JPH06319587A - ヒト抗ｔｎｆ抗体 - Google Patents
ヒト抗ｔｎｆ抗体Info
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- JPH06319587A JPH06319587A JP6058102A JP5810294A JPH06319587A JP H06319587 A JPH06319587 A JP H06319587A JP 6058102 A JP6058102 A JP 6058102A JP 5810294 A JP5810294 A JP 5810294A JP H06319587 A JPH06319587 A JP H06319587A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトＴＮＦαに結合するヒトモノクローナル
抗体（ｍＡｂ）の提供。 【構成】 ＩｇＭおよびＩｇＧイソタイプ両方の自己抗
体を開示する。好適なヒトモノクローナル抗体はＢ５
（Ｆ７８−１Ａ１０−Ｂ５ ｍＡｂ）として識別され、
これは、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、３種の高親
和力中和マウスｍＡｂに匹敵するタイターで組換え型ヒ
トＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）に結合する。これはまた、
細胞表面ＴＮＦαに結合することで、ヒト単球細胞系に
よるＴＮＦα分泌を防止する。
抗体（ｍＡｂ）の提供。 【構成】 ＩｇＭおよびＩｇＧイソタイプ両方の自己抗
体を開示する。好適なヒトモノクローナル抗体はＢ５
（Ｆ７８−１Ａ１０−Ｂ５ ｍＡｂ）として識別され、
これは、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、３種の高親
和力中和マウスｍＡｂに匹敵するタイターで組換え型ヒ
トＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）に結合する。これはまた、
細胞表面ＴＮＦαに結合することで、ヒト単球細胞系に
よるＴＮＦα分泌を防止する。
Description
【０００１】
【発明の背景】本願は、1993年3月5日付で出願した米国
特許出願第08/026,957号の一部継続出願に基づく。
特許出願第08/026,957号の一部継続出願に基づく。
【０００２】
【産業上の利用分野】この開示は、一般的にモノクロー
ナル抗体に関するものであり、特に、ヒト腫瘍壊死因子
（ＴＮＦα）に結合するヒト抗体に関する。
ナル抗体に関するものであり、特に、ヒト腫瘍壊死因子
（ＴＮＦα）に結合するヒト抗体に関する。
【０００３】
【従来の技術】ＴＮＦαは多能性で多面的なサイトカイ
ンである。これは主に活性化されたマクロファージによ
って産生されるが、それの合成および分泌はまた、顆粒
球、扁桃腺Ｂ細胞、Ｂ細胞系、ＮＫ細胞、Ｔ細胞系、主
要な慢性悪性腫瘍Ｂ細胞単離物および末梢血液Ｔ細胞を
用いて観察されてきた。
ンである。これは主に活性化されたマクロファージによ
って産生されるが、それの合成および分泌はまた、顆粒
球、扁桃腺Ｂ細胞、Ｂ細胞系、ＮＫ細胞、Ｔ細胞系、主
要な慢性悪性腫瘍Ｂ細胞単離物および末梢血液Ｔ細胞を
用いて観察されてきた。
【０００４】ＴＮＦαはまた明らかに２つの形態で細胞
表面上に発現し得る。１つは、単球、Ｔ細胞および他の
いくつかの細胞上の、分子量が２６ｋｄの膜内在性型２
トランスメンブラン蛋白質である。もう１つの形態は、
それのレセプタに結合する分泌１７ｋｄ産物である。
表面上に発現し得る。１つは、単球、Ｔ細胞および他の
いくつかの細胞上の、分子量が２６ｋｄの膜内在性型２
トランスメンブラン蛋白質である。もう１つの形態は、
それのレセプタに結合する分泌１７ｋｄ産物である。
【０００５】分泌されるＴＮＦαが示す数多くの作用の
中には、胸腺細胞成長因子、Ｂ細胞成長および成熟因
子、出血性壊死のインビボ発生、体重損失、心臓血管崩
壊および多重器官損傷がある。当然に、これらの後者の
作用は、ＴＮＦαに関する臨床的興味の源である。
中には、胸腺細胞成長因子、Ｂ細胞成長および成熟因
子、出血性壊死のインビボ発生、体重損失、心臓血管崩
壊および多重器官損傷がある。当然に、これらの後者の
作用は、ＴＮＦαに関する臨床的興味の源である。
【０００６】敗血症性ショック並びに炎症病の間に、Ｔ
ＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８の合成およ
び分泌が行われることが報告されてきた。従って、ある
種の個体の免疫系は慢性的にこれらのサイトカイン類に
さらされている。実際、ＴＮＦαに対する低親和力抗体
が報告されている（A. Fomsgaard他「健康なヒトおよび
炎症病およびグラム陰性細菌感染にかかっている患者に
おける腫瘍壊死因子αに対する自己抗体」、Scand. J.
Immunol. 30:219-23、 1989およびK. Bendtzen他「正常
な個体および感染および免疫炎症障害におけるＩＬ−１
αおよびＴＮＦαに対する自己抗体」、Prog. Leukocyt
e. Biol. 10B:447-52、 1990）。しかしながら、これら
の抗ＴＮＦα自己抗体は特異的でない可能性がある（H.
-G. Leusch他「ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットに
よるヒト血清内のＴＮＦα特異的自己抗体を示すことは
失敗に終わった」、J. Immunol. Meth. 139:145-147、 1
991）。
ＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８の合成およ
び分泌が行われることが報告されてきた。従って、ある
種の個体の免疫系は慢性的にこれらのサイトカイン類に
さらされている。実際、ＴＮＦαに対する低親和力抗体
が報告されている（A. Fomsgaard他「健康なヒトおよび
炎症病およびグラム陰性細菌感染にかかっている患者に
おける腫瘍壊死因子αに対する自己抗体」、Scand. J.
Immunol. 30:219-23、 1989およびK. Bendtzen他「正常
な個体および感染および免疫炎症障害におけるＩＬ−１
αおよびＴＮＦαに対する自己抗体」、Prog. Leukocyt
e. Biol. 10B:447-52、 1990）。しかしながら、これら
の抗ＴＮＦα自己抗体は特異的でない可能性がある（H.
-G. Leusch他「ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットに
よるヒト血清内のＴＮＦα特異的自己抗体を示すことは
失敗に終わった」、J. Immunol. Meth. 139:145-147、 1
991）。
【０００７】ヒト血清、並びに他の動物由来の血清が示
す１つの奇妙な特徴は、それがいわゆる多反応性を示す
自然抗体を含有している点である。これらは通常、低親
和力で種々の自己抗原に結合するＩｇＭ抗体である（A.
B. Hartman他「未免疫化成人Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の
器官反応性を示す自己抗体は多反応性を示し、非バイア
スＶｈ遺伝子使用（Non-Biased Vh Gene Usage）を発現
する」、Molec. Immunol. 26:359-70、 1989およびP. Ca
sali他「ＣＤ５＋Ｂリンパ球、多反応性を示す抗体およ
びヒトＢ細胞レパートリー」、Immunol. Today. 10:364
-8、 1989）。従って、ヒトＴＮＦαに対する自己抗体様
反応性は低い親和力であると予測され、そして恐らくは
他のいくつかの抗原と交差反応性も低いものと予測され
得る。
す１つの奇妙な特徴は、それがいわゆる多反応性を示す
自然抗体を含有している点である。これらは通常、低親
和力で種々の自己抗原に結合するＩｇＭ抗体である（A.
B. Hartman他「未免疫化成人Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の
器官反応性を示す自己抗体は多反応性を示し、非バイア
スＶｈ遺伝子使用（Non-Biased Vh Gene Usage）を発現
する」、Molec. Immunol. 26:359-70、 1989およびP. Ca
sali他「ＣＤ５＋Ｂリンパ球、多反応性を示す抗体およ
びヒトＢ細胞レパートリー」、Immunol. Today. 10:364
-8、 1989）。従って、ヒトＴＮＦαに対する自己抗体様
反応性は低い親和力であると予測され、そして恐らくは
他のいくつかの抗原と交差反応性も低いものと予測され
得る。
【０００８】ＩＬ−１αに対する高親和力中和抗体がい
くつか、通常の血清（N. Mae他「ＩＬ−１αに関する高
感度酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおける干渉物質と
して通常のヒト血清内の高親和力抗ＩＬ−１α自己抗体
の同定」、Lymphokine Cytokine and Research 10:(1)6
1-68、 1991）に関してか、或は患者（H. Suzuki他「リ
ウマチ様関節炎にかかった患者の血清内のＩＬ−１αに
対する中和自己抗体の証明」、J. Immunol. 145:2140-
6、 1990）に関して報告された。
くつか、通常の血清（N. Mae他「ＩＬ−１αに関する高
感度酵素結合抗体免疫吸着アッセイにおける干渉物質と
して通常のヒト血清内の高親和力抗ＩＬ−１α自己抗体
の同定」、Lymphokine Cytokine and Research 10:(1)6
1-68、 1991）に関してか、或は患者（H. Suzuki他「リ
ウマチ様関節炎にかかった患者の血清内のＩＬ−１αに
対する中和自己抗体の証明」、J. Immunol. 145:2140-
6、 1990）に関して報告された。
【０００９】これらの考察にも拘らず、我々は、特異的
にＴＮＦαに結合するモノクローナルヒト抗体は有意な
臨床的価値を有していると考えられているがこれらのい
ずれも開示されていないことに気が付いた。従って、Ｔ
ＮＦαに対する単一特異的モノクローナル抗体に対する
必要性が残存していた。
にＴＮＦαに結合するモノクローナルヒト抗体は有意な
臨床的価値を有していると考えられているがこれらのい
ずれも開示されていないことに気が付いた。従って、Ｔ
ＮＦαに対する単一特異的モノクローナル抗体に対する
必要性が残存していた。
【００１０】
【発明の要約】我々は、ヒトおよびマウス両方のＴＮＦ
αに結合するモノクローナルヒト抗体を作り出した。こ
れらの抗体は、ＥＬＩＳＡで試験した時、３種の高親和
力中和（high affinity neutralizing）マウスｍＡｂに
匹敵するタイターで組換え型ヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦ
α）に結合する。最も完全に特徴づけされた抗体はＩｇ
Ｍイソタイプのものであるが、我々はまたＩｇＧイソタ
イプの抗体も調製した。競合結合実験により、この抗体
は、今まで記述されている中和マウスｍＡｂが結合する
それとは異なるｒｈＴＮＦα上のエピトープと結合する
ように見える。特異性に関する分析により、このヒトＩ
ｇＭ自己抗体はヒトおよびマウス両方の組換え型ＴＮＦ
αに結合するが、多反応性を示す自然ＩｇＭ自己抗体が
通常に認識する他の抗原には結合しないことが示されて
いる。ヒトおよびマウス間のＴＮＦα分子に関する高レ
ベルのアミノ酸同一性により、この抗体は、これらの２
つの形態のＴＮＦαが共有する一定のエピトープに対し
て単一特異的であることが示唆されている。
αに結合するモノクローナルヒト抗体を作り出した。こ
れらの抗体は、ＥＬＩＳＡで試験した時、３種の高親和
力中和（high affinity neutralizing）マウスｍＡｂに
匹敵するタイターで組換え型ヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦ
α）に結合する。最も完全に特徴づけされた抗体はＩｇ
Ｍイソタイプのものであるが、我々はまたＩｇＧイソタ
イプの抗体も調製した。競合結合実験により、この抗体
は、今まで記述されている中和マウスｍＡｂが結合する
それとは異なるｒｈＴＮＦα上のエピトープと結合する
ように見える。特異性に関する分析により、このヒトＩ
ｇＭ自己抗体はヒトおよびマウス両方の組換え型ＴＮＦ
αに結合するが、多反応性を示す自然ＩｇＭ自己抗体が
通常に認識する他の抗原には結合しないことが示されて
いる。ヒトおよびマウス間のＴＮＦα分子に関する高レ
ベルのアミノ酸同一性により、この抗体は、これらの２
つの形態のＴＮＦαが共有する一定のエピトープに対し
て単一特異的であることが示唆されている。
【００１１】Ｂ５抗体はまた、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、単
球、ヒト由来の種々のリンパ系および単球子孫の細胞
系、並びに星状細胞腫、乳癌およびメラノーマ上の、細
胞表面ＴＮＦα（ｃｓＴＮＦα）に結合する。この抗体
はまた、チンパンジーリンパ球およびマウスＴリンパ腫
細胞系のｃｓＴＮＦαに結合する。ｃｓＴＮＦαに対す
るこの抗体の結合は特異的である、と言うのは、これ
は、ＴＮＦαで阻害され得るが、ＴＮＦβにも、中和マ
ウス抗−ＴＮＦαｍＡｂにも、またｐ５５ＴＮＦレセプ
タ（ＴＮＦＲ）の組換え型細胞外ドメインにも阻害され
ないからである。このＢ５自己抗体は、ヒト単球様細胞
系ＴＨＰ−１細胞によるＬＰＳ誘発ＴＮＦα分泌を阻害
し得る。
球、ヒト由来の種々のリンパ系および単球子孫の細胞
系、並びに星状細胞腫、乳癌およびメラノーマ上の、細
胞表面ＴＮＦα（ｃｓＴＮＦα）に結合する。この抗体
はまた、チンパンジーリンパ球およびマウスＴリンパ腫
細胞系のｃｓＴＮＦαに結合する。ｃｓＴＮＦαに対す
るこの抗体の結合は特異的である、と言うのは、これ
は、ＴＮＦαで阻害され得るが、ＴＮＦβにも、中和マ
ウス抗−ＴＮＦαｍＡｂにも、またｐ５５ＴＮＦレセプ
タ（ＴＮＦＲ）の組換え型細胞外ドメインにも阻害され
ないからである。このＢ５自己抗体は、ヒト単球様細胞
系ＴＨＰ−１細胞によるＬＰＳ誘発ＴＮＦα分泌を阻害
し得る。
【００１２】いくつかのモノクローナルマウス抗ヒトＴ
ＮＦα抗体が文献の中に記述されている。しかしなが
ら、これらのいずれもマウスＴＮＦαに結合しない。
ＮＦα抗体が文献の中に記述されている。しかしなが
ら、これらのいずれもマウスＴＮＦαに結合しない。
【００１３】このＢ５が示す特異性、自己抗体性質、細
胞表面ＴＮＦαに対する結合、並びにＴＮＦα分泌を阻
害する能力から、このＢ５は新規なｍＡｂである。
胞表面ＴＮＦαに対する結合、並びにＴＮＦα分泌を阻
害する能力から、このＢ５は新規なｍＡｂである。
【００１４】これらの抗体の特徴およびそれらの製造方
法を以下に記述する。
法を以下に記述する。
【００１５】
【発明の詳細な記述】材料および方法 試薬 Bayer A.G.、 Wuppertal、 GermanyがｒｈＴＮＦαを供給
した。ｒｍＴＮＦαおよびｒｈＬＴをGenzymeから購入
した。ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントをChemiconから購
入した。インシュリンをNovo Nordisk Labsから購入
し、そしてＥＬＩＳＡで用いた他の全ての抗原をSigma
から購入した。黄色ブドウ球菌(Staph. aureus)Cowan株
をCalbiochem（San Diego、 CA）から購入した。抗ヒト
ＩｇＤ−デキストラン接合体を個人的な給源から入手し
た。ホルボールミリスチン酸、マウスＩｇＧ1、ブドウ
球菌のエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）およびフィトヘム
アグルチニン（ＰＨＡ）をSigmaから購入した。大腸菌
のＬＰＳを個人的給源から入手した。異なるウシ胎児血
清（ＦＢＳ）をHycloneから購入した。
した。ｒｍＴＮＦαおよびｒｈＬＴをGenzymeから購入
した。ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントをChemiconから購
入した。インシュリンをNovo Nordisk Labsから購入
し、そしてＥＬＩＳＡで用いた他の全ての抗原をSigma
から購入した。黄色ブドウ球菌(Staph. aureus)Cowan株
をCalbiochem（San Diego、 CA）から購入した。抗ヒト
ＩｇＤ−デキストラン接合体を個人的な給源から入手し
た。ホルボールミリスチン酸、マウスＩｇＧ1、ブドウ
球菌のエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）およびフィトヘム
アグルチニン（ＰＨＡ）をSigmaから購入した。大腸菌
のＬＰＳを個人的給源から入手した。異なるウシ胎児血
清（ＦＢＳ）をHycloneから購入した。
【００１６】Genetic Systems Corporationから入手し
た、８Ｂ９ ＥＢＶで形質転換したヒトＢ細胞系以外、
表２に挙げる細胞系は全てAmerican Type Culture Coll
ection（ＡＴＣＣ）から購入した。
た、８Ｂ９ ＥＢＶで形質転換したヒトＢ細胞系以外、
表２に挙げる細胞系は全てAmerican Type Culture Coll
ection（ＡＴＣＣ）から購入した。
【００１７】標準技術、簡単に言えば、５０ｍＭのＮａ
ＨＣＯ3（ｐＨ８．５）の中に溶解させたＴＮＦにビオ
チンのＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを１５分
間加え、ＮＨ4Ｃｌでクエンチした後、透析して未反応
のビオチンを除去することにより、ＴＮＦのビオチニル
化を行った。
ＨＣＯ3（ｐＨ８．５）の中に溶解させたＴＮＦにビオ
チンのＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを１５分
間加え、ＮＨ4Ｃｌでクエンチした後、透析して未反応
のビオチンを除去することにより、ＴＮＦのビオチニル
化を行った。
【００１８】マウスＡ１０Ｇ１０抗ＴＮＦα ＩｇＧ1
ｍＡｂは、Chiron Corporationとの共同で生じさせ、そ
してハイブリドーマ細胞系２−２−３Ｅ３として識別す
るＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ ９７３６を有する。
ｍＡｂは、Chiron Corporationとの共同で生じさせ、そ
してハイブリドーマ細胞系２−２−３Ｅ３として識別す
るＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ ９７３６を有する。
【００１９】Ａ６およびＢ６マウスＩｇＧ1 ｍＡｂを、
我々の実験室で高度免疫化させたマウスから生じさせ
た。３種のマウスｍＡｂは全て、ＴＮＦ細胞毒性を中和
し、そしてこれらはGalloway他「モノクローナル抗腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）抗体はＴＮＦ細胞毒性からマウスお
よびヒト細胞を保護する」、J. Immunol. Meth. 140:37
-43、(1991）（引用することによって本明細書に組み入
れられる）の中に記述されている。アフィニティークロ
マトグラフィーを用いてこれらのｍＡｂの精製を行っ
た。
我々の実験室で高度免疫化させたマウスから生じさせ
た。３種のマウスｍＡｂは全て、ＴＮＦ細胞毒性を中和
し、そしてこれらはGalloway他「モノクローナル抗腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）抗体はＴＮＦ細胞毒性からマウスお
よびヒト細胞を保護する」、J. Immunol. Meth. 140:37
-43、(1991）（引用することによって本明細書に組み入
れられる）の中に記述されている。アフィニティークロ
マトグラフィーを用いてこれらのｍＡｂの精製を行っ
た。
【００２０】多反応性を示す（polyreactive）ＩｇＭ
ｍＡｂである１Ａ６Ｂ５ＦおよびＦ２．２．３４は、Ka
saian他「天然抗体を産生する新規なヒト表面ＣＤ５−
Ｂリンパ球サブセットの同定および分析」、J. Immuno
l. 148:2690-702 (1992）によって作り出されそして特
徴づけされた。７Ｔ１ヒトＩｇＭであるｍＡｂは個人的
給源によって作り出され、そして腹水内に入れて提供さ
れた。
ｍＡｂである１Ａ６Ｂ５ＦおよびＦ２．２．３４は、Ka
saian他「天然抗体を産生する新規なヒト表面ＣＤ５−
Ｂリンパ球サブセットの同定および分析」、J. Immuno
l. 148:2690-702 (1992）によって作り出されそして特
徴づけされた。７Ｔ１ヒトＩｇＭであるｍＡｂは個人的
給源によって作り出され、そして腹水内に入れて提供さ
れた。
【００２１】ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １８６９で示さ
れる、６Ｆ１１−Ｅ４（６Ｆ１１）ＥＢＶで形質転換し
たＢ細胞リンパ芽球（lymphoblastoid）系は、ヒト抗Fi
sher型２のシュードモナスＬＰＳ特異的ＩｇＭ抗体を産
生し、これをGenetic Systems Corporationから購入し
た。この細胞系由来のモノクローナル抗体を我々の実験
室内で作り出した。これは、ヒト抗ｒｈＴＮＦα ｍＡ
ｂのためのイソタイプに対抗する対照ｍＡｂとして働
く。このＣ７Ｆ７ ｍＡｂは、Genentech Inc.と共同し
て開発したマウスＩｇＧ1抗ｈＦＶＩＩＩであり、これ
を、マウス抗ｒｈＴＮＦα ｍＡｂのためのイソタイプ
に対抗する対照ｍＡｂとして用いる。
れる、６Ｆ１１−Ｅ４（６Ｆ１１）ＥＢＶで形質転換し
たＢ細胞リンパ芽球（lymphoblastoid）系は、ヒト抗Fi
sher型２のシュードモナスＬＰＳ特異的ＩｇＭ抗体を産
生し、これをGenetic Systems Corporationから購入し
た。この細胞系由来のモノクローナル抗体を我々の実験
室内で作り出した。これは、ヒト抗ｒｈＴＮＦα ｍＡ
ｂのためのイソタイプに対抗する対照ｍＡｂとして働
く。このＣ７Ｆ７ ｍＡｂは、Genentech Inc.と共同し
て開発したマウスＩｇＧ1抗ｈＦＶＩＩＩであり、これ
を、マウス抗ｒｈＴＮＦα ｍＡｂのためのイソタイプ
に対抗する対照ｍＡｂとして用いる。
【００２２】ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチニル化ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧをJackson Labsから購入した。ビオチニ
ル化ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチニル化マウス抗ヒ
トＩｇＭをZymedから購入した。アビジン連成ＨＲＰお
よびアビジン連成アルカリ性ホスファターゼをZymedか
ら購入した。
ギ抗ヒトＩｇＧをJackson Labsから購入した。ビオチニ
ル化ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチニル化マウス抗ヒ
トＩｇＭをZymedから購入した。アビジン連成ＨＲＰお
よびアビジン連成アルカリ性ホスファターゼをZymedか
ら購入した。
【００２３】藻紅素接合抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９抗体
をDakopattsから購入した。藻紅素接合抗ＬｅｕＭ３をB
ecton Dickinsonから購入した。フルオレセイン（Ｆ
Ｌ）接合Ｆ（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭ、ＦＬ−Ｆ（ａ
ｂ）’2抗ヒトＩｇＧおよびＦＬ−Ｆ（ａｂ）’2抗マウ
スＩｇＧ抗体をCappelから購入した。
をDakopattsから購入した。藻紅素接合抗ＬｅｕＭ３をB
ecton Dickinsonから購入した。フルオレセイン（Ｆ
Ｌ）接合Ｆ（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭ、ＦＬ−Ｆ（ａ
ｂ）’2抗ヒトＩｇＧおよびＦＬ−Ｆ（ａｂ）’2抗マウ
スＩｇＧ抗体をCappelから購入した。
【００２４】ＥＬＩＳＡ 炭酸塩／重炭酸塩緩衝液内か、或はＢＳＡが２０ｕｇ／
ｍＬ入っているＰＢＳ内で、４℃で一晩か或は３７℃で
３時間、抗原もしくは捕捉用抗体（抗免疫グロブリン抗
体）をプラスチック製プレートにコートさせた。４℃で
一晩か或は室温で２時間内の第二インキュベーションを
実施した。二次抗体をビオチニル化した後、アビジン連
成ＨＲＰとアビジン連成アルカリ性ホスファターゼを用
いて、それらの結合を確認した。
ｍＬ入っているＰＢＳ内で、４℃で一晩か或は３７℃で
３時間、抗原もしくは捕捉用抗体（抗免疫グロブリン抗
体）をプラスチック製プレートにコートさせた。４℃で
一晩か或は室温で２時間内の第二インキュベーションを
実施した。二次抗体をビオチニル化した後、アビジン連
成ＨＲＰとアビジン連成アルカリ性ホスファターゼを用
いて、それらの結合を確認した。
【００２５】
【特定態様】ハイブリドーマの創製 マウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３非分泌型ミエローマと
融合させることによって、ヒトＩｇＭ ｍＡｂを作り出
した。ＣＭＶ陽性を示すドナー由来の末梢血液単核細胞
を、Ficoll遠心分離で分離させ、Ｌ−ロイシルロイシン
メチルエステルで処理し、抗原と一緒にインビトロでイ
ンキュベートした後、ＥＢＶを用いた形質転換を行っ
た。形質転換体を制限濃度で分布させ、そしてＴＮＦに
結合する抗体を産生する細胞を融合させた後、サブクロ
ーニングを行った。Ｂ５ハイブリドーマを最小で５回サ
ブクローン化した後、寄託番号ＣＲＬ １１３０６とし
て1993年3月24日付けでＡＴＣＣに寄託した。インビト
ロで免疫化したヒト扁桃細胞の融合で、Ｈ５および７Ｔ
１ ｍＡｂを作り出した。次の実験で用いる目的で、モ
ノクローナルヒトＩｇＭ抗体を標準技術でアフィニティ
ー精製した。
融合させることによって、ヒトＩｇＭ ｍＡｂを作り出
した。ＣＭＶ陽性を示すドナー由来の末梢血液単核細胞
を、Ficoll遠心分離で分離させ、Ｌ−ロイシルロイシン
メチルエステルで処理し、抗原と一緒にインビトロでイ
ンキュベートした後、ＥＢＶを用いた形質転換を行っ
た。形質転換体を制限濃度で分布させ、そしてＴＮＦに
結合する抗体を産生する細胞を融合させた後、サブクロ
ーニングを行った。Ｂ５ハイブリドーマを最小で５回サ
ブクローン化した後、寄託番号ＣＲＬ １１３０６とし
て1993年3月24日付けでＡＴＣＣに寄託した。インビト
ロで免疫化したヒト扁桃細胞の融合で、Ｈ５および７Ｔ
１ ｍＡｂを作り出した。次の実験で用いる目的で、モ
ノクローナルヒトＩｇＭ抗体を標準技術でアフィニティ
ー精製した。
【００２６】細胞毒性アッセイ 種々のｍＡｂが示すＴＮＦ中和能力を評価する目的で、
Galloway他（上に引用）が記述したアッセイを用い、以
下に示す若干の修飾を行った。簡単に言えば、２０ｐｇ
／ｍＬのＴＮＦを６０，０００個のＷＥＨＩ １６４細
胞および試験ｍＡｂと一緒に一晩インキュベートした。
次に、結晶バイオレット染色を行いそして５７０ｎｍに
おける光学密度を読み取ることによって、生存力のある
細胞を検出した。
Galloway他（上に引用）が記述したアッセイを用い、以
下に示す若干の修飾を行った。簡単に言えば、２０ｐｇ
／ｍＬのＴＮＦを６０，０００個のＷＥＨＩ １６４細
胞および試験ｍＡｂと一緒に一晩インキュベートした。
次に、結晶バイオレット染色を行いそして５７０ｎｍに
おける光学密度を読み取ることによって、生存力のある
細胞を検出した。
【００２７】ウエスタンブロッティング １２％のポリアクリルアミドゲルを用い、βメルカプト
エタノールおよびＳＤＳ存在下、組換え型ｈｕＴＮＦα
（１００ｕｇ／ｍＬと１００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡ）およ
び組換え型ｍＴＮＦα（５ｕｇ／ｍＬと１００ｕｇ／ｍ
ＬのＢＳＡ）を電気泳動させた。次に、蛋白質をニトロ
セルロースに電気転移させた後、これをＢＳＡでブロッ
クした。試験ｍＡｂを結合させた後、ビオチニル化した
抗免疫グロブリン試薬を用いて検出を行った。次に、ス
トレプトアビジン−ＨＲＰに続いて基質を添加した。
エタノールおよびＳＤＳ存在下、組換え型ｈｕＴＮＦα
（１００ｕｇ／ｍＬと１００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡ）およ
び組換え型ｍＴＮＦα（５ｕｇ／ｍＬと１００ｕｇ／ｍ
ＬのＢＳＡ）を電気泳動させた。次に、蛋白質をニトロ
セルロースに電気転移させた後、これをＢＳＡでブロッ
クした。試験ｍＡｂを結合させた後、ビオチニル化した
抗免疫グロブリン試薬を用いて検出を行った。次に、ス
トレプトアビジン−ＨＲＰに続いて基質を添加した。
【００２８】蛍光分析 ＦＢＳを１％そしてアジ化ナトリウムを０．０２％含ん
でいるＰＢＳに入っている通常２．５−４０ｕｇ／ｍＬ
から成る最適濃度の一次抗体で、百万個の細胞を４℃で
１／２時間染色した。同様な緩衝液を用い同様な時間で
細胞を２回洗浄した後、最適濃度の蛍光二次抗体を加え
た。洗浄した後、２％のパラホルムアルデヒド溶液で細
胞を固定した。次に、FACSCAN（装置の名前）を用いて
細胞の蛍光を分析した。
でいるＰＢＳに入っている通常２．５−４０ｕｇ／ｍＬ
から成る最適濃度の一次抗体で、百万個の細胞を４℃で
１／２時間染色した。同様な緩衝液を用い同様な時間で
細胞を２回洗浄した後、最適濃度の蛍光二次抗体を加え
た。洗浄した後、２％のパラホルムアルデヒド溶液で細
胞を固定した。次に、FACSCAN（装置の名前）を用いて
細胞の蛍光を分析した。
【００２９】ＴＮＦα分泌のＬＰＳ刺激の阻害 １ｍＬ当たり百万個のＴＨＰ−１細胞を１ｕｇ／ｍＬの
大腸菌ＬＰＳと一緒に、４０ｕｇ／ｍＬのヒトＩｇＭ抗
体の存在有り無しで４時間インキュベートした。上澄み
液を収穫し、遠心分離し、濾過した後、上述したＷＥＨ
Ｉ １６４アッセイでＴＮＦα細胞毒性に関するアッセ
イを行った。上澄み液を滴定し、そして上澄み液希釈度
に対して生存力をプロットした。これらの曲線を、ｒｈ
ｕＴＮＦαを用いた標準曲線と比較することにより、こ
れらの細胞が産生するＴＮＦαの実際濃度を決定した。
大腸菌ＬＰＳと一緒に、４０ｕｇ／ｍＬのヒトＩｇＭ抗
体の存在有り無しで４時間インキュベートした。上澄み
液を収穫し、遠心分離し、濾過した後、上述したＷＥＨ
Ｉ １６４アッセイでＴＮＦα細胞毒性に関するアッセ
イを行った。上澄み液を滴定し、そして上澄み液希釈度
に対して生存力をプロットした。これらの曲線を、ｒｈ
ｕＴＮＦαを用いた標準曲線と比較することにより、こ
れらの細胞が産生するＴＮＦαの実際濃度を決定した。
【００３０】結果 モノクローナルヒトＩｇＭ抗体Ｂ５は固相組換え型ヒト
ＴＮＦ（ｒｈＴＮＦα）に結合する。モノクローナル抗
ｒｈＴＮＦα抗体を分泌するいくつかハイブリドーマを
我々の実験室内で樹立した。終点タイター分析を行っ
て、６種のヒトＩｇＭ ｍＡｂと３種のヒトＩｇＧ ｍＡ
ｂから成る一団を、３種の高親和力中和マウスｍＡｂで
あるＡ１０Ｇ１０、Ａ６およびＢ６と比較した。ＥＬＩ
ＳＡプレートにｒｈＴＮＦαを２ｕｇ／ｍＬになるよう
にコートさせた。これらの指示したｍＡｂを滴定濃度で
加えた後、結合を分光光度測定で評価した。検出可能な
ｒｈＴＮＦα結合を生じる最小ｍＡｂ濃度を示す。Ｂ５
およびＦ１２（Ｆ８０−１Ｂ９−Ｆ１２）は、この基準
で最良のヒトＩｇＭ ｍＡｂの２つであり、これらは、
サブナノグラム／ｍＬ範囲の終点タイターを示してい
る。以下の表１にこのデータを示す。
ＴＮＦ（ｒｈＴＮＦα）に結合する。モノクローナル抗
ｒｈＴＮＦα抗体を分泌するいくつかハイブリドーマを
我々の実験室内で樹立した。終点タイター分析を行っ
て、６種のヒトＩｇＭ ｍＡｂと３種のヒトＩｇＧ ｍＡ
ｂから成る一団を、３種の高親和力中和マウスｍＡｂで
あるＡ１０Ｇ１０、Ａ６およびＢ６と比較した。ＥＬＩ
ＳＡプレートにｒｈＴＮＦαを２ｕｇ／ｍＬになるよう
にコートさせた。これらの指示したｍＡｂを滴定濃度で
加えた後、結合を分光光度測定で評価した。検出可能な
ｒｈＴＮＦα結合を生じる最小ｍＡｂ濃度を示す。Ｂ５
およびＦ１２（Ｆ８０−１Ｂ９−Ｆ１２）は、この基準
で最良のヒトＩｇＭ ｍＡｂの２つであり、これらは、
サブナノグラム／ｍＬ範囲の終点タイターを示してい
る。以下の表１にこのデータを示す。
【００３１】 表１ いくつかのモノクローナルヒト抗体をｒｈＴＮＦαに結合させる、 固相ＥＬＩＳＡフォーマットの比較ｍＡｂ 終点タイター（ｎｇ／ｍＬ） Ｉｇの種類 Al-G10 0.6 マウスIgG A6 0.15 マウスIgG B6 0.08 マウスIgG F78-1A10-A1 0.3 ヒト IgM F78-1A10-B5 0.6 ヒト IgM F80-1B9-F12(ATCC HB 11343) 0.15 ヒト IgM F81-4E3-D6 9.8 ヒト IgM F83-1D6-B6 625.0 ヒト IgM D83-1D6-F6 1250.0 ヒト IgM F83-1A7-G7 0.76 ヒト IgG F83-1G12-C1 1.5 ヒト IgG F83-4D3-D8 0.38 ヒト IgG F83-8D5-F10 0.76 ヒト IgG F84-6G9-D6 1563.0 ヒト IgG ＩｇＭ抗ＴＮＦα ｍＡｂとＩｇＧ抗ＴＮＦα ｍＡｂに
関する範囲および終点タイターは類似していることを特
記する。
関する範囲および終点タイターは類似していることを特
記する。
【００３２】図１は、ヒトＢ５とマウスＡ１０Ｇ１０
ｍＡｂに関する更に拡大させた比較を表している。両方
のｍＡｂが示す結合は、ＴＮＦコーティング濃度に関係
なく濃度依存である。高いＴＮＦコーティング濃度を用
いた場合、Ｂ５ ｍＡｂはＡ１０Ｇ１０よりも若干良好
な結合を示した。しかしながら、このＴＮＦコーティン
グ濃度を低くするにつれて、Ｂ５の結合はＡ１０Ｇ１０
よりも急速に低下した。このことは、ｒｈＴＮＦαに関
する親和力はＢ５の方がＡ１０Ｇ１０よりも低いことと
一致している。これらのデータは、このＢ５ ｍＡｂが
固相ｒｈＴＮＦαに結合することを示している。
ｍＡｂに関する更に拡大させた比較を表している。両方
のｍＡｂが示す結合は、ＴＮＦコーティング濃度に関係
なく濃度依存である。高いＴＮＦコーティング濃度を用
いた場合、Ｂ５ ｍＡｂはＡ１０Ｇ１０よりも若干良好
な結合を示した。しかしながら、このＴＮＦコーティン
グ濃度を低くするにつれて、Ｂ５の結合はＡ１０Ｇ１０
よりも急速に低下した。このことは、ｒｈＴＮＦαに関
する親和力はＢ５の方がＡ１０Ｇ１０よりも低いことと
一致している。これらのデータは、このＢ５ ｍＡｂが
固相ｒｈＴＮＦαに結合することを示している。
【００３３】Ｂ５ ｍＡｂは、３種のマウス抗ＴＮＦ ｍ
Ａｂが結合するのとは異なる、ｒｈＴＮＦα上のエピト
ープに結合する。競合結合実験により、Ａ１０Ｇ１０と
Ｂ６はｒｈＴＮＦα上の同様なエピトープを認識する一
方、Ａ６は異なるエピトープを認識することが示された
（データは示していない）。Ｂ５が示すエピトープ結合
特異性を試験する目的で、マウスｍＡｂ類とＢ５を用い
て競合結合実験を行った。
Ａｂが結合するのとは異なる、ｒｈＴＮＦα上のエピト
ープに結合する。競合結合実験により、Ａ１０Ｇ１０と
Ｂ６はｒｈＴＮＦα上の同様なエピトープを認識する一
方、Ａ６は異なるエピトープを認識することが示された
（データは示していない）。Ｂ５が示すエピトープ結合
特異性を試験する目的で、マウスｍＡｂ類とＢ５を用い
て競合結合実験を行った。
【００３４】ＴＮＦαで予めコートしたＥＬＩＳＡプレ
ートに、これらのマウスｍＡｂを異なる濃度で添加し
た。次に、Ｂ５ ｍＡｂを最適濃度で添加した後、ビオ
チニル化した抗ヒトＩｇＭを用いて結合を検出した。も
しこれらのマウスｍＡｂがＢ５ｍＡｂと同じエピトープ
を認識するとしたならば、これらは、濃度依存様式でＢ
５ ｍＡｂの結合を阻害すべきである。
ートに、これらのマウスｍＡｂを異なる濃度で添加し
た。次に、Ｂ５ ｍＡｂを最適濃度で添加した後、ビオ
チニル化した抗ヒトＩｇＭを用いて結合を検出した。も
しこれらのマウスｍＡｂがＢ５ｍＡｂと同じエピトープ
を認識するとしたならば、これらは、濃度依存様式でＢ
５ ｍＡｂの結合を阻害すべきである。
【００３５】図２の（Ａ）に示すように、プレートに結
合させたｒｈＴＮＦαに対してマウスｍＡｂが示す結合
は濃度依存である。図２の（Ｂ）は、これらのマウスｍ
Ａｂのいずれも、このプレートに最大の結合を生じさせ
るに必要とされる量よりも有意に高いマウスｍＡｂ濃度
でさえも、固定量のＢ５ ｍＡｂがｒｈＴＮＦαに結合
するのを妨害しないことを示している。これらのデータ
は、Ｂ５は、Ａ１０Ｇ１０、Ａ６およびＢ６が認識する
ものとは異なるｒｈＴＮＦα上エピトープを認識するこ
とを示唆している。
合させたｒｈＴＮＦαに対してマウスｍＡｂが示す結合
は濃度依存である。図２の（Ｂ）は、これらのマウスｍ
Ａｂのいずれも、このプレートに最大の結合を生じさせ
るに必要とされる量よりも有意に高いマウスｍＡｂ濃度
でさえも、固定量のＢ５ ｍＡｂがｒｈＴＮＦαに結合
するのを妨害しないことを示している。これらのデータ
は、Ｂ５は、Ａ１０Ｇ１０、Ａ６およびＢ６が認識する
ものとは異なるｒｈＴＮＦα上エピトープを認識するこ
とを示唆している。
【００３６】この発見を支持する目的で、Ａ１０Ｇ１０
とＢ６とＡ６のｍＡｂ組み合わせを予めコートしたＥＬ
ＩＳＡプレートにｒｈＴＮＦαを加えた。次に、Ｂ５
ｍＡｂを加えることで、これが、それらのマウスｍＡｂ
と複合体形成しているか或はそれらに捕捉されているｒ
ｈＴＮＦαに結合するか否かを試験した。
とＢ６とＡ６のｍＡｂ組み合わせを予めコートしたＥＬ
ＩＳＡプレートにｒｈＴＮＦαを加えた。次に、Ｂ５
ｍＡｂを加えることで、これが、それらのマウスｍＡｂ
と複合体形成しているか或はそれらに捕捉されているｒ
ｈＴＮＦαに結合するか否かを試験した。
【００３７】図３は、マウスｍＡｂ類と複合体形成して
いるｒｈＴＮＦαに、Ｂ５および他の全てのヒトＩｇＭ
ｍＡｂ（７Ｔ１を除く）が結合することを示してい
る。ｒｈＴＮＦαが存在していない場合、これらのヒト
ｍＡｂの結合は見られず、このことは、ｒｈＴＮＦαが
有するある種のエピトープに関する特異性を示してい
る。複合体形成したＴＮＦに７Ｔ１ ｍＡｂが結合する
ことができないのは、単にその親和力が低いことによる
ものであろう。これらの結果は、ヒトＩｇＭ ｍＡｂで
あるＢ５、Ｆ１２、Ａ１、Ｂ６およびＤ６と、該３種の
マウスｍＡｂは、ｒｈＴＮＦα上の異なるエピトープを
認識することの結論を支持している。
いるｒｈＴＮＦαに、Ｂ５および他の全てのヒトＩｇＭ
ｍＡｂ（７Ｔ１を除く）が結合することを示してい
る。ｒｈＴＮＦαが存在していない場合、これらのヒト
ｍＡｂの結合は見られず、このことは、ｒｈＴＮＦαが
有するある種のエピトープに関する特異性を示してい
る。複合体形成したＴＮＦに７Ｔ１ ｍＡｂが結合する
ことができないのは、単にその親和力が低いことによる
ものであろう。これらの結果は、ヒトＩｇＭ ｍＡｂで
あるＢ５、Ｆ１２、Ａ１、Ｂ６およびＤ６と、該３種の
マウスｍＡｂは、ｒｈＴＮＦα上の異なるエピトープを
認識することの結論を支持している。
【００３８】Ｂ５ ｍＡｂは多反応性を示さない。Ｂ５
ｍＡｂは、ヒトＴＮＦαに結合するヒトＩｇＭであり、
従ってこれが自己抗体として定義される特性を有してい
ることから、このｍＡｂ性質を決定してそれが示す多反
応性を評価することが重要であった。我々は、多反応性
を限定する目的で典型的に用いられているヒトおよび非
ヒト抗原の一団を選択した。Ｂ５ ｍＡｂ、Ａ１０Ｇ１
０、多反応性を示すヒトＩｇＭの２種の対照ｍＡｂであ
る１Ａ６Ｂ５ＦおよびＦ２．２．３４、および他の２種
のヒトＩｇＭ抗ＴＮＦ ｍＡｂが示す上記抗原との結合
を比較した。これらの結果を各抗体に関して正規化する
ことによって、直接的な比較を可能にした。
ｍＡｂは、ヒトＴＮＦαに結合するヒトＩｇＭであり、
従ってこれが自己抗体として定義される特性を有してい
ることから、このｍＡｂ性質を決定してそれが示す多反
応性を評価することが重要であった。我々は、多反応性
を限定する目的で典型的に用いられているヒトおよび非
ヒト抗原の一団を選択した。Ｂ５ ｍＡｂ、Ａ１０Ｇ１
０、多反応性を示すヒトＩｇＭの２種の対照ｍＡｂであ
る１Ａ６Ｂ５ＦおよびＦ２．２．３４、および他の２種
のヒトＩｇＭ抗ＴＮＦ ｍＡｂが示す上記抗原との結合
を比較した。これらの結果を各抗体に関して正規化する
ことによって、直接的な比較を可能にした。
【００３９】図４〜９は、４つの同様な実験の１つで得
られるデータを示す。マウスｍＡｂであるＡ１０Ｇ１０
は特異的にｒｈＴＮＦαに結合し、そして他の抗原のい
ずれにも結合しない。それとは対照的に、多反応性を示
すｍＡｂである１Ａ６Ｂ５Ｆは、試験した抗原の本質的
に全てと結合する。多反応性を示す他のｍＡｂであるＦ
２．２．３４に関しても同じことが当てはまるが、ＢＳ
ＡおよびＴＮＦに対する結合は、他の抗原で見られるよ
りもずっと強力であった。Ｂ５ ｍＡｂはｒｈＴＮＦα
に特異性を示した。Ｂ５ ｍＡｂは組換え型ヒトリンフ
ォトキシン（ｒｈＴＮＦβ）にも、試験した他の抗原の
いずれにも結合しないことが観察された。これらのデー
タは、Ｂ５ ｍＡｂは多反応性を示さないことの証拠を
与えている。
られるデータを示す。マウスｍＡｂであるＡ１０Ｇ１０
は特異的にｒｈＴＮＦαに結合し、そして他の抗原のい
ずれにも結合しない。それとは対照的に、多反応性を示
すｍＡｂである１Ａ６Ｂ５Ｆは、試験した抗原の本質的
に全てと結合する。多反応性を示す他のｍＡｂであるＦ
２．２．３４に関しても同じことが当てはまるが、ＢＳ
ＡおよびＴＮＦに対する結合は、他の抗原で見られるよ
りもずっと強力であった。Ｂ５ ｍＡｂはｒｈＴＮＦα
に特異性を示した。Ｂ５ ｍＡｂは組換え型ヒトリンフ
ォトキシン（ｒｈＴＮＦβ）にも、試験した他の抗原の
いずれにも結合しないことが観察された。これらのデー
タは、Ｂ５ ｍＡｂは多反応性を示さないことの証拠を
与えている。
【００４０】それとは対照的に、７Ｔ１およびＨ５ヒト
ＩｇＭ ｍＡｂ類はヒトＦｃフラグメントに結合し、こ
のことは、リューマチ様因子性質を示している。これら
の２種の抗体はまたインシュリンに結合し、そして７Ｔ
１は同様にＢＳＡと結合する。これらの多反応性を示す
対照ｍＡｂは、２種類の多反応性を限定しているように
見られ、その１つは、特異性に関して非常に幅広く、そ
してもう１つは、認識する抗原に関してより制限されて
いる。これらの７Ｔ１およびＨ５ ｍＡｂは、より限定
された種類の多反応性ｍＡｂに属している。Ｆ１２抗Ｔ
ＮＦ ｍＡｂはヒトＴＮＦαに結合するが、他の抗原に
対する結合は最低限である。
ＩｇＭ ｍＡｂ類はヒトＦｃフラグメントに結合し、こ
のことは、リューマチ様因子性質を示している。これら
の２種の抗体はまたインシュリンに結合し、そして７Ｔ
１は同様にＢＳＡと結合する。これらの多反応性を示す
対照ｍＡｂは、２種類の多反応性を限定しているように
見られ、その１つは、特異性に関して非常に幅広く、そ
してもう１つは、認識する抗原に関してより制限されて
いる。これらの７Ｔ１およびＨ５ ｍＡｂは、より限定
された種類の多反応性ｍＡｂに属している。Ｆ１２抗Ｔ
ＮＦ ｍＡｂはヒトＴＮＦαに結合するが、他の抗原に
対する結合は最低限である。
【００４１】Ｂ５ ｍＡｂは組換え型マウスＴＮＦαに
結合する。このＢ５ ｍＡｂに関する特異性を分析して
いる間に、我々は、これはまたマウスＴＮＦαに結合す
ることに気が付いた。これを示す目的で、我々は最初
に、中和ハムスターモノクローナル抗体にマウスＴＮＦ
αを捕捉させた後、この複合体にＢ５を結合させた。図
１０は、この種類の実験結果を示している。Ｂ５が示す
結合は、存在しているＢ５の濃度と、これらのプレート
をコートする目的で用いたハムスター抗体濃度の両方に
依存している。マウスＴＮＦαを添加しないと結合は全
く観察されず、このことは、この系におけるＢ５の結合
は特異的であることを示している。他の実験（示してい
ない）により、Ｆ１２ ｍＡｂはマウスＴＮＦαに結合
することが確認された。
結合する。このＢ５ ｍＡｂに関する特異性を分析して
いる間に、我々は、これはまたマウスＴＮＦαに結合す
ることに気が付いた。これを示す目的で、我々は最初
に、中和ハムスターモノクローナル抗体にマウスＴＮＦ
αを捕捉させた後、この複合体にＢ５を結合させた。図
１０は、この種類の実験結果を示している。Ｂ５が示す
結合は、存在しているＢ５の濃度と、これらのプレート
をコートする目的で用いたハムスター抗体濃度の両方に
依存している。マウスＴＮＦαを添加しないと結合は全
く観察されず、このことは、この系におけるＢ５の結合
は特異的であることを示している。他の実験（示してい
ない）により、Ｆ１２ ｍＡｂはマウスＴＮＦαに結合
することが確認された。
【００４２】Ｂ５ ｍＡｂは可溶ｒｈＴＮＦαに検出可
能な親和力で結合するが、その親和力は低い。次に、我
々は、ｍＡｂが示す可溶ｒｈＴＮＦαに対する結合能力
を評価した。ＥＬＩＳＡプレートに抗ヒトＩｇＭをコー
トした後、Ｂ５を加えた。次に、その結合したＢ５ ｍ
Ａｂがビオチニル化ｒｈＴＮＦαを捕捉する能力を測定
した。
能な親和力で結合するが、その親和力は低い。次に、我
々は、ｍＡｂが示す可溶ｒｈＴＮＦαに対する結合能力
を評価した。ＥＬＩＳＡプレートに抗ヒトＩｇＭをコー
トした後、Ｂ５を加えた。次に、その結合したＢ５ ｍ
Ａｂがビオチニル化ｒｈＴＮＦαを捕捉する能力を測定
した。
【００４３】図１１では、これらの条件下で可溶ＴＮＦ
αにＡ１０Ｇ１０およびＢ５が結合する能力を比較し
た。両方のｍＡｂ共、可溶ｒｈＴＮＦαに結合するが、
Ａ１０Ｇ１０のそれに相当する結合を生じさせるには、
約３００倍高いＢ５ ｍＡｂ濃度が必要である。更に、
固定化したＢ５に対する可溶ＴＮＦαの結合は、試験し
たＢ５濃度では飽和されなかった。これらの結果は、Ｂ
５ ｍＡｂがｒｈＴＮＦαに結合する親和力は低いこと
と一致している。実際、Ｂ５ ｍＡｂが示す結合定数を
測定する試みにより、その親和力は通常の方法で計算す
るには低すぎることが確認された（データを示していな
い）。
αにＡ１０Ｇ１０およびＢ５が結合する能力を比較し
た。両方のｍＡｂ共、可溶ｒｈＴＮＦαに結合するが、
Ａ１０Ｇ１０のそれに相当する結合を生じさせるには、
約３００倍高いＢ５ ｍＡｂ濃度が必要である。更に、
固定化したＢ５に対する可溶ＴＮＦαの結合は、試験し
たＢ５濃度では飽和されなかった。これらの結果は、Ｂ
５ ｍＡｂがｒｈＴＮＦαに結合する親和力は低いこと
と一致している。実際、Ｂ５ ｍＡｂが示す結合定数を
測定する試みにより、その親和力は通常の方法で計算す
るには低すぎることが確認された（データを示していな
い）。
【００４４】抗ＩｇＭをプレートにコートし、Ｂ５を捕
捉させた後、未修飾可溶ｒｈＴＮＦαを添加することに
よっても、Ｂ５が可溶ｒｈＴＮＦαに結合することを示
した。次に、Ａ１０Ｇ１０を添加し、そしてこれが、上
記のようにＢ５と複合体形成した形態のｒｈＴＮＦαに
結合することを、ビオチニル化した抗マウスＩｇＧを用
いて検出した。図１２では、Ｂ５と対照ヒトＩｇＭであ
る６Ｆ１１が示す、可溶ｒｈＴＮＦαを捕捉しそしてそ
れをＡ１０Ｇ１０に提示する能力を比較する。この実験
において、対照ｍＡｂを用いた場合でも何らかの非特異
的結合は見られるが、Ｂ５ ｍＡｂは約４倍から８倍量
のｒｈＴＮＦαと結合した。これらのデータは、Ｂ５が
低い結合定数を示すことと一致しており、そして更に、
Ｂ５ ｍＡｂとＡ１０Ｇ１０ ｍＡｂはｒｈＴＮＦα上の
異なるエピトープを認識すると言った概念を支持してい
る。
捉させた後、未修飾可溶ｒｈＴＮＦαを添加することに
よっても、Ｂ５が可溶ｒｈＴＮＦαに結合することを示
した。次に、Ａ１０Ｇ１０を添加し、そしてこれが、上
記のようにＢ５と複合体形成した形態のｒｈＴＮＦαに
結合することを、ビオチニル化した抗マウスＩｇＧを用
いて検出した。図１２では、Ｂ５と対照ヒトＩｇＭであ
る６Ｆ１１が示す、可溶ｒｈＴＮＦαを捕捉しそしてそ
れをＡ１０Ｇ１０に提示する能力を比較する。この実験
において、対照ｍＡｂを用いた場合でも何らかの非特異
的結合は見られるが、Ｂ５ ｍＡｂは約４倍から８倍量
のｒｈＴＮＦαと結合した。これらのデータは、Ｂ５が
低い結合定数を示すことと一致しており、そして更に、
Ｂ５ ｍＡｂとＡ１０Ｇ１０ ｍＡｂはｒｈＴＮＦα上の
異なるエピトープを認識すると言った概念を支持してい
る。
【００４５】ウエスタンブロットにおいてＢ５ ｍＡｂ
はｒｈＴＮＦαを認識する。図１３は、Ｂ５が変性ＴＮ
Ｆαに結合することを示すウエスタンブロッティングを
用いた実験結果を示している。奇麗にする目的でこれら
の画像を増強した。レーンＡ−Ｇでは、マウスＴＮＦα
への結合を検査し、そしてレーンＨおよびＩでは、ヒト
ＴＮＦαへの結合を試験した。６Ｆ１１抗体はどちらの
ＴＮＦα種にも結合せず、特異性対照を与えている。ヒ
トＩｇＭ ｍＡｂである７Ｔ１、Ｈ５、１Ａ６Ｂ５Ｆお
よびＢ５は全てマウスＴＮＦαに結合する。更に、これ
らの条件下で、Ｂ５抗体はまたヒトＴＮＦαに結合す
る。これらの結果は、Ｂ５がｒｈＴＮＦαの線形エピト
ープを認識し得ることを示唆している。
はｒｈＴＮＦαを認識する。図１３は、Ｂ５が変性ＴＮ
Ｆαに結合することを示すウエスタンブロッティングを
用いた実験結果を示している。奇麗にする目的でこれら
の画像を増強した。レーンＡ−Ｇでは、マウスＴＮＦα
への結合を検査し、そしてレーンＨおよびＩでは、ヒト
ＴＮＦαへの結合を試験した。６Ｆ１１抗体はどちらの
ＴＮＦα種にも結合せず、特異性対照を与えている。ヒ
トＩｇＭ ｍＡｂである７Ｔ１、Ｈ５、１Ａ６Ｂ５Ｆお
よびＢ５は全てマウスＴＮＦαに結合する。更に、これ
らの条件下で、Ｂ５抗体はまたヒトＴＮＦαに結合す
る。これらの結果は、Ｂ５がｒｈＴＮＦαの線形エピト
ープを認識し得ることを示唆している。
【００４６】Ｂ５ ｍＡｂは、ｒｈＴＮＦαの細胞毒性
を中和しない。ＴＮＦ感受性を示す細胞系ＷＥＨＩ １
６４を用いて、Ｂ５ ｍＡｂがＴＮＦα細胞毒性を中和
する能力を評価した。図１４は、Galloway他（上に引
用）が以前に示したように、Ａ１０Ｇ１０は明らかに用
量依存様式でｒｈＴＮＦαを中和することを示してい
る。しかしながら、Ｂ５を如何なる濃度で用いても、ｒ
ｈＴＮＦαの中和は全く観察されなかった。試験した他
の３種のヒトＩｇＭ抗ＴＮＦα ｍＡｂであるＢ６、Ｆ
１２および７Ｔ１に関しても同じことが言える。これら
のデータは、Ｂ５およびＡ１０Ｇ１０はＴＮＦの異なる
エピトープと結合すると言う考えに対するさらなる支持
を与えており、そしてＢ５ ｍＡｂが可溶ｒｈＴＮＦα
と結合する能力は弱いことと一致している。
を中和しない。ＴＮＦ感受性を示す細胞系ＷＥＨＩ １
６４を用いて、Ｂ５ ｍＡｂがＴＮＦα細胞毒性を中和
する能力を評価した。図１４は、Galloway他（上に引
用）が以前に示したように、Ａ１０Ｇ１０は明らかに用
量依存様式でｒｈＴＮＦαを中和することを示してい
る。しかしながら、Ｂ５を如何なる濃度で用いても、ｒ
ｈＴＮＦαの中和は全く観察されなかった。試験した他
の３種のヒトＩｇＭ抗ＴＮＦα ｍＡｂであるＢ６、Ｆ
１２および７Ｔ１に関しても同じことが言える。これら
のデータは、Ｂ５およびＡ１０Ｇ１０はＴＮＦの異なる
エピトープと結合すると言う考えに対するさらなる支持
を与えており、そしてＢ５ ｍＡｂが可溶ｒｈＴＮＦα
と結合する能力は弱いことと一致している。
【００４７】Ｂ５ ｍＡｂ抗ｒｈＴＮＦαは異なるいく
つかの細胞系の表面と結合する。Ｂ５ ｍＡｂは特異的
にｒＴＮＦαに結合することから、いくつかの細胞系を
選択して、ｍＡｂがそれらの表面に結合するか否かを試
験した。図１５および１６は、２つの細胞系を用いた典
型的な実験結果を示している。ＥＢＶで形質転換したヒ
トＢリンパ芽球細胞系８Ｂ９およびヒト単球細胞系ＴＨ
Ｐ−１を、Ｂ５抗ＴＮＦαもしくは６Ｆ１１抗シュード
モナスＬＰＳ ｍＡｂのどちらかに続いて蛍光抗ヒトＩ
ｇＭ Ｆ（ａｂ）’2フラグメントで染色した。
つかの細胞系の表面と結合する。Ｂ５ ｍＡｂは特異的
にｒＴＮＦαに結合することから、いくつかの細胞系を
選択して、ｍＡｂがそれらの表面に結合するか否かを試
験した。図１５および１６は、２つの細胞系を用いた典
型的な実験結果を示している。ＥＢＶで形質転換したヒ
トＢリンパ芽球細胞系８Ｂ９およびヒト単球細胞系ＴＨ
Ｐ−１を、Ｂ５抗ＴＮＦαもしくは６Ｆ１１抗シュード
モナスＬＰＳ ｍＡｂのどちらかに続いて蛍光抗ヒトＩ
ｇＭ Ｆ（ａｂ）’2フラグメントで染色した。
【００４８】これらの８Ｂ９細胞はＢ５ ｍＡｂで充分
に染色される一方、対照６Ｆ１１ ｍＡｂを用いた場
合、その細胞表面への有意な結合は見られなかった。Ｔ
ＨＰ−１細胞に関してもＢ５染色が観察された。しかし
ながら、染色されたこの集団内の細胞数は少なく、そし
てその観察された染色は、８Ｂ９細胞で見られるよりも
いくらかぼんやりしていた。しかしながら、Ｂ５ ｍＡ
ｂを用いた時検出されるように、ＴＨＰ−１集団内の細
胞の約１／３が細胞表面ＴＮＦα（ｃｓＴＮＦα）を発
現した。このレベルの染色がｃｓＴＮＦα発現の何らか
の調節を反映しているか否か、或はこれはその細胞系内
のクローナル変異によるものであるか否かは明らかでな
い。
に染色される一方、対照６Ｆ１１ ｍＡｂを用いた場
合、その細胞表面への有意な結合は見られなかった。Ｔ
ＨＰ−１細胞に関してもＢ５染色が観察された。しかし
ながら、染色されたこの集団内の細胞数は少なく、そし
てその観察された染色は、８Ｂ９細胞で見られるよりも
いくらかぼんやりしていた。しかしながら、Ｂ５ ｍＡ
ｂを用いた時検出されるように、ＴＨＰ−１集団内の細
胞の約１／３が細胞表面ＴＮＦα（ｃｓＴＮＦα）を発
現した。このレベルの染色がｃｓＴＮＦα発現の何らか
の調節を反映しているか否か、或はこれはその細胞系内
のクローナル変異によるものであるか否かは明らかでな
い。
【００４９】ＴＨＰ−１単球およびＵ９３７組織球細胞
系を用いて、Ｂ５が細胞表面に結合する濃度依存性を更
に密に試験した。刺激なしか、ＬＰＳと一緒か、或はＬ
ＰＳ＋ＰＭＡと一緒に３時間インキュベートした後の、
滴定量のＢ５抗体を用いて、上記細胞の染色を行った。
これらの結果を図１７に示す。全ての場合において、Ｂ
５が細胞に結合するのは用量依存であった。興味の持た
れることには、細胞系をＬＰＳもしくはＬＰＳ＋ＰＭＡ
と一緒にプレインキュベートした時、これらは細胞系両
方に関して観察される結合が増大した。これは特にＵ９
３７細胞系で明らかであった。このように増大は、知ら
れているところの、これらの薬剤は単球細胞系によるＴ
ＮＦ分泌を誘発する能力を有することに一致している。
刺激すると、Ｂ５は、数百ナノグラム／ｍＬの抗体量で
さえ、明らかにこれらの細胞と結合した。
系を用いて、Ｂ５が細胞表面に結合する濃度依存性を更
に密に試験した。刺激なしか、ＬＰＳと一緒か、或はＬ
ＰＳ＋ＰＭＡと一緒に３時間インキュベートした後の、
滴定量のＢ５抗体を用いて、上記細胞の染色を行った。
これらの結果を図１７に示す。全ての場合において、Ｂ
５が細胞に結合するのは用量依存であった。興味の持た
れることには、細胞系をＬＰＳもしくはＬＰＳ＋ＰＭＡ
と一緒にプレインキュベートした時、これらは細胞系両
方に関して観察される結合が増大した。これは特にＵ９
３７細胞系で明らかであった。このように増大は、知ら
れているところの、これらの薬剤は単球細胞系によるＴ
ＮＦ分泌を誘発する能力を有することに一致している。
刺激すると、Ｂ５は、数百ナノグラム／ｍＬの抗体量で
さえ、明らかにこれらの細胞と結合した。
【００５０】表２は、Ｂ５抗ＴＮＦα ｍＡｂの結合が
生き残ることに関する２つの実験結果を示している。示
した一次抗体およびフルオレセイン標識した抗ヒトＩｇ
Ｍ（μ−特異的）二次抗体を用いて細胞の染色を行っ
た。FACSCAN装置を用いて測定した細胞陽性染色のパー
セントを示す。
生き残ることに関する２つの実験結果を示している。示
した一次抗体およびフルオレセイン標識した抗ヒトＩｇ
Ｍ（μ−特異的）二次抗体を用いて細胞の染色を行っ
た。FACSCAN装置を用いて測定した細胞陽性染色のパー
セントを示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】ヒトＢおよびＴリンパ球、乳癌、星状細胞
腫、グリア芽腫、単球、組織球、メラノーマおよび単芽
球由来の細胞系を含む種々の細胞系を試験した。マウス
Ｔ細胞リンパ腫も同様に試験した。試験した１５種の細
胞系の中で、乳癌Ｕ１１８ＭＧのみが全くＢ５による結
合を示さなかった。その他は、ｃｓＴＮＦαを発現する
各集団内の細胞パーセントで表して、Ａ３７５メラノー
マに関する約８％の低い値からＥＢＶ形質転換Ｂ細胞に
関する９０％以上に渡る範囲を表した。この種類の対抗
する６Ｆ１１抗ＬＰＳ ｍＡｂは、これらの細胞系のい
ずれも染色しなかった。このような細胞系および陰性細
胞系は、その見られるＢ５染色は特異的であることを表
しており、そして全ての細胞に一般的な親和力の結果で
ないことを示している。
腫、グリア芽腫、単球、組織球、メラノーマおよび単芽
球由来の細胞系を含む種々の細胞系を試験した。マウス
Ｔ細胞リンパ腫も同様に試験した。試験した１５種の細
胞系の中で、乳癌Ｕ１１８ＭＧのみが全くＢ５による結
合を示さなかった。その他は、ｃｓＴＮＦαを発現する
各集団内の細胞パーセントで表して、Ａ３７５メラノー
マに関する約８％の低い値からＥＢＶ形質転換Ｂ細胞に
関する９０％以上に渡る範囲を表した。この種類の対抗
する６Ｆ１１抗ＬＰＳ ｍＡｂは、これらの細胞系のい
ずれも染色しなかった。このような細胞系および陰性細
胞系は、その見られるＢ５染色は特異的であることを表
しており、そして全ての細胞に一般的な親和力の結果で
ないことを示している。
【００５３】中和マウス抗ＴＮＦα ｍＡｂはｃｓＴＮ
Ｆαに結合しないこと。
Ｆαに結合しないこと。
【００５４】ＥＬＩＳＡ実験により、Ｂ５ ｍＡｂのＴ
ＮＦ特異性を示し、そしてそれはこの中和マウスｍＡｂ
であるＡ１０Ｇ１０が結合するのとは異なるＴＮＦα上
エピトープと結合することを示した。我々は次に、Ａ１
０Ｇ１０ ｍＡｂが認識するエピトープが、Ｂ５が結合
する細胞表面上に発現するか否かを試験した。
ＮＦ特異性を示し、そしてそれはこの中和マウスｍＡｂ
であるＡ１０Ｇ１０が結合するのとは異なるＴＮＦα上
エピトープと結合することを示した。我々は次に、Ａ１
０Ｇ１０ ｍＡｂが認識するエピトープが、Ｂ５が結合
する細胞表面上に発現するか否かを試験した。
【００５５】表３は、Ｕ９３７およびＴＨＰ−１細胞系
を用いて上記を行うことを意図した５つの実験から得ら
れたデータを示している。指示した一次抗体およびフル
オレセイン標識した抗マウスＩｇＧ（γ特異的）もしく
は抗ヒトＩｇＭ（μ特異的）二次抗体を用いて細胞の染
色を行った。星記（＊）は、Ａ１０Ｇ１０ ｍＡｂのＦ
（ａｂ）’2フラグメントを用いたことを示している。F
ACSCAN装置を用いて測定した、陽性染色する細胞のパー
セントを示す。測定されずをｎｄで示す。
を用いて上記を行うことを意図した５つの実験から得ら
れたデータを示している。指示した一次抗体およびフル
オレセイン標識した抗マウスＩｇＧ（γ特異的）もしく
は抗ヒトＩｇＭ（μ特異的）二次抗体を用いて細胞の染
色を行った。星記（＊）は、Ａ１０Ｇ１０ ｍＡｂのＦ
（ａｂ）’2フラグメントを用いたことを示している。F
ACSCAN装置を用いて測定した、陽性染色する細胞のパー
セントを示す。測定されずをｎｄで示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】５つの実験全てにおいて、Ｂ５ ｍＡｂは
各細胞系に結合した。他方、Ａ１０Ｇ１０ ｍＡｂは、
これらの実験の４つにおいて、有意度合では結合を生じ
なかった。これらの５つの実験の１つにおいて、Ｕ９３
７細胞にＡ１０Ｇ１０が若干結合することが観察され
た。これらのデータを一緒にすると、これらの細胞系の
表面上にＴＮＦαは存在しているが、外因性刺激が存在
していない場合、Ａ１０Ｇ１０が認識するエピトープは
ｍＡｂ類による結合にはほとんど利用されないことを示
している。
各細胞系に結合した。他方、Ａ１０Ｇ１０ ｍＡｂは、
これらの実験の４つにおいて、有意度合では結合を生じ
なかった。これらの５つの実験の１つにおいて、Ｕ９３
７細胞にＡ１０Ｇ１０が若干結合することが観察され
た。これらのデータを一緒にすると、これらの細胞系の
表面上にＴＮＦαは存在しているが、外因性刺激が存在
していない場合、Ａ１０Ｇ１０が認識するエピトープは
ｍＡｂ類による結合にはほとんど利用されないことを示
している。
【００５８】細胞表面ＴＮＦα発現のＬＰＳ誘発。
【００５９】ＬＰＳは、ヒト単球によるＴＮＦα分泌を
誘発する目的で通常に用いられている薬剤である。我々
は、ＴＨＰ−１およびＵ９３７細胞をＬＰＳと一緒にイ
ンキュベートすることにより、ｃｓＴＮＦα発現が増大
し得るか否かを試験した。表４は３つの実験の結果を示
している。１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと一緒に３または
４時間インキュベートすることによって、刺激を行っ
た。指示した一次抗体およびフルオレセイン標識した抗
マウスＩｇＧ（γ特異的）もしくは抗ヒトＩｇＭ（μ特
異的）二次抗体を用いて細胞の染色を行った。星記
（＊）は、Ａ１０Ｇ１０ ｍＡｂのＦ（ａｂ）’2フラグ
メントを用いたことを示している。FACSCANを用いて測
定した、陽性染色する細胞のパーセントを示す。測定さ
れずをｎｄで示す。
誘発する目的で通常に用いられている薬剤である。我々
は、ＴＨＰ−１およびＵ９３７細胞をＬＰＳと一緒にイ
ンキュベートすることにより、ｃｓＴＮＦα発現が増大
し得るか否かを試験した。表４は３つの実験の結果を示
している。１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと一緒に３または
４時間インキュベートすることによって、刺激を行っ
た。指示した一次抗体およびフルオレセイン標識した抗
マウスＩｇＧ（γ特異的）もしくは抗ヒトＩｇＭ（μ特
異的）二次抗体を用いて細胞の染色を行った。星記
（＊）は、Ａ１０Ｇ１０ ｍＡｂのＦ（ａｂ）’2フラグ
メントを用いたことを示している。FACSCANを用いて測
定した、陽性染色する細胞のパーセントを示す。測定さ
れずをｎｄで示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】３つの実験全てにおいて、ＬＰＳは、Ｂ５
がＴＨＰ−１細胞に結合する度合を増大させた。これ
は、これらの３つの実験の２つにおいて、Ｕ９３７細胞
にもまた当てはまる。ＴＨＰ−１およびＵ９３７系の両
方において、誘発していない細胞とは対照的にＬＰＳ刺
激によりＡ１０Ｇ１０ ｍＡｂで染色されるようになっ
た。しかしながら、Ａ１０Ｇ１０が認識するＴＮＦαエ
ピトープを発現する両方の系における細胞パーセント
は、Ｂ５ ｍＡｂで見られるパーセントに比較して小さ
い。これらのデータは、ＬＰＳと一緒にインキュベート
することによってｃｓＴＮＦα量が上昇し、そしてこの
上昇は、中和抗体が認識するＴＮＦαエピトープの獲得
と相関関係にあることを示唆している。
がＴＨＰ−１細胞に結合する度合を増大させた。これ
は、これらの３つの実験の２つにおいて、Ｕ９３７細胞
にもまた当てはまる。ＴＨＰ−１およびＵ９３７系の両
方において、誘発していない細胞とは対照的にＬＰＳ刺
激によりＡ１０Ｇ１０ ｍＡｂで染色されるようになっ
た。しかしながら、Ａ１０Ｇ１０が認識するＴＮＦαエ
ピトープを発現する両方の系における細胞パーセント
は、Ｂ５ ｍＡｂで見られるパーセントに比較して小さ
い。これらのデータは、ＬＰＳと一緒にインキュベート
することによってｃｓＴＮＦα量が上昇し、そしてこの
上昇は、中和抗体が認識するＴＮＦαエピトープの獲得
と相関関係にあることを示唆している。
【００６２】ｃｓＴＮＦα発現に対するＬＰＳ以外の因
子の影響 我々の実験を行っている間に、我々の細胞系のいくつか
は自然発生的ｃｓＴＮＦα発現をいくらか失った。ｃｓ
ＴＮＦα発現に対するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響を
試験する目的で、異なるロットのウシ胎児血清の中で４
日間ＴＨＰ−１細胞を培養した後、細胞表面ＴＮＦα発
現に関する分析を行った。表５は典型的な結果を示して
いる。そこに示されているのは、指示した一次抗体およ
び蛍光を示す二次染色抗体で染色陽性を示す細胞のパー
セントである。ＦＢＳロット１０７９、１０８７、２０
８１および１０２６に関する、Limulusアメーバ様細胞
溶解産物単位で表すエンドトキシン濃度は、それぞれ
０．１２５、０．２５０、０．０６０および０．７５０
である。FACSCAN装置を用いて分析を行った。
子の影響 我々の実験を行っている間に、我々の細胞系のいくつか
は自然発生的ｃｓＴＮＦα発現をいくらか失った。ｃｓ
ＴＮＦα発現に対するウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響を
試験する目的で、異なるロットのウシ胎児血清の中で４
日間ＴＨＰ−１細胞を培養した後、細胞表面ＴＮＦα発
現に関する分析を行った。表５は典型的な結果を示して
いる。そこに示されているのは、指示した一次抗体およ
び蛍光を示す二次染色抗体で染色陽性を示す細胞のパー
セントである。ＦＢＳロット１０７９、１０８７、２０
８１および１０２６に関する、Limulusアメーバ様細胞
溶解産物単位で表すエンドトキシン濃度は、それぞれ
０．１２５、０．２５０、０．０６０および０．７５０
である。FACSCAN装置を用いて分析を行った。
【００６３】 表５ ＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦαの細胞表面発現に対するウシ胎児血清の影響 ＦＢＳロット番号 一次Ａｂ 二次Ａｂ １０７９ １０８７ ２０８１ １０２６ 染色陽性細胞（％） なし なし 0.2 0.3 0.1 0.2 なし ＦＬ抗ＩｇＭ 2.2 3.5 1.6 2.6 Ｂ５ ＦＬ抗ＩｇＭ 29.5 15.1 6.8 14.1 ６Ｆ１１ ＦＬ抗ＩｇＭ 6.7 7.1 4.2 5.2 ＦＢＳのロットは、ＴＨＰ−１細胞によるｃｓＴＮＦα
発現に対して大きな影響を示した。発現の差は、使用し
た特別なＦＢＳバッチに応じて約４倍変化した。これら
の異なるロットにおけるエンドトキシンレベルを比較す
ることにより、ｃｓＴＮＦαレベルとは直接的な相関関
係がないことが確認された。これらのデータは、ＬＰＳ
以外の因子がｃｓＴＮＦα発現に影響を与えている可能
性があることを示唆している。
発現に対して大きな影響を示した。発現の差は、使用し
た特別なＦＢＳバッチに応じて約４倍変化した。これら
の異なるロットにおけるエンドトキシンレベルを比較す
ることにより、ｃｓＴＮＦαレベルとは直接的な相関関
係がないことが確認された。これらのデータは、ＬＰＳ
以外の因子がｃｓＴＮＦα発現に影響を与えている可能
性があることを示唆している。
【００６４】ｃｓＴＮＦαに対するＢ５ ｍＡｂ結合の
特異性。
特異性。
【００６５】表６は、ＴＨＰ−１細胞に対するＢ５ ｍ
Ａｂ結合の特異性を立証するデータを示している。ＬＰ
Ｓで刺激したＴＨＰ−１細胞に暴露するに先立って、指
示した濃度の阻害剤と一緒にＢ５ ｍＡｂを１０ｕｇ／
ｍＬでインキュベートした。フルオレセインに接合させ
たＦ（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭ抗体を用いてそれの結合
を検出した。ＬＴは組換え型ヒトリンフォトキシンであ
り、ＥＣＤ５５はｐ５５ＴＮＦレセプタの組換え型細胞
外ＴＮＦα結合ドメインであり、そしてＡ１０Ｇ１０は
中和マウスＩｇＧ1抗ＴＮＦα ｍＡｂである。FACSCAN
装置を用いて分析を行った。
Ａｂ結合の特異性を立証するデータを示している。ＬＰ
Ｓで刺激したＴＨＰ−１細胞に暴露するに先立って、指
示した濃度の阻害剤と一緒にＢ５ ｍＡｂを１０ｕｇ／
ｍＬでインキュベートした。フルオレセインに接合させ
たＦ（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭ抗体を用いてそれの結合
を検出した。ＬＴは組換え型ヒトリンフォトキシンであ
り、ＥＣＤ５５はｐ５５ＴＮＦレセプタの組換え型細胞
外ＴＮＦα結合ドメインであり、そしてＡ１０Ｇ１０は
中和マウスＩｇＧ1抗ＴＮＦα ｍＡｂである。FACSCAN
装置を用いて分析を行った。
【００６６】 表６ ＴＨＰ−１細胞表面に対するＢ５抗ＴＮＦα ｍＡｂ結合の特異性 染色陽性細胞（％） 阻害剤（ｕｇ／ｍＬ） 阻害剤 0.0 0.03 0.30 3.0 30.0 ＴＮＦα 44.1 43.2 35.9 22.2 15.8 ＬＴ 44.1 39.8 40.0 40.0 29.7 Ａ１０Ｇ１０ 44.1 39.6 40.9 44.4 41.9 ＴＮＦαと一緒にＢ５ ＩｇＭ ｍＡｂをプレインキュベ
ートすると、それが示す次の細胞表面結合が用量依存様
式で阻害される一方、リンフォトキシンと一緒にプレイ
ンキュベートした場合阻害されなかったが、最大濃度の
時にのみ若干の影響が生じた。ＴＮＦαを高用量で用い
ても完全な阻害が生じなかったことは、以前に示した、
このｍＡｂが可溶ＴＮＦαに対して示す親和力が低いこ
とと一致している。興味の持たれることには、Ｂ５ ｍ
ＡｂをＡ１０Ｇ１０と一緒にプレインキュベートした
後、両者を添加した場合、Ｂ５結合の低下は生じなかっ
た。これらのデータは、中和Ａ１０Ｇ１０は、Ｂ５ ｍ
Ａｂが結合するＴＮＦα上エピトープと同じエピトープ
に関して競合しないことを示している。
ートすると、それが示す次の細胞表面結合が用量依存様
式で阻害される一方、リンフォトキシンと一緒にプレイ
ンキュベートした場合阻害されなかったが、最大濃度の
時にのみ若干の影響が生じた。ＴＮＦαを高用量で用い
ても完全な阻害が生じなかったことは、以前に示した、
このｍＡｂが可溶ＴＮＦαに対して示す親和力が低いこ
とと一致している。興味の持たれることには、Ｂ５ ｍ
ＡｂをＡ１０Ｇ１０と一緒にプレインキュベートした
後、両者を添加した場合、Ｂ５結合の低下は生じなかっ
た。これらのデータは、中和Ａ１０Ｇ１０は、Ｂ５ ｍ
Ａｂが結合するＴＮＦα上エピトープと同じエピトープ
に関して競合しないことを示している。
【００６７】新鮮なヒト脾臓細胞上のｃｓＴＮＦαに対
するＢ５結合 上のセクションでは、いくつかの異なる細胞系上のｃｓ
ＴＮＦαに対するＢ５結合を確立した。Ｂ５が未形質転
換細胞に結合するか否かを測定する目的で、ヒト脾臓細
胞を用いた実験を行った。
するＢ５結合 上のセクションでは、いくつかの異なる細胞系上のｃｓ
ＴＮＦαに対するＢ５結合を確立した。Ｂ５が未形質転
換細胞に結合するか否かを測定する目的で、ヒト脾臓細
胞を用いた実験を行った。
【００６８】Ｂ５によるｃｓＴＮＦαのＢ細胞発現分析
を行う目的で、我々は、接合させていないＢ５ ＩｇＭ
を用いた、と言うのは、この抗体を直接フルオレセイン
化もしくはビオチニル化した場合それが示すＴＮＦα結
合能力が不充分になるか或は干渉を受けるからである。
Ｂ５結合を検出する目的で、抗ヒトＩｇＭ抗体の蛍光Ｆ
（ａｂ）’2フラグメントを用いた。数多くの通常Ｂ細
胞は既にｓＩｇＭを抗原レセプタとして発現することか
ら、ｓＩｇＭ＋細胞のパーセント上昇としてｃｓＴＮＦ
αを検出することは必ずしも可能でなかった。しかしな
がら、我々は、Ｂ５ ｍＡｂと一緒に細胞を培養した時
の、蛍光を示す抗ＩｇＭによる染色強度上昇を測定し、
それを、対照６Ｆ１１ ＩｇＭ ｍＡｂと一緒のインキュ
ベーションと比較するか、或は全く抗体なしのインキュ
ベーションと比較することにより、ｃｓＴＮＦαの検出
を行うことができた。
を行う目的で、我々は、接合させていないＢ５ ＩｇＭ
を用いた、と言うのは、この抗体を直接フルオレセイン
化もしくはビオチニル化した場合それが示すＴＮＦα結
合能力が不充分になるか或は干渉を受けるからである。
Ｂ５結合を検出する目的で、抗ヒトＩｇＭ抗体の蛍光Ｆ
（ａｂ）’2フラグメントを用いた。数多くの通常Ｂ細
胞は既にｓＩｇＭを抗原レセプタとして発現することか
ら、ｓＩｇＭ＋細胞のパーセント上昇としてｃｓＴＮＦ
αを検出することは必ずしも可能でなかった。しかしな
がら、我々は、Ｂ５ ｍＡｂと一緒に細胞を培養した時
の、蛍光を示す抗ＩｇＭによる染色強度上昇を測定し、
それを、対照６Ｆ１１ ＩｇＭ ｍＡｂと一緒のインキュ
ベーションと比較するか、或は全く抗体なしのインキュ
ベーションと比較することにより、ｃｓＴＮＦαの検出
を行うことができた。
【００６９】図１８および１９は、Ｂ５ ｍＡｂがＢ細
胞に結合すると蛍光強度のシフトが見られることを示し
ている。図１８の（Ａ）は、抗ＩｇＭ抗体単独を用いて
染色した細胞の蛍光柱状図表を示している。図１８の
（Ｂ）は、これらの同じ細胞を最初にＢ５ ｍＡｂ抗Ｔ
ＮＦαと反応させた後、蛍光を示す抗ＩｇＭ抗体で再染
色した時の柱状図表を示している。このシフトを測定す
るに最も有効な統計値は、蛍光強度の中間チャンネルま
たは単に中間チャンネルである。Ｂ細胞を試験した時の
中間チャンネル番号を以下の表に示す。
胞に結合すると蛍光強度のシフトが見られることを示し
ている。図１８の（Ａ）は、抗ＩｇＭ抗体単独を用いて
染色した細胞の蛍光柱状図表を示している。図１８の
（Ｂ）は、これらの同じ細胞を最初にＢ５ ｍＡｂ抗Ｔ
ＮＦαと反応させた後、蛍光を示す抗ＩｇＭ抗体で再染
色した時の柱状図表を示している。このシフトを測定す
るに最も有効な統計値は、蛍光強度の中間チャンネルま
たは単に中間チャンネルである。Ｂ細胞を試験した時の
中間チャンネル番号を以下の表に示す。
【００７０】表７は、脾臓生検材料を用いた２つの実験
で得られるデータを示している。フルオレセイン接合さ
せた抗ヒトＩｇＭと協力させて、フィコエリスリン接合
させた抗ＬｅｕＭ３、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９をそれ
ぞれ用いた、２色免疫蛍光分析により、単球、Ｔ細胞お
よびＢ細胞上のｃｓＴＮＦα発現を試験した。生検を行
って１日後受け取ったヒト脾臓細胞を、指示したモノク
ローナル抗体で染色する細胞表面の発現に関して分析し
た。小型のリンパ球を、前方および横方向に散乱する特
性を用いて通門させた後、分析を行った。フィコエリス
リンに接合させた抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９および抗Ｌｅｕ
Ｍ３抗体を用いてそれぞれＴ細胞、Ｂ細胞および単球の
染色を行った。次に、フルオレセイン標識したＦ（ａ
ｂ）’2抗ヒトＩｇＭおよび指示したＩｇＭ ｍＡｂ類を
用いて、上記集団に対する２色分析を行った。下線を付
けた値は、陽性染色された細胞のパーセント上昇が有意
である値を表しているか、或は適当な対照集団が示す蛍
光強度の２倍以上であることを表している。FACSCAN装
置を用いて分析を行った。
で得られるデータを示している。フルオレセイン接合さ
せた抗ヒトＩｇＭと協力させて、フィコエリスリン接合
させた抗ＬｅｕＭ３、抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９をそれ
ぞれ用いた、２色免疫蛍光分析により、単球、Ｔ細胞お
よびＢ細胞上のｃｓＴＮＦα発現を試験した。生検を行
って１日後受け取ったヒト脾臓細胞を、指示したモノク
ローナル抗体で染色する細胞表面の発現に関して分析し
た。小型のリンパ球を、前方および横方向に散乱する特
性を用いて通門させた後、分析を行った。フィコエリス
リンに接合させた抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９および抗Ｌｅｕ
Ｍ３抗体を用いてそれぞれＴ細胞、Ｂ細胞および単球の
染色を行った。次に、フルオレセイン標識したＦ（ａ
ｂ）’2抗ヒトＩｇＭおよび指示したＩｇＭ ｍＡｂ類を
用いて、上記集団に対する２色分析を行った。下線を付
けた値は、陽性染色された細胞のパーセント上昇が有意
である値を表しているか、或は適当な対照集団が示す蛍
光強度の２倍以上であることを表している。FACSCAN装
置を用いて分析を行った。
【００７１】
【表４】
【００７２】両方の実験において、全脾臓細胞集団を構
成している単球は５％未満であった。両方の実験におい
て、これらの有意な画分は抗ＴＮＦα Ｂ５ ｍＡｂで染
色された。他方、これらの細胞は対照６Ｆ１１ヒトＩｇ
Ｍ ｍＡｂで染色されなかった。これらの結果は、ある
種の脾臓単球はｃｓＴＮＦαを発現することを示唆して
いる。
成している単球は５％未満であった。両方の実験におい
て、これらの有意な画分は抗ＴＮＦα Ｂ５ ｍＡｂで染
色された。他方、これらの細胞は対照６Ｆ１１ヒトＩｇ
Ｍ ｍＡｂで染色されなかった。これらの結果は、ある
種の脾臓単球はｃｓＴＮＦαを発現することを示唆して
いる。
【００７３】ＣＤ３＋Ｔ細胞が示すｃｓＴＮＦα発現は
変動していた。これらの実験において、ｃｓＴＮＦα陽
性を示すＴ細胞のパーセントは変動を示す一方、Ｂ５
ｍＡｂを用いた染色は、Ｂ細胞および単球で見られるよ
りもずっと弱かった。Ｔ細胞のｃｓＴＮＦαに関する中
間蛍光強度は、その背景対照で見られる強度の２倍まで
行かなかった。これらの結果は、若干であるがｃｓＴＮ
Ｆαを発現する脾臓Ｔ細胞の割合は変動を示すことを示
唆している。
変動していた。これらの実験において、ｃｓＴＮＦα陽
性を示すＴ細胞のパーセントは変動を示す一方、Ｂ５
ｍＡｂを用いた染色は、Ｂ細胞および単球で見られるよ
りもずっと弱かった。Ｔ細胞のｃｓＴＮＦαに関する中
間蛍光強度は、その背景対照で見られる強度の２倍まで
行かなかった。これらの結果は、若干であるがｃｓＴＮ
Ｆαを発現する脾臓Ｔ細胞の割合は変動を示すことを示
唆している。
【００７４】Ｂ細胞のｃｓＴＮＦα発現に関する分析を
行った結果、極めて強力なｃｓＴＮＦα発現が確認され
た。脾臓Ｚで見られるように、Ｂ５ ｍＡｂと一緒にイ
ンキュベートした後のＩｇＭ＋Ｂ細胞のパーセントは上
昇していた。更に、全Ｂ細胞集団が示す染色強度は約３
倍であった。６Ｆ１１対照抗体を用いた場合全く染色の
増大は見られず、このことは、Ｂ細胞に関するＢ５染色
が特異的であることを示している。
行った結果、極めて強力なｃｓＴＮＦα発現が確認され
た。脾臓Ｚで見られるように、Ｂ５ ｍＡｂと一緒にイ
ンキュベートした後のＩｇＭ＋Ｂ細胞のパーセントは上
昇していた。更に、全Ｂ細胞集団が示す染色強度は約３
倍であった。６Ｆ１１対照抗体を用いた場合全く染色の
増大は見られず、このことは、Ｂ細胞に関するＢ５染色
が特異的であることを示している。
【００７５】これらの分析に、多反応性を示すｍＡｂで
ある７Ｔ１とＨ５を含めた。これらの抗体は、ＴＮＦα
に結合することに加えて、他のいくつかの抗原と反応す
る。従って、これらの細胞表面結合の特異性は知られて
いない。これらがＴＮＦに結合するからばかりでなく、
固定されていない細胞に対する多反応性ｍＡｂ類の結合
に関するデータをほとんど利用することができないこと
から、我々はこれらを比較の目的で含めた。これらの抗
体は明らかにＴ細胞およびＢ細胞と反応するが、これら
は単球表面と更によく反応する。これらの抗体によるＢ
およびＴ細胞染色パーセント上昇は有意であることに加
えて、両方の実験において、単球の大部分が染色され
た。
ある７Ｔ１とＨ５を含めた。これらの抗体は、ＴＮＦα
に結合することに加えて、他のいくつかの抗原と反応す
る。従って、これらの細胞表面結合の特異性は知られて
いない。これらがＴＮＦに結合するからばかりでなく、
固定されていない細胞に対する多反応性ｍＡｂ類の結合
に関するデータをほとんど利用することができないこと
から、我々はこれらを比較の目的で含めた。これらの抗
体は明らかにＴ細胞およびＢ細胞と反応するが、これら
は単球表面と更によく反応する。これらの抗体によるＢ
およびＴ細胞染色パーセント上昇は有意であることに加
えて、両方の実験において、単球の大部分が染色され
た。
【００７６】これらのデータは、Ｂ５抗ＴＮＦα ｍＡ
ｂはＢおよびＴ細胞子孫の脾臓リンパ球と反応し得ると
共に脾臓単球を認識してそれらと結合し得ることを示唆
している。
ｂはＢおよびＴ細胞子孫の脾臓リンパ球と反応し得ると
共に脾臓単球を認識してそれらと結合し得ることを示唆
している。
【００７７】培養したヒト脾臓細胞上のｃｓＴＮＦαに
対するＢ５結合 表７で試験した１つの個体から得られる脾臓細胞を、種
々の刺激剤と一緒にインビトロで３日間培養した後、Ｂ
５ ｍＡｂ結合に関する分析を行った。結果を表８に示
す。これらの細胞を培養した結果、単球の損失が生じた
ことで、ＬｅｕＭ３＋細胞に関するデータは示していな
い。フィコエリスリンに接合させた抗体を用いてＣＤ３
またはＣＤ１９に関する細胞染色を行うことで、フルオ
レセイン接合させたＦ（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭおよび
指示したヒトＩｇＭ ｍＡｂ類を用いた２色分析を行う
ことが可能になった。培養物の中に活性剤を全く含有さ
せなかった場合、全ての細胞で分析値が得られ、活性剤
を含有させた培養物では、大きく活性化した細胞のみで
分析値が得られた。下線を付けた値は、陽性染色された
細胞パーセントの上昇が有意であることを示している
か、或は適当な対照集団が示す蛍光強度の２倍以上であ
ることを示している。FACSCAN装置を用いて分析を行っ
た。
対するＢ５結合 表７で試験した１つの個体から得られる脾臓細胞を、種
々の刺激剤と一緒にインビトロで３日間培養した後、Ｂ
５ ｍＡｂ結合に関する分析を行った。結果を表８に示
す。これらの細胞を培養した結果、単球の損失が生じた
ことで、ＬｅｕＭ３＋細胞に関するデータは示していな
い。フィコエリスリンに接合させた抗体を用いてＣＤ３
またはＣＤ１９に関する細胞染色を行うことで、フルオ
レセイン接合させたＦ（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭおよび
指示したヒトＩｇＭ ｍＡｂ類を用いた２色分析を行う
ことが可能になった。培養物の中に活性剤を全く含有さ
せなかった場合、全ての細胞で分析値が得られ、活性剤
を含有させた培養物では、大きく活性化した細胞のみで
分析値が得られた。下線を付けた値は、陽性染色された
細胞パーセントの上昇が有意であることを示している
か、或は適当な対照集団が示す蛍光強度の２倍以上であ
ることを示している。FACSCAN装置を用いて分析を行っ
た。
【００７８】
【表５】
【００７９】培地内で培養した細胞の５５％はＣＤ１９
＋（Ｂ細胞）であり２２％はＣＤ３＋（Ｔ細胞）であっ
た。ＣＤ１９＋細胞の中の８５％は、中間チャンネル強
度が５４のｓＩｇＭ＋であった。Ｂ５ ｍＡｂで染色す
ることにより、この強度は中間チャンネル２９４の所ま
で上昇した、即ちほとんど６倍高くなった。このような
上昇は、多反応性を示すＩｇＭ ｍＡｂまたは対照Ｉｇ
Ｍ ｍＡｂ類を用いた場合見られなかった。Ｂ５ ｍＡｂ
と結合するＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントが上昇すること
も見られるが、この染色強度は低かった。抗ＩｇＭ単独
でもいくらかＴ細胞染色を生じるが、これらのＴ細胞に
６Ｆ１１を添加しても、抗ＩｇＭ染色の増大は全く生じ
ず、このことは、Ｂ５染色が特異的であることを示して
いると共に、このＢ５ ｍＡｂは、活性化されたＴ細胞
上に発現するＩｇＭレセプタに結合しないことを示唆し
ている。恐らくは、これらのレセプタは既に占拠されて
おり、抗ＩｇＭ二次抗体で観察される背景染色を説明す
るものである。
＋（Ｂ細胞）であり２２％はＣＤ３＋（Ｔ細胞）であっ
た。ＣＤ１９＋細胞の中の８５％は、中間チャンネル強
度が５４のｓＩｇＭ＋であった。Ｂ５ ｍＡｂで染色す
ることにより、この強度は中間チャンネル２９４の所ま
で上昇した、即ちほとんど６倍高くなった。このような
上昇は、多反応性を示すＩｇＭ ｍＡｂまたは対照Ｉｇ
Ｍ ｍＡｂ類を用いた場合見られなかった。Ｂ５ ｍＡｂ
と結合するＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントが上昇すること
も見られるが、この染色強度は低かった。抗ＩｇＭ単独
でもいくらかＴ細胞染色を生じるが、これらのＴ細胞に
６Ｆ１１を添加しても、抗ＩｇＭ染色の増大は全く生じ
ず、このことは、Ｂ５染色が特異的であることを示して
いると共に、このＢ５ ｍＡｂは、活性化されたＴ細胞
上に発現するＩｇＭレセプタに結合しないことを示唆し
ている。恐らくは、これらのレセプタは既に占拠されて
おり、抗ＩｇＭ二次抗体で観察される背景染色を説明す
るものである。
【００８０】Ｔ細胞とＢ細胞の両方を活性化する超抗原
であるスタフィロコッカス属のエンテロトキシンＢ（Ｓ
ＥＢ）を用いた刺激により、これらのＴ細胞の約２４％
がその二次抗ヒトＩｇＭ抗体に結合した。しかしなが
ら、そのＳＥＢで活性化したＴ細胞の約６６％がＢ５抗
ＴＮＦα ｍＡｂに結合した。６Ｆ１１対照ｍＡｂを用
いた場合全くｓＩｇＭ＋Ｔ細胞増加は見られなかった。
これらのデータは、Ｔ細胞が活性化されるとｃｓＴＮＦ
α発現が誘導されることを示している。
であるスタフィロコッカス属のエンテロトキシンＢ（Ｓ
ＥＢ）を用いた刺激により、これらのＴ細胞の約２４％
がその二次抗ヒトＩｇＭ抗体に結合した。しかしなが
ら、そのＳＥＢで活性化したＴ細胞の約６６％がＢ５抗
ＴＮＦα ｍＡｂに結合した。６Ｆ１１対照ｍＡｂを用
いた場合全くｓＩｇＭ＋Ｔ細胞増加は見られなかった。
これらのデータは、Ｔ細胞が活性化されるとｃｓＴＮＦ
α発現が誘導されることを示している。
【００８１】抗ＩｇＤデキストランまたは黄色ブドウ球
菌Cowan株Ｉ（ＳＡＣ）のどちらか（両方共、効力を示
すＢ細胞マイトジェン）で活性化したＢ細胞は、Ｂ５抗
ＴＮＦα ｍＡｂによる結合を示した。ＳＡＣ誘発後に
見られるＢ５染色蛍光強度がより高いことは、抗ＩｇＤ
で活性化したＢ細胞か或は培地単独内で培養したＢ細胞
で見られるＢ細胞表面のＴＮＦα発現レベルがより高い
ことを示唆している。これらのデータは、活性化したヒ
トＢ細胞およびＴ細胞の両方共が、Ｂ５ ｍＡｂが認識
するｃｓＴＮＦαエピトープを発現することを示唆して
いる。
菌Cowan株Ｉ（ＳＡＣ）のどちらか（両方共、効力を示
すＢ細胞マイトジェン）で活性化したＢ細胞は、Ｂ５抗
ＴＮＦα ｍＡｂによる結合を示した。ＳＡＣ誘発後に
見られるＢ５染色蛍光強度がより高いことは、抗ＩｇＤ
で活性化したＢ細胞か或は培地単独内で培養したＢ細胞
で見られるＢ細胞表面のＴＮＦα発現レベルがより高い
ことを示唆している。これらのデータは、活性化したヒ
トＢ細胞およびＴ細胞の両方共が、Ｂ５ ｍＡｂが認識
するｃｓＴＮＦαエピトープを発現することを示唆して
いる。
【００８２】ヒトおよびチンパンジーの末梢血液リンパ
球に対するＢ５ ｍＡｂの結合 ヒト脾臓リンパ球がｃｓＴＮＦαを発現することの発見
を広げる目的で、ヒトおよびチンパンジー由来の末梢血
液リンパ球を試験した。表９は、２匹のチンパンジーと
１人のヒトから得られる血液を用いた時の結果を示して
いる。チンパンジーの血液は、それの採血を行って１日
後に受け取り、一方ヒトの血液は新しいものを用いた。
チンパンジーの血液を受け取ったのが遅れたことで、明
らかにその血液から単球が失われていた。Ficollを用い
て分離を行うことにより、末梢血液の単核細胞を調製し
た後、ＰＥで誘導化した抗ＣＤ３、ＣＤ１９またはＬｅ
ｕＭ３を用いた染色を行った。チンパンジーの１７１お
よび２０３に関する細胞のそれぞれ２％未満および０．
６％未満がＬｅｕＭ３＋であった。ヒト細胞の約２０．
２％がＬｅｕＭ３＋であった。これらの細胞は、チンパ
ンジーリンパ球の６２％および５４％を構成しており、
そしてヒトリンパ球の６８％を構成していた。チンパン
ジーに関するＢ細胞パーセントは２．８および５．４％
であり、そしてヒトに関しては１６．４％であった。指
示したＩｇＭ一次抗体と一緒に細胞をインキュベートし
た後、フルオレセインに接合させたＦ（ａｂ）’2抗ヒ
トＩｇＭ試薬を用いた染色を行った。FACSCAN装置を用
いて分析を行った。下線を付けた値は、陽性染色された
細胞パーセントの上昇が有意であることを示している
か、或は適当な対照集団が示す蛍光強度の２倍以上であ
ることを示している。
球に対するＢ５ ｍＡｂの結合 ヒト脾臓リンパ球がｃｓＴＮＦαを発現することの発見
を広げる目的で、ヒトおよびチンパンジー由来の末梢血
液リンパ球を試験した。表９は、２匹のチンパンジーと
１人のヒトから得られる血液を用いた時の結果を示して
いる。チンパンジーの血液は、それの採血を行って１日
後に受け取り、一方ヒトの血液は新しいものを用いた。
チンパンジーの血液を受け取ったのが遅れたことで、明
らかにその血液から単球が失われていた。Ficollを用い
て分離を行うことにより、末梢血液の単核細胞を調製し
た後、ＰＥで誘導化した抗ＣＤ３、ＣＤ１９またはＬｅ
ｕＭ３を用いた染色を行った。チンパンジーの１７１お
よび２０３に関する細胞のそれぞれ２％未満および０．
６％未満がＬｅｕＭ３＋であった。ヒト細胞の約２０．
２％がＬｅｕＭ３＋であった。これらの細胞は、チンパ
ンジーリンパ球の６２％および５４％を構成しており、
そしてヒトリンパ球の６８％を構成していた。チンパン
ジーに関するＢ細胞パーセントは２．８および５．４％
であり、そしてヒトに関しては１６．４％であった。指
示したＩｇＭ一次抗体と一緒に細胞をインキュベートし
た後、フルオレセインに接合させたＦ（ａｂ）’2抗ヒ
トＩｇＭ試薬を用いた染色を行った。FACSCAN装置を用
いて分析を行った。下線を付けた値は、陽性染色された
細胞パーセントの上昇が有意であることを示している
か、或は適当な対照集団が示す蛍光強度の２倍以上であ
ることを示している。
【００８３】
【表６】
【００８４】ヒト脾臓を用いた前の結果とは対照的に、
この新鮮な末梢ヒト単球は、Ｂ５ｍＡｂを用いたとき見
られるようにｃｓＴＮＦαを発現しなかった。しかしな
がら、これらの細胞の有意な画分は、多反応性を示すｍ
Ａｂである７Ｔ１およびＨ５と結合した。
この新鮮な末梢ヒト単球は、Ｂ５ｍＡｂを用いたとき見
られるようにｃｓＴＮＦαを発現しなかった。しかしな
がら、これらの細胞の有意な画分は、多反応性を示すｍ
Ａｂである７Ｔ１およびＨ５と結合した。
【００８５】この新鮮なヒトＴ細胞は表面ＩｇＭを発現
しなかったが、１日前に採取したチンパンジーＴ細胞は
発現した。しかしながら、両方の種から得たＴ細胞は、
Ｂ５ｍＡｂを用いたとき検出される中間量でｃｓＴＮＦ
αを発現した。しかしながら、このような抗ＴＮＦα染
色は非常に弱く、このことは、存在しているｃｓＴＮＦ
αレベルが低いことを示唆している。両方の種から得ら
れるＴ細胞は、多反応性を示す７Ｔ１またはＨ５に認識
された。
しなかったが、１日前に採取したチンパンジーＴ細胞は
発現した。しかしながら、両方の種から得たＴ細胞は、
Ｂ５ｍＡｂを用いたとき検出される中間量でｃｓＴＮＦ
αを発現した。しかしながら、このような抗ＴＮＦα染
色は非常に弱く、このことは、存在しているｃｓＴＮＦ
αレベルが低いことを示唆している。両方の種から得ら
れるＴ細胞は、多反応性を示す７Ｔ１またはＨ５に認識
された。
【００８６】これらのＴ細胞とは対照的に、チンパンジ
ーおよびヒトの両方から得られる末梢血液Ｂ細胞は、Ｂ
５ ｍＡｂを用いたとき見られる高レベルでｃｓＴＮＦ
αを表した。この発現は、Ｔ細胞で見られるよりもずっ
と高強度であった。これらの結果は、通常のヒト末梢血
液単球はｃｓＴＮＦαを発現しない一方、両方の種から
得られるいくつかのＴリンパ球および大部分のＢリンパ
球はこの細胞表面サイトカインを発現することを示唆し
ている。
ーおよびヒトの両方から得られる末梢血液Ｂ細胞は、Ｂ
５ ｍＡｂを用いたとき見られる高レベルでｃｓＴＮＦ
αを表した。この発現は、Ｔ細胞で見られるよりもずっ
と高強度であった。これらの結果は、通常のヒト末梢血
液単球はｃｓＴＮＦαを発現しない一方、両方の種から
得られるいくつかのＴリンパ球および大部分のＢリンパ
球はこの細胞表面サイトカインを発現することを示唆し
ている。
【００８７】Ｂ５抗ＴＮＦα ｍＡｂは、ＴＨＰ−１細
胞によるＬＰＳ誘発ＴＮＦα分泌を阻害する。
胞によるＬＰＳ誘発ＴＮＦα分泌を阻害する。
【００８８】ｃｓＴＮＦαに対するＢ５ ｍＡｂ結合が
何らかの機能的有意さを有しているか否かを試験する目
的で、我々は、Ｂ５もしくは他のヒトＩｇＭ ｍＡｂ類
存在下、ＬＰＳを用いてＴＨＰ−１ヒト単球細胞系を刺
激した。我々は、ＴＮＦαに感受性を示すＷＥＨＩ １
６４細胞系の上澄み液が示す細胞毒性活性を測定するこ
とによって、生物学的活性を示すＴＮＦαの分泌を評価
した。４つの上記実験の２つに関する結果を表１０に示
す。指示したＴＮＦ非中和ヒトＩｇＭ ｍＡｂ類を４０
ｕｇ／ｍＬ存在させて、１００ｎｇ／ｍＬの大腸菌ＬＰ
ＳでＴＨＰ−１細胞を４時間刺激した。これらの培養物
から得られる上澄み液を、次に、ＴＮＦαに敏感性を示
すＷＥＨＩ １６４細胞系に対する細胞毒性に関して試
験した。全ての上澄み液細胞毒性は濃度依存性を示し、
Ａ１０Ｇ１０抗ＴＮＦα ｍＡｂで中和されることによ
り、この細胞毒性はＴＮＦαによるものであることが示
された。標準曲線と比較することにより、分泌されたＴ
ＮＦα濃度を測定した。
何らかの機能的有意さを有しているか否かを試験する目
的で、我々は、Ｂ５もしくは他のヒトＩｇＭ ｍＡｂ類
存在下、ＬＰＳを用いてＴＨＰ−１ヒト単球細胞系を刺
激した。我々は、ＴＮＦαに感受性を示すＷＥＨＩ １
６４細胞系の上澄み液が示す細胞毒性活性を測定するこ
とによって、生物学的活性を示すＴＮＦαの分泌を評価
した。４つの上記実験の２つに関する結果を表１０に示
す。指示したＴＮＦ非中和ヒトＩｇＭ ｍＡｂ類を４０
ｕｇ／ｍＬ存在させて、１００ｎｇ／ｍＬの大腸菌ＬＰ
ＳでＴＨＰ−１細胞を４時間刺激した。これらの培養物
から得られる上澄み液を、次に、ＴＮＦαに敏感性を示
すＷＥＨＩ １６４細胞系に対する細胞毒性に関して試
験した。全ての上澄み液細胞毒性は濃度依存性を示し、
Ａ１０Ｇ１０抗ＴＮＦα ｍＡｂで中和されることによ
り、この細胞毒性はＴＮＦαによるものであることが示
された。標準曲線と比較することにより、分泌されたＴ
ＮＦα濃度を測定した。
【００８９】 表１０ Ｂ５ ｍＡｂによるＬＰＳ誘発ＴＮＦα分泌阻害実験 ｍＡｂ ｕｇ／ｍＬ ＴＮＦα（ｐｇ／ｍＬ） 阻害（％） 1 なし 0 1003 0 6F11 40 990 1 7T1 40 976 3 B5 40 102 90 〃 20 409 59 〃 10 812 19 〃 5 962 4 ────────────────────────────────── 2 なし 0 2057 0 6F11 40 1992 3 B5 40 143 93 〃 20 783 62 〃 10 1271 38 〃 5 2276 -10 刺激されたＴＨＰ−１細胞は、活性を示すＴＮＦαを分
泌し、そして細胞毒性アッセイの中にＡ１０Ｇ１０を含
有させると、上記細胞毒性活性の全てが阻害された（デ
ータは示していない）。細胞毒性アッセイの中にＢ５
ｍＡｂを含めた前の実験は、Ｂ５はＴＮＦαを中和しな
いことを示していた（図１４）。表１０は、ＴＨＰ−１
細胞とＢ５ ｍＡｂとの共培養物はＬＰＳ誘発ＴＮＦα
分泌を阻害することを示している。これらのデータは、
ｃｓＴＮＦαとのＢ５ ｍＡｂ相互作用はＬＰＳ誘発Ｔ
ＮＦ分泌を阻害し得ることを示唆している。
泌し、そして細胞毒性アッセイの中にＡ１０Ｇ１０を含
有させると、上記細胞毒性活性の全てが阻害された（デ
ータは示していない）。細胞毒性アッセイの中にＢ５
ｍＡｂを含めた前の実験は、Ｂ５はＴＮＦαを中和しな
いことを示していた（図１４）。表１０は、ＴＨＰ−１
細胞とＢ５ ｍＡｂとの共培養物はＬＰＳ誘発ＴＮＦα
分泌を阻害することを示している。これらのデータは、
ｃｓＴＮＦαとのＢ５ ｍＡｂ相互作用はＬＰＳ誘発Ｔ
ＮＦ分泌を阻害し得ることを示唆している。
【００９０】この開示の抗体が示す追加的特徴は、以下
の表１１に示すように、ヒトリンパ系細胞のマイトジェ
ン誘発増殖の阻害を仲介する目的でこれらが用いられる
得る点である。
の表１１に示すように、ヒトリンパ系細胞のマイトジェ
ン誘発増殖の阻害を仲介する目的でこれらが用いられる
得る点である。
【００９１】 表１１ ヒトリンパ系細胞のマイトジェン誘発増殖に関するＢ５ ｍＡｂ仲介阻害 培養物に添加した抗体（ｃｍｐ ｘ 10-3）マイトジェン なし Ｂ５ ６Ｆ１１ なし 200 100 200 抗ＩｇＤデキストラン＋ＩＬ−２ 6150 2550 5450 パンソルビン（Pansorbin） 4650 2450 4450 ＥＢＶ 1300 600 900 指示したマイトジェンおよび抗体と一緒にヒト脾臓細胞
を３日間培養した。その最終日に３ＨＴｄＲを６時間添
加した後、細胞を収穫し、そしてチミジン取り込みを評
価した。
を３日間培養した。その最終日に３ＨＴｄＲを６時間添
加した後、細胞を収穫し、そしてチミジン取り込みを評
価した。
【００９２】
【発明の有効性】本出願のｍＡｂ類はいくつかの有効な
特徴を示す。
特徴を示す。
【００９３】最初に、本開示のヒトモノクローナル抗Ｔ
ＮＦ抗体を用いることで、通常のイムノアッセイ技術を
用いてＴＮＦをインビトロで検出および／または測定す
ることができる。例えば、これらを診断様式で用いて、
ヒトおよびマウス細胞、および恐らくは他の種由来の細
胞上の、細胞表面ＴＮＦ発現を評価することができる。
ＮＦ抗体を用いることで、通常のイムノアッセイ技術を
用いてＴＮＦをインビトロで検出および／または測定す
ることができる。例えば、これらを診断様式で用いて、
ヒトおよびマウス細胞、および恐らくは他の種由来の細
胞上の、細胞表面ＴＮＦ発現を評価することができる。
【００９４】２番目として、この抗体は、表面ＴＮＦを
発現する細胞に結合することにより、補体結合を通して
これらの細胞の死滅を開始させ得る。これは、表面ＴＮ
Ｆを発現する細胞を除去するに有効であり得る。例え
ば、患者から細胞を取り出し、この抗体と補体で処理す
るか、或はこの抗体が結合する細胞の細胞毒性をもたら
す同様な試薬で処理した後、その残存している細胞を再
びそのドナーに戻してもよい。これは、患者から末梢Ｂ
細胞白血病細胞を除去するに有効であるか、或は表面Ｔ
ＮＦを発現する他の白血病細胞を除去するに有効であり
得る。
発現する細胞に結合することにより、補体結合を通して
これらの細胞の死滅を開始させ得る。これは、表面ＴＮ
Ｆを発現する細胞を除去するに有効であり得る。例え
ば、患者から細胞を取り出し、この抗体と補体で処理す
るか、或はこの抗体が結合する細胞の細胞毒性をもたら
す同様な試薬で処理した後、その残存している細胞を再
びそのドナーに戻してもよい。これは、患者から末梢Ｂ
細胞白血病細胞を除去するに有効であるか、或は表面Ｔ
ＮＦを発現する他の白血病細胞を除去するに有効であり
得る。
【００９５】３番目として、表面ＴＮＦを発現する細胞
を死滅させるか或は除去する補助となる治療剤として、
この抗体を患者の中に導入することができる。我々は、
いくつかの癌細胞系を含む数多くの活性化された細胞が
表面ＴＮＦを発現することを示した。これらの種類の細
胞、並びに表面ＴＮＦを発現する他のものは、本抗体発
明で治療するに適当な標的となり得る。
を死滅させるか或は除去する補助となる治療剤として、
この抗体を患者の中に導入することができる。我々は、
いくつかの癌細胞系を含む数多くの活性化された細胞が
表面ＴＮＦを発現することを示した。これらの種類の細
胞、並びに表面ＴＮＦを発現する他のものは、本抗体発
明で治療するに適当な標的となり得る。
【００９６】４番目として、ＴＮＦ産生が病気の過程ま
たは状態の原因となっている患者にこの抗体を導入する
ことができる。この目的は、ＴＮＦ産生を阻害すること
である。我々は、この抗体の結合がある種の細胞による
ＴＮＦ分泌を阻害し得ることを示したことから、このよ
うな手段の治療も有益であり得る。
たは状態の原因となっている患者にこの抗体を導入する
ことができる。この目的は、ＴＮＦ産生を阻害すること
である。我々は、この抗体の結合がある種の細胞による
ＴＮＦ分泌を阻害し得ることを示したことから、このよ
うな手段の治療も有益であり得る。
【００９７】５番目として、この抗体を患者に導入し
て、表面ＴＮＦを発現する細胞の増殖を弱めるか或は抑
制することができる。我々は、マイトジェンで活性化さ
れたヒト細胞は表面ＴＮＦを発現し、これにＢ５抗体が
結合することを示した。（表１１参照）。再び、癌また
は白血病治療に特別な用途が存在し得る。
て、表面ＴＮＦを発現する細胞の増殖を弱めるか或は抑
制することができる。我々は、マイトジェンで活性化さ
れたヒト細胞は表面ＴＮＦを発現し、これにＢ５抗体が
結合することを示した。（表１１参照）。再び、癌また
は白血病治療に特別な用途が存在し得る。
【００９８】本発明が示す主要な利点は、これはヒト抗
ＴＮＦ抗体を含んでおり、そしてそれだけで、他の如何
なる種由来の抗体よりもずっと低い免疫原性を示すと期
待される点である。推定であり充分には定義されていな
い自然抗ＴＮＦ抗体のいずれもから本発明を区別してい
る特性は、それが示す特異性と結合能力である。本開示
で記述するＢ５ ｍＡｂ発明とは異なり、文献中の他の
ヒト抗体はいずれもＴＮＦ特異性を示さないことが確か
められている。
ＴＮＦ抗体を含んでおり、そしてそれだけで、他の如何
なる種由来の抗体よりもずっと低い免疫原性を示すと期
待される点である。推定であり充分には定義されていな
い自然抗ＴＮＦ抗体のいずれもから本発明を区別してい
る特性は、それが示す特異性と結合能力である。本開示
で記述するＢ５ ｍＡｂ発明とは異なり、文献中の他の
ヒト抗体はいずれもＴＮＦ特異性を示さないことが確か
められている。
【００９９】
【考察】我々の知る限りにおいて、これは、ヒトおよび
マウスＴＮＦαに特異性を示すモノクローナルヒト自己
抗体に関する最初の報告である。Ｂ５ ｍＡｂのＣＭＶ
セロポジティブ（seropositive）ドナー源が有意である
か否かは確かでない。この抗体は、Galloway他が以前に
示したように（上に引用）、ＴＮＦαに対して我々が生
じさせたマウスｍＡｂ類（これらの全ては中和を生じ
る）とは明らかに異なっている。
マウスＴＮＦαに特異性を示すモノクローナルヒト自己
抗体に関する最初の報告である。Ｂ５ ｍＡｂのＣＭＶ
セロポジティブ（seropositive）ドナー源が有意である
か否かは確かでない。この抗体は、Galloway他が以前に
示したように（上に引用）、ＴＮＦαに対して我々が生
じさせたマウスｍＡｂ類（これらの全ては中和を生じ
る）とは明らかに異なっている。
【０１００】３つの系の証拠が、Ｂ５ ｍＡｂは、その
記述したマウスｍＡｂ類が認識するエピトープとは異な
るエピトープを認識することを示唆している。１番目と
して、ＴＮＦをコートしたプレートに対する結合に関し
て、ヒトｍＡｂとマウスｍＡｂとの間には競合が存在し
ていない。２番目として、このヒトｍＡｂが結合するＴ
ＮＦは、該マウスｍＡｂ類によって認識され、そしてそ
の逆も言え得る。最後に、Ｂ５ ｍＡｂはｒｈＴＮＦα
を中和しないが、該マウスｍＡｂ類は中和する。ＴＮＦ
αは三量体であり、そしてプレートに結合させた中和マ
ウスｍＡｂ類に結合したＴＮＦαは、それとしてまだ、
ｍＡｂ Ｂ５が認識するのと同じエピトープを提示し得
るとの論議があるかもしれない。プレートに結合させた
ＴＮＦαに関する、マウスｍＡｂ類とｍＡｂ Ｂ５との
間に競合がないことは、上記可能性に対する強力な反論
である。Ｂ５ ｍＡｂが中和活性を有していないことに
加えて、その競合データは、マウスｍＡｂとヒトｍＡｂ
とが異なるエピトープ認識を行うとした解釈を支持して
いる。ＴＮＦαが示す生物学的効果、特にそれがＩｇ分
泌を促進する能力を有していることで、これらの用いた
技術では、高親和力中和ヒト抗ＴＮＦα自己抗体は生じ
得ない。このような能力はまた、Ｂ５ ｍＡｂとその３
種の中和マウスｍＡｂ類とが異なるエピトープ特異性を
示すことの説明となり得る。
記述したマウスｍＡｂ類が認識するエピトープとは異な
るエピトープを認識することを示唆している。１番目と
して、ＴＮＦをコートしたプレートに対する結合に関し
て、ヒトｍＡｂとマウスｍＡｂとの間には競合が存在し
ていない。２番目として、このヒトｍＡｂが結合するＴ
ＮＦは、該マウスｍＡｂ類によって認識され、そしてそ
の逆も言え得る。最後に、Ｂ５ ｍＡｂはｒｈＴＮＦα
を中和しないが、該マウスｍＡｂ類は中和する。ＴＮＦ
αは三量体であり、そしてプレートに結合させた中和マ
ウスｍＡｂ類に結合したＴＮＦαは、それとしてまだ、
ｍＡｂ Ｂ５が認識するのと同じエピトープを提示し得
るとの論議があるかもしれない。プレートに結合させた
ＴＮＦαに関する、マウスｍＡｂ類とｍＡｂ Ｂ５との
間に競合がないことは、上記可能性に対する強力な反論
である。Ｂ５ ｍＡｂが中和活性を有していないことに
加えて、その競合データは、マウスｍＡｂとヒトｍＡｂ
とが異なるエピトープ認識を行うとした解釈を支持して
いる。ＴＮＦαが示す生物学的効果、特にそれがＩｇ分
泌を促進する能力を有していることで、これらの用いた
技術では、高親和力中和ヒト抗ＴＮＦα自己抗体は生じ
得ない。このような能力はまた、Ｂ５ ｍＡｂとその３
種の中和マウスｍＡｂ類とが異なるエピトープ特異性を
示すことの説明となり得る。
【０１０１】カルボキシ末端に向かい合うアミノ末端を
有するベル型の三量体ＴＮＦα分子の基部は、ＴＮＦレ
セプタに結合する分子の領域である（M.J. Eck他「２．
６Å分解能における腫瘍壊死因子αの構造、レセプタ結
合に関する暗示」、J. Biol.Chem. 264:17595-605、 198
9およびA. Corti他「腫瘍壊死因子アルファの抗原領域
および構造／機能ドメインに関するそれらの地図関
係」、Molec. Immunol. 29:471-9、 1992）。この報告で
用いられているマウスｍＡｂ類はＴＮＦαを中和し、そ
してＴＮＦαがそれのレセプタに結合するのをブロック
することが見付け出されていることから、この三量体の
基部内のエピトープは上記抗体で認識される可能性があ
る。この報告の中に示されているデータから、該Ｂ５
ｍＡｂは、この三量体の「上部」により近いＴＮＦα分
子領域を識別すると予測されるかもしれない。
有するベル型の三量体ＴＮＦα分子の基部は、ＴＮＦレ
セプタに結合する分子の領域である（M.J. Eck他「２．
６Å分解能における腫瘍壊死因子αの構造、レセプタ結
合に関する暗示」、J. Biol.Chem. 264:17595-605、 198
9およびA. Corti他「腫瘍壊死因子アルファの抗原領域
および構造／機能ドメインに関するそれらの地図関
係」、Molec. Immunol. 29:471-9、 1992）。この報告で
用いられているマウスｍＡｂ類はＴＮＦαを中和し、そ
してＴＮＦαがそれのレセプタに結合するのをブロック
することが見付け出されていることから、この三量体の
基部内のエピトープは上記抗体で認識される可能性があ
る。この報告の中に示されているデータから、該Ｂ５
ｍＡｂは、この三量体の「上部」により近いＴＮＦα分
子領域を識別すると予測されるかもしれない。
【０１０２】可溶ＴＮＦαに対するＢ５ ｍＡｂの結合
が弱いことは、そのリガンドに対してこのｍＡｂが示す
結合定数が低いことと一致している。しかしながら、こ
のＩｇＭ ｍＡｂが示す原子価は、この欠点を補って余
りある可能性があり、その結果として、Ｂ５は、その試
験した高親和力中和マウス抗ＴＮＦα ｍＡｂ類と同じ
か或はそれよりも良好に、固相ＴＮＦαと結合し得る。
明らかに、利用できる抗原密度が充分である場合、多地
点結合により、このｍＡｂ Ｂ５は強力にＴＮＦαに接
着する。
が弱いことは、そのリガンドに対してこのｍＡｂが示す
結合定数が低いことと一致している。しかしながら、こ
のＩｇＭ ｍＡｂが示す原子価は、この欠点を補って余
りある可能性があり、その結果として、Ｂ５は、その試
験した高親和力中和マウス抗ＴＮＦα ｍＡｂ類と同じ
か或はそれよりも良好に、固相ＴＮＦαと結合し得る。
明らかに、利用できる抗原密度が充分である場合、多地
点結合により、このｍＡｂ Ｂ５は強力にＴＮＦαに接
着する。
【０１０３】Ｂ５は明らかに低い親和力で結合するが、
我々は、これは特異的にＴＮＦαと結合し、試験した他
の抗原のいずれとも結合しないことを示した。これは、
多反応性を示す他の２つの対照ｍＡｂが示す観察された
結合とは対照的である。従って、Ｂ５は明らかに単一特
異的であり、多反応性を示さない。Ｂ５は特異的にエピ
トープに結合すると考えられ、最も可能性が高いのは、
マウスおよびヒトＴＮＦαが共有する線形エピトープに
対する結合である。これらの特性により、Ｂ５は自己抗
体として分類され、そしてこれは、今まで記述された他
のｍＡｂ類とは異なっている。
我々は、これは特異的にＴＮＦαと結合し、試験した他
の抗原のいずれとも結合しないことを示した。これは、
多反応性を示す他の２つの対照ｍＡｂが示す観察された
結合とは対照的である。従って、Ｂ５は明らかに単一特
異的であり、多反応性を示さない。Ｂ５は特異的にエピ
トープに結合すると考えられ、最も可能性が高いのは、
マウスおよびヒトＴＮＦαが共有する線形エピトープに
対する結合である。これらの特性により、Ｂ５は自己抗
体として分類され、そしてこれは、今まで記述された他
のｍＡｂ類とは異なっている。
【０１０４】このヒトＢ５自己抗体は、幅広い範囲のヒ
ト細胞系およびリンパ系細胞上の表面ＴＮＦαに結合す
る。チンパンジー由来ＴＮＦαとヒト由来ＴＮＦαのア
ミノ酸配列の間には差がないことから、これがチンパン
ジーのＴＮＦαを認識するのは驚くにあたらない。我々
はヒトＴＮＦαに対して約８０％の同一性を示す（D.Pe
nnica他「マウス腫瘍壊死因子に関するｃＤＮＡの大腸
菌内クローニングおよび発現」、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 82:6060-4、 1985）マウスＴＮＦαをＢ５が認識
することを示した。従って、Ｂ５がマウスｃｓＴＮＦα
を認識するのは驚くにあたらない。
ト細胞系およびリンパ系細胞上の表面ＴＮＦαに結合す
る。チンパンジー由来ＴＮＦαとヒト由来ＴＮＦαのア
ミノ酸配列の間には差がないことから、これがチンパン
ジーのＴＮＦαを認識するのは驚くにあたらない。我々
はヒトＴＮＦαに対して約８０％の同一性を示す（D.Pe
nnica他「マウス腫瘍壊死因子に関するｃＤＮＡの大腸
菌内クローニングおよび発現」、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 82:6060-4、 1985）マウスＴＮＦαをＢ５が認識
することを示した。従って、Ｂ５がマウスｃｓＴＮＦα
を認識するのは驚くにあたらない。
【０１０５】他の人達も確かに、ヒトＢ細胞（M. Jaeae
telae「病気の生物学。腫瘍壊死因子−ae／カケクチン
（Cachectin）が示す生物学的活性および作用機構」、L
ab.Invest. 64:724-42、 1991およびSmeland他「通常の
ヒトＢリンパ球由来インターロイキン６のインターロイ
キン４誘発選択産生」、J. Exp. Med. 170:1463-68、198
9）、Ｔ細胞（S.-S.J. Sung他「ホルボールミリステー
トアセテートおよび抗ＣＤ３抗体で刺激したヒトＴ細胞
系および末梢血液Ｔリンパ球による腫瘍壊死因子／カケ
クチン産生」、J. Exp. Med. 167:937-、 1988）、単球
（Beutler他「カケクチンＴＮＦαの生物学：宿主応答
の主要仲介剤」、Ann. Rev. Immunol. 7:625-55、 198
9）、Ｂ細胞系（S.-S.J. Sung他「ホルボールミリステ
ートアセテートおよび抗ＣＤ３抗体で刺激したヒトＴ細
胞系および末梢血液Ｔリンパ球による腫瘍壊死因子／カ
ケクチン産生」、J. Exp. Med. 167:937-、 1988および
G.J. Jochems他「モノクローナルヒトエプスタイン・バ
ールウイルスで形質転換したＢ細胞系一団が示すサイト
カイン産生および応答性両方に関する不均一さ」、Hum.
Antibod. Hybridomas 2:57-64、 1991）、星状細胞（A.
P. Leiberman他「リポ多糖類または神経親和性ウイルス
で刺激した星状細胞による腫瘍壊死因子および他のサイ
トカイン類の産生」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 8
6:6348-52、 1989およびI.Y. Chung他「星状細胞による
腫瘍壊死因子アルファ産生：リポ多糖類、ＩＦＮ−ガン
マおよびＩＬ−１ベータによる誘発」、J. Immunol. 14
4:2999-3007、1990およびK. Selmaj他「多発硬化症病変
におけるリンフォトキシンおよび腫瘍壊死因子の同
定」、J. Clin. Invest. 87:949-54、 1991）、並びにい
くつかのＴＮＦ耐性細胞系（B.Y. Rubin他「腫瘍壊死因
子に対する耐性に関して選択した非造血細胞は腫瘍壊死
因子を産生する」、J. Exp. Med. 164:1350-5、 1986）
によるＴＮＦ産生を記述している。我々は、上記発見
を、少なくとも１種の転移性を示す乳癌ＤＵ４４７５、
メラノーマＡ３７５およびＵ３７３星状細胞腫／グリア
芽細胞腫を含めるように広げた。我々はまた、ヒト脾臓
リンパ系細胞上のｃｓＴＮＦα発現を明らかに示した。
これはいくらか驚くべきことである、と言うのは、他の
人達が以前に行ったｃｓＴＮＦα実証では活性化された
細胞を用いる傾向があったからである。
telae「病気の生物学。腫瘍壊死因子−ae／カケクチン
（Cachectin）が示す生物学的活性および作用機構」、L
ab.Invest. 64:724-42、 1991およびSmeland他「通常の
ヒトＢリンパ球由来インターロイキン６のインターロイ
キン４誘発選択産生」、J. Exp. Med. 170:1463-68、198
9）、Ｔ細胞（S.-S.J. Sung他「ホルボールミリステー
トアセテートおよび抗ＣＤ３抗体で刺激したヒトＴ細胞
系および末梢血液Ｔリンパ球による腫瘍壊死因子／カケ
クチン産生」、J. Exp. Med. 167:937-、 1988）、単球
（Beutler他「カケクチンＴＮＦαの生物学：宿主応答
の主要仲介剤」、Ann. Rev. Immunol. 7:625-55、 198
9）、Ｂ細胞系（S.-S.J. Sung他「ホルボールミリステ
ートアセテートおよび抗ＣＤ３抗体で刺激したヒトＴ細
胞系および末梢血液Ｔリンパ球による腫瘍壊死因子／カ
ケクチン産生」、J. Exp. Med. 167:937-、 1988および
G.J. Jochems他「モノクローナルヒトエプスタイン・バ
ールウイルスで形質転換したＢ細胞系一団が示すサイト
カイン産生および応答性両方に関する不均一さ」、Hum.
Antibod. Hybridomas 2:57-64、 1991）、星状細胞（A.
P. Leiberman他「リポ多糖類または神経親和性ウイルス
で刺激した星状細胞による腫瘍壊死因子および他のサイ
トカイン類の産生」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 8
6:6348-52、 1989およびI.Y. Chung他「星状細胞による
腫瘍壊死因子アルファ産生：リポ多糖類、ＩＦＮ−ガン
マおよびＩＬ−１ベータによる誘発」、J. Immunol. 14
4:2999-3007、1990およびK. Selmaj他「多発硬化症病変
におけるリンフォトキシンおよび腫瘍壊死因子の同
定」、J. Clin. Invest. 87:949-54、 1991）、並びにい
くつかのＴＮＦ耐性細胞系（B.Y. Rubin他「腫瘍壊死因
子に対する耐性に関して選択した非造血細胞は腫瘍壊死
因子を産生する」、J. Exp. Med. 164:1350-5、 1986）
によるＴＮＦ産生を記述している。我々は、上記発見
を、少なくとも１種の転移性を示す乳癌ＤＵ４４７５、
メラノーマＡ３７５およびＵ３７３星状細胞腫／グリア
芽細胞腫を含めるように広げた。我々はまた、ヒト脾臓
リンパ系細胞上のｃｓＴＮＦα発現を明らかに示した。
これはいくらか驚くべきことである、と言うのは、他の
人達が以前に行ったｃｓＴＮＦα実証では活性化された
細胞を用いる傾向があったからである。
【０１０６】我々は、光散乱特性で測定される如き小型
リンパ球を試験してきたが、これらの細胞を部分的に活
性化するか、或は上記細胞表面分子を発現し得る分化段
階にこれらを置くことも可能である。ｃｓＴＮＦαを発
現するヒト末梢血液由来Ｔリンパ球および単球のパーセ
ントが小さいことは、これらの細胞の静止表現型と一致
している。如何なる場合でも、ｃｓＴＮＦα発現が示す
幅広さは、数多くの細胞表面においてそれが重要な役割
を果していることを示唆している。
リンパ球を試験してきたが、これらの細胞を部分的に活
性化するか、或は上記細胞表面分子を発現し得る分化段
階にこれらを置くことも可能である。ｃｓＴＮＦαを発
現するヒト末梢血液由来Ｔリンパ球および単球のパーセ
ントが小さいことは、これらの細胞の静止表現型と一致
している。如何なる場合でも、ｃｓＴＮＦα発現が示す
幅広さは、数多くの細胞表面においてそれが重要な役割
を果していることを示唆している。
【０１０７】他の人達は、内在性トランスメンブラン蛋
白質、および細胞表面上のレセプタに結合している成熟
した蛋白質の両方として、ＴＮＦαが存在し得ることを
示してきた（B. Luetting他「２つの形態の膜腫瘍壊死
因子が存在していることの証拠：内在性蛋白質およびレ
セプタに結合した分子」、J. Immunol. 143:4034-38、19
89）。数人の観察者達は、Ｂ５ ｍＡｂは内在性トラン
スメンブラン蛋白質を認識すると示唆している。細胞を
ＬＰＳもしくはＰＭＡで活性化すると、Ｂ５結合が増大
した。両方の薬剤、特にＰＭＡは、種々の細胞型上のＴ
ＮＦレセプタ発現を減少させる調節を行う（A.H. Ding
他「細菌のリポ多糖類に対する応答で、マクロファージ
は急速にそれらの腫瘍壊死因子レセプタを取り込む」、
J. Biol.Chem. 264:3924-9、 1989およびB.A. Aggarwal
他「腫瘍壊死因子αのための細胞表面レセプタのダウン
レギュレーションおよび再分布に対するホルボールエス
テルの効果」、J. Biol. Chem. 262:16450-5、 1987）。
白質、および細胞表面上のレセプタに結合している成熟
した蛋白質の両方として、ＴＮＦαが存在し得ることを
示してきた（B. Luetting他「２つの形態の膜腫瘍壊死
因子が存在していることの証拠：内在性蛋白質およびレ
セプタに結合した分子」、J. Immunol. 143:4034-38、19
89）。数人の観察者達は、Ｂ５ ｍＡｂは内在性トラン
スメンブラン蛋白質を認識すると示唆している。細胞を
ＬＰＳもしくはＰＭＡで活性化すると、Ｂ５結合が増大
した。両方の薬剤、特にＰＭＡは、種々の細胞型上のＴ
ＮＦレセプタ発現を減少させる調節を行う（A.H. Ding
他「細菌のリポ多糖類に対する応答で、マクロファージ
は急速にそれらの腫瘍壊死因子レセプタを取り込む」、
J. Biol.Chem. 264:3924-9、 1989およびB.A. Aggarwal
他「腫瘍壊死因子αのための細胞表面レセプタのダウン
レギュレーションおよび再分布に対するホルボールエス
テルの効果」、J. Biol. Chem. 262:16450-5、 1987）。
【０１０８】Ｂ５は、刺激していない細胞系に結合する
が、ＴＮＦを分泌させるには通常、細胞系を誘発する必
要がある。従って、刺激なしの細胞系はＴＮＦに結合し
たレセプタをほとんど表さないと予測される。我々は、
細胞表面に対するＢ５結合は、ＴＮＦαと一緒にプレイ
ンキュベートすることによって阻害されるが、Ａ１０Ｇ
１０抗ＴＮＦα ｍＡｂでは阻害されないことを示し
た。このことは、Ｂ５抗体が特異的であることを示して
いる。
が、ＴＮＦを分泌させるには通常、細胞系を誘発する必
要がある。従って、刺激なしの細胞系はＴＮＦに結合し
たレセプタをほとんど表さないと予測される。我々は、
細胞表面に対するＢ５結合は、ＴＮＦαと一緒にプレイ
ンキュベートすることによって阻害されるが、Ａ１０Ｇ
１０抗ＴＮＦα ｍＡｂでは阻害されないことを示し
た。このことは、Ｂ５抗体が特異的であることを示して
いる。
【０１０９】ＴＮＦβは、ＴＮＦαと同じレセプタに結
合することで、これは細胞表面上のある種のレセプタと
結合したＴＮＦαと競合してそれを除去し得る。ＴＮＦ
βを高用量で用いた表６のデータは、上記が生じること
を示唆しており、そしてこれは、Ｂ５染色が低下するこ
とによって検出された。このような理由で、Ｂ５は２６
ｋｄのトランスメンブラン形態ＴＮＦαを認識すると考
えられ、そして恐らくはレセプタに結合したＴＮＦを認
識すると考えられる。
合することで、これは細胞表面上のある種のレセプタと
結合したＴＮＦαと競合してそれを除去し得る。ＴＮＦ
βを高用量で用いた表６のデータは、上記が生じること
を示唆しており、そしてこれは、Ｂ５染色が低下するこ
とによって検出された。このような理由で、Ｂ５は２６
ｋｄのトランスメンブラン形態ＴＮＦαを認識すると考
えられ、そして恐らくはレセプタに結合したＴＮＦを認
識すると考えられる。
【０１１０】上記研究の１つの混乱させる結果は、Ａ１
０Ｇ１０結合が生じないか或はＢ５で見られるよりも低
い多くの場合において、Ｂ５ ｍＡｂがｃｓＴＮＦαに
結合する点である。これらの２種の抗体は、重複してい
ないエピトープを識別するのは明らかである。Ａ１０Ｇ
１０はＴＮＦα細胞毒性を中和してＴＮＦαがそれのレ
セプタに結合するのを防止していることから、このマウ
スｍＡｂは、恐らくは、そのレセプタ結合ドメイン近く
でＴＮＦαに結合するのであろう。
０Ｇ１０結合が生じないか或はＢ５で見られるよりも低
い多くの場合において、Ｂ５ ｍＡｂがｃｓＴＮＦαに
結合する点である。これらの２種の抗体は、重複してい
ないエピトープを識別するのは明らかである。Ａ１０Ｇ
１０はＴＮＦα細胞毒性を中和してＴＮＦαがそれのレ
セプタに結合するのを防止していることから、このマウ
スｍＡｂは、恐らくは、そのレセプタ結合ドメイン近く
でＴＮＦαに結合するのであろう。
【０１１１】他の人達は、アミノ末端の１５個に近いア
ミノ酸に結合するｍＡｂがＴＮＦα細胞毒性をブロック
することを示した（S.H. Socher他「細胞表面レセプタ
に腫瘍壊死因子が結合するのを、それが有するアミノ酸
１−１５に対する抗体がブロックしている」、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 84:8829-33、 1987）。従って、ト
ランスメンブラン形態のＴＮＦα上の最も膜基部に近い
Ｎ末端アミノ酸のいくつかとＡ１０Ｇ１０とが結合する
可能性がある。このＴＮＦ分子それ自身が存在していた
としても、上記領域は、Ａ１０Ｇ１０が結合を生じるに
は近付き難い領域であるが、これをＢ５ ｍＡｂが認識
し得る。
ミノ酸に結合するｍＡｂがＴＮＦα細胞毒性をブロック
することを示した（S.H. Socher他「細胞表面レセプタ
に腫瘍壊死因子が結合するのを、それが有するアミノ酸
１−１５に対する抗体がブロックしている」、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 84:8829-33、 1987）。従って、ト
ランスメンブラン形態のＴＮＦα上の最も膜基部に近い
Ｎ末端アミノ酸のいくつかとＡ１０Ｇ１０とが結合する
可能性がある。このＴＮＦ分子それ自身が存在していた
としても、上記領域は、Ａ１０Ｇ１０が結合を生じるに
は近付き難い領域であるが、これをＢ５ ｍＡｂが認識
し得る。
【０１１２】ウエスタンブロッティング実験により、Ａ
１０Ｇ１０はＴＮＦα単量体を認識しないが、恐らくは
配座エピトープを認識するであろうことが示唆されてい
る（データを示していない）。トランスメンブランＴＮ
Ｆαは主に単量体である場合、Ａ１０Ｇ１０が認識する
エピトープ類は存在していない可能性がある。追加的実
験により、これらのおよび他の可能性を決定する補助を
得ることができる。
１０Ｇ１０はＴＮＦα単量体を認識しないが、恐らくは
配座エピトープを認識するであろうことが示唆されてい
る（データを示していない）。トランスメンブランＴＮ
Ｆαは主に単量体である場合、Ａ１０Ｇ１０が認識する
エピトープ類は存在していない可能性がある。追加的実
験により、これらのおよび他の可能性を決定する補助を
得ることができる。
【０１１３】興味の持たれることには、我々は、細胞を
ＬＰＳで活性化するとＡ１０Ｇ１０が細胞表面結合を生
じることを観察した。このような誘発により、生物学的
活性を示すＴＮＦα三量体が分泌され、これがその後、
残存しているＴＮＦレセプタと結合し得る。三量体ＴＮ
Ｆαは多原子価を示すことから、これは、残存している
レセプタの結合ドメインの１つまたは２つさえも遊離状
態で残存させる様式で、ある種のレセプタと結合し得
る。Ａ１０Ｇ１０が認識するのはこのような形態のｃｓ
ＴＮＦαであろう。実際、他の人達は、活性化していな
い、パラホルムアルデヒドで固定化したヒト単球をＴＮ
Ｆαと一緒に培養すると、ＴＮＦαはそれのレセプタと
結合して、これらの単球が細胞毒性を示すようになるこ
とを示した。更に、このような細胞毒性は、中和抗ＴＮ
Ｆ抗体によって無くなる（A Nii他「腫瘍壊死因子アル
ファと一緒にヒト血液単球をインキュベートすると、腫
瘍壊死因子に感受性を示す腫瘍細胞の細胞溶解がもたら
されるが耐性を示す腫瘍細胞の溶解はもたらされな
い」、Lymphokine Res. 9:113-24、 1990）。
ＬＰＳで活性化するとＡ１０Ｇ１０が細胞表面結合を生
じることを観察した。このような誘発により、生物学的
活性を示すＴＮＦα三量体が分泌され、これがその後、
残存しているＴＮＦレセプタと結合し得る。三量体ＴＮ
Ｆαは多原子価を示すことから、これは、残存している
レセプタの結合ドメインの１つまたは２つさえも遊離状
態で残存させる様式で、ある種のレセプタと結合し得
る。Ａ１０Ｇ１０が認識するのはこのような形態のｃｓ
ＴＮＦαであろう。実際、他の人達は、活性化していな
い、パラホルムアルデヒドで固定化したヒト単球をＴＮ
Ｆαと一緒に培養すると、ＴＮＦαはそれのレセプタと
結合して、これらの単球が細胞毒性を示すようになるこ
とを示した。更に、このような細胞毒性は、中和抗ＴＮ
Ｆ抗体によって無くなる（A Nii他「腫瘍壊死因子アル
ファと一緒にヒト血液単球をインキュベートすると、腫
瘍壊死因子に感受性を示す腫瘍細胞の細胞溶解がもたら
されるが耐性を示す腫瘍細胞の溶解はもたらされな
い」、Lymphokine Res. 9:113-24、 1990）。
【０１１４】これらのデータの多くを説明する１つのモ
デルは、Ｂ５ ｍＡｂがトランスメンブランＴＮＦα単
量体を認識するということである。我々は、Ｂ５による
可溶単量体認識を示した。細胞表面ＴＮＦα単量体は、
三量体ＴＮＦのそれとは異なる全体的構造を示す可能性
がある。これらは、ＴＮＦレセプタ結合ドメインを暴露
し、その結果として、細胞接触による細胞毒性を仲介す
る能力を有し得る。数多くの単量体を発現する細胞は、
従って、標的細胞上でＴＮＦレセプタ架橋を生じ得る。
活性化シグナルは、細胞膜内のＴＮＦ単量体重合を生じ
させることで、構造変化をもたらす可能性があり、これ
が今度は、生物学的活性を示す成熟した三量体ＴＮＦα
の放出をもたらす蛋白質分解開裂部位の暴露を生じさせ
得る。放出に続いて、ＴＮＦレセプタとの相互作用が生
じ、これによって、上に示唆した如きＡ１０Ｇ１０結合
を可能にし得る。Ｂ５は明らかに、膜遠方のＴＮＦドメ
インに結合し、そうすることによって、ｃｓＴＮＦα重
合か、その後の構造的変化か、或はそれの両方を妨害し
得る。Ｂ５は恐らくはその蛋白質分解開裂部位には結合
しないであろう、と言うのは、これは、その成熟した三
量体分子と結合するからである。このようなモデルは、
細胞表面染色に関する結果を説明すると共にまた、ＴＨ
Ｐ−１細胞をＬＰＳで活性化した後のＴＮＦ分泌に関し
て観察された阻害を説明するものである。このようなモ
デルは、ｃｓＴＮＦα重合で細胞質ドメインが果す役割
を考慮したものであることを特記する。これは単に実用
モデルであり、これはそれに相応して、明らかに仮説で
ある。
デルは、Ｂ５ ｍＡｂがトランスメンブランＴＮＦα単
量体を認識するということである。我々は、Ｂ５による
可溶単量体認識を示した。細胞表面ＴＮＦα単量体は、
三量体ＴＮＦのそれとは異なる全体的構造を示す可能性
がある。これらは、ＴＮＦレセプタ結合ドメインを暴露
し、その結果として、細胞接触による細胞毒性を仲介す
る能力を有し得る。数多くの単量体を発現する細胞は、
従って、標的細胞上でＴＮＦレセプタ架橋を生じ得る。
活性化シグナルは、細胞膜内のＴＮＦ単量体重合を生じ
させることで、構造変化をもたらす可能性があり、これ
が今度は、生物学的活性を示す成熟した三量体ＴＮＦα
の放出をもたらす蛋白質分解開裂部位の暴露を生じさせ
得る。放出に続いて、ＴＮＦレセプタとの相互作用が生
じ、これによって、上に示唆した如きＡ１０Ｇ１０結合
を可能にし得る。Ｂ５は明らかに、膜遠方のＴＮＦドメ
インに結合し、そうすることによって、ｃｓＴＮＦα重
合か、その後の構造的変化か、或はそれの両方を妨害し
得る。Ｂ５は恐らくはその蛋白質分解開裂部位には結合
しないであろう、と言うのは、これは、その成熟した三
量体分子と結合するからである。このようなモデルは、
細胞表面染色に関する結果を説明すると共にまた、ＴＨ
Ｐ−１細胞をＬＰＳで活性化した後のＴＮＦ分泌に関し
て観察された阻害を説明するものである。このようなモ
デルは、ｃｓＴＮＦα重合で細胞質ドメインが果す役割
を考慮したものであることを特記する。これは単に実用
モデルであり、これはそれに相応して、明らかに仮説で
ある。
【０１１５】本発明は、本発明の精神もしくは必須特徴
から逸脱することなく、他の特定形態で具体化され得
る。従って、本態様は、全ての面において説明的である
と見なされ、制限的であると見なされるべきでなく、本
発明の範囲を、上記記述ではなく添付請求の範囲の中に
示す。従って、これらの請求の範囲が有する意味および
相当する範囲内に入る全ての変化をそこに包含させるこ
とを意図している。
から逸脱することなく、他の特定形態で具体化され得
る。従って、本態様は、全ての面において説明的である
と見なされ、制限的であると見なされるべきでなく、本
発明の範囲を、上記記述ではなく添付請求の範囲の中に
示す。従って、これらの請求の範囲が有する意味および
相当する範囲内に入る全ての変化をそこに包含させるこ
とを意図している。
【０１１６】上記実施例を与えることにより、本分野の
技術者に変形が思い浮かぶものと考えられる。従って、
上記実施例は説明として見なされるべきであり、そして
本発明の範囲は請求の範囲によってのみ限定されるべき
ものであると意図する。
技術者に変形が思い浮かぶものと考えられる。従って、
上記実施例は説明として見なされるべきであり、そして
本発明の範囲は請求の範囲によってのみ限定されるべき
ものであると意図する。
【０１１７】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。
ある。
【０１１８】１． ヒト腫瘍壊死因子アルファに結合す
るヒトモノクローナル抗体を含んでいる組成物。
るヒトモノクローナル抗体を含んでいる組成物。
【０１１９】２． 該抗体がＩｇＭ型の抗体を含んでい
る上記第１項の組成物。
る上記第１項の組成物。
【０１２０】３． 該抗体がＩｇＧ型の抗体を含んでい
る上記第１項の組成物。
る上記第１項の組成物。
【０１２１】４． 薬学的に許容される担体内の上記第
１項の組成物。
１項の組成物。
【０１２２】５． 該抗体が静脈投与に適切である上記
第１項の組成物。
第１項の組成物。
【０１２３】６． 該抗体がまたマウス腫瘍壊死因子ア
ルファに結合する上記第１項の組成物。
ルファに結合する上記第１項の組成物。
【０１２４】７． 該抗体が腫瘍壊死因子アルファの非
中和エピトープに結合し得る上記第１項の組成物。
中和エピトープに結合し得る上記第１項の組成物。
【０１２５】８． 該抗体が腫瘍壊死因子アルファに特
異的である上記第１項の組成物。
異的である上記第１項の組成物。
【０１２６】９． 該抗体がヒト細胞表面上の腫瘍壊死
因子アルファに結合する上記第１項の組成物。
因子アルファに結合する上記第１項の組成物。
【０１２７】１０． 該抗体が腫瘍壊死因子アルファの
分泌を阻害する上記第１項の組成物。 １１． 該抗体が、Ｆ７８−１Ａ１０−Ｂ５（ＡＴＣＣ
寄託ＣＲＬ１１３０６）で表示される細胞系から発現す
る上記第１項の組成物。
分泌を阻害する上記第１項の組成物。 １１． 該抗体が、Ｆ７８−１Ａ１０−Ｂ５（ＡＴＣＣ
寄託ＣＲＬ１１３０６）で表示される細胞系から発現す
る上記第１項の組成物。
【０１２８】１２． 特異的にヒトＴＮＦアルファに結
合し、そしてＥＬＩＳＡで試験した時、３種の高親和力
中和マウスモノクローナル抗体に匹敵するタイターを示
すことによって特徴づけられる、ヒトモノクローナル抗
体調合物。
合し、そしてＥＬＩＳＡで試験した時、３種の高親和力
中和マウスモノクローナル抗体に匹敵するタイターを示
すことによって特徴づけられる、ヒトモノクローナル抗
体調合物。
【０１２９】１３． ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、単球、並び
にヒト由来の単球子孫を基とするリンパ細胞系から成る
群から選択される細胞上の細胞表面ＴＮＦアルファに結
合することを更に特徴とする上記第１１項の抗体。
にヒト由来の単球子孫を基とするリンパ細胞系から成る
群から選択される細胞上の細胞表面ＴＮＦアルファに結
合することを更に特徴とする上記第１１項の抗体。
【０１３０】１４． ヒト単球様細胞によるＬＰＳ誘発
ＴＮＦアルファ分泌を阻害することを更に特徴とする上
記第１１項の抗体。
ＴＮＦアルファ分泌を阻害することを更に特徴とする上
記第１１項の抗体。
【図１】Ｂ５（ヒト）およびＡ１０Ｇ１０（マウス）モ
ノクローナル抗体をｒｈＴＮＦαに結合させる固相ＥＬ
ＩＳＡフォーマットの比較をグラフフォーマットそれぞ
れ（Ａ）および（Ｂ）に示している。ＥＬＩＳＡプレー
トにＴＮＦを種々の濃度でコートした後、滴定量でｍＡ
ｂを結合させた。そこに示されているのは、種々のＴＮ
Ｆコーティング濃度に対する各抗体の結合曲線である。
ノクローナル抗体をｒｈＴＮＦαに結合させる固相ＥＬ
ＩＳＡフォーマットの比較をグラフフォーマットそれぞ
れ（Ａ）および（Ｂ）に示している。ＥＬＩＳＡプレー
トにＴＮＦを種々の濃度でコートした後、滴定量でｍＡ
ｂを結合させた。そこに示されているのは、種々のＴＮ
Ｆコーティング濃度に対する各抗体の結合曲線である。
【図２】マウスｍＡｂとＢ５ ｍＡｂの間にはＴＮＦα
への結合に関する競合がないことをグラフフォーマット
でそれぞれ示している。（Ａ）は、固相ｒｈＴＮＦαに
対する３種のマウス抗ＴＮＦ ｍＡｂの結合、およびそ
れに対する対照Ｃ７Ｆ７抗ｒＦＶＩＩＩ ｍＡｂ結合を
示している。（Ｂ）は、最初にマウスモノクローナルを
ＴＮＦプレートに結合させた後Ｂ５抗体を添加した場
合、プレートに結合したＴＮＦへのＢ５結合が阻害され
ないことを示している。
への結合に関する競合がないことをグラフフォーマット
でそれぞれ示している。（Ａ）は、固相ｒｈＴＮＦαに
対する３種のマウス抗ＴＮＦ ｍＡｂの結合、およびそ
れに対する対照Ｃ７Ｆ７抗ｒＦＶＩＩＩ ｍＡｂ結合を
示している。（Ｂ）は、最初にマウスモノクローナルを
ＴＮＦプレートに結合させた後Ｂ５抗体を添加した場
合、プレートに結合したＴＮＦへのＢ５結合が阻害され
ないことを示している。
【図３】マウスｍＡｂであるＡ１０Ｇ１０、Ｂ６および
Ａ６をプレートに結合させることから成る組み合わせに
よって複合体として捕捉されそして提示されたｒｈＴＮ
Ｆαに対するヒトＩｇＭ抗ＴＮＦ ｍＡｂの結合を棒グ
ラフフォーマットで示している。ＥＬＩＳＡプレートに
これらの３種のマウスｍＡｂをプレコートした後、ｒｈ
ＴＮＦαと一緒にインキュベートした。プレートを洗浄
した後、指示したヒトＩｇＭ ｍＡｂを２０ｕｇ／ｍＬ
で結合させた。濃い棒グラフは、ＴＮＦと一緒にインキ
ュベートした、上記３種マウスｍＡｂへのヒトＩｇＭ
ｍＡｂの結合を示しており、そして斜線を付けた棒グラ
フは、これらの結合させたマウスｍＡｂをＴＮＦに暴露
しなかった時のＩｇＭ ｍＡｂの結合を示している。
Ａ６をプレートに結合させることから成る組み合わせに
よって複合体として捕捉されそして提示されたｒｈＴＮ
Ｆαに対するヒトＩｇＭ抗ＴＮＦ ｍＡｂの結合を棒グ
ラフフォーマットで示している。ＥＬＩＳＡプレートに
これらの３種のマウスｍＡｂをプレコートした後、ｒｈ
ＴＮＦαと一緒にインキュベートした。プレートを洗浄
した後、指示したヒトＩｇＭ ｍＡｂを２０ｕｇ／ｍＬ
で結合させた。濃い棒グラフは、ＴＮＦと一緒にインキ
ュベートした、上記３種マウスｍＡｂへのヒトＩｇＭ
ｍＡｂの結合を示しており、そして斜線を付けた棒グラ
フは、これらの結合させたマウスｍＡｂをＴＮＦに暴露
しなかった時のＩｇＭ ｍＡｂの結合を示している。
【図４】いくつかのモノクローナル抗体が示す結合特異
性に関する分析結果を多数のグラフフォーマットで示し
ている。組換え型ヒトＴＮＦα（■）、組換え型ヒトリ
ンホトキシン（◆）、ヒトインシュリン（□）、ブタチ
ログロブリン（▲）、ＢＳＡ（○）、ｓｓＤＮＡ
（■）、ｄｓＤＮＡ（ 【】）またはヒトＩｇＧＦｃフラグメント（△）のどれ
かでプレートをプレコートした。マウスｍＡｂであるＡ
１０Ｇ１０をＥＬＩＳＡで評価したものである。
性に関する分析結果を多数のグラフフォーマットで示し
ている。組換え型ヒトＴＮＦα（■）、組換え型ヒトリ
ンホトキシン（◆）、ヒトインシュリン（□）、ブタチ
ログロブリン（▲）、ＢＳＡ（○）、ｓｓＤＮＡ
（■）、ｄｓＤＮＡ（ 【】）またはヒトＩｇＧＦｃフラグメント（△）のどれ
かでプレートをプレコートした。マウスｍＡｂであるＡ
１０Ｇ１０をＥＬＩＳＡで評価したものである。
【図５】図４と同様なグラフフォーマットで、ヒトＩｇ
ＭｍＡｂであるＢ５をＥＬＩＳＡで評価したものであ
る。
ＭｍＡｂであるＢ５をＥＬＩＳＡで評価したものであ
る。
【図６】図４と同様なグラフフォーマットで、ヒトＩｇ
ＭｍＡｂである７Ｔ１をＥＬＩＳＡで評価したものであ
る。
ＭｍＡｂである７Ｔ１をＥＬＩＳＡで評価したものであ
る。
【図７】図４と同様なグラフフォーマットで、ヒトＩｇ
ＭｍＡｂであるＨ５をＥＬＩＳＡで評価したものであ
る。
ＭｍＡｂであるＨ５をＥＬＩＳＡで評価したものであ
る。
【図８】図４と同様なグラフフォーマットで、ヒトＩｇ
ＭｍＡｂである１Ａ６Ｂ５ＦをＥＬＩＳＡで評価したも
のである。
ＭｍＡｂである１Ａ６Ｂ５ＦをＥＬＩＳＡで評価したも
のである。
【図９】図４と同様なグラフフォーマットで、ヒトＩｇ
ＭｍＡｂであるＦ２、２・３４をＥＬＩＳＡで評価した
ものである。
ＭｍＡｂであるＦ２、２・３４をＥＬＩＳＡで評価した
ものである。
【図１０】組換え型マウスＴＮＦαへのＢ５結合をグラ
フフォーマットで示している。プラスチック製プレート
に中和モノクローナルハムスター抗マウスＴＮＦα抗体
を８ｕｇ／ｍＬ（正方形）、４ｕｇ／ｍＬ（三角形）お
よび２ｕｇ／ｍＬ（丸）でプレコートした。次に、組換
え型マウスＴＮＦαを２ｕｇ／ｍＬ（中が黒い記号）で
添加するか、或は添加しなかった（中が白い記号）。次
に、示した濃度でヒトｍＡｂであるＢ５を結合させた。
次に、抗ヒトＩｇＭ抗体を用いたＥＬＩＳＡで結合を評
価した。
フフォーマットで示している。プラスチック製プレート
に中和モノクローナルハムスター抗マウスＴＮＦα抗体
を８ｕｇ／ｍＬ（正方形）、４ｕｇ／ｍＬ（三角形）お
よび２ｕｇ／ｍＬ（丸）でプレコートした。次に、組換
え型マウスＴＮＦαを２ｕｇ／ｍＬ（中が黒い記号）で
添加するか、或は添加しなかった（中が白い記号）。次
に、示した濃度でヒトｍＡｂであるＢ５を結合させた。
次に、抗ヒトＩｇＭ抗体を用いたＥＬＩＳＡで結合を評
価した。
【図１１】可溶ｒｈＴＮＦαに結合するＢ５ ｍＡｂ
（三角形）とｍＡｂ Ａ１０Ｇ１０（丸）の比較をグラ
フフォーマットで示している。抗ヒトもしくは抗マウス
抗体をプレコートしたプラスチック製プレートに抗体を
結合させた。次に、これらの抗体と一緒にビオチニル化
ＴＮＦをインキュベートした。酵素−アビジン接合体を
用いて可溶ＴＮＦαの結合を検出した。
（三角形）とｍＡｂ Ａ１０Ｇ１０（丸）の比較をグラ
フフォーマットで示している。抗ヒトもしくは抗マウス
抗体をプレコートしたプラスチック製プレートに抗体を
結合させた。次に、これらの抗体と一緒にビオチニル化
ＴＮＦをインキュベートした。酵素−アビジン接合体を
用いて可溶ＴＮＦαの結合を検出した。
【図１２】捕捉されたＢ５ ｍＡｂが可溶ＴＮＦαに結
合しそしてそれを弱くＡ１０Ｇ１０ ｍＡｂに提示する
ことをグラフフォーマットで示している。抗ヒトＩｇＭ
をプレコートしたプレートに、Ｂ５ ｍＡｂ抗ＴＮＦα
もしくは対照としての６Ｆ１１（ヒト抗ＬＰＳ Ｉｇ
Ｍ）を結合させた。次に、その複合体形成させたヒトｍ
Ａｂに可溶ＴＮＦαを結合させた。マウスｍＡｂである
Ａ１０Ｇ１０を添加し、そして酵素結合させた抗マウス
ＩｇＧ抗体を用いて、Ｂ５ ｍＡｂと複合体形成させた
ＴＮＦに対するそれの結合を検出した。
合しそしてそれを弱くＡ１０Ｇ１０ ｍＡｂに提示する
ことをグラフフォーマットで示している。抗ヒトＩｇＭ
をプレコートしたプレートに、Ｂ５ ｍＡｂ抗ＴＮＦα
もしくは対照としての６Ｆ１１（ヒト抗ＬＰＳ Ｉｇ
Ｍ）を結合させた。次に、その複合体形成させたヒトｍ
Ａｂに可溶ＴＮＦαを結合させた。マウスｍＡｂである
Ａ１０Ｇ１０を添加し、そして酵素結合させた抗マウス
ＩｇＧ抗体を用いて、Ｂ５ ｍＡｂと複合体形成させた
ＴＮＦに対するそれの結合を検出した。
【図１３】いくつかのヒトＩｇＭ抗体がマウスＴＮＦα
に結合すること、並びにヒトＢ５ｍＡｂがヒトＴＮＦα
に結合することを、ウエスタンブロットの結果を示す電
気泳動図に代わる写真である。組換え型マウスＴＮＦα
（レーンＡ−Ｇ）およびｒｈｕＴＮＦα（レーンＨおよ
びＩ）を還元条件下で電気泳動にかけた後、ニトロセル
ロースに転移させた。以下に示すモノクローナル抗体を
用いてマウスＴＮＦαのブロッティングを行った：７Ｔ
１（レーンＡ）、Ｂ５（レーンＢ）、１Ａ６Ｂ５Ｆ（レ
ーンＣ）、６Ｆ１１（レーンＤ）、Ｈ５（レーンＥ）、
Ａ８（レーンＦ）および一次抗体なし（レーンＧ）。ヒ
トＴＮＦαをレーンＨおよびＩ内で電気泳動にかけた。
次に、レーンＨをＢ５ ｍＡｂでブロッティングし、そ
してレーンＩを６Ｆ１１ ｍＡｂでブロッティングし
た。次に、レーンＡ−Ｆ、ＨおよびＩをビオチニル化抗
ヒトＩｇＭに暴露した。レーンＦをビオチニル化抗ヒト
ＩｇＧに暴露した、と言うのは、Ａ８はＩｇＧ抗体であ
るからである。次に、展開剤であるアビジン連成西洋ワ
サビペルオキシダーゼに全てのレーンを暴露した。２１
１ｋｄから１５．４ｋｄの分子量範囲を有する分子量標
準を平行して泳動させ、それらの位置を示す。
に結合すること、並びにヒトＢ５ｍＡｂがヒトＴＮＦα
に結合することを、ウエスタンブロットの結果を示す電
気泳動図に代わる写真である。組換え型マウスＴＮＦα
（レーンＡ−Ｇ）およびｒｈｕＴＮＦα（レーンＨおよ
びＩ）を還元条件下で電気泳動にかけた後、ニトロセル
ロースに転移させた。以下に示すモノクローナル抗体を
用いてマウスＴＮＦαのブロッティングを行った：７Ｔ
１（レーンＡ）、Ｂ５（レーンＢ）、１Ａ６Ｂ５Ｆ（レ
ーンＣ）、６Ｆ１１（レーンＤ）、Ｈ５（レーンＥ）、
Ａ８（レーンＦ）および一次抗体なし（レーンＧ）。ヒ
トＴＮＦαをレーンＨおよびＩ内で電気泳動にかけた。
次に、レーンＨをＢ５ ｍＡｂでブロッティングし、そ
してレーンＩを６Ｆ１１ ｍＡｂでブロッティングし
た。次に、レーンＡ−Ｆ、ＨおよびＩをビオチニル化抗
ヒトＩｇＭに暴露した。レーンＦをビオチニル化抗ヒト
ＩｇＧに暴露した、と言うのは、Ａ８はＩｇＧ抗体であ
るからである。次に、展開剤であるアビジン連成西洋ワ
サビペルオキシダーゼに全てのレーンを暴露した。２１
１ｋｄから１５．４ｋｄの分子量範囲を有する分子量標
準を平行して泳動させ、それらの位置を示す。
【図１４】ｒｈＴＮＦαはＡ１０Ｇ１０マウスｍＡｂで
中和されるが、ヒトｍＡｂでは中和されないことをグラ
フフォーマットで示している。滴定濃度のｍＡｂ存在下
で、細胞毒性を示す用量のｒｈＴＮＦαと一緒にＷＥＨ
Ｉ １６４細胞をインキュベートした。その後、生存力
を評価した。
中和されるが、ヒトｍＡｂでは中和されないことをグラ
フフォーマットで示している。滴定濃度のｍＡｂ存在下
で、細胞毒性を示す用量のｒｈＴＮＦαと一緒にＷＥＨ
Ｉ １６４細胞をインキュベートした。その後、生存力
を評価した。
【図１５】ヒトＩｇＭ抗ＴＮＦα ｍＡｂで染色した２
つの細胞系が示す蛍光染色プロファイルを柱状図表フォ
ーマットで示している。８Ｂ９細胞（（Ａ）および
（Ｃ））およびＴＨＰ−１細胞（（Ｂ）および（Ｄ））
を、抗体で染色せず（（Ａ）および（Ｂ））、ＦＬ−Ｆ
（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭで染色した（（Ｃ）および
（Ｄ））。任意単位で表す、蛍光強度チャンネル番号
を、縦座標上のチャンネル毎に細胞に対してプロットす
る。各サンプルについて５０００個の細胞を蓄積させ
た。陽性を示す蛍光として評価する、指示したマーカー
内に入る細胞のパーセントを示す。
つの細胞系が示す蛍光染色プロファイルを柱状図表フォ
ーマットで示している。８Ｂ９細胞（（Ａ）および
（Ｃ））およびＴＨＰ−１細胞（（Ｂ）および（Ｄ））
を、抗体で染色せず（（Ａ）および（Ｂ））、ＦＬ−Ｆ
（ａｂ）’2抗ヒトＩｇＭで染色した（（Ｃ）および
（Ｄ））。任意単位で表す、蛍光強度チャンネル番号
を、縦座標上のチャンネル毎に細胞に対してプロットす
る。各サンプルについて５０００個の細胞を蓄積させ
た。陽性を示す蛍光として評価する、指示したマーカー
内に入る細胞のパーセントを示す。
【図１６】ヒトＩｇＭ抗ＴＮＦαｍＡｂで染色した２つ
の細胞系が示す蛍光染色プロファイルを柱状図表フォー
マットで示している。８Ｂ９細胞（（Ｅ）および
（Ｇ））およびＴＨＰ−１細胞（（Ｆ）および（Ｈ））
をＢ５ＩｇＭ抗ＴＮＦα＋ＦＬ抗ＩｇＭで染色し
（（Ｅ）および（Ｆ））、そして６Ｆ１１抗ＬＰＳ＋Ｆ
Ｌ抗ＩｇＭで染色した（（Ｇ）および（Ｈ））。任意単
位で表す、蛍光強度チャンネル番号を、縦座標上のチャ
ンネル毎に細胞に対してプロットする。各サンプルにつ
いて５０００個の細胞を蓄積させた。陽性を示す蛍光と
して評価する、指示したマーカー内に入る細胞のパーセ
ントを示す。
の細胞系が示す蛍光染色プロファイルを柱状図表フォー
マットで示している。８Ｂ９細胞（（Ｅ）および
（Ｇ））およびＴＨＰ−１細胞（（Ｆ）および（Ｈ））
をＢ５ＩｇＭ抗ＴＮＦα＋ＦＬ抗ＩｇＭで染色し
（（Ｅ）および（Ｆ））、そして６Ｆ１１抗ＬＰＳ＋Ｆ
Ｌ抗ＩｇＭで染色した（（Ｇ）および（Ｈ））。任意単
位で表す、蛍光強度チャンネル番号を、縦座標上のチャ
ンネル毎に細胞に対してプロットする。各サンプルにつ
いて５０００個の細胞を蓄積させた。陽性を示す蛍光と
して評価する、指示したマーカー内に入る細胞のパーセ
ントを示す。
【図１７】Ｂ５抗ＴＮＦα ｍＡｂを用いた、ＴＨＰ−
１およびＵ９３７細胞上ＴＮＦαの細胞表面発現の検
出、並びにＬＰＳおよびＰＭＡを用いた時の発現増大の
検出をグラフフォーマットで示している。ＴＨＰ−１
（Ａ）およびＵ９３７（Ｂ）細胞を、培地（白丸）、Ｌ
ＰＳ（黒丸）またはＬＰＳ＋ＰＭＡ（黒三角）と一緒に
３時間インキュベートした。
１およびＵ９３７細胞上ＴＮＦαの細胞表面発現の検
出、並びにＬＰＳおよびＰＭＡを用いた時の発現増大の
検出をグラフフォーマットで示している。ＴＨＰ−１
（Ａ）およびＵ９３７（Ｂ）細胞を、培地（白丸）、Ｌ
ＰＳ（黒丸）またはＬＰＳ＋ＰＭＡ（黒三角）と一緒に
３時間インキュベートした。
【図１８】Ｆ１抗ＩｇＭ抗体で染色した細胞にＢ５抗Ｔ
ＮＦαＩｇＭ ｍＡｂを結合させたとき染色強度がシフ
トすることをグラフフォーマットで示している。ＣＤ１
９陽性を示す脾臓細胞（splenocytes）を示す。これら
を、藻紅素接合させた抗ＣＤ１９で染色し、そして陽性
を示す細胞のみを更に、フルオレセイン接合させた抗体
染色に関して分析した。（Ａ）は、ＦＬ抗ＩｇＭで染色
されないＣ１９＋脾臓細胞を示している。（Ｂ）は、Ｂ
５＋ＦＬ抗ＩｇＭを用いた時のこれらの細胞の染色を示
している。
ＮＦαＩｇＭ ｍＡｂを結合させたとき染色強度がシフ
トすることをグラフフォーマットで示している。ＣＤ１
９陽性を示す脾臓細胞（splenocytes）を示す。これら
を、藻紅素接合させた抗ＣＤ１９で染色し、そして陽性
を示す細胞のみを更に、フルオレセイン接合させた抗体
染色に関して分析した。（Ａ）は、ＦＬ抗ＩｇＭで染色
されないＣ１９＋脾臓細胞を示している。（Ｂ）は、Ｂ
５＋ＦＬ抗ＩｇＭを用いた時のこれらの細胞の染色を示
している。
【図１９】Ｆ１抗ＩｇＭ抗体で染色した細胞にＢ５抗Ｔ
ＮＦαＩｇＭ ｍＡｂを結合させたとき染色強度がシフ
トすることをグラフフォーマットで示している。ＣＤ１
９陽性を示す脾臓細胞（splenocytes）を示す。これら
を、藻紅素接合させた抗ＣＤ１９で染色し、そして陽性
を示す細胞のみを更に、フルオレセイン接合させた抗体
染色に関して分析した。（Ｃ）はＦＬ抗ｈＩｇＭ単独を
用いた時の染色を示しており、そして（Ｄ）は、対照６
Ｆ１１抗ＬＰＳ ＩｇＭ＋ＦＬ抗ＩｇＭを用いた時の染
色を示している。指示したマーカー内の細胞パーセント
を示し、これは、フルオレセイン接合した抗体を用いた
とき陽性を示す細胞染色のパーセントを示している。こ
の陽性を示す集団に関する中間チャンネル番号も示す。
これらの番号は、蛍光に陽性を示す集団に関する、任意
単位で測定した染色強度を反映している。
ＮＦαＩｇＭ ｍＡｂを結合させたとき染色強度がシフ
トすることをグラフフォーマットで示している。ＣＤ１
９陽性を示す脾臓細胞（splenocytes）を示す。これら
を、藻紅素接合させた抗ＣＤ１９で染色し、そして陽性
を示す細胞のみを更に、フルオレセイン接合させた抗体
染色に関して分析した。（Ｃ）はＦＬ抗ｈＩｇＭ単独を
用いた時の染色を示しており、そして（Ｄ）は、対照６
Ｆ１１抗ＬＰＳ ＩｇＭ＋ＦＬ抗ＩｇＭを用いた時の染
色を示している。指示したマーカー内の細胞パーセント
を示し、これは、フルオレセイン接合した抗体を用いた
とき陽性を示す細胞染色のパーセントを示している。こ
の陽性を示す集団に関する中間チャンネル番号も示す。
これらの番号は、蛍光に陽性を示す集団に関する、任意
単位で測定した染色強度を反映している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケネス・ジエイ・レンバツク アメリカ合衆国カリフオルニア州94526ダ ンビル・パークヒルロード662
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒト腫瘍壊死因子アルファに結合するヒ
トモノクローナル抗体を含んでいる組成物。 - 【請求項２】 薬学的に許容される担体内の請求項１の
組成物。 - 【請求項３】 特異的にヒトＴＮＦアルファに結合し、
そしてＥＬＩＳＡで試験した時、３種の高親和力中和マ
ウスモノクローナル抗体に匹敵するタイターを示すこと
によって特徴づけられる、ヒトモノクローナル抗体調合
物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2695793A | 1993-03-05 | 1993-03-05 | |
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