JPH06503418A - 慢性下位脊椎痛および頚部痛の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 慢性下位を椎痛および頚部痛の診断法 発明の分野 本発明は、慢性を椎および頚部を椎痛の診断のための新規な方法に関する。

発明の背景 米国人口の８５％が、しばしば慢性のを椎痛のための診察をうけたがっている。

４０００万Å以上の人々が慢性を椎痛（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｂａｃｋ　ｐｔｉｎ　 ）　（または下位背部症状（ｌｏｗ　ｂＩｃｋ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）　）による 身体障害を訴えており、これらの人々の介護をするための医療費だけで４００億 ドルを超えているしアロノフ　ジー　エム（Ａｔｏｎｏ日、Ｇ。

バーブ（Ｕ＋ｂｘｎ　ａｎｄ　５ｃｈｖｘ＋！ｅｎｂｅ＋ｇ　）　、バルチモア （Ｂｔ目ｉｍｏ＋ｅ　）　（１９８５）　］。これには、数兆ドルと見積もられ る膨大な社会−経済的損失は、含めていない。１９８５年に２７０万人の人々が 総計１８９億ドルの社会安全身体障害保険（ｓｏｃ目１５ｅｃｕ＋ｉ１７　ｄｉ ｓｘｂｉｌＮ７１ｎｓｔ＋＋ｘｎｅｅ）をうけた［ソシアル　セキュリティー　 アトミニストレージョン（Ｓｏｃｉｘｌ　Ｓｅｃ＋ｕｉｔｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔ ＋ｘｔｉｏｎ）、（Ｗｘｓｈｉｎｇｌｏｎ　Ｄ、　Ｃ，）　、デパートメント　 オブ　ヘルスアンド　ヒユーマン　サービシーズ（Ｄｅｐｘ＋ｔｍｅｎｌ　ｏｆ Ｈｅｘｌｌｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅ＋ｗｉｃｅｓ　）　（１９８６）　］ 。

臨床的には、慢性病は、急性病とは反対に６ケ月かそれ以上ひき続く、継続的な 痛みである。痛みは、実際のもしくは潜在的な組織損傷に関連しているかまたは そのような損傷という言葉で称される不快な感覚や感情の体験として定義されて いる［インターナショナル　アソシエーション　フォー　ザ　スタディ−オブ　 ペイン（Ｉｎｔｅｒｎｓ１０＋１１１　Ａ＋ｓｏｃｉｇＮ＋ｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ 　５ｌａｄ７　ｏｆ　１ｉｎ　）、マースキー（Ｍｅｒｓｋｙ）により開催（１ ９７９）］。バスデバン（Ｗａｓυｄｅマ■）は、疼痛に様々な局面：ノシオセ プション（ｎｏｃｉｏｃｅｐｔｉｏｎ）　（疼痛の知覚、肉体的刺激）；　“痛 い′として刺激を判断すること；さらに苦しみを引き起こしているとして痛みを 評価すること、があることに注目している。［バスデバンら、“カランセリンブ ザ　ペイシャント　ウィズ　りロニック　ベインーーザ　ロール　オブ　ザ　フ ィシシャン”　（Ｃｏｍ＊５ｅｌｉＢ　ｌｈｅ　Ｐ＠ｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｃ ｈｒｏｎｉｃ　Ｐｌｉｎ−Ｔｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｌ　ｔｈｅ　Ｐ’Ｈｓ−ズ（に １ｉｖｅ「＾ｃｍｄｅ＋ａｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）　、ボストン（Ｂｅｓ ｔｏｎ）（１９８８）］。

現在の技術段階では、頚部（首）を椎（ｃｅｒｖｉｃｒｌ　（＋＋ｃｃｋ）　５ ｐｉｎｅ）と下位背部病（１！Ｉｆ　ｂｇｃｋｓｅｈｅ）および／または放射病 （目ｄｉ１１ｉＢ　ｐｔｉｎ）のための客観的で、統計学的に有意な検査法はな い。より詳しく言えば、頚部を椎および慢性背部症状（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｂｌｃ ｋ　ｓマｌｄｔｏｍｅ　）の有無を定量的に検出する、タンパク質に基づいた臨 床検査はなく、さらには慢性下位背部または頚部痛の進行や退行を定量またはは モニターしうる検査法はない。このような検査法があれば、患者、医師およびこ の問題の代価の負担を負っている社会に対して計り知れない価値のあるものとな るであろう。慢性を椎および頚部痛の客観的な検査法は、下記のことを考慮にい れるものである。

１、器官の原因に基づいた下位背部または頚部症状の有無を確かめる。理想的に は、本検査法は、本検査の定量的な面を利用して基準線を設けることができるよ うに初診時に行なわれるだろう。もし本検査によって器官の原因が存在しないと なれば、現在の技術的段階では、この症状の原因でないとするために必要とされ る、より高価な検査（たとえば、ＭＲＩ　＝　５ＳＣＴスキヤン、を髄造影（ｍ ７ｅｌｏｇロｍｓ）椎間板写真（ｄｉｓｃｏｇ目ｍｓ）　、骨スキャン、を髄電 気記録（ｅｌｅｃｔ＋ｏｍ７ｅｌｏＨＩｉｓ　）および診察を引き続き行なう必 要はないであろう。器官の原因があると決定されれば、成功への高い期待をもっ てきまりきった仕事が続行されつる。この時点で、もし慢性背部症状のためのき まりきった検査が陰性であって、ここに述べたタンパク質に基づいた分析が背部 症状に対して陽性であるばあいには、担当医が正しい器官の原因を追及しつづけ るのが正当であろう。

２、治療の進行と有効性をモニターする。すべての慢性背部症状は、最初は保存 的に治療される。この治療の効果は、分析可能であり、１崖またはそれ以上の、 以下の判断を行なうことができる：改善された検査結果で継続し；より悪くなっ た検査結果で中断し；より悪くなった検査結果で治療を変更し；検査結果がより 悪くなっていたかまたは何ら向上が見られなかったばあいにのみ、初めてまたは 改めて、外科的手術を勧める。このように、客観的な生化学的検査は、保存的な 患者の処理の能率を・向上させ、不必要な外科手術をすべて排除するであろう。

ここに開示される検査法が、タンパク質分析により必要が示されたばあいのみに 、外科手術の必要が示される評価の基準になるであろうことは予測できることで ある。

３、医療による改善の上限点を確認する。治療の進行のあいだに定期的に検査を 行なうことにより、検査の定量的性質から医師は、背部痛および／または放射痛 さらに頚部を椎痛の程度を評価することができるようになり、医療を終えるべき 時期を確認する助けとなるであろう。

この時点で、治療およびリハビリテーションの努力を止めることができ、医師、 患者および雇用者は、安心して終日労働、制限つき労働に復帰すること、請求額 を支払うこと、退職などを勧めることができる。医療効果が向上する一方、医療 費は低減されよう。

４、頚部痛、背部痛および／または放射痛の痛みから身体障害を患っている患者 と頚部痛、背部痛および／または放射痛を患っていない人々を見分ける。（放射 痛とは、片側もしくは両側の臀部および／または片方もしくは両方の四肢末端（ ｌｏｗｅｒ　ｅｘｌ＋ｅｅ＋１ｌｉｅｓ　）において知覚される痛みとして、定 義される。）これは、好適な社会計画において、客観的に文書により証明される 背部痛の条件のために経済的補助に対する資格を与える人々を認め、医学的に資 格のない人を確認して、そういう人を除外するのに関係官庁の助けとなるであろ う。

５、補償をうけるべき痛みの損傷や、頚部痛、背部痛および／または放射痛の２ 次的な苦痛を正当に評価することに関連して、法廷およびそのほかの人々を助け る。

慢性背部症状のための臨床検査は、視察、触診および操作を含む。臨床検査の大 部分は、患者の痛いという訴えやそのほかの反応に依存しており、それゆえに当 てにならないほど主観的である。現在の技術段階での客観的な臨床検査には、反 射の変化、けいれんおよび正しく行なわれる脚をまっすぐにしてもち上げる検査 （ｓｌｎｉｇｈｌ　１ｅｌｉ　ｒ１口ｉｎｇ　ｔｅｘｔｓ）が含まれ、これらの 検査は、下位背部症状の診断の助けになるかもしれず、ならないかもしれない。

さらにこれらの検査は、定量化できないし、下位背部症状の進行をモニターする こともできない。

サーモグラム、心理学的面接（ｐｓ７ｃｈｏｌｏｇｉｃｌｌ　１ｎｊｅｃｔｉｅ ｖ＋）　（たとえば、マックギル（ＭｃＧｉｌｌ）検査およびＭＭＰＩ検査）、 ポリグラフならびに器具による検査（１ｓｔ＋ｕｍｅｎｌａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ ｓ　）がまた、慢性を椎痛の診断を助けるのに用いられるかもしれない。しかし ながら、それらもまた主観的であって、裏書きする反応のタイプや度合いを患者 が報告することに依存するものであるので、これらのうちに完全に正確な方法は １つもない。

Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ″Ｓ１骨髄造影、椎間板写真、節電図および骨スキ ャンなどの、研究所での検査は、痛みの発生の可能性のある領域で、それが慢性 背部症状の臨床的発見に関連するに違いない領域の有無を輪郭づけることができ る。これらの検査は、断じて下位背部症状それ自身の有無を検出するものでも、 いずれにしろ定量するものでもない。さらに、これらの検査に誤った陽性や誤っ た陰性結果がでることは、めずらしいことではない。これらの検査のすべてまた はいずれがが陰性と出てもなお、患者が痛みを訴え続けるがもしれないし、反対 にこれらの検査のすべてまたはいずれかが陽性と出ても患者は症状が出ないまま かもしれない。さらに、これらの検査のうちのいつくかは、患者を不必要な放射 線にさらすものである。血清が、ただ１つのタンパク質、すなわちアルブミンし か含まないと信じられていた、１９世紀中期以降、タンパク質、とくに血中タン パク質から診断の情報をつる能力は、急速に進歩してきている。

１８８７年までに、レウィス（ＬｅｖＮｈ）は、塩析沈殿によって、血清タンパ ク質がアルブミンとグロブリンに分離しうろことを実証した。アルブミンのグロ ブリンに対する比率（Ａ／Ｇ比）が、診断的な価値をもつものであることが明ら かにされ、これは今日でもなお利用されている。電気的分離、免疫的分析技術お よび酵素的分析の導入に伴って、診断価値を有する血漿タンパク質の数は、指数 的に増加してきている。特定の血中タンパク質の検査は、心筋梗塞後の心筋損傷 を決定する際にクレアチンフォスファターゼレベルをモニターするばあいのよう に１、計り知れないほど診断の助けになるということがわかｇｔｌ、Ａｃｘｄ、 ｓｃｉ、、　ＵＳＡ）、７６巻、４３３５〜４３３９頁（１９７９）］を組合わ せた２次元電気泳動［オーファカル　ケミストリー（１，８ｉｏ１．Ｃｅｔ）　 ２５０巻、４００７〜４０２１頁（１９７５）］を用いて、血漿タンパク質の分 離能（ｙｅｓ・１１目ｏｌ）および検出感度が向上したことによって、研究者ら は、ヒト血漿中で１０００を超えるタンパク質、またヒト脳を髄液中でおよそ３ ００個のタンパク質を調べることができるようになった。

アンダーソン（八ｍｄｅ＋ｓｏｗ）ら［？ｏｃ、　Ｎｔｌｌ、　Ａｃｔｄ、　Ｓ ｃｉ、。

ＵＳＡ、　７４巻、５４２１〜５４２５頁（１９７７）］は、２次元電気泳動に よって分離した血漿タンパク質のマツピングおよび同定をはじめた。この研究の 目的は、これらのタンパク質を遺伝的変異のスクリーニングに利用することであ った。１９８４年までに、彼らは彼らの電気泳動および染色のシステムによって 、目視できた６４６個の血清タンパク質のうちの３８個だけを同定することミッ ク　プレス（＾ｃｓｄｅｍｉｃ　Ｐ「ｅｓｓ）　、ニューヨーク（１９８４）］ 。

血清や組織中のタンパク質の、存在や量の増加を、種々の疾病に関連づけるのに 、２次元ゲル電気泳動が、用いられうろことが示唆されてきているしトレイシー （Ｔ＋１ｃりら、［トウー　ディメンジョナル　ゲル　エレクトロフォレシス： メッソズ　アンド　ポテンシャル　アプリケーションズ　イン　ザ　クリニカル 　ラボラトリ−Ｊ　（”Ｔｗｏ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　Ｇｅｔ　Ｅｌｅｃｌ ＋ｏｐｈｏ＋ｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｏｌｅｎｔ口ｌ＾ｐｐｌｉ ｅｘｌｉｏｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ１Ｃ１１ｎｉｃ　Ｌｘｂｏ＋号、２３５頁（ １９８３）］。また、疾病の段階ごとのタンパク質の「プロファイル（ｐｔｏｌ ｉｌｅ　）　Ｊの現像が、診断に有用であるかもしれないということも知られて きている［トレーシーら、前出の２４２頁］。

しかしながら、２次元電気泳動法によってえられた分離能の向上や、近年開発さ れた染色法をもってえられる高い検出感度の結果として、この方法論が広く臨床 に応用されるようにはまだなっていない。このように、一般にそしてとくに慢性 を椎痛においては、２次元ゲル分析を用いた疾病の段階の診断は、新しいもので あって、報告された方法はただ１つあるにすぎない。この方法とは、脳を髄液の ２次元ゲルタンパク質分析を用いて、クロイッフヱルドヤコブ病をほかの疾呆の 原因から区別するものである［バーリントン（ＨＩｒｒｉｎｇｌｏｎ）ら、米国 特許第４８９２８１４号）。

はまた、パーキンソン病と***病とに関連したいくつかのタンパク質を見出だし たが、これは診断的な価値があるかもしれないが、ないかもしれない。血漿［ア ンダーソンら、１９８４、前出］と、脳を髄液［ゴールドマン（Ｇｏｌｄｍｓｎ 　）ら、クリニカル　ケミストリー２６巻、１３１７〜１３２２頁（１９８０） ］の２次元電気泳動によってマツピングされ、同定されたいくつかのタンパク質 は、多形性であることが実証され、したがって、遺伝的および法的な応用を提供 するかもしれないが、特定の疾病の診断指標として信頼しうると証明されてはい ない。

前記の技術上の不充分さを克服するために、本発明者らは、慢性背部症状および 頚部を椎痛診断のための客観的で定量的な検査を開発した。該検査は、患者から の体液サンプル中の、あるタンパク質の濃度が、正常人のコントロールと比較し て増加または減少していることを分析するために、２次元電気泳動を利用するも のである。

発明の概要 本発明の目的は、慢性頚部または下位を椎痛のための客観的な診断検査を提供す ることである。

本発明のさらなる目的は、慢性下位を椎痛または頚部癌の重篤さを決定する方法 を提供することである。

また、さらなる本発明の目的は、慢性下位を椎痛または頚部癌の治療の方針のタ イプ（すなわち、保存的対外科的）や、有効性を決定する方法を提供することで ある。

前記の目的に達する過程で、本発明者らはまた、慢性を椎痛ど頚部癌に関連した タンパク質を、２次元ポリアクリルアミドゲル上の動きによって同定することも 行なっｔ−０かくして、そのように同定されたタンパク質と、それから誘導可能 な産物（たとえば、抗体）などもまた、本発明の一部をなす。当業者が認めるで あろうように、染色した２次元ゲル上のスポットは、１つまたはそれ以上、のタ ンパク質をあられしうる。

本発明の方法によって検出されうる多くのタンパク質は、濃度および／または移 動のパターンにおいて変化することが、見い出された。この種の研究のうえで期 待されるとおり、あるタンパク質のスポットは、統計的な分析に供されたばあい にほかのタンパク質よりも高い診断的価値を有するものであることが、見い出さ れた。

本発明の最初の研究によれば、慢性下位を椎痛は、慢性を椎痛を患っている疑い のある患者において、４４個のタンパク質のレベルが正常人のコントロール（す なわち、慢性を椎痛の臨床的証拠がない正常人のボランティア）と比べて、増加 しているがまたは減少しているかを検出することによって正確に診断される。慢 性を椎痛患者においては、２９個のタンパク質が正常人コントロールに比べて少 なくとも３倍のレベルにまで統計的に有意に上昇することが見い出された。（統 計的に有意とは、ここではスチューデントを検定（Ｓｌａｄｅ＋ｔ　ｔ　１ｅｓ ｔ）またはログ（ｌｏｇ）スチューデントを検定によるｐ値が０゜０５以下であ ること、と定義される。）これらの２９個のタンパク質のうち、１３個は慢性を 椎痛患者のみに見出だされる。他方、慢性を椎痛患者では、１３個のタンパク質 が、コントロールに比べて少なくとも１／３にまで減少したレベルを呈する。こ れらのうち７個のタンパク質は、を椎痛症状の患者において、まったく消失して いる。さらなる研究（「第２の研究」）によって、を椎痛または頚部癌の有無を 予測しうる可能性が非常に高く、したがって、観察が容易であるだけでなく、診 断的価値において好ましいもう１つのスポットが見い出された。

かくのごとく、本発明の診断法では、慢性背部症状または頚部癌を診断すべきサ ンプル中の、前記タンパク質の増加もしくは減少または有無を同定する技術を用 いることができる。

もちろん、ゲル上の特定の位置にあるスポット上の１種または２種以上の限定さ れたタンパク質の有無は、電荷または分子量が変化したタンパク質の移動度が変 わることによるのかもしれない。また、通常の統計的手法によって、ずらりと並 んだ１つより多いタンパク質の多種類の分析を行なってもよい。

これらのタンパク質は、それらの相対分子量と等電点１（すなわち、２次元電気 泳動のゲル上のそれらの移動度）によって同定される。タンパク質の正確な同一 性は、いまだ不明である。しかしながら、慢性下位を椎痛および頚部癌は、炎症 に関連しているかもしれないので、慢性を椎痛において増加するように見えるタ ンパク質のうちいくつかは、組織の損傷や疾病に応じて増加すると知られている 血清タンパク質のクラスに属するかもしれない。

このクラスのタンパク質は、肺炎球菌肺炎の患者において誘導が観察されたこと により、最初に発見された［マツカーティー、エム（ＭｘｃＣｓ＋ｔ７．Ｍ、　 ）　、ヒストリカルパースペクティブ　オン　シー　リアクティブ　プロティン （”Ｈ口ｔｏｒｉｃｚｌ　？ｚｐｅｃｌｉｙｅ　ｏｎ　Ｃ−Ｒｔｘｃ目ｗｅ　Ｐ ｒｏｌｅｉｎ”　）クシュナ−（Ｋｕｓｈｎｅｒ　）ら（編集）シー　リアクテ ィブ　プロティン　アンド　ザ　プラズマ　プロテイアナルズ　オブ　ザ　ニュ ーヨーク　アカデミ−オブサイエンス（Ａｎｎｇｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　 Ｙｏｌｋ　Ａｃｇｄｅａ７　ｏＩ　５ｉｔｎｃｅＳ）　３８９巻、１〜１０頁（ １９８２）］、これらの最初の観察以来、数多くの研究所で急性期の反応で起こ る代謝的、生理的変化が研究されてきた。急性期の反応は、外傷、感染、非感染 性炎症状態および組織梗塞などの多くの異なるタイプの刺激によって呼び起こさ れうろことが見出だされた。前出のクシュナーら（編集）を参照されたい。これ らのタンパク質のほとんどが、肝臓において合成されることが知られているが、 それらの誘導の本質はまだわかっていない。合成の部位、すなわち肝葉に血管も 神経もあるので、誘導は血液で運ばれる物質によるかまたは神経因子による可能 性がある［マツクインティレ（Ｍｘｃｌｎ１７ｒｅ　）ら、［バイオシンセシス オブ　シー　リアクティブ　プロティン（“ＢｉｏＢ＊Ｉｈｃｓｉｓ　ｏｌ　Ｃ −Ｒｅｘｃｔｉｗｅ　？ｏｔｅｉｎ″）、クシュナーら（出版）、前出７６−８ ７頁］。

急性期の反応性タンパク質のいくつかは、マウスにおいて誘導され、２次元電気 泳動で、それらの相対的な位１１１０１６Ｂ　）　、５５巻、３３１〜３３９頁 （１９８６）］。

本出願人らは、本発明にかかわるタンパク質が、前に観察された急性期の反応性 タンパク質であるのか、またはこれらの反応性タンパク質のクラスの新しいメン バーであるのかはっきりわからなかった。しかしながら、出願人らは、補体Ｃ３ 、α−１アンチトリプシン、トランスフェリン、α−１酸性糖タンパク質および Ｃ−反応性タンパク質（よく特徴づけされた急性期の反応性タンパク質）を測定 するために、民間の研究所に各臨床サンプルの一部を送付した。標準的な分析に よると、これらのタンパク質の上昇は検出されなかった。しかしながら、この結 果は、急性期の反応性タンパク質における変化が生じていないことによりもむし ろ、分析の感度を反映しているのかもしれない。他方、これらのタンパク質のう ちいくつかは、損傷した末梢神経の再生のあいだに顕著に蓄積される（中枢神経 系への損傷の再生においてはより低い）ということがよく立証されているアポリ ポタンパク質であるとも仮定されうる。事実ウェスタンプロットを用いた予備試 験で、［ｄｐ１３．１．４．７１９が抗−、アポＥ血清に陽性であることが示さ れたりしかしながら、これは、交叉反応性のためかもしれない。

初めの研究での患者のうち３人は、慢性を椎痛のためのいかなる投薬をもうけて いなかったので、ここで認められるタンパク質の変動が、痛みの緩和のために患 者が用いていたかもしれないような薬物のためであるということは、なさそうで ある。

これらの３人の患者は、薬物を用いていた患者と類似の、タンパク質の変化を示 した。

また、タンパク質の変動が貯蔵によって生じた物質であるということもなさそう である。トレイシーらは、凍結および一２０℃での貯蔵によって変化する血漿タ ンパク質の存在を証明した［トレイシーら、クリニカル　ケミストリー２８巻、 ８９０〜８９９頁（１９８２）コ。

我々の１３０５．１３１８．１３２３および４６１４のスポットは、トレーシー らによってそのようなスポットの出現として示された領域にある。しかしながら 、患者と、年齢および性が合致したコントロールサンプルを同時に採取して、同 一の条件下で保存しているのだから、本研究で着目しているタンパク質は貯蔵に よって生じた物質ではまずない。

図面の説明 図１：銀で染色された血漿のゲル。本ゲルは、コントロールからの血漿１．４７ μｍを用いて作成された。円は、コントロールでは一般に見られないが、慢性を 椎痛の患者に存在するタンパク質を示す。−Ｍ−のうしろに付した数字は、表１ に示された指標となるタンパク質を示す。

残りの印を付したタンパク質は、表■および■に示すように、統計的に有意に、 ３またはそれ以上の要素によって増加または減少するものである。

図２：　［この］最初の研究で分析されたすべてのタンパク質の、コンピュータ ーで作成した図である。番号を付したタンパク質は、図１に示されたものと同じ である。

図３＝最初の研究で、慢性を椎痛と強く相関性を示したタンパク質を図示した、 散布図である。円の左側に付した数字は、１以上の度数を示し、その数の患者が 観察された。データの各グループの右に付した円と線は、そのグループに対する 平均と、平均の標準誤差（Ｓ、Ｅ。

Ｍ、）を示す。

図４＝最初の研究で、慢性を椎痛と、ある程度強く相関性を示したタンパク質を 図示した、散布図である。円の左側に付した数字は、１以上の度数を示し、その 数の患者が観察された。データの各グループの右に付した円と線は、そのグルー プに対する平均と、平均の標準誤差を示す。

図５：タンパク質１３１８の密度と下位背部の障害の度合いとの、患者間での比 較。障害の度合いは、いくつかの要素、たとえば、背と足の動きの限度の測定値 、膝蓋朧反射の異常および背部の外科手術歴などを用いて、評点された。

図６・タンパク質１３１６の密度と下位背部の障害の度合いとの、患者ごとの比 較。

図７：タンパク質１２０４の密度と下位背部の障害の度合いとの、患者ごとの比 較。

図８＝タンパク質１３０５の密度と下位背部の障害の度合いとの、患者ごとの比 較。

図９＝タンパク質３２０３の密度と下位背部の障害の魔合いとの、患者ごとの比 較。

図１０＝タンパク質３２１１の密度と下位背部の障害の度合いとの、患者ごとの 比較。

図１１：タンパク質１３１６および１３１８の密度の平均と、下位背部の障害の 度合いとの、患者ごとの比較。

図１２〜１４：第２番目の研究における、慢性下位を椎痛の３人の患者の２次元 電気泳動ゲルの像。１ｂｐ１３−１４．７１９のスポットを示す。

図１５〜１７：図１２〜Ｊ４のゲルと並べて行なった、３人のコントロールの２ 次元電気泳動ゲルの像。中あきの円は１．ｄｐ１３−１４．７］、９スポツトが 消失している領域を示す。

図１８〜２０：図１２〜１４の区切られた領域を拡大したもの。

図２１〜２３：図１５〜１７の区切られた領域を拡大したもの。

発明の詳細な説明 本発明には、正常および異常個体からのタンパク質サンプルを、２次元電気泳動 および／またはイムノアッセイに供する、慢性下位背部または頚部を椎痛の診断 法が含まれる。２次元ゲル電気泳動を用いたばあいに、両方のタイプの個体に共 通な非常に多数のタンパク質のスポットと、異常患者のグループで出現または消 失するスポットが、決定される。

初めに、調べられるべきタンパク質スポットの数は、正常人コントロールと慢性 を椎痛患者のあいだに統計的に有意な差が示されるもののみに減じられる。これ は、スポットの強度のデータのスチューデントを検定またはログスチューデント を検定を行なうことにより決定される。これらのテストのいずれかまたは両方で 、有意水準値０．０５で統計的に差異のあるそれらのタンパク質が、さらなる研 究のために選択される。

本発明の診断法を実施する際に用いるためのタンパク質のデータを明らかにする のに、多くのプロトコールを使用しうる。

本研究において用いられたプロトコールは、ここで例示したように、ヒユースト ンのセントリューク病院（３１、Ｌａｋｅ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔ１１　ｉｎ　Ｈｏ ｕｓｔｏｎ　）　、テキサスのインスチチューショナル　レビュー　ボアード（ ＩＲＢ）ならびに、患者と性および年齢が一致しており、同意書にそれぞれサイ ンしたボランティアにより示された。

叡者は、報告のあった負傷から２次的に慢性（持続して６ケ月またはそれ以上） 下位を椎痛を訴えていたもので、出願人の整形外科受診者のうちから無作為に選 ばれた。患者は、血液採取に先だって少なくとも１週間は、薬物を使用しないよ うに依頼された。コントロールの人々は、既往歴と身体検査によって決定された 結果、医学的に重大な問題がなかった。最初の研究は、１０人の患者と、性およ び年齢が一致した１０人のコントロールとからなる。２番目の研究においては、 第１分析は３２人の下位を椎患者と、３２人のコントロールからの６４の血漿サ ンプルからなり、第２の盲目分析は、１０人の下位を椎痛患者と７人のコントロ ールからの１７の血漿サンプルからなる。

被験者からの組織、血清または他の体液（好ましくは血液、さらに好ましくは血 漿）のサンプルの分解を防ぐために、サンプルは初めにドライアイス中で凍結さ れる。

電気泳動前のどの時点にでも、たとえばローリ−法によってタンパク質の量を測 定および分析するために、サンプルの一部を取出してよい。

２次元電気泳動のための第１段階のゲルは、通常約９Ｍ濃度の尿素と約２％の非 イオン性界面活性剤を含み、これらはいずれもタンパク質の分離を助けるもので ある。

非イオン性界面活性剤は、分離されたタンパク質が、それらの等電点て沈殿しな いようにするのを助ける。これらの試薬とその配合割合は、前記目的が成しとげ られるのであれば、ある程度変更可能である。両性電解質（たとえば２％のｐＨ ４〜８の両性電解質）も、ゲルの長さ全体にわたってｐＨ勾配を維持するために 望ましいが、ｐＨ勾配を維持する他の試薬に置き換えることができる。

第１段階のゲルのアクリルアミド濃度は、タンパク質がその等電点に移動しうる 程度であるべきである。第１段階のゲルは、いくつかの形状をとりうる；たとえ ば、等電点電気泳動チューブ中に、またはスラブ形状中に収容することができる 。好ましくは第１次元は、チューブゲルの形で行なうのがよい。

サンプルは通常、第１段階のために、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）か または約９Ｍ濃度の尿素中で可溶化することにより、調製される。還元剤の２− メルカプトエタノールもまた、ジスルフィド結合したサブユニットを分離させる ために、通常配合される。ｐＨ勾配を維持するための両性電解質、タンパク質の 電荷に影響を与えない非イオン性界面活性剤およびジスルフィド結合をこわすジ チオスレイトール（ＤＴＴ）もまた、配合されてもよい。他の試薬が添加されて もよく、または前記した機能を成しとげる他の試薬を代わりに用いてもよい。

たとえば、サンプルをゲル電気泳動に供する前に、サンプルはサンプル用緩衝液 （好ましくは０．３％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノールおよびトリス緩衝 液、ｐＨ８）中に入れてよく、溶解を助けるためにおよそ２分間、沸騰水浴（お よそ１００℃で）中に置いてもよい。それにさらされたこの温度と時間では、タ ンパク質の分解は引き起こさないとわかった；しかしながら、溶解がなされ、タ ンパク質の分解が起こらなければ、いずれも変更しつる。サンプル用緩衝液は、 タンパク質をときほぐし、ジスルフィド結合したサブユニットを分離し、ｐＨを 維持する。前記の機能を成しうるほかのサンプル用緩衝液や、タンパク質サンプ ルを可溶化する他の方法もまた用いうる。

つぎに、サンプルを氷上で冷却し、粘性を減するためにＤ　Ｎ　１ｓｔおよびＲ Ｎ　ｔｉｅで処理してもよい。そののちサンプルは、即座にゲルに流さないので あれば、液体チッ素中で急速に凍結し、ドライアイス中に詰めることができる。

これでサンプルを充分に保存できる。しかしながら、可溶化されたサンプルを、 −７０℃またはそれ以下に冷却するいずれの方法をもっても、サンプルは保存で きることがわかった。

ＳＤＳ存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動が、通常２次元の分離に用い られている。ＳＤＳはイオン性界面活性剤であって、タンパク質に強固に結合す る。ＳＩ）　Ｓは、クンバク質の本来の電荷性を取り除いて、タンパク質を棒状 の形状にまでときほぐす。トレーシーら、ジャーナル　オブ　クリニカル　ラボ ラトリ−オートメーション、前出を参照されたい。したがって、タンパク質をポ リアクリルアミドゲルマトリックス中の電場に供すると、電荷をもたず、５ＤＳ −タンパク質複合体が比較的に均一な形状であるために、ポリアクリルアミドが ふるいと（７て働いて、本質的には分子量によって分離が行なわれる。

第２段階のゲルは、好ましくはタンパク質の電荷を除去するために、ＳＤＳで平 衡化されており、分子量によってタンパク質を分離する際の助けとなるように、 第１段階のゲルよりも高いアクリルアミド濃度を含有する。

他の試薬を添加または置換できる。さらに、第２のゲルは、種々の形状にするこ とができる；しかしながら好ましくは、第２段階は、スラブゲルの形状で行なう 。

ゲル上のスポットは、クマシーブルーを用いた染色および銀染色を含んだ多種の 方法によって目視できる。それらは、相対的なタンパク質密崖に応じて手動的に 目視化しうるが、標準化の基準を用いた適切なカメラシステム（ナショナル　プ リュー　オブ　スタンダード（Ｎａｌｉｎｎｍｌ　Ｂ！ｌ「ｅａｕ　ｏｌ　５ｌ ｘｎｄｘ＋ｄ＠）　、ガイセルスブルグ、エムディ（Ｇａｉｔｈｅ＋５ｂｏＢ、 ［）から購入可能、で走査され、さらに相対的なタンパク質のスポットの染色強 度および密度を計測するコンピューターデンシトメーターを用いて分析されるこ とが好ましい。

慢性下位背部症状または慢性頚部癌を診断および／またはモニターするための免 疫学的検査を行なうための第１段階は、着目するタンパク質に対する抗体をうろ ことである。これをなしとげるための、当業者によく知られている方法が数多く ある。（包括的な研究所での方法にｏｒ７　Ｍａａｕｘｌ）　、コールド　スプ リング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ「ｉｎｇ　Ｈｘ＋ｂｏｒ　Ｌｓ ｂｏｔｍｔｏ＋ｙ　）　（１９８８）を参照されたい。これは本願でも引用され ている。）ウェスタンプロットやイムノアッセイのために充分な特異性を有した 抗体をえるためには、抗原が均質にまで精製されなければならないか、またはモ ノクローナル抗体をえるために抗原が用いられるべきである。本発明で着目して いるタンパク質は、第２次元口のポリアクリルアミドゲル上で、特徴のあるスポ ットとして見い出されるので、好ましくはそれぞれの抗原の最終の精製段階とし て、該ゲルが使用されうる。慢性下位を椎痛患者において、強度が増加または減 少しているスポットを切り出すことによって、純粋な抗原調製物をえることがで きる。

このゲル切片は、抗体を作らせる動物に注射することができる。代わりに、タン パク質のスポットを切り出して、注射のためのタンパク質を溶液でえるために、 そのゲルから電気的に溶出させてもよい。ゲルで分離したのち注射するためのタ ンパク質を処理するいま１つの技術は、タンパク質をニトロセルロースに電気的 に転写して、染色（たとえば、ボンソーＳ　（Ｐｏｎｃｅｘｏ　Ｓ）　）によっ て着目しているタンパク質の位置を決め、スポットを切り出し、注射のために細 片に切り分けることである。用いられる特定の方法は、着目しているタンパク質 に対する免疫反応を引き出す能力によってのみ限定される。

電気泳動のゲル上の分離よって精製された抗原を直接用いる代わりに、タンパク 質のスポットを溶出し、その技術分野でよく知られているいずれかの方法によっ て部分配列をえて、その配列を合成ペプチドを作成する（通常、固相法を用いた 自動装置を用いる）のに用いてもよい。その合成ペプチドは、もとのタンパク質 に結合する抗体を誘導するためには、６個以上のアミノ酸長さであるべきである 。精製された合成ペプチドは、それらからキャリアタンパク質と結合されて、こ の結合物が動物を免疫するために用いられる。

前記方法を用いてえらえた抗血清中のポリクローナル抗体はウェスタンプロット およびそのほかの免疫学的検査に使用することができる。しかしながら、さらに 、モノクロナール抗体をえるため、ハイブリドーマ技術を用いてもよく、これは 免疫化学的手法のためには最良の選択かもしれない。モノクロナール作製の方法 は、その技術分野においてよく知られており、コーラ−とミルシュタイン（にｏ ｈｌｅ＋　ｘｎｄ　Ｍｉｌｓｌｅｉｎ　）が１９７５年に最初に発表した。手短 かに言うと、抗体分泌細胞を、たとえばミエローマ細胞と融合して、ハイブリド ーマ細胞を作り、そのハイブリドーマ細胞をクローン化し、所望の抗体をえるた めに、適切な方法でスクリーニングを行なう。

本発明の診断法の１つには、慢性を椎痛または頚部癌の患者に存在するのに、正 常人コントロールに存在しないタンパク質の検出が含まれる。２次元ゲル上で染 色してこれらのタンパク質のスポットの位置を定めることに加えて、着目してい る特定のタンパク質に対して作成されたポリクローナルまたはモノクローナル抗 体を用いて、イムノブロッティングまたはウェスタンブロッティングを行なって タンパク質を検出してもよい。イムノブロッティングのプロトコールは、この技 術分野においてよく知られており、一般的には、ゲル電気泳動、転写、ブロッキ ング、抗体の添加および検出の工程が含まれる。サンプルの調製と、２次元ゲル 電気泳動は前記の通りである。電気泳動が終了すると、タンパク質は、ゲルから 、たとえば、ニトロセルロース、活性化（ジアゾ群）紙および活性化（陽性に電 荷した）ナイロンのようなマトリックスに転写される。相対的にバックグラウン ドが低いため、また価格を考慮にいれたうえで、ニトロセルロース膜が好ましい ；しかしながら、転写されたタンパク質が充分に結合すればどんな膜でも、用い ることができる。

好ましくは、タンパク質の転写は、電気的な溶出によってなしとげられるが、； 単純拡散またはバキューム−アシステツド　ソルベント　フロー（マＩｃｃ冒■ −■ｔｉｓｔｅｄ　ｔ。

１マＢＩ　ｌ１ｏｖ）もまた用いることができる。転写ののち、膜を分子量マー カーの位置を決定するため、任意に染色してもよい。

抗原を検出する前に、免疫試薬の非特異的吸着を防ぐために、膜をブロックしな ければならない。もっとも好ましくは、ブロッキング溶液は、脱脂乾燥ミルクが 、牛血清アルブミンからなるものであろう。ブロッキングののち、抗原を、直接 的にまたは間接的に検出することができる。直接的な検出は、標識された１次抗 体を用いる。

ヨウ素、酵素またはビオチンで標識された抗体は、当業者によく知られた方法に よって調製することができる。

間接的な検出では、１次抗体（非標識）が、はじめに膜に加えられ、つぎに放射 活性を有するヨウ素またはたとえばホースラディツシュペルオキシダーゼのよう な酵素で標識された２次抗体（抗−１次抗体）が加えられる。

そののち、放射活性で標識された膜ではＸ線フィルムを感光させることによって 、酵素で標識された抗体のばあいは、膜に基質を加えることによって、抗原が検 出される。

慢性下位を椎痛または頚部痛の診断のための、タンパク質を定量または検出する いま１つの方法は、体液サンプルに直接行なわれるイムノアッセイを用いるもの である。本発明に関連して、種々のイムノアッセイ、：抗体捕獲（抗体過剰）； 抗原捕獲（抗原競合）および２抗体サンドイツ千法などが使用できよう。すべて のイムノアッセイは、標識された抗原、抗体または検出および定量のための２次 試薬に依存する。用いられる標識は、放射活性か酵素でありうるし、またはフル オロクロームかビオチンで標識してもよい。

標識の選択は、たとえば価格、感度、放射活性の被爆などを考慮１７たうえでの 、診断者の自由裁量の問題である。ここで用いた「標識」の語は、前記のいずれ にも適用される。

抗体捕獲のタイプの分析では、検査サンプルを、固相に直接的に結合させ、結合 しない抗原はすべて洗い流す。

抗原に対して特異的な抗体を加え、結合させる。非結合抗体を洗い流したのち、 固相に結合した抗体の量を、２次試薬を用いて測定する。好ましい２次試薬には 、抗イムノグロブリン抗体であるプロティンＡまたはプロティンＧが含まれる。

これらは、市販のものからえるか、またはその技術分野において知られた方法で 調製することもできる。詳細なプロトコールは、バーロウら、前出、にあり、こ こでは参照に編入されているが、用いられる特定の方法は、本発明の実施を限定 したり、本発明の実施に必須なものであったりするわけではない。

抗原捕獲のタイプの分析では、標識と非標識の抗原のあいだの競合によって、検 査サンプル中の抗原の量を測定する。このタイプの分析の例としては、「ラジオ イムノアッセイ」すなわちＲＩＡがあげられる。このタイプの分析の第１段階は 、固相支持体に非標識抗体を結合（直接にまたはたとえば抗−イムノグロブリン 抗体のような仲介タンパク質によって）することである。既知量の既知の抗原サ ンプルを標識し、このサンプルを、未知量の抗原を含む検査材料に添加し、その 混合物を、結合した抗体に加える。検査サンプル中の抗原は、固相支持体に結合 している抗体との結合において、標識された抗原と競合する。結合していない抗 原を除去したのち、結合した標識抗原の量を測定する。未知の試験サンプル中の 抗原濃度が高いほど、標識された抗原と、より効果的に競合する；それゆえに、 非標識抗原の量の増加にともなって標識量の減少が検出される。したがって、作 られた標準滴定曲線が、抗原の相対的レベルを明らかにするであろう。

抗原濃度を定量するいま１つのイムノアッセイは、２−抗体サンド・イッチ法で ある。このタイプの分析は、抗原の２つの別々のエピトープに結合する２つの抗 体を必要とする。１．たがって、抗原上の２つの別々な部位を認識する２つのモ ノクローナル抗体を用いてもよいし、または精製された１群のポリクロナール抗 体を用いることもできる。必要な工程は以下に示すとおりである・１）１つの精 製された抗体を、固相に結合し、検査サンプル中の抗原を第１抗体に結合する； ２）非結合抗原を洗い流し、標識された第２抗体を抗原に結合させる；３）洗浄 ののち、マトリックスに結合した第２標識抗体を定量する。他の分析と同様に既 知の濃度で標準滴定曲線をプロット１７、それと未知サンプルとを比較する。絶 対量を決定するために、既知の抗原量で作成した標準曲線を用いる。

本発明によって可能となった診断技術における進歩を利用するために、広範な種 類の検査キットが、実施可能である。そのうちのあるものをここで述べる；その ほかは当業者によって考えられうる。

検査キットの中心的な反応は、慢性下位を椎痛または頚部痛の患者に見い出され る異常なタンパク質のうちのどれかと、前記および下記の実施例におけるごとく に調製された、抗体とのあいだの反応であろう。下記の実施例は、ウサギからの 抗体の標品で行なわれ、それに続く記述と他の検査キットや検査法の実施例は、 ウサギの標品に基づく。ウサギは、イムノグロブリンとのその両分の好ましい材 料である；しかしながら、当業者は、下記の実施例が、典型例としてウサギを用 いているにすぎないことを認めるであろう。他の動物を用いることが可能であり 、このばあい、検査やキットで用いられるほがの試薬にいくらか変更を加える必 要があるであろうし、これは当業者にとって容易に明白なことである。

検査キットでは、どんな種類の吸着体でも用いることができ、たとえば、ガラス がプラスチックの表面が含まれ、それらは試験管の内壁または試験用のプレート の表面であってもよい。とくに酵素−結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）またはラ ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において有用な平たんな表面の例としては、ガラ ス、ニトロセルロース紙またはたとえばポリスチレン、ポリカーボネートもしく は種々のポリビニルのようなプラスチックが含まれる。リガンドは、既知の手法 にしたがって、直接吸着、強制吸着またはカップリングによって表面に付着する ことができる。典型的な検査キットは、下記実施例に述べられている。

下記の実施例は、本発明の診断法の有用性を示すものであって、本発明の範囲の 限定を意図するものではない。

たとえば下位を椎痛または頚部痛の診断の助けとするために、既知のイムノアッ セイのいずれをも用いうる。また、診断法は、本実施例で明らかにされた特定の タンパク質に限定されるものではない。当業者にとって明白であろう手順の変更 は教示の範囲内である。

実施例１ 第１の（最初の）研究では、報告された障害に対して２次的に、６ケ月またはそ れ以上のあいだ下位を椎痛を訴える患者の群から任意に慢性を椎痛を有する１ｏ 人の患者を選んだ。これらの患者は、女性３人、男性７人で、２０才から５５才 の範囲の年齢であった。これらの患者のうち、７人はその痛みに対する投薬をう けていたが、３人は投薬をうけていなかった。下位を椎障害の程度は、っぎのよ うないくつかの要素：を椎痛の既往歴（せきおよび（または）くシゃみに伴う痛 みの放射ならびに誘導を含む）；Ｌ−４からＬ−５の皮膚知覚帯における感覚の 喪失を含む身体検査；背部および脚の運動限界の測定；膝蓋脚反射における異常 ；およびを椎Ｘ線撮影（を椎症、狭窄症、椎間板ヘルニア、退行変性（ｄＢｅｍ ｅ目目ｏｎｓ　）、推骨間空間の狭窄などのため）ならびにその他ＭＲＩ。

ＣＴスキャン、を髄造影およびを髄電気記録などの特別の研究により評価した。

コントロールは患者群に年齢および性別が一致するように選択された。コントロ ールは、既往歴および身体検査により決定されたところ大きな医学的問題がない とされた者である。

圧迫帯を１分間適用し、１４３ＵＳＰ単位のヘパリンを含有する真空チューブを 用いて、静脈穿刺により１０ｍ１の血液を採取した。コントロールサンプルは、 患者からのサンプルと同時に採取するが、全サンプルは午後の数時間の間に採取 した。全血を２０００Ｘｇで１０分間遠心したのちにピペッティングにより、沈 殿した（ｐｇｃｋｅｄ）赤血球および白血球から血漿を分離することで、血漿を 単離した。分析のため研究所へ輸送（ドライアイス中）する前に、血漿を一２０ ℃で凍結させた。サンプルは、電気泳動するまで一７０℃にて貯蔵した。電気泳 動は静脈穿刺から３ケ月以内に行なった。

血漿サンプルを解凍し、各サンプルの２０μｌを１０％（重量／容量）ＳＤＳお よび２．３％（重量／容量）ＤＴＴを含有する変性溶液２０μｌに加えた。つぎ に、サンプルを４分間９５℃に加熱したのち、室温まで冷却シタ。つキニ、Ｏ， ＩｇＤＴＴ、０．４ｇＣＨＡＰＳ。

５．４ｇ尿素、０．５ｍ１ｐＨ３，５〜１０両性電解質および６．５ｍｌ脱イオ ン水を含有する電気泳動溶液の９６μｌを各サンプルに加えた。そのサンプルを ポルテックス（Ｖｏｌｔｅｚ）　ミキサー上で混合し、処理されたサンプルの各 １０μｌ　（１，４７μｌの血漿を含有）を１次元等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲ ルに加えた。等電点電気泳動は、４％（重量／容量）両性電解質（ｐＨ３，５〜 １０およびｐＨ５〜７の両性電解質の１；１混合物を含有する）を有し、０．０ ３％ジアクリルピペラジン（ＰＩＰまたはＤ　Ｉ　Ｐ）で架橋された３％（重量 ／容量）アクリルアミドゲル、すなわち３％Ｔ／１％Ｃ中で行なった。電気泳動 は、１８０００ボルト時間、１０００ボルト１７時間で始めて、つぎに２０００ ボルト３０分間行なった。

２次元、これによりタンパク質が質量により分離されるのであるが、を１６０ｃ ｍＸ２００ｃｍｘ１．５ｍｍのスラブゲル　バイオラド　プロチアンｎ　（Ｂｉ ｏ−Ｒｓｄ　Ｐ＋ｏｌｅ１ｎ　ＩＩ　）チャンバーを用いて行なった。このゲル は、１２．２％（重量／容量）アクリルアミド、０．２Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８， ８）　、０．７％（重量／容量）チオスルフオン酸ナトリウム、０．３％（重量 ／容量）ジアクリリルピペラジン、０．５％（重量／容量’）１，４−ジメチル ピペラジンおよび０．０７％（１量／容量）過硫酸アンモニウムにて調製した。

電気泳動はゲルあたり４０ｍＡの一定電流で７℃にて行なった。

銀染色 泳動後、ゲルをガラス板から離して水中で５分間洗浄した（この期間にタンパク 質の喪失は検出されない）。

つぎに、そのゲルを３６ｒｐｍのオービタル振とぅ器上、エタノール／酢酸／脱 イオン水（４０／１０１５０）の溶液中に１時間浸した。つぎに、この溶液をエ タノール／酢酸／脱イオン水（５１５／９０）の溶液で置換し、少なくとも３時 間の間ゲルを浸した。ゲルを脱イオン水で５分間洗浄し、３０分間グルタルアル デヒド溶液（１００ｍｌ／リットル）中に浸した。グルタルアルデヒドを完全に 除くため、脱イオン水での大規模な洗浄を３×１０および４×３０分間行なった ）。［冷脱イオン水（く１５℃）はより効率良くグルタルアルデヒドを除去する 。］っぎに、ゲルを１０分間アンモニア性硝酸銀溶液（３０ｍｌの脱イオン水中 に６ｇの硝酸銀を溶かし、１６０ｍ１の水、１０ｍ１の濃縮水酸化アンモニウム および］、、５ｍｌの水酸化ナトリウム、１０モル／リットルを含む溶液中にゆ っくり混合する；この溶液をつぎに脱イオン水で希釈して最終容量を７５０ｍ　 ｌとする）（溶液Ｈ）中で染色した。溶液Ｈの温度は２０℃であった。染色後、 ゲルを脱イオン水で５分間×３、洗浄した。

つぎに、クエン酸およびホルムアルデヒド溶液（１リツトルの脱イオン水中０． １ｇクエン酸および１ｍｌホルムアルデヒド）（溶液■）中で、バックグラウン ド染色がわずかに現れるまで現像した。（溶液Ｖの最適温度は１５〜１８℃であ る。）少なくとも１５分間、酢酸／脱イオン水溶液（５／９５）にて現像工程を 停止した。染色したゲルをグリセロール／エタノール／脱イオン水溶液（７／１ ０／８３）中に貯蔵した。［この染色法はホラホストラセール（Ｈａｃｈｓｔｒ ｉｇｓｅ＋）ら、アナリティヵルバイオケミストリ−（Ａ■１７ｔｉｅａｌ　Ｂ ｉｏｃｋｅｍｉｓｌ＋７　）、１ユニ、４２４〜４３５頁（１９８９）に記載。

］ゲル分析 タンパク質の定量のため、ゲルをエイコニクス　シリーズ（Ｅｉｋｏｎｉｃｓ　 ５ｅｒｉｅｓ　）　７８　／　９９デジタルスキヤナーにてスキャンして、そう して作られたゲルの像をＳＵＮ　４−２６０ミ＝：＋ンピューター上ＰＤＱＵＥ ＳＴソフトウェア（プロティンデータベース社（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｓｊａｂ■ ｅ、Ｉｎｃ、　）　、／’ンチントン州、ＮＹ）により解析した。ゲル像をＰＤ ＱＵＥＳＴソフトウェアの平均ｌｏｇ比正規化処置を用いてタンパク質負荷およ び染色変動に対して正規化した。各ゲル上、１３００のタンパク質を解析し、そ のタンパク質を照合し、定量的に比較した。

この解析は、複雑なスポットパターンを含むゲル領域において目視検査およびオ ペレーター介在（ｉｎｆｅｒマｅｎｔｉｏｍ）の助けをえてＰＤＱＵＥＳＴを用 いることにより行なった。３倍またはそれ以上の、（スチューデントを検定また はログスチューデントを検定の方法により）統計上有意であるとわかった濃度が 増加または減少したすべてのタンパク質を重要なスポットと考えた。

図１はコントロール被験者からの血漿サンプルの染色されたゲルを示す。マーカ ータンパク質は接頭辞Ｍで示され、表Ｉにはゲル上の措標となっているマーカー 血漿タンパク質があげられている。慢性を椎痛を有する患者に増加または減少し ていることがわかったタンパク質をそれぞれ表■および表■にあげ、図１に示す ゲル上では番号で示す。患者の血漿中に欠失しているタンパク質は、図１のコン トロールゲル上、中あきの円で示す。

この実施例で解析されたタンパク質のコンピューター作成のマスターマツプを図 ２に示す。

表　■ 指標血漿タンパク質 し以下余白］ 表　■ 慢性下位を椎痛に伴い増加した血漿タンパク質表　■ 慢性下位を椎痛に伴い減少した血雫タンパク質＊濃度は任意の濃度単位である。

ｐは０．０５以下 実施例２ さらに進んだ広範囲の研究（第２の研究）において、慢性下位を椎痛を有する３ ２人の患者と３２人のコントロールを、実施例１で述べたと同じ方法に供した。

新しいスポットを同定する努力として、患者のゲルを、コンピューター分析の助 けなしに、目視的にコントロールと比較した。患者で現れた１つの特定の（１つ または複数の）タンパク質のスポットがコントロールでは、目で見たところほと んど存在しなかった。このスポットは、ゲル上きわめて近接して位置していた別 のスポットにとり込まれていたので、コンピューターが同定しなかったと仮定さ れる。この新しいスポットを１ｂｐ１３−１４゜７１９と示した。その存在は、 図１２〜１４および１８〜２０に示され、コントロールのゲル上で対応するスポ ットが存在しないことは、図１５〜１７および２１〜２３の中あきの円で示す。

本研究でえられたデータの要約を、表■に示す。「実験」例の下の数字は、異な る日に行なわれた４つの別々の群のゲルを示す、無作為に決められた数字である 。この研究は、分析を行なった研究者がどのゲルがを椎痛のサンプルであり、ど れがコントロールであるかわからないという程度まで、「盲検」であった。表■ かられかるように、どのサンプルがどの群に属するかを予測する確率は、顕著に 高い（全体の９７％）。さらに、この新しいスポットで、コンピューターを用い た分析の必要がなく、目視的に同定できるようになるので、それゆえ診断過程を 簡素化する。

表■ 実施例２のを椎痛の研究 前記の分析に続いて、１０人の患者と７人のコントロールからの１７の血漿サン プルを用いて同一の方法で盲検研究を行なった。この研究の結果により、１０人 の下位を椎痛患者のうち９人（９／１０）（９０，００％）およびすべての無症 候のコントロール（７／７）　（１００％）を、＋ｂｐｉ：３−ｚ、７１９の有 無に基づいて、正しく同定することが示された。合わせた正確さは、１６／１７ または９４．１２％で、カイ２乗分析によるｐ値は０．００５より小であった。

Ｉｂｐ１３−１４．７１９のスポットが、１つ以上のタンパク質をあられしてい る可能性もある；しかしここで用いられる分離方法に基づくと、単一スポットと して出現する。

実施例３ さらに５つの群の患者の血漿を１．ｂｐ１３−１４．７１９について分析した。

これらの群は下記に示す群からなる： Ａ、１５人（男性９人と女性６人）の下位背部以外のどこかに痛みをもつ患者。

８．５人（すべて男性）の客観的判断に基づいて、以前に背部病を有していた、 または生体力学的欠損があると証明されたが痛みは有さない患者。

Ｃ，７人（男性１人と女性６人）の慢性炎症疾病を有する患者。

Ｄ、４人（男性３人と女性１人）の末梢神経の領域のの患者。

Ｅ、３人（すべて女性）の慢性頚部を椎痛を有する患者。

前記のサンプルを、実施例２に記載の方法および分析に供し、１ｂ［）１３−１ ４．７１９の有無を決定した。

Ａ群の結果を、表Ｖに示す。１０個のサンプルで１ｂｐ１３−１４．７１９が見 られなかった。５個が陽性を示し、修復をともなう神経損傷の存在を示した。こ れらの５人のうち２人は、を椎に問題があり、２人は、神経損傷の可能性のある 脛骨および腓骨の重篤な骨折を有しており、１人は「偶発滑液嚢」をともなう肩 の痛みを有していた。最後の患者の正確な病状は、不明であるが、神経損傷をと もなっているのかもしれない。このことから、１ｂｐ１３−１４．７１９がを椎 の異常に排他的に制限されるものではなく、どこかほかのところの神経損傷が偽 陽性を作り出しうろことが実証された。また、神経損傷が、これらの条件下では 予想されるよりも多く存在することが示された。

Ｂ群の結果を表■に示す。その結果から、２人の痛みのないを椎すべり症と、３ 人の無症候の背部手術者には、神経損傷または修復がないので、１ｂｐ１３−１ ４．７１９が存在しないことが示された。これによって１ｂｐ１３−］ｉ、７１ ９の存在が、外科的手術の傷跡に続く手術後の出現物ではないし、変化した生体 力学の外傷にきまって存在するものでもないことが明らかとなった。

神経の損傷か修復が、おそらく血漿中の１ｂｐ１３−１４．７１．９合成に必須 であった。

０群の結果を表■に示す。この研究は、１ｂｐ１３−１４．７１９が急性期のタ ンパク質であるという推測を否定するために行なった。１ｂｐ１３−１４．７１ ９は限局性回腸炎の３症例と狼瘉の２症例に存在していたが、リウマチ性関節炎 の２症例には存在していなかった。リウマチ性関節炎の炎症が該タンパク質のス ポットを作らないので、限局性回腸炎と狼癒では神経損傷があるのかもしれない 。これらの疾病は、偽陽性を作りだしつる。

Ｄ群の結果を表■に示す。３人の患者が、Ｉｂｐ１３−１４．７１９に対して陽 性で、無痛の放射性神経麻痺を有する１人の患者が陰性であった。腕における放 射神経があまり回復していないということが、文書で証明されており、ここで１ ｂｐ１３−１４．７１９がないことが、生理的に不充分にしか修復していないこ とを示唆するかもしれない。慢性下位を椎痛を調べる際に、これらの状態が、偽 陽性を与えうる。

Ｅ群の結果を、表■に示す。慢性頚部を椎痛を有する３人の徹者はすべて、１ｂ ｐ１３−１４．７１９に対して陽性を示した。このことは、慢性頚部を椎痛が、 慢性表Ｖ−Ａ群 「＋」は、Ｉｐｂ１３−１４．７１９の存在を示す。

表ＶＩ−Ｂ群 表■−Ｃ群 「＋」は、Ｉｐｂ１３−１４．７１９の存在を示す。

略語の説明 表■−Ｄ群 表ＩＸ−Ｅ群 「＋」は、１ｐｂ１３−１４．７１９の存在を示す。

下位を椎痛と同じ生化学を有し、１ｂｐ１３−１４．７１９がこの状態を統御す る助けとなっているのかもしれないことを示唆する。しかしながら、Ｉｂｐ１３ −１４゜７１９の存在が、これら２つの状態のあいだの差を識別することはない であろう。

実施例４ タンパク質のスポットの密度と、痛みの重篤さとのあいだに相関があるかどうか を決定するために、第１の研究で着目した種々のタンパク質の密度を、下位背部 障害の程度を身体的および放射線医学的と同時に既往歴で決定して評点して、比 較した。

短い、簡略化した評点のシステム（１４４の可能な要素の範囲から簡略化した） を、考案し、これは、ワッブル（Ｗａｄｄｅｌ）アプローチ［ワッブル　アンド 　メイン（Ｌｄｄｅｌ　ａｎｄ　Ｍｓｉｎ　）　ｒアセスメント　オブ　セビリ ティー　イン　ローバック　ディスオーダーズ」、（“＾＄ｓｅｓｓｍｅｎｊ　 ｏｌ　５ｅｖｅ「自７　ｉｎ　ｌｏｗ−ｂａｃｋ　ｄｉｔｏｒｄｅ＋ｓ”　）　 、スｅ＞　（Ｓｐｉｎｅ　）　、９巻、２０４〜２０８頁（１９８４）；ワッブ ル、メイン、モリス、パオラおよびグレイ（Ｗｓｄｄｅｌｌ、Ｍｇ１ｎ、Ｍｏ＋ ＋ｉｓ、Ｐｇｏｌｇ　ｔｎｄ　ＧｒＢ）　、１９８４　；ワッブルら、１９８０ ］と類似している。ワッブルらが重要であるとして選んだ身体的徴候は、：腰の 弯曲の程度、脚をまっすぐにしてもち上げる；根圧迫の徴候；および過去の腰の 手術である。簡略化した尺度で用いた６つの臨床的徴候はそれと類似しており、 それらが臨床の客観的尺度（ＣＯ８）を構成した。

１、過去の背部手術による傷跡。すべての背部手術は、いかに巧みになされたも のであろうと、永続的な変化をともなって、永続的に傷跡を残す。これが、主た るを椎痛がわずかに存在することに寄与する。各手術は、評点２である。

２、患者が制御できない真のけいれん（すべての中でもっとも重要な徴候）。こ れは、患者が制御できるような動きの限定ではなく、医師が認めうる、真の制御 不能のけいれんのことである。たとえば焼つくされた強直性を椎炎のような状態 では、時折無痛であることもあるが、そうでなければひどい痛みの徴候である。

医師は、この例外を容易に認識できる。この所見は、評点４である。

３、脚をまっすぐもち上げること（ＳＬＲ）（右および左）。これは、脚のけい れんおよび機能的なＳＬＲと区別されなければならない。稗のけいれんまたは硬 直は、太ももに局所的に痛みをもたらすものであり、ＳＬＲをともなって背部病 をもたらすのではない。機能的なＳＬＲは、患者を卓の端にすわらせて、楽に（ ｃｚｓ■ｌｌマ）膝をのばさせることで容易に認められる。もし患者が、を椎痛 を訴えていなければ、ＳＬＲは陽性ではない。熟達した手腕では、これは客観的 な所見である。各ＳＬＲは、評点２である。

４、膝蓋またはアキレス謎反射の変化（右および左）。

これらは、すべてのばおいて客観的な所見である。古い外傷または手術が原因で ある痛みをともなわずにこれらの変化が存在することはありうる。ある反射の変 化は、衰弱または萎縮に関連しているが、これらの調査がしばしば記録されてい ないので、後者を評価するのは実際的でない。各反射の変化は、評点１である。

表Ｘにｃｏｓを要約する。

表　Ｘ 本研究の患者の簡略化した評点を、表ＸＩに示す。ゲルのつぎに示した数は、任 意に決めた患者の番号である。

表　■ 患者のＣＯＳの評点 前記のＣＯ３評点を、ゲル中の１３１８タンパク質の量と比較することによって 、１３１８で示されるタンパク質が、痛みの重篤さと関連することがわかる。こ れは図５に示される。

同じ比較を、タンパク質１３１６．１２０４．１３０５．３２０３および３２１ １とも行なった。また、タンパク質１３１８と１３１６との平均とも比較した。

これらの結果を図６〜１１に示す。

実施例５ を椎痛の治療の過程における効果を調べるために、治療前に慢性を推痛患者から 血液サンプルをえた。２次元ゲルを行ない、染色し、基準線をうるために、表■ と■に示したタンパク質のうち１つかそれ以上のもののレベルを分析した。治療 を施したのち、１つまたはそれ以上の血液サンプルを採取し５、初めに分析した と同じ１つまたはそれ以上のタンパク質のレベルを分析した。正常レベルにまで 、比例的に（分析されたタンパク質が、慢性を推痛患者において増加または減少 していることが見出だされたものであるかどうかによる）増加または減少してい ることが、治療が効果的であることを意味する。

実施例６ Ａ、抗原の調製。慢性下位を椎痛と確認された患者について２次元ゲル電気泳動 を行なったのち、着目しているタンパク質の位置を確定するためにゲルを、ゲル をクマシーブルーを用いて染色する。ゲルは数分間脱イオン水で、数回水を変え ながらすすぐ。タンパク質を含むスポットを、メスを用いてゲルから切り出し、 パラフィルムかプラスチックラップの上におく。ペーパータオルの端を用いて、 毛細管現象によって染色水をすべて除去する。つぎに２つの５ｃｃのシリンジの 注射筒（ｂｘ＋＋ｅｌ）からプランジャーを取り除き、注射筒の１つの中にゲル 片を入れる。そののちプランジャーをもとにもどし、シリンジの出口を２つめの シリンジの注射筒に取り付ける。

速く、安定した圧力をプランジャーにがけることで、ゲルを２つめのシリンジの 注射筒に押し出す。この工程を、２つのシリンジのあいだで数回行き来させて繰 り返した。

そののち、シリンジの出口に２１ゲージの針を取り付け、前記の工程を繰り返す 。シリンジのあいだを小片が通過して行き来するために、少量の緩衝液（Ｐ　Ｂ 　Ｓ）が必要かもしれない。これでサンプルを注射する準備ができる。

Ｂ、抗体の調製。調製した抗原（前記）を注射して免疫したウサギで、抗体を作 成する。最初に、調製したタンパク質のうち１−っをおよそ１５０μｇ皮下注射 し、続いてその抗原を、およそ１００μｇ１カ月ごとに２回注射する。これでイ ムノアッセイに用いるには充分な力価（タイター）の抗体をえる。

Ｃ，モノクローナル抗体の調製。モノクローナル抗体は、コーラ−とミルシュタ インらの方法にしたがって、調製しつる。この方法は、１つかそれ以上のエピト ープを有する抗原で（すなわち、下位を椎痛タンパク質の１つ）でマウスを免疫 することを含む。該マウスは、血清中に抗体（または複数の抗体）として出現す る抗−エピトープ（複数のエピトープ）を作る肺臓細胞を発現させる。肺臓を摘 出し、各々の細胞を、プリン酵素欠損であって、しばしばＩｇが分泌できないた めに選択される、絶え間なく***している（すなわち、不死の）Ｂ腫瘍細胞と、 ポリエチレングリコール中で融合する。その結果えられた細胞を、融合しなかっ た細胞を絶滅させるＨ　ＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培 地を入れたマイクロウェルプレート中に、平均して、各ウェルが１つ以下のハイ ブリドーマ細胞を含むような高い希釈率にて播種する。各ハイプリドーマは、た だ１種の抗体−産生細胞と腫瘍細胞の融合産物であって、前者の１種の抗体を分 泌する能力と、それを不断に増殖させうるような後者の不死性とを合わせ持つの で、クローン化した子孫が終わることなく抗体を供給するものである。

Ｄ、ウェスタンプロット（イムノプロット）。実施例１−ノ２次元ゲルからのタ ンパク質を、染色の前に、０゜２μｍのニトロセルロース膜に、電気的に溶出す る。膜を、ＰＢＳですすぎ、ＢＳＡ（３％ＢＳＡ　（フラクションＶ、０．０２ ％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ中）とインキュベートした。そののち膜を、ＰＢ Ｓ中およそ１から５０μｇ　／　ｍ　１のあいだの濃度で、１次つサギポリクロ ーナル抗体（前記の方法でえられる）とインキュベートする。それから膜をＰＢ Ｓを数回変えて洗浄し、引き続きホースラディツシュペルオキシダーゼで標識さ れたヤギ抗−ウサギ抗体とインキュベートする。最後に、ＰＢＳですすいだのち 、膜を４−クロロ−１−ナフトール（貯蔵溶液は、１０ｍ１絶対エタノール中、 ０．３ｇクロロナフトール；使用溶液は、１０ｍ１の５０　ｍ　Ｍ　トリス、ｐ Ｈ７，６に０．１ｍｌの貯蔵溶液を加えたちの；白色の沈殿物を濾１．とり、１ ０μｍ０３０％過酸化水素水を添加する）で、現像する。反応を、ＰＢＳを用い てすすぐことによって停止する。着目しているスポットが、青−黒色に出現すれ ば、陽性の結果が認められる。

前記のイムノプロットの手順において、より高い特異性をつるためにモノクロー ナル抗体を１次ポリクローナル抗血清に置き換えてもよい。

Ｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）。本分析を行なうために、着目したタンパ ク質（たとえば、実施例１で例示したもの）のうち１つに対する、前記したよう な既知の方法にしたがって調製されたモノクローナル抗体を用いる。

ニトロセルロース紙１枚をドツトプロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）装置の大きさに 切断する。該シートは、前もって水で湿し、そののち装置に合わせて置く。患者 からの血清サンプルを、連続的に希釈してウェル中に入れ（３０μｌ／ウエル） 、高湿の大気中で２時間インキュベートする。

そののちシートを、ＰＢＳを２回変えて洗浄する。そののちシートを、少なくと も２時間０．０２％アジ化ナトリウムを含む３％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓの溶液 とインキュベートしてブロックする。ＰＢＳを用いた洗浄に引き続き、１次モノ クローナル抗体（０，０２％アジ化ナトリウムを含む３％ＢＳＡ／ＰＢＳの溶液 中）を、適切な希釈率で添加して、振とうしながら２時間インキュベートする。

結合していない抗体を、ＰＢＳで洗い流す。そののち、１１２５−標識ヤギ抗− ウサギＩ　ｇＧ　（０，０２％アジ化ナトリウムを含む３％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ 　Ｓの溶液中）と該シートとを振とうしながら２時間インキュベートする。結合 しなかった標識抗体を、ＰＢＳで４回、それぞれ５分づつ洗浄して除去する。結 合した標識抗体の量を、オートラジオグラフィーによる検出によって測定する。

これは、サンプルシートをＸ線フィルムに直接接触させて、これを増感スクリー ンとともに一７０℃で保存して行なう。結果は感光されたフィルムを目視試験に より概算し、さらに定量的には、デンシトメーターによるトレーシングで定量化 する。異なるサンプル中の相対的な抗原量は、滴定曲線の中間点と比較すること によって決定する。抗原の絶対量は、既知の抗原量を用いてえられた値とこれら の値とを比較して決定しうる。

Ｆ、酵素−結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）。このイムノアッセイは、前記のＲ ＩＡ法と同様に行なわれる：しかしながら、２次抗体である、ヤギ抗−ウサギ抗 体を１１２５で標識仕ずに、ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で 標識する。該ＨＲＰを検出して定量するために、クロロナフトールを用いたドツ トプロットを行なう。貯蔵溶液を調製するために、４−クロロ−１−ナフトール （０，３ｇ）を、１０ｍ１の絶対エタノール中に溶解する。分析に付する直前に 、０，１ｍｌの貯蔵溶液を、Ｉ、　Ｏｍ　ｌの５０　ｍ　Ｍ　トリス（ｐＨ７， ６）に加える。形成された白色沈殿は、ワットマン（ＷｈｓｌｍＩｎｌ　Ｎ　ｏ 　。

１濾紙を用いて濾過する。この溶液に１０μｌの３０％過酸化水素水を添加する 。該クロロナフトール溶液を、ニトロセルロースシートに加え、スポットが適切 な濃度になるまで、（約３０分）振とうする。反応は、ＰＢＳですすぐことによ って停止する。結果は、ＲＩＡと同様に決定し、定量は、目視による検査か、反 射デンシトメトリーより行なうことができる。

実施例７ ＲＩＡまたはＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａを用いた検査に使用する典型的な検査キットに は、下記のものが含まれる：■、ウサギＩｇＧのＦａｂ断片を吸着させたプレー ト（表■、■および■に前記したタンパク質のいずれかに対する）、またはウサ ギＩｇＧを吸着させたニトロセルロースシート。

２、ウサギ全１ｇＧ（前記のものと同一のタンパク質に対する）。

３、標識されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ。

１、ウサギＩｇＧ（表■、■および■に示したタンパク質のいずれかに対する） ２、標識されたヤギ抗−ウサギ。

これらのキットには、たとえばＰＢＳのような適切な緩衝液、ブロッキング溶液 および適切な酵素基質（ＥＬＩＳＡ用）が含まれていてもよい。

これらの材料は、キットと一緒に供給されてもよいし、別々に供給または調製さ れてもよい。

「プレート」の語は、ＲＩＡまたはＥＬ　Ｉ　ＳＡで用いることのできる平らな 表面のものすべてを含む広い意味に用いられる。

実際には、検査キットＡ（前記）は下記のとおりに用いる： １、プレートを、検査する患者の血清と、適切な時間と温度で（たとえば３７℃ で２〜４時間）、インキュベートする。

２、ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄する。

３、ウサギ全１ｇＧとインキュベートし、緩衝液で洗浄する。

４．標識されたヤギ抗−ウサギＩｇＧとインキュベートし、同じ緩衝液で洗浄す る。

５、前記の手順のいずれかによって陽性の検査結果であるばあいには、反応産物 （または放射活性シグナル）の生成を、検出する。

検査キットＢは、下記のとおりに用いる：１、基質（プレート、ニトロセルロー ス紙など）を、未知サンプル（たとえば血漿）と、適切な時間と温度でインキュ ベートする。

２、ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄する。

３、基質を、ウサギＩｇＧとインキュベートし、緩衝液で洗浄する。

４、ヤギ抗−ウサギＩｇＧとインキュベートし、同じ緩衝液で洗浄する。

５、適切な手順によって陽性の検査結果であるばあいには、反応産物（または放 射活性シグナル）の生成を、検出する。

拳 ・−１−一一一一一−Ｎ 轡１Ｏ−３ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、ｌ６ ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　２０ ＦＩＧ、　２１ ＦＩＧ、２Ｂ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）ＰＣＴ／ＵＳ９１１０８５５２ ２発明の名称 慢性下位を推痛および頚部癌の診断法 ３特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、７７０２４テキサス州、ヒユーストン、スート　１０ ４、ポーストオーク　プルバード　５１５ 国　饋　アメリカ合衆国 住　所　アメリカ合衆国、ワシントン、ディー　シー（番地なし） 名称　アメリカ合衆国 国　籍　アメリカ合衆国 ４代理人　〒５４０ 住　所　大阪市中央区谷町二丁目２番２２号５補正書の提出年月日 １９９２年１２月２１日 ６添付書類の目録 （明細書８頁１行〜１０頁下から４行をつぎのとおり補正する） 号、２３５頁（１９８３）］。また、疾病の段階ごとのタンパク質の「プロファ イル（ｐｒｏｆｉｌｅ　）　Ｊの現像が、診断に有用であるかもしれないという ことも知られてきている［トレーシーら、前出の２４２頁］。

しかしながら、２次元電気泳動法によってえられた分離能の向上や、近年開発さ れた染色法をもってえられる高い検出感度の結果として、この方法論が広く臨床 に応用されるようにはまだなっていない。このように、一般にそしてとくに慢性 を椎痛においては、２次元ゲル分析を用いた疾病の段階の診断は、新しいもので あって、報告された方法はただ１つあるにすぎない。この方法とは、脳を髄液の ２次元ゲルタンパク質分析を用いて、クロイツフエルドヤコブ病をほかの疾呆の 原因から区別するものである「バーリントン（Ｈｔ＋＋ｉｎｇｌｏｎ）ら、米国 特許第４８９２８１４号）。

はまた、パーキンソン病と***病とに関連したいくつかのタンパク質を見出だし たが、これは診断的な価値があるかもしれないが、ないかもしれない。血漿［ア ンダーソンら、１９８４、前出１と、脳を髄液しゴールドマン（ＧｏｌｄＩＩｌ ａｎ　）ら、クリニカル　ケミストリー２６巻、１３１７〜１３２２頁（１９８ ０）］の２次元電気泳動によってマツピングされ、同定されたいくつかのタンパ ク質は、多形性であることが実証され、したがって、遺伝的および法的な応用を 提供するかもしれないが、特定の疾病の診断指標として信頼しうると証明されて はいない。

ニー　アホネン（＾、＾ｈｏｎｅｎ）ら、アクタ　ニューロロジ力　スカンジナ ビ力　（＾ｃｊＩＮｅｗ＋ｏｌｏｇｉｃａ　Ｓｃ１＊ｄｉ＊１ｗ１ｃ８）５８． ３５８〜３６５頁（１９７Ｂ）は、脳を髄液（ＣＳ　Ｆ）中の総タンパク質およ びアルブミンの参考値（＋ｅｌｅ＋ｅ＋＋ｃｅ　ｗｘｌａｅｓ）の測定を開示し ている。全サンプルが慢性を推痛患者からのものであったが、彼らはＣ８Ｆ参考 値によってめたところタンパク質の変化を起こすような疾病にかかっていなかっ たため、「正常」個体の代表として選ばれたものであり、これは健康体からのＣ ３Ｆサンプルを用いることは非倫理的であると考えられたためである。

アール　ピー　トレイシー（Ｒ，Ｐ、Ｔ＋Ｉｃ７　）ら、ジャーナル　オブ　ク リニカル　ラボラトリ−オートメ−シコン（１，Ｃｌ１ｎ、　Ｌｇｂ、＾ａｌｏ ｍａ＋ｉｏｎ　）　３．２３５〜２４３頁（１９８３）は、単に２次元ゲル電気 泳動およびその、疾病状態でのタンパク質濃度の測定への一般的応用をあられし ている。を椎痛、頚部痛または末梢神経損傷の診断については言及していない。

発明の概要 前記の技術上の欠点を克服するために、本発明者らは、慢性を椎痛、頚部を椎痛 および末梢神経損傷診断のための客観的な検査を開発した。該検査は、患者から の体液サンプル中のある、正常人のコントロールと比較して増加または減少する タンパク質の濃度を分析するために、２次元電気泳動を用いる。本発明者らは、 慢性を椎痛と頚部痛に関連１．たタンパク質を、２次元ポリアクリルアミドゲル −Ｌの動きによって同定した。かくして、そのように同定されたタンパク質と、 それから誘導可能な産物（たとえば、抗体）などもまた、本発明の一部をなす。

当業者が認めるであろうように、染色した２次元ゲル上のスポットは、１つまた はそれ以上のタンパク質をあられしうる。

本発明の方法によって検出されうる多くのタンパク質は、濃度および、／′また は移動のパターンにおいて変化することが、見い出された。この種の研究のうえ で期待されルトおり、あるタンパク質のスポットは、統計的な分析に供されたば あいにほかのタンパク質よりも高い診断的価値を有するものであることが、見い 出された。

本発明の最初の研究によれば、慢性下位を椎痛は、慢性を椎痛を徹っている疑い のある患者において、４４個のタンパク質のレベルが正常人のコントロール（す なわち、慢性を椎痛の臨床的証拠がない正常人のボランティア）と比べて、増加 しているかまたは減少しているかを検出することによって正確に診断される。慢 性を推痛患者においては、２９個のタンパク質が正常人コントロールに比べて少 なくとも３倍のレベルにまで統計的に有意に上昇することが見い出された。（統 計的に有意とは、ここではスチューデントを検定（Ｓｌｕｄｅｎｌ　ｌ　１ｅｓ ｔ）またはログ（ｔｏπ）スチューデントを検定によるｐ値が０゜０５以下であ ること、と定義される。）これらの２９個のタンパク質のうち、１３個は慢性を 推痛患者のみに見出だされる。他方、慢性を椎痛患者では、１３個のタンパク質 が、コントロールに比べて少なくとも１／３にま・で減少したレベルを呈する。

これらのうち７個のタンパク質は、を椎痛症状の患者において、まったく消失し ている。第２の研究でもう１つのスポット（Ｉ　ｂ　ｐ　１−３−１４．７１９ と名づけだ）が見出され、これはを椎痛または頚部痛の有無を予測しうる可能性 が非常に高く、したがって、観察が容易であるだけでなく、診断的価値において 好ましい。

かくのごとく、本発明の診断法では、慢性背部症状または頚部痛を診断すべきサ ンプル中の、前記タンパク質の増加もしくは減少または有無を同定する技術を用 いることができる。

（明細書１３頁１行〜下から３行をつぎのとおり補正する） 蓄積される（中枢神経系への損傷の再生においてはより低い）ということがよく 立証されているアポリポタンパク質であるとも仮定されうる。事実ウェスタンプ ロットを用いた予備試験で、Ｉｄｐ１３−１４．７１９が抗−アポＥ血清に陽性 であることが示された；しかしながら、これは、交叉反応性のためかもしれない 。

初めの研究での患者のうち３人は、慢性を椎痛のためのいかなる投薬をもうけて いなかったので、ここで認められるタンパク質の変動が、痛みの緩和のために患 者が用いていたかもしれないような薬物のためであるということは、なさそうで ある。

これらの３人の患者は、薬物を用いていた患者と類似の、タンパク質の変化を示 した。

また、タンパク質の変動が貯蔵によって生じた物質であるということもなさそう である。トレイシーらは、凍結および一２０℃での貯蔵によって変化する血漿タ ンパ我々の１３０５．１３１８．１３２３および４６１４のスポットは、トレー シーらによってそのようなスポットの出現として示された領域にある。しかしな がら、患者と、年齢および性が合致したコントロールサンプルを同時に採取して 、同一の条件下で保存しているのだから、本研究で着目しているタンパク質は貯 蔵によって生じた物質ではまずない。

（明細書２８頁１行〜２９頁２行をっぎのとおり補正する） 血漿サンプルを解凍し、各サンプルの２０μｌを１０％（重量／容量）ＳＤＳお よび２．３％（重量／容量）ＤＴＴを含有する変性溶液２０μｌに加えた。つぎ に、サンプルを４分間９５℃に加熱したのち、室温まで冷却した。つぎに、Ｏ， ＩｇＤＴＴ、０．４ｇＣＨＡＰＳ。

５．４ｇ尿素、０．５ｍ１ｐＨ３，５〜１０両性電解質および６．５ｍｌ脱イオ ン水を含有する電気泳動溶液の９６μｌを各サンプルに加えた。そのサンプルを ポルテックス（Ｖｏｌｌｅり　Ｅキサ−上で混合し、処理されたサンプルの各１ ０μＩ　（１，４７μｌの血漿を含有）を１次元等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル に加えた。等電点電気泳動は、４％（重量／容量）両性電解質（ｐＨ３，５〜１ ０およびｐＨ５〜７の両性電解質の１〜１混合物を含有する）を有し、０．０３ ％ジアクリロイルピペラジンで架橋された３％（重量／容量）アクリルアミドゲ ル、すなわち３％Ｔ／１％Ｃ中で行なった。電気泳動は、１８０００ボルト時間 、１０００ボルト１７時間で始めて、つぎに２０００ボルト３０分間行なった。

２次元、これによりタンパク質が質量により分離されるのであるが、を１６０ｃ ｍＸ２００ｃｍＸ１．５ｍｍのスラブゲル　バイオラド　プロチアンＩＩ　（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ　？ｏ１ｅａｎ　ＩＩ　）チャンバーを用いて行なった。このゲル は、１２．２％（重量／容量）アクリルアミド、０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８， ８）、０．７％（重量／容量）チオスルフオン酸ナトリウム、０．３％（重量／ 容量）ジアクリロイルピペラジン、０．５％（重量／容量）１，４−ジメチルピ ペラジンおよび０．０７％（重量／容量）過硫酸アンモニウムにて調製した。電 気泳動はゲルあたり４０ｍＡの一定電流で７℃にて行なった。

（明細書４９真下から２行〜５０頁１６行をっぎのとおり補正する） 実施例７ ＲＩＡまたはＥＬ［ＳＡを用いた検査に使用する典型的な検査キットには、下記 のものが含まれる：■、ウサギＩｇＧのＦａｂ断片を吸着させたプレート（表■ 、■および■に前記したタンパク質のいずれかに対する）、またはウサギＩｇＧ を吸着させたニトロセルロースシート。

２、ウサギ全１ｇＧ（前記のものと同一のタンパク質に対する）。

３、標識されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ０１、ウサギＩｇＧ（表■、■および■に 示したタンパク質のいずれかに対する） ２、標識されたヤギ抗−ウサギＩｇＧ０これらのキットには、たとえばＰＢＳの ような適切な緩衝液、ブロッキング溶液および適切な酵素基質（ＥＬＩＳＡ用） が含まれていてもよい。

請求の範囲 １．　（ａ）慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛を有する患者の血漿中に存在 して、正常コントロール患者には事実上存在しない、２次元ゲル電気泳動で測定 されたｐｔが６．０〜６．２で、相対分子量が約３２キロダルトンであり、抗− アポリポタンパク質Ｅ血清と、ウェスタンプロットにおいて反応性を有するタン パク質（Ｉｂｐ１３−１４．７１９と名づけた）；もしくはその必要なエピトー プを含む合成ペプチド；または（ｂ）ｌｂｐ１３−１４．７１９または前記ペプ チドに対する抗体 の慢性を椎痛、慢性頚部を椎痛または末梢神経損傷の診断における用途。

２、　タンパク質１ｂｐ１３−１４．７１９が、慢性を椎痛または慢性頚部を椎 痛を有する患者の血漿サンプル２０μｍを、１０％（重量／容１ｌｌ）ＳＤｓと ２．３％（重量／容量）ＤＴＴを含む等量の変性溶液に加え、そのサンプルを９ ５℃まで４分間加熱し、室温まで冷却し、０．１ｇＤＴＴＳ　０．４ｇＣＨＡＰ Ｓ、５．４ｇ尿素、０．５ｍ１両性電解質ｐＨ３，５〜１０および６．５ｍｌ脱 イオン水を含む電気泳動溶液９６μｌを加え、サンプルを混合し、そのサンプル の１０μｌ（１，４７μｍの血漿を含有）を、４％（重量／容量）（ｐＨ３，５ 〜１０およびｐＨ５〜７の両性電解質の１・１混合物の）両性電解質を有し、０ ．０３％ジアクリロイルピペラジンで架橋された３％（重量／容量）アクリルア ミドより作成した等電点電気泳動ゲルに供し、該ゲルで１次元電気泳動を１ｓｏ ｏｏボルト時間、１０００ボルト１７時間で始めて、つぎに２０００ボルトで３ ０分間行ない、その１次元電気泳動ゲルを１２．２％（重量／容量）アクリルア ミド、０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）および０．０７％（重量／容量）過硫 酸アンモニウムより作成した１６０ｃｍＸ２００ｃｍＸ１．５ｍｍのスラブゲル に供し、ゲルあたり４０ｍＡの一定電流で７℃にて泳動を行ない、ゲルから１ｂ ｐ１３−１４．７１９を単離することによってえられる（が、必らずしもそうす ることによりえるとは限らない）請求項１記載の用途。

３、　抗体がモノクロナールである請求項１または２記載の用途。

４、　慢性下位を椎痛、慢性頚部を椎痛または末梢神経損傷を有する疑いのある 患者の体液サンプルを２次元ゲル電流泳動またはイムノアッセイに供し、請求項 １または２に記載した１ｂｐ１３−１４．７１９の存在することまたは事実上存 在しないことを検出することを特徴とする、患者における慢性下位を椎痛、慢性 頚部を椎痛または末梢神経損傷の診断法。

５、　サンプルを、１ｂｐ１３−１４．７１９かまたはその中に必要なエピトー プを含む合成ペプチドに対する抗体が、サンプルによって捕獲される抗体捕獲イ ムノアッセイに供することを特徴とする請求項４記載の方法。

６゜　サンプルを２次元ゲル電気泳動に供し、前記を椎痛または前記神経損傷を 有していない個体からのコントロールサンプルと比較して、前記タンパク質の有 無を検出することを特徴とする請求項４記載の方法。

７、　前記の検出が、ゲルを染色して前記タンパク質を含むスポットを目視化す ることによることを特徴とする請求項６記載の方法。

８、　１ｂｐ１３−１．４．７１９タンパク質またはその必要なエピトープを含 む合成ペプチドに対する請求項１．２または３記載の抗体と、該抗体に対する標 識された抗体を含んでなる検査キットの慢性下位を椎痛、慢性頚部を椎痛または 末梢神経損傷の診断における用途。

９　（ａ）図１および２中に１２０４．１３２４．１７０２．４ｇ２Ｌ０５０８ ．３２１１．４１０９．５５２４．７６２２．６３３１．８３２２．３１５１． １３２３．５２４０．２１０５．１３１６．６１０４．７１０９．３６０６．７ １１４．７４４８．３２０３．０６０９．０６０４．７７＋１または５６１５と いう番号によって示される、図２に示される２次元ゲル電気泳動によって測定さ れたｐｌおよび相対分子量を有する、正常のコントロール患者と比較して、慢性 下位を椎痛または慢性頚部を椎痛を有する患者の血漿中に濃度が増加して存在す るタンパク質；もしくはその必要なエピトープを含む合成ペプチド：または （ｂ）前記タンパク質または前記ペプチドに対する抗体 の慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛の診断における用途。

１０、（ａ）慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛を有する患者の血漿サンプル ２０μｌを、１０％（重量／容量）ＳＤＳと２．３％（重量／容量）ＤＴＴを含 む等量の変性溶液に加え、そのサンプルを９５℃まで４分間加熱し、室温まで冷 却し、Ｏ，ＩｇＤＴＴ、０．４ｇｃＨＡＰｓ、５．４ｇ尿素、０．５ｍ１両性電 解質ｐＨ３，５〜１０および６．５ｍｌ脱イオン水を含む電気泳動溶液９６μｍ を加え、サンプルを混合し、そのサンプルの１０μｌ　（１，４７μｌの血漿を 含有）を、４％（重量／容量）（ｐＨ３，５〜１０およびｐＨ５〜７の両性電解 質の１：１混合物の）両性電解質を有し、０．０３％ジアクリロイルピペラジン で架橋された３％（重量／容量）アクリルアミドより作成した等電点電気泳動ゲ ルに供し、該ゲルで１次元電気泳動を１８０００ボルト時間、１０００ボルト１ ７時間で始めて、つぎに２０００ボルトで３０分間行ない、その１次元電気泳動 ゲルを１２．２％（重量／容量）アクリルアミド、０．２Ｍ）リス塩酸（ｐＨ８ ，０）および０．０７％（重量／容量）過硫酸アンモニウムより作成した］、６ ０ｅｍｘ２００ｃｍＸ１．５ｒｎｍのスラブゲル上での第２次元の電気泳動に供 し、ゲルあたり４０ｍＡの一定電流で７℃にて泳動を行ない、ゲルから図１中１ ｃ１２０４．１３２４、＋７０２．４８２１．０５０１１．３２１１．４１０９ ．５５２４．７６２２．６３３１．８３２２．３１５１．１３２３．５２４０゜ ２１０５．１３Ｉ６．６１０４．７１ｏ９．３６ｏ６．７１１４．７４４８．３ ２ｏ３．０６０９．０６０４．７７１１または５６１５という番号によってに示 される位置にあって、正常コントロール患者がらの対応する５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動ゲルでは濃度が減少して存在しているタンパク質を単離す ることによってえられる（が、必らずしもそうすることによりえるとは限らない ）、正常コントロール患者に比較して前記痛みを有する患者の血漿で濃度におい て増加して存在しているタンパク質；もしくはその必要なエピトープを含む合成 ペプチド；または（ｂ）前記タンパク質または前記ペプチドに対する抗体 の慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛の診断における用途。

１１、タンパク質が１２０４．１３２４．１７０２．４８２１．０５０８．３２ １１．４１０９．５５２４．７６２２．６３３１または８３２２であり、患者の サンプルに存在し、コントロールサンプルには存在しない請求項１０記載の用途 。

！２．抗体がモノクローナルである請求項９．１０または１１紀載の用途。

１３　慢性下位を椎痛または頚部を椎痛を有する疑いのある患者の体液サンプル を、２次元ゲル電気泳動またはイムノアッセイに供し、請求項９．１０または１ １に記載のタンパク質の濃度を測定することを特徴とする、患者における慢性下 位を椎痛または頚部隔部を推痛の診断法。

１４　サンプルを、前記タンパク質に対するまたはその必要なエピトープを含む 合成ペプチドに対する抗体がサンプルによって捕獲される抗体捕獲イムノアッセ イに供することを特徴とする請求項１３記載の方法。

１５　サンプルを、２次元ゲル電気泳動に供し、前記の痛みを有しない個体から のコントロールサンプルと比較してタンパク質濃度を測定することを特徴とする 請求項１４記載の方法。

１６、前記測定が、ゲルを染色し、前記タンパク質を含むスポットを目視化する ことによることを特徴とする請求項１５記載の方法。

１７、タンパク質が、１２０４．１３２４、＋７０２．４８２１．０５０８．３ ２１１．５５２４．７６２２．６３３１または８３２２であり、患者サンプルに 存在してコントロールサンプルには存在しない請求項１３．１４．１５または１ ６記載の方法。

１８、請求項９．１０．１１または１２記載の抗体と該抗体に対する標識された 抗体を含んでなる検査キットの慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛診断におけ る用途。

１９、（ａ）図１および２中に４６２４．７２１２．７３０９．７２１４．２８ ０６．５０１３．４６１４．３１５５．８３０９．８４１８．７４５５．５４１ １または７５１５という番号によって示される、図２に示される２次元ゲル電気 泳動によって測定されたｐ！および相対分子量を有する、正常のコントロールと 比較して慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛を有する患者の血漿中で濃度が減 少して存在しているタンパク質；もしくはその必要なエピトープを含む合成ペプ チド；または （ｂ）前記タンパク質に対するもしくは前記ペプチドに対する抗体 の慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛の診断における用途。

２（１，（ａ）慢性下位を椎痛または慢性頚部を椎痛を有する患者の血漿サンプ ル２０μ！を、１０％（重量／容量）ＳＤＳと２．３％（重量／容量）ＤＴＴを 含む等量の変性溶液に加え、そのサンプルを９５℃まで４分間加熱し、室温まで 冷却し、０．１ｇＤＴＴ、０．４ｇＣＨＡＰＳ、５．４ｇ尿素、０．５ｍ１両性 電解質ｐＨ３，５〜１０および６．５ｍｌ脱イオン水を含む電気泳動溶液９６μ ｌを加え、サンプルを混合し、そのサンプルの１０μｌ　（１，４７μｍの血漿 を含有）を、４％（重量／容量）（ｐＨ３，５〜１０およびｐＨ５〜７の両性電 解質の１：１混合物の）両性電解質を有し、０．０３％ジアクリロイルピペラジ ンで架橋された３％（重量／容量）アクリルアミドより作成した等電点電気泳動 ゲルに供し、該ゲルで１次元電気泳動を１８０００ボルト時間、１０００ボルト １７時間で始めて、つぎに２０００ボルトで３０分間行ない、その１次元電気泳 動ゲルを１２．２％（重量／容量）アクリルアミド、０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ ８，０）および０．０７％（重量／容量）過硫酸アンモニウムより作成した１６ ０ｃｍＸ２００ｃｍＸ１．５ｍｍのスラブゲル上での第２次元の電気泳動に供し 、ゲルあたり４０ｍＡの一定電流で７℃にて泳動を行ない、ゲルから図１中に４ ６２４．７２１２．７３０９．７２１４．２８０６．５０Ｉ３．４６１４．３１ ５５．８３０９．８４１８．７４５５．５４１１または７５１５という番号によ って示される位置にあって、正常コントロール患者からの対応する５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動ゲルでは濃度が増加して存在しているタンパク質を 単離することによってえられる（が、必らずしもそうることによりえるとはかぎ らない）、正常コントロール徹者に比較して前記の痛みの患者の血漿で濃度にお いて減少して存在しているタンパク質；または必要なエピトープをその中に含む 合成ペプチド；または （ｂ）前記タンパク質または前記ペプチドに対する抗体の、慢性下位を椎痛また は慢性頚部を椎痛の診断における用途。

２１．９ンパク質が４６２４．７２１２．７３ｏ９．７２１４．２８ｏ６または ５０１３であり、コントロールサンプルに存在して患者のサンプルには存在しな い請求項２ｏ記載の用途。

２２、抗体がモノクローナルである請求項１９．２ｏまたは２１記載の用途。

２３、前記を椎痛を有する疑いのある患者の体液サンプルを２次元ゲル電気泳動 またはイムノアッセイに供し、請求項１９．２０または２１に記載のタンパク質 の濃度を測定することを特徴とする、患者における慢性下位を椎痛または頚部隔 部を推痛の診断法。

２４、サンプルを、前記タンパク質に対するまたはその必要なエピトープを含む 合成ペプチドに対する抗体がサンプルによって捕獲される抗体捕獲イムノアッセ イに供することを特徴とする請求項２３記載の方法。

２５　サンプルを、２次元ゲル電気泳動に供し、前記の痛みを有しない個体から のコントロールサンプルと比較してタンパク質濃度を測定することを特徴とする 請求項２４記載の方法。

２６、前記測定が、ゲルを染色し、前記タンパク質を含むスポットを目視化する ことによることを特徴とする請求項２５記載の方法。

２７、タンパク質が、４６２４．７２１２．７３ｏ９．７２１４．２８ｏ６また は５０１３であり、コトロールサンプルに存在して患者サンプルには存在しない 請求項２３．２４．２５または２６記載の方法。

２８、請求項１９．２０．２１または２２記載の抗体と該抗体に対する標識され た抗体を含んでなる検査キットの慢性下位を椎痛または頚部を椎痛の診断におけ る用途。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０６ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　２７／４４７ ３３１５０　Ｔ　７０５５−２Ｊ ３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ ３３１５７７　９０１５−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　メリル、カール　アールアメリカ合衆国、２０８５０　メリー ランド州、ロックビル、ウィンダ−コート　２ Ｉ （７２）発明者　クリート、ガイ　ジョーゼフアメリカ合衆国、２２２０４　バ ージニア州、アーリントン、サウス　ジョージ　メイスン　ドライブ　１５００ 、アパートメント　２３（７２）発明者　パンダーパラトン、　ディルアメリカ 合衆国、２０００２　ワシントン、ディー　シー、エヌ　イー　セブンス　スト リート　５２５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．慢性脊椎痛または頚部痛を有する疑いがある患者からの体液サンプルを２次 元電気泳動またはイムノアッセイに供すること；および 慢性脊椎痛または頚部痛を有しない個体からのコントロールサンプルと比較して 、濃度が増加または減少してるい１種または２種以上のタンパク質を測定するこ とを含んでなる 慢性脊椎痛または頚部病の診断法。 ２．体液サンプルが、血漿または血清を含んでなる請求項１記載の方法。 ３．前記血漿を、２次元電気泳動に供する請求項２記載の方法。 ４．銀染色またはクマシープルーを用いた染色で前記タンパク質を検出する請求 項３記載の方法。 ５．デンシトメーターで密度を測定することにより濃度を定量することを含んで なる請求項４記載の方法。 ６．前記の濃度が増加しているタンパク質が、図１に示される４２１０、１２０ ４、１３１８、１３２４、１７０２、４８２１、０５０８、３２１１、４１０９ 、５５２４、７６２２、６３３１、８３２２、３１５１、１３２３、５２４０、 ２１０５、１３１６、６１０４、７１０９、３６０６、１３０５、３１４６、７ １１４、７４４８、３２０３、０６０９、０６０４、７７１１および５６１５よ りなる群から選ばれた少なくとも１つを含んでなる請求項１記載の方法。 ７．前記の密度が増加するタンパク質が、ｌｂｐ１３−１４．７１９である請求 項１記載の方法。 ８．前記の濃度が増加するタンパク質が、１３１６、１３２４、１２０４、１３ ０５、１３１８および１３２３よりなる群から選ばれた少なくとも１つを含んで なる請求項６記載の方法。 ９．前記の濃度が減少するタンパク質が、図１に示される４７３７、４６２４、 ７２１２、７３０９、７２１４、２８０６、５０１３、４６１４、３１５５、８ ３０９、８４１８、７４５５、５４１１および７５１５よりなる群から選ばれた 少なくとも１つを含んでなる請求項１記載の方法。 １０．慢性脊椎痛または頚部痛を有する疑いがある患者からの体液サンプルを２ 次元電気泳動またはイムノアッセイに供すること；および ４２１０、１２０４、１３１８、１３２４、１７０２、４８２１、０５０８、３ ２１１、４１０９、５５２４、７６２２、６３３１、８３２２およびｌｂｐ１３ −１４．７１９よりなる群から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の存在を検 出し、その少なくとも１つのタンパク質の存在により、前記患者が慢性脊椎痛を 有することを確証することを含んでなる慢性脊椎痛の診断法。 １１．体液サンプルが、血漿または血清を含んでなる請求項１０記載の方法。 １２．前記血漿を２次元電気泳動に供してなる請求項１１記載の方法。 １３．銀染色またはクマシープルーを用いた染色で前記１種または２種以上のタ ンパク質を検出する請求項１２記載の方法。 １４．前記１種または２種以上のタンパク質をウェスタンプロット法によって検 出する請求項１２記載の方法。 １５．慢性脊椎痛を有する疑いのある患者からの体液サンプルを２次元電気泳動 またはイムノアッセイに供すること； および慢性脊椎痛を有しない個体からのコントロールサンプルと比較して：４７ ３７、４６２４、７２１２、７３０９、７２１４２８０６および５０１３よりな る群から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の有無を検出し、その少なくとも １つのタンパク質がないことにより、前記患者が慢性下位脊椎痛を有することを 確証することからなる慢性脊椎痛の診断法。 １６．体液サンプルが、血漿または血清を含んでなる請求項１５記載の方法。 １７．前記血漿を２次元電気泳動に供してなる請求項１６記載の方法。 １８．前記１種または２種以上のタンパク質がないことを銀染色またはクマシー プルーを用いた染色によって検出する請求項１７記載の方法。 １９．前記１種または２種以上のタンパク質がないことを、ウェスタンブロット 法によって確証する請求項１５記載の方法。 ２０．慢性脊椎痛患者からの体液サンプルを、２次元電気泳動またはイムノアッ セイに供すること；１３１８、１２０４、１３０５、１３１６、３２０３および ３２１１よりなる群から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定する こと；および 該濃度を前もって決定した臨床相関表と比較して、１種または２種以上のタンパ ク質の増加の程度により、前記表と比較して、慢性下位脊椎痛の重篤さを決定す ることを含んでなる慢性下位脊椎痛の重篤さの決定法。 ２１．慢性脊椎痛の重篤さが、タンパク質１３１８と１３１６との平均濃度の増 加を測定することによって決定される請求項２０記載の方法。 ２２．体液サンプルが、血漿または血清を含んでなる請求項２０記載の方法。 ２３．前記血漿を２次元電気泳動に供する請求項２２記載の方法。 ２４．銀染色またはクマシープルーを用いた染色ののち密度分析を行なうことに よって、１種または２種以上のタンパク質の濃度を測定する請求項２３記載の方 法。 ２５．治療開始前の、慢性脊椎痛または頚部痛の患者からの体液サンプル中の１ 種または２種以上のタンパク質の濃度を測定すること；および 治療ののちの、同じ体液サンプルの同じ１種または２種以上のタンパク質の濃度 を測定し、 慢性脊椎痛または頚部痛を有しない個体にみられるレベルにまで、タンパク質が 比例して増加または減少することにより治療の有効性を示すことを含んでなる慢 性脊椎痛または頚部痛の治療の有効性の決定法。 ２６．体液が、血漿または血清を含んでなる請求項２５記載の方法。 ２７．前記血漿を２次元電気泳動またはイムノアッセイに供する請求項２６記載 の方法。 ２８．２次元電気泳動のゲルを銀染色またはクマシープルーを用いた染色によっ て染色する請求項２７記載の方法。 ２９．さらにデンシトメーターを用いて染色密度を測定することにより濃度を定 量することからなる請求項２８記載の方法。 ３０頚部脊椎痛を有する疑いのある患者からの体液サンプルを２次元電気泳動ま たはイムノアッセイに供すること；および ｌｂｐ１３−１４．７１９の存在を確認し、ｌｂｐ１３−１４．７１９の存在に より前記患者が頚部脊椎痛を有することを確証することを含んでなる頚部脊椎痛 の診断法。 ３１．４２１０、１２０４、１３１８、１３２４、１７０２、４８２１、０５０ ８、３２１１、４１０９、５５２４、７６２２、６３３１、８３２２、３１５１ 、１３２３、５２４０、２１０５、１３１６、６１０４、７１０９、３６０６、 １３０５、３１４６、７１１４、７４４８、３２０３、０６０９、０６０４、７ ７１１、５６１５、４７３７、４６２４、７２１２、７３０９、７２１４、２８ ０６、５０１３、４６１４、３１５５、８３０９、８４１８、７４５５、５４１ １、７５１５およびｌｂｐ１３−１４．７１９よりなる群から選ばれたタンパク 質のうち１つに対する抗体。 ３２．抗血清中に存在するポリクローナル抗体からえられた請求項３０記載の抗 体。 ３３．モノクローナル抗体である請求項３０記載の抗体。 ３４．４２１０、１２０４、１３１８、１３２４、１７０２、４８２１、０５０ ８、３２１１、４１０９、５５２４、７６２２、６３３１、８３２２、３１５１ 、１３２３、５２４０、２１０５、１３１６、６１０４、７１０９、３６０６、 １３０５、３１４６、７１１４、７４４８、３２０３、０６０９、０６０４、７ ７１１、５６１５、４７３７、４６２４、７２１２、７３０９、７２１４、２８ ０６、５０１３、４６１４、３１５５、８３０９、８４１８、７４５５、５４１ １、７５１５およびｌｂｐ１３−１４．７１９よりなる群から選ばれたタンパク 質のうち１つに対する、診断に役立つ量の抗体および該抗体に対する標識抗体を 含んでなる慢性下位脊椎痛または頚部痛を検出する検査キット。 ３５．前記抗体がポリフローナルまたはモノクローナルである請求項３３記載の 検査キット。