CN1165147A - 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联受体蛋白质,其生产和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐、G蛋质偶联受体蛋白质的部分肽、编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA、鉴定G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法、筛选出能够改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物的方法或药盒、用该筛选方法或使用筛选药盒得到的化合物或其盐、含有该化合物或其盐的药物组合物,以及抗G蛋白偶联受体蛋白质或部分肽的抗体。
Description
本发明涉及新的人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质,编码所说G蛋白偶联受体蛋白质的DNA,生产所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法,以及所说蛋白质和DNA的应用。
有许多生物活性物质例如激素和神经递质都通过存在于细胞表面上或细胞内的受体蛋白质调节生物学功能。那些生物活性物质(以下有时也称之为配体,以与受体相对应)与受体蛋白质的相互作用是很特异的,并从而决定了例如每种个别生物活性物质的靶细胞或器官、药理学作用、及其强度和作用时间。因此,与受体蛋白质相互作用的物质是开发药物的重要手段之一。具体地说,如果发现了作用于受体蛋白质的新物质,便可望其具有很独特的药理学活性。
在各种受体蛋白质中,有一类蛋白质通过激活鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(以下有时也将其简称为G蛋白)参与细胞内信号转导。所说的这类蛋白质被称为G蛋白偶联受体蛋白质。它们的结构特征是,均具有七个推测可能穿越细胞膜的高度疏水区域(跨膜区)并且彼此间在氨基酸序列上显示有很高的相似性。因此,既使还不知道这些蛋白质所结合的物质是什么,但从结构观点看将这些蛋白质命名为受体蛋白质。因此,已例如利用G蛋白偶联受体蛋白质间的序列相似性,以聚合酶链反应(以下简称为PCR),或与已知受体cDNA杂交,或对cDNA进行随机测序等技术分离了许多编码新的G蛋白偶联受体蛋白质的DNA。一般说来,结构上彼此接近的受体趋向于结合结构上彼此相似的配体。从这样的观点出发,就某些新的受体蛋白质来说,迄今已鉴定了一些它们所结合的配体。然而,对于其他一些新的受体蛋白质,尽管推测所说的蛋白质应在结构上与已知配体相份的配体相结合,但对这样的物质仍有待进一步确定。再者,就预计相关配体来说,有许多受体还缺少足够的相似性,并因而将这些受体分类为孤独受体。虽然它们所结合的配体仍是未知的,但可以通过原位杂交或Northern印迹技术确定这些孤独受体的表达模式或定位。对于某些孤独受体来说,鉴于已经预计到它们参与的生理学功能,所以就应更有理由确定它们所结合的配体。
已经从用糖皮质素和毛喉素处理的小鼠T淋巴细胞系WEH1-7TG中分离了这样一种孤独受体,即糖皮质素诱导的受体(GIR)[Harrigan,M.T.et al.,Molecular Endocrinology(分子内分泌学),5,1331-1338(1991)]。已知用糖皮质素处理T淋巴细胞可诱导破坏所说细胞的代谢***,导致细胞死亡。此时,特异性基团的表达即被诱导。GIR便是这样一种基团,并且被认为是一种参与免疫***调节作用的受体。因此,寻找GIR的配体可能是对新的免疫调节剂的进一步研制和开发。最近,本发明人用PCR方法从人脑杏仁核衍生的cDNA中获得了一种与编码所说受体的cDNA很接近的新的cDNA片段。基于对部分分析之氨基酸序列的鉴定,估计该受体是小鼠已知受体GIR的人对应物。迄今有关GIR之人对应物的结构还所知很少。
根据目前的发现,也已知道了同时作用于免疫***和中枢神经***的因子,例如白介素6。有鉴于此,预计所说的孤独受体和它所连接的配体在控制中枢神经***的某些或其他功能中也起到重要作用。从药物开发的角度考虑,可期望获得受体蛋白质的人对应物并将其用于开发各个药物材料。例如,从一种动物到另一种动物化合物会产生完全不同的效应,并且这种由不同种的受体本身引起不同效应的事实并不罕见。因此,在研究和开发人用药物中,人对应物受体基因是十分必要的。
本发明提供一种新的人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质,含有编码所说G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的DNA序列,生产所说G蛋白偶联受体蛋白质的方法,以及所说蛋白质和DNA的应用。
虽然本发明人预先得到了编码人杏仁核衍生的受体蛋白质片段的cDNA序列并分析了其部分核苷酸序列,但仍有必要获得具有全长度开放读框的cDNA,以便能够鉴定出结合于由所说的cDNA编码之受体蛋白质上的受体。
例如,使用具有这一全长度开放读框的cDNA,有可能产生有良好效能的所说的受体蛋白质。使用适当的工具表达的所说的受体蛋白质,便有可能用受体结合实验或细胞内第二信使检测的结果作为指标,从出现于体内的化合物或其他天然或非天然化合物中筛选出所说受体蛋白质的配体。此外,还将有可能筛选出能够改变配体对受体蛋白质结合活性的化合物。
更具体地说,为了揭示使用基于G蛋白偶联蛋白质的共有序列设计并制备的DNA引物,以PCR技术获得的人杏仁核衍生之受体的完整一级结构并在构建适当的表达***后寻找与所研究的受体结合的配体,以RACE方法(cDNA末端快速扩增法)分析所说受体之开放读框5’和3’末端部分的核苷酸序列,并以PCR技术克隆全长度开放读框。结果发现了一个具有由SEQ ID NO:2代表之核苷酸序列的cDNA并测定了由之编码的全部氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。具体地说,本发明第一次制得了图16和17中所示的序列,即编码第一位氨基酸残基(Met)到第91位氨基酸残基(Leu)的部分和编码第301位氨基酸残基(Phe)到翻译终止密码子的部分。就编码第92位(Val)到第300位氨基酸残基(Leu)的部分来说,已通过分析p63A2确定了其部分序列,但还没有明确确定该区域的全部序列。本发明现已揭示了该部分的确切序列。将总氨基酸序列与小鼠受体GIR相比较,可看出两者之间有高达85.8%的同一性,而序列中N末端和C末端部分所显示的差异可能是由于种属差异所致(图19)。
因此所揭示的全长度开放读框的结构更强有力地提示,由之编码的蛋白质落入具有七个疏水氨基酸簇的所谓G蛋白偶联受体蛋白质这一大类之内(图18)。
再者,以PCR技术从人下丘脑cDNA文库和人全脑poly(A)+RNA扩增了编码所说受体的cDNA这一事实有力地提示,所说的受体可在中枢神经***的相对广泛的区域内发挥功能。
当使用具有全长度开放读框的本发明cDNA时,可以产生受体蛋白质。当使用以适当的工具表达的所说的受体蛋白质时,便可以以受体结合实验或细胞内第二信使检测的结果作为指标从出现于体内的化合物或其他天然或非天然化合物中筛选出与所说受体蛋白质结合的配体。此外,也有可能筛选出能够改变G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物,例如能够抑制结合活性的化合物。
因此,本发明提供:
(1)包括由SEQ ID NO:1物表示的氨基酸序列或其实质等同物的G蛋白偶联受体蛋白质,或其盐;
(2)如(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽,或其盐。例如,至少16个氨基酸的片段;
(3)包括编码(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或如(2)中所述的部分肽之核苷酸序列的DNA;
(4)(3)中所述的包括由SEQ ID NO:2表示之核苷酸序列的DNA;
(5)包含(3)中所述DNA的重组载体;
(6)携带(3)中所述DNA或(5)中所述重组载体的重组体;
(7)生产(1)所述G蛋白偶联受体蛋白质或其盐的方法,其包括培养(6)中所述的重组体;
(8)用于检测(1)中所述G蛋白偶联受体蛋白质结合之配体的方法,其包括使(i)如(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或如(2)中所述的部分肽或其盐与(ii)待检样品接触;
(9)用于筛选能够改变(1)中所述G蛋白偶联受体蛋白质或其盐与配体之结合活性的化合物的方法,该方法包括就下列两种情况进行比较:(i)所说的配体与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或(2)中所述的部分肽或其盐接触的至少一种情况,和(ii)所说的配体连同待检样品一起与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或(2)中所述的部分肽或其盐相接触的至少一种情况;
(10)用于筛选能够改变(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐与配体之结合活性的化合物的药盒,该药盒包含如(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或如(2)中所述的部分肽或其盐。
(11)按(9)中所述的筛选方法或使用(10)中所述的筛选药盒得到的、能够改变(1)中所述G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐;
(12)抗(1)中所述G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或(2)中所述的部分肽或其盐的抗体。
更具体地说,本发明进一步提供:
(13)用于检测(8)中所述配体的方法,其中配体是下列物质之一:血管紧张肽、铃蟾肽、类***苷、缩胆囊肽、谷氨酰胺、血管紧张素、褪黑素、神经肽Y、阿片样肽、嘌呤、加压素、催产素、VIPs(血管活性肠肽和相关肽)、促生长素抑制素、多巴胺、促胃动素、糊精、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、白三烯、胰抑制素、***素样激素、凝血烷、腺嘌呤核苷、肾上腺素、α和β超化固子(如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、RANTES、等)、内皮肽、肠抑胃泌素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽和galanin;
(14)筛选能够改变(1)中所述G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括在至少下述各种情况下检测与所说的G蛋白偶联受体蛋白质结合被标记配体的量:(i)被标记配体与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或(2)中所述的部分肽或其盐接触时,以及(ii)被标记配体连同待检化合物与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或(2)中所述的部分肽或其盐接触时,并比较所检测到的被标记之配体的量;
(15)筛选能够改变(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括在至少下述各种情况下检测与含有所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞结合的被标记配体的量:(i)在被标记配体与所说的细胞接触的情况下,以及(ii)在标记配体连同待检化合物与所说的细胞接触的情况下,并比较所测得的被标记之配体的量;
(16)筛选能够改变(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括在至少下述各种情况下检测与含有所说G蛋白偶联受体蛋白质之细胞的膜部分结合的被标记配体的量:(i)在被标记配体与所说的膜部分接触的情况下;(ii)在被标记配体连同待检化合物与膜部分接触的情况下,并比较所检测到的被标记配体的量;
(17)筛选能够改变(1)中所说G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括在下列至少各种情况下检测与所说G蛋白偶联受体蛋白质结合的被标记配体的量:(i)在被标记的配体与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质接触的情况下,但其中所说的受体蛋白质是在培养(6)中所述转化体后在所说转化体的细胞膜上表达的,和(ii)在被标记配体连同待检化合物一把与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质接触的情况下,但其中所说的受体蛋白质是在培养(6)中所述转化体后在该转化体的细胞膜上表达的,并比较所测得的被标记配体的量;
(18)筛选能够改变(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与其配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括在至少下列各种情况下检测G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性:(i)在能够激活如(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质的化合物与含有如(1)中所述之G蛋白偶联受体蛋白质的所说细胞相接触的情况下,以及(ii)在能够激活如(1)所述的G蛋白偶联受体蛋白质的化合物连同待检测化合物一起与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞相接触的情况下,然后比较所测得的细胞刺激活性;
(19)筛选能够改变(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括在至少下列各种情况下检测G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性:(i)在能够激活如(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质的化合物与G蛋白偶联受体蛋白质接触的情况下,其中所说的受体蛋白质是在培养含有(3)中所述DNA的转化体后在所说转化体的细胞膜上表达的,和(ii)在能够激活(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质的化合物连同待检化合物一起与G蛋白偶联受体蛋白质接触的情况下,其中所说的受体蛋白质是在培养含有(3)中所述DNA的转化体后在所说转化体的细胞膜上表达的,然后比较所测得的细胞刺激活性;
(20)如(18)或(19)中所述的筛选方法,其中能够激活(1)中所述之G蛋白偶联受体蛋白质的化合物是下列物质之一:血管紧张肽、铃蟾肽、类***苷、缩胆囊肽、谷氨酰胺、血管紧张素、褪黑素、神经肽Y、阿片样肽、嘌呤、加压素、催产素、VIPs(血管活性肠肽和相关肽)、促生长素抑制素、多巴胺、促胃动素、糊精、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、白三烯、胰抑制素、***素样激素、凝血烷、腺嘌呤核苷、肾上腺素、α和β超化固子(如IL-8、GROα、GROβ GROr、NAP-2、ENA-78、PE4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、MANTES、等)、内皮肽、肠抑胃泌素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽和galanin;
(21)按(9)和(14)至(20)中所述筛选方法之一获得的化合物或其盐;
(22)包含如(21)中所述之化合物或其盐的药物组合物;
(23)如(10)中所述的药盒,其包括含有如(1)中所G蛋白偶联受体蛋白质的细胞;
(24)如(10)中所述的药盒,其包括含有如(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质的细胞膜部分;
(25)使用(10)、(23)或(24)中所述的药盒获得的化合物或其盐;
(26)包含(25)中所述化合物或其盐的药物组合物;以及
(27)检测如(1)中所述G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或如(2)中所述部分肽或其盐的方法,其包括使(12)中所述的抗体与(1)中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或(2)中所述的部分肽或其盐接触。
附图的简要说明
图1显示以PCR扩增技术从人杏仁核得到的新的受体蛋白质cDNA克隆p63A2的5’侧部分核苷酸序列,以及由其编码的氨基酸序列。划下线部分相当于用于PCR扩增的合成引物。
图2显示经PCR扩增从人杏仁核得到的新的受体蛋白质cDNA克隆p63A2的3’侧部分核苷酸序列,以及由其编码的氨基酸序列。划下线部分相当于用来进行PCR扩增的合成引物。
图3显示基于图1所示氨基酸序列制作的疏水性曲线图。根据该图,揭示其中存在由1至3指示的疏水区域。
图4显示基于图2所示氨基酸序列制作的疏水性曲线图。根据该图,提前其中存在由4至6指示的疏水区域。
图5显示经分析p63A2编码的新的受体蛋白质cDNA所得到的部分氨基酸序列,并与由小鼠T细胞衍生的糖皮质素诱导表达的G蛋白偶联受体蛋白质(P30731)的部分氨基酸序列相比较。涂暗部分指示相同的氨基酸残基。
图6显示为了以RACE方法进行克隆而制备的p63A2特异性引物,得自人下丘脑的新的受体蛋白质cDNA的未知序列区域,以及引物的λgt11上的定位。
图7显示对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析所得到的结果,其中扩增产物是使用图6中所示引物的不同组合经RACE制得的。
图8显示使用p63A2特异性序列作为探针对图7中所示的多个扩增产物进行southern杂交所得到的结果。该图提示存在如箭头所指示的带有p63A2特异性序列的扩增产物。
图9显示在以RACE方法从人下丘脑得到之cDNA的5’末端区域核苷酸序列和由小鼠T细胞衍生之糖皮质素诱导表达的G蛋白偶联受体蛋白质GIR(P30731)的相应核苷酸序列不同进行同源性检索的结果。方框内包括的部分为各个可能作为转译起始密码子的序列,椭圆内包括的部分为各个可能作为转译终止密码子的序列。划双下线的部分为用于扩增整个开放读框之引物序列。该图还提示,在相当于小鼠GIR起始密码子之附近的部分中还存在一个可能作为以RACE方法扩增的cDAN中的起始密码子的序列。
图10显示对以RACE方法从人下丘脑得到之cDNA的3’末端区域核苷酸和小鼠GIR之相应核苷酸序列间进行同源性检索所得到的结果。该图所示结果提示,与小鼠GIR相比较,所得cDNA的3’末端区域没有达到转译终止密码子处。
图11图样显示如基于图9和图10中所示核苷酸序所估计的,从人下丘脑得到之cDNA的开放读框的未知序列区域。
图12显示对用3’AmpliFINDER RACE方法从人脑cDNA得到的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析的结果。
图13显示使用p63A2特异性序列作为探针为图12中所示的多个扩增产物进行Southern杂交的结果。从该图中看出,存在有如箭头指示的具有p63A2特异性序列的扩增产物。
图14显示在以3’AmpliFINDER RACE方法从总人脑poly(A)+RNA得到之cDNA的3’末端区域核苷酸序列和小鼠GIR的相应序列之间进行同源性检索的结果。椭圆内所包括的部分指示可能作为转译终止密码子的序列。划双下线的部分指示用于全长度开放读框扩增的引物序列。从该图中看出,在小鼠GIR的终止密码子付近存在可能作为cDNA中之终止密码子的序列。
图15显示含有63A2full之全长度开放读框的扩增产物,所说的扩增产物是使用基于用9中所示5’非翻译区和图14所示3’非翻译区的核苷酸序列制备的引物,经PCR扩增得到的。
图16和图17显示经亚克隆图15中所示的PCR扩增产物所得到的p63A2 full编码之受体蛋白质cDNA的完整开放读框的核苷酸序列,以及由所说的序列编码的氨基酸序列。
图18显示基于图16和17中所示氨基酸序列制得的疏水性曲线图。根据该图,提示存在由I到VII指示的七个疏水区域。
图19显示p63A2 full编码的氨基酸序列与小鼠GIR编码的氨基酸序列之间的比较。划暗影部分指示相同的氨基酸残基。
本发明的G蛋白偶联受体蛋白质可以是衍生于人和例如豚鼠、大鼠、小鼠、猪、羊、牛、猴等其他温血动物的杏仁核、脑垂体、胰脱、脑、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肺、消化道、血管、心脏、胸腺、脾、白细胞等各种组织或细胞的任何G蛋白偶联受体蛋白质,并包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其实质上的等同物。因此,本发明的G蛋白偶联受体蛋白质中除了包括有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质外,还包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列有90%以上,较好有95%以上氨基酸序列同源性,并且与包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的蛋白质在至少一种生物学活性上有定性上实质等同活性的那些蛋白质。这些蛋白质所具有的定性上实质等同的活性可以包括配体结合活性和信号转导活性。术语“实质等同的”是指配体结合活性等性质是等同的。因此,既使在例如配体结合活性的强度和受体蛋白质的分子量等方面强度上有所差异也是允许的。
优选地,G蛋白偶联受体蛋白质包括人杏仁核衍生的具有如SEQID NO:1所示氨酸基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质。G蛋白偶联受体蛋白质还包括突变体如其中从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中删除了1-30个氨基酸残基,较好1至10个氨基酸残基,最好几个氨基酸残基的缺失蛋白质,和其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列上加入1至30个氨基酸残基,较好1至10个氨基酸残基,最好几个氨基酸残基的蛋白质,以及其中用一个或多个其他氨基酸残基取代SEQ ID NO:1的氨基酸序列中1至30个氨基酸残基、较好1至10个氨基酸残基,最好几个氨基酸残基的蛋白质和它们的组合。在一个实施方案中,删除了跨膜区。
此外,G蛋白偶联受体蛋白质还包括其中N末端Met已用C1-6酰基例如甲酰或乙酰基等保护基团保护起来的蛋白质、其中Glu的N末端侧已在体内被切割而形成焦谷氨酰胺的蛋白质、其中任何相关结构氨基酸的侧链已被保护的蛋白质,和连接扩链后得到的复合蛋白质如糖蛋白。
G蛋白偶联受体蛋白质的盐包括与生理上可接受的碱例如碱土金属或酸例如有机或无机酸形成的盐,并且较好是生理上可接受的酸加成盐。这些盐例如包括与盐酸、磷酸、氢硼酸或硫酸等无机酸形成的盐,以及与乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸或苯磺酸等有机酸形成的盐。
可用本领域已知的纯化技术,或如下文所述的培养携带有G蛋白偶联受体蛋白质之DNA编码序列的转化体等方法,从人或其他温血动物的组织或细胞中生产G蛋白偶联受体蛋白质或其盐。也可以按照下文所述的肽合成方法生产G蛋白偶联受体蛋白质。
G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽可以包括例如含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞外部分,即暴露在细胞模外部位的片段。部分肽可以是含有一个如在对G蛋白偶联受体蛋白质进行疏水图形分析时见到的(如图17中所示的)细胞外区域(亲水区)的片段,例如包括从第一位Met到第91位Leu之氨基酸序列的肽。此外,也可以使用部分地含有例如从SEQ ID NO:1中第92位Val到第300位Leu,或者从SEQ ID NO:1中第301位Phe到第423位Ser的片段。在一个实施方案中,也可使用含有各个区域的肽,另外,还可使用同时含有多个区域的肽。在一个实施方案中,人们可以使用除SEQ ID NO:3(Val-Cys-His-Val-Ile-Phe-Lys-Asn-Gln-Arg-Met-His-Ser-Ala-Thr-Ser-Leu-Phe-Ile-Val-Asn-Leu-Ala-Thr-Pro-Phe-Thr-Leu-Val-Arg-Phe-Val-Asn-Ser-Thr-Trp-Ile-Phe-Gly-Lys-Gly-Met-Cys-His-Val-Ser-Arg-Phe-Ala-Glu-Tyr-Cys-Leu-His-Val-Ser-Ala-Leu-Thr)及其部分外的SEQ ID NO:1的任何肽片段。人们也会使用cDNA区段SEQ ID NO:5(274-483碱基)或其部分。优选地人们不应使用少于16个氨基酸残基的230~300氨基酸残基(SEQ ID NO:4)的肽片段。同样,在此区域(碱基688-900)(SEQID NO:6)中,人们不应使用少于48个碱基对的cDNA区段。
在另一实施方案中,当与相应的小鼠蛋白质相比时,该肽片段应含有人蛋白质所独有的氨基酸残基。见图19。
在另一优选的实施方案中,肽片段的长度为至少16个氨基酸,优选至少20个氨基酸,更优选至少25个氨基酸。
G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽的盐可以是与提到的G蛋白偶联受体蛋白质的盐相同类型的盐。
可以用本领域已知的肽合成方法或用以适当的肽酶切割G蛋白偶联受体蛋白质的方法生产G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽。肽合成方法可以是固相合成法和/或液相合成法。因此,可以将部分肽或能够构成蛋白质的氨基酸与其残余部分相缩合来生产目的肽,并且当产物带有保护基因时可以从所需肽上除掉保护基团。用于缩合和去保护的已知技术包括下列文献(1)-(5)中所述的方法。
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(4)Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara,BiochemicalExperiment Series(生化学实验***)1,Protein Chemistry(蛋白质化学)IV,205,1977
(5)Haruaki Yajima(ed.),Development of Drugs-Continued,14,Peptide Synthesis(肽合成),Hirokawa Shoten
反应后,可联合使用例如溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相层析和重结晶等常规的纯化技术以纯化和分离本发明的蛋白质。当按上述方法分离的蛋白质是游离化合物时,可用已知方法将其转变成适当的盐。而当分离的产物是盐时,则可以用已知方法将其转变成游离肽。
编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质的DNA可以是编码具有SEQID:1所示氨基酸序列之G蛋白偶联受体蛋白质或其实质上的等同物的DNA。也可以是人基因组DNA、人基因组DNA文库、人组织或细胞衍生的cDNA、人组织或细胞衍生的cDNA文库及合成的DNA中的任何一种。这些文库的载体可以包括噬菌体、质粒、粘粒和噬菌粒。此外,可以使用从组织或细胞制备的mRNA组分,以RT-PCR方法进行直接扩增。
更具体地说,编码包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的人杏仁核衍生之G蛋白偶联受体蛋白质的DNA可以是其中含有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其部分核苷酸序列,例如SEQ ID NO:2中第1至第273位,第274至第900位、或第901位至第1269位核苷酸序列的DNA。
此外,可以使用编码上述部分蛋白质如16个氨基酸的片段,突变体,单个或多个区域肽之DNA。
另外,可以使用能与所说的DNA杂交的DNA。杂交体DNA是编码与SEQ ID NO:1的G蛋白偶联受体蛋白质有相似活性之蛋白质的DNA。
可用多种方法克隆完全编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质的DNA,例如可以使用具有G蛋白偶联受体蛋白质之部分核苷酸序列的合成的DNA引物进行PCR扩增,或者使用***到适当载体中并标记的DNA与含有人衍生的G蛋白偶联受体蛋白质之部分或全部区域的DNA片段或合成的DNA进行杂交。典型地可以按照Molecular Cloning[分子克隆](2nd,ed.,J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)中所述的方法进行杂交。在使用商品文库时,可以按照其所附带的手册中的说明书进行操作。
根据使用的目的不同,可以直接使用,或在用限制性酶消化后或加入接头后使用克隆的编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA。该DNA在5’末端具有作为翻译起始密码子的ATG,并可在3’末端具有作为终止密码子的TAA、TGA或TAG。可以借助适当的DNA衔接头加入翻译起始和终止密码子。
例如可以(a)从本发明编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA中切掉靶DNA片段,并且(b)将把DNA片段连接在适当表达载体中启动子的下游侧。从而得到G蛋白偶联受体蛋白质的表达载体。
载体可以包括衍生于大肠杆菌的质粒,例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等;衍生于枯草芽胞杆菌的质粒,例如pUB110、pTP5、pC194等;衍生于醇母的质粒;例如pSH19、pSH15等;噬菌体例如入噬菌体,以及动物病毒例如逆转录病毒、痘病毒如牛痘病毒或鸟痘病毒,疱疹病毒和杆状病毒。
根据本发明,只要与用来表达基因的宿主细胞相容,任何启动子均可使用。当用于转化的宿主是大肠杆菌时,启动子较好是trp启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等。当用于转化的宿主是芽胞杆菌时,启动子较好是SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时,启动子较好是PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当宿主是动物细胞时,所用的启动子包括SV40衍生的启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒(CMA)启动子、SRα启动子等。为表达目的产物,可有效地利用增强子。
再者,必要时可在G蛋白偶联受体蛋白质的N端侧加上宿主相容的信号序列。当宿主是大肠杆菌时,可利用的信号序列包括碱性磷酸酶信号序列、OmpA信号序列等。当宿主是芽胞杆菌时,可利用α-淀粉酶信号序列、枯草蛋白酶信号序列等。当宿主是酵母时,可利用交配因子α信号序列、转化酶信号序列等。当宿主是动物细胞时,可利用胰岛素信号序列、α干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
使用如此构建的携带本发明编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的载体来产生转化体或转染体。宿主例如可以是埃希氏杆菌属微生物、芽胞杆菌属微生物、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。埃希氏杆菌属和芽胞杆菌属微生物包括大肠杆菌K12.DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.60,160(1981))、JA221(J.of Molecular Biology(分子生物学杂志),Vol.120,517(1978))、HB101(J.of Molecular Biology(分子生物学杂志),Vol,41,459(1969))、C600(Genetics(遗传学),Vol.39,440(1954))等。芽胞杆菌属微生物包括枯草芽胞杆菌MI114(Gene(遗传),Vol.24,255(1983))、207-21(J.of Biochemistry(生物化学),Vol.95,76(1984))等。
酵母可以是酿酒酵母AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。昆虫可以是蚕(Bombyx mori幼虫)(Maeda et al.,Mature,Vol.315,592(1985))等。宿主动物细胞可以是猴衍生的细胞系、COS-7、Vero、中国仓鼠***系(CHO细胞)、DHFR基因缺陷性中国仓鼠细胞系(dhfr-CHO细胞)、小鼠L细胞、小鼠骨髓瘤细胞,人FL等。
根据所使用的宿主细胞不同,可使用适合于这些细胞的标准技术进行转化。可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.69,2110(1972)、Gene,Vol.17,107(1982)等文献中公开的方法转化大肠杆菌。可以按照例如Molecular&General Genetics,Vol.168,111(1979)等文献中所述的方法转化芽胞杆菌属微生物。可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.75,1929(1978)等文献中公开的方法转化酵母。可以按照例如Bio/Technology,6,47-55(1988)中描述的方法转化昆虫细胞。可以按照例如Virology,Vol.52,456(1973)等文献中公开的方法转化动物细胞。按照上面提到的技术生产其中包藏有携带G蛋白偶联受体蛋白质编码DNA之表达载体的转化体或转染子。
可以在液体培养基中培养的埃希氏杆菌属或芽胞杆菌属微生物作为宿主的转化体(转染体)。培养基可含有转化体生长所必需的碳源、氦源、矿物质等。碳源可以包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等、氮源可包括铵盘、硝酸盐、玉米浸沧液的浓缩液、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、豆饼、马铃薯浸膏等有机或无机物质。也可以进一步加入酵母,维生素、生长促进因子等。希望培养基的pH值约在5至8之间。
埃希氏杆菌属微生物的培养基较好是含有例如葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基(Miller,Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1972)。可根据需要在培养基中添加例如3β-吲哚基为烯酸等药物以改善启动子的效率。在培养埃希氏杆菌的情况下,通常于大约15至40℃培养大约3至24小时。必要时进行通气和搅拌。在培养芽胞杆菌宿主时,通常于大约30至40℃培养大约6至24小时。必要时也可进行通气和搅拌。在培养以酵母为宿主的转化体时,可使用Burkholder基本培养基(Bostian,K.L.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.77,4505(1980))、含有0.5%酪蛋白氨基酸的SD培养基(Bitter,G.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.81,5330(1984))等。培养基的pH较好调到大约5至8。通常于大约20至35℃培养大约24至72小时。必要时可进行通气和搅拌。在培养其中宿主为昆虫的转化体的情况下,所用的培养基可包括向Grace’s昆虫培养基(Grace,T.C.,Nature,195,788(1962))内加入纯化的(或固定化的)10%牛血清等适当添加剂所得到的培养基。最好将培养基的pH调到大约6.2至6.4。培养通常于大约27℃下进行大约3至5天。必要时可进行通气和搅拌。在培养其中宿主为动物细胞的转化体的情况下,所用的培养基可包括MEM培养基(Science,Vol.122,501(1952))、DMEM培养基(Virology,Vol.8,396(1959))、RPMI1640培养基(J.of the American Medical Association,Vol.199,519(1967))、199培养基(Proceedings of the Society of the BiologicalMedicine,Vol,73,1(1950))等,其中含有例如大约5-20%的胎牛血清。pH值最好是大约6至8。培养通常是在大约30至40℃下进行约15到60小时。必要时可更换培养基、通气和搅拌。
可以按照如下文所述的方法从上述培养物中分离并纯化G蛋白偶联受体蛋白质。
为了从培养的微生物或细胞中提取G蛋白偶联受体蛋白质,在培养后用已知方法收集微生物或细胞,将其悬浮在适当的缓冲液中,用超声波、溶菌酶和/或冻融法等破碎细胞,然后经离心或过滤得到G蛋白偶联受体蛋白质的提取物。也可以使用其他的常规提取或分离方法。缓冲液可含有尿素或盐酸胍等蛋白变性剂,或Triton X-100(注册商标,以下常称之为“TM”等表面活性剂)。
如果G蛋白偶联受体蛋白质是分泌到培养基中的,则在培养完成后从微生物或细胞中分离出上清液并用已知方法收集所得到的上清液。可通过已知的离析、分离和纯化方法的适宜组合纯化含有G蛋白偶联受体蛋白质的培养物上清液及提取物。已知的离析、分离和纯化方法可包括利用溶解度的方法,例如盐析法或溶剂沉降法,主要利用分子大小或重量差异的方法,例如透析、超滤、凝胶过滤或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用电荷差异的方法例如离子交换层析,利用特异亲和性的方法例亲和层析,利用疏水性质之差异的方法例如反相高效液相层析,以及利用等电点差异的方法例如等电聚焦电泳等。
如果所得到的G蛋白偶联受体蛋白质是游离形式的,可用已知方法或与之类似的方法将游离蛋白质转变成其盐。反之,如果所得到的G蛋白偶联受体蛋白质是盐形式的,可用已知的方法或类似的方法将蛋白质盐转变成游离蛋白质或任何其他蛋白质盐。
可随意地修饰由转化体产生的G蛋白偶联受体蛋白质,或者在纯化前或纯化后在适当的蛋白质修饰酶的作用下从蛋白质上去掉一部分多肽。蛋白质修饰酶可包括胰蛋白酶、胰凝胶蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。可以通过试验与标记之配体的偶联(或结合),或者使用特异性抗体以酶免疫检测法(酶联免疫检测法)来检测如此生成之G蛋白偶联受体蛋白质的活性。
以下描述生产本发明G蛋白偶联受体蛋白质(63A2full)的典型实例。
(1)构建用于动物细胞中的表达载体,该载体含有作为***片段的63A2 full编码cDNA的全长度开放读框。
用限制性酶Sa1I消化按下文实施例2中提到的方法制得的质粒p63A2full,从而切下63A2full编码cDNA的全长度开放读框。将此序列与按同样方式用sa1I消化并进一步用BAP(细菌碱性磷酸酶)处理的防止自环化的用于动物细胞中的表达载体PAKKO-111或相似载体进行连接。
连接反应完成后,用一部分反应混合物转化大肠杆菌DH5或类似菌株。在所得到的转化体中,借助限制性酶裂群进行基因图谱分析,或通过核苷酸序列测定来选择一株携带有含63A2full编码cDNA之重组载体的重组体菌株,并大量制备质粒DNA,其中所说的cDNA就已预先掺入pAKKO-111中的启动子例如SRα来说,它是以正向***的。
(2)制备用来表达新的G蛋白偶联受体63A2full的CHO细胞
使用例如基于磷酸钙方法或脂质体方法将基因导入动物细胞内的药盒,将上文(1)中制备的表达载体DNA导入CHO dhfr-细胞中。尽管原始CHOdhfr-细胞不能在无核酸培养基上生长,但含有已在其中导入之表达载体的细胞则可以生长于无核酸培养基上。基于这一特征,使用经向无核酸培养基内加入透析过的胎牛血清而制备的选择性培养基,选择已在其中导入了cDNA的细胞。然后,从基于其可在选择性培养基上生长而选择的细胞中制备poly(A)+RNA部分,然后再例如使用市售药盒制备cDNA,并使用如实施例2中所示的引物进行RT-PCR。可检测由RT-PCR产生的特异性带以证实63A2full在这些细胞内的表达。在添加有10%经透析之胎牛血清和适当抗生素的α-MEM(无核酸)培养基中,于37℃和5%CO2加95%空气的条件下培养所选择的CHO细胞,从而在CHO细胞内产生63A2full受体蛋白质。
(3)制备新的G蛋白偶联受体蛋白质63A2full受体蛋白质。
使用能够表达63A2full受体的CHO细胞或人或动物组织或培养的细胞作为材料,用已知的溶解和层析技术纯化63A2full受体蛋白质。在使用能够与63A2full受体结合的配体或抗63A2full受体蛋白质或其肽片段之抗体的情况下,能够以良好的效率检测到含在各个层析部分中的63A2full受体蛋白质。
更具体地说,将用适当的工具标记的配体结合到63A2full受体上,然后用适当的方法使两者交联,并以标记物作为鉴定指征来纯化63A2full受体蛋白质。另外,通过引起抗63A2full受体之抗体的结合来制备抗体柱并使用所说的柱进行免疫亲和层析,可以更为有效地获得63A2full受体蛋白质。再者,使用所说的抗体,可以借助例如EIA、RIA或Western印迹法量性地检测出包含在各个层析部分的63A2full受体蛋白质,并且可以用此定量结果作为纯化的指标,进一步说,也有可能使结合63A2full受体蛋白质的G蛋白偶联受体蛋白质与信息传递***的各种分子整合,以尽可能地保留之。换句话说,为了筛选出63A2full受体的激动剂或拮抗剂,不一定要得到绝对纯的63A2full受体,而只得到膜组分、溶解产物或部分纯化的产物即可。
G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽和G蛋白偶联受体蛋白质编码DNA可以用于:
1)检测本发明G蛋白偶联受体蛋白质的配体,
2)制备抗体和抗血清,
3)构建用于表达重组受体蛋白质的***,
4)使用上述开发***建立受体结合试验***并筛选药物候选化合物,
5)基于对具有相似或模拟结构的配体和受体的比较设计药物,
6)制备用于分析基团的探针及制备PCR引物,
7)基团操作治疗。
具体地说,有可能借助受体结合试验***(该***则使用一个用于表达重组G蛋白偶联受体蛋白质的***)来筛选对温血动物例如人特异的G蛋白偶联受体激动剂或拮抗剂。如此筛选或鉴定的激动剂或拮抗剂可适于各种应用,其中包括预防和/或治疗各种疾病。
以下描述的是G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或G蛋白偶联受体蛋白质编码DNA及其抗体的应用。
(1)检测本发明G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法
G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或其盐可用作研究所说的G蛋白偶联受体蛋白质之配体的试剂。
根据本发明,提供了检测G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,该方法包括使G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽与待检化合物接触,并测定试验化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的结合量、细胞刺激活性等。
待检化合物可包括但不只限于已知的配体,例如血管紧张肽、铃蟾肽、类***苷、缩胆囊肽、谷氨酰胺、血管紧张素、褪黑素、神经肽Y、阿片样肽、嘌呤、加压素、催产素、VIPs(血管活性肠肽和相关肽)、促生长素抑制素、多巴胺、促胃动素、糊精、缓激肽、CGRP(降钙素基团相关肽)、白三烯、胰抑制素、***素样激素,凝血烷、腺嘌呤核苷、肾上腺素、α和β超化因子(例如IL-8、GROα、GROβGROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、RANTES、等)、内皮肽、肠抑胃泌素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽、galanin、其经过修饰的衍生物、其类似物、其家族成员等,而且还包括人或例如小鼠、大鼠、猪、牛、羊和猴等温血动物的组织提取物、细胞培养物上清液等。例如,将所说的组织提取物、所说的细胞培养物上清液等加到G蛋白偶联受体蛋白质中以检测细胞刺激活性等,并依赖检测结果对单个配体进行分级分离,最后确定并得到之。
在本发明的一个具体实施方案中,所说的检测配体的方法包括检测某样品(包括某种化合物或其盐)是否能够刺激靶细胞的方法,该方法包括在G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或其盐的存在下,或者在受体结合试验***(其中构建并使用重组受体蛋白质的表达***)中,使所说的化合物与G蛋白偶联受体蛋白质结合;并检测受体介导的细胞刺激活性等。可被检测的细胞刺激活性的例子包括刺激或抑制,例如释放花生四烯酸代谢产物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生细胞内cAMP、产生cGMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质磷酸化、激活c-fos、降低细胞外pH等生物学反应。所说的能够通过与G蛋白偶联受体蛋白质的结合刺激细胞的化合物或其盐包括肽、蛋白质、非肽类化合物、合成的化合物、发酵产物等。
在本发明的更具体的实施方案中,所说的筛选和鉴定配体的方法包括:
1)筛选G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,该方法包括使标记的试验化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或它的部分肽或其盐接触,并检测与所说的蛋白质或其盐,或与所说的部分肽或其盐结合的标记之试验化合物的量;
2)筛选G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,该方法包括使标记的试验化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜部分接触,并检测与所说的细胞或所说的膜部分结合之标记的试验化合物的量,在这样的方法中,DNA可用于制备含有G蛋白或其片段的细胞或细胞膜;
3)筛选G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,该方法包括使标记的试验化合物与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质之编码DNA的转化细胞体而在其细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触,并检测与所说的G蛋白偶联受体蛋白质结合之被标记试验化合物的量;
4)筛选G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,该方法包括使试验化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触,并检测细胞刺激活性,例如对通过G蛋白偶联受体蛋白质介导的释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生cGMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质磷酸化、活化c-fos、降低细胞外pH等生物学反应的促进或抑制活性;以及
5)筛选G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,该方法包括使试验化合物与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质之编码DNA的转化体细胞而在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触,并检测至少一种细胞刺激活性,例如促进或抑制通过G蛋白偶联受体蛋白质介导的释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生cGMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质磷酸化,活化c-fos、降低细胞外pH等生理学反应的活性。
以下描述的是筛选和鉴定配体之方法的特定实例。
首先,用于检测配体之方法的G蛋白偶联受体蛋白质可以包括含有上述G蛋白偶联受体蛋白质、其部分肽或其盐的任何材料,但更可取的是在动物细胞中表达大量的G蛋白偶联受体蛋白质。
在大量生产G蛋白偶联受体蛋白质中,可以使用上文提到的方法并通过在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达所说的蛋白质编码DNA来完成之。就编码细胞外表位、细胞外区域等特殊区域的DNA片段来说可以使用互补DNA,但表达方法不只限于此。例如,也可以使用基因片段或合成的DNA。
为了在宿主动物细胞内导入G蛋白偶联受体蛋白质的编码DNA并有效地表达之,最好将所说的DNA片段掺入到衍生于核多角体病毒(其属于杆状病毒)的多角体启动子、衍生于SV40的启动子、衍生于逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、人热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等启动子的下游。可以使用本领域技术人员已知方法或基于本公开的相似方法检测所表达之受体的数量和质量。例如,可以使用Nambi,P.et al.,The Journal of Biochemical Society,Vol.267,19555-19559(1992)中所述的方法。
因此,就检测配体来说,含有G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的材料可以包括按本领域技术人员已知的方法或其相似方法纯化的含有G蛋白偶联受体蛋白质的产物、所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽片段,含有所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、含有所说受体蛋白质之细胞的膜部分等。
当在配体检测方法中使用含G蛋白偶联受体蛋白质时,可以用包括戊二醛、甲醛等结合剂固定所说的细胞。可以使用本领域技术人员已知的方法或与之相似的方法进行固定化处理。
含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是表达G蛋白偶联受体蛋白质的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等微生物。
细胞膜部分是在破碎细胞后用本领域技术人员已知的方法或其相似方法制备的离合细胞膜的部分。破碎细胞的方法可以包括使用Potter-Elvehiem匀浆器挤压细胞、用Waring捣碎器或由Kinematica制造的Polytron匀浆器破碎细胞、用超声波破碎细胞,通过从小喷嘴吹出同时使用French挤压器等施加压力破碎细胞。在分级分离细胞膜时,主要使用依靠离心力的分级分离方法,例如分级离心分离和密度梯度离心分离。例如,可用低速度(500rpm到3,000rpm)和短时间(通常为1至10分钟)离心分离出已破碎细胞的细胞液,然后进一步以高速度(15,000rpm 30,000rpm)将上清液离心30分钟至2小时并以所得到的沉淀物作为膜部分。所说的膜部分含有大量表达的G蛋白偶联受体蛋白质和大量膜成分,例如衍生于细胞的磷脂和膜蛋白。
含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞膜部分中G蛋白偶联受体蛋白质的量较好为每个细胞103至108个分子,最好每个细胞105至107个分子。顺便提到的是,每个膜部分所表达的量越大,配体结合活性(比活性)就越高,从而便有可能构建高敏感的筛选***,并且得以在同一批内检测大量的样品。
在完成上述的检测能够与G蛋白偶联受体蛋白质结合之配体的方法时,适当的G蛋白偶联受体部分和标记的试验化合物是必不可少的。G蛋白偶联受体部分较好是天然存在的(天然型)G蛋白偶联受体或具有等同于天然型G蛋白偶联受体之活性的重组G蛋白偶联受体。这里,术语“等同于…的活性”是指如上文中讨论的实质上等同的配体结合活性。
标记的试验化合物包括用[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的上文中提到的待试化合物。
具体地说,按下述方法检测能够与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体:
首先将含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜部分悬浮在适合于该检测方法的缓冲液中,以制备用于检测与G蛋白偶联受体蛋白质结合之配体的受体样品。缓冲液可以是pH4-10,较好pH6-8的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液的任何缓冲液,只要它不抑制配体与受体的结合即可。另外,为了减少非特异性结合,可以向缓冲液内加入CHAPS、Tween 80TM(Kao-Atlas,Japan)、毛地黄皂苷。脱氧胆酸盐等去污剂、以及牛血清白蛋白(BSA)、明胶、牛奶衍生物等各种蛋白质。再者,为了抑制蛋白酶对受体和配体的分解破坏作用,可以加入PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(由Peptide Laboratory生产)、胃酶抑制剂等蛋白酶抑制剂。在0.01至10ml所说的受体溶液中共同存在用预定(或一定)量(5,000cmp到500,000cpm)的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的试验化合物。为了弄清非特异性结合量(NSB),还制备一个向其中加入很大过量未标记试验化合物的反应试管。反应于0-50℃下,较好于4-37℃下进行20分钟至24小时,较好进行30分钟至3小时。反应后,通过玻璃纤维滤器等过滤,用适当量的同一缓冲液洗,并借助液体闪烁计数器或γ计数器测定玻璃纤维滤器中保留的放射活性。鉴定由总结合量(B)(大于0)中减去非特异性结合量(NSB)得到的试验化合物中的结合量(B-NSB),即作G蛋白偶联受体蛋白质之配体的量。
在完成上述检测能够与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体的方法4)至5)时,可以用已知方法或从市场购得的检测药盒检测由G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性,例如释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质磷酸化、激活c-fos、降低细胞外pH、激活G蛋白、细胞增殖等。更具体地说,首先是在多孔平板等装置中培养含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞。
在进行配体检测时,于实验前用新鲜培养基或没有显示对细胞有毒性的适当缓冲液替换之,并于适当条件下和加入试验化合物后足够长时间进行培养。然后,提取细胞内容物或回收上清液并用各种方法测定所得到的产物。当由于细胞中含有降解酶而难以鉴定例如花生四烯酸等物质(其为细胞刺激活性的指标)的产生时,可在加入所说酶的抑制剂后再进行检测。例如仅就对抗cAMP产生之抑制作用的活性而言,可以检测对毛喉素等物质处理的细胞产生cAMP的抑制作用,以增加cAMP产生。
用于检测与G蛋白偶联受体蛋白质结合之配体的方法中的药盒包含G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽、含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、从含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞制备的膜部分等。
检测配体之药盒的实例如下。这些药盒优选在管形瓶中含有各种不同的成分。可将G蛋白偶联受体蛋白质和/或配体冻干以增加贮存寿命。可以包括描述以上测定的说明:
1.用于检测配体的试剂。
1)用于检测的缓冲液和用于洗涤的缓冲液。
缓冲液产品是向Hank氏平衡盐溶液(由Gibco生产)内加入0.05%牛血清白蛋白(由Sigma生产)而制成的。
可使该产品通过一个0.45μm孔径的膜滤器进行除菌,并贮存于4℃下或者在使用时配制。
2)G蛋白偶联受体蛋白质样品。
在12孔平板中以5×105个细胞/孔的比率继代培养表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞,并在潮湿的5%CO2/95%空气环境下37℃培养2天以制备样品。
3)标记的试验化合物。
用市售的[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的或用适当方法标记的化合物。
将水溶液状态的产物贮存于4℃至-20℃下,并在使用时用检测缓冲液稀释到1μm。在试验化合物几乎不溶于水的情况下,可将其溶液于二甲基甲酰胺、DMSO、甲醇等有机溶剂中。
4)未标记的试验化合物。
未标记的化合物是以100至1,000倍浓缩状态制备的同一化合物。
2.检测方式
1)用1ml检测缓冲液将培养于12孔组织培养板中的表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞洗两次,然后向各孔内加入490μl检测缓冲液。
2)加入5μl标记的试验化合物并使混合物于室温下反应1小时。为了检测非特异性结合量,加入5μl来标记的试验化合物。
3)从各孔中除去反应溶液,用1ml检测缓冲液将其洗3次。将与细胞结合的标记的试验化合物溶解于0.2N NaOH-1%SDS中并与4ml由WAKO Pure Chemical,Japan生产的液体闪烁剂混合。
4)使用例如由Beckmann生产的液体闪烁计数器检测放射活性。
可与G蛋白偶联受体蛋白质结合的配体包括出现或存在于脑、脑垂体等组织中的物质。配体的例子有(血管紧张肽、铃蟾肽、类***苷、缩胆囊肽、谷氨酰胺、血管紧张素、褪黑素、神经肽Y、阿片样肽、嘌呤、加压素、催产素、VIPs(血管活性肠肽和相关肽)、促生长素抑制素、多巴胺、促胃动素、糊精、缓激肽、CGRP(降钙素基因相关肽)、白三烯、胰抑制素、***素样激素、凝血烷、腺嘌呤核苷、肾上腺素、α和β超化固子(如IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、PF4、IP10、GCP-2、MCP-1、HC14、MCP-3、I-309、MIP1α、MIP1β、RANTES、等)、内皮肽、肠抑胃泌素、组胺、神经降压素、TRH、胰多肽等)。
(2)G蛋白偶联受体蛋白质缺陷性疾病的预防和治疗剂
如果G蛋白偶联受体蛋白质的配体是通过上述方法(1)揭示的,则可使用编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA作为预防和/或治疗剂,依赖于所说配体发挥的作用治疗所说的G蛋白偶联受体蛋白质缺陷性疾病。
例如,当一个病人因为体内的G蛋白偶联受体蛋白质降低而不能发挥配体的生理学作用时,可以增加所说病人脑细胞中的G蛋白偶联受体蛋白质的量,从而通过下述方法充分实现配体所应有的作用:
(a)给病人投用编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA以表达之;或者
(b)将表达G蛋白偶联受体蛋白质的DNA掺入所说病人的脑细胞或其他细胞内。因此,可以将编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA作为一种安全并有较小毒性的预防和治疗剂用于预防和治疗G蛋白偶联受体蛋白质缺陷性疾病。
当使用上述DNA作为治疗和预防剂时,可以单独使用所说的DNA或者在将其***适当的载体例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体,痘病毒等载体中后,对产物载体进行常规药剂学处理。DNA也可作为“裸露”DNA,加有助于摄取的佐剂,通过“基因”枪或通过导管如装有水凝胶的导管来施用。例如,可将其制成片剂(必要时进行糖衣包裹)、胶囊剂、酏剂、微胶囊等形式的口服药剂,或者制成可注射形式的药剂例如加在水中或其他医药上可接受的液体中制成无菌溶液或悬液。可以将本发明的DNA与生理上可接受的载体、香味剂、赋形剂、防腐剂、稳定剂、粘结剂等混合,以一般制药业中常用的方式制成上述这些单元剂量形式的制剂。这些制剂中活性成分的含量应使适当剂量定在一个特定范围之内。
可混合在片剂、胶囊剂中的添加剂包括例如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和***胶等粘结剂,结晶纤维素等赋形剂、玉米淀粉、明胶和藻酸等膨胀剂,硬脂酸镁等润滑剂,蔗糖、乳糖和糖精等甜味剂,以及胡椒薄荷,akamono油和咖啡果等香味剂。当单位剂型是胶囊时,上述材料中可进一步掺入例如油和脂肪等液态载体。可以使用制药业中常用的方法配制注射用的无菌组合物,例如将活性成分、天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮于注射用水等载体中以制成药物组合物。
注射用含水液体包括生理盐水和含有葡萄糖及其他辅助剂例如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠的等渗溶液,并可与例如乙醇、多元醇如聚乙二醇和丙二醇等适当的助溶剂、例如聚山梨醇酯80(TM)和HCO-50等非离子表面活性剂合用。油状液体包括芝麻油和大豆油,并可与苯甲酸苄酯和苯甲醇等助溶剂合用。另外,也可以加入例如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液等缓冲液,杀藻胺、盐酸普鲁卡因等安慰剂,人血清白蛋白、聚乙二醇等稳定剂,苯甲醇、苯酚等防腐剂,及抗氧剂等一起配制上述材料。如此制得的药物组合物如可注射液体一般装在适当安瓶内。因为这些制剂是很安全而且是低毒性的,所以可投用于人和大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等温血动物。
根据病征程度的不同,成年人(体重60kg)口服给药药剂中所说DNA的剂量一般约为每天0.1-100mg,较好1.0-20mg。在非口服给药时,根据给药对象、靶器官、症状、给药方法等的不同,对成年人(体重60kg)一般每天投用大约0.01-30mg,较好0.1-20mg,最好0.1-10mg可注射制剂形式的DNA。对于其他种动物,可投用换算为每60kg体重的相应剂量。
如果希望使用G蛋白偶联受体蛋白或其片段,则应使用纯化形式的,优选至少90%的纯度,更优选至少95%的纯度,进一步优选至少98%的纯度,最优选至少99%的纯度。可用如上所述的制备DNA的方法制备蛋白制剂。例如,可以使用含有诸如生理盐水的含水液体的药物组合物。蛋白质的施用方法与DNA的施用方法相同,其剂量范围也相同。
(3)定量检测G蛋白偶联受体蛋白质的配体
对配体有结合特性的G蛋白偶联受体蛋白质能够以良好的敏感性定量检测体内配体的量。
例如可与竞争分析法联合完成这一定量检测。为此,使待检样品与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触,从而可以测定所说样品中的配体浓度。在一个定量检测的实施方案中,可以使用下列文献1)和2)中所述的方法或与其相似的方法:
1)Hiroshi Irie(ed):“Radioimmunoassay”(Kodansha,Japan,1974);和
2)Hiroshi Irie(ed):“Radioimmunoassay,Second Series”(Kodansha,Japan,1979)。
(4)筛选能改变G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物
可使用本发明的G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽或其盐。或者,也可构建重组G蛋白偶联受体蛋白质的表达***并使用以所说的表达***进行受体结合试验的***。在这些试验***中,有可能筛选能够改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物,例如肽、蛋白质、非肽类化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取物、动物组织提取物或其盐等。这些化合物包括表现有G蛋白偶联受体介导之细胞刺激活性的化合物(所说的细胞刺激活性例如包括促进或抑制释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生cGMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电势、细胞内蛋白质磷酸化、活化c-fos、降低细胞外pH等生理学反应的活性,所谓“G蛋白偶联受体激动剂”,没有这种细胞刺激活性的化合物,所谓“G蛋白偶联受体拮抗剂”等。术语“改变配体的结合活性”包括配体的结合受到抑制和配体的结合受到促进这两种情况。
因此,本发明提供筛选可改变配体与G蛋白偶联蛋白质或其盐之结合活性的化合物的方法,特征在于其包括以下两种情况:
(i)其中配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或其部分肽或其盐接触;以及
(ii)其中配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或部分肽或其盐及所说试验化合物的混合物接触。
在所说的筛选方法中,本发明的一个特征在于与所说G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽结合之配体的量、配体的细胞刺激活性等是分别在下列两种情况下检测的:(i)配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触,以及(ii)配体和试验化合物与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触,然后将两种情况下检测的结果进行比较。
在本发明的另一个实施方案中,提供了下述方法:
1)筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物或其盐的方法,特征在于当被标记的配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽接触时,并且当被标记的配体和试验化合物与G蛋白偶联受体化合物或其部分肽接触时,检测并比较与所说的受体蛋白质或其部分肽或其盐结合的被标记的受体的量;
2)筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物的方法,特征在于当被标记的配体与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜部分接触时,并且当被标记的抗体和试验化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或所说细胞的膜部分接触时,检测并比较与所说的蛋白质或其部分肽或其盐结合的被标记配体的量;
3)筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物或其盐的方法,特征在于当被标记配体与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质之编码DNA的转化体而在其细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时,并且当被标记的配体和试验化合物与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质之编码DNA的转化体而在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时,检测并比较与所说的G蛋白偶联受体蛋白质结合之被标记配体的量;
4)筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物或其盐的方法,特征在于当激活G蛋白偶联受体蛋白质的化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质细胞接触时,并且当激活G蛋白偶联受体蛋白质的化合物和试验化合物与含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞接触时,检测并比较所产生的G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性,例如促进或抑制包括释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生cGMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质的磷酸化、激活c-fos、降低细胞外pH等生理学反应的活性;以及
5)筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物或其盐的方法,特征在于当激活G蛋白偶联受体蛋白质的化合物与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质之编码DNA的转化体而在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时,以及当激活G蛋白偶联受体蛋白质的化合物和试验化合物一起与通过培养携带G蛋白偶联受体蛋白质之编码DNA的转化体而在细胞膜上表达的G蛋白偶联受体蛋白质接触时,检测并比较所产生的G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性,例如促进或抑制生理学反应的活性;其中所说的生理学反应包括释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生cGMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质的磷酸化、激活c-fos、降低细胞外pH等。
为了筛选G蛋白偶联受体激动剂或拮抗剂。首先必须使用从大鼠或小鼠等衍生的含G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、组织或细胞膜部分获得候选化合物(初步筛选),然后确认候选化合物是否真的抑制人G蛋白偶联受体蛋白质和配体之间的结合(二级筛选)。必然存在其他一些受体蛋白质,并且当使用细胞、组织或细胞膜部分时,它们在固有性质上使之难以筛选出所需受体蛋白质的激动剂或拮抗剂。但由于使用人衍生的G蛋白偶联受体蛋白质,就没有必要进行初步筛选,从而有可能有效地筛选出改变配体与G蛋白偶联受体之间的结合活性的化合物。此外,也有可能估测被筛选的化合物是否为G蛋白偶联受体蛋白质激动剂或G蛋白偶联受体拮抗剂。当研究G蛋白偶联受体蛋白质激动剂或G蛋白偶联受体蛋白质拮抗剂并将其开发为人用药物时,有必要使用人衍生的受体蛋白质将其筛选出来,因为经筛选得到之化合物的不同效应是由受体本身的种间属异造成的。
具有强激动剂或拮抗剂活性的化合物可通过研究化合物的化学结构与活性之间的关系,和设计或修饰化合物来获得。在这种情况下,如果能够使用人衍生的受体,则能容易地进行作为人类医药有效的适宜化合物的设计和评估。然而,如果使用动物衍生的受体筛选激动剂或拮抗剂,则一般不能得到对人具有强活性的化合物。
下文中给出对筛选方法的具体说明。
首先,就用于本发明筛选方法的G蛋白偶联受体蛋白质来说,只要其含有G蛋白偶联受体蛋白质包括被取代的、被删除的或被加入的蛋白质或其部分肽,任何产物均可使用,但优选的是使用哺乳动物器官的膜部分。然而,人器官可能极难得到,因此使用以重组技术大量表达的G蛋白偶联受体蛋白质进行筛选是优选的。
在生产G蛋白偶联受体蛋白质中可以使用上述方法。
生产G蛋白偶联受体蛋白质时可使用上述方法并可通过在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达编码所说蛋白质的DNA而实现之。就编码特定区域如细胞外表位、细胞外区域等的DNA片段来说,可以使用互补DNA,但表达方法不只限于此。例如,也可以使用基因片段或合成的DNA。
为了在宿主动物细胞内导入编码G蛋白偶联受体蛋白质的DNA并有效地表达之,较好将所说的DNA片段掺入到衍生于核多角体病毒(属于杆状病毒)的多角体启动子、衍生于SV40的启动子、衍生于逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、人热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子等启动子的下游侧。可使用本领域技术人员已知的方法或其基于本公开的相似方法检测所表达之受体的量和性质。例如,可使用Nambi,p.等人(The Journal ofBiochemical Society(生化学会杂志),Vol.267,19355-19559(1982))所述的方法进行这一检测。
因此,就检测配体来说,含有G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽的材料可包括含有按本领域技术人员已知的方法或其相似方法纯化的G蛋白偶联受体蛋白质的产物、所说G蛋白偶联受体蛋白质的肽片段、含有所说G蛋白偶联受体蛋白质的细胞、含有所说蛋白质之细胞的膜部分等。
当在检测配体的方法中使用含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞时,可用戊二醛、甲醛等试剂固定所说的细胞。可按本领域技术人员已知的方法或与之相似的方法进行固定化处理。
含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是表达G蛋白偶联受体蛋白质的宿主细胞。所说的宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等微生物。
细胞膜部分是在破碎细胞后按本领域技术人员已知的方法或与之相似的方法制备的富含细胞膜的部分。破碎细胞的方法包括使用Potter-Elvehjem匀浆器压榨细胞、用Waring捣碎器或Kinematica制造的Polytron匀浆器破碎细胞,用超声波破碎细胞、通过从小喷嘴吹出同时使用Franch挤压器等施加压力破碎细胞。在分级分离细胞膜时,主要使用依靠离心力的分级分离方法,例如分级离心分离和密度梯度离心分离。例如,可用低速度(500rpm到3,000rpm)和短时间(通常为1至10分钟)离心分离出已破碎细胞的细胞液,然后进一步以高速度(15,000rpm 30,000rpm)将上清液离心30分钟至2小时并以所得到的沉淀物作为膜部分。所说的膜部分含有大量表达的G蛋白偶联受体蛋白质和大量膜成分,例如衍生于细胞的磷脂和膜蛋白。
含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞膜部分中G蛋白偶联受体蛋白质的量较好为每个细胞103至108个分子,最好每个细胞105至107个分子。顺便提到的是,每个膜部分所表达的量越大,配体结合活性(比活性)就越高,从而便有可能构建高敏感的筛选***,并且得以在同一批内检测大量的样品。
在完成上述的检测能够与G蛋白偶联受体蛋白质结合之配体的方法时,适当的G蛋白偶联受体部分和标记的试验化合物是必不可少的。G蛋白偶联受体部分较好是天然存在的(天然型)G蛋白偶联受体或具有等同于天然型G蛋白偶联受体之活性的重组G蛋白偶联受体。这里,术语“等同于…的活性”是指如上文中讨论的实质上等同的配体结合活性。
就标记的配体来说,有可能使用标记的配体,与标记的配体相类似的化合物等。例如,可利用〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等标记的配体以及其他被标记的物质。
具体地说,首先将含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或细胞膜部分悬浮于适用于所选方法的缓冲液中,以制备用于筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质结合活性之化合物的受体样品。就缓冲液来说,可以使用pH4-10,较好pH6-8的、不抑制配体与受体结合的任何缓冲液,例如Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
另外,为了减少非特异性结合,可以向缓冲液内加入例如CHAPS、Tween80TM(Kao-Atlas,Japan),毛地黄皂苷、脱氧胆酸盐等表面活性剂。另外,为了抑制蛋白酶对受体和配体的分解破坏作用,可以加入PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(由PeptideLaboratory,Japan生产)、胃酶抑制剂等蛋白酶抑制剂。向0.01ml至10ml所说的受体溶液中加入一定量(5,000cpm至500,000cpm)的标记配体,同时其中存在有10-4至10-10M的试验化合物。为了确定非特异性结合量(NSB),还制备一个其中加入了大大过量的未标记之试验化合物的反应管。
反应于0-50℃,较好于4-37℃下进行20分钟至24小时,较好进行30分钟至3小时。反应后,通过玻璃纤维滤器、过滤纸等过滤,用适当量的同一种缓冲液洗涤,并借助液体闪烁计数器或γ计数器测定保留于玻璃纤维滤器中的放射活性。假定从总结合量(B0)(其中不存在拮抗物质)中减去非特异性结合量(NSB)所得到的计数定为100%,即可例如选择其中从总结合量(B)中减去非特异性结合量(NSB)所得到的特异性结俣量(B-NSB)小于50%的试验化合物作为本发明G蛋白偶联受体蛋白质的候选配体。
在进行上述筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物的方法4)至5)时,可使用已知方法或使用市场上可购得的检测药盒检测G蛋白偶联受体蛋白质介导的细胞刺激活性,例如促进或抑制生理学反应的活性,所说生理学反应包括释放花生四烯酸代谢物、释放乙酰胆碱、增加细胞内Ca2+、产生cAMP、产生肌醇磷酸、改变细胞膜电位、细胞内蛋白质磷酸化、活化c-fos、降低细胞外pH等。更具体地说,最初是在多孔平板或类似装置中培养含有G蛋白偶联受体化合物的细胞。
在进行筛选时,预先要用对新鲜培养基或细胞未表现有毒性的适当缓冲液取代之,于适当的条件下并在向其中加入试验化合物后保温一定时间。提取所得到的细胞或回收上清液,并用某种方法检测(最好是定量检测)所得到的产物。当由于细胞内所含分解酶的存在难以鉴定那些指标物质,例如作为细胞刺激活性之指标的花生四烯酸时,可以在加入对抗所说之分解酶的抑制剂后进行检测。对于活性如对cAMP产生的抑制作用来说,可以作为对抗细胞内cAMP产生(其中固有产率已因加入毛喉素等抑制剂而得以增加)的抑制作用进行检测。
在通过测定细胞刺激活性进行筛选时,表达适当的G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是必不可少的。优选的表达G蛋白偶联受体蛋白质的细胞是天然存在的含有G蛋白偶联受体蛋白质(天然型G蛋白偶联受体蛋白质)的细胞系或细胞株例如小鼠T细胞WEHI-7TG等,以及上述表达重组型G蛋白偶联受体蛋白质的细胞系或细胞株等。
试验化合物包括肽、蛋白质、非肽类化合物、合成的化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物、血清、血液、体液等。所说的化合物可以是新的或已知的。
用于筛选可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质或其盐之结合活性的化合物的药盒包含G蛋白偶联受体蛋白质或其部分肽,或含有G蛋白偶联受体蛋白质的细胞或其细胞膜部分。
筛选药盒的实例如下:
1.筛选试剂
1)检测缓冲液和洗涤缓冲液
缓冲液产品是向Hank氏平衡盐溶液(Gibco生产的)内加入0.05%牛血清白蛋白(由Sigma生产的)制成的。
该缓冲液通过一个孔径为0.45m的膜滤器过滤除菌,贮存于4℃下备用或临使用时制备。
2)G蛋白偶联受体蛋白质的样品。
在12孔平板中以5×105个细胞/孔的比率继代培养可表达G蛋白偶联受体蛋白质的CHO细胞,并于37℃,在5%CO2和95%空气环境下培养2天以制备样品。
3)标记的配体。
配体是用市售的〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕等标记的配体。
将水溶液状态的产物贮存于4℃或-20℃,使用时用缓冲液稀释到1m用于检测。
4)标准配体溶液
将配体溶解于含有0.1%牛血清白蛋白(由Sigma生产的)的PBS中使之达到1mM,并贮存于-20℃。
2.检测方法。
1)在12孔组织培养板中培养CHO细胞以表达G蛋白偶联受体蛋白质。用1ml检测缓冲液将表达G蛋白偶联受体蛋白质的细胞洗两次。然后向各孔内加入490μl检测缓冲液。
2)加入5μl浓度为10-3-10-10M的试验化合物溶液,再加入5μl标记的配体并于室温下反应1小时。为了了解非特异性结合量,加入5μl浓度为10-3M的配体以替代试验化合物。
3)从孔中除去反应溶液,用1ml检测缓冲液洗3次。将与细胞结合的被标记的配体溶解于0.2N NaOH-1%SDS中并与4ml液体闪烁剂A(例如由Wako Pure Chemical,Japan生产的)混合。
4)使用液体闪烁计数器(例如Beckmam的产品)检测放射活性并按下更公式计算PMB(百分最大结合):
PMB=[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
其中PMB:百分最大结合
B:加入样品时的测定值
NSB:非特异性结合
Bo:最大结合
以上述筛选方法或筛选药盒制得的化合物或其盐是可改变配体与G蛋白偶联受体蛋白质之结合活性的化合物,其中该化合物抑制或促进结合,更具体地说,其为具有通过G蛋白偶联受体或其盐介导的细胞刺激活性的化合物,即所谓“G蛋白偶联受体激动剂”,或不具有所说的刺激活性的化合物,即所谓“ G蛋白偶联受体拮抗剂”。所说的化合物可以是肽、蛋白质、非肽类化合物、合成的化合物、发酵产物等,并且可以是新的或已知的。
所说G蛋白偶联受体激动剂具有与G蛋白偶联受体蛋白质的配体一样的生理学作用,并因此可依据所说的配体活性将其用作安全而又只有较少毒性的药物组合物。
另一方面,所说的G蛋白偶联受体拮抗剂能够抑制G蛋白偶联受体蛋白之配体的生理学活性,并因此可用作抑制所说配体活性的安全而又有较小毒性的药物组合物。
上述G蛋白偶联受体激动剂或拮抗剂可用作例如脊髓损伤、早老性痴呆、气喘、饮食过多、神经病、痴呆、疼痛、脑血栓、脑炎、脑梗塞、脑血管痉挛、脊椎炎、心绞痛、坏死、***依赖症、***戒除综合症、精神***症、恐怖症、脑缺血性休克、***依赖症、***戒除综合症、焦虑症、抑郁症、呼吸窘迫综合症、戒酒综合症、呕吐、癫痫等疾病的预防和治疗剂。
当使用借助筛选方法或筛选药盒得到的化合物或其盐作为上述药物组合物时,可按常规方法使用之。例如,可以以必要时包裹糖衣的片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型进行口服用药,或者以无菌溶剂和悬浮液(在水或其他药用液体中)将可注射制剂形式进行非口服用药。可以将化合物或其盐与生理上可接受的载体、香味剂、赋形剂、溶剂、抗菌剂、稳定剂、粘结剂等混合,以制药业常用的单位剂量形式生产这些制剂。这些制剂中的活性成分含量应使之得有特定范围之内的适当剂量。
可在片剂、胶囊剂等制剂中混入的添加剂包括明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和***胶等粘结剂,结晶纤维素等赋形剂,玉米淀粉、明胶和海藻酸等膨胀剂、硬脂酸镁等润滑剂,蔗糖,乳糖和糖精等甜味剂,胡椒薄荷、akamono油和咖啡果等香味剂。当单位剂量形式是胶囊剂时,上述材料可进一步掺入液体载体例如油和脂肪。可以按常规制药方法配制注射用的无菌组合物,例如将活性成分、天然植物油例如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮于注射用水等载体中。
注射用水或液体包括生理盐水和含有葡萄糖及其他辅助剂例如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠的等渗溶液,并可与例如乙醇、多元醇如聚乙二醇和丙二醇等适当的助溶剂、例如聚山梨醇酯80(TM)和HCO-50等非离子表面活性剂合用。油状液体包括芝麻油和大豆油,并可与苯甲酸苄酯和苯甲醇等助溶剂合用。另外,也可以加入例如磷酸盐缓冲液和醋酸钠缓冲液等缓冲液,杀藻胺、盐酸普鲁卡因等安慰剂,人血清白蛋白、聚乙二醇等稳定剂,苯甲醇、苯酚等防腐剂,及抗氧剂等一起配制上述材料。如此制得的可注射液体一般装在适当安瓶内。因为这些制剂是很安全而且是低毒性的,所以可投用于人和大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗、猴等温血动物。
根据病征程度的不同,成年人(体重60kg)口服给药药剂中所说的DNA的剂量一般约为每天0.1-100mg,较好1.0-20mg。在非口服给药时,根据给药对象、靶器官、症状、给药方法等的不同,对成年人(体重60kg)一般每天投用大约0.01-30mg,较好0.1-20mg,最好0.1-10mg可注射制剂形式的所说的化合物或其盐。对于其他种动物,可投用换算为每60kg体重的相应剂量。
(5)抗G蛋白偶联受体蛋白质之抗体或抗血清的生产
可使用G蛋白偶联受体蛋白质作为抗原,按本领域已知的抗体或抗血清生产方法或与之相似的方法制备抗G蛋白偶联受体蛋白质的抗体,例如多克隆抗体、单克隆抗体及抗血清。例如可按下述方法制备多克隆抗体。
多克隆抗体的制备
将作为抗原的上述多肽或蛋白质偶联到载体蛋白质上。载体蛋白质例如可以是牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、牛γ球蛋白、血兰蛋白或弗氏完全佐剂(Difco)。
抗原蛋白质和载体蛋白质之间的偶联反应可按已知的方法进行。用于偶联反应的试剂包括但不只限于戊二醛和水溶性碳二亚胺。抗原蛋白质对载体蛋白质的适当比例约为1∶1至1∶10,并且就反应的pH来说,在许多情况下当反应在中性pH,特别是在大约pH6-8范围内进行时,可获得令人满意的结果。在许多情况下,反应时间较好为大约1-12小时,最好为大约2-6小时。在大约0至18℃下,按常规方法将所得到的结合物对水透析,并冷冻贮存或冻干后贮存。
为了生产多克隆抗体,使用按上述方法得到的免疫原接种温血动物。可用于这一目的的温血动物包括哺乳类温血动物,例如兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠、牛、马、猪等;以及鸟类例如鸡、鸽、鸭、鹅、鹑等。就使用免疫原接种温血动物的方法学来说,免疫原的接种量应足以刺激抗体产生。例如,在许多情况下可将1mg免疫原加在1ml含弗氏完全佐剂的盐水中进行乳化,并将此乳剂皮下注射于兔的背部和后肢足垫部位,每间隔4周注射一次,共注射5次以诱导产生所需的抗体。为了收获在温血动物例如兔体内产生的抗体,通常在末次接种后的7至12天从耳静脉放血并离心回收抗血清。为了纯化抗体,一般是使用已结合了各种抗原肽的载体对抗血清进行亲和层析并回收被吸附的部分,以提供多克隆抗体。
可按下述方法生产单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
(a)单克隆抗体生成细胞的制备
单独将G蛋白偶联受体蛋白质或将受体蛋白质与载体或稀释剂一起注射于给药后可能产生抗体的部位。为了提高给药后的抗体产生量,可投用弗氏完全或不完全佐剂。每2-6周给药一次,共2-10次。可使用的温血动物包括猴、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊和鸡,较好是使用小鼠和大鼠。
在制备产生单克隆抗体的细胞时,从用抗原免疫的温血动物中选择出已记录到有抗体滴度的动物(例如小鼠),于末次免疫后2到5天收集动物的脾脏或***,将其中的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合以得到产生单克隆抗体的杂交瘤。为了检测抗血清中的抗体浓度,例如可使被标记的G蛋白偶联受体蛋白质(将在下文中提到)与抗血清反应,然后测定标记试剂与抗体的结合活性。可按照Koehler和Milstein(Nature,256,495,1975)的方法完成融合操作。融合加速剂可以是聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等,但较好是使用PEG。
骨髓瘤细胞可以是NS-1,P3U1、SP2/0、AP-1等,优选的是P3U1。所使用的抗体生成细胞(脾细胞)对骨髓瘤细胞的数量比例较好在大约1∶1至20∶1范围内。以大约10-80%的浓度加入PEG(较好是PEG1000到PEG6000),然后于20-40℃(较好为30-37℃)保温1至10分钟即可实现有效地细胞融合。
可用各种方法筛选产生抗G蛋白偶联受体抗体的杂交瘤。例如,将杂交瘤培养物的上清液加到直接或借助载体吸附了G蛋白偶联受体蛋白质抗原的固相(例如微量滴定板)上,然后向其中加入用放射活性物质、酶等标记物或蛋白A标记的抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞是小鼠细胞时,则使用抗小鼠免疫球蛋白抗体),并检测结合于固相上的抗G蛋白偶联受体单克隆抗体;或者向已吸附了抗免疫球蛋白或蛋白A的固相内加入杂交瘤培养物的上清液,然后加入用放射活性物质标记的G蛋白偶联受体,并检测与固相结合的抗G蛋白偶联受体单克隆抗体。
可以使用本领域技术人员已知的方法或其相似方法选择并克隆产生抗G蛋白偶联受体单克隆抗体的杂交瘤。通常在含有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)的动物细胞培养基中进行所说的选择和克隆。就用于选择、克隆和细胞生长的培养基来说,只要杂交瘤细胞能在其中生长,任何培养基均可使用。例如所说的培养基可以是含有1-20%(较好10-20%)胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基(Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd.,Japan)、含有1-20%胎牛血清的CIT培养基(Wako Pure Chemical,Japan)以及用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101;NissuiSeiyaku,Japan)。培养温度通常为20-40℃,较好为大约37℃。培养时间通常为5天至3周,较好为1至2周。培养通常是在5%CO2气体环境中进行的。可使用上述检测抗血清中抗G蛋白偶联受体之抗体滴度的方法检测杂交瘤培养物上清液中的抗体滴度。
(b)单克隆抗体的纯化
同分离/纯化常规多克隆抗体一样,可使用分离/纯化免疫球蛋白的方法分离/纯化抗G蛋白偶联受体单克隆抗体,这些方法例如包括盐析、用乙醇沉淀、等电沉淀、电泳、使用离子交换剂例如DEAE吸附/解吸附、超离心、凝胶过滤,以及特异性纯化方法(其中通过用例如结合抗原的固相、蛋白A或蛋白G等活性吸附剂处理以便只收集抗体,并在键断裂后得到抗体)。
按上述方法(a)或(b)制备的抗G蛋白偶联受体抗体能够特异性地识别G蛋白偶联受体,并因此可将其用于定量检测液体试验样品中的G蛋白偶联受体,特别是用夹心免疫检测法进行定量检测。
因此,本发明提供例如下述方法:
(i)定量检测液体试验样品中的G蛋白偶联受体的方法,其包括
(a)使液体试验样品和标记的G蛋白偶联受体与结合G蛋白偶联受体的抗体进行竞争性反应,并
(b)检测与所说抗体结合的被标记之G蛋白偶联受体的比例;以及
(ii)定量检测液体试验样品中的G蛋白偶联受体的方法,其包括
(a)使液体试验样品同时或相继与固定于不溶性载体上的抗体及被标记的抗体反应,并
(b)检测不溶性载体上标记试剂的活性;
其中一种抗体能够识别G蛋白偶联受体的N末端区域,而另一种抗体能够识别G蛋白偶联受体的C末端区域。
当使用识别G蛋白偶联受体的本发明的单克隆抗体(下文中可将其称为“抗G蛋白偶联受体抗体”)时,可借助组织染色等方法检测并进而确定G蛋白偶联受体。为此目的,可以使用抗体本身或抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。对利用本发明的抗体完成的检测方法没有特殊限制,只要其中提供助化学或物理手段检测待检液体样品中依赖于或相应于抗原量(例如G蛋白偶联受体等的量)之抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量,然后使用由含有已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算结果即可。例如,可适当地选用naphrometry竞争法、免疫检测法及夹心法,但从敏感性和特异性角度考虑,较好是使用下文描述的夹心法。
用于该检测方法的标记试剂例如可以是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、胶体、磁性物质等。放射性同位素可以是〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕和〔14C〕;优选的酶是比较稳定的并且有大的比活性的酶,例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶;荧光物质例如可以是荧光胺、异硫氰酸荧光素等;发光物质例如可以是鲁米诺、兽米诺衍生物、虫荧光素、光泽精素(lucigenin)等。此外,也可以使用生物素-抗生物素蛋白使抗体或抗原与标记试剂连接在一起。
在固定抗原或抗体时,可以使用物理吸附法,或者也可使用通常用于固定蛋白质或酶的化学结合法。载体例如可以是琼脂糖、葡聚糖及纤维素等不溶性多糖,和聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚硅氧烷等合成树脂,以及玻璃等。
在夹心(或两位点)方法中,先使试验液体样品与固定化的抗G蛋白偶联受体抗体反应(第一反应),然后使之与被标记的抗G蛋白偶联受体抗体反应(第二反应),并检测不溶性载体上标记试剂的活性,进而确定试验液体中G蛋白偶联受体的量。第一反应和第二反应可以颠倒或同步进行,或者可以间隔进行。标记试剂的类型和固定化方法可以与上文所述的相同。在借助夹心法进行免疫试验中,用作标记抗体的抗体和用于固相的抗体并不一定总是同一类型或同一种来源的,为了改善检测敏感性等,也可以使用两种或多种抗体的混合物。
在本发明的利用夹心法检测G蛋白偶联受体的方法中,用于第一和第二反应的优选抗G蛋白偶联受体抗体是其中与G蛋白偶联受体结合的位点彼此不同的抗体。因此,用于第一和第二反应的抗体是其中当用于第二反应的抗体识别G蛋白偶联受体的C末端区域时,则在第一反应中较好是使用识别C末端以外的位点例如识别N末端区域的抗体。
本发明的G蛋白偶联受体的抗体可以用于夹心法以外的检测***例如竞争法、免疫测定法的naphrometry。在竞争法中,使试验溶液中的抗原和被标记的抗原与抗体以竞争方式反应,然后分离未反应的被标记抗原(F)和与抗体结合的被标记抗原(B)(即B/F分离),并检测B和F的标记量,进而在此基础上确定试验溶液中的抗原量。就用于这种反应的方法来说,可包括液相法-其中使用可溶性抗性作为第一抗体并使用聚乙二醇、抗上述抗体的第二抗体等进行B/F分离,以及固相法-其中使用固定化的抗体作为第一抗体或使用可溶性抗体作为第一抗体,同时使用固定化的抗体作为第二抗体。
在免疫测定法中,使试验溶液中的抗原和固定化的抗原与一定量的被标记抗原进行竞争反应,然后分离出固相和液相;或者使试验溶液中的抗原和过量的被标记抗体进行反应,然后加入固定化的抗原,以结合未反应的用固相标记的抗体并分离成固相和液相。之后,检测各相的标记量以确定试验溶液中的抗原量。
在nephrometry中,检测因凝胶中或溶液中抗原-抗体反应所产生的不溶性沉淀物的量。当试验溶液中的抗原量很小并且只得到小量的沉淀物时,可以适当地选用其中利用激光散射的激光nephrometry法。
在将那些免疫学检测方法(免疫检测法)应用于本发明的检测方法时,不必采用特殊的条件、操作步骤等。可以根据本领域技术人员在技术上的考虑,采用各种方法的常规条件和操作步骤建立用于检测G蛋白偶联受体的检测***。有关那些常规技术手段的详细内容,可见参各种评论文献、参考书等,例如可参见
Hiroshi Irie(ed):"Radioimmunoassay"(Kodansha,Japan,1974);HiroshiIrie(ed):"Radioimmunoassay;Second Series"(Kodansha,Japan,1979);Eiji Ishikawa et al.(ed):"EnzymeImmunoassay"(Igaku Shoin,Japan,1978);Eiji Ishikawaet al.(ed):"Enzyme Immunoassay"(Second Edition)(Igaku Shoin,Japan,1982);Eiji Ishikawa et al.(ed):"Enzyme Immunoassay"(Third Edition)(Igaku Shoin,Japan,1987);"Methods in Enzymology" Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A));ibid. Vo.73(Immunochemical Techniques(Part B));ibid. Vo.74(Immunochemical Techniques(Part C));ibid. Vo.84(Immunochemical Techniques (Part D: SelectedImmunoassays));ibid. Vol.92(ImmunochemicalTechniques(Part E:Monoclonal Antibodies and GeneralImmunoassay Methods));ibid. Vol.121(ImmunochemicalTechniques(Part I:Hybridoma Technology and MonoclonalAntibodies))(Academic Press)
据此,现在即可使用本发明的抗G蛋白偶联受体抗体以高准确度确定G蛋白偶联受体蛋白质的量。
在本发明的说明书和附图中,用于代表碱基(核苷酸)、氨基酸等的缩写符号是由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的或是本领域中习惯使用的。下面给出这些缩写字的某些实例。除特别指出者外,可能存在光学异构体的氨基酸均为L型。
DNA:脱氧核糖核苷酸
A:腺嘌呤
T:胸腺嘧啶
G:鸟嘌呤
C:胞嘧啶
RNA:核糖核酸
mRNA:信使核糖核酸
dATP:脱氧腺苷三磷酸
dTTP:脱氧胸苷三磷酸
dGTP:脱氧鸟苷三磷酸
dCTP:脱氧胞苷三磷酸
ATP:腺苷三磷酸
EDTA:乙二胺四乙酸
SDS:十二烷基硫酸钠
EIA:酶免疫检测法
G,Gly:甘氨酸(或甘氨酰)
A,Ala:丙氨酸(或丙氨酰)
V,Val:缬氨酸(或缬氨酰)
L,Leu:亮氨酸(或亮氨酰)
I,Ile:异亮氨酸(或异亮氨酰)
S,Ser:丝氨酸(或丝氨酰)
T,Thr:苏氨酸(或苏氨酰)
C,Cys:半胱氨酸(或半胱氨酰)
M,Met:蛋氨酸(或蛋氨酰)
E,Glu:谷氨酸(或谷氨酰)
D,Asp:天冬氨酸(或天冬氨酰)
K,Lys:赖氨酸(或赖氨酰)
R,Arg:精氨酸(或精氨酰)
H,His:组氨酸(或组氨酰)
F,Phe:苯丙氨酸(或苯丙氨酰)
Y,Tyr:酪氨酸(或酪氨酰)
W,Trp:色氨酸(或色氨酰)
P,Pro:脯氨酸(或脯氨酰)
N,Asn:天冬酰胺(或天冬酰胺酰)
Q,Gln:谷氨酰胺(或谷氨酰胺酰)
说明书的序列表中所列出的各个SEQ ID NO是指下述序列:
〔SEQ ID NO:1〕是由包括在p63A2full中的人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA编码的全长度氨基酸序列,
〔SEQ ID NO:2〕是包含在p63A2full中的人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA的核苷酸序列,
〔SEQ ID NO:3〕是人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列,该序列是根据对包含在p63A2中之cDNA5’末端部分的核苷酸测序推导的,
〔SEQ ID NO:4〕是人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质的部分氨基酸序列,该序列是根据对包含在p63A2中之cDNA3’末端部分的核苷酸测序推导的,
〔SEQ ID NO:5〕是对包含在p63A2中的人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质cDNA片段之5’末端序列测定所得到的部分核苷酸序列,
〔SEQ ID NO:6〕是对包括在p63A2中的人杏仁核衍生的G蛋白偶联受体蛋白质之3’末端序列测定所得到的部分核苷酸序列,
〔SEQ ID NO:7〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:8〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:9〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:10〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:11〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:12〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:13〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:14〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:15〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:16〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:17〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:18〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
〔SEQ ID NO:19〕是用于筛选编码本发明G蛋白偶联受体蛋白质之cDNA的合成的DNA引物,
已按照布达佩斯条约的规定,于1994年8月9日将按参考实施例3中所述方法制得的定名为INVαF’/p63A2的大肠杆菌转化株保藏在日本国际贸易和工业部,工业科学和技术局的国家生物科学和人类技术研究院(NIBH),指定的保藏号为FERM BP-4777。并于1994年8月22日将该菌株保藏在日本大阪的发酵研究所(IFO),其保藏号为IFO 15738。
按下文实施例2中所述制得的定名为p63A2 full的大肠杆菌转化株也已按照布达佩斯条约的规定于1996年2月2日保藏在NIBH并指定保藏号为BP-5380。还于1996年2月13日将该样品保藏于IFO并指定了保藏号为IFO15924。
实施例
以下描述的是本发明的工作实施例,提供这些实施例只是为了举例说明的目的,而不是限制本发明的范围。
参考实施例1
制备用于扩增编码G蛋白偶联受体蛋白质之DNA的合成的DNA引物
对编码相应于或接近于人衍生的TRH受体蛋白质(HTRHR)、人衍生的RANTES受体蛋白质(HUMRANTES)、人伯基特氏淋巴瘤衍生的未知配体受体蛋白质(HSBLRIA)、人衍生的促生长素抑制素受体蛋白质(HUMSOMAT)、大鼠衍生的μ-阿片样物质受体蛋白质(RNU02083)、大鼠衍生的K-阿片样物质受体蛋白质(U00442)、人衍生的神经调节肽B受体蛋白质(HUMNMBR)、人衍生的毒蝇碱性乙酰胆碱受体蛋白质(HSHM4)、大鼠衍生的肾上腺素α1B受体蛋白质(RATAADRE01)、人衍生的促生长素抑制素3受体蛋白质(HUMSSTR3X)、人衍生的C5a受体蛋白质(HUMC5AAR)、人衍生的未知配体受体蛋白质(HUMRDCIA)、人衍生的未知配体受体蛋白质(HUMOPIODRE)和大鼠衍生的肾上腺素α2B受体蛋白质(RATA2BAR)之一的第一跨膜区之已知氨基酸序列的脱氧核糖核苷酸序列进行比较。结果发现其中存在高度同源的区域或其部分。
另外,对编码相当于或接近于小鼠衍生的未知配体受体蛋白质(HUMGIR)、人衍生的铃蟾肽受体蛋白质(HUMBOMB3S)、人衍生的腺嘌呤核苷A2受体蛋白质(S46950)、小鼠衍生的未知配体受体蛋白质(MUSGPCR)、小鼠衍生的TRH受体蛋白质(S43387)、大鼠衍生的神经调节肽K受体蛋白质(RATNEURA)、大鼠衍生肾上腺素A1受体蛋白质(RATAIARA)、人衍生的神经激肽A受体蛋白蛋白(HUMNEKAR)、大鼠衍生的肾上腺素A3受体蛋白质(RATADENREC)、人衍生的促生长素抑制素1受体蛋白质(HUMSRI1A)、人衍生的神经激肽3受体蛋白质(S8637194)、大鼠衍生的未知配体受体蛋白质(RNCGPCR)、人衍生的促生长素抑制素4受体蛋白质(HUMSSTR4Z)和大鼠衍生的GnRH受体蛋白质(RATGNRHA)之一第6跨膜区之已知氨基酸序列的脱氧核糖核酸序列进行比较。结果发现它们之间存在高度同源的区域或其部分。
括号中的上述缩写字是当使用DNASIS Gene/蛋白质测序数据库(CD019,Hitachi Software Engineering,Japan)检索GenBank/EMBL Data Bank时指定的标志符(参考号),并且通常称为“登录号”或“输入号”。但HTRHR是日本专利公开号304797/1993(欧洲专利申请638645)中公开的序列。
具体地说,计划掺入一些依赖于碱基区域的,与编码大量受体蛋白质的cDNA相一致的混合碱基,以便提高甚至包括在其他区域中之尽可能多的受体cDNA的序列碱基一致性。基于这些序列,制备具有由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8表示的互补于同源核苷酸序列之核苷酸序列的简并性合成DNA。
〔合成的DNA〕
5′-CGTGG(G或C)C(A或C)T(G或C)(G或C)
TGGGCAAC(A,G,C或T)(C或T)CCTG-3′
(SEQ ID NO:7)
5′-GT(A,G,C或T)G(A或T)(A or G)(A或G)GGCA
(A,G,C或T)CCAGCAGA(G或T)GGCAAA-3′
括号指示掺入多个碱基,以在引物制备中产生多个寡核苷酸。换句话说,在合成时,于多碱基之混合物的存在下掺入括号内所示上述DNA的核苷酸残基。
参考实施例2
分离编码人杏仁核衍生之G蛋白偶联受体蛋白质的DNA
(1)以PCR方法,使用人杏仁核衍生的cDNA扩增受体cDNA
使用人扁桃体衍生的cDNA(Quicklone,CLONTECHLaboratories,Inc.)作为模板,以实施例1中合成的DNA引物进行PCR扩增。反应溶液的成分由各1μm合成的DNA引物(SEQ:5’引物序列和3’引物序列)、1ng模板cDNA、0.25mM dNTP、1μl Taq DNA聚合酶和酶检测药盒所附带的缓冲液组成,反应溶液的总量为100μl。使用热循环仪(Perkin-Elmer Co.)将包括95℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟的扩增循环重复30次。在加入Taq DNA聚合酶之前,混合保留的反应溶液并于95℃加热5分钟,于65℃加热5分钟。借助1.2%琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色进一步证实扩增的产物。
(2)将PCR产物亚克隆到质粒载体中并通过分析被***之cDNA区域的核苷酸序列来选择新的受体候选克隆
使用0.8%低融点琼脂糖凝胶分离PCR产物,用剃刀切下凝胶上的电泳带部分,加热熔化后用苯酚提取并在乙醇中沉淀以回收DNA。按照TA克隆药盒(Invitrogen Co.)中所附带的使用说明书,将回收的DNA亚克隆到质粒载体pCRTMII中。将重组载体导入大肠杆菌INVαF’感受态细胞(Invitrogen Co.)中以产生重组体克隆。然后在含有氨苄青霉素和X-gal的LB琼脂培养基中选择带有被***之cDNA片段的重组体克隆。用无菌牙签挑取呈现白颜色的重组细胞克隆以得到大肠杆菌INVαF’/p63A2。
在含有氨苄青霉素的LB培养基中将个别克隆培养过夜并用自动质粒提取机(Kurabo Co.,Japan)处理以制备质粒DNA。用EcoRI切割如此制得的DNA等分样品以证实被***之cDNA片段的大小。用RNase进一步加工余留的DNA样品,用苯酚/氯仿提取,并在乙醇中沉淀以浓缩之。使用DyeDeoxy终止子循环测序药盒(ABI Co.)进行序列测定,使用荧光自动序列仪测定DNA序列,并使用DNASIS(Hitachi System Engineering Co.,Japan)分析所得到的核苷酸序列数据。
基于所确定的核苷酸序列进行同源性检索(图1和2)。结果发现,转化体大肠杆菌INVαF’/p63A2所携带的质粒p63A2中的cDNA片段***物编码一种新的G蛋白偶联受体蛋白质。为了进一步证实这一事实,使用DNASIS(Hitachi System Engineering Co.,Japan)将核苷酸序列转变成氨基酸序列(图1和2),在考虑到疏水性作图(图3和4)的情况下并在氨基酸序列水平上进行同源性检索,以找出与小鼠GIR的同源性(图5)。
SEQ ID NOS:3和4的部分肽序列可采用上述方法得到。
实施例1
用RACE方法(cDNA末端的快扩增)从人下丘脑cDNA文库中克隆编码新的人孤独受体之cDNA的未知序列区域(63A2full)
制备作为RACE模板的人下丘脑cNDA文库(clontech)。因为该cDNA文库是在噬菌体载体λgt11的基础上构建的,所以合成下列用于扩增cDNA部分的引物:
基于λgt11在侧臂部分之已知核苷酸序列的引物:
U1:序列5′-ATATGGGGATTGGTGGCGACGACTC-3′
(25mer) (SEQ ID NO:9)
U2:序列5′-CAACATCAGCCGCTACAGTCAACAG-3′
(25mer) (SEQ ID NO:10)
基于右侧臂之已知核苷酸序列的引物:
L1:序 5′-GCCCGGTTATTATTATTTTTGACAC-3′
(25mer) (SEQ ID NO:11)
L2:序列5′-TTCCTTACGCGAAATACGGGCAGAC-3′
(25mer) (SEQ ID NO:12)
另外,合成下列特异于63A2的引物:
63U:序列5′-CGGCCACCAGCCTCTTCATCGTCAACCTGGC-3′
(31mer) (SEQ ID NO:13)
63L:序列5′-GGCAACCAGCAGAGGGCAAAGAGGACTACC-3′
(30mer) (SEQ ID NO:14)
图6中显示了各自引物、***的cDNA片段及λgt11的预测的相对位置。
将人丘脑cDNAλgt11噬菌体文库溶液(20μl)与80μl无菌蒸馏水相混合并于95℃加热10分钟以进行热变性,然后在冰水上骤冷10分钟。
使用AmpliWax PCR Gem 100(Perkin Elmer),以热启动技术进行PCR反应。将2μl10×EXPCR缓冲液(酶附带的)、4μl12.5mM dNTP溶液、各0.5μl50μM引物溶液(相应于图6和图7的引物组合是:泳道1,63U和63L;泳道2,U1和63U;泳道3,U1和63L;泳道4,U2和63U;泳道5,U2和63L;泳道6,L1和63U;泳道7,L1和63L;泳道8,L2和63U;泳道9,U2和63L)和13μl无菌蒸馏水混合在一起制成底层混合物。将2.5μl按上述方法作为模板板制备的噬菌体溶液、3μl10×EXPCR缓冲液(酶附带的)、0.5l TakaRa EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)和24μl无菌蒸馏水混合在一起制成顶层混合物。向如此制得的顶层混合物内加入一份AmpliWax PCR Gem100,于70℃将其处理5分钟并于冰上处理5分钟,然后向其中加入顶层混合物以制成PCR混合物。
将含有反应混合物的试管固定在热循环仪Gene ATAQ控制器(Pharmacia)上,于95℃处理3分钟,于62℃处理22分钟并于75℃处理2分钟。然后将95℃1分钟、 62℃1分钟和75℃2分钟的扩增循环重复30次,再于75℃处理8分钟。
反应完成后,将一部分反应混合物加到Seakem GTG(FMC)中进行1%琼脂糖凝胶电泳,以分析扩增产物。如图7中所示,检测大量的扩增产物,以便进行Southern杂交,进而确定对63A2特异的PCR产物。
使用非放射性同位素(RI)标记的DIG***(Boeh ringerMannheim)进行Southern杂交。使用PCR DIG探针合成药盒(Boehringer Mannheim),以质粒p63A2作模板并以63U和63L作引物制备探针。使用20×SSC,0.4M NaOH溶液,以毛细管法进行Southern转移。使用UV交联剂CL-1000(UVP)将DNA固定在滤膜上。使用含有60ng已制备的PCR DIG探针的Express Hyb杂交溶液(Clontech)于68℃杂交1小时。第一个15分钟洗涤用2×SSC,0.1%SDS溶液于室温下进行两次。第二个15分钟洗涤用0.1×SSC,0.1%SDS溶液于60℃进行两次。使用DIG发光检测药盒(Boehringer Mannheim)检测杂交的带。
如图8中所示,利用引物组合U1和63U,以及U2和63U,经Southern杂交检测出一条与探针杂交的约670bp的DNA带,而利用引物组合L1和63L,以及L2和63L则检测出一条大约1,200bp的DNA带。因此,从杂交的部分中回收到各自的DNA片段并使用TA克隆药盒(Invitrogen)将其亚克隆到质粒载体中,然后对含有670bp或1,200bp PCR产物的克隆进行***物核苷酸序列分析。
使用BcaBESTTM双脱氧测序药盒(Takada Shuzo)在R.O.B.DNA处理器(Pharmacia)上进行测序反应,并使用ALF DNA序列仪II(Pha rmacia)进行核苷酸序列测定。
将如此得到的核苷酸序列与GIR(其为63A2的小鼠对应物)的核苷到序列比较,证实存在结构上很相似的部分(如图9和图10所示)。但如图10中所示,根据GIR的结构预测表明,就63A2之开放读框的3’侧来说,尚没得到含有终止密码子(用于终止转译)的部分。基于图9和图10中所示的序列,揭示出如图11中图解显示的63A2和未知序列区的序列。然后,以总人脑poly(A)+RNA(Clontech)作为模板,使用3’- Ampli FINDERRACE药盒(Clontech)克隆开放读框的3’侧部分。
为了进行3’-Ampli FINDER RACE,合成下列对63A2特异的引物:
63-6:序列 5′-TTCATCCTGCTCTACATCCTGCCCCTCCTC-3′
(30mer) (SEQ ID NO:15)
63-7:序列 5′-GCCCTGCGGCGCAAAAAGAAGAAGACCATC-3′
(30mer) (SEQ ID NO:16)
63-8:序列5′-GCTGGTGGTAGTCCTCTTTGCCCTCTGCTG-3′
(30mer) (SEQ ID NO:17)
为了合成第一股cDNA,向1μl1μg/μl总人脑poly(A)+RNA中加入11.5μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水(药盒附带的)和1μl10μM NN-1 oligo(dT)CDS引物(药盒附带的),并于65℃将混合物处理10分钟,再在水中处理2分钟。向此混合物中加入5μl4×逆转录酶缓冲液(药盒附带的)和5μl超纯dNTP混合物(药盒附带的)。于52℃处理2分钟后,进一步加入0.5μl 25单位/μl AMV逆转录酶(药盒附带的)。于52℃处理30分钟后,加入0.5μl2单位/μl大肠杆菌RNase H(药盒附带的),并将整个混合物于37℃处理20分钟,再于95℃处理5分钟。将如此制备的溶液作为第一股cDNA合成溶液贮存于-20℃。
使用AmpliWax PCR Gem100(Perkin Elmer),以热启动技术进行初步PCR。将2l10×EXPCR缓冲液(附带在酶上)、1μl10mM dNTP溶液、各1μl10μM引物溶液(相应于图12的引物组合是:泳道1,63U和锚定引物(药盒附带的);泳道2,63-6和锚定引物;泳道3,63-7和锚定引物)和15μl无菌蒸馏水充分混合制成底层混合物。将1μl预先作为模板制备的第一股cDNA合成溶液、3μl10×EX PCR缓冲液(酶附带的)、0.5μlTaKaRa EX Taq DNA聚合酶(Kakara Shuzo)和25.5μl无菌蒸馏水混合在一起制成顶层混合物。将一份AmpliWax PCR Gem 100加到如此制备的底层混合物中,于70℃将其处理5分钟再于水上放置5分钟,然后向其中加入顶层混合物以制成PCR混合物。
将含有反应混合物的试管固定在热循环仪PJ 2000(PerkinElmer)上,于95℃处理3分钟,于60℃处理2分钟并于75℃处理2分钟。然后,将95℃1分钟,60℃1分钟和75℃1分钟的扩增循环重复30次,再于75℃处理8分钟。
另外使用AmpliWax PRC Gem100(Perkin Elmer)以热启动技术进行二次PCR。将2μl10×EXPCR缓冲液(酶所附带的)、1μl10mM dNTP溶液、各1μl10μM引物溶液(相应于图12的引物组合是:泳道4,63-6和锚定引物;泳道5,63-7和锚定引物;泳道6,63-8和锚定引物)和15μl无菌蒸馏水混合在一起制得底层混合物。将1μl作为模板的初步PCR反应溶液(使用63U和锚定引物进行的初步反应的PCR溶液被用于使用63-6和锚定引物进行的反应;使用63-6和锚定引物进行的初步反应的PCR溶液被用于使用63-7和锚定引物进行的反应;并将使用63-7和锚定引物进行的初步反应的PCR溶液被用于使用63-8和锚定引物进行的反应)、3μl10×EX PCR缓冲液(酶所附带的)、0.5μl TaKaRa EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)和25.5μl无菌蒸馏水混合在一起制得顶层混合物。将1份AmpliWax PCRGem100加到如此制得的底层混合物中,于70℃将其处理5分钟,在冰上放置5分钟,并向其中加入顶层混合物以制成PCR混合物。
将含有反应混合物的试管固定在热循环仪PJ2000(PerkinElmer)上,于95℃处理3分钟,于60℃处理2分钟并于75℃处理2分钟。然后,将95℃1分钟,60℃1分钟和75℃1分钟的扩增循环重复30次,再于75℃处理8分钟。
如图12中所示,在初步PCR中以及使用初步PCR产物为模板进行的二级PCR中出现了多条带。因此,以如上述的同样方法进行Southern杂交分析。结果如图13中所示,测到了约3Kb的带。从各个杂交的部分中回收DNA片段并使用TA克隆药盒(Invitrogen)亚克隆到质粒载体中,然后分析含有3kb PCR产物之克隆的***物核苷酸序列。
使用BcaBEST双脱氧测序药盒(Takara Shuzo)和R.O.B.DNA处理器(Pharmacia)进行测序反应,并使用ALF DNA序列仪II(Pharmacia)进行核苷酸序列分析。
将如此得到的核苷酸序列与作为63A2之小鼠对应物的GIR相比较,从而证实存在一个在序列上很接近于GIR之开放读框的3’末端侧的部分(参见图14)。
实施例2
克隆63A2之编码cDNA的全长度开放读框
基于如实施例1中确定的5’和3’非翻译区部分的序列,合成加有限制性酶SalI位点的下列引物对:
F63U(-30):序列5′-
GGAGTCGACCAGGGGAGGGGTGGCTCCTGCAAA-3′(33mer)(SEQ ID
NO:18)
F63L(1465):序列5′-
CCCGTCGACCCCCTCCCACTCCCTCTTCCCAAC-3′(33mer)(SEQ ID
NO:19)
使用这些引物并以人脑QUICK-Clone cDNA(Clontech)作为模板进行扩增63A2full之全长度开放读框的PCR反应。
使用AmpliWax PCR Gem 100(Perkin Elmer),以热启动技术进行PCR反应。将2μl10×EXPCR缓冲液(酶附带的)、4μl2.5mM dNTP溶液、各0.5μl50μM引物溶液(引物组合是F63U和F63L)及13μl无菌蒸馏水相混合以制成底层混合物。将1l作为模板的总人脑QUICK-Clone cDNA、3l10×EXPCR缓冲液(酶附带的)、0.5μl TaKaRa EX Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及25.5μl无菌蒸馏水相混合以制成顶层混合物。将1份AmpliWaxPCR Gem100加到如此制得的底层混合物上,于75℃将所得混合物处理5分钟后再于冰水上放置5分钟,然后在其上加入顶层混合物以制成反应混合物。
将含有反应混合物的试管固定在热循环仪PJ2000(PerkinElmer)上并于95℃处理3分钟,于63℃处理2分钟,再于75℃处理2分钟。然后,将95℃1分钟、63℃1分钟和75℃2分钟的循环重复进行30次,并进一步于75℃处理8分钟。
反应完成后,使用Seakem GTG(FMC)对一部分(5μl)反应混合物进行1%琼脂糖凝胶电泳以分析扩增产物。如图15中所示,结果测到一条1.34kb大小的带。使用TA克隆药盒(Invitrogen)将此PCR产物亚克隆到质粒载体中,并针对所得到的转化体菌株测定***部分的完整核苷酸序列。所说的菌株被定名为大肠杆菌/p63A2full。
图16和图17中显示了63A2full之开放读框的全长度核苷酸序列和由之推导的氨基酸序列。如图18中所示,还从疏水性作图的结果证实G蛋白偶联受体蛋白质中存在7个特异性的疏水区域。此外,如图19中所示,当与小鼠GIR的序列相比较时,可见人总脑衍生的63A2full的氨基酸序列与之有高达85.8%的同源性。
本发明提供的G蛋白偶联受体蛋白质和编码所说蛋白质的DNA可用于(1)鉴定本发明的G蛋白偶联受体蛋白质的配体,(2)获得抗体和抗血清,(3)构建重组受体蛋白质的表达***,(4)发展受体结合检测***并使用所说的表达***筛选出候选药物化合物,(5)基于同结构上相似的配体和受体的比较设计药物,(6)制备用于基因诊断的探针和PCR引物,以及(7)基因治疗等。具体地说,阐明G蛋白偶联受体蛋白质的结构和特性可导致对作用于这些***之独特药物的开发。序列表(1)一般信息:
(i)申请人:
(A)名称:Takeda Chemical Industries,Ltd.
(B)街道:1-1,Doshomachi4-chome,Chuo-Ku
(C)城市:Osaka
(D)州:Osaka
(D)国家:Japan
(F)邮政编码(ZIP):541
(ii)发明名称:G蛋白偶联受体蛋白质,其生产及应用
(iii)序列数: 19(2)SEQ ID NO:1的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:423
(B)类型:氨基酸
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(iii)序列描述:SEQ ID NO:1:Met Val Pro His Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Pro Leu Val Arg Ala1 5 10 15Thr Glu Pro His Glu Gly Arg Ala Asp Glu Gln Ser Ala Glu Ala Ala
20 25 30Leu Ala Val Pro Asn Ala Ser His Phe Phe Ser Trp Asn Asn Tyr Thr
35 40 45Phe Ser Asp Trp Gln Asn Phe Val Gly Arg Arg Arg Tyr Gly Ala Glu
50 55 60Ser Gln Asn Pro Thr Val Lys Ala Leu Leu Ile Val Ala Tyr Ser Phe65 70 75 80Ile Ile Val Phe Ser Leu Phe Gly Asn Val Leu Val Cys His Val Ile
85 90 95Phe Lys Asn Gln Arg Met His Ser Ala Thr Ser Leu Phe Ile Val Asn
100 105 110Leu Ala Val Ala Asp Ile Met Ile Thr Leu Leu Asn Thr Pro Phe Thr
115 120 125Leu Val Arg Phe Val Asn Ser Thr Trp Ile Phe Gly Lys Gly Met Cys
130 135 140His Val Ser Arg Phe Ala Gln Tyr Cys Ser Leu His Val Ser Ala Leu145 150 155 160Thr Leu Thr Ala Ile Ala Val Asp Arg His Gln Val Ile Met His Pro
165 170 175Leu Lys Pro Arg Ile Ser Ile Thr Lys Gly Val Ile Tyr Ile Ala Val
180 185 190Ile Trp Thr Met Ala Thr Phe Phe Ser Leu Pro His Ala Ile Cys Gln
195 200 205Lys Leu Phe Thr Phe Lys Tyr Ser Glu Asp Ile Val Arg Ser Leu Cys
210 215 220Leu Pro Asp Phe Pro Glu Pro Ala Asp Leu Phe Trp Lys Tyr Leu Asp225 230 235 240Leu Ala Thr Phe Ile Leu Leu Tyr Ile Leu Pro Leu Leu Ile Ile Ser
245 250 255Val Ala Tyr Ala Arg Val Ala Lys Lys Leu Trp Leu Cys Asn Met Ile
260 265 270Gly Asp Val Thr Thr Glu Gln Tyr Phe Ala Leu Arg Arg Lys Lys Lys
275 280 285Lys Thr Ile Lys Met Leu Met Leu Val Val Val Leu Phe Ala Leu Cys
290 295 300Trp Phe Pro Leu Asn Cys Tyr Val Leu Leu Leu Ser Ser Lys Val Ile305 310 315 320Arg Thr Asn Asn Ala Leu Tyr Phe Ala Phe His Trp Phe Ala Met Ser
325 330 335Ser Thr Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Cys Trp Leu Asn Glu Asn Phe
340 345 350Arg Ile Glu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Met Cys Gln Arg Pro Pro Lys
355 360 365Pro Gln Glu Asp Arg Pro Pro Ser Pro Val Pro Ser Phe Arg Val Ala
370 375 380Trp Thr Glu Lys Asn Asp Gly Gln Arg Ala Pro Leu Ala Asn Asn Leu385 390 395 400Leu Pro Thr Ser Gln Leu Gln Ser Gly Lys Thr Asp Leu Ser Ser Val
405 410 415Glu Pro Ile Val Thr Met Ser
420(2)SEQ ID NO:2的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:1272
(B)类型:核酸
(C)链型:双股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)特征
(C)鉴定方法:S
(X)序列描述:SEQ ID NO:2:ATGGTCCCTC ACCTCTTGCT GCTCTGTCTC CTCCCCTTGG TGCGAGCCAC CGAGCCCCAC 60GAGGGCCGGG CCGACGAGCA GAGCGCGGAG GCGGCCCTGG CCGTGCCCAA TGCCTCGCAC 120TTCTTCTCTT GGAACAACTA CACCTTCTCC GACTGGCAGA ACTTTGTGGG CAGGAGGCGC 180TACGGCGCTG AGTCCCAGAA CCCCACGGTG AAAGCCCTGC TCATTGTGGC TTACTCCTTC 240ATCATTGTCT TCTCACTCTT TGGCAACGTC CTGGTCTGTC ATGTCATCTT CAAGAACCAG 300CGAATGCACT CGGCCACCAG CCTCTTCATC GTCAACCTGG CAGTTGCCGA CATAATGATC 360ACGCTGCTCA ACACCCCCTT CACTTTGGTT CGCTTTGTGA ACAGCACATG GATATTTGGG 420AAGGGCATGT GCCATGTCAG CCGCTTTGCC CAGTACTGCT CACTGCACGT CTCAGCACTG 480ACACTGACAG CCATTGCGGT GGATCGCCAC CAGGTCATCA TGCACCCCTT GAAACCCCGG 540ATCTCAATCA CAAAGGGTGT CATCTACATC GCTGTCATCT GGACCATGGC TACGTTCTTT 600TCACTCCCAC ATGCTATCTG CCAGAAATTA TTTACCTTCA AATACAGTGA GGACATTGTG 660CGCTCCCTCT GCCTGCCAGA CTTCCCTGAG CCAGCTGACC TCTTCTGGAA GTACCTGGAC 720TTGGCCACCT TCATCCTGCT CTACATCCTG CCCCTCCTCA TCATCTCTGT GGCCTACGCT 780CGTGTGGCCA AGAAACTGTG GCTGTGTAAT ATGATTGGCG ATGTGACCAC AGAGCAGTAC 840TTTGCCCTGC GGCGCAAAAA GAAGAAGACC ATCAAGATGT TGATGCTGGT GGTAGTCCTC 900TTTGCCCTCT GCTGGTTCCC CCTCAACTGC TACGTCCTCC TCCTGTCCAG CAAGGTCATC 960CGCACCAACA ATGCCCTCTA CTTTGCCTTC CACTGGTTTG CCATGAGCAG CACCTGCTAT 1020AACCCCTTCA TATACTGCTG GCTGAACGAG AACTTCAGGA TTGAGCTAAA GGCATTACTG 1080AGCATGTGTC AAAGACCTCC CAAGCCTCAG GAGGACAGGC CACCCTCCCC AGTTCCTTCC 1140TTCAGGGTGG CCTGGACAGA GAAGAATGAT GGCCAGAGGG CTCCCCTTGC CAATAACCTC 1200CTGCCCACCT CCCAACTCCA GTCTGGGAAG ACAGACCTGT CATCTGTGGA ACCCATTGTG 1260ACGATGAGTT AG 1272(2)SEQ ID NO:3的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:70
(B)类型:氨基酸
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:Val Cys His Val Ile Phe Lys Asn Gln Arg Met His Ser Ala Thr Ser1 5 10 15Leu Phe Ile Val Asn Leu Ala Val Ala Asp Ile Met Ile Thr Leu Leu
20 25 30Asn Thr Pro Phe Thr Leu Val Arg Phe Val Asn Ser Thr Trp Ile Phe
35 40 45Gly Lys Gly Met Cys His Val Ser Arg Phe Ala Gln Tyr Cys Ser Leu
50 55 60His Val Ser Ala Leu Thr65 70(2)SEQ ID NO:4的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:71
(B)类型:氨基酸
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:肽
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4:Glu Pro Ala Asp Leu Phe Trp Lys Asn Leu Asp Leu Pro Thr Phe Ile1 5 10 15Leu Leu Asn Ile Leu Pro Leu Leu Ile Ile Ser Val Ala Tyr Val Arg
20 25 30Val Thr Lys Lys Leu Trp Leu Cys Asn Met Ile Val Asp Val Thr Thr
35 40 45Glu Gln Tyr Phe Ala Leu Arg Pro Lys Lys Lys Lys Thr Ile Lys Met
50 55 60Leu Met Leu Val Val Val Leu65 70(2)SEQ ID NO:5的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:210
(B)类型:核苷酸
(C)链型:双股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)特征
(C)鉴定方法:S
(X)序列描述:SEQ ID NO:5:GTCTGTCATG TCATCTTCAA GAACCAGCGA ATGCACTCGG CCACCAGCCT CTTCATCGTC 60AACCTGGCAG TTGCCGACAT AATGATCACG CTGCTCAACA CCCCCTTCAC TTTGGTTCGC 120TTTGTGAACA GCACATGGAT ATTTGGGAAG GGCATGTGCC ATGTCAGCCG CTTTGCCCAG 180TACTGCTCAC TGCACGTCTC AGCACTGACA 210(2)SEQ ID NO:6的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:213
(B)类型:核苷酸
(C)链型:双股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(xi)特征
(C)鉴定方法:S
(X)序列描述:SEQ ID NO:6:GAGCCAGCTG ACCTCTTCTG GAAGAACCTG GACTTGCCCA CCTTCATCCT GCTCAACATC 60CTGCCCCTCC TCATCATCTC TGTGGCCTAC GTTCGTGTGA CCAAGAAACT GTGGCTGTGT 120AATATGATTG TCGATGTGAC CACAGAGCAG TACTTTGCCC TGCGGCCCAA AAAGAAGAAG 180ACCATCAAGA TGTTGATGCT GGTGGTAGTC CTC 213(2)SEQ ID NO:7的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:25
(B)类型:核酸
(C)链型:双股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:7:
CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG 25(2)SEQ ID NO:8的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:27
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:8:
GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27(2)SEQ ID NO:9的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:25
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:9:
ATATGGGGAT TGGTGGCGAC GACTC 25(2)SEQ ID NO:10的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:25
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:10:
CAACATCAGC CGCTACAGTC AACAG 25(2)SEQ ID NO:11的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:25
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:11:
GCCCGGTTAT TATTATTTTT GACAC 25(2)SEQ ID NO:12的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:25
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:12:
TTCCTTACGC GAAATACGGG CAGAC 25(2)SEQ ID NO:13的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:31
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:13:
CGGCCACCAG CCTCTTCATC GTCAACCTGG C 31(2)SEQ ID NO:14的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:30
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:14:
GGCAACCAGC AGAGGGCAAA GAGGACTACC 30(2)SEQ ID NO:15的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:30
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:15:
TTCATCCTGC TCTACATCCT GCCCCTCCTC 30(2)SEQ ID NO:16的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:30
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:16:
GCCCTGCGGC GCAAAAAGAA GAAGACCATC 30(2)SEQ ID NO:17的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:30
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:17:
GCTGGTGGTA GTCCTCTTTG CCCTCTGCTG 30(2)SEQ ID NO:18的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:33
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:18:
GGAGTCGACC AGGGGAGGGG TGGCTCCTGC AAA 33(2)SEQ ID NO:19的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:33
(B)类型:核酸
(C)链型:单股
(C)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:其他核酸
合成的DNA
(xi)序列描述:SEQ ID NO:19:
CCCGTCGACC CCCTCCCACT CCCTCTTCCC AAC 33
Claims (12)
1.包含由SEQ ID NO:1表示之氨基酸序列的G蛋白偶联受体蛋白质或其实质上的等同物,或其盐。
2.如权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质的部分肽。
3.包含编码如权利要求1中所述G蛋白偶联受体蛋白质或如权利要求2中所述部分肽之核苷酸序列的DNA。
4.如权利要求3中所述的DNA,其包含由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列。
5.包含如权利要求3中所述之DNA的重组载体。
6.携带如权利要求3中所述DNA或如权利要求5中所述重组载体的转化体。
7.生产如权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐的方法,其包括培养如权利要求6中所述的转化体。
8.检测如权利要求1中所述G蛋白偶联受体蛋白质之配体的方法,其包括使(i)如权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或如权利要求2中所述的部分肽或其盐与(ii)待检样品相接触。
9.筛选能够改变如权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的方法,该方法包括对下述两种情况下检测的结果进行比较:(i)至少一种情况是所说的配体与权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或权利要求2中所述的部分肽或其盐接触,以及(ii)至少一种情况是所说的配体与待检样品一起与权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或权利要求2中所述的部分肽或其盐接触。
10.筛选能够改变权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐的药盒,该药盒包含如权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质或其盐,或如权利要求2中所述的部分肽或其盐。
11.能够改变权利要求1中所述的G蛋白偶联受体蛋白质与配体之结合活性的化合物或其盐,该化合物是使用权利要求9中所述的筛选方法或使用权利要求10中所述的筛选药盒得到的。
12.如权利要求1中所述的抗G蛋白偶联受体蛋白质或其盐或权利要求2中所述的部分肽或其盐的抗体。
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