JP2005521407A - バチルスにおけるタンパク質発現の増大 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は発現タンパク質を生成する能力を変化させるために遺伝子組換えした細胞を提供する。特に、本発明は、目的タンパク質の発現が増大したバチルス種などのグラム陽性細菌に関し、ここで1以上の染色体遺伝子が不活性化され、好ましくは1以上の染色体遺伝子がバチルス染色体から欠失される。いくつかの実施態様において、1以上の固有の染色体領域が対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失される。
遺伝子工学は工業用生物反応器、細胞工場として、及び食物発酵において用いる微生物の向上を可能としてきた。特に、バチルス種は多数の有用なタンパク質及び代謝産物を生成及び分泌する(Zukowski、“Production of commercially valuable products(商業的に有用な産物の生成)”、In:Doi and McGlouglin(編集)Biology of Bachilli:Applications to Industry,Butterworth−Heinemann,Stoneham.Mass第311−337頁[1992])。工業的に用いられる最も一般的なバチルス種はB.リケニフォルミス、B.アミロリケファシエンス及びB.ズブチリスである。これらはGRAS(通常、安全であると認識される)状態であるので、これらバチルス種株は食品及び医薬業界において利用されるタンパク質生成のもっともな候補である。重要な生成酵素はα−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、及びアルカリ(またはセリン)プロテアーゼを含む。しかしながら、バチルス宿主細胞中におけるタンパク質生成の理解の進展にも関わらず、これらタンパク質の発現を増加させるための方法に関する必要性が以前としてある。
本発明は発現タンパク質を生成する能力を変化させるために遺伝子組換えした細胞を提供する。特に、本発明は、目的タンパク質の発現が増大したバチルス種などのグラム陽性細菌に関し、ここで1以上の染色体遺伝子が不活性化され、好ましくは1以上の染色体遺伝子がバチルス染色体から欠失される。いくつかの実施態様において、1以上の固有の染色体領域が対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失される。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、バチルスにおける目的タンパク質の発現及び/または分泌を向上させる方法及び組成物を提供する。
本発明は発現タンパク質を生成する能力を変化させるために遺伝子組換えした細胞を提供する。特に、本発明は、目的タンパク質の発現が増大したバチルス種などのグラム陽性細菌に関し、ここで1以上の染色体遺伝子が不活性化され、または修飾される。好ましい実施態様において、1以上の染色体遺伝子がバチルス染色体から欠失される。いくつかの実施態様において、1以上の固有の染色体領域が対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失される。
ここで言及する全ての特許及び文献、並びに当該特許及び文献に開示される全ての配列はここに明示的に引用するものとする。別に定めない限り、ここで用いる全ての技術及び科学的用語は本発明が属する当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する(例えば、Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版、John Wiley and Sons,ニューヨーク[1994];及びHale and Marham、The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY[1991]を参照、これらはここで用いる多くの用語の当業者の一般的な辞書となる)。ここに記載の方法及び材料に類似または同等のいかなる方法及び材料も本発明を実施または試験するために用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。数値範囲はその範囲を定める数字を含むものとする。明細書及び請求の範囲で用いるように、文脈において明らかに示される場合を除いて、単数の記載は複数も含むものとする。従って、例えば“宿主細胞”への言及は複数の当該宿主細胞も含む。
本発明は発現タンパク質を生成する能力を変化させるために遺伝子組換えした細胞を提供する。特に、本発明は、目的タンパク質の発現が増大したバチルス種などのグラム陽性細菌に関し、ここで1以上の染色体遺伝子が不活性化され、好ましくは1以上の染色体遺伝子がバチルス染色体から欠失される。いくつかの実施態様において、1以上の固有の染色体領域が対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失される。実際、本発明は1または複数の遺伝子を欠失する方法、及び大量の染色体を欠失させる方法を提供する。好ましい実施態様において、当該欠失は目的タンパク質の生成向上などの利点を提供する。
上述の通り、本発明は1または複数の遺伝子欠失及び/または変異及び大量の染色体欠失に関する実施態様を含む。
上述の通り、1及び複数の遺伝子欠失に加えて、本発明は大量の染色体欠失も提供する。本発明のいくつかの好ましい実施態様において、固有染色体領域またはそれらの断片はバチルス宿主細胞から欠失され、変異バチルス株を生成する。いくつかの実施態様において、固有染色体領域はプロファージ領域、抗菌領域(例えば、抗生物質領域)、調節領域、複数連続シングル遺伝子領域及び/またはオペロン領域を含む。ここで言及する固有染色体領域を描写する座標はバチルス・ズブチリス株168染色体地図に従って特定される。数字は通常、存在する場合は、リボソーム結合部位の開始部位に関するものであり、またはコード領域の末端に関し、及び存在するであろうターミネーターは通常含まない。株168のバチルス・ズブチリスゲノムは公知であり(Kunst et al.、Nature 390:249−256[1997];及びHenner et al.、Microbiol.Rev.、44:57−82[1980]を参照)、及び1の4215kb染色体からなる。しかしながら、本発明は任意のバチルス株由来の類似配列も含む。特に好ましくは、その他のB.ズブチリス株、B.リケニフォルミス株及びB.アミロリケファシエンス株である。
1)PPSオペロン領域:
この領域はバチルス・ズブチリス168染色体の約1959410(ppsE)〜1997178bp(ppsA)で見られる。本発明を用いて、染色体の1960409bp〜1998026pに対応する、約38.6kb断片を欠失した。このオペロン領域は抗菌合成に関係し、プリパスタチン・シンテターゼをエンコードする;
2)PKSオペロン領域:
この領域はバチルス・ズブチリス168染色体の約1781110(pksA)〜1857712bp(pksR)で見られる。本発明を用いて、染色体の1781795bp〜1857985pに対応する、約76.2kb断片を欠失した。この領域はポリケチドシンテアーゼをエンコードし、抗菌合成に関係する(Scotti et al.、Gene、130:65−71[1993]);
3)yvfF−yveKオペロン領域:
この領域はバチルス・ズブチリス168染色体の約3513149(yvfF)〜3528184bp(yveK)で見られる。本発明を用いて、染色体の3513137bp〜3528896bpに対応する、約15.8kb断片を欠失した。この領域は推定多糖類をコードする(Dartois et al.、バチルスに関する第7回国際会議(1993)Institute Pasteur[1993]、56頁を参照)。この領域は以下の遺伝子を含む:yvfA−F、yveK−T及びslr。B.ズブチリス168染色体の約3529014〜3529603で見られるslr遺伝子領域は約589bpの断片を包含する。この領域はyvfF−yveKオペロンの調節領域である;
4)DHBオペロン領域:
この領域はバチルス・ズブチリス168染色体の約3279750(yukL)〜3293206bp(yuiH)で見られる。本発明を用いて、染色体の3279418bp〜3292920bpに対応する、約13.0kb断片を欠失した。この領域はcatecholic siderophone2,3−ジヒドロキシ安息香酸−グリシン−トレオニン三量体エステルbacilibactinの生合成テンプレートをエンコードする(May et al.、J.Biol.Chem.,276:7209−7217[2001]を参照)。この領域は以下の遺伝子を含む:yukL、yukM、dhbA−C、E及びF及びyuiI−H。
a)スキン領域について:
i)約2666663〜2693807の座標位置であって、yqcC〜yqaMを含む、及び
ii)約2658440〜2659688の座標位置であって、rapE〜phrEを含む;
b)PBSXプロファージ領域について:
i)約1320043〜1345263の座標位置であって、xkdA〜xkdXを含む、及び
ii)約1326662〜1345102の座標位置であって、xkdE〜xkdWを含む;
c)SPβ領域について:
i)約2149354〜2237029の座標位置であって、xkdA〜xkdXを含む;
d)DHB領域について:
i)約3282879〜3291353の座標位置であって、dhbF〜dhbAを含む;
e)yvfF−yveK領域について
i)約3516549〜3522333の座標位置であって、yvfB〜yveQを含み、
ii)約3513181〜3528915の座標位置であって、yvfF〜yveKを含み、及び
iii)約3521233〜3528205の座標位置であって、yveQ〜yveLを含む;
f)プロファージ1領域について:
i)約213926〜220015の座標位置であって、ybcO〜ybdEを含み、及び
ii)約214146〜220015の座標位置であって、ybcP〜ybdEを含む;
g)プロファージ2領域について:
i)約546867〜559005座標位置であって、rapI〜cspCを含む;及び
h)プロファージ4領域について:
i)約1263017〜675421座標位置であって、yjcM〜ydjJを含む。
断片は同定した固有染色体領域よりも少ない2、3のbpsのみからなることができるので、欠失に適した固有染色体領域の断片の数は多数ある。さらに、多くの同定された固有染色体領域は多数の遺伝子を包含する。当業者は特定の用途の使用のために固有染色体領域のどの断片を欠失させるのが適当かを容易に決定することができる。
1.PBSX領域を欠失するDNA構築体:[yjqB末端及びリボソーム結合部位(RBS)を含むyjpC全体を含む5’フランキング配列1318874−1319860bp]−マーカー遺伝子−[pitのターミネーター及び上流部分を含む3’フランキング配列1348691−1349656bp]。
実験
以下の実施例は特定の好ましい実施態様及び本発明の特徴を示し、さらに説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
実施例1
欠失株の作成
この実施例は“方法1”について説明し、図1にも示される。この方法では、バチルス株内に形質転換されるDNA構築体を運ぶpJM102プラスミドベクターを生成するために大腸菌を用いた(Perego、上述を参照)。欠失部位の5’及び3’末端にすぐ隣接する領域をPCR増幅した。PCRプライマーを約37塩基対長さになるように設計し、バチルス・ズブチリス染色体に相同な31塩基対及びプライマーの5’末端から6塩基対に位置する6塩基対の制限酵素認識部位を含むようにした。プライマーを当該構築体の上流及び下流末端の固有制限酵素認識部位及びクローニング使用のための2つの断片間のBamHI部位構築のため設計した。抗菌マーカーのためのプライマーは当該断片の両側末端にBamHI部位を含んだ。可能であれば、PCRプライマーは欠失固有染色体領域のプロモーターを除去するが、隣接領域の全てのターミネーターを残すように設計した。染色体配列、遺伝子決定、及びプロモーター及びターミネーター情報の主な供給源はKunst et al.、(1997)上述から得ており、また当業者に公知のSubtiListワールドワイドウェブサーバーからも入手可能である(例えば、Moszer et al.、上述を参照)。本発明を用いて多数の欠失を作った。本発明により作成した欠失からのプライマー配列リストを表1に示す。また、プライマー命名システムの説明に関して図2も参照されたい。
大腸菌をバイパスするためにPCR融合を用いるDNA構築体の作成
この実施例は“方法2”について説明し、また図3にも示される。プライマーが抗菌マーカーのプライマー配列に相補的な25bp“テイル”を用いて設計されること以外は、上流及び下流断片は方法1の通り増幅する。“テイル”とは、直接増幅される配列に相同でないが、他のDNA配列に相補的であるプライマーの5’末端上の塩基対としてここで定義する。同様に、抗菌剤を増幅するためのプライマーは断片プライマーに相補的な“テイル”を含む。任意の所定欠失について、欠失X−UFfus及び欠失X−URfusは互いに直接の相補体である。これは、DF−fusとDR−fusプライマーセットに関しても当てはまる。さらに、いくつかの実施態様において、これらのプライマーはプラスミドベクター作成で使用する方法1において用いたものに類似した制限酵素認識部位を含む(表3及び米国特許第5,023,171号を参照)。表3はPCR融合による欠失構築体の作成に有用なプライマーのリストを提供する。表4はPCR融合による欠失構築体の作成に有用な別のプライマーのリストを提供する。しかしながら、この表では、全ての欠失構築体はphleoRマーカーを含む。
実施例3
PCR断片の連結を用いるDNA構築体の作成及び大腸菌クローニングをバイパスするためのバチルス・ズブチリスの直接形質転換
この実施例では、PCR断片の連結を用いるDNA構築体を作成するための方法(“方法3”)及びバチルスの直接形質転換について説明する。例として、prpC、sigD及びtdh/kblの修飾を連結方法を示すために提供する。実際に、sigD及びtdh/kblを1の方法で構築し、prpCを別の方法により構築した。
バチルス・ズブチリス染色体のtdh/kbl領域に隣接した上流及び下流断片を、フランキングDNAの内部プライマーがII型の制限酵素認識部位を含むように設計した以外は方法1に記載した類似のPCRにより増幅した。loxP−スペクチノマイシン−loxPカセットのプライマーをフランキング及び相補的突出部と同じII型制限酵素認識部位を用いて設計した。左側面及び右側面の固有突出部は上流及び下流のフランキングDNA間の抗菌カセットの直接連結を可能にする。全てのDNA断片は適当な制限酵素により消化し、当該断片を製造メーカー取扱説明書を用いてQiagen Qiaquick PCR精製キットで精製した。この精製に続いて、BioRad P−6ゲルを含む1mLの回転カラム中で脱塩を行い、2mM Tris−HCl、pH7.5で釣り合いを取った。断片をSavant Speed Vac SC110システムを用いて124〜250ng/μLに濃縮した。0.8〜1μgの各断片の3つの断片連結を、16時間、14〜16℃で15〜25μL反応体積中で12U T4リガーゼ(ロシュ)を用いて行った。所望の連結生成物の合計収量は、アガロースゲル上の標準DNAラダー(ladder)との比較により評価して、反応当たり100ngより大きかった。当該連結混合物は形質転換反応のための精製を行わないで用いた。この構築体のためのプライマーは下記の表5に示す。
バチルスの直接形質転換のためのPCR増幅DNA断片の連結によりDNA分子を作成する別の実施例は遺伝子prpCの部分フレーム内欠失を含む。prpC遺伝子を含むバチルス・ズブチリス染色体DNAの3953bp断片をp95及びp96を用いてPCRにより増幅した。当該断片を固有制限酵素認識部位PflMI及びBstXIで切断した。これにより3つの断片、上流、下流及び中心断片を生じた。後者は欠失される断片であり、内部からprpC遺伝子に位置した170bpからなる。消化混合物をQiagen Qiaquick PCR精製キットを用いて精製し、続いてBioRad P−6ゲルを含む1mLの回転カラム中、脱塩し、2mMのTris−HCl、pH7.5で釣り合いを取った。2回目のPCR反応で、抗菌カセット、すなわちloxP−スペクチノマイシン−loxPをBstXI部位を含むプライマー及びPflMI部位を含む下流プライマーであって、両方がゲノムDNA断片の部位に相補的な切断部位を含むものを用いて増幅させた。当該断片をPflMI及びBstXIを用いて消化し、上述の染色体断片について説明した通り精製した。上流、抗菌カセット及び下流断片の3つの断片連結を上述のtdh/kblに関しての通り、行った。下記にさらに詳細を説明する通り、所望の連結生成物の収量は類似しており、連結生成物をxylRcomKコンピテントバチルス・ズブチリスの形質転換に関するさらなる処理を行うことなく用いた。
上述の欠失に加えて、pckAも修飾した。PCRプライマーのpckAUF、pckA−2Urfus、spc ffus、spc rfus、pckA Dffus及びpckA DRをPCR及びテンプレートとしてバチルス・ズブチリス168誘導体の染色体DNA及びpDG1726(Guerout−Fleury et al.、Gene 167(1−2):335−6[1995]を参照)を用いるPCR融合反応に関して用いた。プライマーを表8に示す。これらの欠失変異体を構築するのに使用する方法は上述の方法1と同じである。
2001年8月10日に出願され、ここに引用する米国特許出願番号第09/927,161号に記載されているように、部分遺伝子型xylRcomKを有する宿主株バチルス・ズブチリスの細胞を1%キシロースを含むLB培地中で2時間成長させることによりコンピテントにし、OD550を1とした。この培養物を6時間培養物から取り除いた。全ての培養物を37℃で、300rpmで振とうさせながら成長させた。0.3mLのアリコートを1:1の培養物と30%グリセロール混合物として丸底2mL管内に冷凍し、その後の使用のために液体窒素中で保存した。
上述の方法に加えて、トランスクリプトームDNAアレイ法を本発明の変異体を発達させるために用いた。まず、標的RNAを当業者に公知のグアニジン酸(guanidinium acid)フェノール抽出によりバチルス株から取り入れ(例えば、Farrell、RNA Methodologies、(第2版).Academic Press,サンディエゴ、81頁を参照)、及び時点をdeSaizieu et al.(deSaizieu et al.、J.Bacteriol.,182:4696−4703[2003])及びここに記載する方法から適合させた方法によりビオチン標識cDNA内に逆転写した。合計RNA(25mg)を37℃、100mL反応中で一晩中培養した:1×GIBCO 一本鎖(first−strand)緩衝液(50mM Tris−HCl pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2);10mM DTT;40mMランダムヘキサマー;0.3mMの各dCTP、dGTP及びdTTP;0.12mM dATP;0.3mM ビオチン−dATP(NEN0;2500単位 SuperScript II 逆転写酵素(ロシュ)。RNAを除去するために、当該反応を0.25M NaOHに加え、30分間、65℃で培養した。当該反応をHCl及び2.5M 酢酸アンモニウムを含むエタノール中で−20℃で沈殿させた核酸を用いて中和させた。ペレットを洗浄、空気乾燥し、水中で再懸濁させ、UV分光法により量を測った。反応収量は約20〜25mgビオチン標識cDNAであった。
実施例4
変異バチルス株を得るための宿主細胞形質転換
上述の方法1または2によりDNA構築体を作成すると、それを適当なバチルス・ズブチリス研究所株内に形質転換した(例えば、BG2036または、BG2097;任意のコンピテントバチルス直接宿主細胞は本発明の方法に使用できる)。当該細胞は0.5ppmのフレオマイシンまたは100ppmのスペクチノマイシンの選択培地上に必要に応じてプレートした(Ferrari and Miller、Gene Expression Systems:Using Nature for the Art of ExpressionのBacillus Expression:A Gram−Positive Model(バチルス発現:グラム陽性モデル)、65〜94頁[1999])。研究所株はバチルス・ズブチリス生成宿主株内に2回、またはBG3594及びそれからMDT98−113に一度形質転換した欠失を有する染色体DNAの供給源として用いた。形質転換体は1のコロニーに単離するためにストリーキングし、5mLのLBと適当な抗菌剤中で一晩中採取及び成長させた。染色体DNAを当業者に公知の通り単離した(例えば、Hardwood et al.、上述参照)。
実施例5
振とうフラスコ分析−プロテアーゼ活性測定
DNA構築体を安定にコンピテントバチルス・ズブチリス株内に統合すると、ズブチリシン活性を振とうフラスコ分析により測定し、当該活性を野生型レベルと比較した。分析は当業者に公知のズブチリシン生成に適した50mLの成長培地を含む250mlのバッフルフラスコ内で行った(Christianson et al.、Anal.Biochem.,223:119−129[1994];及びHsia et al.、Anal.Biochem.242:221−227[1996]を参照)。当該培地を50μLの8時間、5mL培養物と接種し、250rpmで振とうしながら37℃、40時間成長させた。そして、1mLのサンプルをプロテアーゼ活性分析のために17、24及び40時間の時点で取った。プロテアーゼ活性をモナコ自動分析器(Monarch Automatic Analyser)を用いて405nMで測定した。2つのサンプルを緩衝液中で1:11(3.131g/L)に希釈した。正確な機械較正を保証する対照として、1のサンプルを1:6(5.585g/L)、1:12(2.793g/L)及び1:18(1.862g/L)に希釈した。図7は種々の変異バチルス・ズブチリスクローンにおけるプロテアーゼ活性を示す。図8は、バチルス・ズブチリス野生型株(非変異)及び対応する変異欠失株(−sbo)及び(−slr)の振とうフラスコ培養物から測定した改善されたプロテアーゼ分泌を示すグラフを提供する。プロテアーゼ活性(g/L)を17、24及び40時間後に測定した。
Claims (88)
- バチルス由来の目的タンパク質の発現を増大させる方法であって、
a)目的タンパク質を生成できる変異バチルス株を得る工程であって、ここで前記変異バチルス株はsbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB、phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、pckA、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF及びrocDからなる群より選択される少なくとも1の不活性化染色体遺伝子を有する当該工程;及び
b)前記変異バチルス株を前記目的タンパク質が前記変異バチルス株により発現する条件下で成長させる工程であって、ここで前記目的タンパク質の発現は非変異バチルス宿主株の前記タンパク質の発現と比較して増大している当該工程
を含む、当該方法。 - 目的タンパク質が相同タンパク質及び異種タンパク質からなる群より選択される、請求項1の方法。
- 目的タンパク質がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される酵素である、請求項1の方法。
- 目的タンパク質がプロテアーゼである、請求項3の方法。
- 前記変異バチルス株が、sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB、phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、pckA、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF及びrocDからなる群より選択される1以上の染色体遺伝子を欠失することにより得られる、請求項1の方法。
- 請求項1の方法を用いて得られる変異バチルス株。
- sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB、phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、pckA、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF及びrocDからなる群より選択される1以上の遺伝子の染色体欠失を含む変異バチルス株。
- 前記変異株がB.ズブチリス株である、請求項7の変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株がプロテアーゼ生成株である、請求項7の変異バチルス株。
- 前記プロテアーゼがズブチリシンである、請求項9の変異バチルス株。
- 前記ズブチリシンがズブチリシン168、ズブチリシンBPN’、ズブチリシン・カールスバーグ、ズブチリシンDY、ズブチリシン147、ズブチリシン309及びこれらの変異体からなる群より選択される、請求項11の変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株がdegU、degQ、degS、scoC4、spollE及びoppAからなる群より選択される遺伝子の変異をさらに含む、請求項7の変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株がさらに目的異種タンパク質を含む、請求項7の変異バチルス株。
- sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB、phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、pckA、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF及びrocD、それらの遺伝子断片及びそれらの相同配列からなる群より選択される少なくとも1の遺伝子を含むDNA構築体。
- 前記少なくとも1の遺伝子が配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号37、配列番号25、配列番号21、配列番号50、配列番号29、配列番号23、配列番号27、配列番号19、配列番号31、配列番号48、配列番号46、配列番号35及び配列番号33からなる群より選択される少なくとも1の核酸配列を含む、請求項14のDNA構築体。
- 前記構築体が目的タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項14のDNA構築体。
- 請求項16のDNA構築体を含むプラスミド。
- 請求項17のプラスミドを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルス細胞及び大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項18の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がB.ズブチリスである、請求項19の宿主細胞。
- 前記DNA構築体が前記宿主細胞の染色体内に統合された、請求項18の宿主細胞。
- 前記少なくとも1の遺伝子が配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号30、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36及び配列番号34からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸配列をエンコードする、請求項14のDNA構築体。
- さらに選択マーカーを含み、ここで選択マーカーが前記遺伝子断片またはそれに相同な遺伝子配列の断片の両側に位置する、請求項14のDNA構築体。
- 入来配列を含むDNA構築体であって、前記入来配列は目的タンパク質をエンコードする核酸及び相同ボックスを含む両側に位置する選択マーカーを含み、相同ボックスはsbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB、phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、pckA、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF及びrocDからなる群より選択される少なくとも1の遺伝子のコード領域のすぐ隣に位置する配列に対して80〜100%配列同一性を有する核酸配列を含むDNA構築体。
- 前記遺伝子のコード配列に隣接する少なくとも1の核酸をさらに含む、請求項24のDNA構築体。
- 請求項25のDNA構築体を含むプラスミド。
- 請求項26のプラスミドを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルス細胞及び大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項27の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルス・ズブチリスである、請求項28の宿主細胞。
- 前記DNA構築体が宿主細胞染色体内に統合されている、請求項26の宿主細胞。
- 前記選択マーカーが前記宿主細胞染色体から切除されている、請求項30の宿主細胞。
- プロテアーゼ生成が増大した変異バチルス株を得る方法であって、
a)請求項14のDNA構築体を含むバチルス宿主細胞を形質転換する工程であって、前記DNA構築体中の目的タンパク質がプロテアーゼであり、前記DNA構築体が少なくとも1の遺伝子が不活性化されて変異バチルス株を生成する条件下でバチルス宿主細胞の染色体内に統合される工程;及び
b)増大したプロテアーゼ生成が得られる条件下で前記変異バチルス株を成長させる工程
を含む、当該方法。 - 前記プロテアーゼを回収する工程をさらに含む、請求項32の方法。
- 少なくとも1の不活性化遺伝子が前記変異バチルス株の染色体から欠失される、請求項32の方法。
- 請求項32の方法を用いて生成した変異バチルス株。
- 前記バチルス宿主株が、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ズブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.ブレビス、B.ステロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.プミルス、B.ロータス、B.クラウジイ、B.メガテリウム及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項33の方法。
- 前記バチルス宿主細胞がB.ズブチリスである、請求項36の方法。
- 変異バチルスにおけるプロテアーゼ発現を増大させる方法であって、
a)バチルス宿主細胞を請求項24のDNA構築体を用いて形質転換する工程:
b)前記DNA構築体と前記バチルス宿主細胞の染色体領域を相同組換えする工程であって、ここで前記バチルス宿主細胞染色体の少なくとも1の遺伝子が不活性化され、変異バチルス株を生成する工程;及び
c)プロテアーゼ発現に適した条件下で前記変異バチルス株を成長させる工程であって、ここで前記プロテアーゼの生成が工程a)の形質転換前のバチルス・ズブチリス宿主と比較して変異バチルス・ズブチリス株におけるほうが大きい工程
を含む、当該方法。 - 前記プロテアーゼがズブチリシンである、請求項38の方法。
- 前記プロテアーゼが組換えプロテアーゼである、請求項38の方法。
- 前記不活性化が少なくとも1の前記遺伝子の欠失によるものである、請求項38の方法。
- 前記不活性化が少なくとも1の前記遺伝子の挿入不活性化によるものである、請求項38の方法。
- 請求項38の方法を用いて得た変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株がsbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB、phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、pckA、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF及びrocDからなる群より選択される少なくとも1の不活性化遺伝子を含む、請求項43の変異バチルス株。
- 前記不活性化遺伝子が欠失により不活性化された、請求項44の変異バチルス株。
- degU、degS、degQ、scoC4、spollE及びoppAからなる群より選択される遺伝子における少なくとも1の変異をさらに含む、請求項44の変異バチルス株。
- 前記変異がdegU(Hy)32である、請求項46の変異バチルス株。
- 前記株が組換えプロテアーゼ生成株である、請求項44の変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株がB.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ズブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.ブレビス、B.ステロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.プミルス、B.ロータス、B.クラウジイ、B.メガテリウム及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項44の変異バチルス株。
- 1以上の固有染色体領域またはそれらの断片の欠失を含む変異バチルス株であって、
前記固有染色体領域が約0.5〜500kbを含み、及び前記変異バチルス株が前記変異及び非変異バチルス株を本質的に同じ成長条件下で成長させた場合、対応する非変異バチルス株と比較して目的タンパク質の発現レベルが増大している、
当該変異バチルス株。 - 前記変異バチルス株がB.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ズブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.ブレビス、B.ステロサーモフィラス、B.アルカロフィラス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.プミルス、B.ロータス、B.クラウジイ、B.メガテリウム及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項50の変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株が、B.ズブチリス、B.リケニフォルミス及びB.アミロリケファシエンスからなる群より選択される、請求項51の変異バチルス株。
- 前記変異バチルス株がB.ズブチリス株である、請求項52の変異バチルス株。
- 前記固有染色体領域がPBSX領域、スキン領域、プロファージ7領域、SPβ領域、プロファージ1領域、プロファージ2領域、プロファージ3領域、プロファージ4領域、プロファージ5領域、プロファージ6領域、PPS領域、PKS領域、YVFF−YVEK領域、DHB領域及びそれらの断片からなる群より選択される、請求項50の変異バチルス株。
- 2つの固有染色体領域またはそれらの断片が欠失している、請求項50の変異バチルス株。
- 前記目的タンパク質がプロテアーゼである、請求項50の変異バチルス株。
- 前記プロテアーゼがズブチリシンである、請求項56の変異バチルス株。
- 前記ズブチリシンがズブチリシン168、ズブチリシンBPN’、ズブチリシン・カールスバーグ、ズブチリシンDY、ズブチリシン147、及びズブチリシン309及びこれらの変異体からなる群より選択される、請求項57の変異バチルス株。
- 前記バチルス宿主が組換え株である、請求項50の変異バチルス株。
- さらに、degU、degQ、degS、sco4、spollE及びoppAからなる群より選択される遺伝子に少なくとも1の変異を含む、請求項50の変異バチルス株。
- PBSX領域、スキン領域、プロファージ7領域、SPβ領域、プロファージ1領域、プロファージ2領域、プロファージ3領域、プロファージ4領域、プロファージ5領域、プロファージ6領域、PPS領域、PKS領域、YVFF−YVEK領域、DHB領域及びそれらの断片からなる群より選択される固有染色体領域の欠失を含むプロテアーゼ生成バチルス株。
- 前記プロテアーゼがズブチリシンである、請求項61のプロテアーゼ生成バチルス株。
- 前記バチルスがB.ズブチリス株である、請求項62のプロテアーゼ生成バチルス株。
- 前記プロテアーゼが異種プロテアーゼである、請求項61のプロテアーゼ生成バチルス株。
- バチルス中の目的タンパク質の発現を増大させる方法であって、
a)選択マーカー及び不活性化染色体断片を含むDNA構築体をバチルス宿主株内に導入する工程であって、前記DNA構築体が前記バチルス宿主株の染色体内に導入され、前記バチルス宿主細胞の固有染色体領域またはそれらの断片の欠失を生じ、変異バチルス株を生成する工程;及び
b)前記変異バチルス株を適した条件下で成長させる工程であって、ここで目的タンパク質の発現が変異していないバチルス宿主細胞内の目的タンパク質の発現と比較して変異バチルス株内のほうが大きい工程
を含む、当該方法。 - 前記目的タンパク質を回収する工程をさらに含む、請求項65の方法。
- 前記選択マーカーを変異バチルス株から削除する工程をさらに含む、請求項65の方法。
- 前記固有染色体領域がPBSX、スキン、プロファージ7、SPβ、プロファージ1、プロファージ2、プロファージ3、プロファージ4、プロファージ5、プロファージ6、PPS、PKS、YVFF−YVEK、DHB及びそれらの断片からなる領域の群より選択される、請求項65の方法。
- 前記変異バチルス株が少なくとも2つの固有染色体領域の欠失を含む、請求項65の方法。
- 前記目的タンパク質が酵素である、請求項65の方法。
- 前記バチルス宿主株が、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ズブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.ブレビス、B.ステロサーモフィラス、B.クラウジイ、B.アルカロフィラス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.プミルス及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項65の方法。
- 請求項65の方法を用いて生成した変異バチルス株。
- バチルス株から目的タンパク質を得る方法であって、
a)選択マーカー及び不活性化染色体断片を含むDNA構築体を用いてバチルス宿主細胞を形質転換する工程であって、ここで前記DNA構築体がバチルス株染色体内に統合され、固有染色体領域またはそれらの断片の欠失を生じ、変異バチルス株を生じる工程、
b)目的タンパク質の発現が可能な適した条件下で変異バチルス株を培養する工程、及び
c)目的タンパク質を回収する工程
を含む、当該方法。 - 目的タンパク質が酵素である、請求項73の方法。
- バチルス宿主が目的タンパク質をエンコードする異種遺伝子を含む、請求項73の方法。
- 前記バチルス宿主細胞が、B.リケニフォルミス、B.レンタス、B.ズブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.ブレビス、B.ステロサーモフィラス、B.クラウジイ、B.アルカロフィラス、B.コアグランス、B.サーキュランス、B.プミルス及びB.チューリンゲンシスからなる群より選択される、請求項73の方法。
- 前記固有染色体領域がPBSX、スキン、プロファージ7、SPβ、プロファージ1、プロファージ2、プロファージ3、プロファージ4、プロファージ5、プロファージ6、PPS、PKS、YVFF−YVEK、DHB及びそれらの断片からなる領域の群より選択される、請求項73の方法。
- 前記変異バチルス株がさらに、degU、degQ、degS、sco4、spollE及びoppAからなる群より選択される遺伝子に少なくとも1の変異を含む、請求項77の方法。
- 目的タンパク質がプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼからなる群より選択される酵素である、請求項73の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼである、請求項79の方法。
- バチルス中で目的タンパク質の発現を増大させる方法であって、
a)少なくとも1のバチルス細胞から核酸を得る工程;
b)トランスクリプトームDNAアレイ分析を前記バチルス細胞由来の核酸について行い、少なくとも1の目的遺伝子を同定する工程;
c)少なくとも1の前記目的遺伝子を修飾してDNA構築体を生成する工程;
d)前記DNA構築体をバチルス宿主細胞内に導入して変異バチルス株を得る工程であって、ここで変異していないバチルス内での目的タンパク質発現と比較して前記目的タンパク質の発現が増大する条件下で前記変異バチルス株は目的タンパク質を生成できる当該工程
を含む、当該方法。 - 目的タンパク質がアミノ酸生合成経路及び生分解経路からなる群より選択される少なくとも1の生化学経路に関係する、請求項81の方法。
- 前記生分解経路が前記目的遺伝子の転写により無効にされる、請求項82の方法。
- バチルス内で目的タンパク質の発現を増大する方法であって、
a)少なくとも1のバチルス細胞から少なくとも1の目的遺伝子を含む核酸を得る工程;
b)前記核酸を断片化する工程;
c)前記断片を増幅して、少なくとも1の前記目的遺伝子を含む増幅断片プールを生成する工程;
d)前記増幅断片を連結してDNA構築体を生成する工程;
e)バチルス宿主細胞内に前記DNA構築体を直接形質転換して変異バチルス株を生成する工程;
f)目的タンパク質の発現が変異してないバチルス内での目的タンパク質の発現と比較して増大する条件下で変異バチルス株を培養する工程
を含む、当該方法。 - 前記変異バチルス株がprpC、sigD及びtdh/kblからなる群より選択される修飾遺伝子を含む、請求項84の方法。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号37、配列番号25、配列番号21、配列番号50、配列番号23、配列番号27、配列番号19、配列番号31、配列番号48、配列番号46、配列番号35及び配列番号33からなる群より選択される核酸配列に示される配列を含む単離核酸。
- アミノ酸をエンコードする単離核酸配列であって、
当該アミノ酸が配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36及び配列番号34からなる群より選択される、
当該単離核酸配列。 - アミノ酸配列が配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36及び配列番号34からなる群より選択される、単離アミノ酸配列。
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