FR2713645A1 - Polypeptides à activité de récepteur aux mélanocortines, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes, vecteurs et hôtes les exprimant et application au criblage de médicaments. - Google Patents

Abstract

Polypeptides à activité de récepteur aux mélanocortines, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes, vecteurs et hôtes les exprimant et application au criblage de médicaments. Nouveaux polypeptides ayant une activité de nouveau récepteur pour les mélanocortines MC-5 et fragments d'acides aminés codant pour ces polypeptides. Des hôtes cellulaires transformés par des vecteurs dans lesquels ont été insérés ces fragments expriment ces polypeptides. Applications de ces polypeptides et fragments à la formation d'anticorps, à la réalisation de médicaments, de sondes nucléotidiques de diagnostic et de détection, du criblage de médicaments destinés, notamment, au traitement d'affections cardiovasculaires, rénales, neurologiques, psychiatriques, gastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes et à l'identification de tissus ou cellules.

Description

La présente invention a trait à des polypeptides ayant une activité de

récepteur aux mélanocortines, notamment l'hormone adrénocorticotrope (ACTH) et les

hormones mélanotropes (MSH).

Elle a également trait à des séquences de nucléotides, et notamment d'ADN, codant pour ces polypeptides ainsi qu'à des vecteurs contenant lesdites séquences et à des cellules transformées pour exprimer lesdites séquences et notamment les gènes codant pour les récepteurs contenant, ou constitués par, lesdits polypeptides, ces cellules permettant d'étudier l'activité

d'agoniste ou antagoniste desdits récepteurs.

L'invention a également trait à des sondes nucléotidiques susceptibles de se fixer par hybridation sur lesdites séquences ou lesdits gènes codant pour lesdits polypeptides et destinées au diagnostic d'affections se traduisant par une modification qualitative ou quantitative de la formation ou de l'activité desdits récepteurs, chez l'homme ou l'animal, et notamment d'affections cardiovasculaires, rénales, neurologiques, psychiatriques,

gastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes.

L'invention a également trait à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, humains ou non, dirigés contre

lesdits polypeptides.

Elle a également trait à des moyens de criblage de candidats médicaments, permettant notamment d'étudier l'affinité de substances candidates pour lesdits polypeptides. Enfin elle a trait à des médicaments, notamment pour le traitement des affections cardiovasculaires,

rénales, psychiatriques, neurologiques, gastro-

entérologiques ou neuro-endocriniennes, et contenant des substances ayant une affinité élevée pour lesdits polypeptides à activité de récepteur des mélanocortines ou encore des substances ayant une activité sur des cellules transfectées par lesdites séquences d'ADN codant pour

lesdits polypeptides.

Elle a également trait à des médicaments actifs sur l'un, certains, ou la totalité des récepteurs des mélanocortines déjà identifiés et/ou ceux décrits dans la présente invention et notamment à des médicaments agonistes ou antagonistes des hormones adrénocorticotrope et mélanotropes. L'hormone adrénocorticotrope est un des membres d'une famille de peptides opiomélanotropes dérivés d'un

précurseur commun de haut poids moléculaire, la pro-

opiomélanocortine (POMC). Ce précurseur est hydrolysé enzymatiquement pour donner l'ACTH, la 0-lipotropine (P-LPH) et une partie N-terminale. Ces trois peptides sont eux-mêmes hydrolisés, notamment dans le lobe intermédiaire de l'hypophyse, pour donner d'autres peptides actifs. Ainsi la région N-terminale donne la 7- MSH. L'ACTH est la source de l'hormone a-mélanotrope (a-MSH) et du peptide corticotrope du lobe intermédiaire (CLIP). La P-LPH peut être hydrolysée pour donner la P-endorphine et la y-LPH. Ces deux derniers

peptides sont la source de 1-endorphine 1-27 et de R-MSH.

L'homme adulte n'ayant pas de lobe intermédiaire de l'hypophyse, les taux plasmatiques d'a-MSH sont donc très faibles. De plus, la plus grande partie de la i-LPH reste inchangée, si bien que la R-LPH et l'ACTH sont les deux

mélanocortines principales chez l'homme.

Les activités biologiques des peptides dérivés de la proopiomélanocortine sont très variées. Le premier rôle de I'a-MSH et de la f-MSH est de réguler l'activité des mélanocytes et donc la pigmentation; l'ACTH et la P-LPH se

montrent aussi de puissants stimulants de la pigmentation.

Le premier rôle de l'ACTH est de réguler la synthèse de glucocorticoïdes et d'aldostérone dans la surrénale. Des effets de l'ACTH ont aussi été observés dans divers autres types cellulaires tels que les adipocytes, la glande

lacrimale ou les lymphocytes.

Les mélanocortines ont des activités nombreuses au niveau du système nerveux central ou périphérique: régulation de la production de CRH dans l'hypothalamus (Motta et coll., Endocrinology, 1965, 77: 392; Suda et coll., Endocrinology, 1986, 118: 459), effets sur les

comportements d'évitement (Murphy et Miller, J. Comp.

Physiol. Psychol., 1955, 48: 47), et de prise alimentaire (Sandmanet et coll., Experientia, 1969, 25: 1001; Garrud et coll., Physiol. Psychol. , 1974, 112: 109). Ces activités ne seraient pas provoquées de manière indirecte par une élévation de cortisol, mais dues à la stimulation de

récepteurs cérébraux (Tatro, Brain Res., 1990, 536: 124 -

132).

L'étude pharmacologique des réponses biologiques aux mélanocortines a indiqué qu'elles pouvaient résulter de l'interaction avec des récepteurs différents. Ainsi, certaines données pharmacologiques suggèrent que la synthèse des glucocorticoides et de l'aldostérone dans la surrénale pourraient être régulée par des récepteurs présentant des affinités différentes pour l'a-MSH (Vinson et coll., J.

Steroid Blochem., 1983, 19: 537).

L'ACTH et les MSH sont connues pour interagir avec des récepteurs couplés aux protéines G en activant l'adénylate cyclase. A ce jour, quatre récepteurs aux mélanocortines, dénommés MC-1 à MC-4, ont été clones. Le récepteur MC-1 est un récepteur à l'a-MSH exprimé dans les mélanocytes de souris et les mélanomes humains, mais pas dans d'autres tissus; le récepteur MC-2 est un récepteur à l'ACTH exprimé dans le cortex surrénalien (Mountjoy et coll., Science, 1992, 257, 1248- 1251) Le récepteur MC-3, qui présente des affinités très voisines pour les mélanocortines courtes (MSH) et pour I'ACTH, est exprimé dans le cerveau et le placenta, mais pas dans la surrénale ni dans les cellules provenant d'un mélanome (Gantz et coll., J. Biol. Chem., 1993, 268: 8246-8250). Le récepteur MC-4 est surtout exprimé dans le cerveau mais pas dans la surrénale, le

placenta, ni les mélanocytes (Gantz et coll., J. Biol.

Chem., 1993, 268: 15174-15179).

L'invention des nouveaux polypeptides ci-dessus a permis de découvrir un nouveau récepteur pour les

mélanocortines qui est désigné, ci-après, par MC-5.

L'invention a pour objet de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur aux mélanocortines MC-5 choisis dans le groupe des polypeptides formés par les ensembles 1 et 2 définis ci-après: - Ensemble 1 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 325 acides aminés de rat, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID Ne! ou des fragments peptidiques de cette séquence, lesdits fragments étant tels que soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 325 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier les mélanocortines ou leurs dérivés synthétiques, agonistes ou antagonistes, soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 325 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs MC-1, MC-2, MC-3 et MC-4, Ensemble 2 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence humaine de 325 acides aminés, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID NM 3 ou des fragments peptidiques de ces polypeptides, lesdits fragments étant tels que soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 325 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier les mélanocortines ou leurs dérivés synthétiques agonistes ou antagonistes, soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 325 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs

MC-1, MC-2, MC-3 et MC-4.

L'invention comprend également les polypeptides constitués par ou contenant les séquences homologues aux séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N' 3 présentant une

homologie d'au moins l0 % avec lesdites séquences.

De préférence, les polypeptides de l'ensemble 1 contiennent les sites faisant partie de ladite séquence de 325 acides aminés, dont la présence est nécessaire, quand les polypeptides exprimés par une cellule sont capables d'augmenter l'accumulation d'adénosyl 3', 5' monophosphate cyclique (AMP cyclique) lorsque ces polypeptides sont mis en présence de mélanocortines ou de leurs dérivés synthétiques agonistes selon une pharmacologie indiquée dans le Tableau I. On voit notamment que l'efficacité de l'a-MSH est égale à celle du fragment synthétique 1-24 de l'ACTH, supérieure à celles du norleu-Dphe a-MSH (NDP-aMSH) et de l'ACTH (1-39) et bien supérieure à celles des autres MSH alors que le

fragment d'ACTH (4-10) est pratiquement inactif.

Les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés en étant isolés, ou fixés sur des supports, d'une façon tout à fait classique, ou encore réunis à des séquences d'acides aminés sans relation avec les récepteurs MC-5. Ils peuvent être glycosylés ou non et comporter des

ponts disulfures.

La présente invention a également pour objet les acides nucléiques contenant ou constitués par les séquences de nucléotides codant pour un quelconque des polypeptides

selon l'invention.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent

comprendre ou consister dans la séquence complète, c'est-à-

dire le gène, codant pour le récepteur MC-S chez l'homme ou chez l'animal. Des acides nucléiques selon l'invention sont notamment des acides nucléiques comprenant ou constitués par les séquences SEQ ID N 1 ou N 3 ou des fragments de ces séquences. Parmi les acides nucléiques selon l'invention, des acides nucléiques particulièrement intéressants sont ceux constitués par les séquences s'étendant du nucléotide en position 253 à celui en position 1 227 dans l'identificateur SEQ ID N 1 et du nucléotide en position 184 à celui en position 1158 dans l'identificateur SEQ ID N' 3. Les acides nucléiques comprennent également les fragments codant pour les polypeptides plus courts définis précédemment. Outre les variations de séquences nucléotidiques que l'on peut observer lorsque l'on passe des séquences d'ADN de rat à l'ADN humain représentées sur les identificateurs SEQ ID N 1 et SEQ ID N 3, les acides nucléiques selon l'invention peuvent comporter les variations propres à la dégénérescence du code ainsi que des mutations localisées dans la mesure o les acides nucléiques variants s'hybrident avec les sondes susceptibles de s'hybrider, de façon spécifique, avec les séquences SEQ ID

N' 1 ou SEQ ID N 3.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique classique d'acide nucléique, par réplication dans des vecteurs qui les contiennent ou par tout autre moyen, et notamment multiplication par le procédé dit PCR à partir d'une faible

quantité d'acide nucléique selon l'invention.

L'invention a également pour objet les vecteurs recombinants, utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques, et contenant un acide nucléique selon l'invention, tels que des plasmides, phages ou virus contenant une ou plusieurs séquences selon l'invention en un site non essentiel pour la réplication. Les vecteurs selon l'invention peuvent contenir, le cas échéant, les éléments nécessaires pour l'expression dans un hôte cellulaire tels que promoteur, codon d'initiation, terminateur, séquence signal ou séquence d'ancrage ou tout

autre élément utile à la régulation.

L'invention a également pour objet les hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant selon l'invention et susceptibles d'exprimer la séquence codante selon l'invention pour la synthèse d'un polypeptide selon l'invention. Ces hôtes peuvent être des procaryotes, tels que par exemple E. coli, ou eucaryotes, par exemple des cellules de levure telles que S. cerevisiae ou des cellules

de mammifère, par exemple cellules CHO.

L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un polypeptide selon l'invention. Ces anticorps monoclonaux ou polyclonaux sont obtenus par induction à partir d'un polypeptide selon l'invention et sont spécifiques des polypeptides selon l'invention, tout en étant susceptibles, ou non, de

reconnaître d'autres récepteurs aux mélanocortines.

L'obtention de ces anticorps peut s'effectuer de façon classique, soit par injection d'un polypeptide selon l'invention à un organisme et recueil du sérum avec éventuellement purification des anticorps spécifiques, soit pour les anticorps monoclonaux, par les techniques

classiques de fusion cellulaire formant des hybridomes.

Les anticorps selon l'invention sont utiles pour le diagnostic, par réaction anticorps-antigène mise en évidence à l'aide d'une technique de révélation classique, pour diagnostiquer des variations pathologiques de cellules exprimant le récepteur MC-5. L'invention a également pour objet les sondes nucléotidiques s'hybridant avec l'un des acides nucléiques selon l'invention ou avec leurs séquences complémentaires ou ARN correspondants, en étant spécifiques du récepteur MC-5, et qui ne s'hybrident pas avec les séquences nucléiques ou les ARN correspondants des autres récepteurs aux

mélanocortines décrits ci-dessus.

D'une façon en soi connue, on préfère que les sondes comportent au moins 10, et de préférence au moins 15

à 17 acides nucléiques.

Les sondes selon l'invention sont utiles pour le diagnostic d'affections cardiovasculaires, rénales, neurologiques, psychiatriques, gastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes liées à des anomalies qualitatives ou quantitatives du récepteur MC-5, y compris pour la recherche

d'anomalies génétiques à ce niveau.

Les sondes sont utilisées de façon classique en étant mises en contact, dans les conditions usuelles, avec des préparations présentant des acides nucléiques de cellules suspectées de présenter une anomalie définie ci-dessus. En particulier, les sondes peuvent être utilisées pour détecter une expression pathologique du récepteur MC-5

en révélant la présence de son ARN messager.

Les sondes correspondant à la séquence inverse complémentaire des acides nucléiques ou d'un fragment de ces acides nucléiques selon l'invention, et constituées soit d'acides nucléiques naturels soit d'acides nucléiques chimiquement modifiés pour autant qu'elles s'hybrident avec la séquence selon l'invention, peuvent être utilisées comme sondes antisens pour bloquer l'expression du récepteur MC-5. Ces sondes antisens peuvent être utilisées comme médicaments dans le traitement d'affections cardiovasculaires et rénales, des troubles neurologiques et psychiatriques, des troubles gastro-entérologiques, notamment les troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou secrétoires

et les dysfonctionnements de la surrénale.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements de l'hypertension artérielle et d'autres affections cardiovasculaires, les troubles neurologiques et psychiatriques, les troubles gastro-entérologiques, notamment les troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou secrétoires et les dysfonctionnements de la surrénale. Le criblage d'un médicament peut notamment utiliser la détection de la capacité d'une molécule mélanocortine ou d'un dérivé synthétique à se comporter comme ligand vis-à-vis d'un polypeptide selon l'invention, et consiste, par exemple, à mettre en contact, dans un milieu convenable, la molécule mélanocortine ou un dérivé synthétique avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour le polypeptide et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, de manière telle que la liaison spécifique du ligand candidat puisse être évaluée ou indirectement estimée, par exemple en détectant l'éventuel complexe ligand- polypeptide. Ce procédé peut également comprendre la mesure d'une réponse induite par la liaison avec la cellule, telle que par exemple la production d'AMP cyclique de façon à permettre de différencier les molécules mélanocortines ou leurs dérivés synthétiques qui se comportent comme antagonistes et celles qui se comportent comme agonistes, et même de définir le

caractère relatif de ces dernières.

Dans ce but de criblage, on peut également utiliser un procédé déterminant l'affinité d'un polypeptide de l'invention pour des ligands déterminés, dans lequel on cultive un hôte cellulaire transformé, conformément à l'invention, pour exprimer et présenter dans sa membrane le récepteur MC-5 ou un polypeptide correspondant, après quoi on met la culture cellulaire en contact avec le ligand déterminé et on vérifie s'il se forme une liaison spécifique entre les hôtes cellulaires et les ligands, notamment par des tests de radioliaison et de préférence, de mesure du taux de production ou de libération d'un indicateur convenable tel que AMP cyclique, ou ions intracellulaires, ces derniers tests permettant de distinguer et de définir les agonistes et leur caractère partiel ainsi que les antagonistes. Ce procédé permet également de déterminer les fragments polypeptidiques selon l'invention, par exemple ceux comportant une partie des séquences de 325 acides aminés SEQ ID N 1 ou de 325 acides aminés SEQ ID N' 3, et qui comprennent les sites opérationnels permettant la liaison et/ou l'induction des réponses cellulaires précitées. On peut également identifier ainsi des cellules ou tissus exprimant spontanément à leur surface membranaire un polypeptide selon l'invention, ces cellules ou tissus étant ensuite utilisables pour servir à la mise au point ou au criblage de médicaments ou de ligands interagissant avec les

polypeptides selon l'invention.

L'invention a également pour objet des médicaments contenant, dans une dose prévue pour être administrée, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance active, agoniste ou antagoniste, sur un polypeptide selon l'invention ayant une activité de récepteur MC-5 dans un

véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention a également pour objet des médicaments contenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'une substance active sur d'autres récepteurs des mélanocortines mais non active sur le

récepteur MC-5.

D'autres avantages et caractéristiques de

l'invention apparaîtront à la lecture de la description

suivante, faite à titre d'exemple non limitatif.

Dans cette description, l'identificateur de

séquence SEQ ID N 1 représente la séquence d'un fragment d'ADN de rat de 1 599 paires de bases, dont 325 codons, repérés sur la séquence, codant pour un polypeptide de 325 acides aminés constituant un récepteur des mélanocortines

désigné par MC-5.

L'identificateur de séquence SEQ ID N 3 représente la séquence d'un fragment d'ADN humain de 1262 paires de bases, dont 325 codons repérés sur la séquence, codant pour un polypeptide de 325 acides aminés constituant

un récepteur MC-5 des mélanocortines.

La figure 1 illustre la caractérisation des transcrits du gène du récepteur MC-5 dans plusieurs tissus

de rat.

Clonage des récepteurs MC-5 de rat et MC-5 humain 1. Clonage du récepteur MC-5 de rat On a criblé une banque d'ADN génomique de rat dans des conditions de stringence basse avec une sonde ADN marquée au 32p et correspondant à un fragment de la séquence nucléotidique codant pour le récepteur D3 de la dopamine (Sokoloff et al., Nature 1990, 347, 146-151). Dans ces

conditions, un clone s'hybride fortement avec cette sonde.

La séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN (225 pb) du phage ainsi isolé montre que cet ADN comporte une séquence codant pour un peptide de 75 acides aminés codant une protéine présentant des homologies avec la famille des

récepteurs des mélanocortines.

Le fragment d'ADN de ce clone (nucléotide 810 au nucléotide 1038 de la séquence SEQ ID n' 1) est alors marqué au 32P, puis utilisé pour cribler une banque d'ADNc de striatum de rat dans le vecteur IZAP (Stratagene) dans des conditions de stringence élevée. Un clone est alors isolé puis le plasmide est excisé. Le plasmide obtenu (SLZ 82) est cultivé, purifié puis séquencé. L'insert obtenu (3 Kb) comprend la séquence nucléotidique 1 à 1 599 de la séquence

SEQ ID N 1.

2. Clonage du récepteur MC-5 humain On a criblé une banque d'ADN génomique (Clontech) dans des conditions de stringence élevée avec une sonde ADN double brin marquée au 32p et correspondant aux nucléotides 812 à 1036 de la séquence nucléotidique du récepteur MC-5 de rat (SEQ ID N 1). Deux clones positifs ont été purifiés puis analysés par la technique de Southern et des fragments de restriction EcoRI-BamHl et Xba I ont été subclonés dans pGEM-4Z (Promega) puis séquences. La séquence obtenue (SEQ ID N 3) présente une homologie de près de 90 % avec la séquence du récepteur MC-5 de rat alors qu'elle est au plus de 64 % avec les autres récepteurs aux mélanocortines connus. 3. Expression du récepteur MC-5 de rat dans les cellules CHO La partie codante du récepteur MC-5 de rat a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces nucléotidiques '-CT AAG CTT TTT CTT CCA GCG ATG AAC TCC (SEQ ID N 5) et '-CT GGA TCC ACC TAA TTG ACT GAG AGA TGA (SEQ ID N 6) en utilisant le plasmide SLZ 82 comme matrice selon la technique de Kawasaki et coll. (PCR Technology; éd. Erlich H.A., Stockholm Press, 1989). Le fragment obtenu (1050 bp) est purifié sur agarose puis digéré par les enzymes Hind III

et Bam HI.

Les vecteurs d'expression dérivent du plasmide pSV D2 (Giros, B. et al., Nature 342, 923-926, 1989). Le vecteur pour exprimer le récepteur MC-5 est obtenu en remplaçant le fragment de restriction HindIII- BglII de pSVD2 par un fragment de restriction HindIII-BamHI obtenu ci-dessus, conduisant au plasmide pSV MC-5. Ces constructions sont cultivées, puis purifiées sur gradient de chlorure de césium (Sambrook J. et al., Molecular cloning - a laboratory manual, C. Nolan, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) et transfectées (Graham, F.L. et al., Virol. 52, 456-467, 1973) à des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO-K1), déficientes en dihydrofolate réductase. Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dubelcco's Modified Eagle medium) sans hypoxanthine

et sans thymidine.

L'expression du récepteur MC-5 est mise en évidence par la liaison de la NDP-rMSH [tyr-125I] (Tatro et Reichlin, Endocrinology, 1987, 121: 1900) à des membranes de cellules transfectées. Les expériences de liaison sont effectuées dans un tampon Tris-HCl 50mM pH = 7.4 (volume total 400 Pl) contenant NaCI 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCI2 2 mM et du NDP-c MSH [tyr-125I] à une concentration de

0,1 à 0,2 nM.

L'expression du récepteur MC-5 dans les cellules CHO transfectées est également mise en évidence par la capacité des mélanocortines à stimuler l'accumulation d'AMP cyclique dans ces cellules. Pour mesurer l'accumulation d'AMP cyclique, les cellules CHO transfectées sont cultivées sur plaques de 96 puits, lavées en milieu de Dulbecco modifié par Eagle (DMEM, Gibco BRL) puis mises en présence d'une mélanocortine ou d'un dérivé synthétique pendant 15 minutes à 37 C. L'AMP cyclique est extrait puis quantifié par dosage radioimmunologique (New England Nuclear). Les mélanocortines induisent une accumulation d'AMP cyclique égale à 4 à 5 fois la valeur du taux basal mesuré en absence de mélanocortine. Cette mesure permet de déterminer le caractère agoniste des mélanocortines pour le récepteur MC-5 et l'efficacité des mélanocortines ou de leurs dérivés synthétiques selon le Tableau I.

TABLEAU I

Efficacités des mélanocortines et de leurs dérivés synthétiques pour stimuler l'accumulation de l'AMP cyclique dans des cellules CHO exprimant le récepteur MC-5 de rat AGENT EC50 (nMN)

ACTH (1-24) 0,46

a-MSH 0,59 NDP-a-MSH 1,0

ACTH (1-39) 6,0

f-MSH 12 i-MSH 46 Le tableau I indique clairement que le gène transfecté dans les cellules CHO code pour un récepteur aux mélanocortines comme l'indique la forte efficacité de l'a-MSH et de l'ACTH ainsi que leurs dérivés NDP- cMSH et ACTH (1-24). Cependant, la pharmacologie de ce récepteur MC-5 ne peut en aucun cas être confondue avec celle des

récepteurs des mélanocortines déjà connus.

Caractérisation des transcrits du gène du récepteur MC-5 dans plusieurs tissus de rat Des ARNs poly(A)+ sont préparées à partir de plusieurs tissus cérébraux ou périphériques de rat (Chirgwin et coll., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979; Aviv et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 1408-1412, 1972). Des échantillons (8 pg) sont dénaturés, soumis à électrophorèse sur agarose, transférés sur des membranes de nitrocellulose et hybridés en utilisant un fragment de 225 pb (nucléotides 810 à 1038 de la séquence SEQ ID ne 1) obtenu par amplification d'ADN à l'aide d'amorces oligonucléotidiques,

puis marqué au 32p par la technique de "nick-translation".

Ce fragment marqué est utilisé à raison de 5 x 106 dpm/ml.. Les membranes sont exposées pendant 15 jours à - 80'C avec des écrans amplificateurs. Chez le rat, un transcrit (4,0 kb) est observable dans la surrénale et l'estomac (Figure 1). L'expression des transcrits du récepteur MC-5 dans le cerveau de rat a aussi été étudié par la technique de PCR. On synthétise un ADNc monobrin en utilisant de la reverse transcriptase AMV (20 U, Boehringer), de l'ARN préparé par la technique de Chirgwin et coil. (Biochemistry, 1979, 18: 5294) et l'amorce A: 5'-CAT GAT CAT TAG GAT AAG GTG AAG (SEQ ID N 7) (400 mM). Cette matrice est ensuite amplifiée (Kawasaki et coll., "PCR technology"; éd. Erlich H.A., Stockholm Press, 1989) en utilisant l'amorce A et l'amorce 5'-ATC GAT CGT CTG CCT CAT CTC CAT (SEQ ID N 8) (75 mM chacune) pendant 35 cycles comme suit (94 C, 1 minute et 72 C, 1 minute) avec 5 U d'ADN polymérase Taq (Perkin Elmer Cetus). Une bande d'ADN de taille prévue 225 bp est visualisée avec du bromure d'éthydium et son identité avec un fragment du récepteur MC-5 est déterminée par hybridation avec une sonde constituée d'un mélange d'oligonucléotides '-CTT GAC ATG GTT CCG GGC CA (SEQ ID N 9) et 5'-CAG CAT GAA GGG TGC TAT (SEQ ID N 10) marqués au 32p par la

terminale transférase.

L'expression des transcrits a été aussi étudié par hybridation in situ en utilisant une sonde ARNc. Pour synthétiser la sonde ARN, on a utilisé le plasmide pGEM-4Z contenant le fragment comprenant la séquence SEQ ID N 1 entre les nucléotides 812 à 1036. Pour obtenir la sonde ARNc antisens, le plasmide a été linéarisé par EcoRI et cette matrice a été utilisée dans le kit "Riboprobe' GemIni Il" (Promega) avec la T7 RNA polymérase et de l'UTP 32P. Pour obtenir la sonde ARNc sens, le plasmide a été linéarisé par Hind III et utilisé avec la SP6 RNA polymérase. Ces sondes ont été hybridées sur des coupes de surrénale de rat selon la technique décrite par Bouthenet et coll. (Brain Res., 1991, 564: 203). Dans la surrénale, le récepteur MC- 5 n'est exprimé que dans la couche glomérulaire, lieu de synthèse de l'aldostérose. Le récepteur MC-2 est exprimé dans la couche fasciculaire, lieu de synthèse des glucocorticoïdes et, dans une moindre mesure, dans la couche glomérulaire (Mountjoy et

coll., Science, 1992, 257: 1248).

19 2713645

I,TSTE DE SEQUENCES

(l) INFORMATION GENERAl,E: (i) DEPOSANT:

(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE IA SANTE ET DE LA

RECHERCHE MEDICAI,E

(B) RUE: 101 rue de Tolbiar:

(C) VILLE: PARIS CEDEX 13

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAI,:L 75654 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Polypel)tides à activité de récepteur aux

mélanocortines, médicamemits les comprenant, séq(uences codant potiur eux, q.dfles, vecteurs et hlites les exprimant

et application au criblage de médicaments.

(]ii) NOMBRE DE SEQUENCES: 10 (iv) FORME LISIBILE PAR ORDINATEIIR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC rompatil)ble

(C) SYSTEME D' EXPI,OITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR I,A SEQ ID No: 1: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) ILONGUEUR: 1599 paires de bases (B) TYPE: acide nucli(ltue (C) NOMBRE DE BRINS: doubhle (D) CONFIGURATION: lin.eaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQIJE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: SP(,lelîlr'.f inleo) i]dlique tit r(el)ttlr MC-5 d(le rat (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONEILE:

(A) NOI/CLE: CDS

(B) EMPIACEMENT: 253..1227

SSI 0 SI 5I1 Sú

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06 S8 08

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225 230 215 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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305 310 315 320

Leu Leu Gly Arq Tyr

325

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQIJES DE LA SEQUIENCE: (A) IONGUEUR: 1262 pair:e:s le bases (B) TYPE: acide ntucléi(liUe (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQtIE: NON (iii) ANTI-SENS: NON (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Sequence nuicleot idiqle du recepteur MC-5 huma i n 0l 5t[ 0 EI JlqZ lea.XAú blV dsV lea elyoi a ly nLe nI'I aléoS SAD eaH leS elV Z19 DDV D1D DV1 DDV 1VD 919 VDL) 11V DDD D1D VIl DDV DDL D1V 3DD VD9 z1 ozi JII leA leai S m 1I SAD ail 1 H {"S dIsV atId leA usv dsv alI 9rH b 0V t9s 91DE) DiD DI 1lVD DD1 2)V D1V 3DJ1 DVD ú.11 919 úV DV1 1lV DVD DD3 ULi SOi 00l leA ticd iel (SV elV all leA kaOl Sill sAql usv usv nraq rlq A, all 91S ID IL1l DDD DVD VED9 VLV 9ID9 V1D J; VD 9VV DVV DYV 3D3D V1D DV1 D1V

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LZ7 (C) NOMBRE DE RRTlqS: simpl1c (D) CONFIGURATION: lin,;,ire (ii) TYPE DE MOI,ECTILE: O liqoiu'16otlide de synthèse (primer)

(xi) DESCRIPTION DE IA SEQUENiCE: SEQ ID NO: 6:

CTGGATCCAC CTAATTGACT GAGAGATGA 29

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQIJUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires doe bases (B) TYPE: acide nuiciléiqis (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Oliqgonuciléotide de synthèse (prim.er)

(xi) DESCRIPTION DE IA SEQItENC:F. SEQ ID NO: 7:

CATGATCATT AGGATAAGGT GAAG 24

(2) INFORMATION POUR I,A SEQ ID 110: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQI1ENCE: (A) LONGUEIlR: 24 paires (le hasps (B) TYPE: acide niléicuie (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: I ileaire (ii) TYPE DE MOIECIJ,E: O iqontlciéot ide e synthèse (primer)

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCF.: SEQ ID NO: 8:

ATCGATCGTC TGCCTCATCT CCAT 24

(2) INFORMATION POUR I,A SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE IA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 20 p)aites de bars_.s (B) TYPE: acide nucléifque (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGIJRATION: lii.neaire (ii) TYPE DE MOIECULE: Ol iqonrtlclnt ide <ri s.ynthitse (stind.) :01:UN U(l ÈIS EH:-ilIS V'I 3( NOIldISDS.Q (X Hx) (aPuo-:) o llUAs b:, o[! lodl b!i:IU OlbD I - lO 3l '.I dAl. ()!!) *.l[eK'yI![:NOIi VUlf3iOI.LNOD (1) a!dwls:SNIUG.a( ad'lUWCN (D) a Fil)! 1:,u lLI a)[ L:.e: 3dkL (fi) sisesI 'D s.!e, 81:HI-IL'llINO'I (Y) :'DNu:.ill'S V'1 (U S:111LS1H'.,DVV. (!) :01:U ll U 'S V'I èliOd NOil.LVHdO.NI (Z) oz VDDI)DD;DDLi DiV:)VDV,1,D :6:RN a1 03S:dDDINIU.l''S MVA sGa NOILdIdDS2 (!x) 6Z

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur aux mélanocortines MC-5 choisis dans le groupe des polypeptides formés par les ensembles 1 et 2 définis ci-après: - Ensemble i des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 325 acides aminés de rat, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID N 1 ou des fragments peptidiques de cette séquence, lesdits fragments étant tels que soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 325 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier les mélanocortines ou leurs dérivés synthétiques, agonistes ou antagonistes, soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 325 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs MC-1, MC-2, MC-3 et MC-4, Ensemble 2 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence humaine de 325 acides aminés, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID Ne 3 ou des fragments peptidiques de ces polypeptides, lesdits fragments étant tels que 25. soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 325 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier les mélanocortines ou leurs dérivés synthétiques agonistes ou antagonistes, 30. soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 325 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs

MC-1, MC-2, MC-3 et MC-4.

2. Polypeptides de l'ensemble 1 de la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils contiennent les sites faisant partie de ladite séquence de 325 acides aminés, dont la présence est nécessaire, quand les polypeptides sont exprimés par une cellule, notamment CHO, en présence de mélanocortines ou de leur dérivés synthétiques agonistes pour que l'efficacité desdits agonistes corresponde à celle indiquée ci-dessous: AGENT EC50 (nM)

ACTH (1-24) 0,46

a-MSH 0,59 NDP-u-MSH 1,0

ACTH (1-39) 6,0

P-MSH 12

v-MSH 46

3. Acides nucléiques contenant ou constitués par les séquences de nucléotides codant pour un quelconque des

polypeptides selon la revendication 1.

4. Acides nucléiques consistant en ou comprenant la séquence complète codant pour le récepteur MC-5 chez

l'homme ou chez l'animal.

5. Acides nucléiques comprenant ou constitués par les séquences SEQ ID N 1 ou N 3 ou des fragments de ces séquences.

6. Acide nucléique selon la revendication 5 constitué par la séquence s'étendant du nucléotide en position 253 à celui en position 1 227 dans l'identificateur

SEQ ID N 1.

7. Acides nucléiques selon la revendication 5 constitués par la séquence s'étendant du nucléotide en position 184 à celui en position 1 158 dans l'identificateur

SEQ ID N 3.

8. Vecteurs recombinants utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques, et

contenant un acide nucléique selon l'une des revendications

3 à 7.

9. Hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant selon la revendication 8 et susceptibles d'exprimer la séquence codante pour la synthèse d'un

polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2.

10. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés

contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2.

11. Sondes nucléotidiques s'hybridant avec l'un

des acides nucléiques selon l'une des revendications 3 à 7

ou avec leurs séquences complémentaires ou ARN correspondants, en étant spécifiques du récepteur MC-5, et qui ne s'hybrident pas avec les séquences nucléiques ou les

ARN correspondants des autres récepteurs aux mélanocortines.

12. Sondes selon la revendication 11 pour le diagnostic d'affections cardiovasculaires, rénales, neurologiques, psychiatriques, gastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes liées à des anomalies qualitatives ou

quantitatives du récepteur MC-5.

13. Sondes antisens comprenant ou constituées par la séquence inverse complémentaire ou un fragment des acides

nucléiques selon l'une des revendications 3 à 7 et

s'hybridant avec l'un desdits acides nucléiques, pour

bloquer l'expression du récepteur MC-5.

14. Sondes selon la revendication 13 pour le traitement d'affections cardiovasculaires, rénales, neurologiques, psychiatriques, gastro-entérologiques, notamment les troubles fonctionnels de l'intestin, les troubles moteurs ou sécrétoires et les dysfonctionnements de

la surrénale.

15. Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections cardiovasculaires notamment l'hypertension artérielle, les troubles neurologiques et psychiatriques, les troubles gastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou sécrétoires et les dysfonctionnements de la surrénale, dans lequel on met en contact, dans un milieu convenable, une molécule candidate avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des

revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit

polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire des sites spécifiques de ce polypeptide, l'éventuel complexe

ligand-polypeptide qui se forme étant alors détecté.

16. Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections cardiovasculaires notamment de l'hypertension artérielle, les troubles neurologiques et psychiatriques, les troubles gastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou sécrétoires et les dysfonctionnements de la surrénale dans lequel on mesure une réponse induite par la liaison d'une molécule candidate avec une cellule, transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour

un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et

susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface menbranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de telle manière que la mesure d'un signal tel que la production d'AMP cyclique permette de différencier les molécules mélanocortines ou leurs dérivés synthétiques qui se comportent comme antagonistes et celles

qui se comportent comme agonistes.

17. Procédé de criblage de ligands marqués tels que ligands radioactifs ou fluorescents dans lequel on mesure la liaison spécifique de liqands candidats avec la membrane d'une cellule transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des

revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit

polypeptide de façon à exprimer à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de manière telle que la liaison spécifique du ligand candidat puisse

être évaluée ou indirectement estimée.

18. Procédé d'identification de tissus ou cellules exprimant spontanément à leur surface membranaire un

polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 de telle

manière que lesdits tissus ou cellule, puissent servir à la mise au point de médicaments ou ligands marqués selon les

revendications 15 à 17.

19. Médicaments contenant, dans une dose prévue pour être administrée, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance active agoniste ou antagoniste, sur un polypeptide ayant une activité de récepteur MC-5 dans un

véhicule pharmaceutiquement acceptable.

20. Médicaments contenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'une substance active sur d'autres récepteurs des mélanocortines

mais non active sur le récepteur MC-5.