JPH06502757A - シグナル形質導入に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シグナル形質導入に関与する蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストと して作用する化合物の同定法発明の背景 発明の分野 本発明は、ヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結合性蛋白質（Ｇ−蛋白質） および／または第２メツセンジヤー、たとえばサイクリックアデノシン−リン酸 （ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ　）を用いる、シグナル形質導入経路に関与する蛋白質に対す るアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化学物質の同定法、ならびに Ｇ−蛋白質および／または第２メツセンジヤー、たとえばｃＡＭＰを用いる、シ グナル形質導入経路を介して作用するＧ−蛋白質結合一細胞表面レセブタ−（Ｇ ＰＣレセプター）をコードする核酸クローンの同定法に関するものである。

背景１報 ここに述べる刊行物はすべて参考として引用される。

医学的に重要な生物学的プロセスの多くがＧ−蛋白質および／または第２メツセ ンジヤー、たとえばｃＡＭＰを伴うシグナル形質導入経路に関与する蛋白質によ り仲介されることは十分に確認されている（レフコヴイッツ（Ｌｅｆｋｏｗｉｔ ｚ）（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５１：３５３−３５４）。ここではこれらの 蛋白質は、Ｇ−蛋白質を伴う経路に関与する蛋白質、すなわちＰＰＧ蛋白質と呼 ばれている。これらの蛋白質の若干の例には下記のものが含まれる：ＧＰＣレセ プター、たとえばアドレナリン作動薬およびドーパミンに対するもの（コビルカ 、ディキソン、フリーレ（Ｋｏｂｉ　ｌｋａ　Ｂ、に、、Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ。

、　Ｆｒ１ｅｌｌｅ、　Ｔ、　）ら（１９８７）　Ｐｒｏ　Ｎａｔ　ｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃ　１ＵＳＡ　８４：４６−５０；コビルカ、マツイ、コビルカ（Ｋｏｂ ｉｌｋａＢ、に、、Ｍａｔｓｕｉ、Ｈ，、Ｋｏｂｉｌｋａ　Ｔ、Ｓ、）ら（１９ ８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８：６５０−６５６；ブンゾウ、ファン・トル、グ ランディ、アルバート（Ｂｕｎｚｏｗ、Ｊ、Ｒ，、Ｖａｎ　Ｔｏｌ、Ｈ，Ｈ，Ｍ 、、Ｇｒ６　：　７８３−７８７）　、Ｇ−蛋白質自身、エフェクター蛋白質、 たとえばホスホリパーゼＣ１アデニルシクラーゼおよびホスホジェステラーゼ、 ならびにアクチュエーター蛋白質、たとえばプロティンキナーゼＡおよびプロテ ィンキナーゼＣ（シモン、ストラスマン、ガラタム（Ｓｉｍｏｎ、Ｍ、１．、Ｓ ｔｒａｔｈｍａｎｎ、Ｍ、Ｐ、、Ｇａｕｔａｍ、Ｎ、）（１９９１）　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２５２　：８０２−８）。

色素細胞に内在する数種類のＧＰＣレセプターを活性化する化学物質のバイオア ッセイ法が下記に記載されている：ネギシ（Ｎｅｇｉｓｈｉ）ら（１９８８）Ｇ ｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍ　ａｒａｔｉｖｅ　Ｅ　ｄｏｃｒｉｎｏｌ。

ヱ、７０　：１２７−１３２　；メツセンジャーおよびワーナー（Ｍｅｓｓｅｎ ｇｅｒ、Ｗａｒｎｅｒ）（１９７７）旦工、工、旦ｈａｒｍａｃｏ工且ｘヱ　６ １　：６０７−６１４．そりおよびレルナー（Ｍｏｒｉ、Ｌｅｒｎｅｒ）（１９ ６０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、６７：４４３−４５０；モラーおよびレルナ ー（Ｍｏｌｌｅｒ、Ｌｅｒｎｅｒ）（１９６６）Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ。

Ｘ上ｃａ、５１：１４９−１６０；カーターおよびシュスター（Ｃａｒｔｅｒ。

５ｈｕｓｔｅｒ）（１９７８）ニー１ｎｖ、Ｄｅｒｍａｔｏ土立又ニー　７１　 ＋　２２９−２３２；レルナー（Ｌｅｒｎｅｒ）ら（１９８８）　Ｐ、　Ｎ、　 Ａ、Ｓ、ＵＳＡ、８５：２６１−２６４；ならびにエルウィン（Ｅｒｗｉｎｇ） ら（１９９０）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　＆　Ｂｉｏｅ　ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、５ ：４４９−４５９゜ 以上に挙げた刊行物に記載された方法すべてにおいて、それらと本発明方法との 間には下記６つの主要な相異かある：（１）本発明方法は連続長期培養において 増殖しうる色素細胞に基づくものであるのに対し、上記刊行物に記載されたバイ オアッセイ法はいずれも培養において***し続ける色素細胞を利用していない。

本発明方法の利点は、無制限な数の直系の細胞をアッセイに使用しうろことであ る。これが可能でなければ、大規模の薬物スクリーニングは不可能である。

（２）本発明方法によってのみ、動物から新鮮な細胞を採取することなく既存の ものから形成された色素細胞の継続的供給源を得ることができる。

（３）本発明方法のみが、組織培養容器内で高い密度にまで増殖しうる色素細胞 を使用する。これは多数の薬物をスクリーニングしうるために重要であり、かつ これは標準ミクロタイタープレート読取り装置を用いて信頼性のある結果を得る ことができるために重要である。

（４）本発明方法は、色素細胞上の色素を分散させる内在セロトニンレセプター に作用する薬物をスクリーニングするために利用しつる。これに対し上記に挙げ た刊行物の場合、セロトニンは色素を凝集させると述べられている；たとえばメ ツセンジャーおよびワーナー（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ、Ｗａｒｎｅｒ）（１９７７ ）Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ　６１：６０７−６１４゜（５）本発明方法 は、色素細胞が天然に発現しないレセプターおよび他の蛋白質に対する薬物のア ッセイの基礎として色素細胞が用いられる、組換えＤＮＡ技術を採用する。しか し上記刊行物に記載される方法は色素細胞に内在するレセプターに限定される。

（６）上記刊行物と異なり、本発明方法のみをＧＰＣレセプターのクローニング に利用しつる。本発明方法は色素細胞の連続培養および組換えＤＮＡ技術を利用 するからである。

現在、ＧＰＣレセプターに対する新規な、より良い薬物を見出すには大きな制限 がある。すなわち化学物質がＧＰＣレセプターに作用する能力を試験するための 簡単、迅速かつ一般的な初期スクリーニング法が無い。たとえばＧｓまたはＧｉ を介して細胞内ｃＡＭＰを増加または減少させる作用をするＧＰＣレセプターを 評価するアッセイ法について考えよう。ｃＡＭＰ蓄積についてのラジオイムノア ッセイ法（ＲＩＡ）は経費がかかり、かつ緩徐であり、１人の技術者が３重試験 法で１日２０個以上の化学物質をスクリーニングするのは困難であろう（スタイ ナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）ら（１９７２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４７：１ １０６−１１１３）。一方では、現在のアデニレートシクラーゼ活性化アッセイ 法はＲＩＡより迅速であり、１人で１日に最高１５０個の試料を処理することか できる（サロモン（Ｓ　ａ　ｌ　ｏｍｏ　ｎ）ら（１９７４）Ａｎａ　ｌ　ｔ　 ｉ　ｃａ　ＩＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　５８：５４１−５４８）。しかし現在の アデニレートシクラーゼ活性化アッセイ法は数工程を必要とし、従って煩雑であ る。また両方法とも実質的な放射性物質、たとえば３２ｐまたは１２５■の使用 を伴う。

」 ′化学物質′は、薬物、化合物または分子のいずれをも包含するものであると定 義される。

′Ｇ−蛋白質結合−細胞表面レセしター’　（ＧＰＣレセプター）は、化学物質 により活性化された場合、これがヘテロトリマー型グアニンヌクレオチド結合性 蛋白質（Ｇ−蛋白質）を活性化する、いずれかの細胞表面トランスメンブラン蛋 白質であると定義される。

′Ｇ−Ｇｅ質および／または第２メツセンジヤーを伴うシグナル形質導入経路に 関与する蛋白質（ＰＰＧ蛋白質）′は、この経路に関与するいずれかの蛋白質で あると定義され、ＧＰＣレセプター、Ｇ−蛋白質、エフェクター蛋白質およびア クチュエーター蛋白質が含まれる。

′エフェクター蛋白質′は、Ｇ−蛋白質のαサブユニットにより活性化または不 活性化されるいずれかの蛋白質であると定義される。エフェクター蛋白質の若干 の例には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣおよびホスホリパーゼＡ２が 含まれる。ホスホジェステラーゼもエフェクター蛋白質であると考えられる。

′第２メツセンジャー′は、細胞間または周囲の細胞膜内におけるその濃度がエ フェクター蛋白質の活性の結果として上昇または低下する中間化合物であると定 義される。第２メツセンジヤーの若干の例には、サイクリックアデノシン−リン 酸（ＣＡＭＰ）　、ホスファチジルイノントール（ＰＩ）、たとえばイノシトー ル三リン酸（ＩＦ５）、ジアンルグリセロール（ＤＡＣ）、カルシウム（Ｃａ＋ ＋）およびアラキドン酸誘導体が含まれる。

′アクチュエーター蛋白質′は、その活性化状態が第２メツセンジヤーの結合の 結果として変化する蛋白質であると定義される。エフェクター蛋白質の若干の例 には、ブチインキナーゼＡおよびブチインキナーゼＣが含まれる。

Ｇ−蛋白質および第２メツセンシヤーｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを用いる１経路の例により 、上記の定義の概要を提示する模式図を図１に示す。

′色素細胞′とは、下記の条件を満たすいずれかの色素含有細胞を意味する（１ ）それらは、その色素細胞か特異的刺激、たとえばメラニン細胞刺激ホルモ入メ ラトニン、光などとの接触に応答してそれらの色素を凝集または分散させうるい ずれかの動物から誘導される。（２）それらはインビトロで無限に増殖すること かでき、従って無限な量の細胞が得られる。（３）本発明に用いられる色素細胞 （′被験細胞′）にはたとえば下記のクロマトフォア（色素胞）が含まれるが、 これらは限定ではない；黒色素胞またはメラニン細胞、黄色素胞、赤色液胞、白 色液胞および紅色素胞。色素細胞は進化樹において人類および鳥類より低級の動 物から採取される。本発明に用いられる色素細胞を採取しうる′より低級の動物 ′の例には下記のものが含まれるが、これらは限定ではない：爬虫類（尺！且工 ±工土且）、たとえばトカゲ（Ａｎｏｌｉｓ　ｓ　）；両生類（へ旦且丘ｉ　ｂ 　ｉ　ａ）　、たとえばアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏ　ｕｓ　１ａｅｖｉｓ） ；魚類（Ｐｉｓｃｅｓ）、たとえば（Ｚａｃｃｏ　ｔｅｍｍｉｎｃｋｉ）；甲殻 類、たとえばシオマネキ（Ｕｃａ　ｕ　ｉ　１ａｔｏｒ）；Ｍ反動物（Ｅｃｈｉ ｎｏｄｅ　ｒｍａ　ｔ　ａ）　、たとえばガンガゼ（Ｄｉａｄｅｍａ　ａｎｔｉ ｌｌａｒｕ工）および（Ｃｉｎｉｄａｒｉａ）、たとえば（Ｎａｎｏｍｓａ　ｃ ａｒａ）。

本発明に用いるために特に好ましい色素細胞は、アフリカッメガエルからの培養 された黒色素胞である（Ｐｉ　ｍｅｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（１９８５）、バグナラ（ Ｂａｇｎａｒａ）ら編、東京大学出版会、２１９−２２７頁およびレルナー（Ｌ ｅｒｎｅｒ）ら（１９８８）　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳＡ　８５：２６１ −２６４゜光盟Ω櫃！ 本発明の目的の１つは、ＰＰＧ蛋白質、特にＧＰＣレセプターに対する新規なア ゴニストおよびアンタゴニストを評価するための迅速かつ高感度のバイオアッセ イ法を開発することである。

本発明の他の目的は、ＧＰＣレセプターをコードするＤＮＡのクローニング法を 開発することである。

本発明の他の目的は、ＰＰＧ蛋白質、特にＧＰＣレセプターに対する新規なアゴ ニストおよびアンタゴニストを評価するためのバイオアッセイ法の実施に用いる キットを提供することである。

これらの目的および他の目的、意図ならびに利点が本発明により達成される。

本発明によれば、外来ＧＰＣレセプターに対するアゴニストとして作用する化学 物質、たとえば薬物の同定法か提供される。本方法は、特異的刺激に応答してそ れらの色素を分散または凝集しうる、かつＧＰＣレセプターをコードする外来ク ローンを発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外来ＧＰＣレセプターの活性化が 色素分散を誘発する場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定 する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、または外来ＧＰＣレ セプターの活性化が色素凝集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期 色素配置状態を設定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し；初期 色素配置状態に設定された被験細胞を化学物質と接触させ：そして化学物質で処 理された被験細胞において色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを判 定することよりなる。対照操作を実施することもできる。対照は上記と同じであ るが、ただし外来ＧＰＣレセプターを発現しない色素細胞を用いる。外来ＧＰＣ レセプターを発現する被験細胞において色素配置の変化か観察されるが、外来Ｇ ＰＣレセプターを発現しない対照細胞において色素配置の変化が観察されない場 合、その化学物質はその外来ＧＰＣレセプターに対するアゴニストである。

本発明によれば、外来ＰＰＧ蛋白質に対するアゴニストとして作用する化学物質 、たとえば薬物の同定法が提供される。本方法は、特異的刺激に応答してそれら の色素を分散または凝集しうる、かつＰＰＧ蛋白質をコードする外来クローンを 発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素分散を誘 発する場合は被験細胞内で色素か凝集する初期色素配置状態を設定する刺激物質 、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、または外来ＰＰＧ蛋白質の活性化 が色素凝集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色素配置状態を設 定する刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し：初期色素配置状態に設 定された被験細胞を化学物質と接触させ：そして化学物質で処理された被験細胞 において色素配置か初期色素配置状態から変化したか否かを判定することよりな る。対照操作を実施することもできる。対照は上記と同じであるが、たたし外来 ＰＰＧ蛋白質を発現しない色素細胞を用いる。外来ＰＰＧ蛋白質を発現する被験 細胞において色素配置の変化か観察されるが、外来ＰＰＧ蛋白質を発現しない対 照細胞において色素配置の変化か観察されない場合、その化学物質はその外来Ｐ ＰＧ蛋白質に対するアゴニストである。

また本発明は、外来ＧＰＣレセプターに対するアンタゴニストとして作用する化 学物質の同定法に関するものである。本方法は、特異的刺激に応答してそれらの 色素を分散または凝集しうる、かつＧＰＣレセプターをコードする外来クローン を発現しうる色素細胞系の被験細胞に、外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素分 散を誘発する場合は被験細胞内で色素が凝集する初期色素配置状態を設定する第 １刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入するか、または外来ＧＰＣレセ プターの活性化が色素凝集を誘発する場合は被験細胞内で色素が分散する初期色 素配置状態を設定する第１刺激物質、たとえば化学物質もしくは光を導入し。

初期色素配置状態に設定された被験細胞を同定すべき化学物質と接触させ：細胞 を観察してそれらの色素配置状態が変化していないことを判定し；同定すべき化 学物質と接触させた被験細胞に、外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素分散を誘 発する場合は外来ＧＰＣレセプターの活性化により色素の分散を誘発する第２刺 激物質を添加し；外来ＧＰＣレセプターの活性化が色素凝集を誘発する場合は外 来ＧＰＣレセプターの活性化により色素の凝集を誘発する第２刺激物質を添加し ；そして第２刺激物質を添加した被験細胞において色素配置が初期色素配置状態 から変化したか否かを判定することよりなる。対照操作を実施することもできる 。対照操作の１例は、外来ＧＰＣレセプターを活性化する第２刺激物質の代わり に、その外来ＧＰＣレセプターの活性化が有するものと同じ作用を色素配置に対 して有する、内在ＧＰＣレセプターを活性化する第２刺激物質を導入するもので ある。被験細胞においては色素配置の変化が観察されないが、対照細胞が実際に 色素配置の変化を生じる場合、その同定すべき化学物質はその外来ＧＰＣレセプ ターに対するアンタゴニストである。

本発明は、更に、外因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴニストとして作用す る化学物質を同定する方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を 特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つＰＰＧタンパク質をコードする外 因性クローンを発現することができる試験細胞に対して、外因性ＰＰＧタンパク 質の活性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している色素配 置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し、ま たは外因性ＰＰＧタンパク質の活性化か色素凝集を誘導する場合、色素か試験細 胞内で分散している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学 物質または光を導入し：初期状態の色素配置にある試験細胞を、同定される化学 物質と接触させ、それらの色素配置の状態か未変化のままであることを確認させ る細胞を観察し；同定される化学物質と接触した試験細胞に対して、外因性ＰＰ Ｇタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、外因性ＰＰＧタンパク質を活 性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え、または外因性Ｐ ＰＧタンパク質を活性化することが色素凝集を誘導する場合、外因性ＰＰＧタン パク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を加え；そし て第二の刺激剤が加えられた試験細胞中の色素配置が初期状態の色素配置から変 化しているかどうかを確認することを含む。対照操作も行うことができる。対照 操作の一例は、外因性ＰＰＧタンパク質を活性化する第二の刺激剤の代わりに、 色素配置に対１．て外因性ＰＰＧタンパク質の活性化が存すると考えられるのと 同一の効果を有する内因性ＰＰＧタンパク質を活性化する第二の刺激剤を試験細 胞に対して導入することである。試験細胞において色素配置に変化が見られない 場合、対照細胞は色素配置が変化しないので、同定される化学物質は外因性ＰＰ Ｇタンパク質に対するアンタゴニストである。

更に、本発明は、内因性ＧＰＣ受容体に対するアゴニストとして作用する化学物 質、例えば、黒色液胞に対して内因性であるセロトニンに関するものを同定する 方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応して 分散または凝集させ且つ内因性セロトニン受容体を発現することができる試験細 胞に対して、刺激剤、例えばメラトニンを導入し：色素凝集の初期状態にある試 験細胞を化学物質と接触させ、そして化学物質で処理された試験細胞中の色素が 分散１、ているかどうかを確認することを含む。

更に、本発明は、内因性ＧＰＣ受容体に対するアンタゴニストとして作用する化 学物質、例えば、黒色液胞に対して内因性であるセロトニンに関するものを同定 する方法に関する。その方法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応 して分散または凝集させ且つ内因性セロトニン受容体を発現することができる試 験細胞に対して、色素か試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を決定す る第一の刺激剤、例えばメラトニンを導入し；色素凝集の初期状態にある試験細 胞を、同定される化学物質と接触させ；細胞を観察して、それらの色素配置の状 態が未変化のままであることを確認し、同定される化学物質と接触した試験細胞 に対して、内因性セロトニン受容体を活性化することによって色素分散を誘導す る第二の刺激剤を加え；そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞中の色素が分 散しているかどうかを確認することを含む。対照操作も行うことができる。対照 操作の一例は、内因性セロトニン受容体を活性化する第二の刺激剤の代わりに、 活性化した場合にセロトニン受容体と同様に色素分散を誘導する別の内因性ＧＰ Ｃ受容体、例えば、ＭＳＨ受容体を活性化する第二の刺激剤を試験細胞に対して 導入することである。試験細胞において色素分散が見られない場合、対照細胞は 色素分散を行わないので、同定される化学物質は内因性セロトニン受容体に対す るアンタゴニストであると考えられる。

本発明により、更に、黒色液胞に対して内因性であるＰＰＧタンパク質、例えば 、内因性プロティンキナーゼＡ１プロティンキナーゼＣ等に対するアゴニストと して作用する化学物質を同定する方法を提供する。その方法は、色素細胞系のそ れらの色素を特異的刺激に反応して分散または凝集させ且つ内因性ＰＰＧタンパ ク質を発現することができる試験細胞に対して、ＰＰＧタンパク質の活性化が色 素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集している色素配置の初期状態を 決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し、またはＰＰＧタンパク質 の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素が試験細胞内で分散している色素配置 の初期状態を決定する刺激剤、例えば、化学物質または光を導入し；初期状態の 色素配置にある試験細胞を化学物質と接触させ、そ１〜で化学物質で処理された 二λ験細胞中の色素が初期状態の色素配置から変化し、′Ｃいるかどうかを確認 することをａ／、′。

本発明は、更に、黒色液胞に対して内因性であるＰＰＧタンパク質、例えば、内 因性プロティンキナーゼＡ１プロティンキナーゼＣ１ホスホジェステラーゼ等に 対するアンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法に関する。その方 法は、色素細胞系のそれらの色素を特異的刺激に反応１−で分散または凝集させ ｎつ内因性ＰＰＧタンパク質を発現することができる試験細胞に対して、ＰＰＧ タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、色素が試験細胞内で凝集してい る色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例えば、化学物質または光を導 入し、または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合、色素 が試験細胞内で分散している色素配置の初期状態を決定する第一の刺激剤、例え ば、化学物質または光を導入し；初期状態の色素配置にある試験細胞を、同定さ れる化学物質と接触させ；その細胞を観察して、それらの色素配置の状態が未変 化のままであることを確認し；同定される化学物質と接触した試験細胞に対して 、内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合、内因性ＰＰＧタ ンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤を加え、ま たは内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合、内因性ＰＰＧ タンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を加え、 そして第二の刺激剤が加えられた試験細胞中の色素配置が初期状態の色素配置が ら変化しているかどうかを確認することを含む。

更に、本発明は、ＧＰＣ受容体をクローン化する方法を提供する。その方法は、 カエルなどの下等動物由来て且つインビトロで増殖を続けることができる色素細 胞に対【５て、外因性核酸クローン、例えば、プラスミドベクターにおいて生し たｃＤＮＡライブリーを、任意の許容しうる方法、例えば、エレクトロポレーシ ョンによって導入することを含む。次に、その方法は、内因性ＧＰＣ受容体を活 性化することによって細胞内の色素配置の初期状態を決定する刺激剤、例えば、 化学物質または光を細胞に対して導入し：初期状態の色素配！にある細胞を、外 因性受容体を活性化する化学物質と接触させ、そ（−で色素配置が初期状態の色 素配置から変化していることによって色素配置の変化が、受容体をコードする４ 因性クローンを発現する細胞を示す、化学物質で処理された細胞を同定すること を含む。

本発明は、更に、薬剤などのある化学物質が外因性ＧＰＣ受容体に対するアゴニ ストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは １！またはそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性クローンを発現する 下等動物色素試験細胞、並びに外因性受容体の活性化か色素分散を誘導する場合 に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメ ラトニンおよび／または外因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因 性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば、光また はＭＳＨを含む。

本発明により、更に、ある化学物質が外因性ＧＰＣ受容体に対するアンタゴニス トとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１ 個またはそれ以上の容器中に、受容体をコードする外因性クローンを発現する下 等動物色素試験細胞；外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性 受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラ トニンおよび／または外因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性 受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば光； 並びに外因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に外因性受容体を活性化 することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／または外因性受容体 の活性化が色素凝集を誘導する場合に外因性受容体を活性化することによって色 素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。

更に、本発明は、薬剤などのある化学物質が外因性ＰＰＧタンパク質に対するア ゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキッ トは１ｍまたはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする外因性クローンを 発現する下等動物色素試験細胞；並びに外因性タンパク質の活性化が色素分散を 誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激 剤、例えばメラトニンおよび／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘 導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤 、例えば光を含む。

本発明により、更に、ある化学物質が外因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴ ニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキット は１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質をコードする外因性クローンを発 現する下等動物色素試験細胞：外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する 場合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤 、例えばメラトニンおよび／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導 する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺 激剤、例えば光；並びに外因性タンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に 外因性タンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤お よび、／または外因性タンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に外因性タ ンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を含む。

本発明は、更に、薬剤などのある化学物質が内因性ＧＰＣ受容体に対するアゴニ ストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは １間またはそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色素試験細胞、並び にその化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場 合に内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えば メラトニンおよび／または化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色 素凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導 する刺激剤、例えば光を含む。

本発明により、更に、ある化学物質が内因性ＧＰＣ受容体に対するアンタゴニス トとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキットは１ 個またはそれ以上の容器中に、受容体を発現する下等動物色素試験細胞、その化 学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素分散を誘導する場合に内因 性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメ ラトニンおよび／または化学物質が向けられている内因性受容体の活性化が色素 凝集を誘導する場合に内因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導す る第一の刺激剤、例えば光：並びに化学物質が向けられている内因性受容体の活 性化が色素分散を誘導する場合に、化学物質が向けられている内因性受容体を活 性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤および／または化学物質 が向けられている内因性受容体の活性化が色素凝集を誘導する場合に、化学物質 が向けられている内因性受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する第 二の刺激剤を含む。

更に、本発明は、薬剤などのある化学物質が内因性ＰＰＧタンパク質に対するア ゴニストとして作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキッ トは１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下等動物色素試験細 胞、並びに内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性 受容体を活性化することによって色素凝集を誘導する刺激剤、例えばメラトニン および／または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内 因性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する刺激剤、例えば光を含 む。

本発明により、更に、ある化学物質が内因性ＰＰＧタンパク質に対するアンタゴ ニストとじて作用するかどうかを確認するためのキットを提供する。そのキット は１個またはそれ以上の容器中に、タンパク質を発現する下等動物色素試験細胞 ；内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性受容体を 活性化することによって色素凝集を誘導する第一の刺激剤、例えばメラトニンお よび／または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因 性受容体を活性化することによって色素分散を誘導する第一の刺激剤、例えば光 ；並びに内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素分散を誘導する場合に内因性Ｐ ＰＧタンパク質を活性化することによって色素分散を誘導する第二の刺激剤およ び／または内因性ＰＰＧタンパク質の活性化が色素凝集を誘導する場合に内因性 ＰＰＧタンパク質を活性化することによって色素凝集を誘導する第二の刺激剤を 含む。

本発明に関する上記論及において、色素配置の初期状態を決定する基準は「化学 物質または光」を用いて行われることが多い。キセノプス・レヴイス（Ｘｅｎｏ ｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）由来の黒色液胞に関して研究した本発明者の経験では、 色素凝集の初期状態を決定する最も好都合な方法はメラトニンを用いることであ るが、色素分散の初期状態を決定する最も好都合な方法は光を用いることである 。これらの選択の理由は、双方の場合において、それらの効果が、色素配置に対 して反対の効果を有する刺激によって速やかにＨつ容易に克服されることによる 。このことは、全ての種類の色素胞の場合ではない。例えば、多数の魚類の黒色 液胞は、それらの色素を分散させる代わりに凝集させることによって光に反応す るが、メラトニンには全く反応しない。このような黒色液胞を本発明で用いるた めに開発したならば、別の初期刺激、例えば、色素凝集に対する光および色素分 散に対するエピネフリンが用いられるであろう。しかしながら、検定に関係する 実際の化学物質または光および色素胞にかかわりなく、その概念は同様である。

２面の固巣呈悦盟 図１はＧ−蛋白質及び第二メソセンジャー（本ケースではｃＡＭＰ）を用いたシ グナル形質導入経路の一例を示す模式図である。

図２ａはメラトニンで処理した細胞を示す写真であり、図２ｂはＭＳＨで処理し た図２ａと同じ細胞を示す写真である。

図３はＸｅユ立且且ｓ　１ａｅｖｉｓからの培養メラノフォア（メラニン保有細 胞）のスペクトル感受性を示す、光刺激の波長と相対分散％とのプロットである 。メラトニン凝集メラノフオアを、ＰＴＩ格子モノクロメータを用いて種々の波 長の光で１０分間刺激した。種々の波長に対するメラノフォアの相対感受性は、 ４６０ｎｍに対して１００％の値を与えるように調節した。

図４３及び４ｂは色素顆粒が凝集または分散されたフンフルエンド細胞により示 される不透明性の相違を比較する写真である。

図５は最初にメラトニンで色素凝集状態にセットされ次にＭＳＨで処理されたコ ンフルエントのメラノフォアを含む９６ウエルプレートのウェルによる、吸光度 と時間の変化のプロットである。

図６ａは各ウェルを異なる組合せのメラトニンとＭＳＨで処理した各ウェルを有 する９６ウエルプレートにおけるメラノフォアに関してのドーズリスポンスカー ブの写真表示であり、図６ｂはマイクロタイタープレートリーダーにより変換さ れた図６ａと同じ情報のグラフ表示である。

図７はメラノフォアが（本ケースではβ−ガラクトシダーゼをコードするｃＤＮ Ａの発現により）組換えＤＮＡを発現できることを示す写真である。

図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、メラノフォアが外来ヒトβ−２−アドレナリン性すセ プターを発現できること、及び該リセプターが刺激されたとき色素細胞がその色 素を分散させることを示す一連の写真である。

図９は色素細胞内で発現することが知られているＧ−蛋白質の異なるサブユニッ トを示す模式図である。

図１０はβ−２−アドレナリン性すセブターアゴニストアソセイの模式図である 。

図１１はβ−２−アドレナリン性すセプターアンタゴニストアッセイの模式図で ある。

図１２はα−２−アドレナリン性すセプターアゴニストアッセイの模式図である 。

図１３はα−２−アドレナリン性すセプターアンタゴニストアソセイの模式図で ある。

図１４ａ及び１４ｂは模式図である。図１４ａは細胞の仮想区域における色素配 置の初期状態を示す１図１４ｂはそのリセブターをクローンすべき薬剤で処理し た後の同区域での色素分散を示す。

図１５は、ボンへシンリセプターをコードする種々の組合せのプラスミドでの形 質転換に続いてのボンベシンに対する応答性メラノフォアの割合対ベータガラク トシダーゼ応答性メラノフォアの関係を示すグラフである。

元服の詳卵を脱型 概要 本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで連続増殖可能で、モしてＧ−蛋白質および／また は第二メツセンジャー（例えばサイクリックアデノシンモノフォスフェート（ｃ ＡＭＰ））を用いたシグナル形質導入経路に関与する蛋白質の刺激に応答して外 観を劇的に変化させることか可能な特殊な色素細胞ライブラリーの開発を利用し たものである。

出願人は、ＧＰＣリセブター及び他のＰＰＧ蛋白質を活性化または阻害する能力 について、文字通り１日に何千もの化学物質をスクリーニングするために用いる ことが可能な、正確で直接的バイオアッセイを設計した。試験可能なＧＰＣリセ ブターの例には、ベータ　２−アドレナリン性すセブター、ボンベシンリセブタ ー及びセロトニンリセプターか含まれる。試験可能な他のＰＰＧ蛋白質の例には 、アデニルサイクラーゼ及びプロティンキナーゼＣか含まれる。

本発明の主な利点は、潜在的薬剤かＧＰＣリセプターのアゴニストまたはアンタ ゴニストとして作用する能力を評価する速度を、現在の方法にくらべて非常に高 めることかできる点である。その本質において、Ｇ　Ｐ　Ｃリセプター、例えば へ−タ　２−アドレナリン性すセブターをコートするｃＤＮＡクローンを、数あ るなかの任意の標準方法例えばエレクトロポレーションにより、色素細胞に導入 する。一時的もしくは永久的に該リセプターを発現する細胞を基礎としてバイオ アッセイを行い、化学物質の該細胞に対する添加が該細胞内の色素の配置状態に いかに影響するかを観察することにより、該化学物質のベータ　２−アドレナリ ン性すセブターに対するアゴニストまたはアンタゴニストとしての能力を評価す る。同様にして、該細胞は、化学物質か既に色素細胞に存在するＧＰＣリセプタ ーのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を評価するために用い ることも可能である。最後に、該細胞は、化学物質が既に色素細胞に存在するＰ ＰＧ蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を評価するた めに用いることも可能である。

出願人はさらに、ＧＰＣリセブターをコードするｃＤＮＡのクローニング方法も 設計した。例えば、二つの公知タイプのグルカゴンリセプターが存在し、両者と もＧＰＣリセプターである（Ｗａｋｅ　ｌ　ａｍ、Ｍ、Ｊ、Ｏ，、Ｍｕｒｐｈｙ 、　Ｇ、Ｊ、　、Ｈｒｕｂｙ、　Ｖ、Ｊ、及びＨｏｕｓｌａｙ、Ｍ、Ｄ、（１９ ８６）Ｎａｔｕｒｅ、３２３　：６８−７１）　。それらの一方は、細胞内のｃ ＡＭＰレベルを調節するシグナル形質導入経路を活性化し、他方はＩＦ５のレベ ルを調節する。いずれのバスウェイも色素の分散を誘発するから、これらリセブ ターの両者は新たな方法でクローニング可能である。本発明は、色素含有細胞を 、目的リセブター（本ケースではグルカゴン）を発現する組織または細胞ライン 内に存在するｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリー（プラスミドもしくはウィル ス性）で、色素含有細胞をトランスフェクトするために、分子生物学的方法を用 いる。イメージ形成システム、例えばコンピューターガイドビデオンステムまた は写真もまた、グルカゴンに応答して色素顆粒（メラノゾーム）を分散する色素 細胞を同定するために、用いることができる。一旦反応性細胞が見つかったら、 目的リセブターをクローニングするために、いくつもの周知の方法を用いること ができる黒色液胞の培養物を得た。黒色液胞の長期連続培養物を確立した（ｊｄ ｅ（１９７４）、Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏ　、４１：３８０− ３８４）。本出願人の使用したＸｅｎｏ　ｕｓ　ａｅｖｉｓがら由来する培養物 は１００以上の細胞集団倍加数を経ており、およそ５日おきに安定に***し続け ているものである。本出願人はさらに、いくつかの精製クローンサプラインにつ いて、その成長速度、色素形成の程度、および光やメラトニンなどの刺激剤に対 する色素配列の感受性などの面を試験して性質を決定した。

刺激剤 ＧＰＣ受容体またはＰＰＧタンパク質に影響を及ぼす薬剤は黒色液胞に劇的変化 をもたらす。生きている動物、皮膚および培養細胞を用いる実験に基づいて、各 種動物からのいくつかの型の色素胞、および特に黒色液胞は、そのメラノソーム を拡散するか、あるいは凝集することによって多数の薬剤に応答することが長年 知られてきた（Ｌｅｒｎｅｒ　ａｎｄ　Ｃａ５ｅ　（１９５９）、Ｉｎｖｅｓｔ ｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、３２：２１１−２２１；Ｂｕｔｍａ ｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｚｏｏｌ、、２０８：１７−３４ ；Ｈｏｇｂｅｎ　ａｎｄ　Ｓｌｏｍｅ　（１９３１）Ｐｒｏｃ、Ｒｏｙａｌ　Ｓ 。

ｃ、Ｂ、、１０８：１Ｏ−５３）。色素拡散を誘導する化学物質の一例はメラニ ン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）を含む。一方、メラトニンは色素凝集を引き起こ す。ノルエピネフリンのようないくつかの薬剤はＸｅｎｏ　ｕｓ　１ａｅｖｉｓ のようなある型のカエルからの黒色液胞では色素拡散を誘導するが、Ｒａｎａ且 工且１且ユ互のような他の種からの黒色液胞では凝集を誘導する。Ｘ互ユ立且ｕ ｓ　１ａｅｖｉｓからの黒色液胞はベーターアドレナリン受容体を有するが、有 意な数のアルファーアドレナリン受容体を欠いており、一方Ｒａ二〇工且１ｅｎ ｓからの黒色液胞はベーター受容体もアルファー受容体ももっていることか明ら かとなった。興味深いことに、我々の黒色液胞のような１つの源からの黒色液胞 はどの受容体が発現するかという点については一定であるけれども、１つの種の 中においてもかなりの遺伝的差異かありうる。例えば、いくつかのＲａｎａｉｉ ｅｎｓにおける黒色液胞はアセチルコリンにさらすとその色素顆粒を凝集するの に対して、その他のＲａｎａ　ｉ　１ｅｎｓの黒色液胞では該化学物質に応答し ない（Ｍｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｒｎｅｒ（１９６６）、Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ、５１：１４９−１６０）。細胞内ｃＡＭＰの増加を引 き起こす薬剤は全て色素拡散を引き起こすことは知られていない（Ｒｏｚｄｚａ ｉｌ　ａｎｄ　Ｈａｉｍｏ（１９８６）、Ｃｅ１ｌ、４７：１０６１−１０７０ ；Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１ 　：　４２１２−４２１６）。

本出願人はＸｅｎｏ　ｕｓ　１ａｅｖｉｓ黒色素胞のいくつかの化学物質に応答 する能力を試験し、図２は４つの細胞に対するメラトニンおよびＭＳＨの効果を 示す。細胞を０．１ｎＭメラトニンで３０分間処理した効果を図２の左側に示し 、右側には同じ細胞を次いで１１００ｎ　ＭＳＨにさらに３０分間さらした（メ ラトニンは引き続き存在する）効果を示す。メラトニンにもＭＳＨにもさらさな かった細胞は色素凝集および拡散の程度にバラツキがある（データ示さず）。

ＭＳＨ，メラトニンおよびベータ１−アドレナリン受容体を活性化する薬剤は黒 色液胞に影響を及ぼすことが知られているが、本出願人はＸ！旦旦λ且互−１互 ｅｖｉｓからの黒色液胞がセロトニンに応答してその色素を拡散することをも発 見した。文献ではこの逆の効果を報告しているので、この発見は重要である（Ｍ ｅｓｓｅｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｒｎｅｒ　（１９７７）Ｂｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍ ａｃｏｌｏｇｙ　６１：６０７−６１４）、一方、本出願人はこれらの細胞が、 ベータ２−アドレナリン、ボンベシン（ｂｏｍｂｅｓｉｎ）または物質Ｐ受容体 選択的アゴニストのようなＧＰＣクラスに属する受容体に影響を及ぼす化学物質 の多くに対して、色素配置に何ら変化を伴う応答をしないことも発見した。本出 願人の得た結果のいくつかを表１にまとめた。

表１は、本出願人の黒色液胞において色素移動を誘導する化学物質と光のリスト の一部分を示す。

表１ 試薬　メラノソームに対する効果 Ａ、０．１ｎＭメラトニン　凝集 これに引き続き １０ｎＭ　ＭＳＨ拡散 １０ｎＭ（−）イソプロテレノール　拡散１μＭ　ノルエピネフリン　拡散 ４６０ｎｍ　光　拡散 １１００ｎ　セロトニン　拡散 １１００ｕ　メタプロテレノール　応答なし１μＭ　ボンベシン　応答なし １μＭ　物質Ｐ　応答なし １μＭ　ドーパミン　応答なし Ｂ、３ｎＭ　ＭＳＨ拡散 これに引き続き １１００ｎ　メラトニン　凝集 １００μＭ　クロニジン　応答なし １００μＭｐ−アミノクロニンン　応答なし１００μＭ　フニニレフリン　応答 なし光導入メラノソーム分散はＧ−蛋白に基づくシグナル形質導入経路によって 仲介される。アフリカッメガエル由来のメラニン保有細胞の場合では、経路には 第２のメツセンジャーとしてｃＡＭＰか用いられる。この発見は、メラニン保有 細胞中への光形質導入はを椎動物の視覚系において使用されたｃ　Ｇ　Ｍ　Ｐに 基づく系と異なる第２のメソセンンヤー系によって仲介されるという観点からみ て、驚くべきものである（Ｓｔｒｙｅｒ、　Ｌ、（１９８６）　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、　９：　８７−１１９）。　しかしながら、ここで の重要な点は、色素の細胞感光性によって、非常に簡単なやり方で細胞を色素分 散状態に固定でき、そして色素の凝集を起こす化学物質をスクリーニングするの に有用なことである。図３はアフリカッメガエル由来の培養されたメラニン保有 細胞の分光感光性を示している。メラトニンへの露光の結果である凝集した色素 を持つメラニン保有細胞は、ＰＴＩグレーティングモノクロメータ−を用いて、 様々な波長の光によって１０分間刺激された。異なる波長に対するメラニン保有 細胞の比感光性は４６０％Ｍについて１００％の値を導入るように調節された。

図３に示されるように、細胞か一定の強さである範囲の波長の光に露光される場 合、細胞は４６０％ｍの光に対して最高の感光性であり、５５０％ｍ以上の光に 対しては感光しなかった。５５０％ｍは可視領域であるから、光応答性を刺激す ることなく、メラニン保有細胞を取り扱うことは困難なことで色素配置９定員化 図４ａ及び図４ｂは、色素粒子が凝集又は分散している融合性細胞によって示さ れる不透明度の違いを比較したものである。図４ａはＯ，ｌｎＭのメラトニンで ３０分間処理した融合性メラニン保有細胞をもつ１００ｍｍの組織培養皿を示す 。図４ｂは、同数のメラニン保有細胞を含有する別の培養皿を示すが、メラトニ ンで処理した後１１００ｎのＭＳＨで３０分間処理したものである。

本発明によるメラトニン保有細胞検定は標準９６ウエルプレートリーダーで読み 取ることが出来る。化学物質が、メラトニン保有細胞内での色素の分散又は凝集 を誘因する能力は、目によって容易に認識できるが、迅速な医薬スクリーニング の為には、例えば標準９６ウエルプレートの使用による色素分散の程度定量化が 有用である。図５は９６ウエルマイクロタイタープレートの１つのウェル内で化 学的刺激に応答したメラニン保有細胞内の色素分散の結果をグラフ化して示すも のである。この曲線を得る為に、メラトニン保有細胞の融合層を有するウェルは 最初メラトニンで１時間処理された。６２０％ｍ（細胞の内因性光レセプターで は検知されない波長）の光の吸光度が決定された。次に、ＭＳＨを１１００ｎで 添加し、そしてウェルによる５２０％ｍ光の吸光度が５分間隔で１時間測定され た。

本発明によるメラトニン検定はＧＰＣレセプター及び別のＰＰＧ蛋白に作用する 化学物質対して応答する投与量を迅速に決定するために使用できる。図６は、色 素細胞にたいして内因性であるＭＳＨレセプターにより、この点を示している。

図６ａでは、各ウェルか異なるメラトニンとＭＳＨとの組み合わせで処理された マイクロタイタープレートを示す。最初の８つの異なるメラトニン投与量は、最 終濃度が０．１１−３２０ｎの範囲になるように、列毎に添加された。６０分後 、ウェルは、０．５５−１Ｏ２４ｎの範囲のＭＳＨの１２の異なる投与量のうち の１つがカラムにより与えられた。３０分後、プレートはマイクロプレートリー ダーで読み取られ、次いで固定された。固定されたプレートは図６ａの写真に示 す。一方、マイクロプレートリーダーによって決定された最下部から上部への列 を表す投与量応答曲線は図６ｂに示される。プレートリーダーは異なる濃度の化 学物質を受け入れているウェルを容易に区５りできる。

メラニン　にお蕃る　ＧＰＣレセプターのＧＰＣレセプターにおける化学物質の 影響を研究するための、メラニン保有細胞をベースとする方法論を開発する最初 の工程は、細胞内で外来ＤＮＡをどのように発現するかを決定することである。

幾つかのプロモーター及びＤＮＡのトランスフェクションのための幾つかの方法 が、外来ｃＤＮＡ類を発現する為にウェルのメラニン保有細胞において使用され るそれらの能力について、試験された。

試験されたプロモーターは、ＣＭＶ　（サイトメガロウィルス）、ＲＳＶ（ラウ ス肉腫ウィルス）、ウェル熱シヨツク、５Ｖ−４０７−リー及びウェルベータア クチンである。一方、予め評価された細胞にＤＮＡを導入する試験方法はリン酸 カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、リボフェクション及びエレクトロポ レーション（電気穿孔法）である。

（Ｈａｌｌ、Ｃ，Ｖ、、Ｊａｃｏｂ、Ｐ、Ｅ、、Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｇ、Ｍ、およ びＬｅｅ、Ｆ、（１９８３）、Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　１．Ｇｅｎｅｔ、、２：１０１ −１０９；Ｈａｒｌａｎｄ、ＲおよびＭｉｓｈｅｒ、Ｌ、（１９８８）　Ｄｅｖ ｅｌｏ　ｍｅｎｔ、１０２：８３７−８５２；Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍ、、Ｍｅｒ ｌｉｎｏ、Ｇ、Ｔ、、Ｗｉ　ｌｌｉｎｇｈａｎ、Ｍ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、（１９ ８２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、２２：６７７７−６７８１ ；５ｐａｅｔｅ、Ｒ，Ｒ，およびＭｏｃａｒｓｋｉ、Ｅ、Ｓ、（１９８５）、Ｊ ｏｕｒｎａ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　、５６：１３５−１４３；Ｓａｍｂｒ。

ｏｋ、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ　およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、（１９８ ９）　Ｍｏ１ｅｃｕ　ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２ｎｄ、ｅｄ、１６１０−１６１ ２；ＭｃＣｕｔｃｈａｎ、Ｊ、ＨおよびＰａｇａｎｏ、Ｊ、Ｓ、（１９６８）、 Ｊ、Ｎａｔ　１．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、４１：３５１−３５７；Ｗａｒｄ ｅｎ、Ｄ、およびＴｈｏｒｎｅ、Ｈ，Ｖ、（１９６８）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ。

、、３：３７１−３７７；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｐ、Ｌ、、Ｇａｄｅｋ、Ｔ、Ｒ，。

Ｈｏ１ｍ、、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、８４ニア４１３−７４１４：Ｂｏｇｇｓ、Ｓ、Ｓ、Ｇｒｅｇｇ、Ｒ 。

Ｇ、、Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｎ、およびＳｍ１ｔｈｉｅｓ、Ｏ，（１９８６） 、Ｅｘ　、Ｈｅｍａｔｏ　、、１４：９８８−９９４）最良の組み合わせは、初 期のｃＤＮＡの発現をもたらすＣＭＶプロモーターをエレクトロポレーションに よって使用することであると思われる。図７には、ＣＭＶプロモーターの後ろに ベータガラクトシダーゼをコードする１ａｃＺ遺伝子を含むプラスミドを色素細 胞に導入するためにエレクトロポレーションを用いる例が示されている。サイト ブラズム内でＸ−ｇａｌ染色によるベータガラクトシダーゼの可視化を助けるた めに、細胞は予めメラトニンで処理される。この具体的試験でのトランスフェク ションの有効率は６３％であった。試験の平均では、有効率は３７％であった。

薬剤のスクリーニングに用いる色素細胞ｃＤＮＡ表示システムを明らかにする際 の次の工程は、Ｇ−タンパク質に基づく信号形質導入経路を活性化しかつ一般に ヒトによって発現される特徴のある７つのトランスメンブランドメインレセプタ ーが、ウェルの黒色液胞で適切に発現できることを証明するものであった。本出 願人等は、ウェルの色素細胞が、ベータ２−レセプター特異的薬剤であるメタプ ロテレノールに反応しないことを知っていたので（表１参照）、この重要なポイ ントを評価するために、ヒトベータ２−アドレナリン性レセプターを選んだ。

２つの基準を満たさなければならなかった。第１に、レセプターは、有意な数の 細胞によって発現されなければならなかった。第２に、トランスフェクトされた 細胞によって発現されるレセプターは、内在性のＧに結合することができなけれ ばならなかった。

図８は、前記の基準１及び２を満たしたことを証明している。第１のパネルでは 、ＣＭＶプロモーターの後ろに配置されたヒトベータ２−レセプターに４０μｇ のプラスミドコードを用いる、エレクトロボーレイジョン実験において、２日早 くトランスフェクトされた色素細胞が示されている。ここで、細胞は１０ｎＭメ ラトニ　で６０分間処理して色素を凝集させた。第２のパネルは、以下のように して何回も露光して得た同一範囲の細胞を示す。

第１に、細胞を赤色光にさらすが、カメラ内のフィルムは前進させなかった。

第２に、細胞を１μＭのメタプロテレノールで３０分間処理した。第３に、細胞 を白色光にさらした。

メタプロテノールに反応して色素を分散させたどの細胞も、白色光がフィルムに 当たるのを妨げるが、赤色光は通過させた。この結果、メタプロテレノールに反 応して色素を分散させた細胞は、中心が黒ずんだ赤色となった。

一方、ベータ２−レセプタープラスミドを受け入れなかったどの細胞も、メタプ ロテレノールに反応して色素を分散させることはなく、従って、これらの細胞は 、赤色及び白色の光にさらしたフィルムのどの領域も白色となったので、小さな 黒っぽいスポットとなっただけである。最後のパネルは、同じ細胞を示すが、メ タプロテレノールで処理した後、１回露光したものである。この実験では、メタ プロテレノールに反応する能力を得た細胞の割合は、出願人等の平均トランスフ ェクション効率と同じであった。このことは、人間から本来誘導されたレセプタ ーが、ウェルの色素細胞内のＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路に機能的に結 合することができることを証明している。

出願人等はまた、他のＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路が、いくつかの基準 に基づいてウェルの黒色素胞内の色素のトランスロケーションを制御しうろこと も証明した。第１に、細胞は図９に示すように、多数の異なるＧ−タンパク質を 有する。実際、色素細胞は各種類からの多数のＧ−タンパク質を有する。第２に 、３つの他の外来性のＧＰＣレセプターが、ウェルの黒色素胞内で示された（デ ータは示さない）。これらには、セロトニン、ボンベシン及びサブスタンスＰに 対するレセプターが含まれる。いずれの場合も、適当なアゴニストを添加すると 色素の分散を引き起こした。これらの研究の重要なことは、ボンベシン及びサブ スタンスＰレセプターの効果はＧ−タンパク質仲介信号形質導入経路を経て働く ものであるが、これらは、ベータ２−アドレナリン性レセプターが用るものとは 異なるものを用いていることである。第３に、カルシウムイオノフオアＡ２３１ ８７（ブレスマン、Ｂ、Ｃ，（１９７６）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　、４５　：　５０１−５３０）も色素分散を引き起こす（データは示さ ない）。第４に、タンパク質キナーゼＣを刺激することが知られている薬剤ＴＰ Ａが色素分散を引き起こす（データは示さない）。

トランスフェクションによって色素細胞内で示されるどのＧＰＣレセプターも、 色素分散を引き起こすことが可能であるはずである。上述のように、色素細胞は 多くの外来性Ｇタンパク質を有する。それらの全てが、ＧＰＣレセプターを細胞 内の色素トランスロケーションメカニズムに結び付けるものではないが、それら の多くはそうであるにちがいない。また、黒色素胞内のＧＰＣレセプターを示す のに用いられる組み換えＤＮＡ法の種類で外来性のものを示すことによって、さ らに別のものも加えることができる。最後に、色素のトランスロケーションに導 くＧ−タンパク質に基づく経路に対して、色素のトランスロケーションに導かな いＧ−タンパク質に基づく経路に一般につながるＧＰＣレセプターにすることが できる架空のＧ−タンパク質を、試験官内でつくり、そして黒色素胞内で示すこ とが可能である。これらの点の重要なことは、色素トランスロケーションを調節 する信号形質導入システムに細胞をつなぐことができるＧ−タンＩくり質を発現 するように細胞がつくられているとき、どのＧＰＣレセプターも、刺激を加えた ときに色素のトランスロケーションを引き起こすことができることである。

ＧＰＣレセプターに・　る　在・なアゴニスト　びアンタボ：、Ｘ）−＋９るた めのバイオアッセイ 本発明のバイオアッセイ法の予備工程は、アフリカッメガエル（ｆｉｓ　１ａｅ ｖｉＳ）からの黒色素胞内で外来性ｃＤＮＡを発現させることである。明確にす るために、ヒトベータ２−アドレナリン性レセプターを例として用いる。しかし なから、この記載は、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン−絨毛性コナドト ロピン、ドパミン及びヒスタミンレセプター等のような、コードＤＮＡをクロー ン化した多くのＧＰＣレセプターに、等しく十分に適用される。同様に、グルカ ゴンの場合のように、クローンが他のＧＰＣレセプターに利用できれば、アッセ イは以下のように説明される。

斉一　び、プロセスの　− ＧＰＣレセプター及び他のＰＰＧタンパク質に作用する薬剤を見いだすための、 及びＧＰＣレセプターをクローン化するための技術は、薬学及び生物学いずれに とっても重要なことである。本発明の方法は以下のものを提供する：（１）ＧＰ Ｃレセプター及び他のＰＰＧタンパク質に作用する新しい薬剤を素早くかつ注意 深くスクリーニングする有効な方法、及び（２）新しいＧＰＣレセプターをクロ ーン化するための、及びレセプターがどのように作用するかを厳密に調べるため の有効な方法。追加のＧＰＣレセプター遺伝子を特徴づけそして特定部位の突然 変異誘発を用いてそれらを分析するので、これらのレセプターに働く基本的なメ カニズムについての詳細な知識が得られる。これらのレセプターに働く基本的な メカニズムについての根本的な知識は、有望な新薬をいかに開発するがを理解す る際に、大いに用いられる。

本発明また、食品又は血液もしくは尿のような体液中の麻酔薬、例えばコカイン 、ヘロイン、モルフイン又はアヘン誘導体のような薬剤の試験に用いることもｉ 　、２５＜　、−を　ヒトベータ２−アドレナリン　レセプター又（鱈１のＧＰ Ｃレセプターに、　る潜在的アゴニストを・　るためのバイオアッセイβ２−ア ドレナリン性レセプターを刺激する新薬をスクリーンするために、レセプターを 発現する組み換えメラニン含有細胞及びレセプターを発現しない非組み換えメラ ニン含有細胞を、図１０に示す何組かの組織培養穴にセットする。全ての穴を０ ．１１−１ｎメラトニンで処理して、細胞内色素凝集を生じさせる。

メラトニンの濃度は、イソプロテレノール（メラニン含有細胞外来性ベータ１− アドレナリン性レセプターを刺激する）又はＭＳＨの少量の投与で、容易に低下 させることができる。

図１０の欄１にあるように、メタプロテレノールのような選択的ベータ２−レセ プターアゴニストを、正のコントロール物質として用いる。この場合、ベータ２ −レセプターを含む細胞を含有する穴は、色素の拡散により黒っぽく変化する。

試験を行う薬剤を同時に、図１０の欄２及び３に示すように、他の組の穴に入れ る。これらの穴にはそれぞれ、ベータ２−レセプターを発現するメラニン含有細 胞及び非組み換え親細胞が含まれている。

潜在的に関心のある薬剤は、メタプロテレノールのように、組み換え細胞内に色 素の拡散を引き起こすが、標準的なものには作用しない。

有望な薬剤を識別したら、これをさらに少なくとも２つの方法で特徴づける。

第１に、色素の分散を引き起こす様々な濃度での速度を、メタプロテレノールの ような確立された薬剤の場合の用量反応と比較することができる。そして第２に 、他のＧＰＣレセプターを表すメラニン含有細胞が得られたら、これらのレセプ ターについての特異性度対交差反応性を確かめることができる。

ベータ２−アドレナリン性レセプターを拮抗する新薬をスクリーンするために、 レセプターを発現するメラニン含有細胞及びレセプターを、図１１に示す並列の 何組かの組織培養穴にセットする。ベータ２−アドレナリン性レセプターアゴニ ストを識別する戦略を用いるので、全ての穴に、０．１１−１ｎメラトニンを加 えて、細胞内色素凝集を生じさせる。プロプラノロールのようなベーターアドレ ナリン性レセプターを、正のコントロール物質として用いる（欄１）。ベータレ セプター遮断薬は、ベータ２−アドレナリン性レセプター選択性刺激物のメタプ ロテレノールの添加後、細胞が色素を分散するのを妨げる。試験を行う新薬は他 の組みの穴に用いる。

有望な薬剤は、プロプラノロールのように、メタプロテレノールに反応して色素 が分散するのを妨げるが、欄２及び３に見られるように細胞上の別のＧＰＣレセ プターを刺激するＭＳＨのような薬剤によって引き起こされる色素の黒ずみを妨 げないものである。負のコントロール物質は、問題の薬剤が単に細胞の損傷によ って色素の分散を妨げているのではないことを確認するために、そしてまたメタ プロテレノールによって引き起こされる色素の分散の遮断か、ベータ２−アドレ ナリン性レセプターを越えたｃＡＭＰカスケードでのいくらかより基本的なレベ ルで生じているのではないことを確かめるために用いる。後者の例は、アデニレ ートシクラーゼを直接阻害する薬剤である。興味のある薬剤を見いだしたら、新 しいベータ２−アドレナリン性レセプターアゴニストを評価する場合に説明した ように、さらに、レセプター特異性及び効能について特徴づける。

大施刑旦：第３バイオアッセイ 活　が　、を　くヒトα２−アドレナリン　レセプター又は号１のＧＰＣｒｉｎ ｏｌｏ　１６：　１４７−１５６）アルファ２−アドレナリン受容体を刺激する 新しい薬剤をスクリーニングするために、アッセイは明るいウェルの代わりに暗 いウェルで始める点を除いてベータ−２〜アドレナリン受容体アゴニストの記載 とほとんど同一である。受容体を発現する組み換え、および受容体を欠く非組み 換えメラニン保有細胞は、図１２に概略されるように平行な組繊培養ウェルの組 にて準備された。すべてのウェルは光に暴露されるかまたは少量のＭＳＨのよう な薬剤を与えられて細胞内色素分散を誘導する、ｐ−アミノクロニジンのような アルファ２−アドレナリン受容体選択的アゴニストは陽性対照として役立つ。

メラトニンの効果のように、ｐ−アミノクロニジンは組み換え細胞を誘導してそ れらのｃＡＭＰの細胞内濃度を低め、それらのメラノソームを凝集させるべきで ある、試験される薬剤をその他のウェルの組に適用し、その中の幾つかは組み換 えメラニン保有細胞を含有し、およびその中の幾つかはカラム２および３に表さ れる標準物質を含むであろう。

興味深い薬剤はアルファ２−アドレナリン受容体陽性細胞中で色素凝集を誘導す るが、親細胞に影響を及ぼさないものである。ベーター２−受容体アゴニストを 評価するための章に記載にされるように潜在的に有用な薬剤はその受容体特異性 および効力に関してさらに特性決定され得る。

４　第４パイオアンセイ ヒトアルファ２−アドレナリン受容体えな住丈のに左肩１ヒビおす１１丈うひと つのＧＰＣＪ″６　についての　アンタゴニストを・　るためのバイオアルファ ２−受容体に拮抗する新しい薬剤に関するアッセイは図１３に概略されたアルフ ァ２−受容体を発現する組み換えメラニン保有細胞を含有するウェルで（光を暗 くされた）かまたはＭＳＨのような薬剤を含有するウェルで始まる。ラウウォル シン（ｒａｕｗｏｌｓｃｉｎｅ）のようなアルファ２−受容体アンタゴニストは １色素凝集を誘導することからアゴニストｒアミノクロニジンを保護するので陽 性対照として役立つであろう、新しい物質を平列ウェルに供し、有力な目的薬剤 はラウウォルシンのようにｒアミノクロニジンを遮断するが色素凝集を誘導した メラトニンではない。以前のように、有望分子の選択性および効力はベーター２ −アドレナリン受容体アゴニストの評価の場合において記載されたようにさらに 特徴つけられる。

内因性セロトニン受容体を刺激する新しい薬剤に関してスクリーンするためにメ ラニン保有細胞を組織培養ウェルの組上に準備する。すへてのウェルは０　、１ １−１ｎのメラトニンで処理し、細胞内色素凝集を誘導する。メラトニンのこの 濃度はイソプロテレノール（メラニン保有細胞内因性ベータ−１アドレナリン受 容体を刺激する）またはＭＳＨのような少量の薬剤投与で容易に克服される。セ ロトニンはウェルを色素凝集により暗くすることにより陽性対照として役立つ、 試験された薬剤は、同時に他のウェルの組にも適用された。効果の面で興味深い 薬剤は、セロトニンのように細胞中で色素分散を誘導するものである。有望な薬 剤が同定されると、セロトニンのように確立された薬剤に関する投与反応と比較 して。

色素分散を誘導する種々の濃度での早さによりさらに特徴つけられ得る。

有望化合物に関する特異性の対照としてセロトニン受容体アンタゴニストを有望 化合物の添加に先立ち加える事かできる。この時有望化合物の添加に引き続き色 素凝集か避けられたら新しい化合物はセロトニン受容体に対する特異的アゴニス トであろう。

これまでに記載されたすべてのアッセイについて、内因性ＧＰＣ受容体を一時的 または永久に発現するメラニン保有細胞および他のＰＰＧタンパク質を使用でき ることが明らかである。

６：ＧＰＣタンパク　をコード　るｃＤＮＡクローンのカエルメラニン保有細胞 はｃＤＮＡライブラリーの迅速なスクリーニングによすＧＰＣ受容体に関するク ローニング方法の基礎を形成できる。ＧＰＣ受容体をクロ−ニングするための鍵 は５目的受容体をコードするものを見いだすためにライブラリーから任意のｃＤ ＮＡクローンを迅速にスクリーニングすることができるようになることである。

ここで、マウスボンベシン受容体を使用して、いかに１回の実験で少なくとも１ ０．０００クローンをスクリーニングできるか、ならび例えばにこの系を使用し ていかにして新しいＧＰＣ受容体をクローン化するかを提供する。

ボンベシン受容体を使用するこの実施例において、二つの組のプラスミドを利用 する。第一のプラスミドはＣＭＶプロモーターの後ろにボンベシン受容体をコー ドするｃＤＮＡを含み、一方第二のプラスミドはボンベシン受容体のひとつに位 置するマーカー遺伝子ベーターガラクトシダーゼをコードするｃＤＮＡを含有す る。プラスミドは種々の相対濃度で一緒に混合されて、各粗金４０μｇのプラス ミドを産するが各含量は異なる。ひとつの極端な場合において、ボンベシン受容 体をコードするプラスミドのみが存在する。他の混合物はボンベシン対ベーター ガラクトシダーゼに関するプラスミドを１・９９および１：９９９９で含む。

種々のプラスミド混合物を別個のメラニン保有細胞の組に電気的に流入させ。

次に別個の組繊培養プレートに撒く、各回は、一度１０ｎＭメラトニンで３０分 インキユベーシッンして処理され１次に写真的または例えばサイエンティフィッ クイメージングシステム（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅ ｍ：Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ　Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）のようなコンピュータ制御画像 システムを使用して目動的に走査される。

次にボンベシンを加えてさらに３０分後に、第二写真を第一の物について二倍露 光して取るか、または第二の別個ビデオ画像を得る。

写真的方法を使用する場合は、結果は図８に見られるもののようになり、ここで 試験リガンドに反応する細胞は赤く現れる。ビデオシステムを使用する場合には 第一画像は第二から引かれる。この研究の図式的例は図１４により提供される図 １４ａは、殆ど全てのベーターガラクトシダーゼに関するプラスミドを含有する プラスミド混合物でトランスフェクトし１次に数日後にメラトニンで処理した細 胞の仮説領域を示す、小さな点は凝集した色素をもつメラニン保有細胞であり一 方大きいものはメラトニンには何らかの理由で反応しない分散したメラノソーム を持つ擬似細胞によりつくられたバックグラウンドノイズを表す。

図１４ｂはボンベシン添加後の細胞の同じ領域を表す１画像は元の画像のネガテ ィブである１図式１４ａおよび１４ｂの斜線の箱は、絵を整列させる目的で提供 される。同様なマーカーは現実の組織培養プレートの表面に置かれ、コンピュー ターが領域を一致させることができるようようにする。二つの絵を並べることに よって１図１４ｂには裸眼またはコンピューターによってさらに一つの大きな点 を観察することが容易にできる。ボンベシン反応細胞が同定された時、加えた薬 剤を洗い流し、メラトニンおよびボンベシン処理を繰り返し、そして写真および ビデオ法が再び同じ細胞を見いだすことにより再確認することができる。

上記のように設計された実験の実際の組からのデータは図１５に表わされる。グ ラフから３つの点を作ることができる。第−且つ最も重要にはボンベシン受容体 をコードするプラスミドを少なくとも１０．０００倍に希釈して、なおボンベシ ンに反応する色素細胞を見いだすことが可能である。特に、ここで討論された具 体的実施例では、ボンベシン受容体をコードするプラスミドが１０．０００個の うち１個存在する時、ボンベシン受容体細胞の頻度は５００個のうちの１個であ った。第二に。

バックグラウンドノイズ、即ち、任意に与えられた３０分の実験中に自発的に色 素を分散する細胞の分画は１０，０００個に１個であり真の信号より２０倍低い 、第三に、実験を実施する時間中その自然な色素分散をするｉｏ、ｏｏｏ個のう ち１個の細胞のバックグラウンドノイズ上に見ることができる１０．０００倍に 希釈したプラスミドからの信号の理由は高希釈プラスミドでの曲線の形から理解 できる。これは外来ＤＮＡを発現できる細胞は約１００の異なるプラスミドを発 現し、ただ１つでは無いということを示している。これはＧＰＣレセプターをコ ードするプラスミドである時最高１０．０００個のｃＤＮＡクローンが一回の実 験操作でスクリーンできることを意味すると思われる。

ＧＰＣ受容体をクローニングするためのアッセイ用色素細胞を使用するために。

幾つかの基本的考察か関連する。第一にｃＤＮＡライブラリーをたとえばインビ トロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐｃＤＮＡｌのような多くの任意の標 準真核発現プラス、ミド中に構築できる。第二に、ライブラリーを作成するため の組織または細胞の選択は目的のＧＰＣ受容体を発現する任意のもので有り得る 。第三に、ｃＤＮＡライブラリーからのクローンの種々の組でトランスフェクト した細胞のさらなる組から集めた単純なデータにより１０．０００クロ一ン以上 の多くをスクリーンできる。

ＧＰＣ受容体のクローンを単離するために、いくつかの可能な方法を採用できる 。ひとつの例は分画法である。陽性信号が観察されたら、はじめに１０．０００ クローンのプールを生じた細菌性コロニーを例えば各１　、０００クローンのよ うなより小さなプールに副分割する。これらを増殖させ、プラスミドが単離され ならびに各々の組が再試験される。プールが陽性信号を与えた時、それを再び副 分割し、単一クローンが同定されるまでこの工程を繰り返す、Ｇ−タンパク質に 結合する受容体をクローンするためにプールスクリーニング法が使用できること はよく実証されている（Ｊｕｌｉｕｓ、Ｄ、、　ＭａｃＤｅｒｍｐｔｔ、Ａ、Ｂ 、、Ａｘｅｌ、Ｒ，ａｎｄ　Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｔ、Ｍ、　（１９８８）：セ鴻g ニンＩＣ受容体をコードする機能性ｃＤＮＡの分子特性決定”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃ ＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　５ｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｌｃ　Ｒｅｃｅｐｔ ｏｒ：@５ｃｉｅｎｃｅ ２４１　：５４５８−５６４）。

本明細書は説明のための実例により説明され限定ではなく、種々の改良および変 更は本発明の精神を逸脱することなくなされ得ることか理解されるであろう。

浄１（内容に１更なしン 第２メツセンジヤーとしてのＣＡＭＰを伴なうＧ蛋白質と結合したりセプター経 路 細胞効果◆日◆　第２メツセンジヤーの形成ＦＩＧ、１ 波　長（ｎｍ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、　２Ａ　ＦＩＧ、　２８ ＦＩＧ、　４Ａ　ＦＩＧ、　４Ｂ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、５ １　０．１　０．０１　０．００１　０α）０１浄書（内容に変更なし） ｎＭ　ＭＳ）−１ ０−・・１１３タト婁 ＦＩＧ、６Ａ ＭＭＳＨ ＦＩＧ、６Ｂ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　８Ａ　ＦＩＧ、　８８　ＦＩＧ、　８Ｃ浄書（内容に変更なし） ４０　５０　６０　７０　８０　９０　＋００アミノ酸配列の同一性（％） ＦＩＧ、９ 浄書（内容に変更なし） プロプラノロール　試験化学物質　試験化学物質浄書（内容に変更なし） α２　アコ゛ニストアッセイ ＦＩＧ、１２ 浄書（内容に変更なし） α２　アンタコ“ニストアッセイ １０ｎＭＭＳＨを与えられた α２リセプター発現細胞 ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、　１４Ｂ 手続補正書 平成５年８月３日輪

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の刺激に応答して色素を分散もしくは凝集させる能力及びＧＰＣリセプ ターをコードする外来クローンを発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細 胞に、外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には該試験細 胞内で色素が凝集するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し、あ るいは外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には該試験細 胞内で該色素が分散するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し該 初期色素配置状態にセットされた試験細胞を試験化学物質と接触させ；そして該 化学物質で処理された試験細胞内の色素配置が初期色素配置状態から変化したか 否かを調べ、外来ＧＰＣリセプターを発現する該試験細胞内に観察される色素配 置の変化を、該化学物質が該外来ＧＰＣリセプターのアゴニストであることを示 唆するものとすることよりなる；ＧＰＣリセプターに対するアゴニストとして作 用する化学物質を同定する方法。
2. ２．試験細胞が、Ｘｅｎｏｐｕｓ１ａｅｖｉｓのメラノフォアであり、そして刺 激が化学物質または光である、請求項１記載の方法。
3. ３．外来リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激がメラトニン であり、または外来リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には刺激が 光、メラノサイト刺激ホルモンまたはベータ１−アドレナリン性リセプターアゴ ニストである、請求項１記載の方法。
4. ４．特定の刺激に応答して色素を分散または凝集する能力を有し且つ該リセプタ ーをコードする外来クローンを発現しないコントロール細胞に、外来ＧＰＣリセ プターの活性化が色素の分散を誘発する場合には該コントロール細胞内で色素が 凝集するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し、あるいは外来Ｇ ＰＣリセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には該コントロール細胞内 で該色素が分散するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し；該初 期色素配置状態にセットされたコントロール細胞を試験化学物質と接触させ；そ して該化学物質で処理されたコントロール細胞内の色素配置が初期色素配置状態 から変化したか否かを調べ、該化学物質と接触したコントロール細胞内の色素配 置に変化が観察されず試験細胞には変化が見られるときは該化学物質が外来ＧＰ Ｃリセプターのアゴニストであるとみなす、工程からなるコントロール操作をさ らに含む、請求項１記載の方法。
5. ５．特定の刺激に応答して色素を分散もしくは凝集させる能力及びＧＰＣリセプ ターをコードする外来クローンを発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細 胞に、外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には該試験細 胞内で色素が凝集するような色素配置の初期状態をセットする第一の刺激を導入 し、あるいは外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には該 試験細胞内で該色素が分散するような色素配置の初期状態をセットする第一の刺 激を導入し；該初期色素配置状態にセットされた試験細胞を同定すべき化学物質 と接触させ；該細胞を観察して色素配置の状態が変化していないことを調べ；同 定すべき化学物質と接触させた該試験細胞に、外来ＧＰＣリセプターの活性化が 色素の分散を誘発する場合には外来ＧＰＣリセプターの活性化により色素の分散 が誘発されるような第二の刺激を加え、あるいは該外来ＧＰＣリセプターの活性 化が色素の凝集を誘発する場合には該外来ＧＰＣリセブターの活性化により色素 の凝集が誘発されるような第二の刺激を加え；そして第二の刺激を加えた試験細 胞内の色素配置が初期色素配置状態から変化したかどうかを調べることよりなる 、ＧＰＣリセプターのアンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法。
6. ６．試験細胞が、Ｘｅｎｏｐｕｓ１ａｅｖｉｓのメラノフォアであり、そして刺 激が化学物質または光である、請求項５記載の方法。
7. ７．外来リセプターの活性化が色素の分数を誘発する場合には第一の刺激がメラ トニンであり、または外来リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には 第一の刺激が光、メラノサイト刺激ホルモンまたはベータ１−アドレナリン性リ セプターアゴニストである、請求項５記載の方法。
8. ８．特定の刺激に応答して色素を分散もしくは凝集させる能力及びＧＰＣリセプ ターをコードする外来クローンを発現する能力を有する色素細胞ラインのコント ロール細胞に、外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には 該コントロール細胞内で色素が凝集するような色素配置の初期状態をセットする 第一の刺激を導入し、あるいは外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の凝集を誘 発する場合には該コントロール細胞内で該色素が分散するような色素配置の初期 状態をセットする第一の刺激を導入し；該初期色素配置状態にセットされたコン トロール細胞を同定すべき化学物質と接触させ；該細胞を観察して色素配置の状 態が変化していないことを調べ；同定すべき化学物質と接触させた該コントロー ル細胞に、外来ＧＰＣリセブターの活性化が色素の分散を誘発する場合には内因 ＧＰＣリセプターの活性化により色素の分散が誘発されるような第二の刺激を加 え、あるいは該外来ＧＰＣリセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には 内因ＧＰＣリセプターの活性化により色素の凝集が誘発されるような第二の刺激 を加え；そして第二の刺激を加えたコントロール細胞内の色素配置が初期色素配 置状態から変化したか否かを調べ、コントロール細胞内の色素配置が変化し試験 細胞に変化が見られない場合は第一の刺激は該外来リセプターに対する特異的ア ンタゴニストであるとみなす、工程からなるコントロール操作をさらに含む、請 求項５記載の方法。
9. ９．特定の刺激に応答して色素を分散もしくは凝集させる能力及びＰＰＧ蛋白質 をコードする外来クローンを発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細胞に 、外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には該試験細胞内で色 素が凝集するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し、あるいは外 来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には該試験細胞内で該色素 が分散するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し；該初期色素配 置状態にセットされた試験細胞を試験化学物質と接触させ；そして該化学物質で 処理された試験細胞内の色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを調べ 、外来ＧＰＣリセプターを発現する該試験細胞内に観察される色素配置の変化を 、該化学物質が該外来ＧＰＣリセプターのアゴニストであることを示唆するもの とすることよりなる；ＰＰＧ蛋白質に対するアゴニストとして作用する化学物質 を同定する方法。
10. １０．試験細胞が、Ｘｅｎｏｐｓ１ａｅｖｉｓのメラノフォアであり、そして刺 激が化学物質または光である、請求項９記載の方法。
11. １１．外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激がメラト ニンであり、または外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には 刺激が光、メラノサイト刺激ホルモンまたはベータ１−アドレナリン性リセプタ ーアゴニストである、請求項９記載の方法。
12. １２．特定の刺激に応答して色素を分散または凝集する能力を有し且つ該ＰＰＧ 蛋白質をコードする外来クローンを発現しないコントロール細胞に、外来ＰＰＧ 蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には該コントロール細胞内で色素が 凝集するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し、あるいは外来Ｐ ＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には該コントロール細胞内で該 色素が分散するような色素配置の初期状態をセットする刺激を導入し；該初期色 素配置状態にセットされたコントロール細胞を試験化学物質と接触させ；そして 該化学物質で処理されたコントロール細胞内の色素配置が初期色素配置状態から 変化したか否かを調べ、核化学物質と接触したコントロール細胞内の色素配置に 変化が観察されず試験細胞には変化が見られるときは該化学物質が外来ＰＰＧ蛋 白質のアゴニストであるとみなす、工程からなるコントロール操作をさらに含む 、請求項９記載の方法。
13. １３．特定の刺激に応答して色素を分散もしくは凝集させる能力及びＰＰＧ蛋白 質をコードする外来クローンを発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細胞 に、外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には該試験細胞内で 色素が凝集するような色素配置の初期状態をセットする第一の刺激を導入し、あ るいは外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には該試験細胞内 で該色素が分散するような色素配置の初期状態をセットする第一の刺激を導入し ；該初期色素配置状態にセットされた試験細胞を同定すべき化学物質と接触させ ：該細胞を観察して色素配置の状態が変化していないことを調べ；同定すべき化 学物質と接触させた談試験細胞に、外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘 発する場合には外来ＰＰＧ蛋白質の活性化により色素の分散が誘発されるような 第二の刺激を加え、あるいは該外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発す る場合には該外来ＰＰＧ蛋白質の活性化により色素の凝集が誘発されるような第 二の刺激を加え：そして第二の刺激を加えた試験細胞内の色素配置が初期色素配 置状態から変化したか否かを調べることよりなる、ＰＰＧ蛋白質のアンタゴニス トとして作用する化学物質を同定する方法。
14. １４．試験細胞が、Ｘｅｎｏｐｕｓ１ａｅｖｉｓのメラノフォアであり、そして 刺激が化学物質または光である、請求項１３記載の方法。
15. １５．外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には第ーの刺激が メラトニンであり、または外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場 合には第一の刺激が光、メラノサイト刺激ホルモンまたはベータ１−アドレナリ ン性リセプターアゴニストである、請求項１３記載の方法。
16. １６．特定の刺激に応答して色素を分散もしくは凝集させる能力及びＰＰＧ蛋白 質をコードする外来クローンを発現する能力を有する色素細胞ラインのコントロ ール細胞に、外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には該コン トロール細胞内で色素が凝集するような色素配置の初期状態をセットする第一の 刺激を導入し、あるいは外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合 には該コントロール細胞内で該色素が分散するような色素配置の初期状態をセッ トする第一の刺激を導入し；該初期色素配置状態にセットされたコントロール細 胞を同定すべき化学物質と接触させ；該細胞を観察して色素配置の状態が変化し ていないことを調べ；同定すべき化学物質と接触させた該コントロール細胞に、 外来ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には内因ＰＰＧ蛋白質の 活性化により色素の分散が誘発されるような第二の刺激を加え、あるいは該外来 ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には内因ＰＰＧ蛋白質の活性 化により色素の凝集が誘発されるような第二の刺激を加え；そして第二の刺激を 加えたコントロール細胞内の色素配置が初期色素配置状態から変化したか否かを 調べ、コントロール細胞内の色素配置が変化した場合は第一の刺激は該外来ＰＰ Ｇ蛋白質に対する特異的アンタゴニストであるとみなす、工程からなるコントロ ール操作をさらに含む、請求項１３記載の方法。
17. １７．特定の刺激に応答して色素を分散または凝集する能力を有し、そして内在 セロトニンリセプターを発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細胞に刺激 を導入し；色素凝集の初期状態にセットした該試験細胞を化学物質と接触させ該 化学物質で処理した該試験細胞内で色素が分散したか否かを調べ、適当なコント ロールと比べて色素が分散したときは該化学物質はセロトニンリセプターのアゴ ニストであると判断することよりなる、メラノフォアに関して内在性のセロトニ ンリセプターのアゴニストとして作用する化学物質を同定する方法。
18. １８．刺激がメラトニンである、請求項１７記載の方法。
19. １９．特定の刺激に応答して色素を分散または凝集する能力を有し、そして内在 性セロトニンリセプターを発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細胞に第 一の刺激を導入して、該試験細胞内で色素が凝集するような初期色素配置状態に セットし：該色素凝集初期状態にセットされた試験細胞を同定すべき化学物質と 接触させ；該細胞を観察してその色素配置状態が変化していないことを調べ；該 同定すべき化学物質と接触させた試験細胞に第二の刺激を与えて内在性セロトニ ンリセプターを活性化して色素分散を誘発させ；第二の刺激を加えた試験細胞内 の色素が分散したかを調べ、色素分散の欠如を試験化学物質がセロトニンリセプ ターのアンタゴニストであることの示唆とすることよりなる、メラノフォアに関 して内在性のセロトニンリセプターのアンタゴニストとして作用する化学物質を 同定する方法。
20. ２０．第一刺激がメラトニンであり、そしてコントロール操作として次の工程即 ち、試験細胞に、内在性セロトニンリセブターを活性化する前記第二刺激の代わ りに、セロトニンリセプターと同様に活性化された時色素分散を誘発する別の内 在性ＧＰＣリセプターを活性化する第二刺激を導入し、試験細胞に色素分散が見 られずコントロール細胞が色素分散を生じた時は、同定すべき化学物質は該内在 性セロトニンリセプターのアンタゴニストであるとする工程、をさらに含む、請 求項１９記載の方法。
21. ２１．ＧＰＣリセプターがＭＳＨリセプターである請求項２０記載の方法。
22. ２２．特定の刺激に応答して色素を分散または凝集する能力を有し、そして内在 性ＰＰＧ蛋白質を発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細胞に刺激を導入 し；色素凝集の初期状態にセットした該試験細胞を化学物質と接触させ；該化学 物質で処理した該試験細胞内で色素が分散したか否かを調べ、適当なコントロー ルと比べて色素の配置が変化したときは該化学物質は内在性ＰＰＧ蛋白質のアゴ ニストであると判断することよりなる、メラノフォアに関して内在性のＰＰＧ蛋 白質のアゴニストとして作用する化学物質を同定する方法。
23. ２３．ＰＰＧ蛋白質が、キナーゼＡ、キナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリ バーゼＡ２及びＧ−蛋白質からなる群から選択され、そして刺激がメラトニンで ある、請求項２２記載の方法。
24. ２４．特定の刺激に応答して色素を分散または凝集する能力を有し、そして内在 性ＰＰＧ蛋白質を発現する能力を有する色素細胞ラインの試験細胞に、ＰＰＧ蛋 白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には該試験細胞内で色素が凝集するよ うな色素配置の初期状態をセットする第一の刺激を導入し、あるいは内在ＰＰＧ 蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には該試験細胞内で該色素が分散す るような色素配置の初期状態をセットする第一の刺激を導入し；該初期色素配置 状態にセットされた試験細胞を同定すべき化学物質と接触させ；該細胞を観察し て色素配置の状態が変化していないことを調べ；同定すべき化学物質と接触させ た該試験細胞に、内在ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には内 在ＰＰＧ蛋白質の活性化により色素の分散が誘発されるような第二の刺激を加え 、あるいは該内在ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には該内在 ＰＰＧ蛋白質の活性化により色素の凝集が誘発されるような第二の刺激を加えそ して第二の刺激を加えた試験細胞内の色素配置が初期色素配置状態から変化した か否かを調べることよりなる、メラノフォアに関して内在性のＰＰＧ蛋白質のア ンタゴニストとして作用する化学物質を同定する方法。
25. ２５．ＰＰＧ蛋白質が、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ホスホ リバーゼＣ、ホスホリバーゼＡ２及びＧ−蛋白質からなる群から選択される、請 求項２４記載の方法。
26. ２６．カエルのような下等動物由来のｉｎｖｉｔｒｏで連続増殖可能な色素細胞 に外来核酸クローンを導入し；該細胞に内在ＧＰＣリセプターを活性化して該細 胞内の色素配置を初期状態にセットする刺激を導入し：該色素の初期配置状態に セットされた細胞を該外来性リセプターを活性化する化学物質に接触させ；そし て該化学物質で処理された細胞のうち色素配置が初期状態から変化したものを同 定し、色素配置の変化を該リセプターをコードする外来クローンを発現する細胞 の指標とする、ことよりなるＧＰＣリセプターのクローニング方法。
27. ２７．外来核酸クローンが、プラスミドベクター内に造成されたｃＤＮＡライブ ラリーからのものであり、そして色素細胞にエレクトロポレーションにより請人 される請求項２６記載の方法。
28. ２８．一つまたはそれ以上の容器に、 下記リセプターをコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；及 び該外来リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には内在性リセブター の活性化により色素の凝集を誘発する刺激剤、および／または該外来リセブター の活性化が色素の凝集を誘発する場合には内在性リセプターの活性化により色素 の分散を誘発する刺激剤、 を含有してなる、化学物質が外来ＧＰＣリセプターのアゴニストとして作用する かどうかを決定するためのキット。
29. ２９．試験色素細胞がＸｅｎｏｐｕｓ１ａｅｖｉｓのメラノフォアであり、外来 リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激剤がメラトニンであり 、そして外来リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には刺激剤がメラ ノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項２８記載のキッ ト。
30. ３０．一つまたはそれ以上の容器に、 下記リセプターをコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；外 来リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には内在性リセプターを活性 化して色素の凝集を誘発する第一の刺激剤、および／または外来リセプターの活 性化が色素の凝集を誘発する場合には内在性リセプターを活性化して色素の分散 を誘発する第一の刺激剤；及び 外来リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には該外来リセプターを活 性化して色素の分散を誘発する第二の刺激剤、および／または外来リセプターの 活性化が色素の凝集を誘発する場合には該外来リセプターを活性化して色素の凝 集を誘発する第二の刺激剤、 を含有してなる、化学物質が外来ＧＰＣリセプターのアンタゴニストとして作用 するかどうかを決定するためのキット。
31. ３１．試験色素細胞がＸｅｎｏｐｕｓ１ａｅｖｉｓのメラノフォアであり、外来 リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には第一の刺激剤がメラトニン であり、そして外来リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には第一の 刺激剤がメラノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項３ ０記載のキット。
32. ３２．一つまたはそれ以上の容器に、 下記蛋白質をコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；及び該 外来蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には内在性リセプターの活性化 により色素の凝集を誘発する刺激剤、および／または該外来蛋白質の活性化が色 素の凝集を誘発する場合には内在性リセプターの活性化により色素の分散を誘発 する刺激剤、 を含有してなる、化学物質が外来ＰＰＧ蛋白質のアゴニストとして作用するかど うかを決定するためのキット。
33. ３３．外来蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激剤がメラトニン であり、そして外来リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には刺激剤 がメラノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項３２記載 のキット。
34. ３４．一つまたはそれ以上の容器に、 下記蛋白質をコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；外来蛋 白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には内在性リセプターを活性化して色 素の凝集を誘発する第一の刺激剤、および／または外来蛋白質の活性化が色素の 凝集を誘発する場合には内在性リセプターを活性化して色素の分散を誘発する第 一の刺激剤；及び 外来蛋白質の溶性化が色素の分散を誘発する場合には該外来蛋白質を活性化して 色素の分散を誘発する第二の刺激剤、および／または外来蛋白質の活性化が色素 の凝集を誘発する場合には該外来蛋白質を活性化して色素の凝集を誘発する第二 の刺激剤、 を含有してなる、化学物質が外来ＰＰＧ蛋白質のアンタゴニストとして作用する かどうかを決定するためのキット。
35. ３５．外来蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には第一の刺激剤がメラ トニンであり、そして外来蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には第一 の刺激剤がメラノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項 ３４記載のキット。
36. ３６．一つまたはそれ以上の容器に、 下記リセプターをコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；及 び下記化学物質の榛的である下記内在性リセプターの活性化が色素の分散を誘発 する場合には内在性リセプターの活性化により色素の凝集を誘発する刺激剤、お よび／または下記化学物質の標的である該内在性リセプターの活性化が色素の凝 集を誘発する場合には内在住リセブターの活性化により色素の分散を誘発する刺 激剤、 を含有してなる、化学物質が内在ＧＰＣリセプターのアゴニストとして作用する かどうかを決定するためのキット。
37. ３７．内在性蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激剤がメラトニ ンであり、または内在性蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には刺激剤 がメラノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項３６記載 のキット。
38. ３８．一つまたはそれ以上の容器に、 下記リセプターをコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；化 学物質の標的となる内在リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には内 在性リセプターを活性化して色素の凝集を誘発する第一の刺激剤、及び／または 化学物質の標的となる内在リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合には 内在性リセプターを活性化して色素の分散を誘発する第一の刺激剤；及び化学物 質の標的となる内在リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には核化学 物質の標的となる内在リセプターを活性化して色素の分散を誘発する第二の刺激 剤、および／または化学物質の標的となる内在リセプターの活性化が色素の凝集 を誘発する場合には核化学物質の標的となる内在リセプターを活性化して色素の 凝集を誘発する第二の刺激剤、を含有してなる、化学物質が内在ＧＰＣリセプタ ーのアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するためのキット。
39. ３９．内在性リセプターの活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激剤がメラ トニンであり、または内在性リセプターの活性化が色素の凝集を誘発する場合に は刺激剤がメラノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請求項 ３８記載のキット。
40. ４０．一つまたはそれ以上の容器に、 下記蛋白質をコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞；及び下 記内在性蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には内在性リセブターの活 性化により色素の凝集を誘発する刺激剤、および／または該内在性蛋白質の活性 化が色素の凝集を誘発する場合には内在性リセプターの活性化により色素の分散 を誘発する刺激剤、 を含有してなる、化学物質が内在ＰＰＧ蛋白質のアゴニストとして作用するかど うかを決定するためのキット。
41. ４１．内在性ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には刺激剤がメ ラトニンであり、または内在性ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の凝集を誘発する場 合には刺激剤がメラノサイト刺激ホルモンまたはイソプロテレノールである、請 求項４０記載のキット。
42. ４２．一つまたはそれ以上の容器に、 下記蛋白質をコードする外来クローンを発現する下等動物色素試験細胞：内在Ｐ ＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には内在性リセプターを活性化 して色素の凝集を誘発する第一の刺激剤、及び／または内在ＰＰＧ蛋白質の活性 化が色素の凝集を誘発する場合には内在性リセプターを活性化して色素の分散を 誘発する第一の刺激剤一及び 内在ＰＰＧ蛋白質の活性化が色素の分散を誘発する場合には該内在ＰＰＧ蛋自賛 を活性化して色素の分散を誘発する第二の刺激剤、および／または内在ＰＰＧ蛋 白質の活性化が色素の凝集を誘発する場合には該内在ＰＰＧ蛋白質を活性化して 色素の凝築を誘発する第二の刺激剤、を含有してなる、化学物質が内在ＰＰＧ蛋 白質のアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するためのキット。