JPH06507075A - バシラス属中の遺伝子発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新しい遺伝子、ベクター並びに酵素の過剰産生に有用な、該遺伝子およ びベクターにより形質転換されたバシラス属に関する。特に、本発明は、酵素の 過剰産生を相乗的に誘発する、突然変異型または野生型のいずれかの未結合遺伝 子の特定の組合せに関する。

発明の背景 工業的に重要な多くの産生物が、バシラス属の構成員から産生される。これらの うちのいくつかは、プロテアーゼ、アミラーゼ、およびベーターグルカナーゼを 含む（ブリースト、１９７７、細菌学レビュー、４１　：　７１１−７５３　） 。これらの酵素のほとんどは、胞子形成後に、または定常期の徴候とともにバシ ラス属により産生される。

枯草菌１−１６８は、最も広く研究されているバシラス属の一員であり、長年の 学術的な研究の結果として十分に発達した遺伝子システムを有する。その結果、 細胞外酵素の発現に関する著しい量の知識が蓄えられ、これらの酵素の発現にお いて変更される枯草菌１−１６８の多くの突然変異体が存在する。そこには、細 胞外酵素の発現を調節するタンパク質をコードするいくつかの異なる既知の遺伝 子がある。この調節の正確な分子機構は完全には理解されていないが、これらの 遺伝子の産生物は、標的酵素の転写水準で直接的または間接的に相互作用するこ とが明確である（フエラリら、１９８８、Ｊ、バクチリオル、　１７０　：　２ ８９−２９５　；ヘナーら、１９８８、Ｊ、バクチリオル、　１７０　：　２９ Ｂ　−３００）。

プロモーターの周囲のＤＮＡ領域は、ある転写制御因子と活発に相互作用でき、 特定プロモーターの強度と能率を効果的に調節できる。この相互作用は、その特 定標的遺伝子の転写の刺激または抑制のいずれかとなる。結果として、これらの 転写制御因子をコードする遺伝子、または相互作用する染色体領域のいずれの突 然変異は、多かれ少なかれ標的遺伝子のｍＲＮＡを産生ずることが予期される。

これは次には細胞により合成された酵素の量が多いか少ないかということになる 。

遺伝子操作技術の出現により、枯草菌ｌ−１６８中の別の種から、または他のバ シラス種から遺伝子をクローンまたは発現することが可能となった。これらの研 究のほとんどでは、クローニングベクターとしての多重コピープラスミドを使用 している。クローンしたタンパク質の産生は、野生型宿主における産生を超えて 著しく増大せしめられたが、突然変異誘発により得られた産生菌株に報告された 酵素の産生よりは大きく下回った。これはまた、酵素が、枯草菌から誘導された 強い転写および翻訳要素の調節下にあったときの場合であった。明らかに、プラ スミドを複製する、多重コピーから得られた酵素の産生は、ある突然変異体、す なわち、いくつかの分泌酵素の過剰産生を誘発できると記載された５ａｃＵ　（ Ｈｙ）　、５ａｃＱ　（Ｈｙ）およびｈｐｒ（デドンダーら、微生物学１９７Ｂ 、Ｄ、シュレシンジャー（Ｅ　ｄ）　、５ｇ−８９頁、アメリカの微生物協会、 ワシントン、ＤＣ，バルバら、１９８３、ＦＥＭＳ微生物レターし、１７　：　 １ｌｌ−８５；フェラリ、未出版の報告）の存在には影響されなかった。これら の調節遺伝子は、影響された酵素のために構造遺伝子に結合されず、それゆえ、 それら遺伝子は、遺伝子が多重コピープラスミド中に存在する場合にも多大に刺 激活性を用いることを予期すべきである。

サブチリシン遺伝子転写と直接的または間接的に相互作用することが知られてい る異なる調節遺伝子には少なくとも６つある：　５ａｃＵＳｓａｃＱ、ｐｒｔＲ Ｓｈｐｒ、ｓｉｎおよびａｂｒＢ。

５ａｃＵ遺伝子のある突然変異体は、これら全ての既知の調節遺伝子の中で最も 多面作用的な効果を有する修飾ポリペプチドをコードする。例えば５ａｃＵ（Ｈ ｙ）突然変異体を担持する菌株は、高水準のグルコースの存在下で胞子形成でき 、非常に低い形質転換能率を有し、べん毛を欠如しており、いくつかの分泌酵素 の過剰産生の原因でもある（テンダーら、微生物学１９７６、上記）。

３つの異なるバシラス属からの５ａｃＱ遺伝子をクローニングして特徴付けた（ アモリーら、１９１１７、Ｊ、バクチリオル、１６９．２３４　；ヤンら、１９ ８６、Ｊ、バクチリオル、１６Ｂ　、１３３　；および富岡ら、１９８５、Ｊ、 バイオチクノル３．８５）。枯草菌から単離した遺伝子は、４６のアミノ酸から なるポリペプチドをコードする。５ａｃＱ遺伝子は、プロモーター中の突然変異 のために過剰発現されたとき、または多重コピープラスミド中に存在するときに 、アルカリ性プロテアーゼを含むある細胞外酵素の過剰産生を生じる（ヤンら、 １９８６、Ｊ、バクチリオル１８６　、１１３−１１９　）。

ｐｒｔＲ遺伝子は、６ｏのアミノ酸からなるポリペプチドをコードする。この遺 伝子が多重コピープラスミド中の枯草菌に存在するときに、タンパク質の産生が 増大する。しかしながら、５ａｃＱとは違って、プロテアーゼの産生を増大せし めるこの遺伝子のデータに対する染色体突然変異体はない（ヤンら、１９８７、 Ｊ、バクチリオル、　１６９．４３４−４３７）。

ｈｐｒ遺伝子は２０３のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、この遺伝子中 のある突然変異体はアルカリ性プロテアーゼの産生を刺激する。この遺伝子産生 物の損失を生じる突然変異体がサブチリシン遺伝子の転写を刺激することを確立 した（ペレゴおよびホック、１９８ｇ、Ｊ、バクチリオル１７０．２５８０−２ ５６７）。それゆえ、ｈｐｒ遺伝子の産生物は、おそらくサブチリシン遺伝子の リプレッサーであろう。また、５ｃｏＣ遺伝子とあるいはｃａｔＡ遺伝子はｈｐ ｒと同一であることも分かった。これ以後、ｈｐｒという表記はｈｐｒ、５ｃｏ ＣまたはｃａｔＡと呼ばれる３つの対立遺伝子のいずれかを称するのに用いる。

ｓｉｎ遺伝子は１１１のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする（ボアら、 １９８Ｂ、Ｊ、バクチリオル、１６８：８６０−８６９　）。遺伝子の挿入不活 性化は、高水準のアルカリ性プロテアーゼの産生を引き起こし、この遺伝子がア ルカリ性プロテアーゼの発現のリプレッサーとして作用もすることを示唆してい る。

最後に、ａｂｒＢ遺伝子は９７のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする。

またこの遺伝子に関して、これはアルカリ性プロテアーゼの転写のリプレッサー であり、この遺伝子の一時性の調節に重要な役割を有するという証拠がある。

発明の概要 驚くべきことに、これらの遺伝子の突然変異体の組合せを担持する菌株中に相乗 効果が達成できることを発見した。

そのような有機体は、発現される酵素がそのすべての調節領域に関してプロモー ターの制御下にある、組込みベクターまたはプラスミドにより形質転換される場 合、複製多重コピープラスミドまたは上述した調節突然変異遺伝子の１つのみの いずれかの使用から予期されるよりも多い酵素を発現する。

したがって、本発明は、 ａ）　酵素遺伝子配列、 ｂ）　該酵素遺伝子配列に操作可能に結合した酵素遺伝子の発現を制御する機能 的プロモーター遺伝子配列、および Ｃ）　各個々の突然変異遺伝子が酵素の発現の増大を誘発している、前記プロモ ーターの転写調節に必要な２つ以上の突然変異遺伝子であって、好ましくは、ｈ ｐｒ、５ａｃＱ、５ａｃＵ、ｓ　ｉｎ、ａｂｒＢｓまたはｐｒｔＲからなる群よ り選択される突然変異遺伝子、からなる、酵素を過剰産生できるバシラス属に関 する。

本発明はまた、新しい遺伝子からなるベクター、該ベクターにより形質転換され た細胞、および酵素の製造方法に第１図はｐＳＡＲ遺伝子の構成を示す。

第２図はｐＳＡＩＣＭ遺伝子の構成を示す。

第３図はｐｓＡＩｃＭ遺伝子の枯草菌染色体中への組込本出願人は、突然変異ま たは野生型遺伝子、ベクター、および酵素の過剰産生を誘発する能力が特有な遺 伝子とベクターで形質転換されたバシラス属の新しい組合せを証明した。上述し たような２つの突然変異遺伝子を、適切なプロモーターと遺伝子配列を担持する 菌株中に導入する。プロモーター配列と酵素の遺伝子配列を、組込みベクターを 用いてそのような宿主菌株中に導入する。そのようなベクターは、組込みにより 増幅されていても、されていなくてもよく、宿主ゲノムの一部としてしっかり保 持され、細胞内で染色体の必須の部分を複製する。組込みは、限定されるもので はないが、特定の構成に用いられるプロモーターと相同な領域を含む染色体の異 なる領域に生じ得る。そのような宿主は、元の酵素配列、または所望の酵素産生 に有害で、標準技術により欠失または効果のないように作られた他の遺伝子配列 を有するかもしれない。

ここに用いているような、「酵素遺伝子配列」は、一般的にバシラス属に非相同 また相同のいずれかである酵素の発現のためにコードするＤＮＡ配列を称する。

いくつかの酵素が知られており、限定されるものではないが、この教示の範囲に は、バシラス　レングス（ｌｅｎｔｕｓ）、バシラス　アミロリクエファシェン ス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（例えば、ＡＴＣＣ２３８４４）、 バシラス　リケニホルミス（１ｉ　ｃｈｅｎ　ｉ　ｆ　ｏ　ｒｍｉ　ｓ）（例え ば、ＡＴＣＣ２１４１５）　、バシラス　アル力ロフィラス（ａｌｃａｌｏｐｈ ｉｌｕｓ）（例えば、ＡＴＣＣ２１５２２）、枯草菌（例えば、ＡＴＣＣ６０５ １）およびバシラス　セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）（例えば、ＡＴＣＣ２１７６８ ）からの好ましい酵素を含む。また、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、エ ステラーゼ、エンドグリコシダーゼ、等をコードする酵素のようなバシラス中で 発現されることのできる全ての遺伝子を含む。好ましい酵素はサブチリシンであ る。他の好ましい酵素は、ストレプトミセス属種からのエンドグリコシダーゼＨ およびシュードモナス　メンドチノ（ｍｅｎｄｏｃ　１ｎｏ）ＡＴＣＣ５３５５ ２（ＭＤ、　、ロックビル、アメリカ型培養コレクションから得られる）からの リパーゼを含む。高いｐＨで最適に作用するサブチリシンのような酵素は、好ま しい酵素の中の１つである。また、それぞれの転写調節遺伝子により影響を受け る（すなわち、過剰産生ずる）プロモーターは、本発明に包含することを意図す るのも言うまでもない（例えば、ａｐｒＥおよびｎｐｒＥ）。酵素遺伝子配列は また、遺伝子配列中の１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失をコードする 突然変異ＤＮＡ配列を産生ずるように修飾された、自然に生じた酵素遺伝子配列 をコードするＤＮＡ配列を含む。適切な修飾方法が、例えば、１９８５年１月９ 日に発行された欧州特許公開第０１３０７５６号に開示されている。

サブチリシンは、一般的にタンパク質またはペプチドのペプチド結合を開裂する ように作用する細菌アルカリ性プロテアーゼである。ここで用いているような「 サブチリシン」は、自然発生サブチリシンまたは組換えサブチリシンを意味する 。一連の自然発生サブチリシンは、様々な細菌種により産生されたりしばしば分 泌されることが知られている。この系の構成物のアミノ酸配列は、完全には相同 ではない。しかしながら、この系のサブチリシンは、同一または類似の種類のタ ンパク質分解活性を示す。この綱のセリンプロテアーゼは、これをキモトリプシ ン関連網のセリンプロテアーゼと区別する触媒二連構造を定義する共通のアミノ 酸配列を共有する。サブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼ の両者は、アスパラギン酸塩、ヒスチジンおよびセリンからなる触媒二連構造を 有する。

サブチリシン関連プロテアーゼにおいて、アミノ基からカルボキシル基までを読 む、これらのアミノ酸の相対的な順番は、アスパラギン酸塩−ヒスチジン−セリ ンである。しかしながら、キモトリプシン関連プロテアーゼにおいて、相対的な 順番は、ヒスチジン−アスパラギン酸塩−七リンである。それゆえ、ここにおけ るサブチリシンはセリンプロテアーゼを称する。

「組換えサブチリシン」は、サブチリシンをコードするＤＮＡ配列が、自然発生 サブチリシンアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入 をコードする突然変異ＤＮＡ配列を産生ずるように修飾されているサブチリシン を称する。そのような修飾を行なう適切な方法は、欧州特許公開第０１３０７５ ８号とここに開示した方法を含む。例えば、アミノ酸残基５０．１２４および２ ２２でのメチオニンがそれぞれフェニルアラニン、イソロイシンおよびグルタミ ンで置換されたサブチリシン多重突然変異体は、欧州特許公開第０１３０７５８ 号に開示された残基２２２（Ｇｌｎ−２２２）でのグルタミンが置換された組換 えサブチリシンから誘導されたものと考えられる。それゆえ、多重突然変異体は 、Ｇｌｎ−２２２組換えサブチリシンにおいて、残基５０のメチオニンをフェニ ルアラニンで、残基１２４のチメオニンをイソロイシンで置換することにより産 生ずる。

ここに用いているように、「酵素遺伝子配列に操作可能に結合した酵素遺伝子の 発現を調節する機能プロモーター配列」は、バシラス属の暗号配列の転写と翻訳 を調節するプロモーター配列を称する。このプロモーター配列は、配列が発現の ために選択された微生物中で機能的であるように選択される。例えば、ラムダＰ （ルノー等、遺伝子１５．８１　［１９８１］　）並びにｔｒｐ（ラッセル等、 遺伝子２０．２３［１９８２］　）　！タハｔ　ａ　ｃ　（デボア等、ＰＮＡＳ 、ＵＳＡ８０゜２１　［１９８３］　）から形成されたプロモーター配列（リポ ソーム結合部位を含む）は、操作可能に暗号配列に結合せしめられ、大腸菌中に アルカリ性プロテアーゼを発現する。枯草菌１−１６８が発現宿主である場合、 その発現が記載した上流の調節遺伝子により影響を受ける、枯草菌アルカリ性プ ロテアーゼプロモーター（スタール等、Ｊ、バクチリオル１５１１．４１１−４ １８　［１９８４］　）、枯草菌のアルファアミラーゼプロモーター（シン等、 １９８３、核酸Ｒｅｓ、１１．２３７−２４９　）またはバクラス　アミロリヶ ファシェンス（ターキネン等、Ｊ、Ｂ　ｔ　ｏ　１．　Ｃｈ　ｅｍ、　２５ｇ　 、１００７−１０１３［１９８３］　）　、枯草菌からの中性プロテアーゼプロ モーター（シン等、Ｊ、バクチリオル、Ｊ、６０．１５−２１　［１９８４］　 ）または枯草菌もしくは他の関連バシラス属からの別のプロモーターが用いられ る。本発明の好ましいプロモーターは、ａｐｒＥプロモーターである。またはｎ ｐｒＥプロモーターも好ましい。

ここに用いられている、「転写調節遺伝子」は、その産生物が酵素プロモーター からの転写の水準に影響を与えるあらゆる遺伝子を称する。これらの遺伝子産生 物は、プロモーター水準（例えば、ＡｂｒＢ）で、または直接的または間接的に その上流か下流の領域（例えば、ｈｐ「、５ａｅＵ、５ａｅＱ、ＰｒｔＲ，５ｉ ｎ）と相互作用できる。

上述した定義は、広範囲の遺伝子産生物またはその欠如および特定のプロモータ ーの転写水準（例λば、多重コピー）を増大せしめる可能な突然変異体である。

この定義は、プロモーター領域中のある突然変異体に限定するものではないが、 良好な相互作用または調節遺伝子もしくは転写概構（例えば、転写を妨害する遺 伝子産生物の産生を減少ぜ１７めるＲＮＡポリポリーセ、突然変異体）での相互 作用の欠如により、転写中に増大する標的遺伝子のプロモーター領域の下流また は上流を含むことを意味する。これらの遺伝子とその突然変異体の影響はすでに 述べＣいる。これらの特定の組合せは、いずれかの単一の突然変異体のみから予 期ｉ−た結果と比較ｊまたときに相乗効果を示ｌ−２ている。

高水準で酵素を発現し、これらの調節突然変異体の制御下でより効果的に発現を 行なうために、プロモーターは、宿主バシラス属細胞のゲノム中に組み込まれる か、またはおそらく低いコピー数のプラスミドにより担持される必要がある。酵 素遺伝子を担持する高いコピー数の複製プラスミドは、調節突然変異体のいくつ かを生じる菌株中で不十分にしか許容されないように思われ、そのプラスミドは 失われるか、または非常に高い頻度で再配列せしめられる。

高水準で発現される酵素をコードする遺伝子を、宿主バシラス属細胞のゲノム中 に組み込むことが好ましい。

「発現ベクター」は、適切な宿主中のＤＮＡの発現に影響を与えられる適切な調 節配列に操作可能に結合せしめられたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構成物を称す る。そのような調節配列は、転写に影響するプロモーターまたはそのような転写 を調節する任意の操作配列、適切なリポソーム結合部位（ＲＢＳ）をコードする 配列および転写と翻訳の終了を調節する配列を含み得る。ベクターは、プラスミ ド１、ファージ粒子、または潜在的なゲノム挿入物であってもよい。一度適切な 宿主に形質転換されると、ベクターは複製され宿主遺伝子とは独立して機能する か、または遺伝子それ自身に組み込まれる。好まｌ２、いベクターはｐｓＡＩで ある。

本発明の目的とするバシラス属宿主細胞は、発現ベクターを機能上受容できるバ シラス属宿主である。好ましくは、それらの宿主が所望の酵素に有害な他の酵素 を分泌できなくするという欧州特許公開第０１３０７５６号に開示された方法に より産生される。サブチリシンを発現する好ましい宿主細胞は、酵素的に活性な 中性プロテアーゼとアルカリ性プロテアーゼ（未変性サブチリシン）が欠失した 枯草菌菌株ＢＧ２０３６である。菌株ＢＧ２０３６の構成は、欧州特許公開第０ １３０７５８号に詳細に記載されており、さらにヤン等（１９８４）　Ｊ、バク チリオル、　１６０１５−２１に記載されている。サブチリシンを発現する他の 宿主は、枯草菌ｌ−１６８の誘導体とそのようなシステムが作動するバクラス属 の他の構成物（すなわち、バクラス　アミロリクエファシェンスおよびバクラス 　リケニホルミス（欧州特許公開第０１３０７５８号））を含む。

ここに使用している「操作可能に結合」は、２つのＤＮＡ領域の間の関係を記載 したものであり、それらが互いに機能的に関連していることを意味する。例えば 、プロモーターが配列の転写を適切に調節する場合には、プロモーターはアルカ リ性プロテアーゼをコードする遺伝子配列に操作可能に結合されている。

以下の実施例は限定を意図するものではない。当業者は、別のプロモーターを選 択でき、他の突然変異体を発見または使用でき、バクラス属中に他の酵素を発現 できる。また、当業者は、一般的に得られる材料で本発明の教示を模写できるこ とが容易に分かる。したがって、ここに使用されている菌株で預けられているも のはない。

実　施　例 サブチリシン遺伝子のクローニング ウェルス等、１９８３、核酸Ｒｅ　ｓ　、　１１　：　７９１１−７９２５に記 載されているように、バクラス　アミロリクエファシェンスからサブチリシン遺 伝子を単離した。手短に言うと、バクラス　アミロリクエファシェンスからの部 分的５ａｕ３Ａ切断染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ切断ｐＢＳ４２に連結し、大腸菌 を形質転換するのに用いた。ｐＢＳ４２は、それ自体枯草菌によりコニされるよ うなｐＵＢｌｌｏからの複製の起源、大腸菌中でプラスミドの複製が行なえるｐ 　ＢＲ３２２からの複製の起源、および大腸菌と枯草菌の両者においてＣｍＲを 発現できる、スタフィロコ力ス　オーレウス（堀内およびウニイスプラム、１９ ８２）からの完全に特徴付けられたプラスミドである、ｐｃ１９４からのクロラ ムフェニルコル（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）アセチルトランスフェラー ゼ（ＣＡＴまたはＣｍＲ）からなるプラスミドベクターである。サブチリシンの 既知のアミノ酸配列から設計された合成りＮＡプローブを用いて、遺伝子のＤＮ Ａ暗号を担持するプラスミド（ｐ５４）を単離した。

単離したＤＮＡ断片は、枯草菌に形質転換されるときにサブチリシン産生をコー ドでき、アルカリ性プロテアーゼの公表されているアミノ酸配列に一致させるよ うにＤＮＡ配列を翻訳した（ウェルズ等、１９８３、核酸Ｒｅ　ｓ、　１１：　 ７９１１−７９２５）　。

遺伝子の３′末端の後に信号配列の８番目のコドンから２５０ｂｐまでのサブチ リシン構造遺伝子（全てバクラスアミロリクエファシエンスＤＮＡ）からなる、 ｐＳ４−５（ｐＳ４の誘導体）からの５ａｕ３Ａ　ＢａｍＨＩ断片を、プロモー ターと、枯草菌サブチリシン遺伝子の翻訳配列の最初の８コドンを担持する７５ ０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｓａｕ３Ａ断片に融合した（第１図）。バクラスＤＮＡ のみを含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片中に担持され、そのような再構成さ れた遺伝子を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切断したｐＢＳ４２中に挿入し、プラス ミドｐＳＡＲを産生した。このプラスミドが、枯草菌中にサブチリシンを産生で きることが分かった。

バクラス　アミロリクエファシェンスサブチリシン遺伝子に融合される枯草菌ａ ｐ　ｒＥプロモーターを担持する、ｐＳＡＲからのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片 を、ＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ切断ｐＪＨ１０１に連結した（フェラリ等、Ｊ、バ クチリオル、１５４巻、１５１３−１５１５）。枯草菌ではなく大腸菌中で複製 できる、生成プラスミドをｐｓＡｌと称した。枯草菌中に形質転換と続いてのク ロラムフェニルコルにより、このプラスミドをａｐｒＥプロモーターと相同な部 位で染色体中に組み込む。

１．６キロ塩基（Ｋｂ）Ｃｌａｌ断片中に含まれた、ｐＣ１９４からのＣｍＲ遺 伝子を、Ｃ１ａｌ切断ｐＢＲ３２２中にクローニングした。ＥｃｏＲＩとＨｉｎ ｄＩＩＩの切断により、このプラスミドは、ｐＢＲ３２２起源のいくつかの塩基 対を側腹に有するＣｍＲ抵抗遺伝子を放出する（以下参照）。

サブチリシン遺伝子を担持するｐＳＡＲまたはｐｓＡＩのいずれかからのＥｃｏ ＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＵＣ９の合成ポリリンカー領域のＥｃｏＲＩ−Ｂａ ｍＨ１部位にサブクローニングした。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの切断により 、このプラスミドは、一方の側腹に合成リンカ−の１７ｂｐを有するサブチリシ ン遺伝子を担持する２、２ｋｂ断片を放出する（第２図）。

これらの２つのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片をともに連結し、ＣｍＲを 選択する、枯草菌を形質転換するのに用いた。ＰＢＳＩ形質導入に示したように 、形質転換により、このプラスミドを染色体に組み込む（第３図）。枯草菌中の 最終的な構成は、ｐｃｉ９４からの１．８ｋｂと短いリンカ−領域によりともに 連結されたサブチリシン遺伝子からなる。１つのリンカ−は、ｐＵＣ９からの２ ０ｂｐからなり、他のものは、ＥｃｏＲＩとＣｌａｌ部位の間に含まれるｐＢＲ ３２２からの１７ｂｐからなる。

我々が関心を持っているプロテアーゼを主に産生ずる菌株を得るために、ストー ルとフェラリ（１９８４）　、Ｊ、バクチリオル、　１５８　：　４１１−４１ ８およびヤン等（１９８４）　、Ｊ。

バクチリオル、　１８０　：　１５−２１に記載されているように、はとんど全 でのバクラス属に存在する２つの主なプロテアーゼ（アルカリ性プロテアーゼと 中性プロテアーゼ）を欠失した。次いで上述したプラスミドを、ＣｍＲを選択す る形質転換によりＢＧ２０３６中に導入した。ｐＳＡＩに類似したこのプラスミ ドを、枯草菌サブチリシンプロモーターにより与えられた相同領域中で染色体（ 複製プラスミドはまったく検出できなかった）に組み込む（第３図）。適切な制 限酵素で切断した染色体ＤＮＡのサザンプロット分析とＰＢＳＩ遺伝子地図作成 により、組込みと適切なサイズの断片の存在を確認した。

過剰産生を行なうために、コンピテント細胞形質転換またはＰＢＳＩ形質導入の いずれかにより、分泌酵素の水準を増大せしめることが知られている染色体突然 変異を取り入れた。これら両者の技術は、枯草菌における遺伝子研究に通常用い られている。産生じた菌株は、バクラス　アミロリクエファシェンスサブチリシ ン遺伝子と染色体中に組み込まれるｐｃ１９４からのＣｍＲ遺伝子を担持する枯 草菌ｌ−１６８（カタログ番号１−Ａ１、バクラス属遺伝子貯蔵センター）の原 栄養胞子形成誘導体である。

Ｈｐｒ９７．５ｃｏＣＳＣａｔＡ菌株の構成標準枯草菌遺伝子技術を用いて、こ こに記載した全ての菌株を構成した。アナグネストボウロスおよびスピチーゼン （Ｊ、バクチリオル、８１　：　７４１−７４６．１９６１）により記載された 方法にしたがって、形質転換を行なった。ホッチ等（Ｊ、バクチルオル、９３　 ：　１９２５−１９３７．１９６７）により記載された方法にしたがって、バク テリオファージＰＢＳＩを用いて形質導入を行なった。形質転換により、組込み プラスミドｐＳＡＩを菌株ＢＧ２０９７　（ａｐｒＥおよびｎｐｒＥ遺伝子が欠 失した、公に得られる菌株）に導入し、菌株ＢＧ３００２を産生じた。ＢＧ３０ ０２がら調製したＤＮＡを用いて、クロラムフェニコル抵抗性に対してそれぞれ ５ｃｏｃ１、ｃａｔＡまたはｈｐｒ−９７突然変異を含む菌株ＩＰＣＣ７６９８ （バスチャーインスティテユート培養コレクション、パリ、フランスから得られ る）、ｌＡ１５１（バクラス属遺伝子貯蔵センター、コロンブス、オハイオ州か ら得られる）およびＨｐｒ９７　（Ｄｒ、Ｊ。

Ａ、ホッチ、スクリブスクリニックの研究所、ラジョラ、カリフォルニア州から 得られる）を形質転換した。生成したクロラムフェニコル抵抗菌株を、親菌株の 特性（ＳＣＯＣ％ｃａｔおよびｈｐｒ突然変異の存在による）となる過剰プロテ アーゼの検出のためにスキムミルクを含有する固体媒質上（トリプトース血液ア ガー塩基対、ＴＢＡＢ）にスコアした。ＰＢＳ−１溶解産物（上記）を、標準公 開技術（ホッチ等１９６７、上記）により、ｐＳＡＩ組込みプラスミドを担持す る５ｃｏＣ，ＣａｔＡおよびＨｐｒ菌株上に調製した。これらの溶解産物を用い て、菌株ＢＧ２０９７を形質導入した。これらの形質導入により、プラスミドｐ ＳＡＩにより染色体に組み込んだサブチリシン遺伝子をＢＧ２０９７に導入し、 またａｐｒＥ遺伝子（すなわち、ｐＳＡＩ）への連結で５ｃｏｃまたはｃａｔＡ またはｈｐｒ突然変異を移入した。約１０−２０％のクロラムフエニコル抵抗形 質導入物が、多量のプロテアーゼ産生物を示し、これらの菌株が実際に５ｃｏＣ またはｃａｔＡまたはｈｐｒ過剰産生表現型を得たことを示唆している。

形質導入物のいくつかを１．６％のスキムミルクを含有するプレート上でスクリ ーニングし、ＢＧ３００２と比較した。これらの型のプレート上に大きなかさを 産生できる形質導入物を選択し、菌株ＢＧ３００８、ＢＧ３００５およびＢＧ３ ００７を得た。突然変異体５ｃｏｃ１、ｃａｔＡまたはｈｐｒ９７がそれぞれ存 在する場合には、これらの菌株の遺伝子型は、ｈｐｒ遺伝子を除いて同質遺伝子 型（ｈ　ｉ　５ＡＳａｐ　ｒＥ、ｎｐ　ｒＥＳｐＳＡＩ　：　：　ＣｍＲ）であ る。普通ブイヨン媒質を用いて、この形質導入の代表物を振とうフラスコ中で試 験した場合、その代表物は、約１９−１７ｍｇ／Ｌのサブチリシン、または過剰 産生突然変異体を含まない菌株よりも５−１０倍多い量のサブチリシンを産生じ た。

５ａｃＵ（Ｈｙ）菌株の構成 ５ａｃＵ（Ｈｙ）菌株の特性の１つは、べん毛を産生じ、運動型となる能力が欠 如していることである。ＰＢＳ−１は運動型べん毛に付着しているので、５ａｃ Ｕ（Ｈｙ）菌株上でＰＢＳ−１作用溶解産物を調製することは不可能である。運 動型であり、そのプロテアーゼ過剰産生表現型を保持した自然発生した変異体の 単離により、この問題を回避した。運動型となる突然変異体の性質は知られてい ない。

運動型５ａｃＵ（Ｈｙ）菌株上で溶解産物を調製した。この溶解産物を用いて、 ｐｓＡＩプラスミドを含有するいずれかのＢＧ３００２　（Δａｐｒ、Δｎｐｒ 、ｈｉｓＡ）をヒスチジンプロトトロピー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）に形質導入 した。５ａｃＵ遺伝子とｈｉｓＡ遺伝子は形質導入により結合しているので、あ る程度の量の形質導入物が５ａｃＵ　（Ｈｙ）３２遺伝子を含有することが予期 された。

この突然変異体の存在はスキムミルクプレート上で確認した；約９０％の形質導 入物が過剰産生表現型を示した。普通ブイヨン媒質中で成長する場合、５ａｃＵ （ＨＹ）突然変異体を含有する代表菌株は３５−４５ｍｇ／Ｌを産生じた。５ｃ ｏＣまたはｃａｔＡ突然変異体を含有する菌株が５ａｃＵ（Ｈｙ）菌株上に調製 されたＰＢＳＩ溶解産物により形質導入されたときに、同一の一般工程を施した 。５ｃｏｃ（ＢＧ３００８）およびｃａ　ｔＡ　（ＢＧ３００５）突然変異体を 含有する菌株は首尾よ＜　ｓ　ａ　ｃＵ　（Ｈｙ）に形質導入できた。５ａｃＵ 　（Ｈｙ）３２および５ｃｏＣまたはＣａｔＡ突然変異体のいずれかの両者を含 有する菌株は、個々の突然変異体を含有する菌株のいずれよりも、スキムミルク プレート上で大きな透明帯を示した。これらの菌株は普通ブイヨン媒質中で約５ ５ｍｇ／Ｌを産生じた。

５ａｃＱ（Ｈｙ）菌株の構成 溶解産物を５ａｃＱ（ＨＹ）菌株上で調製した。この溶解産物を用いて、ある菌 株をスレオニンプロトトロピーに形質導入した。再度、ｔｈｒ遺伝子と５ａｃＱ （Ｈｙ）遺伝子は形質導入により結合しているので、ある程度の量の個体群が過 剰産生５ａｃＱ（Ｈｙ）遺伝子を含有することが予期された。同じ方法を用いて 、５ａｃＱ（Ｈｙ）突然変異体単体のみまたは５ｃｏＣまたはｃａｔＡ突然変異 体のいずれかの組合せを含有する菌株を構成した。

三重変異体の構成 ５ａｃＵ　（Ｈｙ）３２．５ａｃＱ（Ｈｙ）およびｓｃ。

ＣまたはｃａｔＡ突然変異体のいずれかを含有する菌株は、上述した方法の組合 せを使用することにより構成できた。

一般的に、ｃａｔＡ／５ｃｏＣ突然変異体は、プラスミドｐｓＡＩとともに１つ の工程で導入され、続いて５ａｃＱ（Ｈｙ）突然変異体の導入が行なわれ、最終 的に５ａｃＵ（Ｈｙ）突然変異体が菌株に導入された。

結　果　酵素水準振とう 菌　株　フラスコ’　（ｍｇ／Ｉ） ＢＧ３００２（野生型）　ｐｓＡＩ　０．５ＢＧ　３００４５ａｃＵ（Ｈｙ）、 ｐＳＡｌ　４０ｓａｃＵ　（Ｈｙ）　、ｐｓＡＩ　、ｐＢＳ７ＡＳ　３ＢＢＧ　 ３００５　ｃａｔＡ、ｐｓ＾１２ＢＧ　３００６　ｃａｔＡ、　５ａｃＵ（Ｈｙ ）、ｐＳＡＩ　５８ＢＧ　３００７　ｈｐｒ９７　、ｐｓＡｌ　１０１　媒質： 　５ｃｈａｅｆ’ｆｅｒの普通ブイヨン＋０．１％グルコース ＦＩＧ、　１ ◆ ＦＩＧ、　３ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／７５ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０７） Ｉ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素の過剰産生に使用するバシラス属であって、ａ）酵素構造遺伝子、 ｂ）プロモーターが操作可能に前記酵素構造遺伝子に結合した、機能的プロモー ター配列、およびｃ）個々の突然変異体が、突然変異転写調節遺伝子を欠如した 細胞により産生されるよりも高い水準で酵素の増大した産生を誘発する、前記プ ロモーターの転写調節に必要な２つ以上の突然変異調節遺伝子からなることを特 徴とするバシラス属。
2. ２．前記転写調節遺伝子が、ｈｐｒ、ｓａｃＱ、ｓａｃＵ、ｓｉｎ、ａｂｒＢお よびｐｒｔＲからなる群より選択され、選択された調節遺伝子の１つがｓａｃＱ またはｓａｃＵである場合、追加の転写調節遺伝子が、ｈｐｒ、ｓｉｎ、ａｂｒ Ｂ、およびｐｒｔＲからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載のバシラス属。
3. ３．前記産生された酵素がサブチリシンであることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載のバシラス属。
4. ４．前記産生された酵素がエンドグリコシダーゼＨまたはリパーゼであることを 特徴とする請求の範囲第１項記載のバシラス属。
5. ５．前記酵素の増大した産生が、前記転写調節遺伝子を過剰発現することにより 行なわれることを特徴とする請求の範囲第１項記載のバシラス属。
6. ６．前記ｈｐｒ対立遺伝子がｈｐｒ９７、ｓｃｏＣ１またはｃａｔＡ変異体であ ることを特徴とする請求の範囲第２項記載のバシラス属。
7. ７．前記ｓａｃＵ対立遺伝子がｓａｃＵ（Ｈｙ）３２変異体であることを特徴と する請求の範囲第２項記載のバシラス属。
8. ８．前記ｓａｃＱ対立遺伝子がｓａｃＱ（Ｈｙ）３６変異体であることを特徴と する請求の範囲第２項記載のバシラス属。
9. ９．前記酵素遺伝子が少なくとも第２の遺伝子の一部に融合せしめられているこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載のバシラス属。
10. １０．前記酵素の増大した産生が、ｓａｃＱおよびｐｒｔＲからなる群より選択 される前記転写調節遺伝子の多重コピーで前記バシラス属を構成することにより 行なわれることを特徴とする請求の範囲第２項記載のバシラス属。
11. １１．前記プロモーターがａｐｒＥまたはｎｐｒＥプロモーターであることを特 徴とする請求の範囲第１項記載のバシラス属。
12. １２．前記プロモーターがバシラス層プロモーターであることを特徴とする請求 の範囲第１項記載のバシラス属。
13. １３．枯草菌Ｉ−１６８から誘導されることを特徴とする請求の範囲第１項記載 のバシラス属。
14. １４．バシラス属中に酵素を過剰産生する方法であって、ａ）酵素構造遺伝子、 プロモーターが操作可能に前記酵素構造遺伝子に結合した、機能的プロモーター 配列、および個々の突然変異体が、突然変異転写調節遺伝子を欠如した細胞によ り産生されるよりも高い水準で酵素の増大した産生を誘発する、前記プロモータ ーの転写調節に必要な２つ以上の突然変異調節遺伝子からなるバシラス属を構成 し、 ｂ）前記酵素の発現のために適切な媒質中でバシラス属を成長せしめることを特 徴とする方法。
15. １５．前記プロモーターがａｐｒＥまたはｎｐｒＥプロモーターであることを特 徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．前記転写調節遺伝子が、ｈｐｒ、ｓａｃＱ、ｓａｃＵ、ｓｉｎ、ａｂｒＢ およびｐｒｔＲからなる群より選択され、選択された調節遺伝子の１つがｓａｃ ＱまたはｓａｃＵである場合、追加の転写調節遺伝子が、ｈｐｒ、ｓｉｎ、ａｂ ｒＢ、およびｐｒｔＲからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第 １４項記載の方法。
17. １７．前記酵素が、サブチリシン、エンドグルコシダーゼＨおよびリパーゼから なる群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。