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Technisches
Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft die Identifizierung eines Liganden für einen
G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) und seine Verwendung in Durchmusterungsverfahren
und in der rationellen Wirkstoffentwicklung zur Identifizierung
von Antagonisten und Agonisten des Rezeptors.
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Hintergrund
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Die
Membranproteingen-Superfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
(GPCRs) wird dadurch gekennzeichnet, dass sie 7 mutmaßliche Transmembrandomänen besitzt.
Es wird angenommen, dass die Domänen
Transmembran-α-Helices
darstellen, die durch extrazelluläre und cytoplasmatische Schleifen
verbunden sind. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren schließen einen
weiten Bereich von biologisch aktiven Rezeptoren ein, wie z.B. Hormon-,
virale, Wachstumsfaktor- und Neurorezeptoren.
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G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren werden dadurch gekennzeichnet, dass sie diese 7 konservierten hydrophoben
Abschnitte mit ca. 20 bis 30 Aminosäuren einschließen, wobei
wenigstens 8 divergente hydrophile Schleifen verbunden werden. Die
G-Proteinfamilie von gekoppelten Rezeptoren schließt Dopaminrezeptoren
ein, die an neuroleptische Wirkstoffe binden, die zur Behandlung
von psychotischen und neurologischen Störungen verwendet werden. Andere
Beispiele für
Mitglieder dieser Familie schließen ohne Beschränkung Calcitonin-,
adrenerge, Endothelin-, cAMP-, Adenosin-, Muscarin-, Acetylcholin-,
Serotonin-, Histamin-, Thrombin-, Kinin-, follikelstimulierende
Hormon-, Opsin-, endotheliale Differenzierungsgen-1-, Rhodopsin-, Duft-
und Cytomegalovirus-Rezeptoren ein.
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Die
meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren haben einzelne konservierte
Cysteinreste in jeder der ersten zwei extrazellulären Schleifen,
die Disulfidbindungen bilden, von denen angenommen wird, dass sie
die funktionelle Proteinstruktur stabilisieren. Die 7 Transmembranregionen
werden als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7 bezeichnet. TM3
wurde mit der Signaltransduktion in Verbindung gebracht.
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Die
Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung)
von Cysteinresten kann die Signaltransduktion einiger G-Protein-gekoppelter
Rezeptoren beeinflussen. Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren enthalten potentielle
Phosphorylierungsstellen innerhalb der dritten cytoplasmatischen Schleife
und/oder innerhalb des Carboxy-Terminus. Für mehrere G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren wie den B-Adrenorezeptor vermittelt die Phosphorylierung
durch Proteinkinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen eine
Rezeptordesensibilisierung.
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Für einige
Rezeptoren wird angenommen, dass die Ligandenbindungsorte der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
einen hydrophilene Anschluss umfassen, der durch mehrere G-Protein-gekoppelte
Rezeptor-Transmembrandomänen
gebildet wird, wobei der Anschluss von hydrophoben Resten der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
umgeben ist. Es wird postuliert, dass die hydrophile Seite jeder
G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Transmembranhelix nach innen zeigt
und einen polaren Ligandenbindungsort bildet. TM3 wurde mit mehreren
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren als einen Ligandenbindungsort,
wie z.B. der TM3-Aspartatrest, aufweisend in Verbindung gebracht.
TM5-Serine, ein TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine
werden ebenfalls mit der Ligandenbindung in Verbindung gebracht.
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G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren können
intrazellulär
durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene intrazelluläre Enzyme,
Ionenkanäle
und Transporter gekoppelt werden (s. Johnson et al., Endoc. Rev., (1989)
10: 317-331). Unterschiedliche G-Protein-A-Untereinheiten stimulieren
vorzugsweise besondere Effektoren zur Modulierung verschiedener
biologischer Funktionen in einer Zelle. Die Phosphorylierung von
cytoplasmatischen Resten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wurde
als ein wichtiger Mechanismus für
die Regulierung der G-Protein-Kopplung einiger G-Protein-gekoppelter
Rezeptoren identifiziert. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden
an zahlreichen Orten innerhalb eines Säugetierwirtes gefunden.
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In
den vergangenen 15 Jahren wurden beinahe 150 therapeutische Mittel,
die auf 7-Transmembran-(7-TM)-Rezeptoren abzielen, erfolgreich im
Markt eingeführt,
wodurch ihr Wert als therapeutische Ziele etabliert wurde.
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Zusammenfassung
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Ein
erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern
einer Testverbindung zur Bestimmung, ob die Verbindung ein GPR40-Rezeptorligand
ist. Das Verfahren umfasst das Detektieren, ob die Testverbindung
kompetitiv die Bindung eines Fettsäure-GPR40-Liganden an einen
GPR40-Rezeptor inhibiert, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand eine gesättigte oder
ungesättigte
C6-C23-Fettsäure ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität. Das Verfahren
umfasst das Bereitstellen einer Testzelle, die auf ihrer Oberfläche einen
GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reporterkonstrukt enthält, das
ein Gq-reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst,
worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal
erzeugt. Die Testzelloberfläche
wird einem GPR40-Fettsäureagonisten
unter Bedingungen ausgesetzt, die die Bindung eines GPR40-Fettsäureagonisten
erlauben, und dann einer Testverbindung ausgesetzt. Jedes durch
das Reportergen erzeugte detektierbare Signal wird gemessen und
mit dem detektierbaren Signal verglichen, dessen Erzeugung erwartet
wird, falls die Zelle nur dem GPR40-Agonisten ausgesetzt würde. Eine Abnahme
des detektierbaren Signals zeigt an, dass die Testverbindung ein
GPR40-Antagonist
ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität. Das Verfahren
umfasst das Bereitstellen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen
GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reportkonstrukt enthält, das
ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst,
worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal
erzeugt. Das reagierende Transkriptionselement kann ein Gi-reagierendes
Transkriptionselement, ein Gq-reagierendes Transkriptionselement
oder ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement sein. Die Testverbindung
wird mit der Zelloberfläche
unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bindung eines GPR40-Liganden
an den GPR40-Rezeptor erlauben, und die Reportgenexpression wird
detektiert.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität. Das Verfahren
umfasst das Bereitstellen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen
GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reporterkonstrukt enthält, das
ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst,
worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt.
Das reagierende Transkriptionselement kann ein Gi-reagierendes Transkriptionselement,
ein Gq-reagierendes Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes
Transkriptionselement sein. Die Zelloberfläche wird mit einer Testverbindung
und einem GPR40-Agonisten unter Bedingungen in Kontakt gebracht,
die die Bindung eines GPR40-Liganden an den GPR40-Rezeptor erlauben,
und die Reportergenexpression wird detektiert. Eine verringerte
Reportergenexpression in Gegenwart von sowohl Testverbindung als
auch Agonist im Vergleich mit der Reportergenexpression in Gegenwart
nur des GPR40-Agonisten zeigt an, dass die Testverbindung ein GPR40-Antagonist
ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität, worin
das Verfahren das Detektieren umfasst, ob eine Testverbindung die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung
aus oder Produktion durch Säugetier-Pankreas-β-Zellen in
Gegenwart eines GPR40-Agonisten verringert, verglichen mit der Glucose-stimulierten
Insulinfreisetzung, die aufgrund der Gegenwart des GPR40-Agonisten
auftreten würde.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität, das das
Detektieren umfasst, ob die Verbindung an GPR40 bindet und die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung
aus oder Produktion durch Säugetier-Pankreas-β-Zellen erhöht.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeigt
die Calciumreaktion (gemessen durch Fluoreszenzveränderung)
von GPR40 auf die Fettsäure
Elaidinsäure
in HEK-293-Zellen,
die transient entweder GPR40, den 7TM-Rezeptor GPRW oder den 7TM-Rezeptor
HLTEX11 exprimieren.
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2 zeigt
die Ergebnisse von Tests unter Verwendung von transient transfizierten
Melanophoren zur Bestimmung der G-Protein-Kopplung von GPR40. Zunehmende
Mengen von transfizierter GPR40-DNA erzeugten eine Zunahme der Gαi/Gαo-Aktivität, was anzeigt,
dass eine konstitutive Aktivität
von GPR40 durch Gαi erfolgt.
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3a zeichnet
die x-fache Reaktion von CHO-Zellen auf, die CRE-Luciferase humanes GPR40 exprimieren;
es gab keine Zunahme der im CRE-System
detektierten Reporteraktivität
bei jeglicher Dosis von GPR40-Expressionsvektor.
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3b zeichnet
die x-fache Reaktion von CHO-Zellen auf, die CRE-Luciferase humaner GS-gekoppelter Rezeptor
exprimieren; es gab eine signifikante Zunahme der mit zunehmenden
Dosen von Expressionsvektor detektierten Luciferaseaktivität.
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3c zeichnet
die Wirkung von Calcitonin und Eicosatriinsäure auf die Luciferaseaktivität von CHO-Zellen
auf, die CRE-Luciferase humanes GPR40 exprimieren, oder von CHO-Zellen,
die CRE-Luciferase ohne Rezeptor exprimieren. Die Luciferaseproduktion
nahm durch Calcitonin sowohl in den Zellen, die nur Reporter enthielten,
als auch in den Zellen, die GPR40 enthielten, zu, wohingegen kein
signifikanter Effekt von 5,8,11-Eicosatriinsäure bei
jeglicher getesteter Konzentration detektiert wurde.
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4A zeigt
Veränderungen
der L-alpha-Lysophosphatidsäure-(LPA)-stimulierten Reporteraktivität mit und
ohne Pertussistoxin-(PTX)-Behandlung.
Wirtszellen bestanden aus CHO-Zellen, die GAL4/Elk-1-Luciferase-Reporterkonstrukte
enthielten. 3G8 und 5F6 sind klonale CHO-Zelllinien, die mit humanem GPR40 transfiziert
sind und GAL4/Elk-1-Luciferase-Reportkonstrukt
enthalten. Die Luciferaseproduktion in Wirtszellen aufgrund von
LPA-Stimulation wurde durch Pertussistoxin-Behandlung aufgehoben.
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4B zeigt
Veränderungen
der 5,8,11-Eicosatriinsäure-stimulierten
Reporteraktivität
mit und ohne Pertussistoxin-(PTX)-Behandlung. Die Zellen sind wie
für 4A beschrieben.
Die Luciferaseproduktion aufgrund von 5,8,11-Eicosatriinsäure-Stimulation
war in Zellen erhöht,
die GPR40 transfiziert waren, und wurde nicht durch Pertussistoxin-Behandlung
gehemmt.
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4C zeigt
Veränderungen
der Thrombin-stimulierten Reporteraktivität mit und ohne Pertussistoxin-(PTX)-Behandlung.
Die Zellen sind wie für 4A beschrieben.
Die Luciferaseproduktion aufgrund von Thrombin-Stimulation war nur
teilweise abgeschwächt
nach Pertussistoxin-Behandlung.
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4D zeigt
die prozentuale Inhibierung der Luciferase-Aktivität nach Pertussistoxin-Behandlung
in CHO-Zellen, die nur GAL4/ELK-1-Luciferase exprimieren (Wirtszelle),
und in 5 unterschiedlichen CHO-Zellklonen, die GAL4/ELK1-Luciferase
und humanes GPR40 exprimieren.
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4E zeigt
Basis-Luciferasezahlen aus CHO-Zellen, die nur GAL4/ELK1-Luciferase
exprimieren (Wirtszelle), und aus unterschiedlichen CHO-Zellklonen,
die GAL4/ELK1-Luciferase und humanes GPR40 exprimieren, entweder
mit oder ohne Pertussistoxin-Behandlung. Mit GPR40-Expressionskonstrukt
und ELK-Gal4-Reporter transfizierte Klone wiesen eine erhöhte Basis-Reporteraktivität verglichen
mit derjenigen der Wirtszelllinie auf, aber diese war um bis zu
70% nach Pertussistoxin-Behandlung
verringert.
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Ausführliche
Beschreibung
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GPR40
ist ein vor kurzem beschriebener seltener G-Protein-gekoppelter
Rezeptor, der während
einer Suche nach neuen Rezeptoren isoliert wurde (Sawzdargo, M.
(1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 239 (2), 543-547). Die Polynukleotidsequenz
von humanem GPR40 (GenBank-Eingansnummer NM_005303) ist hier in
SEQ ID NO: 1 angegeben, und die Aminosäuresequenz des dadurch kodierten
Polypeptids ist hier in SEQ ID NO: 2 angegeben.
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Vor
noch neuerer Zeit wurde ein Mäuse-GPR40-Ortholog
kloniert und sequenziert (US-Patentanmeldung Nr. 60/234,253, SmithKline
Beecham). Die Polynukleotidsequenz von Mäuse-GPR40 wird hier in SEQ
ID NO: 3 angegeben, und das dadurch kodierte Polypeptid hat die
vorliegende Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 4.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf dem ungewöhnlichen und unerwarteten Befund,
dass der humane GPR40-Rezeptor spezifisch durch sowohl gesättigte als
auch ungesättigte
Fettsäure
aktiviert wird. Ferner wurde gezeigt, dass GPR40 in der menschlichen
Bauchspeicheldrüse
exprimiert wird, spezifisch in den β-Zellen der Langerhansschen
Inseln.
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Die
vorliegenden Erfinder stellten fest, dass der GPR40-Rezeptor konstitutiv
durch ein Pertussistoxin-empfindliches G-Protein wirken kann. Sowohl
Gi- als auch Go-Proteine (und Subtypen davon) sind als Pertussistoxin-empfindlich
bekannt. Jedoch führten
die vorliegenden Erfinder weitere Untersuchungen zur Feststellung
durch, dass Fettsäuren
GPR40-Liganden sind, die über
Gq-Protein (Pertussistoxin-unempfindliches G-Protein) wirken.
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Viele
Studien haben gezeigt, dass die akute Behandlung von Langerhansschen
Inseln mit Fettsäuren (1-3
Stunden) die Glucose-stimulierte Insulinsekretion stimuliert, wohingegen
längere
Behandlungszeiträume (6-24
Stunden) inhibitorisch für
die Glucose-stimulierte Insulinsekretion sind (Warnotte C. et al.
(1994), Diabetes 43(5): 703-7111; Zhou YP. et al. (1996), Metabolism:
Clinical & Experimental,
45(8): 981-986). Es gibt zunehmende Beweise, die zeigen, dass eine
Zunahme der Plasma-Fettsäurespiegel
nachteilig für
die β-Zellfunktion
sein kann (Lipotoxizität).
Studien in den ZDF-Ratten, die häufig
als Modell für
Diabetes verwendet werden, haben gezeigt, dass erhöhte Spiegel
von Fettsäuren
im Kreislauf zur Produktion von Ceramid, Aktivierung von Stickoxidsynthase
und Apoptose von β-Zellen
führen
(Shimabukuro M. et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2498-2502).
Wir haben festgestellt, dass die Expression von GPR40 in humanen
Langerhansschen Inseln um das 2- bis
100-fache (4 individuelle Proben analysiert) für einen äquivalenten RNA-Eingang im
Vergleich mit humaner vollständiger
Bauchspeicheldrüsen-RNA
angereichert ist. Diese Gewebelokalisierung legt nahe, dass der
Rezeptor eine Rolle in der β-Zellfunktion
haben kann. Der Befund, dass Fettsäuren Liganden für GPR40
sind, kann in der Aufklärung
der GPR40-Funktion in den β-Zellen
helfen. Eine Konsequenz der akuten Rezeptoraktivierung kann deshalb
die Steigerung der Glucose-stimulierten Insulinsekretion sein, wohingegen man
erwarten kann, dass längere
Zeiträume
zu Abnahmen der Glucose-stimulierten Insulinsekretion und von Genen
führen,
die mit Glucoseempfindlichkeit von β-Zellen verbunden sind, z.B.
Glucokinase. Auf dieser Basis ist es möglich, dass entweder Agonisten
oder Antagonisten für
GPR40 von therapeutischem Wert für
Diabetes und insbesondere für
Typ II-Diabetes
sein können.
Man kann deshalb erwarten, dass die Behandlung mit einem GPR40-Agonisten
die Glucose-stimulierte Insulinsekretion auf β-Zellen kurzfristig erhöht. GPR40-Antagonisten
können
von therapeutischem Wert in Bezug auf mögliche Reduktionen der Lipotoxizität sein und
somit zur Verbesserung der β-Zellfunktion
wirken.
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Diese
Identifizierung von Fettsäuren
als Liganden für
GPR40 erleichtert deshalb die Entwicklung von Durchmusterungsverfahren
zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten des Rezeptors.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren
von Verbindungen bereit, die an den GPR40-Rezeptor binden und ihn
aktivieren (Agonist) oder seine Aktivierung inhibieren (Antagonist),
wobei das Verfahren die Verwendung von GPR40 in Kombination mit
Fettsäure-GPR40-Liganden
von gesättigten
oder ungesättigten
C6-C23-Fettsäure, die
ggf. bis zu 6 Alken- oder 3 Acetylenbindungen, ggf. cyclisch oder
verzweigt, und ggf. substituiert mit 1 bis 3 Hydroxygruppen, umfasst.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet „GPR40" ein Rezeptorpolypeptid
mit wenigstens 95% Identität
mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptidsequenz und mit GPR40-Funktion;
GPR40-Rezeptorpolypeptide, die in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, stammen bevorzugt aus Säugern und
sind besonders bevorzugt human. GPR40 bezeichnet auch Derivate des
Rezeptors, die in den hier offenbarten Durchmusterungs- und rationalen wirkstoffentwicklungsverfahren
nützlich
sind. Solche Derivate schließen
Teile des Polypeptids auf SEQ ID NO: 2 ein, die Ligandenbindungsfunktion
bewahren.
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Bevorzugt
ist der Fettsäureligand
aus der Gruppe ausgewählt,
die aus folgenden Mitgliedern besteht:
- 1) trans-Retinolsäure (Vitamin
A-Säure;
Tretinoin) C20H28O2 (unges.)
- 2) cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure C22H32O2 (unges.)
- 3) Palmitinsäure
C16H32O2 (ges.)
- 4) Pentadecansäure
C15H30O2 (ges.)
- 5) Elaidinsäure
C18H34O2 (unges.)
- 6) Petroselinsäure
C18H34O2 (unges.)
- 7) Heptadecansäure
C17H34O2 (ges.)
- 8) Tridecansäure
C13H26O2 (ges.)
- 9) Laurinsäure
(Dodecansäure)
C12H24O2 (ges.)
- 10) Arachidonsäure
C20H32O2 (unges.)
- 11) Linolensäure
C18H30O2 (unges.)
- 12) Palmitoleinsäure
C16H30O2 (unges.)
- 13) Caprinsäure
C10H20O2 (ges.)
- 14) Myristinsäure
C14H28O2 (ges.)
- 15) Stearinsäure
C18H36O2 (ges.)
- 16) Undecansäure
C11H22O2 (ges.)
- 17) Eicosatriinsäure
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In
dieser Liste bezeichnet „ges." eine gesättigte und „unges." eine ungesättigte Fettsäure.
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Wie
hier nachfolgend verwendet, wird der Begriff „Fettsäureligand" als ein Fettsäureligand der Erfindung definiert,
wobei der Ligand eine gesättigte
oder ungesättigte
C6-C23-Fettsäure ist,
die ggf. bis zu 6 Alken- oder
3 Acetylenbindungen enthält,
ggf. cyclisch oder verzweigt und ggf. mit 1 bis 3 Hydroxygruppen
substituiert.
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Unter
Verwendung der Verfahren der Erfindung identifizierte Verbindungen
können
nützlich
in der Behandlung von Typ II-Diabetes (nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus, NIDDM)
und Fettsucht, Glucoseintoleranz, Insulinresistenz, neurodegenerativer
Krankheit (z.B. Alzheimer-Krankheit) und anderen Indikationen wie
Schlaganfall sein.
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In
einer ersten Ausführungsform
kann ein Agonist oder Antagonist von GPR40 durch In-Kontakt-Bringen
einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche den Rezeptor GPR40 exprimiert,
wobei der Rezeptor mit einer zweiten Komponente assoziiert ist,
die ein detektierbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer
Verbindung an den Rezeptor liefern kann, mit einer zu durchmusternden
Verbindung unter Bedingungen, die die Bindung an den Rezeptor erlauben;
und durch Bestimmung, ob die Verbindung an den Rezeptor bindet und
ihn aktiviert oder inhibiert, durch Bestimmung der Gegenwart oder
Abwesenheit eines Signals identifiziert werden, das aus der Wechselwirkung
der Verbindung mit dem Rezeptor erzeugt wird, ggf. in Gegenwart
von markiertem oder unmarkiertem Ligand, z.B. einem Fettsäureligand.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann ein Agonist oder Antagonist von GPR40 durch Bestimmen der Inhibierung
der Bindung eines Liganden (z.B. eines Fettsäureliganden) an Zellen, die
den GPR40-Rezeptor auf ihrer Oberfläche aufweisen, oder mit Zellmembranen,
die den Rezeptor enthalten, in Gegenwart einer Kandidatenverbindung
und unter Bedingungen identifiziert werden, die die Bindung an den
Rezeptor erlauben. Durch Bestimmung der an den Rezeptor gebundenen
Ligandenmenge wird eine Verbindung, die eine Reduzierung der Bindung
eines Liganden verursachen kann, als Agonist oder Antagonist von
GPR40 identifiziert.
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Allgemein
beinhalten solche Durchmusterungsverfahren das Bereitstellen geeigneter
Zellen, die GPR40 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Solche Zellen
schließen
Zellen aus Säugetieren
(z.B. Eierstock des Chinesischen Hamsters (CHO), HEK (humane embryonale
Niere), Beta-Zellen aus Langerhansschen Inseln), Melanophorzellen
und Zellen aus Drosophila oder E. coli ein. Insbesondere wird ein
Polynukleotid, das GPR40 kodiert, zur Transfektion von Zellen eingesetzt,
um dadurch den Rezeptor zu exprimieren. Die Konstruktion von Expressionsvektoren,
die ein GPR40-kodierendes Polynukleotid umfassen, und die Transfektion
von Zellen mit den GPR40-Expressionsvektoren
kann unter Verwendung von Standardverfahren erreicht werden, wie
sie z.B. beschrieben werden in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Die Rezeptorexpression kann transient
oder stabil sein. Bevorzugt ist die Expression stabil. Besonders
bevorzugt wird eine Säuger-Zelllinie
mit einem Expressionsvektor transfiziert, der eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, die den GPR40-Rezeptor kodiert, z.B. das Polynukleotid
von SEQ ID NO: 1, oder die kodierende Region davon, und die Zelllinie
wird dann in einem Kulturmedium kultiviert, so dass der Rezeptor
stabil auf der Oberfläche
der Zelle exprimiert wird. Der exprimierte Rezeptor wird dann mit
einer Testverbindung zur Beobachtung von Bindung, Stimulation oder
Inhibierung einer funktionellen Reaktion in Gegenwart oder Abwesenheit
eines Liganden (wie eines Fettsäureliganden
wie hier oben beschrieben) in Kontakt gebracht.
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Tests
wie hier beschrieben können
intakte Zellen verwenden, die funktionelles GPR40 exprimieren, oder
Zellmembranen, die den Rezeptor enthalten, wie es fachbekannt ist.
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Alternativ
kann ein löslicher
Teil des GPR40-Rezeptors (d.h. nicht membrangebunden), der die Ligandenbindungsdomäne umfasst,
in der löslichen
Fraktion exprimiert werden, entweder im intrazellulären Kompartiment
oder sezerniert aus der Zelle in das Medium. Techniken zur Isolierung
und Reinigung von exprimierten löslichen
Rezeptoren sind allgemein fachbekannt.
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Ein
Beispiel für
ein Durchmusterungsverfahren schließt das Exprimieren von GPR40
ein, in dem der Rezeptor an Phospholipase C oder D gebunden ist.
Repräsentative
Beispiele für
solche Zellen schließen
ohne Beschränkung
Endothelzellen, glatte Muskelzellen und embryonale Nierenzellen
ein. Die Durchmusterung kann wie hier oben beschrieben durch Detektieren
der Aktivierung des Rezeptors oder der Inhibierung der Aktivierung
des Rezeptors aus dem Phospholipase-Sekundärsignal erreicht werden.
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Ein
anderes Verfahren beinhaltet das Durchmustern auf Verbindungen,
die Liganden für
GPR40 sind, durch Bestimmung der Inhibierung der Bindung eines markierten
Liganden (wie eines Fettsäureliganden)
an Zellen, die den Rezeptor auf ihrer Oberfläche aufweisen, oder an Zellmembranen,
die den Rezeptor enthalten. Ein solches Verfahren beinhaltet das
Transfizieren einer eukaryotischen Zelle mit DNA, die GPR40 kodiert,
so dass die Zelle den Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert. Die Zelle wird
dann mit einer Testverbindung in Gegenwart einer markierten Form
eines Liganden, wie z.B. mit einem markierten Fettsäureliganden,
in Kontakt gebracht. Der Ligand kann unter Verwendung jedes geeigneten
Verfahrens markiert werden, wie es fachbekannt ist, einschließlich Radioaktivität (z.B.
mit 125Iod), fluoreszente Verbindungen, β-Glucuronidase,
Luciferase etc. Die an die Rezeptoren gebundene Menge von markiertem
Ligand wird z.B. durch Messung der Radioaktivität gemessen, die mit transfizierten
Zellen oder Membranen aus diesen Zellen assoziiert ist. Falls die Testverbindung
an den Rezeptor bindet, wird die Bindung von markiertem Ligand an
den Rezeptor inhibiert, wie es durch eine Reduzierung des markierten
Liganden bestimmt wird, der an die Rezeptoren bindet. Dieses Verfahren
wird allgemein als Bindungstest („Bindungsassay") bezeichnet.
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Ein
weiteres Durchmusterungsverfahren beinhaltet die Verwendung von
Säugerzellen,
die zur Expression von funktionellem GPR40 transfiziert sind. Die
Zellen werden mit einem Indikatorfarbstoff beladen, der ein Fluoreszenzsignal
bei Bindung an Calcium erzeugt, und die Zellen werden mit einer
Testsubstanz und/oder einem Rezeptoragonisten wie einem Fettsäureliganden
in Kontakt gebracht. Jede Veränderung
des Fluoreszenzsignals wird über
einen definierten Zeitraum unter Verwendung z.B. eines Fluoreszenzspektrophotometers
oder Fluoreszenz-Bildplattenlesegerät („Fluorescence
Imaging Plate Reader")
gemessen. Eine Veränderung
des durch den Liganden erzeugten Fluoreszenzsignalmusters zeigt an,
dass eine Verbindung ein potentieller Agonist für den Rezeptor ist. Eine Abnahme
des durch den Agonisten in Gegenwart der Testverbindung erzeugten
Fluoreszenzsignalmusters zeigt an, dass eine Verbindung ein potentieller
Antagonist für
den Rezeptor ist.
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Ein
anderes Verfahren beinhaltet das Durchmustern auf GPR40-Liganden
durch Bestimmung der Wirkungen auf die Rezeptor-vermittelte cAMP-
und/oder Adenylylcyclase-Anreicherung. Ein solches Verfahren beinhaltet
das transiente oder stabile Transfizieren einer eukaryotischen Zelle
mit GPR40 zur Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche. Die
Zelle wird dann mit Testverbindungen in Gegenwart oder Abwesenheit eines
GPR40-Agonisten wie einer Fettsäure
in Kontakt gebracht. Die Veränderung
des cAMP-Spiegels wird dann über
einen definierten Zeitraum gemessen, z.B. durch Radioimmun- oder Proteinbindungstests
(z.B. unter Verwendung von F1ashPlates (PerkinElmer Life Sciences)
oder eines Scintillationsproximitätstests). Veränderungen
der cAMP-Spiegel können
auch durch direktes Messen der Aktivität des Enzyms, Adenylatcyclase,
in aufgebrochenen Zellzubereitungen bestimmt werden. Falls die Testverbindung
den Rezeptor bindet und die GPR40-Aktivierung beeinflusst, werden
die Spiegel von GPR40-vermitteltem cAMP oder die Adenylatcyclase-Aktivität reduziert
oder erhöht
sein.
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Verschiedene
Verfahren sind zur Detektion von GPCR-Aktivierung fachbekannt, abhängig zum
Teil vom G-Protein, an das der Rezeptor gekoppelt ist. Z.B. verringert
die Aktivierung des Gi-Reaktionsweges die Adenylylcyclase-Aktivität, und ein
Gi-Signal kann durch Messung der Inhibierung der Forskolin-stimulierten cAMP-Anreicherung
detektiert werden (Wong et al., Methods Enzymology, 238:81 (1994)).
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Die
Verwendung von Reporter-basierten Tests ist fachbekannt zur Identifizierung
von GPCR-Liganden. Allgemein verwenden solche Tests rekombinante
Zellen, die ein funktionelles Zielrezeptorprotein exprimieren, dessen
Signaltransduktionsaktivität
durch Wechselwirkung mit einem extrazellulären Liganden moduliert wird,
wobei die Transduktionsaktivität
ein detektierbares Signal erzeugen kann. Siehe z.B. Chen et al.,
J. Pharmacol. Toxicol. 42:199 (1999); Stables et al., J. Recept.
Signal Transduct. Res. 19:395 (1999).
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Zur
Veranschaulichung wird das transduzierte intrazelluläre Signal
durch die spezifische Wechselwirkung eines extrazellulären Liganden
mit dem Rezeptor auf der Zelloberfläche eingeleitet. Diese Wechselwirkung
leitet eine Reihe von intrazellulären Ereignissen ein, die zu
einer schnellen und detektierbaren Veränderung der Transkription oder
Translation eines Gens führen.
Durch Selektieren regulatorischer Transkriptionssequenzen, die auf
die transduzierten intrazellulären
Signale ansprechen, und funktionsfähiges Verbinden der ausgewählten Promotoren
mit Reportergenen, deren Transkription, Translation oder letztliche
Aktivität
leicht detektierbar und messbar ist, zeigt der Transkriptions-basierte
Test an, ob ein spezifischer Rezeptor mit einer Testverbindung zur
Beeinflussung der intrazellulären
Transduktion wechselwirkt. Siehe z.B. Himmler et al., J. Receptor
Res. 13:79 (1993); Weyer et al., Receptors and Channels 1:193 (1993);
Bevan et al., Neuroreport 9:2703 (1998).
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Unter
Verwendung solcher Tests können
Testverbindungen, die die Rezeptorsignalisierung induzieren, identifiziert
werden (Agonisten). Alternativ kann der Test Testverbindungen auf
die Fähigkeit
zur Potenzierung der Induktionsreaktion untersuchen, die durch Behandlung
der Zelle mit einem bekannten Agonisten erzeugt wird. Falls die
Testverbindung die Aktivität
des Rezeptorproteins nicht direkt zu induzieren scheint, kann der
Test mit der rekombinanten Zelle wiederholt werden, die zuerst mit
einem bekannten Aktivator des Zielrezeptors in Kontakt gebracht
wurde, um den Signaltransduktionsweg zu induzieren (und das detektierbare
Signal zu erzeugen). Testverbindungen können dann auf die Fähigkeit
untersucht werden, der Aktivierung des Rezeptors durch einen bekannten
Agonistaktivator entgegenzuwirken (zu inhibieren oder zu blockieren).
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Wie
hier verwendet, bezeichnet ein „Agonist" Mittel, die die Aktivierung von Rezeptorsignalisierungswegen
induzieren, z.B. durch Nachahmung eines Liganden für den Rezeptor,
sowie Mittel, die die Empfindlichkeit des Rezeptors für einen
Liganden potenzieren, z.B. die Konzentrationen an Ligand verringern,
die zur Induzierung einer besonderen Höhe der Rezeptor-abhängigen Signalisierung
erforderlich sind.
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In
solchen Tests verwendete Zellen können den Rezeptor von Interesse
endogen exprimieren oder können
manipuliert werden, um ein heterologes Zielrezeptorprotein zu exprimieren.
Verfahren zur Einführung heterologer
DNA in eukaryotische Zellen sind fachbekannt, und jedes geeignete
Verfahren kann verwendet werden. Wie es fachbekannt ist, kann es
wünschenswert
sein, ein oder mehrere endogene Gene der Wirtszellen zu inaktivieren
(z.B. das Gen für
den homologen Rezeptor). Zusätzlich
können
andere Proteine, die an der Signaltransduktion aus dem Zielrezeptor
beteiligt sind, inaktiviert oder mit einem Ortholog oder Paralog
aus einem anderen Organismus ergänzt
werden, z.B. können
G-Proteinuntereinheiten aus Hefe durch G-Proteinunterheiten aus
Säugetieren
in Hefezellen ergänzt
werden, die auch zur Expression eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors
aus Säugetier
manipuliert sind.
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Die
Wirtszelle kann ein Reporterkonstrukt enthalten, das ein Reportergen
in funktionsfähiger
Verbindung mit einem oder mehreren regulatorischen Transkriptionselementen
umfasst, die auf die Signaltransduktionsaktivität des Rezeptorproteins reagieren.
Exemplarische Reportergene schließen Enzyme (z.B. Luciferase,
Phosphatase, sezernierte alkalische Phosphatase, β-Galactosidase,
grün fluoreszierendes
Protein, Beta-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase), die
ein spektrometrisch aktives Signal erzeugen können (z.B. Veränderungen
von Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz), oder ein Genprodukt ein,
das einen zellulären
Phänotyp
verändert
(z.B. Zellwachstum, Wirkstoffresistenz oder Auxotrophie).
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Wie
hier verwendet, ist ein „Reportergenkonstrukt" ein Nukleinsäuremolekül, das ein
Reportergen einschließt,
das funktionsfähig
mit einer regulatorischen Transkriptionssequenz (Sequenzen) oder
einem Element (Elementen) verbunden ist, die die Transkription des
Reportergens kontrollieren. Die Aktivität wenigstens einer oder mehrerer
dieser Kontrollsequenzen wird direkt oder indirekt durch das Zielrezeptorprotein
reguliert. Die regulatorischen Transkriptionssequenzen schließen die
Promotor- und anderen regulatorischen Regionen ein, wie z.B. Verstärkersequenzen,
die die Aktivität
des Promotors modulieren, oder regulatorische Sequenzen, die die
Aktivität
oder Effizienz der RNA-Polymerase
modulieren, die den Promotor erkennt, oder regulatorische Sequenzen,
die durch Effektormoleküle
erkannt werden, einschließlich
derjenigen, die spezifisch durch Wechselwirkung eines extrazellulären Signals
mit dem Zielrezeptor induziert werden. Z.B. kann die Modulierung
der Aktivität
des Promotors durch Veränderung
der RNA-Polymerasebindung an die Promotorregion bewirkt werden,
oder alternativ durch Wechselwirken mit der Einleitung der Transkription
oder Verlängerung
der mRNA. Solche Sequenzen werden hier kollektiv als regulatorische
Transkriptionselemente oder -sequenzen bezeichnet. Zusätzlich kann
das Konstrukt Sequenzen von Nukleotiden einschließen, die
die Translation der resultierenden mRNA verändern, wodurch die Menge des
Reportgenprodukts verändert
wird.
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Der
Grad der Expression des Reportergens liefert das Rezeptor-abhängige Detektionssignal.
Die Höhe
der Transkription aus dem Reportergen kann unter Verwendung jedes
geeigneten Verfahrens gemessen werden, das den Fachleuten bekannt
ist. Z.B. kann die spezifische mRNA-Expression unter Verwendung
von Northern Blots oder quantitativer Echtzeit- Polymerasekettenreaktion (PTR), wie
z.B. als TAQMAN erhältlich, detektiert
werden; oder spezifisches Proteinprodukt kann durch eine charakteristische
Färbung
oder eine intrinsische Aktivität
identifiziert werden. Das Reportergen kann ein Genprodukt kodieren,
das durch enzymatische Aktivität
zu einem Detektionssignal auf Basis von Farbe, Fluoreszenz oder
Lumineszenz führt.
Die Reaktion des Reportergens wird dann mit der Reaktion in entweder
der gleichen Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen,
oder sie kann mit der Reaktion in einer im wesentlichen identischen
Zelle verglichen werden, der die spezifischen Rezeptoren fehlen.
Jeder statistisch oder in anderer Weise signifikante Unterschied der
Reaktion zeigt an, dass die Testverbindung die Aktivität des spezifischen
Rezeptors verändert
hat.
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Agonisten
und Antagonisten sind „Rezeptoreffektor"-Moleküle, die
die Signaltransduktion über
den Rezeptor modulieren. Die Rezeptoreffektor-Moleküle können an den Rezeptor binden,
obwohl nicht notwendigerweise am Bindungsort des natürlichen
Liganden. Rezeptoreffektoren können
die Signaltransduktion modulieren, wenn sie allein verwendet werden
(Ersatzliganden), oder können
die Signaltransduktion in Gegenwart des natürlichen Liganden verändern, entweder
zur Steigerung oder Inhibierung der Signalisierung durch den natürlichen
Liganden. Z.B. sind „Antagonisten" Moleküle, die
die Signaltransduktionsaktivität
des Rezeptors blockieren oder verringern, z.B. können sie kompetitiv oder nicht-kompetitiv
und/oder allosterisch die Signaltransduktion aus dem Rezeptor inhibieren,
wohingegen „Agonisten" die Signaltransduktionsaktivität eines
Rezeptors potenzieren, induzieren oder in anderer Weise steigern.
Die Begriffe „Rezeptoraktivator" und „Ersatzligand" bezeichnen einen
Agonisten, der die Signaltransduktion aus einem Rezeptor induziert.
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„Signaltransduktion" ist die Verarbeitung
von chemischen Signalen aus der zellulären Umgebung durch die Zellmembran
und kann durch einen oder mehrere verschiedene Mechanismen wie Phosphorylierung,
Aktivierung von Ionenkanälen,
Effektorenzymaktivierung über
Guaninnukleotid-bindende Proteinzwischenstufen, Bildung von Inositphosphat,
Aktivierung von Adenylylcylase und/oder direkte Aktivierung (oder Inhibierung)
eines Transkriptionsfaktors erfolgen. Der Begriff „Modulation
einer Signaltransduktionsaktivität
eines Rezeptorproteins" in
seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, wie hier verwendet,
bezeichnet die Induktion und/oder Potenzierung sowie die Inhibierung
eines oder mehrerer Signaltransduktionswege stromabwärts eines
Rezeptors.
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Verfahren,
die Pigmentzellen zum Identifizieren von GPCR-Liganden verwendet,
sind fachbekannt. Allgemein verwendet das Verfahren Pigmentzellen,
die Pigment als Reaktion auf einen Rezeptor-vermittelten Reiz dispergieren
oder aggregieren können
und einen endogenen G-Protein-gekoppelten
Rezeptor exprimieren. Der Zustand des Pigments (Aggregation oder
Dispersion) als Reaktion auf eine Testverbindung zeigt an, ob die
Testverbindung mit dem exprimierten GPCR wechselwirkt. Siehe z.B.
US-PS 5,462,856; US-PS 6,051,386.
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Xenopus
laevis-Melanophoren können
funktionell rekombinante Rezeptoren exprimieren, die G-Protein unter
Adenylierung von Cyclase oder Phospholipase C (PLC) koppeln. Die
Rezeptor-vermittelte Stimulation eines dieser Enzyme verursacht
die Dispersion von Melanosomen, während die Rezeptorstimulation,
die die Adenylatcyclase inhibiert, die Melanosomaggregation induziert.
Verschiedene Tests wurden entwickelt, die Xenopus-Melanophoren verwenden,
die mit einem GPCR von Interesse transfiziert sind, um die agonistischen (oder
antagonistischen) Wirkungen von Testverbindungen auf die Rezeptoren
zu detektieren. Siehe z.B. Chen et al., J. Pharmacol. Toxicol. 42:199
(1999); McClintock et al., Anal. Biochem. 209:298 (1993); Potenza
et al., Anal. Biochem. 206:315 (1992); Potenza et al., Pigment Cell
Res. 5:372 (1992).
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Der
Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPRTM,
Molecular Devices, UK) misst die intrazelluläre Fluoreszenz in Mulivertiefungsmikroplatten.
Wenn ein GPCR an einen Calciumsignalisierungsweg koppelt, kann das
FLIPR-System mit Zellen verwendet werden, die den G-Protein-gekoppelten
Rezeptor exprimieren und calciumempfindliche fluoreszierende Farbstoffe
enthalten, um den intrazellulären
Calciumstrom zu überwachen,
der nach Aktivierung des G-gekoppelten Rezeptors auftritt. Siehe
z.B. Kirk et al., J. Biomolecular Screening, 1:75 (1996).
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Bestimmte
GPCRs koppeln nicht mit Calciumsignalisierungswegen, während andere
nicht durch Calciumwege signalisieren mögen, abhängig vom Zelltyp, in dem der
Rezeptor exprimiert wird. In solchen Situationen wurden chimäre G-Proteine
verwendet, um den Rezeptor an die Calciumsignalisierung in transfizierten Zellen
zu binden, um dadurch die Verwendung von Hochdurchsatz-FLIPR-Tests
zu erlauben (Wada et al., Developing a High Troughput Functional
Screening Assay for Gi/o-coupled Cloned Receptors using the FLIPRTM System, veröffentlicht von Molecular Devices,
2001; Coward et al., Chimeric G-proteins allow a high-throughput
signaling assay of Gi-coupled receptors, Analytical Biochemistry
270:242 (1999)). Coward et al. berichten über die Verwendung von chimären G-Proteinen,
die die Signalisierung von Gi-gekoppelten Rezeptoren durch Gq erlauben
und eine detektierbare Calciumreaktion in CHO-Zellen erzeugen, gemessen
unter Verwendung der FLIPRTM-Technology.
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Entsprechend
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Durchmustern von
Testverbindungen zur Bestimmung bereit, ob die Verbindung ein GPR40-Rezeptorligand
ist, in dem bestimmt wird, ob die Testverbindung kompetitiv die
Bindung eines Fettsäure-GPR40-Liganden
an einen GPR40-Rezeptor
inhibiert. Der Fettsäureligand
kann mit einem detektierbaren Marker markiert werden, wie es allgemein
fachbekannt ist. Wie hier verwendet, schließen detektierbare Marker Einheiten
ein, die durch visuelle Beobachtung detektiert werden können (z.B.
solche, die gefärbte
Elemente einschließen
oder erzeugen), oder die mit Hilfe künstlicher Detektionssysteme
detektiert werden, die z.B. optische Systeme, spektroskopische Systeme,
radiographische Systeme und dergleichen einschließen. Der
detektierbare Marker kann aus Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen
und Enzymen ausgewählt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Durchmustern von
Testverbindungen auf GPR40-antagonistische Aktivität bereit.
Ein solches Verfahren verwendet eine Testzelle, die auf ihrer Oberfläche einen
GPR40-Rezeptor exprimiert
und ein Reporterkonstrukt enthält,
das ein Gq-reagierendes
Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression
des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Die Testzelloberfläche wird
einem GPR40-Fettsäureagonisten
unter Bedingungen ausgesetzt, die die Bindung des GPR40-Fettsäureagonisten
an den GPR40-Rezeptor
erlauben, und dann wird die Zelloberfläche der Testverbindung unter ähnlichen
Bedingungen ausgesetzt. Das durch das Reportergen erzeugte detektierbare
Signal wird dann gemessen und mit dem detektierbaren Signal verglichen,
von dem man erwartet würde, das
es in Gegenwart allein des GPR40-Fettsäureagonisten auftreten würde (d.h.
in Abwesenheit der Testverbindung). Dieser Vergleich kann ein Nebeneinandervergleich
des detektierbaren Signals in einer Kontrollzelle sein (d.h. in
einer der Testzelle in allen Weisen ähnlichen Zelle, die aber dem
GPR40-Fettsäureagonisten
in Abwesenheit von Testverbindung ausgesetzt wird). Alternativ kann
der Vergleich mit einem Standard sein, der bestimmt wird, bevor
oder nachdem die Zelle verarbeitet wird, d.h. ein Kontrollexperiment,
das vor oder nach dem detektierbaren Signal durchgeführt wurde,
um einen quantitativen oder qualitativen Standard zu ermitteln, der
im Vergleich verwendet wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Durchmustern einer
Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität bereit. Ein solches Verfahren
verwendet eine Zelle, die GPR40-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimiert
und ein Reportkonstrukt enthält,
das ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst,
worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal
erzeugt. Das Transkriptionselement kann ein Gi-reagierendes Transkriptionselement,
ein Gq-reagierendes Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes
Transkriptionselement sein. Die Zelloberfläche wird mit einer Testverbindung
unter Bedingungen in Kontakt gebracht (d.h. ihr ausgesetzt), die
die Bindung eines GPR40-Liganden
an den GPR40-Rezeptor erlauben, und eine etwaige Reportergenexpression
wird detektiert (was anzeigt, dass die Testverbindung GPR40-agonistische
Aktivität
besitzt).
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Durchmustern einer
Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität bereit. Ein solches Verfahren
verwendet eine Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert
und ein Reportkonstrukt enthält,
das ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst,
worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal
erzeugt. Das reagierende Transkriptionselement kann ein Gq-reagierendes
Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement
sein. Die Zelloberfläche
wird einer Testverbindung und einem GPR40-Agonisten unter Bedingungen
ausgesetzt (d.h. damit in Kontakt gebracht), die die Bindung des
GPR40-Agonisten an den GPR40-Rezeptor erlauben. Die nachfolgende
Reportergenexpression wird detektiert, und eine verringerte Reportergenexpression
in Gegenwart von sowohl Testverbindung als auch Agonist (verglichen
mit der in Gegenwart allein des GPR40-Agonisten erwarteten Reportergenexpression)
zeigt an, dass die Testverbindung ein GPR40-Antagonist ist. Wie
hier zuvor beschrieben wurde, kann ein Vergleich der Reportergenexpression
in der Testzelle mit einer Kontrollzelle oder mit einem bekannten
Standard einer quantitativen oder qualitativen Reaktion durchgeführt werden.
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Wie
hier verwendet, ist ein Gq-reagierendes Transkriptionselement eines,
das bei Aktivierung eines Gαq-
(oder Gαq-Subtyp-)-gebundenen
Rezeptors anspricht (aktiviert wird). Wie fachbekannt ist, sind
Gq-Proteine Pertussistoxin-unempfindliche G-Proteine. Wie hier verwendet,
ist ein Gi-reagierendes
Transkriptionselement eines, das bei Aktivierung eines Gαi- (oder Gαi-Subtyp-)-gebundenen
Rezeptors anspricht (aktiviert wird). Wie fachbekannt ist, sind
Gi-Proteine Pertussistoxin-empfindliche G-Proteine (ebenso wie Go).
Wie hier verwendet, ist ein Gq/Gi-reagierendes Transkriptionselement
eines, das bei Aktivierung eines Gαq-gebundenen Rezeptors (oder
von Gαq-Subtypen)
oder eines GαI-gebundenen
Rezeptors (oder von GαI-Subtypen)
anspricht (aktiviert wird). Ein solches Gq/Gi-reagierendes Transkriptionselement ist
GAL4/Elk-1 (siehe z.B. Bevan et al., Neuroreport 9:2703 (1998)).
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Durchmustern einer
Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität durch Detektieren bereit,
ob die Verbindung die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung aus
Pankreas-Beta-Zellen aus Säugetier
(oder die Insulinproduktion innerhalb von Pankreas-Beta-Zellen aus Säugetier)
in Gegenwart eines GPR40-Agonisten verringert, verglichen mit der
Glucose-stimulierten Insulinfreisetzung, die aufgrund der Gegenwart
des GPR40-Agonisten erfolgen würde.
Die „erwartete" Insulinfreisetzung
aufgrund der Gegenwart des GPR40-Agonisten kann durch Durchführen eines
gleichzeitigen oder nachfolgenden Kontrollexperiments ermittelt
werden oder kann ein zuvor bestimmter Standard sein. Verschiedene Verfahren
sind fachbekannt zur Messung der Insulinfreisetzung aus oder -produktion
innerhalb von Zellen. Jedes geeignete Verfahren kann in den vorliegenden
Verfahren verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Durchmustern
einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität durch Detektieren bereit,
ob die Verbindung an GPR40 bindet und die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung
aus (oder Insulinproduktion innerhalb von) Pankreas-Beta-Zellen aus Säugetier
erhöht.
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Umgekehrt
können
weitere Rezeptoren, für
die die Fettsäureliganden
der Erfindung als Liganden wirken, durch Durchmustern potenzieller
Kandidaten gegen einen Fettsäureliganden
in einem geeigneten Test identifiziert werden, z.B. durch Bestimmung
der potentiellen Inhibierung von Forskolinerhöhten cAMP-Spiegeln.
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Kits,
die zur Durchführung
der vorliegenden Verfahren geeignet sind, können folgendes enthalten:
- (a) GPR40 und ein oder mehrere markierte oder
unmarkierte Fettsäureliganden;
- (b) eine rekombinante Zelle, die GPR40 exprimiert, und ein oder
mehrere markierte oder unmarkierte Fettsäureliganden; oder
- (c) eine Zellmembran, die GPR40 exprimiert, und ein oder mehrere
markierte oder unmarkierte Fettsäureliganden.
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Man
wird einsehen, dass in jedem solchen Kit (a), (b) oder (c) eine
substantielle Komponente umfassen kann.
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Agonisten
und/oder Antagonisten können
aus einer Vielzahl von Quellen identifiziert werden, z.B. aus Zellen,
zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken und natürlichen
Produktmischungen. Solche Agonisten und/oder Antagonisten können natürliche oder
modifizierte Substrate, Liganden, Rezeptoren, Enzyme etc., je nach
Fall, eines beliebigen Fettsäureliganden
der Erfindung sein; oder können
strukturelle oder funktionelle Mimetika des Polypeptids der vorliegenden
Erfindung sein (siehe Coligan et al., Current Protocols in Immunology
1(2): Kapitel 5 (1991)).
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Beispiele
für potenzielle
Antagonisten schließen
ein:
- (a) Antikörper oder, in manchen Fälle, Oligonukleotide,
die an den Rezeptor binden, aber keine zweite Botenreaktion auslösen, so
dass die Aktivität
des Rezeptors verhindert wird;
- (b) Fettsäuren,
die eng mit einem Liganden von GPR40 verwandt sind, die aber keine
Reaktion aus dem GPR40-Rezeptor auslösen;
- (c) kleine Moleküle,
die an GPR40 binden, was es unzugänglich für Liganden macht, so dass die
normale biologische Aktivität
verhindert wird, z.B. kleine Peptide oder peptidartige Moleküle;
- (d) lösliche
Formen von GPR40, z.B. Fragmente des Rezeptors, die an den Liganden
binden und die Wechselwirkung des Liganden mit membrangebundenem
GPR40 verhindern.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
nützlich
in einem Verfahren zur rationellen Wirkstoffentwicklung sein, das
die folgenden Schritte umfasst:
- a) Sondieren
der Struktur eines Fettsäureliganden-Bindungsorts
auf dem GPR40-Rezeptor mit dem Fettsäureliganden oder einem Derivat
davon;
- b) Identifizieren von Kontaktatomen im Bindungsort des GPR40-Rezeptors, die mit
einem Fettsäureliganden
während
der Bindung wechselwirken; und
- c) Entwickeln von agonistischen oder antagonistischen Verbindungen,
die mit den in (b) identifizierten Atomen im Bindungsort wechselwirken,
um den Rezeptor zu aktivieren (Agonist) oder dessen Aktivierung
zu inhibieren (Antagonist).
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Umgekehrt
kann auch die Struktur beliebiger Fettsäureliganden bei Bindung an
den Ligandenbindungsort auf dem GPR40-Rezeptor bestimmt werden,
was die Entwicklung von weiteren antagonistischen Verbindungen ermöglicht.
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Solche
Antagonisten binden an den Fettsäureliganden,
wodurch die Bindung des Fettsäureliganden an
den Rezeptor verhindert wird. Verfahren der Verwendung von Liganden
oder ihren Derivaten zum Sondieren der Struktur der Ligandenbindungsorte
in Rezeptoren und die rationelle Wirkstoffentwicklung auf Basis
dieser Strukturinformation sind allgemein fachbekannt (siehe z.B.
S. Boyle et al., Bioorganic & Medicinal
Chemistry 1994, 2, 101-113; A.G. Beck-Sickinger et al., European
Journal of Biochemistry 1994, 225, 947-958; C.A. McWerther et al.,
J. Biol.Chem. 1997, 272, 11874-11880; D.C. Horwell et al., International
Journal of Peptide & Protein
Research 1996, 48, 522-531;
M.A. Bednarek et al., Peptides 1999, 20, 401-409).
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Unter
Verwendung der obigen Durchmusterungs- oder rationellen Entwicklungsverfahren
identifizierte Verbindungen werden von Nutzen in der Therapie sein.
Z.B. kann eine als Agonist oder Antagonist von GPR40 identifizierte
Verbindung nützlich
in der Therapie sein, insbesondere zur Behandlung von Typ II-Diabetes (nicht-insulinabhängiger Diabetes
mellitus, NIDDM) und Fettsucht, Glucoseintoleranz, Insulinresistenz,
neurodegenerative Krankheit (z.B. Alzheimer-Krankheit) und von anderen
Indikationen wie u.a. Schlaganfall.
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Z.
B. ein Verfahren zur Behandlung eines abnormalen Zustands, der mit
einem Übermaß an GPR40-Aktivität und/oder
einem Übermaß eines
GPR40-Liganden (z.B.
eines Fettsäureliganden)
verbunden ist. Das Verfahren umfasst das Verabreichen eines GPR40-Antagonisten,
wie hier zuvor beschrieben, in einer zur Blockierung oder Verringerung
der Bindung von Liganden an den Rezeptor oder zur Inhibierung oder
Verringerung eines zweiten Signals wirksamen Menge an einen bedürftigen
Patienten, um dadurch den abnormalen Zustand zu lindern.
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In
noch einem anderen Ansatz kann die Expression des Gens, das endogenes
GPR40-Polypeptid kodiert, unter Verwendung von Expressionsblockierungstechniken
inhibiert werden. Solche bekannten Techniken beinhalten die Verwendung
von antisense-Sequenzen, entweder intern erzeugt oder extern verabreicht
(siehe z.B. O'Connor,
J. Neurochem. (1991) 56:560 in „Oligodeoxynucleotides as
Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).
Alternativ können
Oligonukleotide, die Tripelhelices („Triplexe") mit dem Gen bilden, zugeführt werden
(siehe z.B. Lee et al., Nucleic Acids Res. (1979) 6:3073; Cooney
et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360).
Diese Oligomere können
als solche verabreicht werden, oder die relevanten Oligomere können in
vivo exprimiert werden. Synthetische antisense- oder Triplex-Oligonukleotide
können
modifizierte Basen oder modifizierte Gerüste umfassen. Beispiele für letztere schließen Methylphosphonat-,
Thiophosphat- oder Peptidnukleinsäure-Gerüste ein. Solche Gerüste werden
in das antisense- oder Triplex-Oligonukleotid aufgenommen, um Schutz
vor Abbau durch Nukleasen bereitzustellen, und sind allgemein fachbekannt.
Antisense- und Triplex-Moleküle,
die mit diesen oder anderen modifizierten Gerüsten synthetisiert werden,
bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
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Zusätzlich kann
die Expression des humanen GPR40-Polypeptids durch Verwendung von
Ribozymen verhindert werden, die spezifisch für die humane GPR40-mRNA-Sequenz
sind. Ribozyme sind katalytisch aktive RNAs, die natürlich oder
synthetisch sein können
(siehe z.B. N. Usman et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (1996) 6(4),
527-33). Synthetische Ribozyme können
entwickelt werden, um GPR40-mRNAs an ausgewählten Positionen spezifisch
zu spalten, um dadurch die Translation der humanen GPR40-mRNAs zu
funktionellem Polypeptid zu verhindern. Ribozyme können mit
einem natürlichen
Ribosephosphat-Gerüst
und natürlichen Basen,
wie sie normalerweise in RNA-Molekülen gefunden werden, synthetisiert
werden. Alternativ können
die Ribozyme mit nicht-natürlichen
Gerüsten
synthetisiert werden, um Schutz vor Ribonukleaseabbau bereitzustellen,
z.B. 2'-O-Methyl-RNA, und können modifizierte
Basen enthalten.
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Die
Identifizierung eines Liganden für
GPR40, wie z.B. eines Fettsäureliganden
der Erfindung, erlaubt die wirksame Identifizierung polyklonaler
oder monoklonaler Antikörper,
die gegen GPR40 erzeugt werden und neutralisierende Antikörper sind.
Solche neutralisierenden Antikörper
sind von Nutzen in der Therapie im Vergleich mit nicht-neutralisierenden
Antikörpern,
die ineffektiv sind. Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung in
einem weiteren Aspekt die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern, die
gegen GPR40 erzeugt wurden, in der Therapie vor.
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Verbindungen,
die aktiv sind, wenn sie oral verabreicht werden, können als
Flüssigkeiten,
z.B. Sirupe, Suspensionen oder Emulsionen, Tabletten, Kapseln und
Lutschtabletten formuliert werden. Eine flüssige Formulierung wird allgemein
aus einer Suspension oder Lösung
der Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes in (einem)
geeigneten flüssigen
Träger(n),
z.B. Ethanol, Glycerin, nicht-wässrigem
Lösungsmittel
(z.B. Polyethylenglycol), Ölen
oder Wasser mit einem Suspendiermittel, Konservierungsmittel, Aroma oder
Färbemittel
bestehen. Eine Zusammensetzung in Form einer Tablette kann unter
Verwendung beliebiger geeigneter pharmazeutischer Träger hergestellt
werden, die routinemäßig zur
Herstellung fester Formulierungen verwendet werden. Beispiele für solche
Träger
schließen
Magnesiumstearat, Stärke,
Lactose, Saccharose und Cellulose ein. Eine Zusammensetzung in Form
einer Kapsel kann unter Verwendung von routinemäßigen Verkapselungsverfahren
hergestellt werden. Z.B. können
Pellets, die den aktiven Bestandteil enthalten, unter Verwendung
von Standardträgern
hergestellt und dann in eine Hartgelatinekapsel gefüllt werden;
alternativ kann eine Dispersion oder Suspension unter Verwendung
beliebiger geeigneter pharmazeutischer Träger (z.B. mit wässrigen
Gummen, Cellulosen, Silicaten oder Ölen) hergestellt und die Dispersion
oder Suspension dann in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden.
Typische parenterale Zusammensetzungen bestehen aus einer Lösung oder
Suspension der Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen
Salzes in einem sterilen wässrigen
Träger
oder einem parenteral akzeptablen Öl, z.B. Polyethylenglycol,
Polyvinylpyrrolidon, Lecithin, Erdnussöl oder Sesamöl. Alternativ
kann die Lösung
lyophilisiert und dann mit einem geeigneten Lösungsmittel gerade vor der
Verabreichung rekonstituiert werden. Eine typische Suppositorienformulierung
umfasst eine aktive Verbindung oder ein pharmazeutisch akzeptables
Salz davon, das bei Verabreichung auf diese Weise aktiv ist, mit
einem Binde- und/oder Schmiermittel wie polymeren Glycolen, Gelatinen
oder Kakaobutter oder anderen niedrig schmelzenden pflanzlichen
oder synthetischen Wachsen oder Fetten. Die Erfindung wird ferner
in den folgenden Beispielen beschrieben, die zur Veranschaulichung
der Erfindung ohne Beschränkung ihres
Umfangs gedacht sind. Zur Erleichterung des Verständnisses
der folgenden Beispiele werden bestimmte Verfahren und/oder Begriffe
beschrieben werden.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
TAQMAN®-Analyse
der GPR40-Expression in humanen Geweben
-
Erzeugung von Proben zur
TAQMAN®-mRNA-Analyse:
-
TAQMAN®-PCR
wurde unter Befolgen des von H. M. Sarau et al. veröffentlichten
Verfahrens durchgeführt
(„Identification,
Molecular Cloning, Expression and Characterisation of a Cysteinyl
Leukotriene Receptor", Molecular
Pharmacology, 1999, 56, 657-663). Quantitative TAQMAN®-PCR
wurde zur Messung von GPR40-mNRA unter Verwendung von mehrfachen
Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Ein 20 μl-Volumen
einer PCR-Mastermischung (enthaltend 2,5 μl TAQMAN®-Puffer,
6 μl 25
mM MgCl2, 0,5 μl 10 mM dATP, 0,5 μl 20 mM dUTP,
0,5 μl 10
mM dCTP, 0,5 μl 10
mM dGTP, 0,25 μl
Uracil-N-glycosylase, 1 μl
10 μM Vorwärtsprimer,
1 μl 10 μM Umkehrprimer,
0,5 μl 5 μM TAQMAN®-Sonde,
0,125 μl
TaqGold [PE Biosystems], 6,625 μl Wasser)
wurde zu jeder Vertiefung unter Verwendung von Biomek-Robotern (Beckman
Coulter, High Wycombe, UK) hinzugegeben und die Platte unter Verwendung
von optischen Deckeln (PE Biosystems) verschlossen. Die PCR-Reaktion
wurde an einem ABI7700 Sequence Detector (PE Biosystems) unter Verwendung
der folgenden PCR-Parameter durchgeführt: 50°C für 2 Minuten, 95° für 10 Minuten
und 45 Zyklen mit 94°C
für 15 Sekunden,
60°C für 1 Minute,
und die Menge von aus mNRA stammender cDNA in jeder Probe wurde
aus dem TAQMAN®-Signal
unter Verwendung von Plasmid/genomischen DNA-Kalibrierungsstandards,
die in jedem Durchlauf eingeschlossen wurden, berechnet. Die Menge
an genomischer DNA, die die ursprünglichen RNA-Proben verunreinigte,
wurde als vernachlässigbar
(< 10 Kopien genomische
DNA/ng RNA) durch TAQMAN®-Messung der genomischen
Sequenz für
10 Gene in wiederholten Proben nachgewiesen, die durch das beschriebene
Umkehrtranskriptionsverfahren unter Auslassung der Umkehrtranskriptase
geführt
wurden. Genspezifische Reagentien für GPR40:
Vorwärtsprimer:
5'GTGGTGCTTAATCCGCTGGT
(SEQ ID NO: 5)
Umkehrprimer: 5'TGGCGTTACTTCTGGGACTTG (SEQ ID NO: 6)
Sonde:
5'CTTGCGTTCTTGCCGCACACACTGT
(SEQ ID NO: 7)
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die höchsten
Mengen von GPR40 in der Bauchspeicheldrüse exprimiert werden; die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt.
-
Tabelle
1 GPR40-Körpergewebe-mRNA-Spiegel Einheiten:
Kopien von detektierter GPR40-mRNA/ng mRNA-Ansammlung
-
-
Beispiel 2
-
Expression von GPR40 in
humanen Langerhansschen Inseln
-
TAQMAN®-Analyse
von RNA aus humanen Langerhansschen Inseln gegenüber Gesamt-Pankreas-RNA wurde
wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für eine äquivalente RNA-Probe aus Inselzellen und
Gesamtpankreas gab es in 3 unabhängigen
Inselproben eine 2- bis 100-fach höhere Expression von GPR40 als
im Gesamtpankreas (Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Beispiel 3
-
Expression von GPR40 in
MIN6- und BRIN-Insulinomzellen
-
TAQMAN®-Bedingungen
für GPR40-Expression
in Maus und Ratte:
-
TAQMAN® wurde
unter Verwendung von 50 ng cDNA pro Reaktion mit 0,3 μM Vorwärtsprimer,
0,3 μM Umkehrprimer,
0,1 μM Sonde
und 1x TAQMAN® Master
Mix (PE Applied Biosystems, UK) durchgeführt. Die Zyklusbedingungen
waren wie folgt: 50°C
für 2 Min.,
95°C für 10 Min.,
gefolgt von 40 Zyklen mit 95°C
für 15
s, 60°C
für 1 Min.
-
Primer/Sondensätze für GPR40
aus Maus/Ratte
-
- Vorwärtsprimer:
5'AGTTCCCTGGGCATCAACATA3' (SEQ ID NO: 8)
- Umkehrprimer: 5'CAAGGGCAGAAAGAAGAGCAGA3' (SEQ ID NO: 9)
- Sonde: 5'AATGGCTCCCCGGTCTGCCTGG3' (SEQ ID NO: 10)
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass
GPR40 in beiden Insulinomzelllinien exprimiert wurde, was die β-Zelllokalisierung
bestätigte.
Die Ergebnisse zeigten ferner, dass die Expression von GPR40 in
MIN6-Zellen viel größer als
in BRIN-Zellen ist.
-
-
- 1) Der Ct-Wert bezeichnet die Zyklusanzahl von TAQMAN®,
die zur Detektion der Genexpression für das Transkript notwendig
ist.
- 2) HPRT = Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
-
Beispiel 4
-
GPR40-Expression ist in
ob/ob-Mäuse-Pankreas
erhöht
-
Die
TAQMAN®-Analyse
wurde zur Bestimmung von GPR40-Spiegeln in mageren C57B1/6-Mäusen im Vergleich
mit homozygoten C57B1/6 ob/ob-Knock-out-Mäusen durchgeführt. Diese
Spiegel wurden ferner mit Spiegeln von Insulin-mRNA verglichen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
-
-
- 1) Relative Messung aus einer Standardkurve, die unter Verwendung
bekannter Mengen von cDNA erzeugt wurde, hergestellt aus Gesamt-RNA
mit zufälligen
Primern.
-
Beispiel 5
-
GPR40 und Fettsäuren – Rezeptor-Liganden-Paarung
-
Zellen,
die den GPR40-Rezeptor exprimieren, weisen eine dosisbezogene Zunahme
der intrazellulären
Calciumspiegel als Reaktion auf Fettsäureliganden gemäß Messung
durch die FLIPR-Technologie auf. 1 zeigt
die nach Zugabe von Elaidinsäure
(trans-Oleinsäure,
9-Octadecansäure)
zu HEK-293-Zellen, die transient den GPR40-Rezeptor exprimieren,
detektierte FLIPR-Reaktion. Keine Reaktion wurde in Zellen detektiert,
die transient zwei andere 7TM-Rezeptoren (PGRW und HLTEX11) exprimieren.
Die Tests verwendeten einen G-Protein-Cocktail (+GPC), der chimäre und promiske
G-Proteine enthielt, wie es auf dem Gebiet der Durchmusterung von
seltenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bekannt ist.
-
Die
GPR40-Stimulation durch andere Fettsäureliganden unter Verwendung
der FLIPR-Technologie, wie hier beschrieben, wird nachfolgend in
Tabelle 4 gezeigt (pEC50 = –log
EC50, worin EC50 die „effektive Konzentration" ist; EC50 ist die
Hälfte
der Konzentration an Verbindung, die für eine maximale Reaktion notwendig
ist).
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Beispiel 5A
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Funktionelle Tests
-
G-Protein-Kopplung
-
Die
meisten GPCRs zeigen konstitutive Aktivität, wenn die Expression des
GPCR zunimmt. Experimente wurden zur Bestimmung, ob GPR40 durch
Gαs, Gαq oder Gαi koppelt, unter Verwendung konstitutiv aktiver
Reporter und nach Agonistaktivierung durchgeführt.
-
Konstitutive-GPR40-Aktivität wurde
in Melanophoren untersucht. Die Melanophoren wurden transient mit
10, 20, 40 und 80 μg
GPR40/pJG3.6-Plasmid-DNA
durch Elektroporation transfiziert und in Platten mit 96 Vertiefungen
ausplattiert. 48 Stunden nach der Elektroporation wurden die Medien
abgesaugt und durch L-15-Testpuffer, Testpuffer + 25 nM Melatonin
oder Testpuffer + 100 nM alpha-MSH ersetzt. Diese Reagenzien ließ man für 2 Stunden
inkubieren, und die Transmittanz (T) wurde ausgelesen.
-
Prozentuale
konstitutive Aktivität
wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: (T(L15) – T(MSH))·100 / (T(Melatonin) – T(MSH))
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass zunehmende Mengen an transfizierter GPR40-DNA eine Zunahme
der Gαq/Gαo-Aktivität
erzeugten, was anzeigt, dass die konstitutive Aktivität von GPR40
durch beide aus der Gαq/Gαo-Familie von G-Proteinen erfolgt (2).
-
Die
spezifische Kopplung wurde in Säugerzellen
unter Verwendung der transienten Expression eines CRE-Luciferase-Reporters
für Gαs und
in stabilen Zelllinien, die Gal4/ELK-1-Luciferase-Reporter enthielten, für Gαq/Gαo bestimmt.
CHO-Zellen vom Wildtyp wurden mit 3X-CRE-Luciferase-Reportervektor und
verschiedenen Mengen eines Expressionsvektors für GPR40 kotransfiziert. Die
Kontrollzellen wurden nur mit Reportervektor transfiziert. Die Reportergenplasmide
wurden inhäusig
erzeugt, aber ähnliche
Vektoren können
von Stratagene erworben werden (PATHDETECT®).
Zellen wurden in eine Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen mit
1 × 104 Zellen/Vertiefung in DMEM/F12, ergänzt mit
5% FBS, ausplattiert. Nach 72 Stunden bei 37°C und 5% CO2 wurden
die Zellen unter Verwendung des liposomalen Tranfektionsreagens,
das unter der Marke LIPOFECTAMINE® verkauft
wird, und mit den folgenden Kombinationen von Plasmiden transfiziert:
- A – 3x-CRE-Luc
- B – 3x-CRE-Luc
+ CMV-GPR40
- C – 3x-CRE-Luc
+ CMV-Gs-gekoppelter Rezeptor
-
Die
Konzentration an Reporterplasmid für alle Vertiefungen betrug
0,15 μg/Vertiefung.
Die Konzentrationen der Reporterplasmide betrugen 0,5, 1,0, 5,0,
10,0 ng/Vertiefung. Nach 24 h wurden Zellen, die 1 ng/Vertiefung
an Reporterplasmid oder keine DNA-Kontrolle und CRE-Luc-Reporter
enthielten, mit Fettsäure
oder Calcitonin, das dafür
bekannt ist, durch einen Gs-gekoppelten Rezeptor zu wirken (Chakraborty,
Science 251:1078 (1991)), mit den angegebenen Konzentrationen behandelt.
Die Luciferase-Produktion
wurde nach 4 Stunden Behandlung unter Verwendung eines Luciferase-Reportergen-Testkits
getestet, das unter der Marke LUCLITE® erhältlich,
verwendet gemäß Herstelleranweisungen
(Packard Bioscience).
-
Wie
in 3a gezeigt wird, gab es keine Zunahme an Reporteraktivität im CRE-System
bei jeder Dosis von GPR40-Expressionsvektor.
Im Gegensatz, wie in 3b gezeigt wird, löste die
Expression eines Gs-gekoppelten Rezeptors eine signifikante Zunahme
an Luciferaseaktivität
aus.
-
Wie
in 3c gezeigt wird, obwohl Calcitonin eine Zunahme
der Luciferaseproduktion sowohl in den Zellen auslöste, die
nur Reporter enthielten, als auch in denjenigen, die GPR40 enthielten,
gab es keine Wirkung von 5,8,11-Eicosatriinsäure bei jeder untersuchten
Konzentration, was anzeigt, dass weder GPR40-konstitutive noch Agonist-aktivierte
Aktivität über Gαs gekoppelt
ist.
-
Zur
weiteren Untersuchung der Kopplung von GPR40 an Gαq/Gαo wurde
ein GAL4-Elk-1-Reporter verwendet. Eine stabile klonale Reporterlinie
wurde durch Transfizieren von CHO-Zellen mit einem Plasmid geschaffen,
das ein Expressionskonstrukt für
GAL4/Elk-1- und ein GAL4-Luciferase-Reporterkonstrukt enthält. Ein ähnliches
Reportersystem kann jetzt von Stratagene erworben werden (unter
der Marke PATHDETECT®). Ein Expressionskonstrukt
für humanes
GPR40, das ein G418-Resistenzkonstrukt enthält, wurde in die CHO-GAL4/Elk-1-Reporterzelllinie
als Wirt (10 μg
Plasmid-DNA pCR3-GPR40) über
Elektroporation transfiziert. Die Zelllinien wurden mit 500 μg/ml G418
selektiert, bis alle Zellen in der Kontrolle tot waren, und Klone wurden
dann gepickt. Der GAL4/Elk-1-Reporter kann durch Gq oder Gi aktiviert
werden. Zur Bestätigung
der Kopplung über
Gi wurden Zellen mit Pertussistoxin-Behandlung behandelt, was Gαi ADP-ribosyliert,
was seine Wechselwirkung mit Rezeptoren verhindert (Bokoch et al.,
J. Biol. Chem. 258:2072 (1983)). Pertussistoxin hat keine bekannte
Wirkung auf Gαq.
-
Wirtszellen
und diejenigen, die mit dem GPR40-Konstrukt transfiziert wurden,
wurden in eine Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen mit 2000 Zellen/Vertiefung
in DMEM/F12, ergänzt
mit 5% FBS, ausplattiert. Nach 48 Stunden bei 37°C mit 5% CO2 wurden
die Zellen in serumfreies DMEM/F12 in Gegenwart oder Abwesenheit
von 1 μg/ml
Pertussistoxin plattiert. Nach 16 Stunden bei 37°C und 5% CO2 wurden
die Wirtszellen behandelt mit: Lysophosphatidsäure (Oleoyl) (LPA), die durch
Gαi zur
Aktivierung von MAP-Kinase
koppelt (Hordijk et al., J. Biol. Chem. 269:645 (1994)); Thrombin,
das durch Gαi
und Gαq
koppelt (Hung et al., J. Biol. Chem. 267:20831 (1992)); oder 5,8,11-Eicosatriinsäure (ein
GPR40-Ligand), mit den angegebenen Konzentrationen. Die Wirtszellen,
die das GPR40-Konstrukt enthalten, wurden mit 5,8,11-Eicosatriinsäure in den
angegebenen Konzentrationen stimuliert. Kontrollen für Lysophosphatidsäure enthielten
0,5% DDMSO; Kontrollen für
5,8,11-Eicosatriinsäure
enthielten 0,5% Ethanol. Luciferaseaktivität wurde 4 Stunden nach der
Behandlung unter Verwendung eines Luciferase-Reportergen-Testkits
getestet, das unter der Marke LUCLITE® erhältlich ist,
gemäß Herstelleranweisung
(Packard Bioscience).
-
Wie
in 4A gezeigt wird, wurde die LPA-stimulierte Reporteraktivität in den
Wirtszellen vollständig durch
die Pertussistoxin-Behandlung
aufgehoben, was eine Kopplung durch Gαi bestätigt.
-
Wie
in 4C gezeigt wird, war die Luciferaseproduktion
aufgrund von Thrombinstimulation nur teilweise nach Toxinbehandlung
abgeschwächt,
was eine Gαi/Gαq-Kopplung
bestätigt.
-
Wie
in 4D und 4E gezeigt
wird, wiesen Klone, die mit dem GPR40-Expressionskonstrukt und einem Elk-/GAL4-Reporter
transfiziert waren, eine Zunahme der Basis-Reportaktivität gegenüber der
Wirtszelllinie auf, die nur Reporter allein enthielt, die um bis
zu 70% nach Pertussistoxin-Behandlung verringert war, was eine konstitutive
Gαi-gekoppelte
Rezeptoraktivität
nahelegt.
-
Wie
in 4B gezeigt wird, hatte 5,8,11-Eicosatriinsäure keine
Wirkung auf die Luciferaseproduktion in den Wirtszellen, aber eine
erhöhte
Luciferaseaktivität
im Vergleich mit der Basis in Zellen, die GPR40 in einer Weise enthielten,
die nicht durch Pertussistoxin-Behandlung inhibiert wurde.
-
Diese
Tests zeigen, dass konstitutive GPR40-Rezeptoraktivität an die
Gαi- oder
Gαo- (und
verwandte Familienmitglieder) -Pertussistoxin-empfindliche G-Proteine gekoppelt ist.
Außerdem
ist die Fettsäureagonist-stimulierte GPR40-Rezeptoraktivierung
durch ein Pertussistoxin-unempfindliches
G-Protein gekoppelt, was nahelegt, dass die Agonist-stimulierte GPR40-Rezeptoraktivierung
durch Gαq
gekoppelt ist.
-
Beispiel 6
-
Funktionale Tests
-
Calciumtest
-
Rezeptoren,
die stabil in HEK 293-Zellen exprimiert werden, können eine
robuste Calciumreaktion auf Agonisten mit der geeigneten Rangreihenfolge
und Wirksamkeit zeigen. Basiscalciumspiegel in den HEK 293-Zellen in GPR40-transfizierten
Zellen oder Vektorkontrollzellen sind im normalen Bereich von 100
bis 200 nM. HEK 293-Zellen, die rekombinante GPR40-Rezeptoren exprimieren,
werden mit dem fluoreszierenden Indikator FLUO-4 beladen, und an
einem einzigen Tag werden mehr als 150 selektierte Liganden auf
Agonist-induzierte Calciummobilisierung ausgewertet. Agonisten,
die eine transiente Calciummobilisierung darstellen, werden in Vektorkontrollzellen
zur Bestimmung getestet, ob die Calciumreaktion einzigartig für die transfizierten
Rezeptorzellen ist. Wenn eine einzigartige Agonist-induzierte Reaktion
identifiziert wird, wird die Reaktion in einer separaten Gruppe
von Zellen reproduziert und dann pharmakologisch mit Konzentrations-Reaktions-Kurven
für die
wirksamen und verwandten Liganden charakterisiert.
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Beispiel 7
-
Membranpräparation
und Durchmusterung auf GPR40
-
Kompetitive
Fettsäureligandenbindungstests
sind nützlich
zum Auffinden von Antagonisten und Agonisten des GPR40-Rezeptors.
Als Quelle des GPR40-Rezeptors
sind CHO- oder HEK-293-Zellen, die mit dem GPR40-Rezeptor stabil transfiziert
sind, nützlich;
andere Zellen, die mit dem GPR40-Rezeptor transfiziert sind, oder
Zellen, die natürlicherweise
eine hochgradige Expression des GPR40-Rezeptors zeigen, können auch eingesetzt
werden. Typischerweise wird die Kultur von Zellen, die den GPR40-Rezeptor
exprimieren, auf 30L maßstabsvergrößert, und
Zellen werden durch Zentrifugieren mit 600 x g für 10 Min. gewonnen. Das Zellpellet wird
dann in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Pellets enthalten gewöhnlich ca. 109 Zellen.
Zur Membranisolierung werden Pellets dreimal eingefroren/aufgetaut.
Sie werden dann in eiskaltem 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM DTA (Natriumsalz)
(40 ml/108 Zellen) resuspendiert und unter
Verwendung eines Dounce-Homogenisators (Glas/Glas)
(20-25 Schläge),
gefolgt von einer Polytron-Suspension
mit 3-10 s-Pulsen bei der Einstellung 3/4 (Brinkman-Gewebehomogenisator)
homogenisiert. Diese Suspension wird mit 300 x g für 10 min.
zentrifugiert. Das Pellet wird verworfen, und die überstehende
Fraktion wird mit 40.000 x g für
30 Min. bei 4°C
zentrifugiert (Sorvall SS-34:
18.000 U/Min.), in Homogenisierungspuffer unter Verwendung des Polytron
resuspendiert und einmal gewaschen. Das Pellet wird in Testpuffer
(50 mM Tris pH 7,5) mit einer Konzentration von 1-4 mg Protein/ml
resuspendiert.
-
Auf
diese Weise erhaltene Membranen sind für das Ansetzen eines kompetitiven
Hochdurchsatz-Fettsäureliganden-Bindungstests
geeignet, um nach Verbindungen zu suchen, die in die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung
eingreifen. Die Gesamtbindung einer markierten Fettsäure an diese
Membranen wird zuerst getestet, damit sie linear zur verwendeten
Menge an Membranen ist. Der Zeitraum, um die Gleichgewichtsbindung bei
einer geeigneten Temperatur zu erreichen, wird ebenfalls ermittelt
und beträgt
nach unserer Erfahrung ca. 1 h bei einer Temperatur von 20°C. Bedingungen
für einen
solchen Durchmusterungstest werden exemplarisch durch diejenigen
angegeben, die in der MCH-Rezeptorbindung verwendet werden. Typischerweise
werden 25 μg
Membranprotein pro Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 100 μl Puffer
verwendet, der 50 mM HEPES, 1 mM CaCl2,
5 mM MgCl2 und 0,5% Rinderserumalbumin (Western-Blot-Qualität) enthält, pH 7,4.
Die Konzentration an 125I-mMCH beträgt typischerweise
1-2 nM und 75.000 Impulse pro Min./Vertiefung. Die spezifische Bindung
von 125I-mMCH sollte vollständig durch
unmarkiertes MCH bei Konzentrationen von 100 nM oder mehr verdrängt werden.
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Die
zu untersuchenden Verbindungen werden typischerweise gelöst und hinzugegeben
in DMSO, und Endkonzentrationen von DMSO im Test sind 1% oder weniger.
Nach Inkubation werden die Inhalte der Vertiefungen auf einem Polyethylenimin-behandelten
GF/C-Filter unter Verwendung eines Zellernters für eine Platte mit 96 Vertiefungen
geerntet, und die Filter werden viermal mit typischerweise 1 ml
eiskaltem Waschpuffer gewaschen, der 20 mM HEPES, 0,5 M NaCl pH
7,4 enthält.
Die Filter werden gezählt,
um Antagonisten der markierten Fettsäureligandenbindung zu identifizieren.
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