JPH0643440B2 - Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor - Google Patents
Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitorInfo
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- JPH0643440B2 JPH0643440B2 JP60131991A JP13199185A JPH0643440B2 JP H0643440 B2 JPH0643440 B2 JP H0643440B2 JP 60131991 A JP60131991 A JP 60131991A JP 13199185 A JP13199185 A JP 13199185A JP H0643440 B2 JPH0643440 B2 JP H0643440B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ａ．産業上の利用分野 本発明は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対する
選択的吸着体およびその吸着体を用いるヒトα２−プラ
スミンインヒビター含有液体からのヒトα２−プラスミ
ンインヒビターの分離回収法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION a. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is a human alpha 2 - relates plasmin inhibitor separation recovery method of over - selective adsorbent for plasmin inhibitor and a human alpha 2 using the adsorbent - plasmin inhibitor from containing liquid human alpha 2 .
ヒトのα２−プラスミンインヒビターは青木と諸井によ
つて、最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラス
ミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害す
る強力なプラスミンヒビターであり、11.7％の糖を含む
分子量約67,000の一本鎖の糖蛋白質であることが知られ
ている〔Moroi＆Aoki；The Journal of Biological Che
mistry，２５１，５９５６−５９６５（１９７６）参
照〕。The human α 2 -plasmin inhibitor was first isolated and purified by Aoki and Moroi, and is a powerful plasmin inhibitor that instantaneously inhibits the esterase activity of the fibrinolytic enzyme plasmin (11.7%). It is known to be a single-chain glycoprotein with a molecular weight of about 67,000 that contains sugars of [Moroi &Aoki; The Journal of Biological Che
mistry, 251, 5956-5965 (1976)].
一方、ヒトα２−プラスミンインヒビターには、３種類
の活性部位があることが知られている。第１は、プラス
ミンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクテ
イブサイト”ということがある。）〔B.Wiman & D.Coll
en；The Joural of Biological Chemistry，２５４，９
２９１−９２９７（１９７９）参照〕であり、第２はカ
ルボキシル基未満側のプラスミン結合部位〔B.Wiman &
D.Collen；European Journal of Bioehemistry，８４，
５７３−５７８（１９７８）参照〕であり、第３はアミ
ノ基末端のフイブリン結合部位である〔Y.Sakata，eta
l.Thrombosis Rescarch，１６，２７９−２８２（１９
７９）参照〕。On the other hand, the human alpha 2 - the plasmin inhibitor is known that there are three kinds of active sites. The first is the site of plasmin that inhibits the action of fibrinolysis (hereinafter referred to as "reactive site") [B.Wiman & D.Coll.
en ； The Joural of Biological Chemistry, 254, 9
291-9297 (1979)], and the second is a plasmin binding site on the side less than the carboxyl group [B. Wiman &
D. Collen; European Journal of Bioehemistry, 84 ,
573-578 (1978)], and the third is a fibrin binding site at the amino terminal [Y. Sakata, eta.
l.Thrombosis Rescarch, 16 , 279-282 (19)
79)]].
従来、ヒト血漿中からのα２−プラスミンインヒビター
の精製には、このインヒビターのプラスミノーゲンへの
親和性を利用したアフイニテイ−クロマトグラフイーが
用いられている〔Moroi & Aoki；The Journal of Biolo
gical Chemistry，２５１，５９５６−５９６５（１９
７６）参照〕。Affinity-chromatography utilizing the affinity of this inhibitor for plasminogen has been used for the purification of α 2 -plasmin inhibitor from human plasma [Moroi &Aoki; The Journal of Biolo.
gical Chemistry, 251 , 5956-5965 (19
76)].
しかし、この方法は、精製に要するステツプが多く、且
つ時間も長くかかるという欠点があつた。However, this method has drawbacks in that many steps are required for purification and it takes a long time.
一方、α２−プラスミンインヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体をリガンドとして不溶性担体（例えばセフア
ロース）に結合させた吸着体を用いれば、ヒトα２−α
２プラスミンインヒビター含有液体、例えばヒト血漿中
のα２−プラスミンインヒビターを容易に、短時間で分
離または精製することができると考えられる。On the other hand, when an adsorbent in which a monoclonal antibody against α 2 -plasmin inhibitor is bound to an insoluble carrier (eg, sepharose) as a ligand is used, human α 2 -α
It is believed that liquids containing 2 plasmin inhibitors, such as α 2 -plasmin inhibitors in human plasma, can be easily separated or purified in a short time.
ｂ．発明の構成 そこで、本発明者らは、ヒトα２−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体について研究を重ねた
ところ、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用阻止部位（第１の活性部位）
を特異的に認識し、しかして第２及び第３の活性部位を
即ちプラスミン結合部位及びフィブリン結合部位を認識
せず、ヒトα２−プラスミンインヒビターの線維素溶解
阻止作用を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を
見出し、またこのモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を創作し得、既に提案した。b. Therefore, the inventors of the present invention have conducted extensive studies on a monoclonal antibody against human α 2 -plasmin inhibitor, and found that the site of fibrinolytic action of plasmin in human α 2 -plasmin inhibitor (first active site).
Monoclonal antibody having the activity of specifically recognizing, and not recognizing the second and third active sites, ie, the plasmin binding site and the fibrin binding site, and suppressing the fibrinolytic inhibitory action of human α 2 -plasmin inhibitor. We have found an antibody and have been able to create hybridoma cells that produce this monoclonal antibody and have already proposed.
本発明者らは、かくして得られたモノクローナル抗体の
特異的な作用の利用について更に研究を進めた結果、ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを特異的に吸着し得る
吸着体およびそれを用いると、ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビター含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビ
ターを選択的に分離・回収することができることを見出
し本発明に到達した。As a result of further studies on the utilization of the specific action of the monoclonal antibody thus obtained, the present inventors have found that an adsorbent capable of specifically adsorbing human α 2 -plasmin inhibitor and the use of the adsorbent make it possible to use human α The present inventors have found that human α 2 -plasmin inhibitor can be selectively separated and recovered from a liquid containing 2 -plasmin inhibitor and have reached the present invention.
すなわち、本発明はヒトα２−プラスミンインヒビター
におけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に認識して結合し得、且つプラスミン結合部位及びフ
ィブリン結合部位に結合しないヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体またはそのFab
部分を少くとも含有する該モノクローナル抗体の断片を
不溶性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対する選択的吸着体を、ヒトα２−プラス
ミンインヒビターを含有する液体と接触させて、該担体
にヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、
該液体から該担体を分離し、そして必要により該担体か
らヒトα２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴
とするヒトα２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回収方法
である。That is, the present invention is directed to a human α 2 -plasmin inhibitor capable of specifically recognizing and binding a site for inhibiting the fibrinolytic action of plasmin in a human α 2 -plasmin inhibitor, and not binding to a plasmin binding site and a fibrin binding site. Monoclonal antibody or Fab
A selective adsorbent for human α 2 -plasmin inhibitor, in which a fragment of the monoclonal antibody containing at least a portion is immobilized on an insoluble solid carrier, is contacted with a liquid containing human α 2 -plasmin inhibitor to give the carrier. After adsorbing human α 2 -plasmin inhibitor on
The carrier was separated from the liquid, and required by the human alpha 2 from the carrier - plasmin inhibitor was allowed to desorb said human alpha 2 - human alpha 2 and recovering the plasmin inhibitor - from plasmin inhibitor-containing liquid It is a method for separating and collecting the human α 2 -plasmin inhibitor.
一般に、吸着体の生物学的親和力を生体物質の分離・精
製に利用するクロマトグラフイーは、アフイニテイ−ク
ロマトグラフイーと呼ばれている〔例えば、千畑一郎，
土佐哲也，松尾雄志著「実験と応用アフイニテイークロ
マトグラフイー」購談社サイエンテイフイツク参照〕。Generally, chromatographies that utilize the biological affinity of adsorbents for the separation and purification of biological materials are called affinity-chromatography [eg, Ichiro Chibata,
Tetsuya Tosa, Yuji Matsuo, "Experimental and Applied Affinity Chromatography," See Kodansha Scientific Ft.
本発明におけるアフイニテイ−，リガンド，不溶性担
体，吸着体なる語は、それぞれ下記に意味に解するもの
とする。The terms "affinity", "ligand", "insoluble carrier" and "adsorbent" in the present invention are to be understood as follows.
アフイニテイー； ２種物質間に存在する特異的親和力リガンド； 吸着あるいは精製を目的とする物質とアフイニテイーを
有する物質 不溶性固体担体； 水に不溶性の支持体（これにはリガンドは含まれない） 吸着体； リガンドを不溶性固体担体に固定化したもの 次に本発明に用いるヒトα２−プラスミンインヒビター
に対する選択的吸着体およびそれを用いたヒトα２−プ
ラスミンインヒビター含有液体よりヒトα２−プラスミ
ンインヒビターを分離回収する方法について詳細に説明
する。Affinity; Specific affinity ligand existing between two substances; Substance for adsorption or purification and substance having affinity Insoluble solid carrier; Water-insoluble support (this does not include ligand) Adsorbent; human alpha 2 using ligand immobilized shall then present invention to an insoluble solid support - plasmin inhibitor for selective adsorbent and human alpha 2 using the same - plasmin inhibitor human than containing liquid alpha 2 - plasmin inhibitor separated and recovered The method for doing so will be described in detail.
ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体またはそのFab部分を少くとも含有する断片を
適当な不溶性担体（例えばセフアロース）に化学的にリ
ガンドとして結合させ、これをカラムに詰め適当な緩衝
溶液（例えば５０ｍＭトリス緩衝液pH7.4，0.15ＭNaC
l）によつて平衝化する。この吸着体に検体試料（例え
ばヒト血漿）を添加して検体試料中のヒトα２−プラス
ミンインヒビターを吸着させる。次に適当な洗浄溶液
（例えば、５０ｍＭトリス緩衝液，pH7.4，0.15ＭNaC
l）によつて、不純物を吸着体から除去する。最後に吸
着体に存在するα２−プラスミンインヒビターを適当な
溶液（例えば５０％エチレングリコールpH11.5）で吸着
体から溶出させる。溶出面分中のα２−プラスミンイン
ヒビターの抗原量及び活性を測定すれば溶出したα２−
プラスミンインヒビターの割合を算出することができ
る。A monoclonal antibody against human α 2 -plasmin inhibitor or a fragment containing at least the Fab portion thereof is chemically bound to a suitable insoluble carrier (eg, Sepharose) as a ligand, packed into a column, and packed in a suitable buffer solution (eg, 50 mM Tris). Buffer pH 7.4, 0.15M NaC
l) to make it equal. A specimen sample (eg, human plasma) is added to this adsorbent to adsorb the human α 2 -plasmin inhibitor in the specimen sample. Then a suitable wash solution (eg 50 mM Tris buffer, pH 7.4, 0.15 M NaC)
l) remove impurities from the adsorbent. Finally, the α 2 -plasmin inhibitor present in the adsorbent is eluted from the adsorbent with a suitable solution (eg 50% ethylene glycol pH 11.5). If the antigen amount and activity of α 2 -plasmin inhibitor in the eluted fraction were measured, the eluted α 2-
The proportion of plasmin inhibitor can be calculated.
本発明に用いる選択的吸着体に用いられる不溶性固体担
体としては、種々のものが使用できるが、例えば材質と
してアガロース，ポリアクリルアミド，セルロース，デ
キストラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこれらの
混合物が好ましく用いられる。これら不溶性固体担体の
形状としては、粉末状，粒状，ペレツト状，ビーズ状，
フイルム状，繊維状など種々の形態があることができ
る。As the insoluble solid carrier used in the selective adsorbent used in the present invention, various ones can be used, but as the material, for example, agarose, polyacrylamide, cellulose, dextran, maleic acid polymer or a mixture thereof is preferably used. The shapes of these insoluble solid carriers include powder, granules, pellets, beads,
There can be various forms such as a film form and a fiber form.
本発明に用いる吸着体に使用されるヒトα２−プラスミ
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体は、本発明
者らによつて見出され、先に特許出願された（昭和５９
年４月１７日付出願昭５９−７５７７８号；発明の名称
“モノクロ−ナル抗体の製造方法”）。A monoclonal antibody against the human α 2 -plasmin inhibitor used in the adsorbent used in the present invention was found by the present inventors and was previously applied for a patent (Showa 59).
Application No. 59-75778 dated April 17, 1995; title of the invention "Method for producing monoclonal antibody").
本発明の前記モノクロナーナル抗体及びその製造方法に
ついては前記特許出願明細書に詳細に説明されている
が、以下にその内容を簡単に説明する。The above-mentioned monoclonal antibody of the present invention and a method for producing the same are described in detail in the above-mentioned patent application specification, but the content thereof will be briefly described below.
《モノクローナル抗体及びその製造方法》 Ａ．抗原の単離，精製； 抗原に用いるヒトα２−プラスミンインヒビターは、前
記青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。<< Monoclonal antibody and method for producing the same >> A. Isolation and Purification of Antigen; The human α 2 -plasmin inhibitor used for the antigen was isolated and purified from human plasma by the method of Aoki and Moroi.
Ｂ．ヒトα２−プラスミンインヒビターによるマウスの
免疫； 雄Ba1b/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマウ
スを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒト
α２−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに少量のヒトα２−プラスミンイン
ヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回
静脈に投与した。最後免疫の数日後に融合の為に脾臓細
胞を取り出す。B. Human alpha 2 - mice with plasmin inhibitors of immune; using male Balb / c mice, it is also possible to use a mouse of another system (strains). In doing so, the immunization regimen and the concentration of human α 2 -plasmin inhibitor should be chosen so that a sufficient amount of antigen-stimulated lymphocytes are formed. For example, mice were immunized several times intraperitoneally with a small amount of human α 2 -plasmin inhibitor at regular intervals, followed by several additional intravenous doses. A few days after the last immunization, spleen cells are taken out for fusion.
Ｃ．細胞融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。脾臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約２０：１
〜約２：１の範囲である。約１０３個の脾臓細胞につい
て0.5〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。C. Cell fusion The spleen is aseptically removed and a single cell suspension is prepared therefrom. The spleen cells are cell-fused with mouse myeloma cells from the appropriate line by using an appropriate fusion promoter. The preferred ratio of spleen cells to myeloma cells is about 20: 1.
To about 2: 1. The use of 0.5-1.5 ml of fusion medium for about 10 3 spleen cells is suitable.
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られているが、本
発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ag8−U1細胞（以下Ｐ３−Ｕ
１と略記する）〔Yelton,D.E et al.,Current Topics i
n Microbiology and Immunology８１，１（１９７９）
参照〕を用いた。これは８−アザグアニン耐性の細胞ラ
インであり、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（hypoxanthine-guanine-phosp
horibosyl transferase）が欠失しており、それゆえに
ＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）
培地中では生存しない。また、この細胞ラインはそれ自
体抗体を分泌しない、いわゆる非分泌型である。While myeloma cells used for cell fusion are known many, in the present invention, P3-X63-Ag 8 -U1 cells (hereinafter P3-U
1)) [Yelton, DE et al., Current Topics i
n Microbiology and Immunology 81, 1 (1979)
Reference] was used. This is a cell line resistant to 8-azaguanine and contains the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (hypoxanthine-guanine-phospsp).
horibosyl transferase) and therefore HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine)
It does not survive in the medium. Also, this cell line is a so-called non-secretory type, which does not itself secrete antibodies.
好ましい融合促進剤としては、例えば平均分子量が１０
００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使用
できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を使
用することもできる。A preferable fusion promoter has, for example, an average molecular weight of 10
Polyethylene glycol of 0-4000 can be advantageously used, but other coalescing agents known in the art can also be used.
Ｄ．融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用される。この選
択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また未融
合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約
１週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨
髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つ
ために選択培地中で生存できる。D. Selection of fused cells; Unfused spleen cells, unfused myeloma cells and a mixture of fused cells in a separate container (eg microtiter plate) diluted with selective medium that does not support unfused myeloma cells Then, the cells are cultured for a sufficient time (about 1 hour) to kill the unfused cells. The medium is drug resistant (eg 8-
Those which are resistant to azaguanine and which do not support unfused myeloma cells (eg HAT medium as described above) are used. Unfused myeloma cells die in this selective medium. In addition, unfused spleen cells are non-neoplastic cells and die after a certain period of time (about 1 week). The cells fused to these cells can survive in the selective medium because they have both the tumorigenicity of the parental cells of myeloma and the characteristics of the parental spleen cells.
Ｅ．各容器中のα２−プラスミンインヒビターに対する
抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対
する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immu
no Sorbent Assay）によりスクリーニングする。E. Confirmation of antibody against α 2 -plasmin inhibitor in each container; After thus detecting hybridoma cells, the culture supernatant was collected and assayed for antibody against human α 2 -plasmin inhibitor by enzyme linked immunoassay (Enzyme Linked Immu).
No sorbent assay).
Ｆ．目的の抗体を産出するハイブリドーマ細胞のクロー
ン化； 目的の抗体を産出するハイプリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とによりその培養上清から、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、そ
のハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を
得ることができる。F. Cloning of hybridoma cells that produce the antibody of interest; When the hybridoma cells that produce the antibody of interest are cloned by a suitable method (for example, the limiting dilution method), the antibodies are produced by two different methods. According to the first method, by culturing the hybridoma cells in an appropriate medium for a certain period of time, the monoclonal antibody produced by the hybridoma cells can be obtained from the culture supernatant. Second
According to this method, the hybridoma cells can be injected into the abdominal cavity of a mouse having an isogenic gene or a semi-isogenic gene. The monoclonal antibody produced by the hybridoma cells can be obtained from the blood and ascites of the host animal after a certain period of time.
本発明においては、上記の如くして得たモノクローナル
抗体自体を使用することもでき、またそのFab部分を少
くとも含有する該モノクローナル抗体の断片も同様に使
用することができる。In the present invention, the monoclonal antibody itself obtained as described above may be used, or a fragment of the monoclonal antibody containing at least the Fab portion thereof may be used as well.
かゝる断片としては、上記モノクローナル抗体を蛋白分
解酵素であるパパインを用いて切断したFab部分を少く
とも含むものであればよく、その他へプシン，トリプシ
ンまたはプラスミンなどの酵素で分解した後に得られる
Fab部分を少くとも含する断片であつても差支えがな
い。抗体をパパインを用いて分解しFab部分を得ること
に関してはそれ自体ポーターらによつて既に知られてい
る方法である〔R.R.Porter,Biochemical Journal７３，
１１９〜１２６（１９５９）参照〕。Such a fragment may be any fragment as long as it contains at least a Fab portion obtained by cleaving the above-mentioned monoclonal antibody with papain which is a protease, and is obtained after digestion with an enzyme such as hepsin, trypsin or plasmin.
It does not matter even if the fragment contains at least the Fab portion. Decomposing an antibody with papain to obtain the Fab portion is a method already known by Porter et al. [RR Porter, Biochemical Journal 73 ,
119-126 (1959)].
これらの不溶性固体担体へのモノクローナル抗体又はそ
の断片の固定化は、一般に該モノクローナル抗体又は断
片を該不溶性固体担体に化学的に結合することにより行
なわれる。例えば、上記の如く、ヒトα２−プラスミン
インヒビター含有液体との接触によりヒトα２−プラス
ミンインヒビターを吸着した吸着体は、該液体から分離
すれば、該液体中のヒトα２−プラスミンインヒビター
は除去される。これにより、該液体としてヒト血漿又は
ヒト血清を用いた場合には、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビターを実質的に含まないヒト血漿又はヒト血清が得
られ、このようなヒトα２−プラスミンインヒビターを
含まないヒト血漿又はヒト血清は、例えば血漿交換又は
血清交換療法に有利に用いることができる。Immobilization of the monoclonal antibody or fragment thereof on these insoluble solid supports is generally carried out by chemically binding the monoclonal antibody or fragment to the insoluble solid support. For example, as described above, the human alpha 2 - plasmin inhibitor containing human alpha 2 by contact with the liquid - adsorbs plasmin inhibitor was adsorbent, if separated from the liquid, the human in the liquid alpha 2 - plasmin inhibitor removal To be done. Thereby, when human plasma or human serum is used as the liquid, human plasma or human serum substantially free of human α 2 -plasmin inhibitor is obtained, and such human α 2 -plasmin inhibitor is contained. Human plasma or human serum that is not present can be used advantageously for plasmapheresis or serum exchange therapy, for example.
一方、該液体から分離したヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを吸着した吸着体は、脱着処理に付すことによ
り、吸着体からヒトα２−プラスミンインヒビターを溶
離させて、ヒトα２−プラスミンインヒビターを回収す
ることができる。回収されたヒトα２−プラスミンイン
ヒビターは、例えば先天性α２−プラスミンインヒビタ
ー欠損症，肝疾患等に於ける補充剤、或いは止血剤等と
して使用することができる。On the other hand, the adsorbent having adsorbed the human α 2 -plasmin inhibitor separated from the liquid is subjected to desorption treatment to elute the human α 2 -plasmin inhibitor from the adsorbent to recover the human α 2 -plasmin inhibitor. be able to. The collected human α 2 -plasmin inhibitor can be used as, for example, a supplement for congenital α 2 -plasmin inhibitor deficiency, liver disease, or a hemostatic agent.
上記の脱着処理は、ヒトα２−プラスミンインヒビター
を吸着した吸着体を溶離液で処理することにより行なう
ことができる。用いうる溶離液としては、pHが2.5〜12.
5、好ましくは5.0〜11.5のエチレングリコール水溶液が
有利に用いられるが、この他に、グリコール水溶液，グ
リシン水溶液，プロピオン酸水溶液，チオシアン酸塩溶
液，グアニジン水溶液等を使用することもできる。The above-mentioned desorption treatment can be carried out by treating the adsorbent having adsorbed the human α 2 -plasmin inhibitor with an eluent. Eluents that can be used have a pH of 2.5 to 12.
An ethylene glycol aqueous solution of 5, preferably 5.0 to 11.5 is advantageously used, but in addition to this, a glycol aqueous solution, a glycine aqueous solution, a propionic acid aqueous solution, a thiocyanate aqueous solution, a guanidine aqueous solution or the like can be used.
上記エチレングリコール水溶液中のエチレングリコール
の濃度は２０〜８０％、好ましくは４０〜６０％が有利
に用いられる。またこの水溶液にはpHの調整のために適
宜、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の水酸塩，Tr
is塩，リン酸塩，ベロナール塩等の塩類、塩酸，硫酸，
硝酸，酢酸，クエン酸，シユウ酸等の酸類、エタノール
アミン等のアミン類、アンモニア，尿素等を含ませるこ
とができる。脱着処理は、氷点以上３７℃以下でおこな
われ、好ましくは２〜１０℃がより有利に行われる。脱
着処理はカラム法，バツチ法等の方法によりおこない、
溶出に要する時間は短かい事が望ましいが、２日間程要
してもよい。The concentration of ethylene glycol in the ethylene glycol aqueous solution is preferably 20 to 80%, preferably 40 to 60%. In addition, to adjust the pH, this aqueous solution should be appropriately adjusted with sodium hydroxide, potassium hydroxide, or another such hydroxide, Tr.
Salts such as is salt, phosphate, veronal salt, hydrochloric acid, sulfuric acid,
Acids such as nitric acid, acetic acid, citric acid and oxalic acid, amines such as ethanolamine, ammonia, urea and the like can be included. The desorption treatment is performed at a freezing point or higher and 37 ° C. or lower, preferably 2 to 10 ° C. more advantageously. Desorption treatment is performed by a column method, batch method, etc.,
It is desirable that the time required for elution is short, but it may take about 2 days.
脱着されたヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回
収はそれ自体既知の方法、例えば透析，濃縮液体クロマ
トグラフイーなどにより行なうことができる。The desorbed human α 2 -plasmin inhibitor can be separated and recovered by a method known per se, such as dialysis and concentrated liquid chromatography.
以上本発明によればヒトα２−プラスミンインヒビター
含有液体からヒトα２−プラスミンインヒビターを簡単
な手段で短時間に分離・回収することができる。As described above, according to the present invention, human α 2 -plasmin inhibitor can be separated and recovered from a liquid containing human α 2 -plasmin inhibitor in a short time by a simple means.
以下実施例を掲げて本発明を詳述する。The present invention is described in detail below with reference to examples.
実施例１ α２−プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体を
用いたヒト血漿中からのα２−プラスミンインヒビター
の分離及び溶出 α２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナル
抗体をリガンドとして化学的に結合させた吸着体（1.0m
l）をカラムに詰め適当な緩衝液（0.01Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液，0.15ＭNaCl pH7.2）で平衡化後、ヒト血漿
2.0mlを吸着体をつめたカラムに添加した。吸着体に吸
着されずに溶出した画分を集め「素通り画分」とした。
次に上記緩衝液１０mlを添加し、吸着体に非特異的に吸
着（結合）している物質を溶出し、集め、「洗浄画分」
とした。EXAMPLE 1 alpha 2 - plasmin inhibitor for selective adsorber alpha 2 from human plasma using - plasmin inhibitor of separation and elution alpha 2 - adsorber monoclonal antibodies were chemically coupled as ligands for plasmin inhibitor ( 1.0m
l) is packed in a column and equilibrated with an appropriate buffer (0.01 M sodium phosphate buffer, 0.15 M NaCl pH7.2), and then human plasma
2.0 ml was added to the column packed with adsorbent. Fractions that were eluted without being adsorbed by the adsorbent were collected and designated as "pass-through fractions".
Next, 10 ml of the above-mentioned buffer solution is added to elute the substances non-specifically adsorbed (bound) to the adsorbent, and the collected "washed fraction" is collected.
And
最後に適用な溶出液を用いて吸着体に結合したヒトα２
−プラスミンインヒビターを溶出し、「溶出画分」とし
た。Finally human α 2 bound to the adsorbent using the applicable eluent
-The plasmin inhibitor was eluted and designated as the "elution fraction".
溶出後としては、(a)〜(c)３種類用いた。After elution, three types (a) to (c) were used.
(a)５０％，Ｖ／ＶエチレングリコールpH11.5 (b)５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−ＰＢＳpH7.4 (c)５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−ＰＢＳ，0.05
％Tween８０pH7.4 それぞれ溶出が終わるごとに、カラム（吸着体）を再
生，平衡化し、上記と同じ操作でヒトα２−プラスミン
インヒビターを吸着体に結合させ、次の溶出液で溶出
し、これら３種類の溶出液を用いた時の〔溶出画分」中
のα２−プラスミンインヒビターの抗原量を酵素免疫定
量法（ＥＬＩＳＡ）で、α２−プラスミンインヒビター
の活性は、合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸
塩）を用いた残存プラスミン活性の測定により求め、結
果をまとめて表１に示す。尚、上記、酵素免疫定量法
は、ヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモノク
ローナル抗体を用いたサンドイツチ法であり、本発明者
らが先に提案した（昭和５９年５月１日付出願、特願昭
５９−86101号：発明の名称“ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクロマーナル抗体を用いた免疫
学的測定試薬及びキツト”）。(a) 50%, V / V ethylene glycol pH 11.5 (b) 50%, V / V ethylene glycol-PBS pH7.4 (c) 50%, V / V ethylene glycol-PBS, 0.05
% Tween80pH7.4 After each elution, the column (adsorbent) was regenerated and equilibrated, and human α 2 -plasmin inhibitor was bound to the adsorbent by the same procedure as above, and eluted with the next eluate. types of eluate [eluted fraction "in alpha 2 when used - plasmin inhibitor antigen amount of enzyme immunoassay of chromatography in (ELISA), alpha 2 - activity of plasmin inhibitor, synthetic substrate S-2251 (H -D-Varyl-L
-Leucyl-L-lysyl-p-nitroanilide dihydrochloride) was used to measure the residual plasmin activity, and the results are summarized in Table 1. The enzyme immunoassay described above is the Sangerci method using a monoclonal antibody against human α 2 -plasmin inhibitor, which the present inventors have previously proposed (filed on May 1, 1984, Japanese Patent Application No. 59). -86101: Title of the invention "Immunological assay reagent and kit using monoclonal antibody against human α 2 -plasmin inhibitor").
表１に、この測定法を用いて求めた各画分中のα２−プ
ラスミンインヒビター抗原量を、表２には、合成基質を
用いて求めた活性を有するα２−プラスミンインヒビタ
ー量をまとめて示す。Table 1 summarizes the amount of α 2 -plasmin inhibitor antigen in each fraction determined by using this assay method, and Table 2 summarizes the amount of α 2 -plasmin inhibitor having the activity determined by using the synthetic substrate. Show.
これらの結果から、(a)〜(c)の溶出液を吸着体に添加す
ることによつてヒトα２−プラスミンインヒビターを溶
出，精製することができ、特に、溶出液として(c)を用
いた時、ヒト血漿2.0ml中のα２−プラスミンインヒビ
ター126μｇのうち、29.7％に当たる37.4μｇが溶出し
活性を有するα２−ＰＩ量は37.2μｇで、溶出したα２
−プラスミンインヒビターは約１００％活性を有してい
た。From these results, it is possible to elute and purify human α 2 -plasmin inhibitor by adding the eluates (a) to (c) to the adsorbent. In particular, (c) is used as the eluent. when I was, in human plasma 2.0 ml alpha 2 - of the plasmin inhibitor 126μg, α 2 -PI amount having the activity was eluted 37.4μg hitting 29.7% in 37.2Myug, eluted alpha 2
-The plasmin inhibitor had about 100% activity.
実施例２ ヒト血漿中のα２−プラスミンインヒビターの精製 実施例１で記載した吸着体（2.0ml）を詰めたカラムを
使用し、ヒト血漿4.0mlを添加し、同様に洗浄後、溶出
後(c)、すなわち５０％，Ｖ／Ｖエチレングリコール−
ＰＢＳ，0.05％Tween８０pH7.4を用いて、ヒト血漿中よ
りα２−プラスミンインヒビター画分を得た。この画分
を濃縮後、高液液体クロマトグラフイー（東洋遭達
（株）ＨＬＣ−８０３Ｄ）を用いてさらに精製を行なつ
た。0.1Ｍトリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
媒系でα２−プラスミンインヒビターを分離，分取し
た。濃縮し、溶媒を水で置換後凍結乾燥し、70.4μｇの
α２−プラスミンインヒビター精製標品を得た。この標
品の１０％ゲル濃度のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動を行なつた結果、その結果から分子量67,000のα２
−プラスミンインヒビターが精製できたことが確められ
た。 Example 2 Purification of α 2 -plasmin inhibitor in human plasma Using the column packed with the adsorbent (2.0 ml) described in Example 1, 4.0 ml of human plasma was added, and after washing similarly, after elution ( c), ie 50%, V / V ethylene glycol-
The α 2 -plasmin inhibitor fraction was obtained from human plasma using PBS, 0.05% Tween 80 pH 7.4. After this fraction was concentrated, it was further purified using high liquid chromatography (HLC-803D, manufactured by Toyo Jinda Co., Ltd.). The α 2 -plasmin inhibitor was separated and separated in a 0.1 M trifluoroacetic acid-50% acetonitrile solvent system. After concentrating, the solvent was replaced with water and freeze-dried to obtain 70.4 μg of purified α 2 -plasmin inhibitor. This sample was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis at 10% gel concentration, and as a result, α 2 having a molecular weight of 67,000 was obtained.
-It was confirmed that the plasmin inhibitor could be purified.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＡ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 青木 延雄 東京都文京区本郷４−20―２―304─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location // A61K 37/64 ACA 8314-4C C12N 5/20 15/06 (C12P 21/08 C12R 1: 91) (72) Inventor Nobuo Aoki 4-20-2-304 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo
Claims (1)
るプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認
識し、かつプラスミン結合部位及びフィブリン結合部位
のいずれをも認識しない、ヒトα２−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体またはそのＦａｂ部
分を少くとも含有する該モノクローナル抗体の断片を不
溶性固体担体に固定化させたヒトα２−プラスミンイン
ヒビターに対する選択的吸着体を、ヒトα２−プラスミ
ンインヒビターを含有する液体と接触させて、該担体に
ヒトα２−プラスミンインヒビターを吸着させた後、該
液体から該担体を分離し、そして必要により、該担体か
らヒトα２−プラスミンインヒビターを脱着させて該ヒ
トα２−プラスミンインヒビターを回収することを特徴
とするヒトα２−プラスミンインヒビター含有液体から
の該ヒトα２−プラスミンインヒビターの分離回収法。1. A human α 2 -plasmin inhibitor which specifically recognizes a site for inhibiting the fibrinolytic action of plasmin in a human α 2 -plasmin inhibitor and does not recognize either a plasmin binding site or a fibrin binding site. A selective adsorbent for human α 2 -plasmin inhibitor, in which a monoclonal antibody or a fragment of the monoclonal antibody containing at least Fab portion thereof is immobilized on an insoluble solid support, is contacted with a liquid containing human α 2 -plasmin inhibitor. After adsorbing the human α 2 -plasmin inhibitor on the carrier, the carrier is separated from the liquid, and if necessary, the human α 2 -plasmin inhibitor is desorbed to remove the human α 2 -plasmin inhibitor. Human α characterized by recovering the inhibitor A method for separating and recovering the human α 2 -plasmin inhibitor from a liquid containing the 2 -plasmin inhibitor.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (en) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60131991A JPH0643440B2 (en) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61291527A JPS61291527A (en) | 1986-12-22 |
| JPH0643440B2 true JPH0643440B2 (en) | 1994-06-08 |
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| JP60131991A Expired - Fee Related JPH0643440B2 (en) | 1985-06-19 | 1985-06-19 | Method for separating and recovering human α2-plasmin inhibitor |
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|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (en) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | Apparatus fixing device in spaceshuttle |
-
1985
- 1985-06-19 JP JP60131991A patent/JPH0643440B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0455200A (en) * | 1990-06-21 | 1992-02-21 | Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd | Apparatus fixing device in spaceshuttle |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61291527A (en) | 1986-12-22 |
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