCCTGGGTTCTGAC
GGTGAAAAAAACCAGTGCGTTTGTT
TACGTAGGACCCAAGACTGCCACTT
TTTTTGGTCACGCAAACCGOTGAAG
GTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAA
CGAC!GGTGATGGCCACTTCCATGG
GGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGOTGC
CACTCTTOGAAGAAATα:X3GGAAG
AATACCTGCAG’rAGGATCCTGGAA
GCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGAC
OTCATCCTAGOAC4個の7ラグメントからの
デスルファトヒルジン遺伝子の製造を、下記のスキーム
2に示す。
スキーム2゜
4個の合成フラグメントからのヒルノン遺伝子の製造t
/!+89v67 4 DNAポリミラーゼI(Klenow)NTP ↓T4DNAリガーゼ 1隻■上112ユツΔ」」dレジンF■■1゛ −pB
R322プラスミドDNA (5μg)を、5単位のP
vu U制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を
100μg / m 1ゼラチンの溶液200m lと
したもので、37℃で1時間消化する。次いで、この溶
液を100mMのトリス−HC1(pH7,5)および
50mMのNaC1に調整し、そしてこのDNAをEc
oRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)
30単位で37℃で2時間消化する。次いで、この溶液
を50mM)リス−HCl (pH8)に調整し、1
0Mg/μlのD N A )1度において、2単位の
ウシ腸アルカリホスファターゼ(Boeringer)
を用いて、37℃で30分間インキュベートする。この
溶液を65℃で60分間加熱することによって、酵素を
不活性化する。次いで、この溶液をTNEで標準化して
、1容量のフェノールおよびクロロホルムで抽出し、消
化されDNAを一20℃で2容量のアルコールを用いて
一晩沈澱させる。
/!+89v67 4 DNAポリミラーゼI(Klenow)NTP ↓T4DNAリガーゼ 1隻■上112ユツΔ」」dレジンF■■1゛ −pB
R322プラスミドDNA (5μg)を、5単位のP
vu U制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を
100μg / m 1ゼラチンの溶液200m lと
したもので、37℃で1時間消化する。次いで、この溶
液を100mMのトリス−HC1(pH7,5)および
50mMのNaC1に調整し、そしてこのDNAをEc
oRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)
30単位で37℃で2時間消化する。次いで、この溶液
を50mM)リス−HCl (pH8)に調整し、1
0Mg/μlのD N A )1度において、2単位の
ウシ腸アルカリホスファターゼ(Boeringer)
を用いて、37℃で30分間インキュベートする。この
溶液を65℃で60分間加熱することによって、酵素を
不活性化する。次いで、この溶液をTNEで標準化して
、1容量のフェノールおよびクロロホルムで抽出し、消
化されDNAを一20℃で2容量のアルコールを用いて
一晩沈澱させる。
pBR322のDNAから切り取られたベクター(pB
R322/ HcoRI / Pvu IF、2297
塩基対)を、1%低融点アガロース(Biorad)/
トリス−アセテ−)−!l!DTA緩衝液(pH8)
上でゲル電気泳動を行うことによって小DNAフラグメ
ント(2067個の塩基対)から分離する。アガロース
ゲル中のDNAをEtBrで染色した後、pBR322
/EcoRI / Pvu Uベクター(−2297塩
基対)のDNAバンドを含むゲルの領域をゲルから切り
取り、65℃で1o分間液化する。20容量のTNEを
このDNA溶液に加えて、Mueller ら、〔ムM
o1.Bio1.第124巻、343頁、1978年〕
の方法に準じて、DE −52クロマトグラフイを行っ
てDNAを精製し、フェノール/クロロホルムで抽出し
、DNAをアルコールで−20℃において一晩沈澱させ
る。
R322/ HcoRI / Pvu IF、2297
塩基対)を、1%低融点アガロース(Biorad)/
トリス−アセテ−)−!l!DTA緩衝液(pH8)
上でゲル電気泳動を行うことによって小DNAフラグメ
ント(2067個の塩基対)から分離する。アガロース
ゲル中のDNAをEtBrで染色した後、pBR322
/EcoRI / Pvu Uベクター(−2297塩
基対)のDNAバンドを含むゲルの領域をゲルから切り
取り、65℃で1o分間液化する。20容量のTNEを
このDNA溶液に加えて、Mueller ら、〔ムM
o1.Bio1.第124巻、343頁、1978年〕
の方法に準じて、DE −52クロマトグラフイを行っ
てDNAを精製し、フェノール/クロロホルムで抽出し
、DNAをアルコールで−20℃において一晩沈澱させ
る。
DNAの沈澱を50ulの0.01M)リス・FIcl
(pH8) 、 0.1 mM EDTAに溶解し、
使用するまで一20℃で貯蔵する。1.4μg(=3.
2pモルの末端)のDNAを得る。
(pH8) 、 0.1 mM EDTAに溶解し、
使用するまで一20℃で貯蔵する。1.4μg(=3.
2pモルの末端)のDNAを得る。
(b) F −DNA/EcoRIの’b化学的に合
成されたF、−DNA (実施例8を参照)24ng
(=1.3pモルの末端)を、50μm100mMトリ
ス−HCl (pH7,5) 、 50mMNac
lおよび1ooμg/mlのゼラチン中で5単位のEc
oRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を用
いて37℃で30分間消化する。次に、線状化したベク
ターpBR322/BcoRI / Pvu U (実
施例10a ) 0.06,17 g (= 0.14
Mモルの末端)を溶液に加える。次いで、酵素を65℃
で加熱することにより10分後に不活性化し、溶液をT
NEで標準化して、フェノール/クロロホルムで抽出す
る。
成されたF、−DNA (実施例8を参照)24ng
(=1.3pモルの末端)を、50μm100mMトリ
ス−HCl (pH7,5) 、 50mMNac
lおよび1ooμg/mlのゼラチン中で5単位のEc
oRI制限エンドヌクレアーゼ(Biolabs)を用
いて37℃で30分間消化する。次に、線状化したベク
ターpBR322/BcoRI / Pvu U (実
施例10a ) 0.06,17 g (= 0.14
Mモルの末端)を溶液に加える。次いで、酵素を65℃
で加熱することにより10分後に不活性化し、溶液をT
NEで標準化して、フェノール/クロロホルムで抽出す
る。
沈澱したDNAを、更に処理するまで、−20”Cで貯
蔵する。
蔵する。
2個の上記DNAフラグメントを含をする、実施例10
(b)で得られたDNA沈澱を、2゜μ【の50mM)
リス・HCl(ptl、7.8)。
(b)で得られたDNA沈澱を、2゜μ【の50mM)
リス・HCl(ptl、7.8)。
10mM MgC1g、10mM DTT、0.5m
MATPおよび100μg/lのゼラチンの溶液に溶解
し、20単位/μIT4DNAリガーゼ(Biolab
s)で15℃で3時間処理する。この方法で、F、−D
NAを含む組み換えプラスミドpML300が、溶液中
に得られる。
MATPおよび100μg/lのゼラチンの溶液に溶解
し、20単位/μIT4DNAリガーゼ(Biolab
s)で15℃で3時間処理する。この方法で、F、−D
NAを含む組み換えプラスミドpML300が、溶液中
に得られる。
形質転換に必要なカルシウム前処理したE、コリllB
101細胞を、Mandelら(J、Mo1.Biol
、 、第53巻、159頁、1970年)により記載さ
れた方法で調製する。
101細胞を、Mandelら(J、Mo1.Biol
、 、第53巻、159頁、1970年)により記載さ
れた方法で調製する。
組み換えプラスミドpl’1L300を含む(c)で得
られた溶液を65℃で10分間加熱して、T、DNAリ
ガーゼを不活性化して、そ叫て次に37℃に冷却する。
られた溶液を65℃で10分間加熱して、T、DNAリ
ガーゼを不活性化して、そ叫て次に37℃に冷却する。
この反応混合物lOμlを、カルシウム処理したE、コ
リ until/10ミリモノL/MgC1tおよび1
0ミリモルのトリス・HCl (pH7,5)150
μIに加えて全量を200I!lとする。
リ until/10ミリモノL/MgC1tおよび1
0ミリモルのトリス・HCl (pH7,5)150
μIに加えて全量を200I!lとする。
次いで、この混合物を30分間氷冷し、42°Cで2分
間加熱した後、L−培地(実施例18を参照されたい)
1ml中で37℃で50分間放置する。この混合物を6
0μ/ m 1のアンピシリン(Serva)を含む5
個の寒天平板(McConkey Agar、Difc
o)上に0.2 m lずつ塗布する。次に、寒天平板
を37℃で16〜18時間保持する。形質転換されたE
、コリII 8101の484個のアンピシリン耐性コ
ロニーが得られる。
間加熱した後、L−培地(実施例18を参照されたい)
1ml中で37℃で50分間放置する。この混合物を6
0μ/ m 1のアンピシリン(Serva)を含む5
個の寒天平板(McConkey Agar、Difc
o)上に0.2 m lずつ塗布する。次に、寒天平板
を37℃で16〜18時間保持する。形質転換されたE
、コリII 8101の484個のアンピシリン耐性コ
ロニーが得られる。
(e)F −DNAを人゛コロニーのスクリーニング
470個の形質転換されたコロニー(実施例10d)を
、ニトロセルロースフィルターB 85(Schlei
cherand 5chull)に押圧する。M、Gr
unstein andD。
、ニトロセルロースフィルターB 85(Schlei
cherand 5chull)に押圧する。M、Gr
unstein andD。
S、Hogness (Proc、Natユ、Ac回
、Sc土ユ旦SA工、第72巻、3961頁、1979
年〕の方法に準じて、コロニーを溶解し、そして変性し
たDNAをフィルター上に固定する0次いで、フィルタ
ーのプレハイブリダイゼーションを、20m1 (フ
ィルター当たり)の4xSET (30mM)リス・
HCl (pH8)、 150mM NaClおよび
1mMHDTAの溶液)、0.1%(w / v )
Ficol1400(Phar+wacia) 、 0
.5%SD3゜50μg / m 1変性したウシ胸腺
DNA中で64℃で4時間行う0次いで、ニトロセルロ
ースフィルターを20m1 (フィルター当たり)の
5xSf!T(W/ v ) Ficoll 400
、0.2%SDSおよび50μg / m 1変性した
ウシ胸腺DNA中で、″P放射能標識したプローブ(フ
ィルター当たり約IO3〜104セーレンコフcpm)
を用いて処理する。
、Sc土ユ旦SA工、第72巻、3961頁、1979
年〕の方法に準じて、コロニーを溶解し、そして変性し
たDNAをフィルター上に固定する0次いで、フィルタ
ーのプレハイブリダイゼーションを、20m1 (フ
ィルター当たり)の4xSET (30mM)リス・
HCl (pH8)、 150mM NaClおよび
1mMHDTAの溶液)、0.1%(w / v )
Ficol1400(Phar+wacia) 、 0
.5%SD3゜50μg / m 1変性したウシ胸腺
DNA中で64℃で4時間行う0次いで、ニトロセルロ
ースフィルターを20m1 (フィルター当たり)の
5xSf!T(W/ v ) Ficoll 400
、0.2%SDSおよび50μg / m 1変性した
ウシ胸腺DNA中で、″P放射能標識したプローブ(フ
ィルター当たり約IO3〜104セーレンコフcpm)
を用いて処理する。
相補的なオリゴヌクレオチド46ン64 (実施例6参
照)をプローブとして使用する。
照)をプローブとして使用する。
次いで、フィルターを2xSET、 0.2%SDSで
2回室温で洗浄し、次いで2xSf!T、 0.5%S
DSで2回60℃で洗浄する。(最初は30分間、次に
60分間)0次に、フィルターを3MM紙(Whats
an)の間で乾燥し、−80℃で強調用スクリーン(I
1ford)を有するX線フィルム(フジ)上に1〜
2日間°置装。
2回室温で洗浄し、次いで2xSf!T、 0.5%S
DSで2回60℃で洗浄する。(最初は30分間、次に
60分間)0次に、フィルターを3MM紙(Whats
an)の間で乾燥し、−80℃で強調用スクリーン(I
1ford)を有するX線フィルム(フジ)上に1〜
2日間°置装。
得られるオートラジオグラムは、その後の処理に用いる
ことができる71個の陽性のコロニーを示し、その一つ
をpML300と命名する。
ことができる71個の陽性のコロニーを示し、その一つ
をpML300と命名する。
pBR322プラスミドDNA (5μg)を、30単
位のBa5al目制限エンドヌクレ、アーゼで、100
mMNaC1、6mM I−リス−HCl (pH7
,9)、6mM8gC1gおよび100μg / m
1ゼラチンノ溶液中で、37℃で30分間消化する。次
いで、Pvu II制限エンドヌクレアーゼ15単位を
溶液に加え、37℃で2時間消化する。
位のBa5al目制限エンドヌクレ、アーゼで、100
mMNaC1、6mM I−リス−HCl (pH7
,9)、6mM8gC1gおよび100μg / m
1ゼラチンノ溶液中で、37℃で30分間消化する。次
いで、Pvu II制限エンドヌクレアーゼ15単位を
溶液に加え、37℃で2時間消化する。
反応混合物を70℃で10分間加熱して、酵素を不活性
化する0次いで、1%低融点アガロース/トリスーアセ
テート−El)TA緩衝液(pH8)上でゲル電気泳動
を行うことによって2つのDNAフラグメントを互いに
分離する(実施例10a参照)。
化する0次いで、1%低融点アガロース/トリスーアセ
テート−El)TA緩衝液(pH8)上でゲル電気泳動
を行うことによって2つのDNAフラグメントを互いに
分離する(実施例10a参照)。
pBR322Baall I / Pvu IIベクタ
ー(= 2672塩基対)のDNAバンドを含むゲルの
領域をゲルから切り取り、液化し、そしてMuelle
rら(上記)の方法に準じて、DB−52クロマトグラ
フイを行ってDNAを精製する。 0.75μg(1,
5pモルの末端)のDNAが得られる。
ー(= 2672塩基対)のDNAバンドを含むゲルの
領域をゲルから切り取り、液化し、そしてMuelle
rら(上記)の方法に準じて、DB−52クロマトグラ
フイを行ってDNAを精製する。 0.75μg(1,
5pモルの末端)のDNAが得られる。
(b ) F −D N A Bam1l Iの一
す゛6化学的に合成されたFg −DNA (実施例8
を参照)25μg(=1.3pモルの末端)を、20μ
lの150m M NaC1,6m M トリス・HC
I(pH7,9>、6mMのMgCbおよび1100u
/mlのゼラチン中で168位のBa+mHl制限エン
ドヌクレアーゼ(Biolabs)を用いて37℃で3
0分間消化する。次に、線状化したベクターpBR32
2/ Baa+II I/ PvuII (実施例11
a)60ng (=96nモルの末端)を溶液に加え、
全溶液をTNEで標準化して、フェノール/クロロホル
ムで抽出し、DNAを2容量のアルコールで沈澱させる
。沈澱したDNAを、更に処理するまで、−20℃でア
ルコール中に貯蔵する。
す゛6化学的に合成されたFg −DNA (実施例8
を参照)25μg(=1.3pモルの末端)を、20μ
lの150m M NaC1,6m M トリス・HC
I(pH7,9>、6mMのMgCbおよび1100u
/mlのゼラチン中で168位のBa+mHl制限エン
ドヌクレアーゼ(Biolabs)を用いて37℃で3
0分間消化する。次に、線状化したベクターpBR32
2/ Baa+II I/ PvuII (実施例11
a)60ng (=96nモルの末端)を溶液に加え、
全溶液をTNEで標準化して、フェノール/クロロホル
ムで抽出し、DNAを2容量のアルコールで沈澱させる
。沈澱したDNAを、更に処理するまで、−20℃でア
ルコール中に貯蔵する。
以下余白
(c) L!且其ム4叶n+HIル企ヱ叩」ゴ81久二
Jユ(配ζ2個の上記DNAフラグメントを含有する実
施例11(b)で得られたDNA沈澱を、20μlの5
0mM)リス・HCl(p)l、7.8)、10mM
MgC1g、10mM DTT、0.5mMATPお
よび100μg / 1 m lのゼラチンの溶液に溶
解し、15単位/μlのT4DNAリガーゼ(Biol
abs)で15℃で3時間処理する。この方法で、F、
−DNAを含む組み替えプラスミドpML 305が溶
液中に得られる。
Jユ(配ζ2個の上記DNAフラグメントを含有する実
施例11(b)で得られたDNA沈澱を、20μlの5
0mM)リス・HCl(p)l、7.8)、10mM
MgC1g、10mM DTT、0.5mMATPお
よび100μg / 1 m lのゼラチンの溶液に溶
解し、15単位/μlのT4DNAリガーゼ(Biol
abs)で15℃で3時間処理する。この方法で、F、
−DNAを含む組み替えプラスミドpML 305が溶
液中に得られる。
カルシウム処理されたE、コリ118101細胞の形質
転換はは、実施例10(d)に記載のようにして行う。
転換はは、実施例10(d)に記載のようにして行う。
実施例11(c)で得られる反応混合物lOμlを用い
る。313個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
る。313個のアンピシリン耐性コロニーが得られる。
以下余白
(e)Fz DNA むコロニーのスクリーニヱ
久 65個の形質転換されたコロニー(実施例11d)を、
実施例10(e)に記載の方法でF、−DNAについて
試験する。相補的オリゴヌクレオチド154/64 (
実施例6を参照されたい)を、放射能プローブとして用
いる。オートラジオダラムにおいて2個の陽性のコロニ
ーが得られ、その一つをpML305と命名する。
久 65個の形質転換されたコロニー(実施例11d)を、
実施例10(e)に記載の方法でF、−DNAについて
試験する。相補的オリゴヌクレオチド154/64 (
実施例6を参照されたい)を、放射能プローブとして用
いる。オートラジオダラムにおいて2個の陽性のコロニ
ーが得られ、その一つをpML305と命名する。
組換プラスミドpMt300およびpl’1L305の
DNAを、l5h−1(oro@itz (Molec
ular C1onin ALaboratorMa
nual(T、Maniatis ら編)、Co1d
Spring HarborLab、、 1982年
、368頁〕の方法に準じて単離する。
DNAを、l5h−1(oro@itz (Molec
ular C1onin ALaboratorMa
nual(T、Maniatis ら編)、Co1d
Spring HarborLab、、 1982年
、368頁〕の方法に準じて単離する。
F、−DNAおよびFz DNAインサートのヌクレ
オチド配列を、MaxamおよびG11bert (
Proc。
オチド配列を、MaxamおよびG11bert (
Proc。
h且」垣虹とLJ鎖、第74巻、560頁、 1977
年;ル銭も一ハ互Bよ、第65巻、499頁、 198
0年も参照されたい〕の方法に準じて確認する。
年;ル銭も一ハ互Bよ、第65巻、499頁、 198
0年も参照されたい〕の方法に準じて確認する。
このためには、それぞれの場合に、10μgのpl’1
L300のプラスミドDNAをIIcoR1111pi
エンドヌクレアーゼで開裂し、そして10μgのpML
305のプラスミドDNAをBamHl制限エンドヌク
レアーゼで開裂し、線状化されたDNAをアガロースゲ
ル〔実施例10(a)参照〕からゲル溶出によって単離
する0次に、単離されたDNAをアルカリ性ホスファタ
ーゼで消化して、そして叶−52上でクロマトグラフィ
を行う(実施例11aを参照されたい)0次に、DNA
を5′−末端で〔γ−32〕ATP (比活性、500
0 Ci / mモル、Amersha+w)およびT
4ポリヌクレオチドキナーゼCP −L −Biocb
emicals)を用いて、放射能標識する。放射能標
識したDNAを、次いで第二の制限エンドヌクレアーゼ
(BcoRII )を用いて開裂する。生成するDNA
フラグメントを、アガロースからゲル溶出によって単離
する。pl’1L300の場合には、F、−DNAのヌ
クレオチド配列をEcoRn −EcoRI ”フラグ
メント(約109塩基対)から決定し、pML300の
場合には、F、−DNAのヌクレオチド配列をEcoR
If −Bamfl I ”フラグメント(約122塩
基対)において決定する(*は放射能標識されているD
NA末端を意味する)。
L300のプラスミドDNAをIIcoR1111pi
エンドヌクレアーゼで開裂し、そして10μgのpML
305のプラスミドDNAをBamHl制限エンドヌク
レアーゼで開裂し、線状化されたDNAをアガロースゲ
ル〔実施例10(a)参照〕からゲル溶出によって単離
する0次に、単離されたDNAをアルカリ性ホスファタ
ーゼで消化して、そして叶−52上でクロマトグラフィ
を行う(実施例11aを参照されたい)0次に、DNA
を5′−末端で〔γ−32〕ATP (比活性、500
0 Ci / mモル、Amersha+w)およびT
4ポリヌクレオチドキナーゼCP −L −Biocb
emicals)を用いて、放射能標識する。放射能標
識したDNAを、次いで第二の制限エンドヌクレアーゼ
(BcoRII )を用いて開裂する。生成するDNA
フラグメントを、アガロースからゲル溶出によって単離
する。pl’1L300の場合には、F、−DNAのヌ
クレオチド配列をEcoRn −EcoRI ”フラグ
メント(約109塩基対)から決定し、pML300の
場合には、F、−DNAのヌクレオチド配列をEcoR
If −Bamfl I ”フラグメント(約122塩
基対)において決定する(*は放射能標識されているD
NA末端を意味する)。
F、−DNAおよびFZ −DNAについて決定される
ヌクレオチド配列は、実施例8に示したものと同じであ
る。
ヌクレオチド配列は、実施例8に示したものと同じであ
る。
10#gのプラスミドpBRHtrp (DI!−0
53111405)を5a単位のf!eoRI (Bi
olabs)を用いて37℃で60分間開裂させ、消化
混合物をフェノール抽出した後、TST41(Kont
ron AG) O−ター中で50mM)リス・HCl
(pH8,0)および1mMのt!DTAにおいて
、サッカロース密度勾配(5〜23%)で分画する。遠
心分離は、40.00Orpm、15℃で14時間継続
する。0.3 m Iずつの両分を、l5CO勾配コレ
クターを用いて1ml/分で集める。小さなフラグメン
トを含む画分をまとめ、この溶液をTNEで標準化し、
−20℃で2容量のエタノールを用いて沈澱させる。
53111405)を5a単位のf!eoRI (Bi
olabs)を用いて37℃で60分間開裂させ、消化
混合物をフェノール抽出した後、TST41(Kont
ron AG) O−ター中で50mM)リス・HCl
(pH8,0)および1mMのt!DTAにおいて
、サッカロース密度勾配(5〜23%)で分画する。遠
心分離は、40.00Orpm、15℃で14時間継続
する。0.3 m Iずつの両分を、l5CO勾配コレ
クターを用いて1ml/分で集める。小さなフラグメン
トを含む画分をまとめ、この溶液をTNEで標準化し、
−20℃で2容量のエタノールを用いて沈澱させる。
f!ppendorf遠心分離機中で遠心分離した後、
DNAを100.crlの10mM)リス・HCl (
pH7,5)および0.5 m M EDTAに溶解す
る。このDNAフラグメント5ttgを5単位のBg
I II (Bilabs)を用いて、37℃で60分
間開裂させる。反応混合物をフェノールおよびクロロホ
ルムで抽出し、DNAを2容量のエタノールと共に一8
0℃で1a分間インキエベートし、DNAを遠心分離に
よって集めて、50μlの50mM)リス・HCI(p
H8,0)に再度溶解させる。この溶液の2μlを採取
して(DNA 0.24 g) 、50mM )リス・
HCl (pH18,0)中で10ng/μlのDN
A濃度で1単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(B
oeringet)と共に37℃で30分間インキュベ
ートする。溶液を65℃で60分間加熱することによっ
て酵素を不活性化する。0.04μgのDNAを採取し
、そして5′−末端を、50mMのトリス−HC1(p
H19,5) 、 10mMのMgC1gおよび5m
MのDTTの反応容積20ul中10#Ci(r−”P
)−ATP(5000Ci /mM 、Amerch
am。
DNAを100.crlの10mM)リス・HCl (
pH7,5)および0.5 m M EDTAに溶解す
る。このDNAフラグメント5ttgを5単位のBg
I II (Bilabs)を用いて、37℃で60分
間開裂させる。反応混合物をフェノールおよびクロロホ
ルムで抽出し、DNAを2容量のエタノールと共に一8
0℃で1a分間インキエベートし、DNAを遠心分離に
よって集めて、50μlの50mM)リス・HCI(p
H8,0)に再度溶解させる。この溶液の2μlを採取
して(DNA 0.24 g) 、50mM )リス・
HCl (pH18,0)中で10ng/μlのDN
A濃度で1単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(B
oeringet)と共に37℃で30分間インキュベ
ートする。溶液を65℃で60分間加熱することによっ
て酵素を不活性化する。0.04μgのDNAを採取し
、そして5′−末端を、50mMのトリス−HC1(p
H19,5) 、 10mMのMgC1gおよび5m
MのDTTの反応容積20ul中10#Ci(r−”P
)−ATP(5000Ci /mM 、Amerch
am。
およびで5単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(P
−L B11che*1cals)と共に37℃で30
分間インキュベートして標識する。放射性試料を非標識
試料(上記参照)と混合して、DNAフラグメントをT
ST60ローター中で50mMトリス・HCl(pH8
,0)および1mM EDTA中で5〜23%サッカ
ロース密度勾配によって分画する。遠心分離を、60.
00Or p m、 15℃で5時間行う、0.2ml
ずつの両分を集める。それぞれの百分の放射能活性をセ
レンコツ放射線を測定することによって計測し、それに
よってフラグメントを同定する。
−L B11che*1cals)と共に37℃で30
分間インキュベートして標識する。放射性試料を非標識
試料(上記参照)と混合して、DNAフラグメントをT
ST60ローター中で50mMトリス・HCl(pH8
,0)および1mM EDTA中で5〜23%サッカ
ロース密度勾配によって分画する。遠心分離を、60.
00Or p m、 15℃で5時間行う、0.2ml
ずつの両分を集める。それぞれの百分の放射能活性をセ
レンコツ放射線を測定することによって計測し、それに
よってフラグメントを同定する。
小さなりNAフラグメントを含む所望のフラグメントを
まとめて、DNAを2容量のエタノールを用いて沈澱さ
せ、遠心分離した後、20μlの10mM)リス−HC
l (pH7,5)および0.5mM HDTAに
再度溶解する。
まとめて、DNAを2容量のエタノールを用いて沈澱さ
せ、遠心分離した後、20μlの10mM)リス−HC
l (pH7,5)および0.5mM HDTAに
再度溶解する。
″′P−標識されたEcoRI −Bgl II DN
Aフラグメントを、50μlの容量中で0.2単位のT
aq r(Billabs)を用いて、37℃で10分
間部分的に開裂させる0反応混合物を、0.2%SD3
.10%グリセリン、 10 mM EDTA 、
0.05%ブロモフェノール−ブルーに調整し、そして
DNAフラグメントをトリス−ホウ酸−EDTA中で6
%ポリアクリルアミド上で分離する(A、C,Peac
ock ら、…匹蝕紅1■、第6巻、1818頁、19
67年〕。所望のEcoRI −Taq I (最大
の部分消化フラグメント)を含むバンドをオートラジオ
グラム上で同定する。
Aフラグメントを、50μlの容量中で0.2単位のT
aq r(Billabs)を用いて、37℃で10分
間部分的に開裂させる0反応混合物を、0.2%SD3
.10%グリセリン、 10 mM EDTA 、
0.05%ブロモフェノール−ブルーに調整し、そして
DNAフラグメントをトリス−ホウ酸−EDTA中で6
%ポリアクリルアミド上で分離する(A、C,Peac
ock ら、…匹蝕紅1■、第6巻、1818頁、19
67年〕。所望のEcoRI −Taq I (最大
の部分消化フラグメント)を含むバンドをオートラジオ
グラム上で同定する。
このフラグメント(L、、第3図参照)をゲルから抽出
して、精製しくW、Muellerら、上記)、そして
10μlの10mMトリス−HCl (pH7,5)お
よび1mMf!DT八に溶解する。
して、精製しくW、Muellerら、上記)、そして
10μlの10mMトリス−HCl (pH7,5)お
よび1mMf!DT八に溶解する。
アクセプタープラスミドとして、C1a IおよびBc
oRIで消化されるpBR322を用いる。2agのp
BR322を20μlの反応容量中で4単位のC1a
I(Biolabs)を用いて37℃で60分間消化さ
れる。
oRIで消化されるpBR322を用いる。2agのp
BR322を20μlの反応容量中で4単位のC1a
I(Biolabs)を用いて37℃で60分間消化さ
れる。
蛋白質をフェノールで抽出し、次いでDNAを2容量の
エタノールを用いて一80℃で10分間沈澱させる。D
NAを遠心分離によって集め、次いで20μlの反応容
積において37℃で10単位のIEcoRI (Bio
labs)を用いて30分間消化する。
エタノールを用いて一80℃で10分間沈澱させる。D
NAを遠心分離によって集め、次いで20μlの反応容
積において37℃で10単位のIEcoRI (Bio
labs)を用いて30分間消化する。
次いで、0.1 M )リス・HCI (pH8,7
) 2容量を溶液に加え、全量を1単位のアルカリ性ウ
シホスファターゼ(Boeringer)と共に37℃
で30分、間インキュベートする。次いで、65℃で6
0分間インキュベートすることによってホスファターゼ
を不活性化する。アクセプタープラスミド1100nを
、l OmM MgC1t 、 20 mM !−リス
・HCI (pH7,8)、10mM DTT、0
.5mMATP中、15μlの反応容積中で、5μlの
フラグメントL−DNAと共に、1.IJlの反応容積
当たり30単位の74DNAリガーゼ(Biolabs
)を用いて、2時間インキュベートする。
) 2容量を溶液に加え、全量を1単位のアルカリ性ウ
シホスファターゼ(Boeringer)と共に37℃
で30分、間インキュベートする。次いで、65℃で6
0分間インキュベートすることによってホスファターゼ
を不活性化する。アクセプタープラスミド1100nを
、l OmM MgC1t 、 20 mM !−リス
・HCI (pH7,8)、10mM DTT、0
.5mMATP中、15μlの反応容積中で、5μlの
フラグメントL−DNAと共に、1.IJlの反応容積
当たり30単位の74DNAリガーゼ(Biolabs
)を用いて、2時間インキュベートする。
この溶液5.czlを、10mM MgCb、 10m
MCaC1zおよび19mMトリス・HCl (pl
+7.5)生塩化カルシウムで処理したE、コリHBI
OIを含む150m lの混合物に加て全体を200μ
mとする。
MCaC1zおよび19mMトリス・HCl (pl
+7.5)生塩化カルシウムで処理したE、コリHBI
OIを含む150m lの混合物に加て全体を200μ
mとする。
この混合物を20分間氷冷し、42℃で1分間加熱し、
20℃で10分間インキュベートする。トリプトン培地
〔蒸留水1リツトル中に、10gのバクトートリプトン
(Dirco) 、1 gの酵母エキス(Dirco)
、1 gのグルコース、8gのNaC1および294
mgのCaC1z ・2 HtOを含む)1mlを加え
て、混合物を30Or p mで攪拌しながら37℃で
30分間インキュベートする。混合物を、2個の50g
g / m lのアンピシリン(Sigma)を加えた
寒天平板(McConkey Agar、 ロ1fc
o;0.6ml/平板)に塗布した。これらの平板を3
7℃で12〜17時間インキュベートする。
20℃で10分間インキュベートする。トリプトン培地
〔蒸留水1リツトル中に、10gのバクトートリプトン
(Dirco) 、1 gの酵母エキス(Dirco)
、1 gのグルコース、8gのNaC1および294
mgのCaC1z ・2 HtOを含む)1mlを加え
て、混合物を30Or p mで攪拌しながら37℃で
30分間インキュベートする。混合物を、2個の50g
g / m lのアンピシリン(Sigma)を加えた
寒天平板(McConkey Agar、 ロ1fc
o;0.6ml/平板)に塗布した。これらの平板を3
7℃で12〜17時間インキュベートする。
10個の異なるコロニーのプラスミドDNAを、次のよ
うにして単離する。
うにして単離する。
上記のコロニーを、25m1の三角フラスコ中50μg
/ m 1のアンピシリンを補填したトリプトン培地
I Q m lに接種するのに用いる。培地を37℃、
300 r p mで15〜18時間攪拌する。細胞を
遠心骨1i1i1(Sorval 、 HS −40−
ター、4℃、4000 r p mで10分間)によっ
て回収する。約0.1gの細胞が得られ、これらを1m
lの50mMのトリス・HCI (pH8,0)に再
分散する。
/ m 1のアンピシリンを補填したトリプトン培地
I Q m lに接種するのに用いる。培地を37℃、
300 r p mで15〜18時間攪拌する。細胞を
遠心骨1i1i1(Sorval 、 HS −40−
ター、4℃、4000 r p mで10分間)によっ
て回収する。約0.1gの細胞が得られ、これらを1m
lの50mMのトリス・HCI (pH8,0)に再
分散する。
0.25m lのリゾチーム溶液(5QmMのトリス・
HC1(pH8,0) 1m l当たり10 m g
s リゾチームは8181118社より発売されてい
る〕を加え、0℃で10分間インキュベートした後、0
.5mM1!DTA (pH7,5) 0.15m l
を加える。0℃でさらに10分装いた後に、60μlの
2%TritonX −100(Merck)を加える
。0℃で30分後に、試料を5orval S A−
600ローター中で4℃で15.00Orpmで30分
間遠心分離する。上澄液を、1容量のフェノール(TN
Eで飽和)で脱蛋白する。
HC1(pH8,0) 1m l当たり10 m g
s リゾチームは8181118社より発売されてい
る〕を加え、0℃で10分間インキュベートした後、0
.5mM1!DTA (pH7,5) 0.15m l
を加える。0℃でさらに10分装いた後に、60μlの
2%TritonX −100(Merck)を加える
。0℃で30分後に、試料を5orval S A−
600ローター中で4℃で15.00Orpmで30分
間遠心分離する。上澄液を、1容量のフェノール(TN
Eで飽和)で脱蛋白する。
4℃で500Or p mで、遠心分離(Sorval
HB −40−ター)することによって、相を分離す
る。上相を1容量のクロロホルムで抽出する。スイ臓R
NAアーゼA(Siga+a; l Omg/1m1T
NE。
HB −40−ター)することによって、相を分離す
る。上相を1容量のクロロホルムで抽出する。スイ臓R
NAアーゼA(Siga+a; l Omg/1m1T
NE。
85℃で10分間前加熱)を加えて最終濃度を25μg
/ m lとして、混合物を37℃で40分間インキ
ュベートする。次いで、溶液をI M NaC1および
10%ポリエチレングリコール6000(F141ka
、オートクレーブ中で120℃で20分間処理)に調整
して、−10℃で2時間インキュベートする。
/ m lとして、混合物を37℃で40分間インキ
ュベートする。次いで、溶液をI M NaC1および
10%ポリエチレングリコール6000(F141ka
、オートクレーブ中で120℃で20分間処理)に調整
して、−10℃で2時間インキュベートする。
沈澱を5orval HB −40−ター(0℃、1
0.OQOrpmで20分間)中で集め、100μlの
TNEに再度溶解する。DNA溶液を1容量のフェノー
ルで抽出して、DNAを2容量のエタノールにより一8
0℃で10分間沈澱させる。沈澱をEppendorf
遠心分離機で遠心分離によって集め、DNAを20μl
の10mM)リス・HCI (pH7,5)および0.
5 mM EDTAに再溶解する。lQmlの培養液
から、8〜lOμgのプラスミド DNAが得られる。
0.OQOrpmで20分間)中で集め、100μlの
TNEに再度溶解する。DNA溶液を1容量のフェノー
ルで抽出して、DNAを2容量のエタノールにより一8
0℃で10分間沈澱させる。沈澱をEppendorf
遠心分離機で遠心分離によって集め、DNAを20μl
の10mM)リス・HCI (pH7,5)および0.
5 mM EDTAに再溶解する。lQmlの培養液
から、8〜lOμgのプラスミド DNAが得られる。
プラスミドDNAは以下の制限酵素を用いる消化の後、
分析する。
分析する。
それぞれの場合に、酵素業者の指示に従い、標準的方法
によってl1pal(Billabs)および1置pa
l([5iolabs) とEcoRI ([1iol
abs)およびC1a I(Biolabs)を用いて
切断する。DNAを、40mMトリス−HC1(pH7
,8) 、 1mM HDTAおよび0.5μg
/ m lの臭化エチジウム中1%アガロースゲル上で
分画する。所望のプラスミドは0pa1部位を含み、3
回消化した後、大きなりNAフラグメントの他に2種類
の小さなフラグメントであってpBR322の小さなI
!coRI −C1a Iフラグメントよりも大きなフ
ラグメントを生じる。これらのプラスミドの一つをp1
59と命名する(第3図参照)。
によってl1pal(Billabs)および1置pa
l([5iolabs) とEcoRI ([1iol
abs)およびC1a I(Biolabs)を用いて
切断する。DNAを、40mMトリス−HC1(pH7
,8) 、 1mM HDTAおよび0.5μg
/ m lの臭化エチジウム中1%アガロースゲル上で
分画する。所望のプラスミドは0pa1部位を含み、3
回消化した後、大きなりNAフラグメントの他に2種類
の小さなフラグメントであってpBR322の小さなI
!coRI −C1a Iフラグメントよりも大きなフ
ラグメントを生じる。これらのプラスミドの一つをp1
59と命名する(第3図参照)。
B、プラスミドllR1145の
2μgのpL59DNAを、10単位のEcoRI(B
iolabs)を用いて37℃で30分間消化する。
iolabs)を用いて37℃で30分間消化する。
DNAをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、
遠心分離の後、lOμlの10mM)リス。
遠心分離の後、lOμlの10mM)リス。
)(CI (pH7,5)および0.5 m M E
DTAに溶解する。EcoRIで消化されたDNAを、
更にlQmMMgCh+ 10 mM β−メルカプ
トエタノール、50m M NaC1,0,1m M
dATP(P & f、B11ches+1cals)
。
DTAに溶解する。EcoRIで消化されたDNAを、
更にlQmMMgCh+ 10 mM β−メルカプ
トエタノール、50m M NaC1,0,1m M
dATP(P & f、B11ches+1cals)
。
0、1 mM dTTP (P & L Bioch
e−micals)中5単位のDNAポリメラーゼ(K
teno−フラグメント)(Boeringet)で1
2℃で15分間処理する。次いで、85℃で5分間イン
キエベートしてポリメラーゼを不活性化する。反応混合
物を、20mM)リス・HC1(pH7,8) 、
10mMのMgCl2110mMのDTT、0.5mM
のA T P (Sigma)で10倍に希釈し、1μ
lの反応混合胸当たり30単位のT、DNAリガーゼを
用いて、15℃で1時間インキエベートする。50nH
のDNAを(上記方法で)E、コリ中に形質転換し、5
0μg/mlのアンピシリンを補填したMcConke
y寒天平板上に塗布する。
e−micals)中5単位のDNAポリメラーゼ(K
teno−フラグメント)(Boeringet)で1
2℃で15分間処理する。次いで、85℃で5分間イン
キエベートしてポリメラーゼを不活性化する。反応混合
物を、20mM)リス・HC1(pH7,8) 、
10mMのMgCl2110mMのDTT、0.5mM
のA T P (Sigma)で10倍に希釈し、1μ
lの反応混合胸当たり30単位のT、DNAリガーゼを
用いて、15℃で1時間インキエベートする。50nH
のDNAを(上記方法で)E、コリ中に形質転換し、5
0μg/mlのアンピシリンを補填したMcConke
y寒天平板上に塗布する。
10個の異なるコロニーのプラスミドDNAを上記の方
法で単離する。プラスミドDNAをEcoR■で消化す
ることによって分析する。所望のプラスミドは[Eco
RI耐性である。分析は、上記の方法で行う。所望のプ
ラスミド1つをllR1145と命名する(第3図参照
)。
法で単離する。プラスミドDNAをEcoR■で消化す
ることによって分析する。所望のプラスミドは[Eco
RI耐性である。分析は、上記の方法で行う。所望のプ
ラスミド1つをllR1145と命名する(第3図参照
)。
C,ブースミドllR1148の゛告二2pgのpHR
1145−D N Aを、5単位のC1al(Boer
inger)を用いて37℃で60分間処理し、次いで
フェノール抽出によって脱蛋白する。
1145−D N Aを、5単位のC1al(Boer
inger)を用いて37℃で60分間処理し、次いで
フェノール抽出によって脱蛋白する。
DNAをエタノールで沈澱させた後、20μmの10m
M)リス・HCl (pH7,5)および0.5mM
EDTAに溶解する。突出した末端を、dATPおよ
びdTTPの代りにdCTP (P & L Rioc
hesicals)およびdGTP (P &゛L B
iochemicalg)を用いることを除き、上記と
同様にしてDNAポリメラーゼ■(Kleno−フラグ
メント)で処理する。85℃で5分間インキエベートす
ることによってポリメラーゼを不活性化する。2容量の
0.1 M )リス・HCI(pH8,7)を反応混合
物に加え、0.5単位のウシホスファターゼ(Boer
inget)と共に37℃で30分間インキエベートす
る0反応部合物をフェノールで抽出することによって脱
蛋白する。DNAをエタノールで沈澱させ、8μlの1
0mMトリス・HCI (pH7,5)および0.5
m M EDTAに溶解する。
M)リス・HCl (pH7,5)および0.5mM
EDTAに溶解する。突出した末端を、dATPおよ
びdTTPの代りにdCTP (P & L Rioc
hesicals)およびdGTP (P &゛L B
iochemicalg)を用いることを除き、上記と
同様にしてDNAポリメラーゼ■(Kleno−フラグ
メント)で処理する。85℃で5分間インキエベートす
ることによってポリメラーゼを不活性化する。2容量の
0.1 M )リス・HCI(pH8,7)を反応混合
物に加え、0.5単位のウシホスファターゼ(Boer
inget)と共に37℃で30分間インキエベートす
る0反応部合物をフェノールで抽出することによって脱
蛋白する。DNAをエタノールで沈澱させ、8μlの1
0mMトリス・HCI (pH7,5)および0.5
m M EDTAに溶解する。
次の式:
%式%
を有する化学的に合成したDNAリンカ−を、0、1
mM rATP(Sign+a)、50mM)リス・H
CI(all 9.5 ) 、10 m M MgC1
g、5mM DTTおよび2単位のT4ポリヌクレオ
チドキナーゼ(P& L Biochemicals)
を含む反応容積8μm中で、8aモルのリンカ−を5μ
Ci (γ−”P−ATP (5500Ci −mM
−’、Amershao+)と共に37℃で30分間イ
ンキエベートすることによって5′−末端をリン酸化す
る。−80℃で凍結することによって反応を停止させる
。
mM rATP(Sign+a)、50mM)リス・H
CI(all 9.5 ) 、10 m M MgC1
g、5mM DTTおよび2単位のT4ポリヌクレオ
チドキナーゼ(P& L Biochemicals)
を含む反応容積8μm中で、8aモルのリンカ−を5μ
Ci (γ−”P−ATP (5500Ci −mM
−’、Amershao+)と共に37℃で30分間イ
ンキエベートすることによって5′−末端をリン酸化す
る。−80℃で凍結することによって反応を停止させる
。
放射能標識したリンカ−を次に1agのC1a Tおよ
びホスファターゼで処理し、そして0.5mMrATP
(Sigma) 、10mM DTT(Calbio
chem)、20mM)リス・HCl (pH7,8
) 、1mMMgCIgおよび800単位のT、DNA
リガーゼ(Biolabs)を含む20μlの反応容積
中でpHR1145−DNA (上記を参照されたい)
と連結する。インキュベーションを15℃で2時間行う
。85℃で10分間インキエベートすることによってリ
ガーゼを不活性化する。次に、2容量の水を加え、塩化
ナトリウム濃度を10mMに調整し、20単位のKpn
I ([1io1abs)を37℃で30分間にわた
って加える9、フェノールおよびクロロホルムで抽出し
た後、混合物を、40Mトリス・酢酸(pH7,8)。
びホスファターゼで処理し、そして0.5mMrATP
(Sigma) 、10mM DTT(Calbio
chem)、20mM)リス・HCl (pH7,8
) 、1mMMgCIgおよび800単位のT、DNA
リガーゼ(Biolabs)を含む20μlの反応容積
中でpHR1145−DNA (上記を参照されたい)
と連結する。インキュベーションを15℃で2時間行う
。85℃で10分間インキエベートすることによってリ
ガーゼを不活性化する。次に、2容量の水を加え、塩化
ナトリウム濃度を10mMに調整し、20単位のKpn
I ([1io1abs)を37℃で30分間にわた
って加える9、フェノールおよびクロロホルムで抽出し
た後、混合物を、40Mトリス・酢酸(pH7,8)。
l m M EDTAおよび0.5.crg/mlの臭
化エチジウム中0.9%の低融点アガロースゲル(Bi
orad)を通して分画する。紫外線照射によって目視
出来且つ同じ大きさのマーカーDNAと同じ移動度を示
すバンドを小力で切り取る。ゲルの部分を65℃で5分
間溶融した後、37℃に冷却する。約20μlの容量が
得られる。この溶液5μlを採取して、0.5mM
ATP、10mM DTT、10mM MgCh、
20 mM トリス・HCl (pH7,8)に調
整しておいた10.IJlの反応容積中400単位のT
4リガーゼ(Biolabs)と共に15℃で12時間
インキュベートする。100mM)リス・HCI(pH
7、8) 、 100mM CaC1gおよび10
0mMMgCl zから成る溶液1/10容量を、リガ
ーゼ混合物(15℃で固イいに加え、全量を65℃で5
分間インキュベートする6次に、この溶液を、上記と同
様にして、カルシウム処理したE、コリHBIOI細胞
を形質転換するのに用いる。50μg/ m lのアン
ピシリンを加えたMcConkey寒天平板上に塗布す
る。
化エチジウム中0.9%の低融点アガロースゲル(Bi
orad)を通して分画する。紫外線照射によって目視
出来且つ同じ大きさのマーカーDNAと同じ移動度を示
すバンドを小力で切り取る。ゲルの部分を65℃で5分
間溶融した後、37℃に冷却する。約20μlの容量が
得られる。この溶液5μlを採取して、0.5mM
ATP、10mM DTT、10mM MgCh、
20 mM トリス・HCl (pH7,8)に調
整しておいた10.IJlの反応容積中400単位のT
4リガーゼ(Biolabs)と共に15℃で12時間
インキュベートする。100mM)リス・HCI(pH
7、8) 、 100mM CaC1gおよび10
0mMMgCl zから成る溶液1/10容量を、リガ
ーゼ混合物(15℃で固イいに加え、全量を65℃で5
分間インキュベートする6次に、この溶液を、上記と同
様にして、カルシウム処理したE、コリHBIOI細胞
を形質転換するのに用いる。50μg/ m lのアン
ピシリンを加えたMcConkey寒天平板上に塗布す
る。
10個の異なるプラスミドDNAが上記と同様に単離さ
れ、このDNAを次の制限酵素分析に付する。すなわち
、それぞれの場合に、0.5μgのプラスミドDNAを
、酵素製造業者の指示にしたがってKpn 1 (Bi
olabs)、Nco I (ISiolabs)およ
びncoRI (Biolabs)を用いて次々と切断
する。開裂生成物を、40mM)リス・酢酸(pH7,
8)、1 mM [!DTA 、、0.5 p g/m
lの臭化エチジウム中1%アガロースゲル上で分画す
る。総てのプラスミドは、それぞれ所望なようにこれら
の酵素切断部位の1つを示す。1つをHRi14Bと命
名する。
れ、このDNAを次の制限酵素分析に付する。すなわち
、それぞれの場合に、0.5μgのプラスミドDNAを
、酵素製造業者の指示にしたがってKpn 1 (Bi
olabs)、Nco I (ISiolabs)およ
びncoRI (Biolabs)を用いて次々と切断
する。開裂生成物を、40mM)リス・酢酸(pH7,
8)、1 mM [!DTA 、、0.5 p g/m
lの臭化エチジウム中1%アガロースゲル上で分画す
る。総てのプラスミドは、それぞれ所望なようにこれら
の酵素切断部位の1つを示す。1つをHRi14Bと命
名する。
このプラスミドHRi14Bは、トリプトファンプロモ
ーター−オペレーターおよびATG (これも含む)ま
でのりボゾーム結合部位を含む。ヒルジンおよびその他
の異種遺伝子も、このプラスミド中に1個存在するEc
oRI、Nco I s Kpn I部位を介して直
接にカップリングすることができる。また、この構造は
、対応する遺伝子上に存在なければならない翻訳の開始
に必要なATGを伴わない異種遺伝子の直接のカップリ
ングおよび発現を行うことが可能である。これは、上記
のように、Nco Iで切断しそしてDNAポリメラー
ゼで突出する末端を修復することにより、またはKpn
Iで切断してヌクレアーゼSIによって突出末端を除
去することにより容易に達成することができる。したが
って、プラスミドHRi14Bは、広い用途を有する発
現プラスミドである。
ーター−オペレーターおよびATG (これも含む)ま
でのりボゾーム結合部位を含む。ヒルジンおよびその他
の異種遺伝子も、このプラスミド中に1個存在するEc
oRI、Nco I s Kpn I部位を介して直
接にカップリングすることができる。また、この構造は
、対応する遺伝子上に存在なければならない翻訳の開始
に必要なATGを伴わない異種遺伝子の直接のカップリ
ングおよび発現を行うことが可能である。これは、上記
のように、Nco Iで切断しそしてDNAポリメラー
ゼで突出する末端を修復することにより、またはKpn
Iで切断してヌクレアーゼSIによって突出末端を除
去することにより容易に達成することができる。したが
って、プラスミドHRi14Bは、広い用途を有する発
現プラスミドである。
5μgのpHR1148のプラスミドDNAを、制限エ
ンドヌクレアーゼEcoRIおよびBa5g1l Iで
消化する。切り取られたベクターpHR1148/[B
coR1/Bam1l Iを、密度勾配遠心分離によっ
て単離する。
ンドヌクレアーゼEcoRIおよびBa5g1l Iで
消化する。切り取られたベクターpHR1148/[B
coR1/Bam1l Iを、密度勾配遠心分離によっ
て単離する。
5μgのpl’1L300のプラスミドDNAを、最初
に100mM)リス・HCl (pH7,5) 、
50mMNaC1および100#g/mlのゼラチン
の溶液50μl中で、10単位のEcoRI制限エンド
ヌクレアーゼを用いて、37℃で1時間消化する。この
線状化したプラスミドDNA/EcoR1の一部(0,
5μg)をアガロースゲル(実施例10a参照)からゲ
ル溶出によって単離し、そしてCr−”P)ATPで放
射能標識する(実施例12参照)。次に、主要量のプラ
スミドD N A/BcoRIをこの放射能標識したD
NAと混合して、BcoRII制御エンドヌクレアーゼ
を用いて消化し、EcoRII −1!coRI ”D
NAフラグメント(109塩基対)を8%ポリアクリル
アミド上でゲル電気泳動によって分離する。
に100mM)リス・HCl (pH7,5) 、
50mMNaC1および100#g/mlのゼラチン
の溶液50μl中で、10単位のEcoRI制限エンド
ヌクレアーゼを用いて、37℃で1時間消化する。この
線状化したプラスミドDNA/EcoR1の一部(0,
5μg)をアガロースゲル(実施例10a参照)からゲ
ル溶出によって単離し、そしてCr−”P)ATPで放
射能標識する(実施例12参照)。次に、主要量のプラ
スミドD N A/BcoRIをこの放射能標識したD
NAと混合して、BcoRII制御エンドヌクレアーゼ
を用いて消化し、EcoRII −1!coRI ”D
NAフラグメント(109塩基対)を8%ポリアクリル
アミド上でゲル電気泳動によって分離する。
200μgのF 1− D N A /EcoRI ”
/EcoRIfを、ゲル溶出によって単離する。
/EcoRIfを、ゲル溶出によって単離する。
Il、F −DNA/BamHI [!coRI[
の 65pgのpML305のプラスミドDNAを、B
am1l I制限エンドヌクレアーゼ10単位を用いて
切断する。この線状化したプラスミドD N A/Ba
s+HIをアガロースゲル(実施例10a参照)からゲ
ル溶出することによって単離し、Cr−”P)(実施例
12参照)を用いて放射能標識する。次に、主要量のプ
ラスミドD N A / Bam1l Iをこの放射能
標識したDNAと混合し、II!coRII制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、EcoRII −Bam+1目
” DNAフラグメント(122塩基対)を8%ポリア
クリルアミド上でゲル電気泳動によって分離する。25
0μgのF2− D N A /Ba5ll I ”
/EcoRIfが単離される。
の 65pgのpML305のプラスミドDNAを、B
am1l I制限エンドヌクレアーゼ10単位を用いて
切断する。この線状化したプラスミドD N A/Ba
s+HIをアガロースゲル(実施例10a参照)からゲ
ル溶出することによって単離し、Cr−”P)(実施例
12参照)を用いて放射能標識する。次に、主要量のプ
ラスミドD N A / Bam1l Iをこの放射能
標識したDNAと混合し、II!coRII制限エンド
ヌクレアーゼで消化し、EcoRII −Bam+1目
” DNAフラグメント(122塩基対)を8%ポリア
クリルアミド上でゲル電気泳動によって分離する。25
0μgのF2− D N A /Ba5ll I ”
/EcoRIfが単離される。
実施例10Cに既に記載の方法で、10ng(=473
nモルの末端)のFl −DNA/EcoRI/Eco
RUおよび9 n g (= 495nモルの末端)の
F t −D N A /Bamfl I /BcoR
IIを、20μlの容量中でT4DNAリガーゼで処理
する。次に、この混合物をフェノール/クロロホルムで
抽出し、そしてDNAをアルコールで沈澱させる0次い
で、このDNA沈澱を実施例10cに記載のように溶解
させ、EcoRIおよびBam1l T制限エンドヌク
レアーゼで消化させる。次いで、この溶液をTNEで標
準化して、30ng(−50nモルの末端)のベクター
D N A pHR1148/EcoRI /Bawl
I (実施例13aD参照)を加える0次に、この
溶液をフェノール/クロロホルムで再度抽出し、そして
DNAをアルコールで沈澱させる。沈澱したDNA混合
物を実施例10cに記載の方法で74DNAリガーセ(
Biolabs)で処理する。この方法で、インサート
としてF、−F、−DNA (デスルファトヒルジン遺
伝子)を含む組み替えプラスミドが溶液中に生成する。
nモルの末端)のFl −DNA/EcoRI/Eco
RUおよび9 n g (= 495nモルの末端)の
F t −D N A /Bamfl I /BcoR
IIを、20μlの容量中でT4DNAリガーゼで処理
する。次に、この混合物をフェノール/クロロホルムで
抽出し、そしてDNAをアルコールで沈澱させる0次い
で、このDNA沈澱を実施例10cに記載のように溶解
させ、EcoRIおよびBam1l T制限エンドヌク
レアーゼで消化させる。次いで、この溶液をTNEで標
準化して、30ng(−50nモルの末端)のベクター
D N A pHR1148/EcoRI /Bawl
I (実施例13aD参照)を加える0次に、この
溶液をフェノール/クロロホルムで再度抽出し、そして
DNAをアルコールで沈澱させる。沈澱したDNA混合
物を実施例10cに記載の方法で74DNAリガーセ(
Biolabs)で処理する。この方法で、インサート
としてF、−F、−DNA (デスルファトヒルジン遺
伝子)を含む組み替えプラスミドが溶液中に生成する。
カルシウムで処理したE、コミ月IBIOI !II胞
の形質転換を、実施例10dに記載の方法で行う。実施
例13cで得られた反応混合物lOμlを用いる。
の形質転換を、実施例10dに記載の方法で行う。実施
例13cで得られた反応混合物lOμlを用いる。
420個のアンピシリン耐性のコロニーが得られる。
18個の形質転換されたコロニー(実施例13d)を実
施例10eに記載の方法でFl−F2−DNA含有につ
いて検討する。実施例5および6において記載したオリ
ゴデオキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとし
て用いる。オートラジオグムにおいて、12個のコロニ
ーが得られ、そのうちの5個をpML310、pML3
11、pML312、pML313およびpML314
と命名する。
施例10eに記載の方法でFl−F2−DNA含有につ
いて検討する。実施例5および6において記載したオリ
ゴデオキシヌクレオチドの混合物を放射能プローブとし
て用いる。オートラジオグムにおいて、12個のコロニ
ーが得られ、そのうちの5個をpML310、pML3
11、pML312、pML313およびpML314
と命名する。
!施■上土 クローン札 の 。
laxam及びG11bert(上記)にしたがってF
、−F、−DNAを配列決定することによって、実施例
12に記載の方法で組換プラスミドpML310に於け
るFl −Fg −DNA配列の特性決定を行う。
、−F、−DNAを配列決定することによって、実施例
12に記載の方法で組換プラスミドpML310に於け
るFl −Fg −DNA配列の特性決定を行う。
10μgのFl Ft−DNAを検討する。Fl−F
2−DNAのヌクレオチド配列は、合成デスルファトヒ
ルジン遺伝子について記載された配列と同一である。
2−DNAのヌクレオチド配列は、合成デスルファトヒ
ルジン遺伝子について記載された配列と同一である。
ヒルジンについて化学的に合成された遺伝子を、プラス
ミドpML310に於ける206bpEcoRI −B
aa+HEインサートとして増幅する。この遺伝子をプ
ラスミドから切除して、制御可能なPII05プロモー
タの制御下に酵母において発現せしめる。この造成物は
、欧州特許出願筒143.081号明細書に記載のよう
に、54tbp鷹プロモ一タ配列および完全なPII0
5シグナル配列(17個のアミノ酸をコードする51個
のヌクレオチド)を含有する。この配列は、天然の成熟
ヒルジンのNHt・−末端アミノ酸としてのバリンのコ
ドンから始まるヒルジンの成熟コード配列にインフレー
ム融合している。ヒルジン遺伝子は、その3′−末端に
P II O5転写停止シグナルを提供するDNAフラ
グメントを有する。
ミドpML310に於ける206bpEcoRI −B
aa+HEインサートとして増幅する。この遺伝子をプ
ラスミドから切除して、制御可能なPII05プロモー
タの制御下に酵母において発現せしめる。この造成物は
、欧州特許出願筒143.081号明細書に記載のよう
に、54tbp鷹プロモ一タ配列および完全なPII0
5シグナル配列(17個のアミノ酸をコードする51個
のヌクレオチド)を含有する。この配列は、天然の成熟
ヒルジンのNHt・−末端アミノ酸としてのバリンのコ
ドンから始まるヒルジンの成熟コード配列にインフレー
ム融合している。ヒルジン遺伝子は、その3′−末端に
P II O5転写停止シグナルを提供するDNAフラ
グメントを有する。
この発現プラスミドのベクタ一部分は酵母2μ配列、酵
母における選択用酵母LEU 2遺伝子およびE、コリ
における選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝子および
E、コリの複製開始点を含む。方法は、第5.6および
7図に示す。
母における選択用酵母LEU 2遺伝子およびE、コリ
における選択と増幅用のアンピシリン耐性遺伝子および
E、コリの複製開始点を含む。方法は、第5.6および
7図に示す。
デスルファトヒルジンをコードするヌクレオチド配列は
、最終の遺伝子生成物においては、N1h−末端バリン
のためのGTTから始まる。E、コリにおけるサブクロ
ーン化および発現を好都合にするため、コード配列は5
′末端においてUcoRI制限部位およびATG介しコ
ドンを含む8個のヌクレオチドにより延長されている。
、最終の遺伝子生成物においては、N1h−末端バリン
のためのGTTから始まる。E、コリにおけるサブクロ
ーン化および発現を好都合にするため、コード配列は5
′末端においてUcoRI制限部位およびATG介しコ
ドンを含む8個のヌクレオチドにより延長されている。
ヒルジンコード配列をPII05>グナルペブチドをコ
ードする配列に正確にインフレーム融合させるためには
、これらの追加のヌクレオチドを除去しなければならな
い。これは、EcoRI制限部位を平滑末端部位に変換
し、Ilgalによるその後の切断がGTTコドンの直
ぐ上流に起こるような位置にHga I認識部位を含有
する合成オリゴヌクレオチドを付加することによって達
成される。
ードする配列に正確にインフレーム融合させるためには
、これらの追加のヌクレオチドを除去しなければならな
い。これは、EcoRI制限部位を平滑末端部位に変換
し、Ilgalによるその後の切断がGTTコドンの直
ぐ上流に起こるような位置にHga I認識部位を含有
する合成オリゴヌクレオチドを付加することによって達
成される。
一゛スルフ トヒルジン゛ −の−の11aI切゛皿位
■星入(第5図参照) 8μgのプラスミドpML310 (実施例13c参照
)を、制限エンドヌクレアーゼf!coRIで完全に消
化する。D N A (pML310/EcoRI )
をフェノール/クロロホルムで抽出して、エタノールで
沈澱させる。ヌクレアーゼS1によって、5′突出末端
を除去する。4μgのpML310/ EcoRI
D N Aを、100μ+の250mM NaC1、1
mM Zn5On 、 30mM酢酸ナトリウム(al
l 4.6 )および20単位/mlのヌクレオチドS
r (Sigma)中で、37℃で45分間消化する
。
■星入(第5図参照) 8μgのプラスミドpML310 (実施例13c参照
)を、制限エンドヌクレアーゼf!coRIで完全に消
化する。D N A (pML310/EcoRI )
をフェノール/クロロホルムで抽出して、エタノールで
沈澱させる。ヌクレアーゼS1によって、5′突出末端
を除去する。4μgのpML310/ EcoRI
D N Aを、100μ+の250mM NaC1、1
mM Zn5On 、 30mM酢酸ナトリウム(al
l 4.6 )および20単位/mlのヌクレオチドS
r (Sigma)中で、37℃で45分間消化する
。
DNAをフェノール/クロロボルムで抽出して、エタノ
ールを用いて沈澱させる。D N A (pML310
/r!coRI /s + )を100.ulの50m
M)リス・HCl (pH8,0)に再分散させ、2
単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CIAP%
Boeringer)と共に37℃で1時間インキュベ
ートする。酵素を、65℃で1.5時間インキュベート
して不活性化する。
ールを用いて沈澱させる。D N A (pML310
/r!coRI /s + )を100.ulの50m
M)リス・HCl (pH8,0)に再分散させ、2
単位のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(CIAP%
Boeringer)と共に37℃で1時間インキュベ
ートする。酵素を、65℃で1.5時間インキュベート
して不活性化する。
培養混合物中のNaC1:33度を150mMに調整す
る。
る。
デスルファトヒルジンD N A (pML310/f
!coRI /S、 /CIAP)を、低塩緩衝液(1
50mM NaC1。
!coRI /S、 /CIAP)を、低塩緩衝液(1
50mM NaC1。
10mMトリス・HCl (pH8,0)、 1 m
M [1DTA )中でDE52 (Whatw+an
)イオン交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝
溶液(1,5M NaC1。
M [1DTA )中でDE52 (Whatw+an
)イオン交換カラムに吸着させて精製した後、高塩緩衝
溶液(1,5M NaC1。
10mM)リス・HC1(pH8,O)、 1 mM
EDTA )を用いて溶出させる。DNAをエタノール
で沈澱させ、水に再分散させて0.8 m g / m
lの濃度にする。
EDTA )を用いて溶出させる。DNAをエタノール
で沈澱させ、水に再分散させて0.8 m g / m
lの濃度にする。
次の式:
%式%
を有するオリゴヌクレオチドを、ホスホトリエステル法
[板倉ら、J、Am、Chem、Soc、、第103巻
、706頁(1981年)]によって合成する。オリゴ
ヌクレオチドの配列は制限エンドヌクレアーゼHga
1の認識部位−GACGC−を有する自己相補性である
。
[板倉ら、J、Am、Chem、Soc、、第103巻
、706頁(1981年)]によって合成する。オリゴ
ヌクレオチドの配列は制限エンドヌクレアーゼHga
1の認識部位−GACGC−を有する自己相補性である
。
2本の単鎖をアニーリングすることにより、12個の塩
基対を有する2本鎖DNAリンカ−になる。
基対を有する2本鎖DNAリンカ−になる。
1.2μgの合成の単鎖オリゴデオキシヌクレチオドを
、10ulの60mMトリス・HCl(pH7,5)、
10mM MgCb、5mM DTT、30μC1の
Cr −”p ] AT P (3000Ci−mM−
’、Amersham)および6単位のT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ(Boehringer)中で37℃で
30分間、次いで0.5mM ATPの存在下で37
℃で15分間リン酸化する。混合者を75℃で10分間
更にインキュベートして酵素を不活性化して、次いで室
温に冷却してアニーリングする。0.6μg (170
pモル)の22pで標識したリンカ−DNAを264#
g (1,75pモル末端)のpML310/ Eco
RI / S +/(、IAPと混合し、20μlの6
0mMトリス・HCl (pH7、5)、 10 m
MのMgC1z、 5 mMDTT、3.5mM
ATP、 800単位の74DNAリガーゼ (Bi
olabs)中で15℃で20時間連結する。リガーゼ
を85℃で10分間で不活性化し、過剰のリンカ−分子
を10 mM EDTA (all7.5)、300
mM酢酸ナトリウム(pH6,0)および0.54容の
イソ−プロパツールの存在でDNAを沈澱させることに
よって除去する。室温で30分後にDNAをベレットに
して、45μlの連結混合物(上述)に再分散し、15
℃で6時間連結させて、環状のDNAを形成させる。
、10ulの60mMトリス・HCl(pH7,5)、
10mM MgCb、5mM DTT、30μC1の
Cr −”p ] AT P (3000Ci−mM−
’、Amersham)および6単位のT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ(Boehringer)中で37℃で
30分間、次いで0.5mM ATPの存在下で37
℃で15分間リン酸化する。混合者を75℃で10分間
更にインキュベートして酵素を不活性化して、次いで室
温に冷却してアニーリングする。0.6μg (170
pモル)の22pで標識したリンカ−DNAを264#
g (1,75pモル末端)のpML310/ Eco
RI / S +/(、IAPと混合し、20μlの6
0mMトリス・HCl (pH7、5)、 10 m
MのMgC1z、 5 mMDTT、3.5mM
ATP、 800単位の74DNAリガーゼ (Bi
olabs)中で15℃で20時間連結する。リガーゼ
を85℃で10分間で不活性化し、過剰のリンカ−分子
を10 mM EDTA (all7.5)、300
mM酢酸ナトリウム(pH6,0)および0.54容の
イソ−プロパツールの存在でDNAを沈澱させることに
よって除去する。室温で30分後にDNAをベレットに
して、45μlの連結混合物(上述)に再分散し、15
℃で6時間連結させて、環状のDNAを形成させる。
1μlおよび3μmの連結混合物を、100μlのカル
シウム処理した形質転換コンピテントE。
シウム処理した形質転換コンピテントE。
コリHBIOI細胞[口、Hanahanの方法(J、
Biol、 Chem、、第166巻、557頁、19
83年)によって調製〕に加える。細胞を氷上で30分
間放置し、次いで42℃で3分間°インキュベートし、
氷上で2分間冷却した後、400μlのSOC培地中で
37℃で1時間インキュベートする。細胞をそれぞれ1
00111に濃縮し、50μg/mlのアンピシリンを
有するLB寒天平板に塗布する。
Biol、 Chem、、第166巻、557頁、19
83年)によって調製〕に加える。細胞を氷上で30分
間放置し、次いで42℃で3分間°インキュベートし、
氷上で2分間冷却した後、400μlのSOC培地中で
37℃で1時間インキュベートする。細胞をそれぞれ1
00111に濃縮し、50μg/mlのアンピシリンを
有するLB寒天平板に塗布する。
12個の形質転換したaa+p”コロニーを、それぞれ
100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で増殖
させる。プラスミドDNAをO,S。
100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で増殖
させる。プラスミドDNAをO,S。
Holmesらの方法[Anal、Bioche+++
、 、第114巻、193頁、1981年]にしたがっ
て調製する。合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は
、プライマーとしてヒルジンのコード鎖にハイブリダイ
ズする単鎖D N Aフラグメントを用いるDNA配列
決定によって確かめられる。ヒルジン遺伝子の前の正確
な位置にリンカ−DNAを含有するクローンを、pML
310Lと称する。
、 、第114巻、193頁、1981年]にしたがっ
て調製する。合成オリゴヌクレオチドリンカーの存在は
、プライマーとしてヒルジンのコード鎖にハイブリダイ
ズする単鎖D N Aフラグメントを用いるDNA配列
決定によって確かめられる。ヒルジン遺伝子の前の正確
な位置にリンカ−DNAを含有するクローンを、pML
310Lと称する。
12μgのプラスミドpML310Lを、制限エンドヌ
クレアーゼBa5in Iを用いて完全に消化する。
クレアーゼBa5in Iを用いて完全に消化する。
DNAをフェノール/クロロホルムを用いて抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、2つの制限フラグメントをト
リス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8,3>中1.2
%アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色し
た0、84k b Pvu I −Bamll Iフラ
グメントをゲルスライス中で単離する。DNAを3ml
の0.2 xTBE緩衝液を満たした透析ベッドで電気
溶出する。閉じたバッグをTF3E緩衝液(pH8,3
)(90mM)リス−塩基、90mMホウ酸、2、5
m Mのt!DTA)中に浸漬する。100mAで30
分間電流を通じた後、電流の極性を45秒間反転させ、
DNAを透析膜から剥離させる。透析バッグのゲルスラ
イスを取り巻く緩衝液を回収して、150mM NaC
1に調整し、Dn52 (Wha tman)イオン交
換カラムを通過させる。DNAを高温緩衝液[1,5M
NaC1,10mM トリス−HC1(pH8,O)
。
タノールで沈澱させた後、2つの制限フラグメントをト
リス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8,3>中1.2
%アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色し
た0、84k b Pvu I −Bamll Iフラ
グメントをゲルスライス中で単離する。DNAを3ml
の0.2 xTBE緩衝液を満たした透析ベッドで電気
溶出する。閉じたバッグをTF3E緩衝液(pH8,3
)(90mM)リス−塩基、90mMホウ酸、2、5
m Mのt!DTA)中に浸漬する。100mAで30
分間電流を通じた後、電流の極性を45秒間反転させ、
DNAを透析膜から剥離させる。透析バッグのゲルスラ
イスを取り巻く緩衝液を回収して、150mM NaC
1に調整し、Dn52 (Wha tman)イオン交
換カラムを通過させる。DNAを高温緩衝液[1,5M
NaC1,10mM トリス−HC1(pH8,O)
。
1 mM EDTA)を用いて溶出させ、エタノールで
沈澱させ、水に再溶解させて0.1 m g / m
lの濃度にする。
沈澱させ、水に再溶解させて0.1 m g / m
lの濃度にする。
pML310Lの0.84k b Pvu I −Ba
mHIフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼHga
Iで更に消化する。この消化により、成熟デスルファ
トヒルジンの完全なコード配列を含有する198k b
Hga l−Ba1m1(Iフラグメントが生じる0
次のAlu Iによる消化では、198bp Hga
T −Baa+HIフラグメントには触れないが、同
様な大きさのその他のHga 1フラグメントを除去す
る。
mHIフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼHga
Iで更に消化する。この消化により、成熟デスルファ
トヒルジンの完全なコード配列を含有する198k b
Hga l−Ba1m1(Iフラグメントが生じる0
次のAlu Iによる消化では、198bp Hga
T −Baa+HIフラグメントには触れないが、同
様な大きさのその他のHga 1フラグメントを除去す
る。
0、2 k b i(ga I −BamHIフラグメ
ントはTBE緩衝液中1.5%アガロースゲル上で他の
フラグメントから分離され、(上記のよ゛うに)電気溶
出によって単離される。DNAは口[52イオン交換ク
ロマトグラフイおよびエタノール沈澱によって精製され
る。DNAを水に再分散して、30μg/m1(0,2
pモル/μl)の濃度にする。
ントはTBE緩衝液中1.5%アガロースゲル上で他の
フラグメントから分離され、(上記のよ゛うに)電気溶
出によって単離される。DNAは口[52イオン交換ク
ロマトグラフイおよびエタノール沈澱によって精製され
る。DNAを水に再分散して、30μg/m1(0,2
pモル/μl)の濃度にする。
プラスミドp31/PII05−TPA18(欧州特許
出願筒143.081号明細書参照)は、皿プロモータ
ーおよび外来構造遺伝子(t−PA)にインフレーム融
合したPII05シグナル配列を存する。584bpB
amll r −Bat Iフラグメントは11 HO
5、および3′末端の8個のヌクレオチドを除(PI(
05シグナル配列の総てを含有する。
出願筒143.081号明細書参照)は、皿プロモータ
ーおよび外来構造遺伝子(t−PA)にインフレーム融
合したPII05シグナル配列を存する。584bpB
amll r −Bat Iフラグメントは11 HO
5、および3′末端の8個のヌクレオチドを除(PI(
05シグナル配列の総てを含有する。
8μgのp31/P1105−↑PA1BDNAを制限
エンドヌクレアーゼBa1Iで消化する(37℃で16
時間)。DNAをフェノール/クロロホルム抽出および
エタノール沈澱によって精製する。
エンドヌクレアーゼBa1Iで消化する(37℃で16
時間)。DNAをフェノール/クロロホルム抽出および
エタノール沈澱によって精製する。
DNAを水に再分散させ、0.7 m g / m 1
の濃度にする。
の濃度にする。
PH05シグナル配列とデスルファトヒルジンをコード
領域との間の正確な連結は、次の式:%式% の合成リンカ−によって行われる。
領域との間の正確な連結は、次の式:%式% の合成リンカ−によって行われる。
リンカ−(5’−CCAATGC八)の5′末端の8個
のヌクレオチドはBal[部位からプロセシング部位へ
のPH05シグナル配列の一部分を表す。
のヌクレオチドはBal[部位からプロセシング部位へ
のPH05シグナル配列の一部分を表す。
オリゴヌクレオチド(2)の5′−の突出している5個
のヌクレオチドは、デスルファトヒルジンコード配列の
5′末端のHga I切断部位に対合する。
のヌクレオチドは、デスルファトヒルジンコード配列の
5′末端のHga I切断部位に対合する。
個々の単鎖オリゴヌクレオチド(1)および(2)は、
ホスホトリエステル法(板金ら、上記)によって合成さ
れる。オリゴヌクレオチド(1)および(2)のそれぞ
れ1.1μgおよび1.8μgを、実施例15に記載の
ようにそれらの5′末端でリン酸化し、等量を混合して
、そしてアニーリングする。
ホスホトリエステル法(板金ら、上記)によって合成さ
れる。オリゴヌクレオチド(1)および(2)のそれぞ
れ1.1μgおよび1.8μgを、実施例15に記載の
ようにそれらの5′末端でリン酸化し、等量を混合して
、そしてアニーリングする。
1.3μg (200pモル)のリン酸化した2本鎖リ
ンカ−DNAを、40plの60mMトリス・HCl
(pH7,5) 10mM MgC1z 、 3
.5mMATP、5mM DTTおよび1400単位
の74DNAリガーゼ(Biolabs)中で7.c+
g(1,8μM)のBa1l開裂p31/PII05−
TPA18に、15℃で16時間で連結する。リガー
ゼを、85℃で10分間不活性化する。過剰のリンカ−
を、10mMEDTA、 300mM酢酸ナトリウム
(pH6,0>および0.54容のイソプロパツールの
存在でDNAを沈澱させることによって除去する。DN
Aを再分散して、制限エンドヌクレアーゼBam1l
Iで更に消化する。DNAをフェノール/クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱させた後、2個の制限フラグ
メントをトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8,3
)中1、2%アガロースゲル上に分離させる。DNAを
電気溶出させ、DE52イオン交換クロマトグラフィお
よびエタノール沈澱によって更に精製する。
ンカ−DNAを、40plの60mMトリス・HCl
(pH7,5) 10mM MgC1z 、 3
.5mMATP、5mM DTTおよび1400単位
の74DNAリガーゼ(Biolabs)中で7.c+
g(1,8μM)のBa1l開裂p31/PII05−
TPA18に、15℃で16時間で連結する。リガー
ゼを、85℃で10分間不活性化する。過剰のリンカ−
を、10mMEDTA、 300mM酢酸ナトリウム
(pH6,0>および0.54容のイソプロパツールの
存在でDNAを沈澱させることによって除去する。DN
Aを再分散して、制限エンドヌクレアーゼBam1l
Iで更に消化する。DNAをフェノール/クロロホルム
で抽出し、エタノール沈澱させた後、2個の制限フラグ
メントをトリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8,3
)中1、2%アガロースゲル上に分離させる。DNAを
電気溶出させ、DE52イオン交換クロマトグラフィお
よびエタノール沈澱によって更に精製する。
0、6 k bのBam1l I −Hga9 D N
Aフラグメントを水に再分散し、40μg / m
1の濃度にする。
Aフラグメントを水に再分散し、40μg / m
1の濃度にする。
9μgのプラスミドpJDB207R/ PI105−
TRA (12−2)DNA (欧州特許出願第14
3.081号明細書参照)を、制限エンドヌクレアーゼ
Baa+HIで消化する。完全に消化し終わった後、D
NAをフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈澱せしめる。DNAを50mMのトリス・HC1(
pH8,0)に再分散し、そしてO,l m g /
m 1の濃度にして、7単位のウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで37℃で1時間消化する。ホスファターゼを
63℃にて1.5時間で不活性化して、DNAをDE5
2イオン交換クロマトグラフィ(実施例13参照)およ
びエタノール沈澱によって精製する。
TRA (12−2)DNA (欧州特許出願第14
3.081号明細書参照)を、制限エンドヌクレアーゼ
Baa+HIで消化する。完全に消化し終わった後、D
NAをフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈澱せしめる。DNAを50mMのトリス・HC1(
pH8,0)に再分散し、そしてO,l m g /
m 1の濃度にして、7単位のウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで37℃で1時間消化する。ホスファターゼを
63℃にて1.5時間で不活性化して、DNAをDE5
2イオン交換クロマトグラフィ(実施例13参照)およ
びエタノール沈澱によって精製する。
6.8に’bの大きなりamHIフラグメントを、トリ
ス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8,3)中1.2%
アガロースゲル上で分離する。DNAを、電気溶出し、
そしてDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタ
ノール沈澱によって精製する。DNAを水に溶解し、そ
して0.4mg/ml (0,1pM/p 1)の濃
度にする。
ス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pH8,3)中1.2%
アガロースゲル上で分離する。DNAを、電気溶出し、
そしてDE52イオン交換クロマトグラフィおよびエタ
ノール沈澱によって精製する。DNAを水に溶解し、そ
して0.4mg/ml (0,1pM/p 1)の濃
度にする。
pJDB207酵母ベクター、皿シグナル配列を有す、
L PH05プロモータフラグメント、およびデスルフ
ァトヒルジン構造遺伝子は、総て連結されて発現プラス
ミドを形成するDNAフラグメント(実施例16a−c
参照)として単離される。
L PH05プロモータフラグメント、およびデスルフ
ァトヒルジン構造遺伝子は、総て連結されて発現プラス
ミドを形成するDNAフラグメント(実施例16a−c
参照)として単離される。
p31/P1105− TPA18の0.6 k b
BamHI −11ga4フラグメント0.3pモル、
およびpl’1L310Lの0.2k b Ilga
I −Bamll Iフラグメント0.3μモルを、1
0.171の60mM)リス・HC1(pH7,5)。
BamHI −11ga4フラグメント0.3pモル、
およびpl’1L310Lの0.2k b Ilga
I −Bamll Iフラグメント0.3μモルを、1
0.171の60mM)リス・HC1(pH7,5)。
10mM MgCh 、5mM DTT、1mM
ATPおよび400単位のT、DNAリガーゼ中で、0
.1μモルのpJDB207R/PII05−TPA(
12−2)の6、8 k b Bam1l Iフラグ
メントに15℃で20時間連結させる。
ATPおよび400単位のT、DNAリガーゼ中で、0
.1μモルのpJDB207R/PII05−TPA(
12−2)の6、8 k b Bam1l Iフラグ
メントに15℃で20時間連結させる。
連結混合物1μlを、l1anahan (上記)によ
り調製した形質転換可能なE、コ月18101細胞10
0μiに加える。形質転換の処理法も、上記文献から採
用する。細胞を、50μg / m lのアンピシリン
を含むLB寒天平板状に塗布する。
り調製した形質転換可能なE、コ月18101細胞10
0μiに加える。形質転換の処理法も、上記文献から採
用する。細胞を、50μg / m lのアンピシリン
を含むLB寒天平板状に塗布する。
24個のamp”コロニーを、別々に100μg/ml
のアンピシリンを有するLB培地で増殖させる。プラス
ミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼPs口で切断す
ることによって、インサートの大きさおよび方向につい
て分析する。インサートの正確な方向を有する単一クロ
ーンを、pJDB207/P1105−1+1Rと称す
る。
のアンピシリンを有するLB培地で増殖させる。プラス
ミドDNAを、制限エンドヌクレアーゼPs口で切断す
ることによって、インサートの大きさおよび方向につい
て分析する。インサートの正確な方向を有する単一クロ
ーンを、pJDB207/P1105−1+1Rと称す
る。
ス並貫土工・、サツカロミセス・セレビシェ−硅旦り坐
貝ll換 プラスミドpHDB207/ PH05−HIRを、1
linnenら(上記)により記載された形質転換法を
用いて、サツカロミセス・セレビシェ−株GRF18
(α。
貝ll換 プラスミドpHDB207/ PH05−HIRを、1
linnenら(上記)により記載された形質転換法を
用いて、サツカロミセス・セレビシェ−株GRF18
(α。
his3−11. h旦3−15. leu 2−3
、 1eu2−112 、 can ” )に導入す
る。5μgのプラスミドDNAを100μlのスフェロ
プラスト懸濁液に加え、この混合物をポリエチレングリ
コールで処理する。スフェロプラストをlQmlの再生
寒天と混合して、ロイシンを欠く酵母最少培地゛平板上
に塗布する。
、 1eu2−112 、 can ” )に導入す
る。5μgのプラスミドDNAを100μlのスフェロ
プラスト懸濁液に加え、この混合物をポリエチレングリ
コールで処理する。スフェロプラストをlQmlの再生
寒天と混合して、ロイシンを欠く酵母最少培地゛平板上
に塗布する。
形質変換した単一酵母コロニーを取り出し、そしてロイ
シンを欠く酵母最少培地中で増殖させる。
シンを欠く酵母最少培地中で増殖させる。
このコロニーを、サツカロミセス・セレビシェ−GRF
18/pJDB207 /PH05−HIRと称する。
18/pJDB207 /PH05−HIRと称する。
S、セレビシェ−GRF18/pJDn207 /PI
I05−HIRの細胞を、20m!の酵母最少培地(D
ifc。
I05−HIRの細胞を、20m!の酵母最少培地(D
ifc。
Yeast Nitrogenベース、2%グルコース
および20mg/lのL−ヒスチジンを添加し、アミノ
酸なし)中で30℃で撹拌し、細胞密度3 x 10’
個/mlまで培養する。細胞を0.9%NaC1で洗浄
した後、低P、−最少培地中に50m1培養液を接種す
るのに用いる。低Pi−78低培地は、Difc。
および20mg/lのL−ヒスチジンを添加し、アミノ
酸なし)中で30℃で撹拌し、細胞密度3 x 10’
個/mlまで培養する。細胞を0.9%NaC1で洗浄
した後、低P、−最少培地中に50m1培養液を接種す
るのに用いる。低Pi−78低培地は、Difc。
Yeast Nitrogen Ba5e培地(アミノ
酸なし)の組成に対応して調製されるが、(Nn4)t
soa、2%のグルコースおよびIg/lのL−ヒスチ
ジンの代わりに0.03g/lのKIltPO4、Ig
/lのKCIおよび10g/lのL−アスパラギンを含
む。培養液を4xlO’個/mlの細胞密度まで接種し
て、30℃で20Or p mで42時間まで撹拌する
。
酸なし)の組成に対応して調製されるが、(Nn4)t
soa、2%のグルコースおよびIg/lのL−ヒスチ
ジンの代わりに0.03g/lのKIltPO4、Ig
/lのKCIおよび10g/lのL−アスパラギンを含
む。培養液を4xlO’個/mlの細胞密度まで接種し
て、30℃で20Or p mで42時間まで撹拌する
。
それぞれ18時間、26時間および42時間の醗酵時間
の後に、それぞれl Q m lの10個の試料を培養
液から採取して、脱塩およびBond ElutC−1
8カラム((1m l s Analytichel+
International)上での濃縮により富化
する。試料をカラムに入れ、そして液体を真空で除去し
た後、カラムを1.5mlの水−アセトニトリル(9:
1)−0,1%トリフルオロ酢酸(9: 1)で2回洗
浄する。ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニトリ
ル−0,1%トリフルオロ酢酸(6: 4)で溶出する
。
の後に、それぞれl Q m lの10個の試料を培養
液から採取して、脱塩およびBond ElutC−1
8カラム((1m l s Analytichel+
International)上での濃縮により富化
する。試料をカラムに入れ、そして液体を真空で除去し
た後、カラムを1.5mlの水−アセトニトリル(9:
1)−0,1%トリフルオロ酢酸(9: 1)で2回洗
浄する。ヒルジン化合物をカラムから水−アセトニトリ
ル−0,1%トリフルオロ酢酸(6: 4)で溶出する
。
2mlの溶出液を、5peed Vac濃縮機(Sav
ant)で400μlの最終濃度まで濃縮する。ヒルジ
ン化合物をI(PLC分析で標準デスルファ上ヒルジン
と比較することにより、及びトロンビン阻害測定法によ
り同定する。試料には、約0.2〜2μg / m 1
のヒルジン化合物が含まれる。
ant)で400μlの最終濃度まで濃縮する。ヒルジ
ン化合物をI(PLC分析で標準デスルファ上ヒルジン
と比較することにより、及びトロンビン阻害測定法によ
り同定する。試料には、約0.2〜2μg / m 1
のヒルジン化合物が含まれる。
42時間の醗酵時間の後に1リツトルの培養液を回収し
、そして遠心分離する。上澄液を、pH?、5で、DE
53セルロース(Wha t+wan)のアニ゛オン交
換カラムに入れる[条件:カラム2.5 x 15.5
cg*(76ml);溶出緩衝液A:20mM酢酸アン
モニウム、100mM NaC1(pH7,5) ;溶
出緩衝液B:20mM酢酸アンモニウム、4 M Na
C1(pH5,0):流速:66m1/時間]。カラム
を228m1緩衝液Aで洗浄した後、緩衝液Aおよび緩
衝液Bのそれぞれ228m1の線形塩勾配で溶出する。
、そして遠心分離する。上澄液を、pH?、5で、DE
53セルロース(Wha t+wan)のアニ゛オン交
換カラムに入れる[条件:カラム2.5 x 15.5
cg*(76ml);溶出緩衝液A:20mM酢酸アン
モニウム、100mM NaC1(pH7,5) ;溶
出緩衝液B:20mM酢酸アンモニウム、4 M Na
C1(pH5,0):流速:66m1/時間]。カラム
を228m1緩衝液Aで洗浄した後、緩衝液Aおよび緩
衝液Bのそれぞれ228m1の線形塩勾配で溶出する。
22m1ずつの両分を集める。ヒルジン化合物は、分画
71〜74(88ml)に溶出し、トロンビン阻害分析
法によって同定する。活性な両分を、−晩4℃で20m
M酢酸アンモニウムに対して透析する。次いで、透析物
を、2回凍結乾燥する。凍結乾燥生成物は、逆相HPL
Cによれば、デスルファトヒルジン化合物を含む。
71〜74(88ml)に溶出し、トロンビン阻害分析
法によって同定する。活性な両分を、−晩4℃で20m
M酢酸アンモニウムに対して透析する。次いで、透析物
を、2回凍結乾燥する。凍結乾燥生成物は、逆相HPL
Cによれば、デスルファトヒルジン化合物を含む。
トロンビン阻害試験で活性な主分画(80mlの溶出液
)を、20mM酢酸アンモニウム(p117.5)に対
して4℃で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレ
ーターを用いて35℃で濃縮して、最終容積を5 m
lとする。
)を、20mM酢酸アンモニウム(p117.5)に対
して4℃で一晩透析し、次いで、ロータリー・エバポレ
ーターを用いて35℃で濃縮して、最終容積を5 m
lとする。
得られる透明な水溶液を、ベッド容積が160mlの5
ephadex G−50精密カラム(Pharma
cia)であって、カラム(2,5x64cm 、 B
iorad)を5%酢酸で予備平衡化させておいたもの
に加える。50m1の溶出液(分画5〜7、流ff15
0m1/時間、25分/分画)に含まれる主活性成分を
ロータリー・エバポレーターを用いて濃縮して、次いで
逆、相肝LC分離を行う。各分画の一部分(500μl
)を、r 5peed vac J濃縮機(Sava
nt)を用いて10分の1に濃縮して、逆相HPLCに
よってそのデスルファトヒルジン化合物の含量を分析す
る。溶液は、デスルファトヒルジン化合物を含む。分画
〇(18ml)は極めて少量の第二の成分を含み、半調
製用逆相肝LCによって更に精製する。
ephadex G−50精密カラム(Pharma
cia)であって、カラム(2,5x64cm 、 B
iorad)を5%酢酸で予備平衡化させておいたもの
に加える。50m1の溶出液(分画5〜7、流ff15
0m1/時間、25分/分画)に含まれる主活性成分を
ロータリー・エバポレーターを用いて濃縮して、次いで
逆、相肝LC分離を行う。各分画の一部分(500μl
)を、r 5peed vac J濃縮機(Sava
nt)を用いて10分の1に濃縮して、逆相HPLCに
よってそのデスルファトヒルジン化合物の含量を分析す
る。溶液は、デスルファトヒルジン化合物を含む。分画
〇(18ml)は極めて少量の第二の成分を含み、半調
製用逆相肝LCによって更に精製する。
実験条件: Vydac 218TP510RP−H
PLCカラム、10x250n ;分離毎の分画6の一
部(200μl、l;10に濃縮); 220nmで
0.5以下(AUFS) ;流速:2ml/分;溶出液
: A : 0.1%トリフルオロ酢酸、Bニアセトニ
トリル/水(8: 2) +0.07%トリフルオロ酢
酸、1分間16%の81次いで40分間に6゛4%のB
まで増加。得られる画分を水で1=1に希釈して、凍結
乾燥する。残渣は、純粋なデスルファトヒルジン化合物
から成る。
PLCカラム、10x250n ;分離毎の分画6の一
部(200μl、l;10に濃縮); 220nmで
0.5以下(AUFS) ;流速:2ml/分;溶出液
: A : 0.1%トリフルオロ酢酸、Bニアセトニ
トリル/水(8: 2) +0.07%トリフルオロ酢
酸、1分間16%の81次いで40分間に6゛4%のB
まで増加。得られる画分を水で1=1に希釈して、凍結
乾燥する。残渣は、純粋なデスルファトヒルジン化合物
から成る。
細胞は、常法に従い破壊する(欧州特許出願第100.
561号明細書参照)。2%酢酸で処理した上澄液を遠
心分離する(12.00Orpm、10℃)、アンモニ
アを加えて最終pnを7.5として、僅かに不透明な溶
液(50ml)を更に上記の様に処理する(実施例19
a)。ヒルジン化合物は上記のようにして、すなわちト
ロンビン阻害法および逆相HPLCによって同定する。
561号明細書参照)。2%酢酸で処理した上澄液を遠
心分離する(12.00Orpm、10℃)、アンモニ
アを加えて最終pnを7.5として、僅かに不透明な溶
液(50ml)を更に上記の様に処理する(実施例19
a)。ヒルジン化合物は上記のようにして、すなわちト
ロンビン阻害法および逆相HPLCによって同定する。
(a)上記のように(実施例19b参照)調製した上澄
液2mlを、高真空下でrSpeed VacJ濃縮
機上で乾燥する。試料をそれぞれ100μmの水に溶解
し、IIPLc分析を行う(実験条件1、下記を参照さ
れたい)。個々の両分のトロンビン阻害を試験する。保
持時間が16.5分および17.7分の画分が、トロン
ビン阻害を示す。これらの2分画の比率(発現収率)は
、約4:1である。アミノ酸組成によれば、これらの百
分はデスルファトヒルジンである。
液2mlを、高真空下でrSpeed VacJ濃縮
機上で乾燥する。試料をそれぞれ100μmの水に溶解
し、IIPLc分析を行う(実験条件1、下記を参照さ
れたい)。個々の両分のトロンビン阻害を試験する。保
持時間が16.5分および17.7分の画分が、トロン
ビン阻害を示す。これらの2分画の比率(発現収率)は
、約4:1である。アミノ酸組成によれば、これらの百
分はデスルファトヒルジンである。
(b)トロンビン阻害試験で活性である、実施例19a
に記載の方法で得られる分画を、異なる2種類の条件下
でIIPLC分析にかける。
に記載の方法で得られる分画を、異なる2種類の条件下
でIIPLC分析にかける。
実1条作よ:ヌクレオシル(MN) C18,5,un
RP −HPLCカラム、4.6 x120m = 5
0μlヒルジン化合物/分離、214 n mでatt
、6;流速1. ’l m 1/分:溶出液? A :
0.1%トリフルオロ酢酸、Bニアセトニトリル/水
(8: 2) +0.08%トリフルオロ酢酸、2分間
は16%のB、次いで50分間を要して64%のBへ増
加。逆圧:66バール。
RP −HPLCカラム、4.6 x120m = 5
0μlヒルジン化合物/分離、214 n mでatt
、6;流速1. ’l m 1/分:溶出液? A :
0.1%トリフルオロ酢酸、Bニアセトニトリル/水
(8: 2) +0.08%トリフルオロ酢酸、2分間
は16%のB、次いで50分間を要して64%のBへ増
加。逆圧:66バール。
1簾条件叢:2分間20%のBで、それ以後40分間を
要して80%のBへ増加する勾配であることを除いて、
上記と同じ条件。
要して80%のBへ増加する勾配であることを除いて、
上記と同じ条件。
分画は1分間の間隔で採取しく全部で45)、そしてト
ロンビン阻害試験を行う。画分17〜19は、活性であ
る。更に、アミノ酸組成、N−末端基およびN−末端配
列を、画分17および18の活性なヒルジン化合物につ
いて決定する。一つの両分(第17)は、更に、ヒルか
らの天然のヒルジンを酵素アリールスルファターゼと反
応させることによって得られる標準のデスルファトヒル
ジンと比較する。これらの結果を、以ドの表1にまとめ
る。
ロンビン阻害試験を行う。画分17〜19は、活性であ
る。更に、アミノ酸組成、N−末端基およびN−末端配
列を、画分17および18の活性なヒルジン化合物につ
いて決定する。一つの両分(第17)は、更に、ヒルか
らの天然のヒルジンを酵素アリールスルファターゼと反
応させることによって得られる標準のデスルファトヒル
ジンと比較する。これらの結果を、以ドの表1にまとめ
る。
分画17および18の収量の比率は、約4:1である。
(c)上記(実施例19a参照)と同様に調製した上澄
液200m lについて、HPLC分析(条件3、以下
を参照)およびFPLC分離(条件4)を行う。個々の
分画のトロンビン阻害を試験する。保持時間が8.0分
(ピーク1)、11.1分(ピーク2)および12.1
分(ピーク3)である分画は、強力なトロンビン阻害を
示す。これらの3種類の化合物の比率(発現収率)は、
約t:a:tである。HP L C分析によれば、ピー
ク2および3に対応する化合物は実施例20b(分画1
7および18)に記載したヒルジン化合物と同一である
。結果を表2に示す。
液200m lについて、HPLC分析(条件3、以下
を参照)およびFPLC分離(条件4)を行う。個々の
分画のトロンビン阻害を試験する。保持時間が8.0分
(ピーク1)、11.1分(ピーク2)および12.1
分(ピーク3)である分画は、強力なトロンビン阻害を
示す。これらの3種類の化合物の比率(発現収率)は、
約t:a:tである。HP L C分析によれば、ピー
ク2および3に対応する化合物は実施例20b(分画1
7および18)に記載したヒルジン化合物と同一である
。結果を表2に示す。
以下金白
、表−」−
[3: Vydac 218TP −B5RP H
PLCカラム、4、 Ox120m、15μgのヒルジ
ン化合物/分離、214nmでatt、 7、流速1.
2 m l /分;溶出液:A : 0.1%トリフル
オロ酢酸、Bニアセトニトリル+0.08%トリフルオ
ロ酢酸、2分間は16%の81次いで20分間を要して
40%のBへ増加。
PLCカラム、4、 Ox120m、15μgのヒルジ
ン化合物/分離、214nmでatt、 7、流速1.
2 m l /分;溶出液:A : 0.1%トリフル
オロ酢酸、Bニアセトニトリル+0.08%トリフルオ
ロ酢酸、2分間は16%の81次いで20分間を要して
40%のBへ増加。
逆圧二80バール。
1簾条イ!i: Pharmacia MonoQ
FPLCアニオン交換カラム、5.0x50n、 15
μgヒルジン化合物/分離、280nmでAUFSo、
01.流速1.0 m l /分、勾配溶出緩衝液A:
20mMのトリス・HCI(att7.5 ”) 、I
I衝液B:緩衝液A+IMのNaC1(pH7,5)
、9分間は15%のBで、次いで21分間を要して70
%のBに増加。
FPLCアニオン交換カラム、5.0x50n、 15
μgヒルジン化合物/分離、280nmでAUFSo、
01.流速1.0 m l /分、勾配溶出緩衝液A:
20mMのトリス・HCI(att7.5 ”) 、I
I衝液B:緩衝液A+IMのNaC1(pH7,5)
、9分間は15%のBで、次いで21分間を要して70
%のBに増加。
HPLC分析によれば、培地(実施例20、表1および
2参照)から単離される分画17(またはピークl)お
よび18(またはピーク2)のヒルジン化合物は、細胞
抽出液から単離された対応する化合物(細胞内ヒルジン
化合物)と同じである。
2参照)から単離される分画17(またはピークl)お
よび18(またはピーク2)のヒルジン化合物は、細胞
抽出液から単離された対応する化合物(細胞内ヒルジン
化合物)と同じである。
これらの化合物およびピーク3 (表2を参照)は、次
のようにして特性決定する。
のようにして特性決定する。
a、アミノ のン
約2.5μgの純粋なヒルジン化合物を、6NのHCI
を用いて110℃で24時間加水分解し、次いでCha
ngらの記載の方法[ロへB5−Cl法; Metho
din Enz 5oloホー、第91巻、41頁、(
1983年)]と同様にして分析する。加水分解物は、
次のような組成を有する。
を用いて110℃で24時間加水分解し、次いでCha
ngらの記載の方法[ロへB5−Cl法; Metho
din Enz 5oloホー、第91巻、41頁、(
1983年)]と同様にして分析する。加水分解物は、
次のような組成を有する。
ピーク1 (表2参照)
Asp 9.2(9)Thr
4.1(4)Set 4.
0(4)Glu 12.4 (12)P
ro 3.1(3)Gly
9.0(9)Val 3.4
(4)シスチン 2.5(3) 11e 2.1(2)Leu
3.3(3)Tyr 1.
9(2)Phe 1.2(1)11i
s 1.0 (1)Lys
3.1(3)Met 0(
0) 合計 (63) ピーク2 ()百17、 1お礼gL先象■Lアミノ酸
加水分解物 Asp 9.9(9)Thr
4.0(4)Ser 3.
9(4)Glu 12.8 (13)P
ro 3.1(3)Gly
9.1(9)Val 3.7
(4)シスチン 2.8(3) 11e 2.1(2)Leu
4.4(4)Tyr 1.
2(2)Phe 1.2(1)His
1.2(1)Lys
2.9(3)Met 0(0) 合計 (65) ピーク3ユ立亘上8工1」]す」ξ[釦1態り八sp
10.0(9)Thr
3.9 (4”)Set
4.1(4)Glu
12.5 (12)Pro
3.1(3)Gly
8.7(9)Val
3.1(4)シスチン 2.4(3) lie 1.9(2)Leu
3.3(4)Tyr 1.
8(2)Phe 1.1(1)11i
s 1.0 (1)Lys
2,8(3)Met 0(
0) 合計 (64) (b)部沿m塞た扼 18μg(2,5nM)の純粋なヒルジン化合物を、[
Edmanの方法による通常の配列分析を行い、N−末
faフェニルチオヒダントイン(PTH)−アミノ酸を
RP −11PLCによって決定する。
4.1(4)Set 4.
0(4)Glu 12.4 (12)P
ro 3.1(3)Gly
9.0(9)Val 3.4
(4)シスチン 2.5(3) 11e 2.1(2)Leu
3.3(3)Tyr 1.
9(2)Phe 1.2(1)11i
s 1.0 (1)Lys
3.1(3)Met 0(
0) 合計 (63) ピーク2 ()百17、 1お礼gL先象■Lアミノ酸
加水分解物 Asp 9.9(9)Thr
4.0(4)Ser 3.
9(4)Glu 12.8 (13)P
ro 3.1(3)Gly
9.1(9)Val 3.7
(4)シスチン 2.8(3) 11e 2.1(2)Leu
4.4(4)Tyr 1.
2(2)Phe 1.2(1)His
1.2(1)Lys
2.9(3)Met 0(0) 合計 (65) ピーク3ユ立亘上8工1」]す」ξ[釦1態り八sp
10.0(9)Thr
3.9 (4”)Set
4.1(4)Glu
12.5 (12)Pro
3.1(3)Gly
8.7(9)Val
3.1(4)シスチン 2.4(3) lie 1.9(2)Leu
3.3(4)Tyr 1.
8(2)Phe 1.1(1)11i
s 1.0 (1)Lys
2,8(3)Met 0(
0) 合計 (64) (b)部沿m塞た扼 18μg(2,5nM)の純粋なヒルジン化合物を、[
Edmanの方法による通常の配列分析を行い、N−末
faフェニルチオヒダントイン(PTH)−アミノ酸を
RP −11PLCによって決定する。
(n、d、 −決定されず)
ピー (2余、 こい
上記のサイクル1カラムサイクル29までの配列。
ピーク3 18、 1および2 糸 れた公り
上記のサイクル1からサイクル27までの配列。
したがって、検討した生合成ヒルジン化合物のN−末端
配列は、標準(真正)試料の配列と同じである。
配列は、標準(真正)試料の配列と同じである。
C,C二速1し辷近
ヒルジン化合物をカルボキシペプチダーゼYで消化し、
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する(J、
Y、Chang、 R,Knedel、及びり、G、B
raunsBiochen+、J、、第199巻、54
7頁を参照されたい)。
放出されたアミノ酸をアミノ酸分析機で決定する(J、
Y、Chang、 R,Knedel、及びり、G、B
raunsBiochen+、J、、第199巻、54
7頁を参照されたい)。
C−末端アミノ酸: −Glu −Tyr 。
ピーク2 (頁17、−1およゾ1」1O−C−末端ア
ミノ酸: −Glu −Tyr −Leu −Gln
% ピーク3 )百18、 1および2央 C−末端アミノ酸: −Glu −Tyr −Leu
。
ミノ酸: −Glu −Tyr −Leu −Gln
% ピーク3 )百18、 1および2央 C−末端アミノ酸: −Glu −Tyr −Leu
。
(d)且l」ゴし辷丑量
デスルファトヒルジン化合物(30μg)を、SDS尿
素ゲル上で分析する[5UDSゲル、Kyteら、An
al、 Biochem、、第133巻、515頁、(
19e3年)参照]、クマシープルー染色の前に、12
%のトリフルオロ酢酸で固定を行う。見掛けの分子量が
6000〜7000ダルトンに相当する単一バンドが観
察される。
素ゲル上で分析する[5UDSゲル、Kyteら、An
al、 Biochem、、第133巻、515頁、(
19e3年)参照]、クマシープルー染色の前に、12
%のトリフルオロ酢酸で固定を行う。見掛けの分子量が
6000〜7000ダルトンに相当する単一バンドが観
察される。
(e) FAB−MSによる 。
デスルファトヒルジン化合物を、迅速原子衝撃陽イオン
マススペクトル分析法(FAB −MS)に付す。
マススペクトル分析法(FAB −MS)に付す。
分析機器: ZAB−11Bマススペクトル分析計(
VG−Analytical Ltd、 、マンチェス
ター)、マトリックス:チオグリセロール・キセノン衝
撃;イオンエネルギー; 10KeV 、外部標準: C5tsJzsC分子量:
6B87.9)およびC5tsJz−I(7147,
76)。
VG−Analytical Ltd、 、マンチェス
ター)、マトリックス:チオグリセロール・キセノン衝
撃;イオンエネルギー; 10KeV 、外部標準: C5tsJzsC分子量:
6B87.9)およびC5tsJz−I(7147,
76)。
以下余白
晃り一肢
実験式: CztJ4t+N7tO+。?S&36分子
量算値) :6722.23分子量(実測値’)
:6719.3゜ピーク2(TI?、 1および2^
)実験式: C20?114411Nl1001 +
os+分子量(計算値) : 6963.5181
8分子量測値) :6963.44分子量は2つの異
なる測定値の平均である。
量算値) :6722.23分子量(実測値’)
:6719.3゜ピーク2(TI?、 1および2^
)実験式: C20?114411Nl1001 +
os+分子量(計算値) : 6963.5181
8分子量測値) :6963.44分子量は2つの異
なる測定値の平均である。
ピーク2 () 18、 lおよび2 )実験式
: CzmtHastNtsO+osSh分子量(計算
値) :6835.39分子量(実測値’) :6
832.9゜上記のデーグーに基づき、ピーク1の化合
物はデスルファトヒルジン(1−63)であり、ピーク
2の化合物は標準デスルファトヒルジン(1−65)と
同一であり、ピーク3の化合物は新規なデスルファトヒ
ルジン(1−64)である。
: CzmtHastNtsO+osSh分子量(計算
値) :6835.39分子量(実測値’) :6
832.9゜上記のデーグーに基づき、ピーク1の化合
物はデスルファトヒルジン(1−63)であり、ピーク
2の化合物は標準デスルファトヒルジン(1−65)と
同一であり、ピーク3の化合物は新規なデスルファトヒ
ルジン(1−64)である。
(f)ヒ ・トロンビン−ヒルジン”
ヒト・トロンビン−デスルファトヒルジン複合体の解離
定数に0は、S、R,5tone及びJ、 Ilofs
teengeの方法[…匹蝕畦■■、第25巻、462
2〜4628頁、(1986年)]にしたがって決定さ
れ、下記の表にまとめである。表には、3種類の得られ
たデスルファトヒルジン化合物の比活性(ATU/mg
で表した)も示している。
定数に0は、S、R,5tone及びJ、 Ilofs
teengeの方法[…匹蝕畦■■、第25巻、462
2〜4628頁、(1986年)]にしたがって決定さ
れ、下記の表にまとめである。表には、3種類の得られ
たデスルファトヒルジン化合物の比活性(ATU/mg
で表した)も示している。
Ke[M] 比活性
[^τU/■g]
酵母 デスルファトヒルジン (1−65) 2.9
xlO−” 11000酵母 デスルファトヒルジン
(1−64) 3.9xlO−” 9600酵母
デスルファトヒルジン (1−63) 3.0X1
0−” 8900実施例19に記載の方法で醗酵を行
い、精製したデスルファトヒルジン化合物の混合物を、
更に分離して、詳細に特性決定する。
xlO−” 11000酵母 デスルファトヒルジン
(1−64) 3.9xlO−” 9600酵母
デスルファトヒルジン (1−63) 3.0X1
0−” 8900実施例19に記載の方法で醗酵を行
い、精製したデスルファトヒルジン化合物の混合物を、
更に分離して、詳細に特性決定する。
Vydac 218 TP 510 RP−III”
LCカラム上で、半調製的分離を行うと、上記デスルフ
7)ヒルジン化合物(実施例21e参照)の他に、保持
時間が8.1分でカラムから溶出するデスルファトヒル
ジン様化合物が生じる。
LCカラム上で、半調製的分離を行うと、上記デスルフ
7)ヒルジン化合物(実施例21e参照)の他に、保持
時間が8.1分でカラムから溶出するデスルファトヒル
ジン様化合物が生じる。
この物質は迅速原子衝撃マススペクトル分析法(FAB
−MS)およびアミノ酸分析、部分配列決定法および
C−末端分析によって特性決定される。
−MS)およびアミノ酸分析、部分配列決定法および
C−末端分析によって特性決定される。
FAB −MSは、この物質が、分子量がそれぞれ64
29.5および6556.8である2種類の化合物の混
合物であることを示している。
29.5および6556.8である2種類の化合物の混
合物であることを示している。
アミノ酸組成は、次のようである。
Asx 8.9(9)Thr
3.7(4)Set 4.
1(4)Glx 10.7 (11)P
ro 3.2(3)Gly
9.7 (9)Val 3.
3 (4)シスチン 3.3(3) 11e 2.1(2)Leu
3.6(3)Tyr O,
9(L)Phe 1.1(1)11
is 1.2 (1)しys
3.2(3)Met
Q(0)合計 (61) 。配+(N−F”) サイクル 1 2 3 アミノ酸 Val Val TyrC−r(
21c参 5960 61 62 C−末端アミノ酸 −11e−Pro−Glu−(
Glu)これらのデーターによれば、この混合物は、デ
スルファトヒルジン(1−61)とデスルファトヒルジ
ン(1−62)とから成る。
3.7(4)Set 4.
1(4)Glx 10.7 (11)P
ro 3.2(3)Gly
9.7 (9)Val 3.
3 (4)シスチン 3.3(3) 11e 2.1(2)Leu
3.6(3)Tyr O,
9(L)Phe 1.1(1)11
is 1.2 (1)しys
3.2(3)Met
Q(0)合計 (61) 。配+(N−F”) サイクル 1 2 3 アミノ酸 Val Val TyrC−r(
21c参 5960 61 62 C−末端アミノ酸 −11e−Pro−Glu−(
Glu)これらのデーターによれば、この混合物は、デ
スルファトヒルジン(1−61)とデスルファトヒルジ
ン(1−62)とから成る。
」11皿と
(a)JDB207ペタターフー外LZ上互垂里6μg
のプラスミドpJDB207R/ IP (α−3)(
EP 100.561)を、制限エンドヌクレアーゼB
al1l目を用いて完全に消化する゛。生成するDNA
フラグメント(6,85Kbおよび1.15kb)をエ
タノールで沈澱させ、400μlの50mMのトリス・
HCI (pH8,0)中で処理する。4.5単位の
ウシ腸ホスファターゼ(Boehringer、マンハ
イム)を加える。混合物を37℃で1時間インキュベー
ションした後、ホスファターゼを65℃で1.5時間で
不活性化する。溶液を150mM NaC1に調整した
後、10mMトリス・HC1(pH7,5)、150m
M NaC1および1mM EDTAで予め平衡にし
ておいたDIE52 (Whatman)アニオン交換
カラム(100μl容量)に適用する。同じ緩衝液で洗
浄操作を行った後、DNAを400.calの1.5
M NaC1゜10mMトリス・HCI (pl+
7.5 ) 、1 mM EDTAで溶出させ、エタノ
ールで沈澱させる。6.85kbの大きなりan+旧フ
ラグメントが、トリス・ホウ酸−EDTA緩衝液(pi
f8.3)中1.2%アガロースゲル上で小さなフラグ
メントから分離される。
のプラスミドpJDB207R/ IP (α−3)(
EP 100.561)を、制限エンドヌクレアーゼB
al1l目を用いて完全に消化する゛。生成するDNA
フラグメント(6,85Kbおよび1.15kb)をエ
タノールで沈澱させ、400μlの50mMのトリス・
HCI (pH8,0)中で処理する。4.5単位の
ウシ腸ホスファターゼ(Boehringer、マンハ
イム)を加える。混合物を37℃で1時間インキュベー
ションした後、ホスファターゼを65℃で1.5時間で
不活性化する。溶液を150mM NaC1に調整した
後、10mMトリス・HC1(pH7,5)、150m
M NaC1および1mM EDTAで予め平衡にし
ておいたDIE52 (Whatman)アニオン交換
カラム(100μl容量)に適用する。同じ緩衝液で洗
浄操作を行った後、DNAを400.calの1.5
M NaC1゜10mMトリス・HCI (pl+
7.5 ) 、1 mM EDTAで溶出させ、エタノ
ールで沈澱させる。6.85kbの大きなりan+旧フ
ラグメントが、トリス・ホウ酸−EDTA緩衝液(pi
f8.3)中1.2%アガロースゲル上で小さなフラグ
メントから分離される。
6μgのプラスミドp 31/ R(EPloo、56
1)を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBa
n+l(Iで消化する。生成する3種のDNAフラグメ
ントを、トリス−ホウ酸−1!DTA緩衝液(pH8,
3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。 534
bp Bam1l I −EcoRIフラグメントが単
離される。このフラグメントは、転写開始部位を有する
鷹プロモーターを含んでいる。
1)を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBa
n+l(Iで消化する。生成する3種のDNAフラグメ
ントを、トリス−ホウ酸−1!DTA緩衝液(pH8,
3)中1.2%アガロースゲル上で分離する。 534
bp Bam1l I −EcoRIフラグメントが単
離される。このフラグメントは、転写開始部位を有する
鷹プロモーターを含んでいる。
9μgのプラスミドpML310 (実施例13c参照
)を、制限酵素Ban+HIおよび1EcoRIで完全
に消化する。生成する2種類のDNAフラグメントを、
トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pif 8.3 )
中1.2%アガロースゲル上で分離する。206bp
EcoRI −Bamll Iフラグメントが、単離さ
れる。
)を、制限酵素Ban+HIおよび1EcoRIで完全
に消化する。生成する2種類のDNAフラグメントを、
トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(pif 8.3 )
中1.2%アガロースゲル上で分離する。206bp
EcoRI −Bamll Iフラグメントが、単離さ
れる。
以下余白
(d)DNAフラグメントの゛′七
第a ”−c項で述べた3種類のDNAフラグメント(
上記参照)を、電気溶出によってアガロースゲルから得
、Dt!52 (Wha t+man)アニオン交換体
上で精製し、エタノールで沈澱し、水に再分散する。
上記参照)を、電気溶出によってアガロースゲルから得
、Dt!52 (Wha t+man)アニオン交換体
上で精製し、エタノールで沈澱し、水に再分散する。
0、 L pモル(0,45μg)の6.85 k b
Bam1l Iベクターフラグメント、0.3pモ
ル(0,1μg)の534bp Ban+tl I
−EcoRI PII05プロモーターフラグメント
および0.25pモル(34n g)のpML310の
206bp EcoRI −BamHIフラグメント
を、15μmの60mM)リス・HC1(pH7、5)
、 10mM MgC1,,10mM DTT、1m
M ATTおよび600単位のT、DNAリガーゼ(
3io1abs)中で15℃で16時間連結させる。
Bam1l Iベクターフラグメント、0.3pモ
ル(0,1μg)の534bp Ban+tl I
−EcoRI PII05プロモーターフラグメント
および0.25pモル(34n g)のpML310の
206bp EcoRI −BamHIフラグメント
を、15μmの60mM)リス・HC1(pH7、5)
、 10mM MgC1,,10mM DTT、1m
M ATTおよび600単位のT、DNAリガーゼ(
3io1abs)中で15℃で16時間連結させる。
24個の形質転換したamp”コロニーを、100μg
/mlのアンピシリンを含むLB培地中で別々に培養す
る。プラスミドDNAを1Ioln+esら(上記)の
方法によって単離し、l1ind m −EcoRに重
消化によって分析する。約6oobpの大きなEcoR
l−l1indI[[フラグメントの出現は、関連する
クロ−ンでは展プロモーターーヒルジンDNAフラグメ
ントがベクター上の転写停止シグナルに対して正確な方
向にあることを示している。予想されるように、約50
%のクローンはインサートの正確な方向を有する。これ
らのクローンの一つをpJDB207R/ PII05
− If IRと命名する。
/mlのアンピシリンを含むLB培地中で別々に培養す
る。プラスミドDNAを1Ioln+esら(上記)の
方法によって単離し、l1ind m −EcoRに重
消化によって分析する。約6oobpの大きなEcoR
l−l1indI[[フラグメントの出現は、関連する
クロ−ンでは展プロモーターーヒルジンDNAフラグメ
ントがベクター上の転写停止シグナルに対して正確な方
向にあることを示している。予想されるように、約50
%のクローンはインサートの正確な方向を有する。これ
らのクローンの一つをpJDB207R/ PII05
− If IRと命名する。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18株(α。
基3−11.皿3−15.1赳2−3.ユ肥2−112
、 can” )を、l1innenら(上記)の方法
にしたがってプラスミドpJDB207R/ PH05
−旧Pを用いて形質転換する。形質転換された酵母細胞
の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天平
板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離され、
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18/ pJDB
207R/PH05−111Rと命名する。
、 can” )を、l1innenら(上記)の方法
にしたがってプラスミドpJDB207R/ PH05
−旧Pを用いて形質転換する。形質転換された酵母細胞
の選定は、ロイシンを欠く酵母最少培地を用いる寒天平
板上で行う。形質転換された酵母コロニーが単離され、
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18/ pJDB
207R/PH05−111Rと命名する。
S、セレビシェ−GRF 1B / pJDB207R
/ PH05−II IRの細胞を、20m1の酵母最
低培地(Difco YeastNitrogen培養
基、アミノ酸なし、2%グルコースおよび20mg/l
のL−ヒスチジンを添加)中で30℃で攪拌し、細胞密
度が3xlO’個/mlになるまで培養する。細胞を0
.9%NaC1で洗浄し、次いで低Pi−最低培地中に
50m1の培養液を接種するのに用いる。低Pi−最低
培地は、Difc。
/ PH05−II IRの細胞を、20m1の酵母最
低培地(Difco YeastNitrogen培養
基、アミノ酸なし、2%グルコースおよび20mg/l
のL−ヒスチジンを添加)中で30℃で攪拌し、細胞密
度が3xlO’個/mlになるまで培養する。細胞を0
.9%NaC1で洗浄し、次いで低Pi−最低培地中に
50m1の培養液を接種するのに用いる。低Pi−最低
培地は、Difc。
Yeast Nitrogen Ba5e培地(アミノ
酸なし)の組成に対応して調製されるが、(NH3)
!SO4,2%グルコースおよびIg/lのL−ヒスチ
ジンの代わりに0.03g/lのに11□po、、1
g / 1のKCl、および10g/lのL−アスパラ
ギンを含む。培養液を接種して細胞密度を4xlOh個
/mlとし、30℃で42時間200rpn+で撹拌す
る。
酸なし)の組成に対応して調製されるが、(NH3)
!SO4,2%グルコースおよびIg/lのL−ヒスチ
ジンの代わりに0.03g/lのに11□po、、1
g / 1のKCl、および10g/lのL−アスパラ
ギンを含む。培養液を接種して細胞密度を4xlOh個
/mlとし、30℃で42時間200rpn+で撹拌す
る。
細胞(実施例22f参照)を、通常の方法にしたがって
破壊する(例えば、欧州特許出願第100.561号明
細書参照)。1.5%酢酸で処理した上澄液を遠心分離
し、そしてそれぞれ2mlの透明な溶液をr 5pee
d Vac J濃縮機上で高真空で乾燥する。
破壊する(例えば、欧州特許出願第100.561号明
細書参照)。1.5%酢酸で処理した上澄液を遠心分離
し、そしてそれぞれ2mlの透明な溶液をr 5pee
d Vac J濃縮機上で高真空で乾燥する。
試料をそれぞれ100μlの水に溶解して、HPLC分
析を行う(条件は実施例20と同じ)。それぞれの分画
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が16.5分の
分画がトロンビン阻害活性を有する。アミノ酸組成によ
れば、この分画はデスルファトヒルジンである。 HP
LC分析によれば、この力価は約10μg/リットルで
ある。培地には、ヒルジン活性は検出されない。
析を行う(条件は実施例20と同じ)。それぞれの分画
のトロンビン阻害を試験する。保持時間が16.5分の
分画がトロンビン阻害活性を有する。アミノ酸組成によ
れば、この分画はデスルファトヒルジンである。 HP
LC分析によれば、この力価は約10μg/リットルで
ある。培地には、ヒルジン活性は検出されない。
付帯のシグナル配列を持たないかまたは有するデスルフ
ァトヒルジン遺伝子を担持する酵母株から得られる細胞
内および細胞外ヒルジン活性の収量を、表3にまとめで
ある。ヒルジン活性はトロンビン阻害法によって測定す
る。
ァトヒルジン遺伝子を担持する酵母株から得られる細胞
内および細胞外ヒルジン活性の収量を、表3にまとめで
ある。ヒルジン活性はトロンビン阻害法によって測定す
る。
ス&、母y汐3す[二り二叉l生q遺底(a)勤王Ll
化 第8図に示されるPII05のBam1l I −Sa
l Iフラグメントを含有する組換ファージM13+m
p9/贋Ba111−Salを、PII05プロモータ
ー源として用いる(欧州特許出願第143.081号明
細書参照)。
化 第8図に示されるPII05のBam1l I −Sa
l Iフラグメントを含有する組換ファージM13+m
p9/贋Ba111−Salを、PII05プロモータ
ー源として用いる(欧州特許出願第143.081号明
細書参照)。
20μgのファージDNACRF:?j!製形)を制限
エンドヌクレアーゼSal Iで消化して、約9kbの
線状DNAを生成せしめる。フェノール/クロロホルム
で抽出の後、DNAをエタノールで沈澱せしめる。DN
Aを、10mMのトリス(p118.0)に再分散させ
て、濃度を0.5μg/mIとする。16/Jgの5a
ll開裂したDNAを、100μlの20mMトリス(
pH8,O)、199mM NaC1゜12 mM M
gCh、12 mM CaCl2および1mMのEDT
A中で2単位のエキソヌクレアーゼBa131(B R
L)で消化する。30℃で1.2.3.4.5および6
分間インキュベートした後に2μgずつのDNAを採取
して、直ちに50μlのフェノールおよび60μlのT
NEと混合する。フェノール/クロロホルムで抽出し、
エタノール沈澱した後、DNAを100μg/mlの濃
度で10mMのトリス(pH8,0)に再分散する。B
a131によるエンドヌクレアーゼ切断の程度を分析す
るため、それぞれの時間に採取した0、5μgずつのD
NAをエキソヌクレアーゼで消化して、トリス−ホウ酸
緩衝液(pH8,3) (90mM トリス−HCl
(pH8,3)。
エンドヌクレアーゼSal Iで消化して、約9kbの
線状DNAを生成せしめる。フェノール/クロロホルム
で抽出の後、DNAをエタノールで沈澱せしめる。DN
Aを、10mMのトリス(p118.0)に再分散させ
て、濃度を0.5μg/mIとする。16/Jgの5a
ll開裂したDNAを、100μlの20mMトリス(
pH8,O)、199mM NaC1゜12 mM M
gCh、12 mM CaCl2および1mMのEDT
A中で2単位のエキソヌクレアーゼBa131(B R
L)で消化する。30℃で1.2.3.4.5および6
分間インキュベートした後に2μgずつのDNAを採取
して、直ちに50μlのフェノールおよび60μlのT
NEと混合する。フェノール/クロロホルムで抽出し、
エタノール沈澱した後、DNAを100μg/mlの濃
度で10mMのトリス(pH8,0)に再分散する。B
a131によるエンドヌクレアーゼ切断の程度を分析す
るため、それぞれの時間に採取した0、5μgずつのD
NAをエキソヌクレアーゼで消化して、トリス−ホウ酸
緩衝液(pH8,3) (90mM トリス−HCl
(pH8,3)。
90mMホウ酸、2.5mMEDT^〕中、1.5%ア
ガロースゲル上で分析する。
ガロースゲル上で分析する。
2個のA z & 6単位のf!coRIリンカ−(5
−GGAATTCC−3)を、250μlの10mMト
リス(pH8)および1mMEDTAに再分散する。2
μgのEcoR1リンカ−を75μlの60mMのトリ
ス(pH7,5”) 。
−GGAATTCC−3)を、250μlの10mMト
リス(pH8)および1mMEDTAに再分散する。2
μgのEcoR1リンカ−を75μlの60mMのトリ
ス(pH7,5”) 。
10 mM MgCLz、15mM DDDT、10μ
MATPおよび33単位のT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理する。3
7℃で1時間後に、混合物を室温に冷却して、次いで一
20℃で貯蔵する。
MATPおよび33単位のT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ(Boehringer)中でキナーゼ処理する。3
7℃で1時間後に、混合物を室温に冷却して、次いで一
20℃で貯蔵する。
アニールした2末鎖EcoRIリンカ−を、それらの平
滑端により、Ba131で処理したDNAフラグメント
に連結する。0.5μgのBa131で処理したDNA
(実施例23a参照)を、20.czlの60mMK
)リス(pH7,5)、 I Q mM MgC1t、
10mM DDT、4mM ATPおよび60
0単位の74DNAリガーゼ(Biolabs)中で、
50倍過剰量のキナーゼ処理したEcoRIリンカ−と
共に室温で16時間インキュベートする。T、DNAリ
ガーゼを不活性化した後(65℃、10分間)、過剰の
UcoRIリンカ−を、50.cglの容量中でEco
RI(Boehringer) 50単位で切断する。
滑端により、Ba131で処理したDNAフラグメント
に連結する。0.5μgのBa131で処理したDNA
(実施例23a参照)を、20.czlの60mMK
)リス(pH7,5)、 I Q mM MgC1t、
10mM DDT、4mM ATPおよび60
0単位の74DNAリガーゼ(Biolabs)中で、
50倍過剰量のキナーゼ処理したEcoRIリンカ−と
共に室温で16時間インキュベートする。T、DNAリ
ガーゼを不活性化した後(65℃、10分間)、過剰の
UcoRIリンカ−を、50.cglの容量中でEco
RI(Boehringer) 50単位で切断する。
DNAをフェノール/クロロホルムで抽出して、エタノ
ールで沈澱させ、10mM1−リスおよび1 mM E
DTA(=TE)中に再分散する。次いで、DNAを5
単位のBaall I (Biolabs)で切断し
、混合物を1.5%の低融点アガロースゲル(Sigm
a)/ トリス−ホウ酸緩衝液(上記参照)に適用する
。バンドを臭化エチジウム、で染色し、366nmの長
波長紫外線下で可視化する。約100b9〜600b9
の幅広い拡散バンドパターンをゲルから切り取り、DN
Aを次のようにして抽出する。すなわち、アガロースの
切片を65℃で液化し、そして500mM NaClに
調整し、そして65℃で20分間インキエベートする。
ールで沈澱させ、10mM1−リスおよび1 mM E
DTA(=TE)中に再分散する。次いで、DNAを5
単位のBaall I (Biolabs)で切断し
、混合物を1.5%の低融点アガロースゲル(Sigm
a)/ トリス−ホウ酸緩衝液(上記参照)に適用する
。バンドを臭化エチジウム、で染色し、366nmの長
波長紫外線下で可視化する。約100b9〜600b9
の幅広い拡散バンドパターンをゲルから切り取り、DN
Aを次のようにして抽出する。すなわち、アガロースの
切片を65℃で液化し、そして500mM NaClに
調整し、そして65℃で20分間インキエベートする。
1容のフェノール(10mM)リス・HCI(pH7,
5)、 1 m M !!DTAおよび500mM N
aC1で平衡にしたもの〕を加える。水相をフェノール
で2回再抽出し、クロロホルムで1回抽出する。
5)、 1 m M !!DTAおよび500mM N
aC1で平衡にしたもの〕を加える。水相をフェノール
で2回再抽出し、クロロホルムで1回抽出する。
DNAを2.5容の冷無水エタノールで沈澱させ、遠心
分離によって集める。DNAのベレットを冷80%エタ
ノールで洗浄し、次いで真空で乾燥する。DNAを10
μlのTEに再分散する。
分離によって集める。DNAのベレットを冷80%エタ
ノールで洗浄し、次いで真空で乾燥する。DNAを10
μlのTEに再分散する。
(c)Ml抛飢生立至迷猪
3μgのM13a+p9のRFを、50μlの容積中、
15単位のEcoRI (Biolabs)および15
単位のBan+HI (Boehringer)を用い
て消化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後
、DNAを50μlのTEに再分散する。5μlの切断
されたベクターDNA (約200ng)を10ulの
上記試料(実施例23bに記載の方法で各種のBa13
1消化物から得られるDNAフラグメント)と混合して
、60mM)リス・HCl(p)%7.5)、 6 m
M MgC1,。
15単位のEcoRI (Biolabs)および15
単位のBan+HI (Boehringer)を用い
て消化する。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後
、DNAを50μlのTEに再分散する。5μlの切断
されたベクターDNA (約200ng)を10ulの
上記試料(実施例23bに記載の方法で各種のBa13
1消化物から得られるDNAフラグメント)と混合して
、60mM)リス・HCl(p)%7.5)、 6 m
M MgC1,。
10mM DTT、1mM A’r’Pおよび20
0単位のT4DNAリガーゼの存在で総120μl中で
15時間リガーゼ処理するIIET コリJMIOI株
のコンピテント細胞の形質導入は、New Engla
ndBiolabs発行のマニュアル[M 13 cl
oning andsequencing syste
mJに準じて行う。多数の白色プラークからのファージ
を増殖させ、制限酵素HcoR1およびBawl Iで
切断することによって、DNAインサートの大きさを分
析する。
0単位のT4DNAリガーゼの存在で総120μl中で
15時間リガーゼ処理するIIET コリJMIOI株
のコンピテント細胞の形質導入は、New Engla
ndBiolabs発行のマニュアル[M 13 cl
oning andsequencing syste
mJに準じて行う。多数の白色プラークからのファージ
を増殖させ、制限酵素HcoR1およびBawl Iで
切断することによって、DNAインサートの大きさを分
析する。
配列決定は、上記のマニュアルに記載のようにSang
erらのジデオキシDNA配列決定方式[1’roc。
erらのジデオキシDNA配列決定方式[1’roc。
Natl、 Acad、 Sci、、米国、第74巻、
5463頁(1977年)]を用いて行う。欠失末端部
を、以下に示す。
5463頁(1977年)]を用いて行う。欠失末端部
を、以下に示す。
以下余白
クローン pH05配列の最後のヌクレオチドの位置(
第8図参照) A −502 B −471 C−422 D −400 E −392 F −369 G −350 H−328 I −300 K −283 L −255 M −226 N −211 0−187 P −111 −88 −57 −33 (e) San er IL−’ による[1a13
1 −rのM13mp9 pH05Bam−5alを
Ba+++tl 1によって切断することを除いて、同
様なセットのBa131欠失を、前記(a)〜(c)に
記載したのと同様に行う。
第8図参照) A −502 B −471 C−422 D −400 E −392 F −369 G −350 H−328 I −300 K −283 L −255 M −226 N −211 0−187 P −111 −88 −57 −33 (e) San er IL−’ による[1a13
1 −rのM13mp9 pH05Bam−5alを
Ba+++tl 1によって切断することを除いて、同
様なセットのBa131欠失を、前記(a)〜(c)に
記載したのと同様に行う。
Ba131で消化された分子を、EcoRIおよび5a
ltによって切断し、生成したフラグメントをEcoR
1および5ailで消化したM13mp9中にクローン
化する。欠失末端点を、以下に示す。
ltによって切断し、生成したフラグメントをEcoR
1および5ailで消化したM13mp9中にクローン
化する。欠失末端点を、以下に示す。
pH05配列の最後のヌクレオチドの位A’
−24 B’ −35 C’ −41 D・ −48 E’ −74 F・ −89 G’ −93 H〆 −97 1’ −124 に’ −162L’
−174M’
−262N’
−2770’
−306P’ −33
2Q’ −346R’
−361S ’
−382T′−393 (d)に記載のBa131欠失セツトはHcoR1で終
わる[左腕J PII05プロモーターフラグメントを
生成し、(0)に記載のBa131欠失セフ 1−はH
coRIで終わる「右腕J PII05プロモーターフ
ラグメントを生成する。各種位置の「左腕」と「右腕」
を組み合わせることにより、欠失したDNAの位置にE
coRIリンカ−セグメントを含む内部欠失が生成され
る。それぞれの内部欠失は、制限エンドヌクレアーゼE
coRIおよびBamHI(左腕)、またはt!coR
Iおよび5alI(右腕)によってM13mp9から「
左腕」および「右腕」を切断し、(b)に記載したのと
同様にソフトアガロ゛−ス電気泳動法により対応するフ
ラグメントを単離することによって構成される。等モル
量の「左腕」、「右腕」、および200BgのBam1
l IおよびSat I消化したM13mρ9ベクター
DNAを(c)に記載したのと同様に連結する。E、コ
リJMIOIに形質導入した後、白色プラクを採取して
、RFを生成させて、制限分析(BasHI、Sal
I s ucoRI )によって分析する。
−24 B’ −35 C’ −41 D・ −48 E’ −74 F・ −89 G’ −93 H〆 −97 1’ −124 に’ −162L’
−174M’
−262N’
−2770’
−306P’ −33
2Q’ −346R’
−361S ’
−382T′−393 (d)に記載のBa131欠失セツトはHcoR1で終
わる[左腕J PII05プロモーターフラグメントを
生成し、(0)に記載のBa131欠失セフ 1−はH
coRIで終わる「右腕J PII05プロモーターフ
ラグメントを生成する。各種位置の「左腕」と「右腕」
を組み合わせることにより、欠失したDNAの位置にE
coRIリンカ−セグメントを含む内部欠失が生成され
る。それぞれの内部欠失は、制限エンドヌクレアーゼE
coRIおよびBamHI(左腕)、またはt!coR
Iおよび5alI(右腕)によってM13mp9から「
左腕」および「右腕」を切断し、(b)に記載したのと
同様にソフトアガロ゛−ス電気泳動法により対応するフ
ラグメントを単離することによって構成される。等モル
量の「左腕」、「右腕」、および200BgのBam1
l IおよびSat I消化したM13mρ9ベクター
DNAを(c)に記載したのと同様に連結する。E、コ
リJMIOIに形質導入した後、白色プラクを採取して
、RFを生成させて、制限分析(BasHI、Sal
I s ucoRI )によって分析する。
次の腕を組み合わせて、(ヌクレオチドの番号に対する
、第8図参照)特異的内部欠失を形成する。
、第8図参照)特異的内部欠失を形成する。
A T’ △7 −5’01 to −3
94108B T’ △8 −470 t
o −39477CT’ △9 −421 to
−39428D S’ △10 −399
to −38317E R’ △11
−391 to −36230F Q’
△12 −368 to −34722C
P’ へ13 −349 to −3331
7ト■ 0 ′ △14
−327 to −307211N’ △1
5 −299 to −27822K
M’ △16 −282 to −263
20L L’ へ17 −254
to −17580M L’
△18 −225 to −17551N
L’ Δ19 −210 to −1
7536OL’ △20 −186 to
−175120K’ △21 −186 t
o −1632401’ △22 −186
to −125620H’ Δ23 −18
6 to −9889P H’
△24 −110 to −9813P
C’ △25 −110 to −94
17P F’ △26 −110
to −9021Q E’
△27 −87 to −7513RD’
△2B −56to −498RC’ へ2
9 −56 to −4215RB’ △3
0 −56 to −3621(g)PH05プロ
モー の の 7野生型のPII05 R
ats−3alフラグメントを欠失した対応物に置き換
えることによって、実施例23(f)に記載の各種欠失
を、プラスミドpJD[1207/PH05[R,Ha
guenauer−Tsapis及びA、l1inne
nのハn匹凰り堕り釦旦虱肛」n旦■、第4巻、266
8〜1675頁(1984年)]中にクローン化する。
94108B T’ △8 −470 t
o −39477CT’ △9 −421 to
−39428D S’ △10 −399
to −38317E R’ △11
−391 to −36230F Q’
△12 −368 to −34722C
P’ へ13 −349 to −3331
7ト■ 0 ′ △14
−327 to −307211N’ △1
5 −299 to −27822K
M’ △16 −282 to −263
20L L’ へ17 −254
to −17580M L’
△18 −225 to −17551N
L’ Δ19 −210 to −1
7536OL’ △20 −186 to
−175120K’ △21 −186 t
o −1632401’ △22 −186
to −125620H’ Δ23 −18
6 to −9889P H’
△24 −110 to −9813P
C’ △25 −110 to −94
17P F’ △26 −110
to −9021Q E’
△27 −87 to −7513RD’
△2B −56to −498RC’ へ2
9 −56 to −4215RB’ △3
0 −56 to −3621(g)PH05プロ
モー の の 7野生型のPII05 R
ats−3alフラグメントを欠失した対応物に置き換
えることによって、実施例23(f)に記載の各種欠失
を、プラスミドpJD[1207/PH05[R,Ha
guenauer−Tsapis及びA、l1inne
nのハn匹凰り堕り釦旦虱肛」n旦■、第4巻、266
8〜1675頁(1984年)]中にクローン化する。
酵母S、セレビシェA11216株を形質転換した後(
欧州特許出願第143.081号明細書参照)、酸性ホ
スファターゼ活性をToh −eらにより記載された方
法[J、 Bacteriol、 、第113巻、72
7頁、(1973年)]によって決定する。欠失△11
および△12は、PI(05活性の約10分の1への低
下を示し、PH05発現に本質的な上流領域(「上流活
性化部位J、UAS)を定義してる。同様な低下効果は
、欠失△17(約5分の1へ低下)およびTATAボッ
クス欠失△欠失−23〜(約30分の1へ低下)で観察
される。総てのその他の欠失は、はぼ野生株の水準の活
性を示す。これらの結果は、P H05の発現に本質的
な情報の3種類の部分は次の位置に配置されていること
を示唆する。
欧州特許出願第143.081号明細書参照)、酸性ホ
スファターゼ活性をToh −eらにより記載された方
法[J、 Bacteriol、 、第113巻、72
7頁、(1973年)]によって決定する。欠失△11
および△12は、PI(05活性の約10分の1への低
下を示し、PH05発現に本質的な上流領域(「上流活
性化部位J、UAS)を定義してる。同様な低下効果は
、欠失△17(約5分の1へ低下)およびTATAボッ
クス欠失△欠失−23〜(約30分の1へ低下)で観察
される。総てのその他の欠失は、はぼ野生株の水準の活
性を示す。これらの結果は、P H05の発現に本質的
な情報の3種類の部分は次の位置に配置されていること
を示唆する。
1、 −349〜−383の位置(UASI)、2、
−225〜−263の位置(UAS2)、3、−87〜
−125の位置(TATAボックス)。
−225〜−263の位置(UAS2)、3、−87〜
−125の位置(TATAボックス)。
P1105(7)UASIまたはUAS2またはUAS
IおよびUAS2を含むDNAフラグメントは、組換フ
ァージM13+++p9/ PII05 Bam −S
a l (上記参照)から適当な制限エンドヌクレアー
ゼで切断することによって生成させることができる。
UASIは、次の式:を有する268bp Bam1l
I −C1a Iフラグメントに含まれる。
IおよびUAS2を含むDNAフラグメントは、組換フ
ァージM13+++p9/ PII05 Bam −S
a l (上記参照)から適当な制限エンドヌクレアー
ゼで切断することによって生成させることができる。
UASIは、次の式:を有する268bp Bam1l
I −C1a Iフラグメントに含まれる。
UAS2は、次の式:
を有する100bp C1a T −BstE Ifフ
ラグメントに含まれ、そして[IASlおよびUAS2
は共に、次の式:を有する368bp Ban+1II
−BstE II7ラグメントニ存在する。
ラグメントに含まれ、そして[IASlおよびUAS2
は共に、次の式:を有する368bp Ban+1II
−BstE II7ラグメントニ存在する。
実施例23は、PH05遺伝子の位置−365付近の領
域[0ASL(P1105)] 、および位置−180
付近のもう一つの領域[UAS2 (PH05) ]を
、調節機能を有するUASの可能な候補とする。UAS
I (P)105)は、268bp BamHI −C
1a Iフラグメントに含まれ、他方UASI (pH
的)およびUAS2 (皿部)は共に368bpBam
HI−Bst[I[フラグメントに含まれる。これらの
2種類のフラグメントはそれぞれ、TATAボックスお
よびGAPDllの転写開始部位を含む2種類の異なる
GAPD■下流のプロモーター要素に融合する。
域[0ASL(P1105)] 、および位置−180
付近のもう一つの領域[UAS2 (PH05) ]を
、調節機能を有するUASの可能な候補とする。UAS
I (P)105)は、268bp BamHI −C
1a Iフラグメントに含まれ、他方UASI (pH
的)およびUAS2 (皿部)は共に368bpBam
HI−Bst[I[フラグメントに含まれる。これらの
2種類のフラグメントはそれぞれ、TATAボックスお
よびGAPDllの転写開始部位を含む2種類の異なる
GAPD■下流のプロモーター要素に融合する。
(a) 母゛ 云 −イフ゛−リーの野生型サツカロ
ミセス・セレビシェ−3288C株から得られる総量が
30ggの高分子量酵母DNA [M、V、01sen
ら、J、Mo1.Biol、 、第132巻、387頁
(1979年)]を、2単位のEcoRIメチラーゼ(
New England l1tolabs)を用いて
、供給業者が勧める方法に従って、250μlのEco
RI uチル化緩衝液中で37℃で30分間インキュベ
ートする。
ミセス・セレビシェ−3288C株から得られる総量が
30ggの高分子量酵母DNA [M、V、01sen
ら、J、Mo1.Biol、 、第132巻、387頁
(1979年)]を、2単位のEcoRIメチラーゼ(
New England l1tolabs)を用いて
、供給業者が勧める方法に従って、250μlのEco
RI uチル化緩衝液中で37℃で30分間インキュベ
ートする。
DNAをエタノールで沈澱させ、500μlの25mM
)リス・HC1(pH8,5)、 2.5 mM Mg
C1z(BcoRビ緩衝液) [H,Meyer、
FEBS Lett、、第90巻、341頁(1979
年)]に再分散し、そしてEcoRT (Boehri
nger)で消化して、DNAフラグメントの分布が3
0〜5Qkbの範囲に最大値を有するようにする(λD
NAのXho 1消化は適当な33kbおよび17kb
マーカーを提供する)。
)リス・HC1(pH8,5)、 2.5 mM Mg
C1z(BcoRビ緩衝液) [H,Meyer、
FEBS Lett、、第90巻、341頁(1979
年)]に再分散し、そしてEcoRT (Boehri
nger)で消化して、DNAフラグメントの分布が3
0〜5Qkbの範囲に最大値を有するようにする(λD
NAのXho 1消化は適当な33kbおよび17kb
マーカーを提供する)。
EcoRビ条件下で消化される酵母DNAはシェークロ
ース勾配〔5〜20%シュークロース710mM)リス
−HCl (pH7,5)および1mMUDTA )
で、5−40ローター中で38.00Or p mにて
6時間サイズ分画する。0.4 m Iずつの30個の
分画を、勾配の上部から集める。分画16は、大きさが
30〜4QkbのDNAフラグメントを含む。
ース勾配〔5〜20%シュークロース710mM)リス
−HCl (pH7,5)および1mMUDTA )
で、5−40ローター中で38.00Or p mにて
6時間サイズ分画する。0.4 m Iずつの30個の
分画を、勾配の上部から集める。分画16は、大きさが
30〜4QkbのDNAフラグメントを含む。
この分画のDNA (3μg)をエタノールで沈澱させ
、)EcoRIで線状化された1μgのコスミドベクタ
ーpYcl [B、IIohnら1.rGenetic
En 1neertn l、第2巻、169頁、ニ
ューヨーク、1980年]に、合計容1ft15μl中
で、15℃で16時間連結させる。連結は、30O単位
のT、DNAリガーゼ(NewEngland Bio
labs)を用いて、業者により記載されている緩衝液
系を使用して行う。DNAを生体外でバクテリオファー
ジλ[8,1lohn 、 rMethodsin
Enzymology J 、第68巻、299頁、ニ
ューヨーク、1979年]にパッケージし、そして集成
されたファージを用いてE、31月)[1101株を形
質導入する(工に−、工1+−、旦且−1肛土−1皿荊
)。
、)EcoRIで線状化された1μgのコスミドベクタ
ーpYcl [B、IIohnら1.rGenetic
En 1neertn l、第2巻、169頁、ニ
ューヨーク、1980年]に、合計容1ft15μl中
で、15℃で16時間連結させる。連結は、30O単位
のT、DNAリガーゼ(NewEngland Bio
labs)を用いて、業者により記載されている緩衝液
系を使用して行う。DNAを生体外でバクテリオファー
ジλ[8,1lohn 、 rMethodsin
Enzymology J 、第68巻、299頁、ニ
ューヨーク、1979年]にパッケージし、そして集成
されたファージを用いてE、31月)[1101株を形
質導入する(工に−、工1+−、旦且−1肛土−1皿荊
)。
形質導入の効率は、18gのpYc1ベクター当たり約
5000個のアンピシリン耐性コロニーである。
5000個のアンピシリン耐性コロニーである。
3000個のae*p’コロニーを採取し、そして10
0μg/mlのアンピシリンを含むLB培地[10gの
Bacto −Tryptone(Difco) 、
5 gのBac t。
0μg/mlのアンピシリンを含むLB培地[10gの
Bacto −Tryptone(Difco) 、
5 gのBac t。
Yeast Extract(Difco)およびLo
gのNaC11中でマイクロタイター・ディッシエのウ
ェルでそれぞれ増殖させる。
gのNaC11中でマイクロタイター・ディッシエのウ
ェルでそれぞれ増殖させる。
(b )GAPDll ’−〇゛
上記遺伝子ライブラリーを、次の構造:5 ’ −GC
TCCATCTTCCACCGCCCC−3’を有する
合成オリゴヌクレオチド[ホスホトリエステル法を用い
て調製: K、 Itakuraら、Recl、Tra
v。
TCCATCTTCCACCGCCCC−3’を有する
合成オリゴヌクレオチド[ホスホトリエステル法を用い
て調製: K、 Itakuraら、Recl、Tra
v。
phiIll、 、Pa 5−Bas 、 9B 、
537(1979) ]によりスクリーニングする。1
0ggのオリゴヌクレオチドを、Maniatisらに
より記載された方法[rMolecular C1on
in J 、Co1d Spring 1larbo
rLab、 、1982年、125頁]により、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)と共
に10μmの7−”P −A T P (3000Ci
/ mM、101Jci/p l Aa+ersha
m)を用いて全容積50μl中ででキナーゼ処理をする
。コロニーハイブリダイゼーションは、上記文献(31
2真)に記載の方法で行う。
537(1979) ]によりスクリーニングする。1
0ggのオリゴヌクレオチドを、Maniatisらに
より記載された方法[rMolecular C1on
in J 、Co1d Spring 1larbo
rLab、 、1982年、125頁]により、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(Boehringer)と共
に10μmの7−”P −A T P (3000Ci
/ mM、101Jci/p l Aa+ersha
m)を用いて全容積50μl中ででキナーゼ処理をする
。コロニーハイブリダイゼーションは、上記文献(31
2真)に記載の方法で行う。
Kodak K −5X線フィルムを用いるオートラジ
オグラフィにより、陽性クローンを検出する。プラスミ
ドDNAを単離して、GAPDHをコードする2100
bp 1lind IIIフラグメントを含むハイブ
リッドクローンを得る[J、P、 Ho1landら、
J、Biol。
オグラフィにより、陽性クローンを検出する。プラスミ
ドDNAを単離して、GAPDHをコードする2100
bp 1lind IIIフラグメントを含むハイブ
リッドクローンを得る[J、P、 Ho1landら、
J、Biol。
Cheap、 益[,9839(1979) ] 、
クローン化されたDNAが真性であることは、2本lD
NAについてG、 F、’llong [Biosci
eiice Re orts ±、243(1981
) ]により記載されたジデオキシ配列決定法との組み
合わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるDN
A配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化
GAPDH遺伝子(第9図参照)は、1lolland
らが報告してい薊LL1491と同じ配列を有する[J
、 Biol、 Chew、 255 、2596(
1980) ]。
クローン化されたDNAが真性であることは、2本lD
NAについてG、 F、’llong [Biosci
eiice Re orts ±、243(1981
) ]により記載されたジデオキシ配列決定法との組み
合わせにおいて、上記オリゴヌクレオチドを用いるDN
A配列決定実験によって最終的に証明する。クローン化
GAPDH遺伝子(第9図参照)は、1lolland
らが報告してい薊LL1491と同じ配列を有する[J
、 Biol、 Chew、 255 、2596(
1980) ]。
(c) GAPD11′、ブロモ−−、の言 1GA
PDH遺伝子のATGからの位置−27〜−675を含
む649bp Taq Iフラグメント(第9図参照
)を、Taq I (New l!ngland Bi
olabs)で上記ハイブリッドプラスミドを消化し、
DNAフラグメントを1、2%ソフト・アガロースゲル
上で分離し、そして熱フェノールによりDNAを抽出す
ることによりuL離する(実施例23参照)。Taq
Iフラグメントのクローン化はpHR322のC1a
I部位中に為される。すなわち、lμgのpHR322
を3単位のC1a I (New England B
iolabs)を用いて、業者により記載された方法で
切断する。300gのフェノール処理されそして切断さ
れたベクターを200単位のT4DNAリガーゼを用い
て、約3oongのインサートD N A (649b
p Taqブラグメント)に全容積20μl中で連結す
る11Ee コリII 8101を形質転換してアンピ
シリン耐性にし1、プラスミドDNAを調製し、そして
制限分析によって分析する。[Taq I 、 叶a
l]。Taq Iフラグメントの方向は、制限エンドヌ
クレアーゼDra IをプラスミドのBam1l 1部
位と組み合わせて用いることにより確立され、pHR3
22のll1ndll[部位の近くに位置−675の部
位を有するaqlプラスミドを選択する。 pBR32
2/GAPDHと命名されるこのプラスミドを、Bam
1l I (New Bngland Biolabs
)を用いて線状化し、そしてBa131を用いる消化を
、BglIIリンカ−(5−CAGATCTG −3、
New England Beolabs)を用いるこ
とを除き、実施例23と同様にして行い、そして消化さ
れたプラスミドを5μg / m lの濃度で、全容f
f120μl中で直接環状化する。
PDH遺伝子のATGからの位置−27〜−675を含
む649bp Taq Iフラグメント(第9図参照
)を、Taq I (New l!ngland Bi
olabs)で上記ハイブリッドプラスミドを消化し、
DNAフラグメントを1、2%ソフト・アガロースゲル
上で分離し、そして熱フェノールによりDNAを抽出す
ることによりuL離する(実施例23参照)。Taq
Iフラグメントのクローン化はpHR322のC1a
I部位中に為される。すなわち、lμgのpHR322
を3単位のC1a I (New England B
iolabs)を用いて、業者により記載された方法で
切断する。300gのフェノール処理されそして切断さ
れたベクターを200単位のT4DNAリガーゼを用い
て、約3oongのインサートD N A (649b
p Taqブラグメント)に全容積20μl中で連結す
る11Ee コリII 8101を形質転換してアンピ
シリン耐性にし1、プラスミドDNAを調製し、そして
制限分析によって分析する。[Taq I 、 叶a
l]。Taq Iフラグメントの方向は、制限エンドヌ
クレアーゼDra IをプラスミドのBam1l 1部
位と組み合わせて用いることにより確立され、pHR3
22のll1ndll[部位の近くに位置−675の部
位を有するaqlプラスミドを選択する。 pBR32
2/GAPDHと命名されるこのプラスミドを、Bam
1l I (New Bngland Biolabs
)を用いて線状化し、そしてBa131を用いる消化を
、BglIIリンカ−(5−CAGATCTG −3、
New England Beolabs)を用いるこ
とを除き、実施例23と同様にして行い、そして消化さ
れたプラスミドを5μg / m lの濃度で、全容f
f120μl中で直接環状化する。
Ba131で短縮されたTaq Iフラグメントの大き
さを、(Bgl Uおよび旧ndl[を用いる)制限分
析により決定する。2つのクローンが選択され、これら
はそれぞれATC上流からGAPDHプロモータへと2
00bpおよび2651)b伸びるDNAフラグメント
を含む。これらのフラグメントは、約−140bpに仮
定のTATAボックスを有する。これらのクローンはな
お、DNAのp[1R322由来部分に複製開始点を含
み、それぞれpGAPDH−FおよびpGAPDH−E
と命名される。
さを、(Bgl Uおよび旧ndl[を用いる)制限分
析により決定する。2つのクローンが選択され、これら
はそれぞれATC上流からGAPDHプロモータへと2
00bpおよび2651)b伸びるDNAフラグメント
を含む。これらのフラグメントは、約−140bpに仮
定のTATAボックスを有する。これらのクローンはな
お、DNAのp[1R322由来部分に複製開始点を含
み、それぞれpGAPDH−FおよびpGAPDH−E
と命名される。
■)皿践り型車
−27の位置のTaq I部位からG A P D H
遺伝子のATCに直接隣接する位置までGAPDHプロ
モーター要素を延長するため、次の構造を有する2個の
合成相補的オリゴヌクレオチドを合成する。
遺伝子のATCに直接隣接する位置までGAPDHプロ
モーター要素を延長するため、次の構造を有する2個の
合成相補的オリゴヌクレオチドを合成する。
5’CGAATAAACACACATAAATAAAG
3’3’ TTATTTGTGTGTA
TTTATTTCTTA^ 5 ′これらのオリゴ
ヌクレオチドは、位置−26から位置−5への純粋なG
APDHプロモータを提供し、末端UcoR1部位を生
じさせる。2μgの2種類のBa131単離体(実施例
24cから)(プラスミドpGAPD11−1!および
−F)を6単位のTaq Iを用いて50ul中で消化
し、生成する混合物をフェノール抽出し、エタノール沈
澱し、そして10μlの水に再分散する0合成オリゴヌ
クレオチドを、10mMトリス・HCl (pH7,
5)、 10 mM MgC1g。
3’3’ TTATTTGTGTGTA
TTTATTTCTTA^ 5 ′これらのオリゴ
ヌクレオチドは、位置−26から位置−5への純粋なG
APDHプロモータを提供し、末端UcoR1部位を生
じさせる。2μgの2種類のBa131単離体(実施例
24cから)(プラスミドpGAPD11−1!および
−F)を6単位のTaq Iを用いて50ul中で消化
し、生成する混合物をフェノール抽出し、エタノール沈
澱し、そして10μlの水に再分散する0合成オリゴヌ
クレオチドを、10mMトリス・HCl (pH7,
5)、 10 mM MgC1g。
50 m M NaC1を含有するiooμl溶液中で
各単鎖2μlを混合し、90℃で3分間加熱し、溶液を
徐々に室温にまで冷却することにより(約3時間以内)
アニールする。Taql消化された各プラスミドlμg
を約20倍モル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレ
オチドと、800単位の74DNAリガーゼを用いて、
20μlの容積中で18時間混合する。全混合物を3単
位のBgl II (NewEngland Biol
abs)で消化し、DNAフラグメントを1.5%ソフ
トアガロースゲル上で分離する。約200bpおよび2
65bpのBgl If −EcoRIフラグメントを
ゲルから切り取り、抽出し、そしてエタノール沈澱させ
る。
各単鎖2μlを混合し、90℃で3分間加熱し、溶液を
徐々に室温にまで冷却することにより(約3時間以内)
アニールする。Taql消化された各プラスミドlμg
を約20倍モル過剰量のアニーリングしたオリゴヌクレ
オチドと、800単位の74DNAリガーゼを用いて、
20μlの容積中で18時間混合する。全混合物を3単
位のBgl II (NewEngland Biol
abs)で消化し、DNAフラグメントを1.5%ソフ
トアガロースゲル上で分離する。約200bpおよび2
65bpのBgl If −EcoRIフラグメントを
ゲルから切り取り、抽出し、そしてエタノール沈澱させ
る。
プラスミドpGAPDII −f!をBgl Ifおよ
びHcoRIを用いて消化し、大きな(約3.5kb)
フラグメントを単離する。このフラグメントをベクター
として用いて、上記のような連結、形質転換およびプラ
スミド単離条件を用いながら、前記265bpおよび2
00bpのBgl II −EcoRIフラグメントを
クローン化する。生成したプラスミドは、pGAPDI
l −ELおよびpGAPDII −PLと命名される
。プラスミドpGAPDH−HLおよびpGAPDll
二FL中のクローン化Bgl U −EcoRIフラグ
メントのDNA配列を第11図に示す。フラグメントの
正確な大きさはそれぞれ5sbpおよび201bpであ
る。
びHcoRIを用いて消化し、大きな(約3.5kb)
フラグメントを単離する。このフラグメントをベクター
として用いて、上記のような連結、形質転換およびプラ
スミド単離条件を用いながら、前記265bpおよび2
00bpのBgl II −EcoRIフラグメントを
クローン化する。生成したプラスミドは、pGAPDI
l −ELおよびpGAPDII −PLと命名される
。プラスミドpGAPDH−HLおよびpGAPDll
二FL中のクローン化Bgl U −EcoRIフラグ
メントのDNA配列を第11図に示す。フラグメントの
正確な大きさはそれぞれ5sbpおよび201bpであ
る。
以下余白
■)貼5t(pH四111!索
3μgのプラスミドp31/Y(欧州特許出願第100
.561号明細書参照)を6単位のC1a I (Ne
wEngland Biolabs)を用いて消化する
。3′の欠損端を、Maniatis (上記)の方法
に従い、E、コリDNAポリメラーゼIのKleno−
フラグメント(Bethedsa Re5earch
Laboratories)を用いてフィルインする。
.561号明細書参照)を6単位のC1a I (Ne
wEngland Biolabs)を用いて消化する
。3′の欠損端を、Maniatis (上記)の方法
に従い、E、コリDNAポリメラーゼIのKleno−
フラグメント(Bethedsa Re5earch
Laboratories)を用いてフィルインする。
8glllリンカ−(5’ −CAGATCTG−3′
)を、例23に記載したのと同様に付加する。
)を、例23に記載したのと同様に付加する。
DNAをSal IおよびBglI[(New Eng
landBiolabs)で消化し、1%ソフトアガロ
ースゲル上で処理する。548bpフラグメントをゲル
から切り取り、フェノール抽出して、上記のようにエタ
ノール沈澱する。
landBiolabs)で消化し、1%ソフトアガロ
ースゲル上で処理する。548bpフラグメントをゲル
から切り取り、フェノール抽出して、上記のようにエタ
ノール沈澱する。
■)デスルフ トヒルジン コー′ るDNAプラスミ
ドpJDB207 /贋(Eco) −111Hの造成
(第12図参照) U S A (P1105)−GAPDHハイブリッド
プロモーター要素をPH05シグナル配列を含むデスル
ファトヒルジンのコード領域に好都合に接続するため(
プラスミドpJDB20? / PH05−II IR
のように)、BcoRI制限部位を、m RN A開始
部位とコード領域のATGとの間の5′非翻訳領域に導
入する。
ドpJDB207 /贋(Eco) −111Hの造成
(第12図参照) U S A (P1105)−GAPDHハイブリッド
プロモーター要素をPH05シグナル配列を含むデスル
ファトヒルジンのコード領域に好都合に接続するため(
プラスミドpJDB20? / PH05−II IR
のように)、BcoRI制限部位を、m RN A開始
部位とコード領域のATGとの間の5′非翻訳領域に導
入する。
15μgのプラスミドpJDU207 / PH05−
HIR(実施例16d参照)を、制限エンドヌクレアー
ゼロral(Boehringer)で消化する。生成
する4個のフラグメントを0.8%アガロースゲル上ト
リス・ホウ酸・f!DTA緩衝液(pH8,3)中で分
離する。ゲルから4.2 k bのDNAフラグメント
を回収し、電気溶出し、エタノール沈澱する。DNAを
水に再分散して、0.6mg/mlの濃度にする。
HIR(実施例16d参照)を、制限エンドヌクレアー
ゼロral(Boehringer)で消化する。生成
する4個のフラグメントを0.8%アガロースゲル上ト
リス・ホウ酸・f!DTA緩衝液(pH8,3)中で分
離する。ゲルから4.2 k bのDNAフラグメント
を回収し、電気溶出し、エタノール沈澱する。DNAを
水に再分散して、0.6mg/mlの濃度にする。
次の式:
%式%
の2種類の合成オリゴヌクレオチド(2,3μgおよび
2.9pg)をそれぞれ20μlの60mMトリス(p
f17.5)、10mM MgCh、5mM DTT
。
2.9pg)をそれぞれ20μlの60mMトリス(p
f17.5)、10mM MgCh、5mM DTT
。
0.5mM ATPおよび20単位のT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ
処理をする。37℃で45分後に、これらの反応混合物
を一緒にし、75℃で10分間加熱し、そして室温に放
冷する。アニールしたオリゴヌクレオチドリンカーを一
20℃、で貯蔵する。
オチドキナーゼ(Boehringer)中でキナーゼ
処理をする。37℃で45分後に、これらの反応混合物
を一緒にし、75℃で10分間加熱し、そして室温に放
冷する。アニールしたオリゴヌクレオチドリンカーを一
20℃、で貯蔵する。
6.5μg(2,3pモル)の4.2kbDralDN
Aフラグメントを70倍過剰量のキナーゼ処理してアニ
ーリングしたオリゴヌクレオチドリンカーと共に50μ
lの60mM)リス(pl[7,5> 。
Aフラグメントを70倍過剰量のキナーゼ処理してアニ
ーリングしたオリゴヌクレオチドリンカーと共に50μ
lの60mM)リス(pl[7,5> 。
10mM MgCl2 .5mM DTT、3.5
mMATPおよび8a0単位の74DNAリガーゼ(B
iolabs)中でインキユベートする。T4DNAリ
ガーゼを85℃で10分間不活性化した後、過剰のリン
カ−を10 mM HDTA、 300mM酢酸ナトリ
ウム(pi(6,0)および0.5容のイソプロパツー
ルの存在でDNAを沈澱させることにより除去する。D
NAをI!coRIと1Iindll[とで消化する。
mMATPおよび8a0単位の74DNAリガーゼ(B
iolabs)中でインキユベートする。T4DNAリ
ガーゼを85℃で10分間不活性化した後、過剰のリン
カ−を10 mM HDTA、 300mM酢酸ナトリ
ウム(pi(6,0)および0.5容のイソプロパツー
ルの存在でDNAを沈澱させることにより除去する。D
NAをI!coRIと1Iindll[とで消化する。
生成するフラグメントを1%アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−EDTA緩衝液(all 8.3 )中で分離
する。
ホウ酸−EDTA緩衝液(all 8.3 )中で分離
する。
643bpフラグメントを、電気溶出およびエタノール
沈澱によりゲルから回収する。DNAを再分散させて、
濃度を0.1pM/ulにする。f!coRI −Hl
ndl[[フラグメントは鷹シグナル配列、デスルファ
トヒルジンのコード配列およびPH05転写ターミーネ
ーターを含む。
沈澱によりゲルから回収する。DNAを再分散させて、
濃度を0.1pM/ulにする。f!coRI −Hl
ndl[[フラグメントは鷹シグナル配列、デスルファ
トヒルジンのコード配列およびPH05転写ターミーネ
ーターを含む。
534bp PH105プロモーターフラグメントをプ
ラスミドp31/R(欧州特許出願第100,561号
明細書)から単離する。
ラスミドp31/R(欧州特許出願第100,561号
明細書)から単離する。
10μgのp31/Rを制限エンドヌクレアーゼEco
RIとBam1l Iとで消化する。生成する3個のフ
ラグメントを0.6%の低融点アガロースゲル上トリス
−ホウ酸BDT^緩衝液(pH8,3)中で分離する。
RIとBam1l Iとで消化する。生成する3個のフ
ラグメントを0.6%の低融点アガロースゲル上トリス
−ホウ酸BDT^緩衝液(pH8,3)中で分離する。
534bp [lamHI −EcoRIフラグメン
トを分離する。
トを分離する。
これはmRNA開始部位を含むPH05プロモーターを
含有する。
含有する。
ベクターフラグメントをプラスミドpJDB20?/P
1105− II IRから単離する(実施例16d)
。このプラスミド6μgをBaaHI &1IindI
[[とで消化する。
1105− II IRから単離する(実施例16d)
。このプラスミド6μgをBaaHI &1IindI
[[とで消化する。
大きな6.5 k bのBawl I−旧ndnlフラ
グメントを、0.65低融点アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−HDTAII衝液(pH8,3)中で小さなフ
ラグメントから分離する。
グメントを、0.65低融点アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−HDTAII衝液(pH8,3)中で小さなフ
ラグメントから分離する。
適切な接着末端を有する上記の3個のDNAフラグメン
トを以下の反応で連結する。0.2pモル(70n g
)の534bp Baa+lI I −EcoRI
PH05プロモーターフラグメント、0.2pモル(8
5ng)の643bp EcoRl−旧ndnlフラ
グメント、0.2pモル(85ng)の643bp
EcoRI−旧ndl[[フラグメント(ヒルジンコー
ド配列)、およヒ0.1pモル(0,4μg)の6.5
k b [lamll I −Hlndll[ベク
ターフラグメントを、lOμlの60mMトリス(pH
7,5) 、 10mM MgC1g 、 5mM D
TT、1mM ATPおよび400単位のT、DNA
リガーゼ中で15℃で6時間連結する。連結混合物1μ
lを100μlのカルシウム処理した形質転換コンピテ
ントE・コリ■101細胞に加える。
トを以下の反応で連結する。0.2pモル(70n g
)の534bp Baa+lI I −EcoRI
PH05プロモーターフラグメント、0.2pモル(8
5ng)の643bp EcoRl−旧ndnlフラ
グメント、0.2pモル(85ng)の643bp
EcoRI−旧ndl[[フラグメント(ヒルジンコー
ド配列)、およヒ0.1pモル(0,4μg)の6.5
k b [lamll I −Hlndll[ベク
ターフラグメントを、lOμlの60mMトリス(pH
7,5) 、 10mM MgC1g 、 5mM D
TT、1mM ATPおよび400単位のT、DNA
リガーゼ中で15℃で6時間連結する。連結混合物1μ
lを100μlのカルシウム処理した形質転換コンピテ
ントE・コリ■101細胞に加える。
12個の形質転換したarap”コロニーをそれぞれ1
00μg / m 1アンピシリンを含むLB培地で増
殖させる。プラスミドDNAをHolmesらの方法に
より調製し[Anal、Bioche+m、 114.
(1981)193 ]、EcoRI及びBamHI制
限酵素により分析する。予想される制限フラグメントを
有するクローンを単離し、そしてpJDI!207/
PII05 (Eco) −HIRと命名する。
00μg / m 1アンピシリンを含むLB培地で増
殖させる。プラスミドDNAをHolmesらの方法に
より調製し[Anal、Bioche+m、 114.
(1981)193 ]、EcoRI及びBamHI制
限酵素により分析する。予想される制限フラグメントを
有するクローンを単離し、そしてpJDI!207/
PII05 (Eco) −HIRと命名する。
15μgのプラスミドpJDB207/PI(05(E
co)(−1111(貧施例24dm参照)を、Eco
R1と旧ndnlとで消化する。DNAフラグメントを
1%アガロースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液
(pH8,3)中で分離する。 643bpフラグメ
ントをゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノール
で沈澱される。DNAを水に再分散し、0.1μM/μ
lの濃度とする。
co)(−1111(貧施例24dm参照)を、Eco
R1と旧ndnlとで消化する。DNAフラグメントを
1%アガロースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液
(pH8,3)中で分離する。 643bpフラグメ
ントをゲルから単離し、電気溶出し、そしてエタノール
で沈澱される。DNAを水に再分散し、0.1μM/μ
lの濃度とする。
6μgのプラスミドpHDB207/PII05− H
IRを、制限エンドヌクレアーゼ旧ndI[Iと5al
lとで完全に消化する。5.3 k bフラグメント(
ベクタ一部分)をソフトアガロースゲル電気泳動、フェ
ノール抽出、およびエタノール沈澱により単離する。
IRを、制限エンドヌクレアーゼ旧ndI[Iと5al
lとで完全に消化する。5.3 k bフラグメント(
ベクタ一部分)をソフトアガロースゲル電気泳動、フェ
ノール抽出、およびエタノール沈澱により単離する。
ベクターDNAフラグメントを水に再分散し、0.05
pモル/μlの濃度にする。
pモル/μlの濃度にする。
108gのプラスミドpGAr’[lll −HL (
実施例24d■参照)をBgI nとFicoRIとで
消化する。 266bg[1μl II −Fico
RIフラグメントを1.2%アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−II!DTA緩衝液(pH8,3)中で分離し
、ゲルから電気溶出し、そしてエタノールで沈澱させる
。DNAを水に再分散され、0.3μ9モル/μIの濃
度にする。
実施例24d■参照)をBgI nとFicoRIとで
消化する。 266bg[1μl II −Fico
RIフラグメントを1.2%アガロースゲル上トリス−
ホウ酸−II!DTA緩衝液(pH8,3)中で分離し
、ゲルから電気溶出し、そしてエタノールで沈澱させる
。DNAを水に再分散され、0.3μ9モル/μIの濃
度にする。
0、3 p モル(7)UASI (PII05)
(実施例24dI[)を含んで成る548bp Sal
I −Bgl Uフラグメント、0.3μモルのpG
Al’DI+ −8Lの266bp Bgl II
−HcoRIフラグメント、0.3pモルのpJDB2
0? /PH05(EcO)−HIRの643bp
EcoRI −11indI[Iフラグメント、および
0.j!pモルの5.3kbSall −11indl
[Iベクターフラグメントを、20μlの50mM1−
リス(pH7,5)、 10 mM MgC1g、
5 mMDTT、1mM ATPおよび400単位の
T4DNAリガーゼ(Biolabs)中で15℃で6
時間連結させる。連結混合物1μmおよび3μlを10
0μlのカルシウム処理したE、コリ118101細胞
に加える。atlp”コロニーからのプラスミドの単離
および5ail、Bgl I 、EcoRIおよびtl
indu[を用いる制限分析を、上記のように行う(実
施例24d■参照)。1個の陽性クローンを選択し、p
JDB207/PAPII!L−HIR(UASI)と
命名する。
(実施例24dI[)を含んで成る548bp Sal
I −Bgl Uフラグメント、0.3μモルのpG
Al’DI+ −8Lの266bp Bgl II
−HcoRIフラグメント、0.3pモルのpJDB2
0? /PH05(EcO)−HIRの643bp
EcoRI −11indI[Iフラグメント、および
0.j!pモルの5.3kbSall −11indl
[Iベクターフラグメントを、20μlの50mM1−
リス(pH7,5)、 10 mM MgC1g、
5 mMDTT、1mM ATPおよび400単位の
T4DNAリガーゼ(Biolabs)中で15℃で6
時間連結させる。連結混合物1μmおよび3μlを10
0μlのカルシウム処理したE、コリ118101細胞
に加える。atlp”コロニーからのプラスミドの単離
および5ail、Bgl I 、EcoRIおよびtl
indu[を用いる制限分析を、上記のように行う(実
施例24d■参照)。1個の陽性クローンを選択し、p
JDB207/PAPII!L−HIR(UASI)と
命名する。
同様な造成を、pGAPD!I −PLから分離される
201bp Bgl U−BcoRIフラグメントを用
いて行う。1個の選択されたプラスミドをpJDB20
7/PAPFL −旧R(UASI) と命名する。。
201bp Bgl U−BcoRIフラグメントを用
いて行う。1個の選択されたプラスミドをpJDB20
7/PAPFL −旧R(UASI) と命名する。。
3μgずつのプラスミドpHDB20?/FAI’EL
−111R(UASI)およびpJDB20? /
PAPFL−11[R([IASl)を、それぞれBg
lIIで消化する。フェノール抽出およびエタノール沈
澱の後、Maniatisらの方法に従い、DNAの3
′欠損末端を、E、コリDNAポリメラーゼ(Klen
o−フラグメント、Bethesda Re5earc
hLaboratories)との反応によりフィルイ
ンする(上記)。酵素を70℃で10分間不活性化させ
る。DNAを更にSal Iで消化して、大きな7.2
kbフラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フ
ェノール抽出およびエタノール沈澱により単離する。各
フラグメントを水に再分散させ、0.05pモル/μl
の濃度にする。フラグメントはヒルジンコード領域、は
とんどのベクター配列およびpGAPDII −ELま
たはpGAPDII −PLから単離される2種類の異
なるG A P D 11プロモーター要素を含む。
−111R(UASI)およびpJDB20? /
PAPFL−11[R([IASl)を、それぞれBg
lIIで消化する。フェノール抽出およびエタノール沈
澱の後、Maniatisらの方法に従い、DNAの3
′欠損末端を、E、コリDNAポリメラーゼ(Klen
o−フラグメント、Bethesda Re5earc
hLaboratories)との反応によりフィルイ
ンする(上記)。酵素を70℃で10分間不活性化させ
る。DNAを更にSal Iで消化して、大きな7.2
kbフラグメントをソフトアガロースゲル電気泳動、フ
ェノール抽出およびエタノール沈澱により単離する。各
フラグメントを水に再分散させ、0.05pモル/μl
の濃度にする。フラグメントはヒルジンコード領域、は
とんどのベクター配列およびpGAPDII −ELま
たはpGAPDII −PLから単離される2種類の異
なるG A P D 11プロモーター要素を含む。
プラスミドp31/Y(欧州特許出願第100.561
号明細書)を、上記のようにBst[!IIで消化し、
E。
号明細書)を、上記のようにBst[!IIで消化し、
E。
コリDNAポリメラーゼ(Kleno−フラグメント)
と共にインキエベートし、そして5ailで切断する。
と共にインキエベートし、そして5ailで切断する。
649bpフラグメントをソフトアガロースゲル上で分
離し、フェノール抽出およびエタノール沈澱により回収
する。
離し、フェノール抽出およびエタノール沈澱により回収
する。
UASI−UAS2 (展)プロモーター要素を含んで
成るp31/Yの649bpフラグメント0.3pモル
、および0.15pモルの7.2 k bフラグメント
の一方を、上記のように連結して、E・コリlIB’1
01中に形質転換する。プラスミドをamp”コロニー
から調製し、そして制限酵素により分析する。単一クロ
ーンを選択し、それらのプラスミドDNAをpJDB2
0? /PAPEL−HIR(UAS1+UAS2)お
よびpJDB207 /PAPFL −111R(UA
S1+UAS2) と命名する。
成るp31/Yの649bpフラグメント0.3pモル
、および0.15pモルの7.2 k bフラグメント
の一方を、上記のように連結して、E・コリlIB’1
01中に形質転換する。プラスミドをamp”コロニー
から調製し、そして制限酵素により分析する。単一クロ
ーンを選択し、それらのプラスミドDNAをpJDB2
0? /PAPEL−HIR(UAS1+UAS2)お
よびpJDB207 /PAPFL −111R(UA
S1+UAS2) と命名する。
(実施例24dlに記載のように)異なる長さの2個の
GAPDIIプロモーター要素をpH05シグナル配列
を含むデスルファトヒルジン蛋白質コードpI 域に連
結する。
GAPDIIプロモーター要素をpH05シグナル配列
を含むデスルファトヒルジン蛋白質コードpI 域に連
結する。
2個の要素(266bpおよび201bp)は、それぞ
れGAPDII TAT^ボックス、mRNA開始部
位およびATに冨む5′非翻訳領域を含んで成る。これ
らの要素のヌクレオチド配列を、第1θ図に示す。
れGAPDII TAT^ボックス、mRNA開始部
位およびATに冨む5′非翻訳領域を含んで成る。これ
らの要素のヌクレオチド配列を、第1θ図に示す。
これらの要素の3′末端はいずれも、GAPDII遺伝
子のATG (これにEcoRI認識部位(実施例24
dIにおいて導入されるオリゴヌクレオチドリンカー参
照)が続く)からの位!−5にあり、5′末端はそれぞ
れATGから位!−198および−263にありこれら
の位置でBgl IIリンカ−が付加されている。
子のATG (これにEcoRI認識部位(実施例24
dIにおいて導入されるオリゴヌクレオチドリンカー参
照)が続く)からの位!−5にあり、5′末端はそれぞ
れATGから位!−198および−263にありこれら
の位置でBgl IIリンカ−が付加されている。
Bal II EcoRIプロモーターフラグメント
を、P1105シグナル配列およびデスルファトヒルジ
ンをコードする配列を有するEcoRI −H1ndl
llフラグメント、およびIt ind m −Bam
1l Iベクターフラグメントに連結する。
を、P1105シグナル配列およびデスルファトヒルジ
ンをコードする配列を有するEcoRI −H1ndl
llフラグメント、およびIt ind m −Bam
1l Iベクターフラグメントに連結する。
6μgのプラスミドpHDB207/PH05−HIR
を制限エンドヌクレアーゼ旧ndI[[およびBamH
Iで完全に消化される。大きな6.5 k bフラグメ
ント(ベクタ一部)を0.8%アガロースゲル上トリス
−ホウ酸−EDT^緩衝液(pH8,3)中で分離し、
ゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノ
ール沈澱する。ベクターDNAフラグメントを水に再分
散して、0.05pモル/μlの濃度にする。
を制限エンドヌクレアーゼ旧ndI[[およびBamH
Iで完全に消化される。大きな6.5 k bフラグメ
ント(ベクタ一部)を0.8%アガロースゲル上トリス
−ホウ酸−EDT^緩衝液(pH8,3)中で分離し、
ゲルから電気溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノ
ール沈澱する。ベクターDNAフラグメントを水に再分
散して、0.05pモル/μlの濃度にする。
0.3pモルのpGAPDil −ELの266bp
Bgl II −EcoRIフラグメント(実施例2
4dlV) 、0.3 pモルのpJDB207/ P
H05(Eco) −111Rの643bp EcoR
l−11indI[[フラグメント(実施例24dl[
[)、およびo、tppモル6.5 k b 1li
nd m −Bam1l Iベクターフラグメントを、
10μlの60mMトリス(pH7,5)、10mM
MgC1g、5mM DTT、1mMATPおよび4
θ0単位の74DNAリガーゼ(Biolabs)中で
15℃で6時間連結させる。連結混合物1μlを、10
0μlのカルシウム処理したE、コリHBIOI細胞に
加える。 ampRコロニーからのプロモーターの単離
およびEcol目を用いる制限分析を、実施例246m
に記載したのと同様に行う。
Bgl II −EcoRIフラグメント(実施例2
4dlV) 、0.3 pモルのpJDB207/ P
H05(Eco) −111Rの643bp EcoR
l−11indI[[フラグメント(実施例24dl[
[)、およびo、tppモル6.5 k b 1li
nd m −Bam1l Iベクターフラグメントを、
10μlの60mMトリス(pH7,5)、10mM
MgC1g、5mM DTT、1mMATPおよび4
θ0単位の74DNAリガーゼ(Biolabs)中で
15℃で6時間連結させる。連結混合物1μlを、10
0μlのカルシウム処理したE、コリHBIOI細胞に
加える。 ampRコロニーからのプロモーターの単離
およびEcol目を用いる制限分析を、実施例246m
に記載したのと同様に行う。
一つの陽性クローンを選択して、そのプラスミドDNA
をpHDB207 /GAPI!L−111Rと称する
。
をpHDB207 /GAPI!L−111Rと称する
。
同様な造成をpGAPDII −PLから単離した20
1bpBgl N −[EcoRIフラグメントを用い
て行う。一つの選択されたクローンのプラスミドDNA
をpJ[1B20? /GAPFL−旧Rと呼ぶ。
1bpBgl N −[EcoRIフラグメントを用い
て行う。一つの選択されたクローンのプラスミドDNA
をpJ[1B20? /GAPFL−旧Rと呼ぶ。
以下の造成は、直列(タンデム)の頭と尾の配置で重複
されたDNAフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、(それぞれ実施例24および25に記載の
ように) GAPDHプロモーターまたはハイブリッド
I’1105− GAPDIIプロモーター、皿邦シグ
ナル配列、デスルファトヒルジンのコード配列、および
P1105転写ターナミネーターからなる。
されたDNAフラグメントを含む。この重複されたフラ
グメントは、(それぞれ実施例24および25に記載の
ように) GAPDHプロモーターまたはハイブリッド
I’1105− GAPDIIプロモーター、皿邦シグ
ナル配列、デスルファトヒルジンのコード配列、および
P1105転写ターナミネーターからなる。
7 μg (7)フラスミ)’p)ID[1207/G
APEL−111Rを、制限エンドヌクレアーゼ旧nd
lllで消化する。3′欠損末端を、Maniatis
(上記)の方法によりE。
APEL−111Rを、制限エンドヌクレアーゼ旧nd
lllで消化する。3′欠損末端を、Maniatis
(上記)の方法によりE。
コリDNAポリメラーゼI (Xleno−フラグメン
ト、Bethesda Re5earch Labor
atory)との反応によりフィルインする。1.85
μgのSal Iリンカ−5′−+IGGTCGACC
−3’ (Biolabs)を、50μlの60mM)
リス(pH7,5)、 10 mM MgCh 、 5
mM DTT、0.5mM ATPおよび50単
位のT、ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehr in
ger)中でキナーゼ処理する。37℃で45分間処理
の後、混合物を75℃で10分間加熱し、室温に放冷す
る。7μg(1,5pモル)の平滑末端(上記)に変換
された1lindllr部位を有する線状化したブラス
ミ)’pJDB pJDB20?/GAPOL−1!1
Rを、80倍過剰量のキナーゼ処理されそしてアニーリ
ルされたSalリンカ−と共に、30μmの60mMt
−リス、(pH7,5)、 10mM MgCl2.
5m、M DTT 。
ト、Bethesda Re5earch Labor
atory)との反応によりフィルインする。1.85
μgのSal Iリンカ−5′−+IGGTCGACC
−3’ (Biolabs)を、50μlの60mM)
リス(pH7,5)、 10 mM MgCh 、 5
mM DTT、0.5mM ATPおよび50単
位のT、ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehr in
ger)中でキナーゼ処理する。37℃で45分間処理
の後、混合物を75℃で10分間加熱し、室温に放冷す
る。7μg(1,5pモル)の平滑末端(上記)に変換
された1lindllr部位を有する線状化したブラス
ミ)’pJDB pJDB20?/GAPOL−1!1
Rを、80倍過剰量のキナーゼ処理されそしてアニーリ
ルされたSalリンカ−と共に、30μmの60mMt
−リス、(pH7,5)、 10mM MgCl2.
5m、M DTT 。
3.5mMのATPおよび800単位の74 D N
A IJガーゼ(Biolabs)中で15℃で16時
間インキュベートする。T4DNAリガーゼを75℃で
10分間不活性化した、後過剰のリンカ−を10mMB
DTA、 300m M酢酸ナトリウム(pH6,0
> および0.54容のイソプロパツールの存在下でD
NAを沈澱させることにより除去する。DNAを5ai
lで消化する。生成するフラグメントを1%アガロース
ゲル上トリス−ホウ酸−〇〇TA緩衝液(pH8,3)
中で分離する。1.1 k bのSal Iフラグメン
トを、ゲルからの電気溶出、フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱により回収する。DNAを0.1μモル/μ
lの濃度で再分散させる。
A IJガーゼ(Biolabs)中で15℃で16時
間インキュベートする。T4DNAリガーゼを75℃で
10分間不活性化した、後過剰のリンカ−を10mMB
DTA、 300m M酢酸ナトリウム(pH6,0
> および0.54容のイソプロパツールの存在下でD
NAを沈澱させることにより除去する。DNAを5ai
lで消化する。生成するフラグメントを1%アガロース
ゲル上トリス−ホウ酸−〇〇TA緩衝液(pH8,3)
中で分離する。1.1 k bのSal Iフラグメン
トを、ゲルからの電気溶出、フェノール抽出およびエタ
ノール沈澱により回収する。DNAを0.1μモル/μ
lの濃度で再分散させる。
5μgのプラスミドpJDB207/GAPEL−旧P
をSal Iで完全に消化する。フェノール抽出および
エタノ−′ル沈澱の後、DNAを100μlの50mM
のトリス(pH8,0)中に再分散させる。4.6単位
のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(Boehring
er)を加える。37℃で1時間置いた後、ホスファタ
ーゼを、loom M NaC1,5mMHDT^お
よび0.5%のSDSの存在下で68℃にて15分間不
活性化する。DNA溶液を、10mM1−リス(pH7
,5)、150 mM NaC1,およびl mM
EDTAで平衡化したDE52アニオン交換体(Wha
tn+an)の100μlのベッドに加える。カラムを
同じ緩衝液で洗浄した後、DNAを400μm(7)1
.5 M NaC1゜10mM1−リス(pH17,5
) 、 1mM EOTAで溶出し、エタノールで沈
澱せしめる。線状化したプラスミドを0.6%のアガロ
ースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断されていない
DNAから分離する。ゲルから線状の7.3kb D
NAフラグメントを回収し、電気溶出し、フェノール抽
出し、エタノールで沈澱させ、そしてO,l pモル/
μlの濃度で再分散させる。
をSal Iで完全に消化する。フェノール抽出および
エタノ−′ル沈澱の後、DNAを100μlの50mM
のトリス(pH8,0)中に再分散させる。4.6単位
のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(Boehring
er)を加える。37℃で1時間置いた後、ホスファタ
ーゼを、loom M NaC1,5mMHDT^お
よび0.5%のSDSの存在下で68℃にて15分間不
活性化する。DNA溶液を、10mM1−リス(pH7
,5)、150 mM NaC1,およびl mM
EDTAで平衡化したDE52アニオン交換体(Wha
tn+an)の100μlのベッドに加える。カラムを
同じ緩衝液で洗浄した後、DNAを400μm(7)1
.5 M NaC1゜10mM1−リス(pH17,5
) 、 1mM EOTAで溶出し、エタノールで沈
澱せしめる。線状化したプラスミドを0.6%のアガロ
ースゲル上トリス−酢酸緩衝液中で、切断されていない
DNAから分離する。ゲルから線状の7.3kb D
NAフラグメントを回収し、電気溶出し、フェノール抽
出し、エタノールで沈澱させ、そしてO,l pモル/
μlの濃度で再分散させる。
0.2pモルの1.1kbSallフラグメントおよび
0.1 pモルの線状化したベクターを10μlの60
mM)リス(pH7,5> 、 10mM MgCl
、、 5mM DTT、1mM ATPおよび2
00単位のT4DNAリガーゼ中15℃で16時間連結
させる。連結混合物1μlを、100μlのカルシウム
処理し形質転換コンピテントE、コリ細胞に加える。
0.1 pモルの線状化したベクターを10μlの60
mM)リス(pH7,5> 、 10mM MgCl
、、 5mM DTT、1mM ATPおよび2
00単位のT4DNAリガーゼ中15℃で16時間連結
させる。連結混合物1μlを、100μlのカルシウム
処理し形質転換コンピテントE、コリ細胞に加える。
24個の形質転換したamp”コロニーを、別々に10
0μg/mlのアンピシリンを含むLB培地中で増殖さ
せる。11olsesらの方法[^na1.Bioch
e+++。
0μg/mlのアンピシリンを含むLB培地中で増殖さ
せる。11olsesらの方法[^na1.Bioch
e+++。
旦4 (1981) 193]に従い、プラスミドDN
Aを調製し、そして[!coRI制限消化によって分析
する。
Aを調製し、そして[!coRI制限消化によって分析
する。
予想される制限フラグメントを有するーっのクローンを
単離し、そしテpJDB207/ [GAPI!L−H
IR]Dと命名する。
単離し、そしテpJDB207/ [GAPI!L−H
IR]Dと命名する。
同様な造成を、プラスミF pJD[1207/GAP
FL −+11RおよびpJDB207/ PAPFL
/IER(UAS1+UAS2)を用いて行う。一つの
選択されたクローンの得られるプラスミドDNAは、そ
れぞれpJDB207/[FAPFL −+11R]
DオヨびpJDB20?/ [PAPFL −1+1R
(UAS1+UAS2) ] Dと呼ばれる。
FL −+11RおよびpJDB207/ PAPFL
/IER(UAS1+UAS2)を用いて行う。一つの
選択されたクローンの得られるプラスミドDNAは、そ
れぞれpJDB207/[FAPFL −+11R]
DオヨびpJDB20?/ [PAPFL −1+1R
(UAS1+UAS2) ] Dと呼ばれる。
以下余白
m工、ノね”、されるデスルファトヒルジン9−〇 A
P D 11−プロモーター、■卯シグナル配列、デ
スルファトヒルジンのコード配列、および皿亜転写ター
ミネータ−を含んで成るDNAフラグメントの4個のコ
ピーを、直列(タンデム)の頭と尾の配置で酵母発現ベ
クターに挿入する。
P D 11−プロモーター、■卯シグナル配列、デ
スルファトヒルジンのコード配列、および皿亜転写ター
ミネータ−を含んで成るDNAフラグメントの4個のコ
ピーを、直列(タンデム)の頭と尾の配置で酵母発現ベ
クターに挿入する。
10μgのプラスミドpHDB20?/ [GA’PF
L−旧RD(実施例26参照)をSal lで消化する
。生成する線状フラグメントの接着末端を、Mania
tiesら(上記)の方法により、E・コリDNAポリ
メラーゼT (Kleno−フラグメント、BRL)
との反応においてフィルインする。0.94μgの旧n
dllIリンカ−[5’ −CAAGCTTG −3’
、Biolabs ]をキナーゼ処理し、セルファニ
ーリングし、そして平滑末端へ変換されたSal1部位
を有する線状化したプラスミドpJDB20?/ [G
APFL−旧RIDに連結する。リンカ−の連結および
イソプロパツールによる沈澱は、実施例26に記載され
ているのと同様である。次に、DNAを旧ndlI[を
用いて切断し、そして生成する2、 2 k bのフラ
グメントを電気溶出し、そしてフェノール抽出およびエ
タノール沈澱により単離する。DNAを0.1μモル/
μlの濃度に再分散する。
L−旧RD(実施例26参照)をSal lで消化する
。生成する線状フラグメントの接着末端を、Mania
tiesら(上記)の方法により、E・コリDNAポリ
メラーゼT (Kleno−フラグメント、BRL)
との反応においてフィルインする。0.94μgの旧n
dllIリンカ−[5’ −CAAGCTTG −3’
、Biolabs ]をキナーゼ処理し、セルファニ
ーリングし、そして平滑末端へ変換されたSal1部位
を有する線状化したプラスミドpJDB20?/ [G
APFL−旧RIDに連結する。リンカ−の連結および
イソプロパツールによる沈澱は、実施例26に記載され
ているのと同様である。次に、DNAを旧ndlI[を
用いて切断し、そして生成する2、 2 k bのフラ
グメントを電気溶出し、そしてフェノール抽出およびエ
タノール沈澱により単離する。DNAを0.1μモル/
μlの濃度に再分散する。
5μgのプラスミドpJDB20?/ [GAPFL−
旧R]Dを、旧ndlllを用いて完全に消化する。D
NAをウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(Boehri
nger)を用いて脱リン酸化し、DE52イオン交換
クロマトグラフィによって精製し、実施例26に記載の
ように電気溶出によって0.6%アガ【1−スゲルから
単離する。
旧R]Dを、旧ndlllを用いて完全に消化する。D
NAをウシ腸アルカリ性ホスファターゼ(Boehri
nger)を用いて脱リン酸化し、DE52イオン交換
クロマトグラフィによって精製し、実施例26に記載の
ように電気溶出によって0.6%アガ【1−スゲルから
単離する。
0、2 pモルの2.2 k b Hind mフラグ
メントおよび0.1 pモルの線状化したベクターを上
記のように連結する。1μlの連結混合物を、100μ
lのコルシウム処理した形質転換コンピテントE。
メントおよび0.1 pモルの線状化したベクターを上
記のように連結する。1μlの連結混合物を、100μ
lのコルシウム処理した形質転換コンピテントE。
コリHBIOI細胞に加える。
12個の形質転換したatmp” :10ニーを、10
0μg / m 1のアンピシリンを含むLB培地で別
々に生育させる。プラスミドDNAを調製し、そしてS
al I + Xba IおよびAva I + Xb
a Iの二重消化およびBa5HI消化によって分析す
る。1.1kbBamll I一連結フラグメントは、
インサートがプラスミド上に既存の2個のコピーに対し
て頭と尾の配置で存在することを示唆している。インサ
ートのこの方向を有する一つのクローンを、pJDB2
07/ [GAPFL−HrR] Tと称する。
0μg / m 1のアンピシリンを含むLB培地で別
々に生育させる。プラスミドDNAを調製し、そしてS
al I + Xba IおよびAva I + Xb
a Iの二重消化およびBa5HI消化によって分析す
る。1.1kbBamll I一連結フラグメントは、
インサートがプラスミド上に既存の2個のコピーに対し
て頭と尾の配置で存在することを示唆している。インサ
ートのこの方向を有する一つのクローンを、pJDB2
07/ [GAPFL−HrR] Tと称する。
4種類のオリゴデオキシリボヌクレオチド(■−1、I
−2、I−3、■−4)を、DNA合成機(380B型
、Applied Biosystems)によって合
成する。脱ブロッキングの後、合成フラグメントを8M
尿素含有する12%ポリアクリルアミドゲルで精製する
。塩を含有しない純粋なオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドが、Sep、Pak (WatersAssocia
tes)を用いて得られる。これらのフラグメントは、
頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルターゼシ
グナル配列をコードするデユープレックスを構成する。
−2、I−3、■−4)を、DNA合成機(380B型
、Applied Biosystems)によって合
成する。脱ブロッキングの後、合成フラグメントを8M
尿素含有する12%ポリアクリルアミドゲルで精製する
。塩を含有しない純粋なオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドが、Sep、Pak (WatersAssocia
tes)を用いて得られる。これらのフラグメントは、
頻繁に用いられる酵母コドンを有するインベルターゼシ
グナル配列をコードするデユープレックスを構成する。
(a)二え久二■m1
1.5μgのp31R/SS −TPAΔ2(欧州特許
出願第143.081号明細書)を、50μlの10m
M)リス・HCl (pH7、5)、 6 mM Mg
Ch、100mM NaC1゜6mMメルカプトエタノ
ール中で、10単位の以下余白 EcoRI (Boehringer)を用いて、37
℃で1時間消化する。1μlの2.5 M NaC1を
加えた後、10単位のXk+o f (Boehrin
ger)を加え、37℃で1時間インキュベートする。
出願第143.081号明細書)を、50μlの10m
M)リス・HCl (pH7、5)、 6 mM Mg
Ch、100mM NaC1゜6mMメルカプトエタノ
ール中で、10単位の以下余白 EcoRI (Boehringer)を用いて、37
℃で1時間消化する。1μlの2.5 M NaC1を
加えた後、10単位のXk+o f (Boehrin
ger)を加え、37℃で1時間インキュベートする。
4,2kbベクターを、0、8%調製用アガロースゲル
上で単離する。ゲルスライスを旧cro Co11oi
dorチユーブ(SartoriusG+++bll)
に写して、200μlのTEで覆い、そして電気溶出す
る(90mAで50分間電気泳動する)。
上で単離する。ゲルスライスを旧cro Co11oi
dorチユーブ(SartoriusG+++bll)
に写して、200μlのTEで覆い、そして電気溶出す
る(90mAで50分間電気泳動する)。
TE溶液を集めて、0.1容の10xTHNを添加した
後、2.5容の無水エタノール中で沈澱させる。
後、2.5容の無水エタノール中で沈澱させる。
DNAペレットを冷80%エタノールで洗浄し、そして
真空中で乾燥する。DNAを、6μlのTEに再分散す
る(40μモル/μl)。
真空中で乾燥する。DNAを、6μlのTEに再分散す
る(40μモル/μl)。
10μmの0.5 M トリス・HClCpH8>中に
それぞれ109モルの4種類のデオキシリボヌクレオチ
ドを含む溶液を、水浴上で95℃で5分間インキュベー
トする。水浴を、5時間にわたって30℃まで徐々に冷
却する。このアニーリング混合物に、それぞれ2μlの
0.1 M MgC1z 、 0.1 MNaCl、3
0mM DTT、4mM ATPおよび8!位(l
μl)のポリヌクレオチドキナーゼ(Boehring
er)を加える。キナーゼ処理は、37℃で1時間行う
。アニーリングし、キナーゼ処理されたオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、および60μモルのEcoRI −
Xho I切断ベクター(1,5μK)を、400単位
(1μl)のT4DNAリガーゼ(Biolabs)を
用いて14℃で17時間連結させる。65℃で10分間
インキュベートすることによって、反応を停止させる。
それぞれ109モルの4種類のデオキシリボヌクレオチ
ドを含む溶液を、水浴上で95℃で5分間インキュベー
トする。水浴を、5時間にわたって30℃まで徐々に冷
却する。このアニーリング混合物に、それぞれ2μlの
0.1 M MgC1z 、 0.1 MNaCl、3
0mM DTT、4mM ATPおよび8!位(l
μl)のポリヌクレオチドキナーゼ(Boehring
er)を加える。キナーゼ処理は、37℃で1時間行う
。アニーリングし、キナーゼ処理されたオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、および60μモルのEcoRI −
Xho I切断ベクター(1,5μK)を、400単位
(1μl)のT4DNAリガーゼ(Biolabs)を
用いて14℃で17時間連結させる。65℃で10分間
インキュベートすることによって、反応を停止させる。
10m1のこの連結部゛合物を、E、31月IBIOI
Ca”細胞の形質転換に用いる[M、Dagertお
よびS、D、Ehrlich 5Gene。
Ca”細胞の形質転換に用いる[M、Dagertお
よびS、D、Ehrlich 5Gene。
56、23−28(1979)1 、20個のaa+p
” :I口二一を採取する。DNAを迅速単離法により
調製する[D、S、Ho1s+esおよび台0口uig
ley +、Ana1.Biochem。
” :I口二一を採取する。DNAを迅速単離法により
調製する[D、S、Ho1s+esおよび台0口uig
ley +、Ana1.Biochem。
J、193−197(1981)] 、 DNAをEc
oRIおよびXho Iを用いて消化し、BcoRI末
端で放射能標識を行い、放射能標識されたpBr322
HaeI[I切断DNAをマーカーとして用いて、8
M尿素を含む6%ポリアクリルアミドゲル上で分析する
。総ての20個のコロニーから得られるDNAについて
、正確な大きさのバンドが観察される。1個のクローン
を100μg / m lのアンピシリンを含む100
m!のLB培地で増殖させる。プラスミドDNAを単離
して、p31RIT−12と称する。
oRIおよびXho Iを用いて消化し、BcoRI末
端で放射能標識を行い、放射能標識されたpBr322
HaeI[I切断DNAをマーカーとして用いて、8
M尿素を含む6%ポリアクリルアミドゲル上で分析する
。総ての20個のコロニーから得られるDNAについて
、正確な大きさのバンドが観察される。1個のクローン
を100μg / m lのアンピシリンを含む100
m!のLB培地で増殖させる。プラスミドDNAを単離
して、p31RIT−12と称する。
5μgのプラスミドp31RIT−12を、Sal I
およびEcoRIを用いて完全に消化する。大きな3.
3k b Sal I −EcoRIフラグメントを、
0.6%アガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液(pH8
,2)中で単離する。DNAをゲルから電気溶出し、フ
ェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。
およびEcoRIを用いて完全に消化する。大きな3.
3k b Sal I −EcoRIフラグメントを、
0.6%アガロースゲル上トリス−酢酸緩衝液(pH8
,2)中で単離する。DNAをゲルから電気溶出し、フ
ェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。
10μgのプラスミドpJDB207/GAPFL −
111R(実施例25参照)をSalおよびEcoRI
を用いて消化する。 477bp Sal I −f
!coRIフラグメントを、0、8%アガロースゲル上
トリス−ホウ酸−porA緩衝液(pH8,3)中で単
離する。DNAを電気溶出し、フェノール抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。これらの単離されたDNA
フラグメントを連結する。連結混合物の一部を用いて、
適当なE・コリIIBIOI細胞を形質転換する。al
lIpRコロニーを増殖せしめ、プラスミドDNAをl
1indlllSail二重消化によって分析する。正
確なインサートを有するプラスミドを、p31/GAP
FL −I Tと命名する。
111R(実施例25参照)をSalおよびEcoRI
を用いて消化する。 477bp Sal I −f
!coRIフラグメントを、0、8%アガロースゲル上
トリス−ホウ酸−porA緩衝液(pH8,3)中で単
離する。DNAを電気溶出し、フェノール抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。これらの単離されたDNA
フラグメントを連結する。連結混合物の一部を用いて、
適当なE・コリIIBIOI細胞を形質転換する。al
lIpRコロニーを増殖せしめ、プラスミドDNAをl
1indlllSail二重消化によって分析する。正
確なインサートを有するプラスミドを、p31/GAP
FL −I Tと命名する。
25μgのプラスミドp31/GAPFL −I Tを
、PsLIおよび5alIを用いて完全に消化する。生
成する676bpフラグメントを、10%調製用アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA衝液(pl! 8
.3 )中で単離する。DNAをゲルから電気溶出し、
0E52イオン交換クロマトグラフイによって精製し、
エタノールで沈澱させ、そしてlIgaI酵素に好適な
緩衝液に再分散して0.1μg/μlの濃度にする。S
al I −Pstl DNAフラグメントを、0.
5単位/μgDNAの存在でIlg、11を用いて37
℃で60分間部分的に消化する。EDTAを添加して最
終濃度を10mMにすることによって、反応を停止させ
る。534bp Sal I −Ilga Iフラグメ
ントを1%調製用アガロースゲル上で単離する。
、PsLIおよび5alIを用いて完全に消化する。生
成する676bpフラグメントを、10%調製用アガロ
ースゲル上トリス−ホウ酸−EDTA衝液(pl! 8
.3 )中で単離する。DNAをゲルから電気溶出し、
0E52イオン交換クロマトグラフイによって精製し、
エタノールで沈澱させ、そしてlIgaI酵素に好適な
緩衝液に再分散して0.1μg/μlの濃度にする。S
al I −Pstl DNAフラグメントを、0.
5単位/μgDNAの存在でIlg、11を用いて37
℃で60分間部分的に消化する。EDTAを添加して最
終濃度を10mMにすることによって、反応を停止させ
る。534bp Sal I −Ilga Iフラグメ
ントを1%調製用アガロースゲル上で単離する。
DNAをゲルから電気溶出し、DE52クロマトグラフ
ィによって精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分
散させて、約0.1μモル/μlの濃度にする。
ィによって精製し、エタノール沈澱し、そして水に再分
散させて、約0.1μモル/μlの濃度にする。
10μgのプラスミドpJDB207/PH05−11
1R(実施例16参照)を、Ba1lおよび旧ndl[
Iを用いて消化する。生成する587 bpBal I
−旧ndIIフラグメントを、調製用1%アガロースゲ
ル上で単離する。DNAを電気溶出し、エタノール沈澱
し、更に旧nflで消化する。
1R(実施例16参照)を、Ba1lおよび旧ndl[
Iを用いて消化する。生成する587 bpBal I
−旧ndIIフラグメントを、調製用1%アガロースゲ
ル上で単離する。DNAを電気溶出し、エタノール沈澱
し、更に旧nflで消化する。
下記のオリゴデオキシヌクレオチド
5’ −CTGCAGTTGTTTACACCGACT
GCACCG−3’3’ −CAACAAATGTGG
CTGACGTGGCTTA−5’のそれぞれ1.3μ
g (160μM)を実施例24dllIに記載のよう
にしてキナーゼ処理し、そしてアニーリングする。0.
6μg(1,6pモル)の旧nflで消化したBal
l−11indn[フラグメント(上記参照)および1
60μモルのキナーゼ処理されアニーリングしたリンカ
−を、83μlの10mM)リス−HCl (pH7
,5)、 10mM MgCb、 5mM DTT、
3.5mM ATPおよび400単位のT、DNAリ
ガーゼ中で、15℃で16時間連結させる。
GCACCG−3’3’ −CAACAAATGTGG
CTGACGTGGCTTA−5’のそれぞれ1.3μ
g (160μM)を実施例24dllIに記載のよう
にしてキナーゼ処理し、そしてアニーリングする。0.
6μg(1,6pモル)の旧nflで消化したBal
l−11indn[フラグメント(上記参照)および1
60μモルのキナーゼ処理されアニーリングしたリンカ
−を、83μlの10mM)リス−HCl (pH7
,5)、 10mM MgCb、 5mM DTT、
3.5mM ATPおよび400単位のT、DNAリ
ガーゼ中で、15℃で16時間連結させる。
85℃にて10分間の後、DNAをイソプロパツールで
沈澱させることによって過剰のリンカ−を除去する(実
施例24dlll参照)。584bp Ilga I
−1lindl[[フラグメントを、1%調製用アガロ
ースゲル上で単離する。電気溶出し、精製し、そしてエ
タノール沈澱させたDNAを水に再分散して、0、1
pモル/μlの濃度にする。
沈澱させることによって過剰のリンカ−を除去する(実
施例24dlll参照)。584bp Ilga I
−1lindl[[フラグメントを、1%調製用アガロ
ースゲル上で単離する。電気溶出し、精製し、そしてエ
タノール沈澱させたDNAを水に再分散して、0、1
pモル/μlの濃度にする。
5μgのpJDB20? /PH05−II Inを旧
ndn[および5ailで消化し、そして大きな6.2
k bフラグメントを単離する。
ndn[および5ailで消化し、そして大きな6.2
k bフラグメントを単離する。
0.2pモルの534bp Sat I −Ilga
Iフラグメン)、0.2pモルの584bp Hga
T −IIindl[Iフラグメント、および0.1μ
モルの6.2 k b Sal I −H1nd■ベク
ターフラグメントを、10μlの10mMトリス・HC
1(pH7、5)、10 mM MgCh、5mM
DTT、1mM ATPおよび400単位のT4リガ
ーゼ中で15℃で5時間連結させる。連結混合物の1μ
lを用いて、コンピテント8.31月1Blot細胞を
形質転換させる。
Iフラグメン)、0.2pモルの584bp Hga
T −IIindl[Iフラグメント、および0.1μ
モルの6.2 k b Sal I −H1nd■ベク
ターフラグメントを、10μlの10mMトリス・HC
1(pH7、5)、10 mM MgCh、5mM
DTT、1mM ATPおよび400単位のT4リガ
ーゼ中で15℃で5時間連結させる。連結混合物の1μ
lを用いて、コンピテント8.31月1Blot細胞を
形質転換させる。
24個の形質転換されたアンピシリン耐性のコロニーを
、100μg / m 1アンピシリンを含むLB培地
で別々に増殖させる。プラスミドDNAを調製して、旧
ndl[[およびSalに重消化によって分析する。正
確な制限パターンを有する単一クローンを単離し、pJ
D[120?/GAPPL −1−111Rと表す。
、100μg / m 1アンピシリンを含むLB培地
で別々に増殖させる。プラスミドDNAを調製して、旧
ndl[[およびSalに重消化によって分析する。正
確な制限パターンを有する単一クローンを単離し、pJ
D[120?/GAPPL −1−111Rと表す。
インベルターゼシグナル配列の同一性およびヒルジンコ
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
ード配列との正確な融合を、ヌクレオチド配列決定法に
よって確かめる。
サツカロミセス・セレビシェ−CFR18株(α。
112、 can” )を、1linnenらの報告
による形質転換法[Proc、Natl、Acad、S
ci、 、USA、?5 、1929(197B) ]
を用いて、次のようなプラスミドを用いて形質転換する
。
による形質転換法[Proc、Natl、Acad、S
ci、 、USA、?5 、1929(197B) ]
を用いて、次のようなプラスミドを用いて形質転換する
。
pJDB20? /PAPEL −111R(UASI
)。
)。
pJDB20? /PAPFL −1+1R(UASI
)。
)。
pJDB207 /PAPI!L −111R(U
AS1+UAS2)。
AS1+UAS2)。
pJDB20? /PAPFL −111R(UAS1
+UAS2)。
+UAS2)。
pJDB20? /GAPBL −IIIR。
pJDB207 /GAPFL −111R。
pJDB20? / [GAPIl!L −1+
1Rコ 0゜9JDB201 / [GAPFL −1
+1R] D。
1Rコ 0゜9JDB201 / [GAPFL −1
+1R] D。
pJDB207 / [PAPFL −HIR] (U
ASI +UAS2)D。
ASI +UAS2)D。
pJDB207 / [GAPFL −HIR] T。
pJDB207 /GAPI?L −1−111R
形質転換した酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地
平板上で選択する。単一の形質転換した酵母コロニーを
単離して、次のように命名する。
形質転換した酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地
平板上で選択する。単一の形質転換した酵母コロニーを
単離して、次のように命名する。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF1B/pJDB2
07/PAPEL−旧R(IIAsI)。
07/PAPEL−旧R(IIAsI)。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18/pJDB2
07/r’APFL−HIR(UASI)。
07/r’APFL−HIR(UASI)。
1フj11+!tX・セレビシェ−GRF18/pJD
B207/PAPEL−111R(UASI + UA
S2)。
B207/PAPEL−111R(UASI + UA
S2)。
1フN1ミにスーkkビ!t’L−GRFt8/pJD
[1207/PAPFL−1+1R(UAS1+LIA
S2)。
[1207/PAPFL−1+1R(UAS1+LIA
S2)。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18/pJD[1
207/GAPEL−HIR。
207/GAPEL−HIR。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF1B/pJD[1
207/GAPFL−HER。
207/GAPFL−HER。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18/pJDn2
07/ [GAPEL−111RI D。
07/ [GAPEL−111RI D。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF1B/pJDB2
0?/ [GAPPL−HIRI D。
0?/ [GAPPL−HIRI D。
サフNJミセス−にレビ’rx−GRF18/pJDB
207/ [PAPFL−111RI (IJA
S1+UAS2)] 0゜9フカUミセス・セレビシ
x−GRF1B/PJI38207/ [GAPF
L−旧111 ?。
207/ [PAPFL−111RI (IJA
S1+UAS2)] 0゜9フカUミセス・セレビシ
x−GRF1B/PJI38207/ [GAPF
L−旧111 ?。
サツカロミセス・セレビシェ−GRF18/pJDB2
07/ GAPFL−1−旧R0゛(b)朋IjJu
帖(社)i醒 S、セレビシェ−GRFlB形質転換体の細胞をそれぞ
れ、50m1三角フラスコ中で、10m1の酵母最少培
地(2%グルコースおよび20mg/lのL−ヒスチジ
ンを加えた、アミノ酸を含有しないDifco Yea
st Nitrogen Ba5e)中で、30℃で2
4時間振盪しながら培養して、3XlO’個/mlの細
胞密度とする。ハイブリγM PH05−GAPD11
プロモーターを有するプラスミドを含む酵母形質転換体
は、デスルファトヒルジンの発現にはプロモーターの抑
制解除を必要とする。細胞を0.9%NaC1で洗浄し
、これを(N++n)zsし、2%グルコースおよびI
g/lのL−ヒスチジンの代わりに0.03g/lのK
ll□poい 10g/lのL−アスパラギンを含むほ
か、Difco Yeast Nitrogen Ba
5e培 −地(アミノ酸なし)の処方にしたがって調製
した50m1の低Pt最少培地に接種する。培養物は、
4x106個/m1以下の細胞密度で接種し、30℃、
20Or p mで24時間攪拌する。最終的密度は、
1xlO’個/ m 1となる。
07/ GAPFL−1−旧R0゛(b)朋IjJu
帖(社)i醒 S、セレビシェ−GRFlB形質転換体の細胞をそれぞ
れ、50m1三角フラスコ中で、10m1の酵母最少培
地(2%グルコースおよび20mg/lのL−ヒスチジ
ンを加えた、アミノ酸を含有しないDifco Yea
st Nitrogen Ba5e)中で、30℃で2
4時間振盪しながら培養して、3XlO’個/mlの細
胞密度とする。ハイブリγM PH05−GAPD11
プロモーターを有するプラスミドを含む酵母形質転換体
は、デスルファトヒルジンの発現にはプロモーターの抑
制解除を必要とする。細胞を0.9%NaC1で洗浄し
、これを(N++n)zsし、2%グルコースおよびI
g/lのL−ヒスチジンの代わりに0.03g/lのK
ll□poい 10g/lのL−アスパラギンを含むほ
か、Difco Yeast Nitrogen Ba
5e培 −地(アミノ酸なし)の処方にしたがって調製
した50m1の低Pt最少培地に接種する。培養物は、
4x106個/m1以下の細胞密度で接種し、30℃、
20Or p mで24時間攪拌する。最終的密度は、
1xlO’個/ m 1となる。
[;APDHプロモーターを有するプラスミドを含有す
る酵母形質転換体は、構成的にデスルファトヒルジンを
発現する。細胞をペプトン(5g/l)、酵母エキス(
10g/l)、グルコース(20g/l)、シュークロ
ース(40g/l)、硫酸アンモニウム(3g/ l
) 、XIIzSO* (2g/ 1)、Mg5O4(
0,5g/ l) 、NaC1(0,1g/ l) 、
CaC1g(0,1g/l)、ビオチン(10μg/l
)から成る複合培地(g/l)中で培養する。30℃、
20Or p mで48時間培養した後に、約1xlO
’個/ m lの細胞が得られる。
る酵母形質転換体は、構成的にデスルファトヒルジンを
発現する。細胞をペプトン(5g/l)、酵母エキス(
10g/l)、グルコース(20g/l)、シュークロ
ース(40g/l)、硫酸アンモニウム(3g/ l
) 、XIIzSO* (2g/ 1)、Mg5O4(
0,5g/ l) 、NaC1(0,1g/ l) 、
CaC1g(0,1g/l)、ビオチン(10μg/l
)から成る複合培地(g/l)中で培養する。30℃、
20Or p mで48時間培養した後に、約1xlO
’個/ m lの細胞が得られる。
幾つかの代表的な形質転換した酵母株によって分泌され
るデスルファトヒルジンの量(トロンビン阻害法によっ
て測定)を、以下の表にまとめである。
るデスルファトヒルジンの量(トロンビン阻害法によっ
て測定)を、以下の表にまとめである。
また、酵母形質転換体によって発現されたデスルファト
ヒルジン化合物の少なくとも90%は培養液中に分泌さ
れることも決定される。回収の時間の関数としての培養
液中および細胞内におけるデスルファトヒルジンの分布
を決定するため、3リツトルのMBRバイオリアクター
(MBRBioreactorAG、 Wetziko
n、スイス)中で醗酵を行う。サツカロミセス・セレビ
シェ−GRF18/pJDB207 /GAPPL−1
+1R株を3リツトルの複合培地(上記参照)に接種し
て、30℃で、攪拌速度500 r p mおよび通気
量200リットル/時間で培養する。最終密度5x10
9個/ m 1が達成される。試料をそれぞれ、18.
24および42時間目に採取し培溶液中および細胞内(
崩壊後、実施例22参照)のデスルファトヒルジンの含
量をトロンビン阻害法およびIIPLCによって測定す
る。
ヒルジン化合物の少なくとも90%は培養液中に分泌さ
れることも決定される。回収の時間の関数としての培養
液中および細胞内におけるデスルファトヒルジンの分布
を決定するため、3リツトルのMBRバイオリアクター
(MBRBioreactorAG、 Wetziko
n、スイス)中で醗酵を行う。サツカロミセス・セレビ
シェ−GRF18/pJDB207 /GAPPL−1
+1R株を3リツトルの複合培地(上記参照)に接種し
て、30℃で、攪拌速度500 r p mおよび通気
量200リットル/時間で培養する。最終密度5x10
9個/ m 1が達成される。試料をそれぞれ、18.
24および42時間目に採取し培溶液中および細胞内(
崩壊後、実施例22参照)のデスルファトヒルジンの含
量をトロンビン阻害法およびIIPLCによって測定す
る。
去旌桝主工・」咀にヒ呂旧Uソ」1七且葬豊サツカロミ
セス・セレビシェ−GRP1B/ pJDB207/
GAPFL−HIR株の細胞を含む深冷凍結アンプルか
ら多数の寒天斜面に接種を行う。1個以上の寒天斜面を
28〜30℃で3〜5日間培養する。1つの寒天斜面の
内容物を、邪魔板がなく、前培養培地100m lを収
容する単一の500m1三角フラスコに無菌的に接種す
る。フラスコを、振幅が50鶴で25orpmのロータ
リー・シエイカーで、培養温度28℃で振盪する。48
時間後に、これらのフラスコの内容物(−次面培養物)
2%(V/V)を、600m lの前培養培地を収容す
る2リツトルの三角フラスコに無菌的に接種する。これ
らのフラスコ(二次前培養物)を、28℃で、ロータリ
ー・シュイカ−上で12Orpmで振幅を50鳳1とし
て48時間振盪する。二次前培養物のフラスコ(2%v
/ v )の内容物を、30リツトルの前培養培地(
プラント前培養物)を収容する50リツトルのステンレ
ススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。プラント前培
養液の醗酵条件は次のようである。600rpm(単一
の6枚羽根のタービン攪拌機、直径115Mfi) 、
4枚の邪魔板、ヘッド圧:03バール、通気量:1リツ
トルの空気/1リツトルの培地7分、温度:28℃、4
8時間。
セス・セレビシェ−GRP1B/ pJDB207/
GAPFL−HIR株の細胞を含む深冷凍結アンプルか
ら多数の寒天斜面に接種を行う。1個以上の寒天斜面を
28〜30℃で3〜5日間培養する。1つの寒天斜面の
内容物を、邪魔板がなく、前培養培地100m lを収
容する単一の500m1三角フラスコに無菌的に接種す
る。フラスコを、振幅が50鶴で25orpmのロータ
リー・シエイカーで、培養温度28℃で振盪する。48
時間後に、これらのフラスコの内容物(−次面培養物)
2%(V/V)を、600m lの前培養培地を収容す
る2リツトルの三角フラスコに無菌的に接種する。これ
らのフラスコ(二次前培養物)を、28℃で、ロータリ
ー・シュイカ−上で12Orpmで振幅を50鳳1とし
て48時間振盪する。二次前培養物のフラスコ(2%v
/ v )の内容物を、30リツトルの前培養培地(
プラント前培養物)を収容する50リツトルのステンレ
ススチール製醗酵槽に無菌的に導入する。プラント前培
養液の醗酵条件は次のようである。600rpm(単一
の6枚羽根のタービン攪拌機、直径115Mfi) 、
4枚の邪魔板、ヘッド圧:03バール、通気量:1リツ
トルの空気/1リツトルの培地7分、温度:28℃、4
8時間。
寒天培地および前培養液は、寒天の有無を除けば同じで
ある。同じ前培養液を総ての前培養工程で用いた。前培
地の組成(g/l): イーストニトロゲンベース(Dirco) 8
.4L−アスパラギン・H2011,6 L−ヒスチジン 1.0グルコ
ース(別途に殺菌)2.0 寒天培地の組成: 前培地に1リツトル当たり20gの寒天を加えたもの。
ある。同じ前培養液を総ての前培養工程で用いた。前培
地の組成(g/l): イーストニトロゲンベース(Dirco) 8
.4L−アスパラギン・H2011,6 L−ヒスチジン 1.0グルコ
ース(別途に殺菌)2.0 寒天培地の組成: 前培地に1リツトル当たり20gの寒天を加えたもの。
(b ) (300リツトル大 )5%
(v/v 、 15リツトル)の培養したプラント前培
養液を300リツトルの無菌醗酵生産培地を収容する6
00リツトルの醗酵機に無菌的に導入する。300リツ
トル生産培地の醗酵条件は、次の通りである。
(v/v 、 15リツトル)の培養したプラント前培
養液を300リツトルの無菌醗酵生産培地を収容する6
00リツトルの醗酵機に無菌的に導入する。300リツ
トル生産培地の醗酵条件は、次の通りである。
450rpm(単一の6枚羽根撹拌機、直径230mm
)。
)。
4枚の邪魔板、ヘッド圧:0.3バール、通気il:0
〜9時間? 0.25リツトル空気/lリツトルの培地
7分、 。
〜9時間? 0.25リツトル空気/lリツトルの培地
7分、 。
9時間〜回収時:1リットル空気71リットルの培地7
分、温度28℃、時間24・〜4B時間、0口、。。=
15〜20、収量:15〜25ふg/l(試験法:HP
L Cおよびトロンビン試験)生産培地の組成(g/
l) ペプトン 5酵母エキス
10シエークロース
40(NH4)2SO46 MgSO4・IHto l
NaC1O,I KH,Po、 2C
a C1z ” 21120
0.013殺菌前のpH〜6.0 消泡剤:必要な場合にはUCON LB625゜≦3町
二二S把LLLL、Jl! −ルの量立 ′)゛の−゛
スル・p1直3.3を有する培養液(実施例30参照)
を17℃に冷却する。細胞を、Wt+5tfalia
SA 14スラツジ除去装置(400〜600リット
ル/時間)により分離する。濃いスラッジは廃棄する。
分、温度28℃、時間24・〜4B時間、0口、。。=
15〜20、収量:15〜25ふg/l(試験法:HP
L Cおよびトロンビン試験)生産培地の組成(g/
l) ペプトン 5酵母エキス
10シエークロース
40(NH4)2SO46 MgSO4・IHto l
NaC1O,I KH,Po、 2C
a C1z ” 21120
0.013殺菌前のpH〜6.0 消泡剤:必要な場合にはUCON LB625゜≦3町
二二S把LLLL、Jl! −ルの量立 ′)゛の−゛
スル・p1直3.3を有する培養液(実施例30参照)
を17℃に冷却する。細胞を、Wt+5tfalia
SA 14スラツジ除去装置(400〜600リット
ル/時間)により分離する。濃いスラッジは廃棄する。
僅か幌濁りを有する上澄液を、一連の5kanフイルタ
ーカートリツジ(第一:孔径5μm;第二:孔径1μm
:第三:孔径0.22μm)を通して濾過し、NaOH
でpH7,5にしてDf!AH陰イオン交換カラムに適
用する。カラムを酢酸ナトリウム(20mM、pH4,
5)で洗浄し、酢酸ナトリウム(20mM 、 pH1
3、l)で溶出する。溶液(15リツトル)をN a
OIIでpH7,5に調整して、循環蒸発装置で?li
して最終容積を1.8リツトルにする。1リツトルを5
ephadex G−25カラム(ベッド容積;8リ
ツ′トル、カラムは水で平衡にする)に充填する。デス
ルファトヒルジンを含む分画をIIPLcで同定する。
ーカートリツジ(第一:孔径5μm;第二:孔径1μm
:第三:孔径0.22μm)を通して濾過し、NaOH
でpH7,5にしてDf!AH陰イオン交換カラムに適
用する。カラムを酢酸ナトリウム(20mM、pH4,
5)で洗浄し、酢酸ナトリウム(20mM 、 pH1
3、l)で溶出する。溶液(15リツトル)をN a
OIIでpH7,5に調整して、循環蒸発装置で?li
して最終容積を1.8リツトルにする。1リツトルを5
ephadex G−25カラム(ベッド容積;8リ
ツ′トル、カラムは水で平衡にする)に充填する。デス
ルファトヒルジンを含む分画をIIPLcで同定する。
デスルファトヒルジン分画(2,5リツトル)を高真空
のローターパップで濃縮して最終容積を200mlとし
て、凍結乾燥する。
のローターパップで濃縮して最終容積を200mlとし
て、凍結乾燥する。
2gの原料を5Qmlの水に溶解し、N a OHでp
H7,5に調整し、Q 5epharose迅速硫下カ
ラム(ベッド容積:200m1)に適用する。カラムを
ギ酸アンモニウム(100mM、 pH3,9)で洗浄
する。
H7,5に調整し、Q 5epharose迅速硫下カ
ラム(ベッド容積:200m1)に適用する。カラムを
ギ酸アンモニウム(100mM、 pH3,9)で洗浄
する。
25m1の画分を採取してII P L Cによってデ
スルファトヒルジンを試験する。デスルファトヒルジン
を含む分画(1〜65)をまとめて(125m l >
高真空のロータパップで最終容積を10m1’まで濃
縮する。濃縮した溶液を5ephadex G−25
カラム(Amicon %カラムを水で平衡にしである
)に適用し、そして脱塩する。得られる透明な溶液(2
5ml)を凍結乾燥する。精製する固形物は、純粋なデ
スルファトヒルジンから成る。
スルファトヒルジンを試験する。デスルファトヒルジン
を含む分画(1〜65)をまとめて(125m l >
高真空のロータパップで最終容積を10m1’まで濃
縮する。濃縮した溶液を5ephadex G−25
カラム(Amicon %カラムを水で平衡にしである
)に適用し、そして脱塩する。得られる透明な溶液(2
5ml)を凍結乾燥する。精製する固形物は、純粋なデ
スルファトヒルジンから成る。
ヒルに由来する70個のアミノ酸から成るポリペプチド
であるニグリンCをコードするヌクレオチド配列、は、
試験管内で合成されており、欧州時出願第146,78
5号明細書記載のようにE、coliでサブクローン化
され、発現されている。ニグリンコード配列のl”11
05シグナルペプチドをコードする配列への正確なイン
フレーム融合は、実施例15および16におけるヒルジ
″ンについて記載したのと全く同様に行われる。ベクタ
ー中のインサートの正確な方向を有する単一クローンを
、pJDB207/PII05−EGLと称する。サツ
カロミセス・セレビシェ−GRF1B株を、通常の方法
で形質転換する。
であるニグリンCをコードするヌクレオチド配列、は、
試験管内で合成されており、欧州時出願第146,78
5号明細書記載のようにE、coliでサブクローン化
され、発現されている。ニグリンコード配列のl”11
05シグナルペプチドをコードする配列への正確なイン
フレーム融合は、実施例15および16におけるヒルジ
″ンについて記載したのと全く同様に行われる。ベクタ
ー中のインサートの正確な方向を有する単一クローンを
、pJDB207/PII05−EGLと称する。サツ
カロミセス・セレビシェ−GRF1B株を、通常の方法
で形質転換する。
形質転換体を、実施例29に記載のように選択し、そし
て培養する。ニグリンCは、培養液中には、検出されな
い。
て培養する。ニグリンCは、培養液中には、検出されな
い。
第1図および第2図は、それぞれプラスミドpML30
0およびpML305の造成を示す模式図である。 第3図は、trpプロモーターを有するプラスミドpH
R1148の造成を示す。 第4図は、発現プラスミドpML310の造成を示す。 第°5図は、成熟デスルファトヒルジンをコードするD
NAフラグメントの単離を示す模式図である。 第6図は、デスルファトヒルジンを分泌する発現プラス
ミドの造成を模式的に示す。 第7図は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を行う発
現プラスミドの造成を模式的に示す。 第8図は、P1105プロモータ領域を含有す4則邸の
BamHI −Sal I制限フラグメントのDNA配
列を示す。 第9図は、GAPDH遺伝子のプロモーター領域のDN
A配列を示す。 第10図は、プラスミドpGAPDH−1!Lの造成を
示す模式図である。 第11図は、プラスミドpGAPDH−PLおよびpG
APDII −EL中に存在するGAPDIIプロモー
ターフラグメントの配列を示す。 第12図は、プラスミドpJDB207 / PH05
(Eco)−’i I Rの造成を示す。 第13図は、プラスミドpJDB207/ PAI’E
L−1+1R(UASI + UAS2) (7)造成
を示す。 第14図は、プラスミドpJDB207/ (GAPH
L −+11R) Dの造成を示す。 第15図は、プラスミドpJDB207/GAPFL
−1−HIRの造成を示す模式図である。 図面では、次の略号を用いる。 p:プロモーター、 SS:シグナル配列、t:タ
ーミネータ−、Lニリンカー。 特許出願人 チバーガイギ−7クチェンゲゼル シャフト(外1名) 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士 石 1) 敬 弁理士 福 本 積 弁理士 山 口 昭 之 弁理士西山雅也 ニMりJ プラスミドl1ML300の造成−】αtC
2プラスミドpML 305の造成JEEii′:41
発現プラスミドpML310の造成JiWHデスル
ファトヒルジンの分泌用発現プラヌミドpJDLl 2
07/PH05−tHltの造成pruIIturmB
−run c’c −540−530−520−510−500ATCCG
AAAC;T TGTATTCkACAAGAATGC
GCAAATATGTCA ACGTATTTG(i−
490−480−470−460−450AAGTCA
TCT丁 ATGTGCGCTG CTTτAATG
TT TTCTCATGTA AGIIICGACG
TC−440−430−420−410−400GTC
TATAAACTTCAAACGAA GGTんり端G
GT TCATAC;CGCT TTTTCTTTOT
−390−380−370−360−350CTGCA
CAAAG AAATATATAT TAMTTAGC
A CGTTTTCGCA TAGAACGCAA−3
40−330−’+20 −310 −3
00−240 −230 −220
−210 −200−140 −130
−120 −110 −100G
GATAAGGGT AAACATCTTT GAAT
T(iTcGA AATGAAACGT ATATAA
GCGC−90’−80−70−60−50 TGATGTTTTG C丁AAGTCCAG G
TTAGTATGG CTTCATCTCT CA
TGAGAATA−40−30−20−10−110 AGAACAACAA CAAATAGA(iCAAG
CAAATTCGAGATTACCA醇遠TTTAAA
T20 30 40
50 60マ CCCTTAGGCA MC丁AGCCGA TG
TCGAC−jαtC#GAPDI−I遺伝子のプロモ
ーター領域−630−620−610−600−590
TAATTAATAG TAGTGA丁TTT C
CTAACTTTA TTTACTCAAA AA
ATTAGCCT−580−570−560−550−
540丁TTAATTCTG CTGTAACCCG
TACATGCCAA AATAGGGGGCG
GGTTACACA−530−520−510−500
−490GAATATATAA CACTGA丁GG
T GCTTGGGTGA ACAGGTTTAT
TCCTCiGCATC−480−470−460
−450〜440CACTAAATAT AA丁GG
AGCCCGCTTTTTAAG CTGtl:CA
TCCA CiAAAMAAAA−430−620−
410−400−390GAA丁CCCAGCACCA
AAATAT TGTTTTCTTCACCAACC
ATCAGTTCATAGG−380−370−360
−350−340TCCATTCTCT TAC;CG
CAACT ACAGAGAACA GGCCACAA
ACAGGCA〜W−330−320−310−300
−290CGGGCACAACCTCAATGGAG
TGATGCAACCTGCCTGGAGT AAAT
GATGAC−280−270−260−250−24
0ACMGGCAAT TGACCCACGCATG
TATCTAT C丁CATTTTCT TACA
CCTTCT−:!30 −220
−210 −200 −190ATT
ACCTTCT GCTCTCTCTII; ATTT
GGAAAA AGCTGAAAAA AAAGGτT
(iAA−180−170−160−150−140A
CCAGTTCCC’rGAAATTATT CCCC
TACTTG ACTAATAAGT ATATAAA
GAC−130−120−110−1oo
−90ヨ1グ1クツB プラスミドpOAI’DII−
ELの造成a、 pGAPDH−Fl、 5’−CATCTOCTCA〜すA kAAQcττC
^^b、pGAPDH−El GTTτCGAATA AACACACATA kkT
kAAG−3”ニ1グjζJ2 プラスミドきIDn2
07/I’1105(Eco)−+111Lの造成−目 pjD82D7/PAPEL−H111111AS++
1aS21ニ1ijりJ41 プラスミドpJl)B2
07/(OAI’rEI、−It IIL)Dの造成p
H18201七駅L−11町υ 手続補正書(方式) 昭和62年3月ノJ日 特許庁長官 黒 1)明 雄 殿 1、事件の表示 昭和61年特許願第293558号 2、 発明の名称 トロンビン阻害剤の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 チバーガイギー アクチェンゲゼルシャフト (外1名)4、代理人 住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番lO号−5
、補正命令の日付 昭和62年2月24日(発送日) 6、補正の対象 (1) 願書の「出願人の代表者」の欄(2)委任状 (3)明細書 7、補正の内容 (1) (2) 別紙の通り (3)明細書の浄書(内容に変更なし)8、添付書類の
目録 (1)訂正願書 1通 (2) 委任状及び訳文 各1通(3
)浄書明細書 1通
0およびpML305の造成を示す模式図である。 第3図は、trpプロモーターを有するプラスミドpH
R1148の造成を示す。 第4図は、発現プラスミドpML310の造成を示す。 第°5図は、成熟デスルファトヒルジンをコードするD
NAフラグメントの単離を示す模式図である。 第6図は、デスルファトヒルジンを分泌する発現プラス
ミドの造成を模式的に示す。 第7図は、デスルファトヒルジンの細胞内発現を行う発
現プラスミドの造成を模式的に示す。 第8図は、P1105プロモータ領域を含有す4則邸の
BamHI −Sal I制限フラグメントのDNA配
列を示す。 第9図は、GAPDH遺伝子のプロモーター領域のDN
A配列を示す。 第10図は、プラスミドpGAPDH−1!Lの造成を
示す模式図である。 第11図は、プラスミドpGAPDH−PLおよびpG
APDII −EL中に存在するGAPDIIプロモー
ターフラグメントの配列を示す。 第12図は、プラスミドpJDB207 / PH05
(Eco)−’i I Rの造成を示す。 第13図は、プラスミドpJDB207/ PAI’E
L−1+1R(UASI + UAS2) (7)造成
を示す。 第14図は、プラスミドpJDB207/ (GAPH
L −+11R) Dの造成を示す。 第15図は、プラスミドpJDB207/GAPFL
−1−HIRの造成を示す模式図である。 図面では、次の略号を用いる。 p:プロモーター、 SS:シグナル配列、t:タ
ーミネータ−、Lニリンカー。 特許出願人 チバーガイギ−7クチェンゲゼル シャフト(外1名) 特許出願代理人 弁理士 青 木 朗 弁理士西舘和之 弁理士 石 1) 敬 弁理士 福 本 積 弁理士 山 口 昭 之 弁理士西山雅也 ニMりJ プラスミドl1ML300の造成−】αtC
2プラスミドpML 305の造成JEEii′:41
発現プラスミドpML310の造成JiWHデスル
ファトヒルジンの分泌用発現プラヌミドpJDLl 2
07/PH05−tHltの造成pruIIturmB
−run c’c −540−530−520−510−500ATCCG
AAAC;T TGTATTCkACAAGAATGC
GCAAATATGTCA ACGTATTTG(i−
490−480−470−460−450AAGTCA
TCT丁 ATGTGCGCTG CTTτAATG
TT TTCTCATGTA AGIIICGACG
TC−440−430−420−410−400GTC
TATAAACTTCAAACGAA GGTんり端G
GT TCATAC;CGCT TTTTCTTTOT
−390−380−370−360−350CTGCA
CAAAG AAATATATAT TAMTTAGC
A CGTTTTCGCA TAGAACGCAA−3
40−330−’+20 −310 −3
00−240 −230 −220
−210 −200−140 −130
−120 −110 −100G
GATAAGGGT AAACATCTTT GAAT
T(iTcGA AATGAAACGT ATATAA
GCGC−90’−80−70−60−50 TGATGTTTTG C丁AAGTCCAG G
TTAGTATGG CTTCATCTCT CA
TGAGAATA−40−30−20−10−110 AGAACAACAA CAAATAGA(iCAAG
CAAATTCGAGATTACCA醇遠TTTAAA
T20 30 40
50 60マ CCCTTAGGCA MC丁AGCCGA TG
TCGAC−jαtC#GAPDI−I遺伝子のプロモ
ーター領域−630−620−610−600−590
TAATTAATAG TAGTGA丁TTT C
CTAACTTTA TTTACTCAAA AA
ATTAGCCT−580−570−560−550−
540丁TTAATTCTG CTGTAACCCG
TACATGCCAA AATAGGGGGCG
GGTTACACA−530−520−510−500
−490GAATATATAA CACTGA丁GG
T GCTTGGGTGA ACAGGTTTAT
TCCTCiGCATC−480−470−460
−450〜440CACTAAATAT AA丁GG
AGCCCGCTTTTTAAG CTGtl:CA
TCCA CiAAAMAAAA−430−620−
410−400−390GAA丁CCCAGCACCA
AAATAT TGTTTTCTTCACCAACC
ATCAGTTCATAGG−380−370−360
−350−340TCCATTCTCT TAC;CG
CAACT ACAGAGAACA GGCCACAA
ACAGGCA〜W−330−320−310−300
−290CGGGCACAACCTCAATGGAG
TGATGCAACCTGCCTGGAGT AAAT
GATGAC−280−270−260−250−24
0ACMGGCAAT TGACCCACGCATG
TATCTAT C丁CATTTTCT TACA
CCTTCT−:!30 −220
−210 −200 −190ATT
ACCTTCT GCTCTCTCTII; ATTT
GGAAAA AGCTGAAAAA AAAGGτT
(iAA−180−170−160−150−140A
CCAGTTCCC’rGAAATTATT CCCC
TACTTG ACTAATAAGT ATATAAA
GAC−130−120−110−1oo
−90ヨ1グ1クツB プラスミドpOAI’DII−
ELの造成a、 pGAPDH−Fl、 5’−CATCTOCTCA〜すA kAAQcττC
^^b、pGAPDH−El GTTτCGAATA AACACACATA kkT
kAAG−3”ニ1グjζJ2 プラスミドきIDn2
07/I’1105(Eco)−+111Lの造成−目 pjD82D7/PAPEL−H111111AS++
1aS21ニ1ijりJ41 プラスミドpJl)B2
07/(OAI’rEI、−It IIL)Dの造成p
H18201七駅L−11町υ 手続補正書(方式) 昭和62年3月ノJ日 特許庁長官 黒 1)明 雄 殿 1、事件の表示 昭和61年特許願第293558号 2、 発明の名称 トロンビン阻害剤の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 チバーガイギー アクチェンゲゼルシャフト (外1名)4、代理人 住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番lO号−5
、補正命令の日付 昭和62年2月24日(発送日) 6、補正の対象 (1) 願書の「出願人の代表者」の欄(2)委任状 (3)明細書 7、補正の内容 (1) (2) 別紙の通り (3)明細書の浄書(内容に変更なし)8、添付書類の
目録 (1)訂正願書 1通 (2) 委任状及び訳文 各1通(3
)浄書明細書 1通
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒルジン活性を有する蛋白質の製造方法であって、 真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジンをコ
ードする第二のDNA配列及びその上流にありそしてそ
れとリーディングフレームが合っているシグナルペプチ
ドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセグメ
ントであって上記発現制御配列の転写制御下にあるもの
と、真核生物の転写終止シグナルを含んで成るDNA配
列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAインサート
、並びに、 URA1、ARG4、LEU2、HIS3、TRP5お
よびTRP1から成る群から選択される選択遺伝子マー
カーを含んで成るハイブリッドベクターで形質転換され
た酵母細胞を適当な栄養条件下で培養し、 培地からヒルジン活性を有する蛋白質を分離して、所望
により細胞に結合しているヒルジン活性を有する別の蛋
白質を細胞内部から任意に分離し、所望により、ヒルジ
ン活性を有する生成蛋白質をヒルジン活性を有する異な
る蛋白質ペプチドに変換することを特徴とする方法。 2、発現制御配列が酵母宿主において用いるために酵母
のゲノムDNAに由来する、特許請求の範囲第1項記載
の方法。 3、発現制御配列が一つの酵母の遺伝子の上流活性化配
列、およびもう一つの酵母遺伝子の機能性TATAボッ
クスを含む下流プロモーターから成るハイブリッドプロ
モーターである、特許請求の範囲第1項記載の方法。 4、シグナルペプチドをコードするDNA配列が、酵母
インベルターゼ、a−因子、α−因子、フェロモンペプ
チダーゼ、「キラー・トキシン」及び抑制性酸性ホスフ
ァターゼ(PHO5)の各遺伝子のシグナル配列、並び
にアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus
awamori)のグルコアミラーゼシグナル配列か
ら成る群から選択される、特許請求の範囲1項記載に記
載方法。 5、PHO5プロモーターと、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードするDNA配列及びその上流にありそれとリ
ーディングフレームが合っているPHO5シグナル配列
から成るDNAセグメントであって前記PHO5プロモ
ーターの転写制御下にあるものと、PHO5遺伝子の3
′フランキング配列とをそれぞれが含有する1個以上の
DNAインサートを有するハイブリッドベクターで形質
転換した酵母を使用する、特許請求の範囲第1項記載の
方法。 6、GAPDHプロモーターと、成熟デスルファトヒル
ジンをコードするDNA配列及びその上流にありそれと
リーディングフレームが合っているPHO5シグナル配
列から成るDNAセグメントであって前記GAPDHプ
ロモーターの転写制御下にあるものと、PHO5遺伝子
の3′フランキング配列とをそれぞれが含有する1個以
上のDNAインサートを有するハイブリッドベクターで
形質転換した酵母を使用する、特許請求の範囲第1項記
載の方法。 7、酵母PHO5遺伝子の上流活性化部位及び酵母GA
PDH遺伝子のTATAボックスを含む下流プロモータ
ー要素を含んで成るハイブリッドプロモーターと、成熟
デスルファトヒルジンをコードするDNA配列及びその
上流にあってそれとリーディングフレームが合っている
PHO5シグナル配列を含んで成るDNAセグメントで
あって前記ハイブリッド・プロモーターの転写制御下に
あるものと、PHO5遺伝子の3′フランキング配列と
をそれぞれが含んで成る1個以上のDNAインサートを
有するハイブリッドベクターで形質転換した酵母を使用
する、特許請求の範囲第1項記載の方法。 8、PHO5プロモーターと、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードするDNA配列及びその上流にあってそれと
リーディングフレームが合っているインベルターゼ・シ
グナル配列を含んで成るDNAセグメントであって前記
PHO5プロモーターの転写制御下にあるものと、PH
O5遺伝子の3′フランキング配列とをそれぞれが含ん
で成る1個以上のDNAインサートを有するハイブリッ
ド・ベクターで形質転換した酵母を使用する、特許請求
の範囲第1項記載の方法。 9、次の式: 【遺伝子配列があります】 を有するデス−(Leu^6^4、Gln^6^5)−
デスルファトヒルジン変形体HV1を製造するための、
特許請求の範囲第1項記載の方法。 10、次の式: 【遺伝子配列があります】 を有するデス−(Gln^6^5)−デスルファトヒル
ジン変形体HV1を製造するための、特許請求の範囲第
1項記載の方法。 11、次の式: 【遺伝子配列があります】 を有するデスルファトヒルジン変形体HV1の製造のた
めの、特許請求の範囲第1項記載の方法。 12、次の式: 【遺伝子配列があります】 を有するデスルファトヒルジン変形体HV2の製造のた
めの、特許請求の範囲第1項記載の方法。 13、次の式: 【遺伝子配列があります】 を有するデスルファトヒルジン変形体PAの製造のため
の、特許請求の範囲第1項記載の方法。 14、デス−(Val)_2−デスルファトヒルジンの
製造のための特許請求の範囲第1項記載の方法。 15、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のDNA配列及びそのの上流にあり
そしてそれとリーディングフレームが合っているシグナ
ルペプチドをコードする第一のDNA配列から成るDN
Aセグメントであって上記発現制御配列の転写制御下に
あるものと、真核生物の転写終止シグナルを含有するD
NA配列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAイン
サート、並びにURA1、ARG4、LEU2、HIS
3、TRP5およびTRP1から成る群から選択される
選択遺伝子マーカーを含んで成る酵母ハイブリッドベク
ター。 16、真核性発現制御配列と、成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする第二のDNA配列及びそ上流にありそし
てそれとリーディングフレームが合っているシグナルペ
プチドをコードする第一のDNA配列から成るDNAセ
グメントであって上記発現制御配列の転写制御下にある
ものと、真核生物の転写終止シグナルを有するDNA配
列とをそれぞれが含有する1個以上のDNAインサート
、並びにURA1、ARG4、LEU2、HIS3、T
RP5およびTRP1から成る群から選択される選択的
遺伝子マーカーを含んで成るハイブリッドベクターで形
質転換した酵母細胞およびその変異株。 17、デス−(Gln^6^5)−デスルファトヒルジ
ン変形体HV1。
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---|---|---|---|
GB858530631A GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1985-12-12 | Thrombin inhibitors |
GB868613088A GB8613088D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-05-29 | Thrombin inhibitors |
GB8530631 | 1986-05-29 | ||
GB8613088 | 1986-05-29 |
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JP5282983A Division JPH0787791B2 (ja) | 1985-12-12 | 1993-11-12 | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター |
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JPH0650990B2 JPH0650990B2 (ja) | 1994-07-06 |
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JP5282983A Expired - Lifetime JPH0787791B2 (ja) | 1985-12-12 | 1993-11-12 | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター |
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---|---|---|---|
JP5282983A Expired - Lifetime JPH0787791B2 (ja) | 1985-12-12 | 1993-11-12 | デスルファトヒルジンをコードする酵母ハイブリドベクター |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0213377A (ja) * | 1988-04-26 | 1990-01-17 | Ciba Geigy Ag | デスルファトヒルジン化合物の製造方法 |
JP2022020610A (ja) * | 2020-07-20 | 2022-02-01 | フォーデイズ株式会社 | 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3583361D1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-08-08 | Ucp Gen Pharma Ag | Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren. |
MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
CA1341032C (en) * | 1987-01-23 | 2000-06-20 | John L. Krstenansky | Anticoagulant peptides |
US6005071A (en) * | 1987-01-23 | 1999-12-21 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
US5789540A (en) * | 1987-01-23 | 1998-08-04 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
GB8907110D0 (en) * | 1988-05-04 | 1989-05-10 | Ciba Geigy Ag | Improvements in the production of polypeptides |
US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
GB8826428D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Biopharm Ltd | Antithrombin |
FR2646437B1 (fr) * | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
ATE196927T1 (de) * | 1992-09-04 | 2000-10-15 | Novartis Ag | Verfahren zur herstellung von proteaseinhibitoren |
DE69616276T2 (de) | 1995-02-09 | 2002-12-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur produktion von proteinen |
US7795205B2 (en) | 2004-04-12 | 2010-09-14 | Canyon Pharmaceuticals, Inc. | Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
EP0138111B1 (en) * | 1983-10-03 | 1991-11-21 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms |
PT79518B (pt) * | 1983-11-21 | 1986-12-12 | Ciba Geigy Ag | 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr |
DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
CA1341414C (fr) * | 1984-03-27 | 2002-12-31 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
DE3583361D1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-08-08 | Ucp Gen Pharma Ag | Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren. |
FR2568891B1 (fr) * | 1984-08-09 | 1988-05-27 | Transgene Sa | Procede de preparation d'une souche, notamment de levure, transformee par un vecteur d'expression, qui peut etre cultivee sur un milieu complet sans pression de selection et souche ainsi obtenue |
DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
FR2593518B1 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
GB8521496D0 (en) * | 1985-08-29 | 1985-10-02 | Ciba Geigy Ag | Repressible yeast promoters |
MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
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1986
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1993
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0213377A (ja) * | 1988-04-26 | 1990-01-17 | Ciba Geigy Ag | デスルファトヒルジン化合物の製造方法 |
JP2022020610A (ja) * | 2020-07-20 | 2022-02-01 | フォーデイズ株式会社 | 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法 |
Also Published As
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