JP2010528647A - ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト - Google Patents

ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト Download PDF

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Abstract

本発明はプロテアーゼによる分解に対して耐性である抗VEGFポリペプチドおよび抗体単一可変ドメイン（dAb）ならびにこれらを含むアンタゴニストに関する。本ポリペプチド、dAbおよびアンタゴニストは、患者の肺投与、経口投与、肺への送達および胃腸管への送達ならびに癌および関節炎などの炎症性疾患を治療するのに有用である。
【選択図】 図２

Description

本発明はプロテアーゼ耐性のポリペプチド、免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインおよびこれらを含む血管内皮成長因子（VEGF）アンタゴニストに関する。本発明はさらに、かかる抗VEGFリガンドを含む使用、製剤、組成物およびデバイスに関する。
ポリペプチドおよびペプチドは、産業上の応用および医学、治療および診療薬としての応用および使用を含む様々な応用において、益々重要な薬剤になっている。しかし、癌および炎症状態（例えばCOPD）などのある特定の生理学的状態において、組織、器官または動物（例えば肺、腫瘍の隣接部）に存在するプロテアーゼの量は増加しうる。プロテアーゼのこの増加は、内因性タンパク質および疾患を治療するために投与される治療ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の分解および不活性化を加速しうる。従って、in vivoでの使用（例えば、疾患を治療、診断または予防する上での使用）に可能性を有するいくつかの薬剤は、プロテアーゼによって速やかに分解されかつ不活性化される故に、その効能は限られている。
プロテアーゼ耐性ポリペプチドはいくつかの利点を提供する。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドはプロテアーゼ感受性薬剤よりもin vivoで長く活性のまま残留し、従って、生物学的効果を生じるのに十分な期間、機能性で残留する。プロテアーゼ分解に耐性がありかつ所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択するための改善された方法も必要である。
VEGF：
VEGFは、その一次転写物の選択的スプライシング（交互スプライシング）によって、いくつかの選択された形態で存在する分泌性、ヘパリン結合性のホモ二量体糖タンパク質である（Leungら, 1989, Science 246: 1306）。VEGFはまた、血管漏洩、炎症における重要なプロセスを誘導する能力によっても知られている。
腫瘍形成、転移および再発を促進する重要な病態生理学的プロセスは腫瘍血管新生である。このプロセスには、腫瘍により発現されるVEGFなどの血管形成因子の生成が介在し、これが腫瘍に栄養分を送達する血管の形成を誘導する。従って、ある特定の癌を治療する手法は、腫瘍を飢餓させるVEGFが介在する、腫瘍血管新生を阻害する方法である。AVASTIN（ベバシズマブ； Genetech、Inc.）はヒトVEGFと結合するヒト化抗体であって、結腸直腸癌を治療する用途に認可されている。抗体2C3（ATCC受託番号PTA 1595）と呼ばれる抗体はVEGFと結合し、VEGFの上皮成長因子受容体2との結合を阻害することが報じられている。
現在利用しうる治療薬を用いてVEGFを標的化することは、全ての患者においてまたは全ての癌に対して有効ではない。従って、癌およびVEGFが介在する他の病理症状、例えば血管増殖性疾患（例えば、加齢に関係する黄斑変性症（AMD））を治療するための改善された薬剤が必要である。
VEGFはまた、炎症障害および自己免疫性疾患とも関係があるとされている。例えば、RA患者の滑膜組織においてVEGFが同定され、RAの病理学におけるVEGFの潜在的な役割が強調されている（Favaら, 1994, J. Exp. Med. 180: 341: 346；Nagashimaら, 1995, J. Rheumatol. 22: 1624-1630）。RAの病理学におけるVEGFの役割は、抗VEGF抗体をマウスコラーゲン誘導性関節炎（CIA）モデルに投与した次の研究において確かなものになっている。これらの研究では、疾患誘導時に関節においてVEGF発現が増加し、抗VEGF抗血清を投与すると、関節炎の発生が阻止されかつ確立された疾患が寛解した（Soneら, 2001, Biochem. Biophys. Res. Comm. 281： 562-568；Luら, 2000, J. Immunol. 164： 5922-5927）
それ故に、VEGFの標的化はまた、RA、および他の症状、例えば炎症および／または自己免疫性疾患に関係する症状を治療するのに利益がありうる。
Leungら, 1989, Science 246: 1306 Favaら, 1994, J. Exp. Med. 180: 341: 346 Nagashimaら, 1995, J. Rheumatol. 22: 1624-1630 Soneら, 2001, Biochem. Biophys. Res. Comm. 281： 562-568 Luら, 2000, J. Immunol. 164： 5922-5927
一態様において、本発明はDOM15-26-593のアミノ酸配列（図5に示した）と少なくとも97％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、パーセント同一性は少なくとも98または99%である。一実施形態において、ポリペプチドはDOM15-26-593である。本発明はさらに（実質的に）純粋なDOM15-26-593単量体を提供する。一実施形態において、DOM15-26-593は少なくとも98、99、99.5%純粋なまたは100%純粋な単量体である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列（図5に示した）と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列によりコードされた（例えば、プロテアーゼ耐性である）ポリペプチドを提供する。一実施形態において、パーセント同一性は少なくとも70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%である。一実施形態において、本プロテアーゼ耐性ポリペプチドは、本明細書に記載のプロテアーゼ耐性ポリペプチドを単離する方法により得ることができる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のヌクレオチド配列と少なくとも55％同一であるアミノ酸配列によりコードされたポリペプチドであって、DOM15-26-593のアミノ酸配列と少なくとも97％同一であるアミノ酸配列を含む前記ポリペプチドを提供する。一実施形態において、ヌクレオチド配列のパーセント同一性は少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%である。一実施形態において、アミノ酸配列のパーセント同一性は少なくとも、98または99%または100%である。例えば、ヌクレオチド配列はDOM15-26-593のヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンであってもよい。コドン最適化は当技術分野で公知である。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、細菌（例えば、大腸菌またはシュードモナス属、例えばP. fluorescens）、哺乳動物（例えば、CHO）または酵母宿主細胞（例えばピキア属またはサッカロミセス属、例えばP. pastorisまたはS. cerevisiae）における発現が最適化されている。
一態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と97％同一であるアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、パーセント同一性は少なくとも98または99%である。
一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、6位にバリンを含む（番号付けはKabatによる）（"Sequences of Proteins of Immunological Interest"、US Department of Health and Human Services 1991）。
一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは99位にロイシンを含む（番号付けはKabatによる）。
一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは30位にリシンを含む（番号付けはKabatによる）。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む抗VEGF 免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のヌクレオチド配列と少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列によりコードされた抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、パーセント同一性は少なくとも70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のヌクレオチド配列と少なくとも55％同一であるアミノ酸配列によりコードされた抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインであって、DOM15-26-593のアミノ酸配列と少なくとも97％同一であるアミノ酸配列を含む前記可変ドメインを提供する。一実施形態において、ヌクレオチド配列の％同一性は少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％である。一実施形態において、本アミノ酸配列の％同一性は少なくとも98または99％または100％である。例えば、本ヌクレオチド配列は、DOM15-26-593のヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンであってもよい。コドン最適化は当技術分野で公知である。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、細菌（例えば、大腸菌またはシュードモナス属、例えばP. fluorescens）、哺乳動物（例えば、CHO）または酵母宿主細胞（例えばピキア属または サッカロミセス属、例えばP. pastorisまたは S. cerevisiae）における発現が最適化されている。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のヌクレオチド配列と同一である配列によりコードされた抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
一態様において、本発明は、本発明による抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを含むVEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態において、本アンタゴニストは、それぞれの可変ドメインが本発明によるものである第1および第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。例えば、本アンタゴニストは前記単一可変ドメインの単量体または前記単一可変ドメインのホモ二量体を含む。一実施形態において、その（またはそれぞれの）単一可変ドメインのアミノ酸配列はDOM15-26-593のアミノ酸配列と同一である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のアミノ酸配列と同一であるか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列と14以下のアミノ酸位置で異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有するアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。一実施形態において、その差は13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下のアミノ酸位置である。一実施形態において、CDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列およびDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列およびDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列およびDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列およびDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列およびDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、そのCDR配列同一性は少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98または99％である。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば、本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、DOM15-26-593のCDRl、CDR2、および／またはCDR3（例えば、CDRl、CDR2、CDR3、CDRlおよびCDR2、CDRlおよびCDR3、CDR2およびCDR3、またはCDRl、CDR2およびCDR3）の配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含むものである抗VEGFアンタゴニストを提供する。アンタゴニストはプロテアーゼ、例えば本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。
一態様において、本発明は、VEGFとの結合についてDOM15-26-593と競合する抗VEGFアンタゴニストを提供する。従って、本アンタゴニストはDOM15-26-593と同じエピトープと結合することができるかまたは重複するエピトープと結合することができる。一実施形態において、本アンタゴニストは、DOM15-26-593のアミノ酸配列と少なくとも97％同一であるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むものである。一実施形態において、％同一性は少なくとも98または99％である。一実施形態において、可変ドメインはDOM15-26-593である。アンタゴニストは、プロテアーゼ、例えば本明細書に記載の1以上のプロテアーゼに、例えば本明細書に記載の一式の条件下で、耐性でありうる。一実施形態において、アンタゴニストは、VEGFに対して結合特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば一価抗原結合フラグメント(例えば、scFv、Fab、Fab'、dAb)である。アンタゴニストの他の例は、VEGFと結合する本明細書に記載のリガンドである。リガンドは、VEGFに対して結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはドメイン抗体（dAb）、またはかかるdAbの相補性決定領域を、好適なフォーマットで含んでもよい。いくつかの実施形態において、リガンドは、VEGFに対して結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはdAbから本質的に成る、または成るdAb単量体である。他の実施形態において、本リガンドは、抗体フォーマットなどの好適なフォーマットでdAb（またはdAbのCDR）を含むポリペプチドである。
これらのVEGFリガンド、例えばdAbは、例えば、PEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域の付着により、または抗体ドメインとのコンジュゲーションにより、さらに大きい水力学的サイズを有するようにフォーマットすることができる。例えば、（i）VEGFと結合し、（ii）VEGF介在性シグナル伝達の活性にアンタゴニスト作用を有し、かつ（iii）VEGFのdAb単量体などのその受容体との結合を阻害しない薬剤（例えば、ポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニスト）を、抗体のより大きい抗原結合フラグメント（例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとしてフォーマットされた）としてフォーマットすることができる。リガンドの水力学的サイズとその血清半減期はまた、VEGF結合剤（アンタゴニスト；可変ドメイン）を本明細書に記載のin vivo半減期を増加する抗原またはエピトープと結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗原結合フラグメント）とコンジュゲートまたは連結することにより増加することができる（本明細書に参照によりその全てが組み入れられるWO 2006038027の添付資料1を参照されたい）。例えば、VEGF結合剤（例えば、ポリペプチド、例えばdAb）を、抗血清アルブミンまたは抗新生児Fc受容体抗体または抗体フラグメント、例えば、抗SAまたは抗新生児Fc受容体dAb、Fab、Fab'またはscFvと、または抗SAアフィボディまたは抗新生児Fc受容体アフィボディとコンジュゲートまたは連結することができる。
本発明によるVEGF結合リガンドに使用するために好適なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるWO 2005/077042 A2およびWO 2006/038027に記載されている。
本開示全体に記載した本発明の他の実施形態において、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおける「dAb」の使用の代わりに、当業者がVEGFと結合するdAbのCDR（例えば、好適なタンパク質スカフォールドまたは骨格、例えばアフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメインまたはEGFドメイン上にグラフトしたCDR）を含むドメイン、または例えば、アフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメインまたはEGFドメインから選択される、VEGFとの結合部位を含むタンパク質ドメインであってもよいドメインを使用しうることを想定している。従って本開示は全体として、かかるドメインをdAbの代わりに用いるアンタゴニスト、リガンド、および方法の開示を提供すると解釈されるべきである。
本発明のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびアンタゴニストは1以上の次のプロテアーゼに対して耐性でありうる：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタルプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンG）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼ。
特別な実施形態において、本プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生体抽出液、生体ホモジネートまたは生体調製物により提供することができる。一実施形態において、プロテアーゼは痰、粘液(例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液)、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵抽出液、胃液、唾液中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは眼および／または涙中に見出されるものである。眼中に見出されるかかるプロテアーゼの例には、カスパーゼ、カルパイン、マトリックス・メタルプロテアーゼ、ディスインテグリン、メタロプロテイナーゼ（ADAM）およびトロンボスポンジンモチーフをもつADAM、プロテオソーム、組織プラスミノーゲンアクチベーター、セクレターゼ、カテプシンBおよびD、シスタチンC、セリンプロテアーゼPRSS1、ユビキチンプロテオソーム経路（UPP）が含まれる。一実施形態において、プロテアーゼは非細菌性プロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは動物、例えば、哺乳動物の、例えば、ヒトのプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは胃腸管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼ、例えば、ヒトにおいて見出される胃腸管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼである。ここに掲げたかかるプロテアーゼはまた、ライブラリーのレパートリーのプロテアーゼへの曝露に関わる本明細書に記載の方法で用いることができる
一態様において、本発明はVEGF結合部位を含むプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメインを提供し、ここでこの可変ドメインは(i)少なくとも10μg/mlプロテアーゼの濃度（c）で37℃にて少なくとも1時間の時間（t）；または(ii)少なくとも40μg/mlプロテアーゼの濃度（c'）で30℃にて少なくとも1時間の時間（t）インキュベートしたときにプロテアーゼに対して耐性である。一実施形態において、プロテアーゼ、例えばトリプシンの可変ドメインに対する比（モル／モル基準で）は8,000〜80,000プロテアーゼ：可変ドメインであり、例えばCが10μg/mlである場合、その比は800〜80,000プロテアーゼ：可変ドメインであり；またはCまたはC'が100μg/mlである場合、その比は8,000〜80,000プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態において、プロテアーゼ（例えばトリプシン）の可変ドメインに対する比（重量／重量基準、例えばμg/μg基準で）は16,000〜160,000プロテアーゼ：可変ドメインであり、例えばCが10μg/mlである場合、その比は1,600〜160,000プロテアーゼ：可変ドメインであり；またはCまたはC'が100μg/mlである場合、その比は16,000〜160,000プロテアーゼ：可変ドメインである。一実施形態においては、濃度（cまたはc'）は少なくとも100または1000μg/mlプロテアーゼである。一実施形態においては、濃度（cまたはc'）は少なくとも100または1000μg/mlプロテアーゼである。ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーについて作業する際に使用するプロテアーゼのタンパク質分解活性に好適な条件（例えば、w/wパラメーター）の本明細書の説明について触れる。これらの条件は、特別な免疫グロブリン単一可変ドメインのプロテアーゼ耐性を決定するための条件として用いることができる。一実施形態において、時間（t）はほぼ1、3または24時間または一晩（例えば、ほぼ12〜16時間）である。一実施形態において、可変ドメインは条件(i)のもとで、すなわち、濃度（c）が丁度またはほぼ10または100μg/mlプロテアーゼおよび時間（t）が1時間の条件において耐性である。一実施形態において、可変ドメインは条件(ii)のもとで、すなわち、濃度（c'）がほぼ40μg/mlプロテアーゼおよび時間（t）が丁度またはほぼ3時間の条件において耐性がある。一実施形態においては、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される。一実施形態においては、プロテアーゼはトリプシンである。一実施形態において、プロテアーゼは痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵抽出液、胃液、唾液または涙または眼中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは眼または涙中に見出されるプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは非細菌性プロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは動物、例えば、哺乳動物、たとえばヒトのプロテアーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは胃腸管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼ、例えば、ヒトで見出される胃腸管プロテアーゼまたは肺組織プロテアーゼである。ここに掲げたかかるプロテアーゼはまた、ライブラリーのレパートリーのプロテアーゼへの曝露に関わる本明細書に記載の方法で用いることができる。
一実施形態において、可変ドメインはトリプシンおよび／または、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される少なくとも1つの他のプロテアーゼに対する耐性がある。例えば、耐性はトリプシンおよびエラスターゼ；トリプシンおよびロイコザイム；トリプシンおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイム；トリプシン、エラスターゼおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼ、パンクレアチンおよびロイコザイム；またはトリプシン、パンクレアチンおよびロイコザイムに対する耐性である。
一実施形態において、条件(i)または(ii)のもとで、例えば106〜1013、例えば108〜1012複製ユニット（感染性ビリオン）のファージライブラリーサイズでインキュベートすると、可変ドメインがバクテリオファージ上に提示される。
一実施形態において、例えば、BiaCore(登録商標)またはELISA、例えば、ファージELISAまたはモノクローナルファージELISAを用いて試験すると、可変ドメインは条件(i)または(ii)のもとでのインキュベーション後にVEGFと特異的に結合する。
一実施形態において、本発明の可変ドメインはプロテインAまたはプロテインLと特異的に結合する。一実施形態においては、条件(i)または(ii)下でのインキュベーション後に、プロテインAまたはLとの特異的結合が存在する。
一実施形態において、本発明の可変ドメインは、例えば条件(i)または(ii)のもとでのインキュベーション後に、ELISA、例えばファージELISAまたはモノクローナルファージELISAにおいて、少なくとも0.404のOD450読取値を有しうる。
一実施形態において、本発明の可変ドメインは、例えば条件(i)または(ii)下でのインキュベーション後に、ゲル電気泳動で（実質的に）単一バンドを提示する。
ある特定の実施形態において、本発明は二重特異的リガンドであるVEGFアンタゴニストを提供し、このリガンドはVEGFと結合する本発明による第1のdAb、および第1のdAbと同じかまたは異なる結合特異性を有する第2のdAbを含む。第2のdAbは次から選択される標的と結合することができる：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、Exodus-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、繊維芽細胞増殖因子10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72a.a.）、IL-8（77a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンフォタクチン、ミューラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67a.a.）、MDC（69a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67a.a.）、MDC（69a.a.）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄前駆細胞阻害因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12（SDF-1）、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドテリン-1、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3）、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、MMP12、PDK1、およびIgE。
一例では、二重特異的リガンドはVEGF上の第1のエピトープと結合する第1のdAbおよび異なる標的上のエピトープと結合する第2のdAbを含む。他の例では、血清アルブミン上のエピトープと結合する第2のdAbを含む。
他の実施形態において、リガンドは、VEGFに対して結合特異性を有する第1のエピトープ結合ドメインおよび第1のエピトープ結合ドメインと異なる結合特異性を有する少なくとも1つの他のエピトープ結合ドメインを含む多特異的リガンドである。例えば、第1のエピトープ結合ドメインはVEGFと結合するdAbであってもよく、またはVEGFと結合するdAbのCDR（例えば、好適なタンパク質スカフォールドまたは骨格、例えばアフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメインまたはEGFドメイン上にグラフトしたCDR）を含むドメインであってもよく、または、ドメインがアフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメインまたはEGFドメインから選択される、VEGFと結合するドメインであってもよい。
ある特定の実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンドまたは抗VEGF dAb単量体は、次の項の1以上により特徴づけられる：1）表面プラズモン共鳴で測定して、50nM〜20pMの解離定数（Kd）および5xlO-1〜1x10-7s-1のKOff速度定数でヒトVEGFから解離すること；2）VEGFのVEGFR2との結合を500nM〜50pMのIC50で阻害すること；3）標準HUVEC細胞アッセイにおいて500nM〜50pMのND50でヒトVEGFを中和すること；4）標準細胞アッセイにおいて≦100nMのND5OでVEGFの活性に対してアンタゴニスト作用を示すこと；5）マウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖を阻害または減少させること；6）凝集に抵抗すること；7）大腸菌またはピキア属（Pichia）（例えば、P.pastoris）またはCHOなどの哺乳動物細胞発現系に発現されると、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌すること；8）可逆的にアンフォールドすること；または9）炎症性疾患を治療、抑制または予防する効力を有すること。条件(1)〜(9)に適用できるアッセイおよび試験およびパラメーターの詳細については、WO 2006038027およびWO 2006059108およびWO 2007049017に言及されており、これらは本明細書に参照により組み入れられる。
特別な実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンドまたはdAb単量体は、表面プラズモン共鳴で測定して、50nM〜20pMの解離定数（Kd）および5xlO-1〜1x10-7s-1のKOff速度定数でヒトVEGFから解離し；VEGFのVEGFR2（VEGF受容体2）との結合を500nM〜50pMのIC50で阻害し；そして標準HUVEC細胞アッセイにおいて500nM〜50pMのND50でヒトVEGFを中和する。他の特別な実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニスト、リガンドまたはdAb単量体は、表面プラズモン共鳴で測定して、50nM〜20pMの解離定数（Kd）および5xlO-1〜1x10-7s-1のKOff速度定数でヒトVEGFから解離し；VEGFのVEGFR2（VEGF受容体2）との結合を500nM〜50pMのIC50で阻害する。
本発明のプロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびアンタゴニストは、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患または症状の療法、予防および診断に利用することができる。特に、これらは、ヒトなどの患者に投与した時におそらくプロテアーゼに遭遇すると思われる薬物の基剤として利用することができる。例えば、胃腸管に投与した（例えば、経口、舌下、直腸に投与した）場合、ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインおよびアンタゴニストは、1以上の上部胃腸管、下部胃腸管、口、胃、小腸および大腸においてプロテアーゼに遭遇しうる。一実施形態は、それ故に、患者の疾患または症状を治療および／または予防するために患者の胃腸管に経口、舌下または直腸に投与するためのプロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアンタゴニストを提供する。例えば、固体腫瘍；炎症および／または自己免疫性疾患などのVEGF介在性症状または疾患を治療および／または予防するための、患者（例えば、ヒト 患者）への経口投与である。
他の例では、ポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニストを肺組織（例えば、肺または気道）へ（例えば、吸入によりまたは鼻腔内に）投与する場合、おそらくプロテアーゼに遭遇すると思われる。一実施形態は、それ故に、プロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアンタゴニストの患者肺組織への吸入または鼻腔内による患者（例えば、ヒト）への投与を行い、患者の疾患または症状を治療および／または予防する。かかる症状は、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、COPD、インフルエンザまたは本明細書に参照により組み入れられるWO 2006038027に開示されたいずれかの他の肺疾患または症状であってもよい。他の例で、患者の眼へ（例えば、眼内注入によりまたは点眼として）投与する場合、おそらくポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニストはプロテアーゼに遭遇すると思われる。一実施形態は、それ故に、患者（例えば、ヒト）にプロテアーゼ耐性ポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアンタゴニストの眼内投与を行い、患者の疾患または症状（例えば、眼の疾患または症状）を治療および／または予防する。投与は点眼液の剤形で、または眼中、例えば硝子体液中への注入による、眼への局所投与であってもよい。
本発明の一実施形態は、AMD（加齢に関係する黄斑変性症）などの眼のVEGF介在性症状または疾患を治療および／または予防するために、例えば点眼剤もしくはゲルの剤形でまたは例えば移植片で、眼に投与するプロテアーゼ耐性のポリペプチド、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアンタゴニストを提供する。
他の例では、ポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニストを肺組織（例えば、肺または気道）へ（例えば、吸入によりまたは鼻腔内に）投与する場合、おそらくプロテアーゼに遭遇すると思われる。一実施形態は、それ故に、本明細書に記載したポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニストのいずれかの、患者の肺組織への吸入または鼻腔内による患者（例えば、ヒト）への投与を行い、患者の疾患または症状を治療および／または予防する。かかる症状は、癌（例えば固体腫瘍、例えば肺癌、結腸直腸癌、頭頚癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、または卵巣癌）、喘息（例えば、アレルギー性喘息）、COPD、または本明細書に参照により組み入れられるWO 2006038027に開示されたいずれかの他の肺疾患または症状であってもよい。本発明によるアンタゴニスト、ポリペプチドおよび免疫グロブリン単一可変ドメインは、改善されたまたは相対的に高い融点（Tm）を提示し、増強された安定性を提供することができる。高アフィニティの標的結合もまた、あるいは代わりに、このアンタゴニスト、ポリペプチドおよび可変ドメインの特徴でありうる。これらの特徴の1つ以上がプロテアーゼ耐性と組合わされて、胃腸管または肺組織投与時または眼投与時にプロテアーゼが特に遭遇すると思われるヒトなどの哺乳動物において、アンタゴニスト、可変ドメインおよびポリペプチドの薬物としての使用を理に叶ったものにする。
従って、一態様において、本発明は経口送達用のVEGFアンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は患者の胃腸管への送達用のVEGFアンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は経口送達用の医薬品の製造におけるVEGFアンタゴニストの使用を提供する。一態様において、本発明は患者の胃腸管への送達用の医薬品の製造におけるVEGFアンタゴニストの使用を提供する。一実施形態においては、可変ドメインはトリプシンならびに／またはエラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される少なくとも1つの他のプロテアーゼに対する耐性がある。例えば、耐性は、トリプシンおよびエラスターゼ；トリプシンおよびロイコザイム；トリプシンおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼおよびロイコザイム；トリプシン、エラスターゼおよびパンクレアチン；トリプシン、エラスターゼ、パンクレアチンおよびロイコザイム；またはトリプシン、パンクレアチンおよびロイコザイムに対するものである。
一態様においては、本発明は肺送達用のVEGFアンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は肺送達用の医薬品の製造におけるVEGFアンタゴニストの使用を提供する。一態様において、本発明は患者の肺へ送達するための医薬品の製造におけるVEGFアンタゴニストの使用を提供する。一実施形態においては、その可変ドメインはロイコザイムに対して耐性である。
一態様において、本発明は、患者の胃腸管へまたは患者の肺または肺組織または眼へ医薬品を経口送達または送達する方法であって、患者に本発明のVEGFアンタゴニストの医学的に有効な量を投与するステップを含んでなる前記方法を提供する。
一態様において、本発明は癌、例えば固体腫瘍を治療および／または予防するための本発明のVEGFアンタゴニストを提供する。一実施形態においては、その固体腫瘍は肺癌、結腸直腸癌、頭頚癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、または卵巣癌からなる群より選択される。
一態様において、本発明は血管増殖性疾患、例えば血管新生、アテローム性動脈硬化症、およびAMD（加齢に関係する黄斑変性症）などの眼における血管増殖性疾患を治療および／または予防するための本発明のVEGFアンタゴニストを提供する。
一態様において、本発明は、炎症性症状を治療および／または予防するための、本発明のVEGFアンタゴニストを提供する。一態様においては、本発明は炎症性症状を治療および／または予防するための医薬品の製造におけるVEGFアンタゴニストの使用を提供する。一実施形態においては、その症状は関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患および慢性閉塞性肺疾患からなる群より選択される。例えば、一態様において、本発明は、呼吸器疾患を治療および／または予防するためのVEGFアンタゴニストを提供する。一態様において、本発明は、呼吸器疾患を治療および／または予防するための、医薬品の製造におけるVEGFアンタゴニストの使用を提供する。例えば、前記呼吸器疾患は、肺の炎症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、肺炎、過敏性肺炎、好酸球増加を伴う肺浸潤、環境性肺疾患、肺炎、気管支拡張症、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、原発性肺高血圧、肺血栓塞栓症、肋膜の障害、縦隔胸膜の障害、横隔胸膜の障害、換気低下、過換気、睡眠時無呼吸、急性呼吸困難症候、中皮腫、肉腫、移植片拒絶、移植片対宿主病、肺癌、アレルギー性鼻炎、アレルギー、石綿沈着症、アスペルギルス腫、アスペルギルス症、気管支拡張症、慢性気管支炎、気腫、好酸性肺炎、特発性肺線維症、浸潤性肺炎球菌性疾患、インフルエンザ、非結核性ミコバクテリア症、胸膜浸出、塵肺、肺胞細胞症、肺炎、肺放線菌症、肺胞蛋白症、炭疽肺炎、肺浮腫、肺塞栓、肺の炎症、肺組織球増殖症X、肺高血圧、肺ノカルジア症、肺結核、肺静脈閉塞病、リウマチ様肺疾患、サルコイドーシス、およびヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される。例えば、疾患は慢性閉塞性肺疾患（COPD）である。例えば、疾患は喘息である。
VEGFを阻害する薬剤を含む本発明のアンタゴニストは、好適な方法を用いて、被験者の組織または器官、例えば肺組織（例えば、肺）または眼に局所投与することができ、ここで前記薬剤は、例えば、抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、Fvフラグメント（例えば、scFv、ジスルフィド結合Fv）、F(ab')2フラグメント、dAb）、リガンド、ならびにdAb単量体および多量体（例えば、ホモまたはヘテロ二量体）からなる群より選択される。例えば、薬剤を吸入または鼻腔内投与を介して肺組織に局所投与してもよい。吸入または鼻腔内投与については、VEGFのアンタゴニストを、噴霧器、吸入器、アトマイザー、エーロゾル化器、霧化器、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、定量スプレー、定量霧化器、定量アトマイザー、または他の好適な吸入器または鼻腔内送達デバイスを用いて投与することができる。従って、一実施形態において、本発明はVEGFアンタゴニストを含有する肺の送達デバイスを提供する。一実施形態において、デバイスは吸入器または鼻腔内送達デバイスである。
一実施形態においては、薬剤を埋込み可能な（implantable）送達デバイスを介して眼に局所投与してもよい。従って、一実施形態において、本発明はVEGFアンタゴニストを含有する埋込み可能な送達デバイスを提供する。
一態様においては、本発明はVEGFアンタゴニストを含有する経口製剤を提供する。製剤は錠剤、丸薬、カプセル、液体またはシロップであってもよい。一態様において、本発明はVEGFアンタゴニストを含有する眼への送達用の眼科用の製剤を提供する。例えば製剤は液体点眼剤またはゲルであってもよい。
一実施形態において、本発明は肺へ送達するための肺用の製剤であって、5ミクロン未満、例えば4.5、4、3.5または3ミクロン未満の粒子径範囲をもつ本発明のアンタゴニスト、ポリペプチドまたは可変ドメインを含む前記製剤（例えば、Britton-Robinsonバッファーの場合、例えば6.5〜8.0のpH、例えば7〜7.5のpH、例えばpH7またはpH7.5）を提供する。
一実施形態において、本発明の製剤および組成物はpH6.5〜8.0、例えば7〜7.5、例えば7、例えば7.5で提供される。
本発明のいずれかの態様による可変ドメインは、少なくとも50℃、または少なくとも55℃、または少なくとも60℃、または少なくとも65℃、または少なくとも70℃のTmを有しうる。本発明のアンタゴニスト、使用、方法、デバイスまたは製剤はかかる可変ドメインを含みうる。
本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物または製剤は、37〜50℃で14日間、Britton-Robinson バッファー中で（1mg/mlのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度にて）インキュベーションの後、実質的に安定である。一実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％は、37℃でのかかるインキュベーションの後、無凝集のまま残存する。一実施形態において、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％は、37℃でのかかるインキュベーションの後、単量体のまま残存する。一実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％ は、50℃でのかかるインキュベーションの後、無凝集のまま残存する。一実施形態において、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％ は、50℃でのかかるインキュベーションの後、単量体のまま残存する。一実施形態において、かかるインキュベーションのいずれの１つの後にもポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集が見られない。一実施形態において、37℃にてBritton-Robinsonバッファー中の1mg/mlのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度でのインキュベーション後に、ポリペプチドまたは可変ドメインのpIは変わらないかまたは実質的に変わらないままである。
本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物または製剤は、7〜7.5のpH（例えば、pH 7またはpH 7.5）のBritton-Robinsonバッファー中の4℃にて7日間のインキュベーション（100mg/mlのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で）の後に、実質的に安定である。一実施形態において、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99または99.5％がかかるインキュベーション後に無凝集のまま残存する。一実施形態においては、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99または99.5％がかかるインキュベーション後に単量体のまま残存する。一実施形態においては、かかるインキュベーションのいずれの１つの後にもポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集が見られない。
本発明の一態様において、本発明のポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニスト、組成物または製剤は、例えば、室温、20℃または37℃にて、1時間、例えば、ジェット噴霧器、例えば、PariLC+cupで（40mg/mlのポリペプチドまたは可変ドメインの濃度で）噴霧後に、実質的に安定である。一実施形態において、ポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインの少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99または99.5％は、かかる噴霧の後に無凝集のまま残存する。一実施形態において、ポリペプチドまたは可変ドメインの少なくとも65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5、99または99.5％は、かかる噴霧の後に単量体のまま残存する。一実施形態においては、かかる噴霧のいずれの１つの後にもポリペプチド、可変ドメイン、アンタゴニストの凝集が見られない。
一態様においては、本発明は、本発明のいずれかの態様による免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードするかまたは本発明のいずれかの態様によるポリペプチド、アンタゴニストまたは可変ドメインをコードする単離されたまたは組換え型の核酸を提供する。一態様においては、本発明はその核酸を含むベクターを提供する。一態様においては、本発明はその核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。一態様において、本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを生産する方法であって、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを生産する前記宿主細胞を前記核酸またはベクターの発現に好適な条件下に維持するステップを含む前記方法を提供する。前記方法はさらに、ポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニストを単離するステップ、および、任意に、単離したポリペプチド、可変ドメインまたはアンタゴニストより改善されたアフィニティおよび／またはND50を有する変異体、例えば突然変異した変異体を生産するステップを含んでもよい。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合アフィニティを改善する技法、例えばアフィニティ成熟のための技法は当技術分野で公知である。
一態様において、本発明は、本発明のいずれかの態様の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ポリペプチドまたはアンタゴニストおよび製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態において、本発明のいずれかの態様の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはアンタゴニストは、任意に、FcのN末端が可変ドメインのC末端に連結されている（任意に、直接連結されている）抗体定常ドメイン、例えば、抗体Fcを含む。好適なFcのアミノ酸配列を図52bに示す。
本発明のポリペプチドまたは可変ドメインは単離されていてもおよび／または組換え体であってもよい。
一態様において、本発明はプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド、例えば血管内皮成長因子（VEGF）のアンタゴニスト、例えば抗VEGF dAbを選択する方法である。その方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、レパートリーとプロテアーゼをプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択する所望の生物学的活性（例えば、VEGFとの特異的結合）を有するペプチドまたはポリペプチドを回収するステップを含んでなる。
レパートリーとプロテアーゼを、一般に、少なくとも約30分間インキュベートする。1種以上の次のような、任意の所望のプロテアーゼを前記方法で用いることができる：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタルプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンG）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼ。特別な実施形態において、プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生体抽出液、生体ホモジネートまたは生体調製物により提供することができる。所望であれば、本発明の方法はさらに、インキュベーション完了後にプロテアーゼインヒビターをレパートリーとプロテアーゼの組合わせに加えるステップを含んでなる。
いくつかの実施形態においては、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを、結合活性に基づいて回収する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、プロテインA、プロテインGまたはプロテインLなどのジェネリックリガンドとの結合に基づいて回収することができる。結合活性はまた標的リガンドとの特異的結合であってもよい。例示の標的リガンドとしては、ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン-1、CEA、CD40、CD40リガンド、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、Exodus-2、FAPα、酸性FGF、塩基性FGF、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、ヒト血清アルブミン、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受容体、IL-1受容体type1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72a.a.）、IL-8（77a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト成長因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンフォタクチン、ミューラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67a.a.）、MDC（69a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67a.a.）、MDC（69a.a.）、MIG、MIP-lα、MIP-lβ、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄前駆細胞インヒビター因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFlα、SDFlβ、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-I、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、血清アルブミン、vWF、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、MMP12、PDK1、IgE、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15、IL-15R、IL-16、IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12（SDF-I）、キマーゼ、FGF、フューリン、エンドテリン-1、エオタキシン類（例えば、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3）、GM-CSF、ICAM-I、ICOS、IgE、IFNa、1-309、インテグリン、L-セレクチン、MIF、MIP4、MDC、MCP-I、MMP、好中球エラスターゼ、オステオポンチン、OX-40、PARC、PD-I、RANTES、SCF、SDF-I、siglec-8、TARC、TGFb、トロンビン、Tim-1、TNF、TRANCE、トリプターゼ、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、cMET、CD8、vWF、アミロイドタンパク質（例えば、アミロイドα）、MMP12、PDKl、およびIgEが挙げられる。
特別な実施形態においては、ペプチドまたはポリペプチドをパニングにより回収する。
いくつかの実施形態において、レパートリーはディスプレイシステムを含む。例えば、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳濁液コンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、または共有結合ディスプレイであってもよい。例示のディスプレイシステムは、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴とを連結する。特別な実施形態において、ディスプレイシステムは複製可能な遺伝子パッケージを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイを含む。例えば、バクテリオファージはfd、M13、λ、MS2またはT7であってもよい。特別な実施形態において、バクテリオファージディスプレイシステムは多価である。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドはpIII融合タンパク質として提示される。
他の実施形態において、本発明の方法はさらに、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップを含んでなる。特別な実施形態において、前記核酸はファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
いくつかの実施形態において、前記レパートリーは、例えば血管内皮成長因子（VEGF）と結合しかつそのアンタゴニストである免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。特別な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは重鎖可変ドメインである。さらに特別な実施形態において、重鎖可変ドメインはヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態においては、免疫グロブリン単一可変ドメインは軽鎖可変ドメインである。特別な実施形態において、軽鎖可変ドメインはヒト軽鎖可変ドメインである。
他の態様においては、本発明は、標的リガンド、例えばVEGFと高アフィニティで結合するペプチドまたはポリペプチドをペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから選択する方法である。その方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、そのレパートリーとプロテアーゼをプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、および標的リガンドと結合するペプチドまたはポリペプチドを回収するステップを含んでなる。
レパートリーとプロテアーゼを一般に少なくとも約30分間インキュベートする。次の1種以上のような、任意の所望のプロテアーゼを前記方法で用いることができる：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタルプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンG）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼ。特別な実施形態において、本プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生体抽出液、生体ホモジネートまたは生体調製物により提供することができる。所望であれば、本発明の方法はさらにプロテアーゼインヒビターを、インキュベーション完了後にレパートリーとプロテアーゼの組合わせに加えるステップを含んでなる。
ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に開示した標的リガンドなどの任意の所望の標的リガンドとの結合に基づいて回収することができる。特別な実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドはパニングにより回収される。
いくつかの実施形態において、レパートリーはディスプレイシステムを含む。例えば、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳濁液コンパートメント化ディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、または共有結合ディスプレイであってもよい。例示のディスプレイシステムは、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結する。特別な実施形態において、ディスプレイシステムは複製可能な遺伝子パッケージを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイを含む。例えば、バクテリオファージはfd、M13、λ、MS2またはT7であってもよい。特別な実施形態において、バクテリオファージディスプレイシステムは多価である。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドはpIII融合タンパク質として提示される。
他の実施形態において、本発明の方法はさらに、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップを含んでなる。特別な実施形態において、前記核酸はファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
いくつかの実施形態において、レパートリーは、例えばVEGFと結合しかつそのアンタゴニストである免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。特別な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは重鎖可変ドメインである。さらに特別な実施形態において、重鎖可変ドメインはヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは軽鎖可変ドメインである。特別な実施形態において、軽鎖可変ドメインはヒト軽鎖可変ドメインである。
他の態様において、本発明はプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを生産する方法である。その方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、そのペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼとをプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収し、それによって複数のプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを生産するステップを含んでなる。
いくつかの実施形態においては、レパートリーとプロテアーゼを少なくとも約30分間インキュベートする。例えば、この方法で用いるプロテアーゼは、次のプロテアーゼの1種以上であってもよい：セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタルプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンG）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼ。特別な実施形態において、本プロテアーゼはトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムである。プロテアーゼはまた、生体抽出液、生体ホモジネートまたは生体調製物により提供することができる。所望であれば、本発明の方法はさらにプロテアーゼインヒビターを、インキュベーション完了後にレパートリーとプロテアーゼの組合わせに加えるステップを含んでなる。
いくつかの実施形態においては、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを、結合活性に基づいて回収する。例えば、複数のペプチドまたはポリペプチドを、プロテインA、プロテインGまたはプロテインLなどのジェネリックリガンドとの結合に基づいて回収することができる。結合活性はまた、本明細書に記載の標的リガンドのような、標的リガンドとの特異的結合であってもよい。特別な実施形態においては、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドを、パニングに基づいて回収する。
いくつかの実施形態において、レパートリーはディスプレイシステムを含む。例えば、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳濁液コンパートメント化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、または共有結合ディスプレイであってもよい。特別な実施形態において、ディスプレイシステムは、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結する。特別な実施形態において、ディスプレイシステムは複製可能な遺伝子パッケージを含む。
いくつかの実施形態において、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイを含む。例えば、バクテリオファージはfd、M13、λ、MS2またはT7であってもよい。特別な実施形態において、バクテリオファージディスプレイシステムは多価である。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドはpIII融合タンパク質として提示される。
他の実施形態において、本発明の方法はさらに、所望の生物学的活性を有する複数のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を増幅するステップを含んでなる。特別な実施形態において、前記核酸はファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。
いくつかの実施形態において、レパートリーは、例えばVEGFと結合しかつそのアンタゴニストである免疫グロブリン単一可変ドメインのレパートリーである。特別な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは重鎖可変ドメインである。さらに特別な実施形態において、重鎖可変ドメインはヒト重鎖可変ドメインである。他の実施形態においては、免疫グロブリン単一可変ドメインは軽鎖可変ドメインである。特別な実施形態において、軽鎖可変ドメインはヒト軽鎖可変ドメインである。
他の態様において、本発明はレパートリーから、標的リガンド、例えば、VEGFと結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドを選択する方法である。一実施形態において、本発明の方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップ、そのファージディスプレイシステムとエラスターゼ、ロイコザイムおよびトリプシンからなる群より選択されるプロテアーゼを、プロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、および標的リガンドと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージを回収するステップを含んでなる。
いくつかの実施形態においては、プロテアーゼを100μg/mlで使用し、そして組合わせたファージディスプレイシステムとプロテアーゼを約37℃にて一晩インキュベートする。
いくつかの実施形態においては、標的リガンドと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージを前記標的との結合により回収する。他の実施形態においては、標的リガンドと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提示するファージをパニングにより回収する。
本発明はまた、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した単離されたプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドにも関する。特別な実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した単離されたプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム）耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ヒト抗体重鎖可変ドメイン、ヒト抗体軽鎖可変ドメイン）に関する。
本発明はまた、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン-、エラスターゼ-、またはロイコザイム-耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）をコードする単離されたまたは組換え核酸、ならびに該核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）および宿主細胞に関する。
本発明はまた、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン-、エラスターゼ-、またはロイコザイム-耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）を作製する方法であって、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを生産する発現にとって好適な条件に維持するステップを含んでなる前記方法に関する。
本発明はまた、医療に使用するための（例えば、療法または診断のための）、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン-、エラスターゼ-、またはロイコザイム-耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）に関する。本発明はまた、疾患を治療する医薬品を製造するための、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択したプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン-、エラスターゼ-、またはロイコザイム-耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）の使用に関する。本発明はまた、それを必要とする被験者に有効な量の本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、トリプシン-、エラスターゼ-、またはロイコザイム-耐性免疫グロブリン単一可変ドメイン）を投与するステップを含んでなる、疾患を治療する方法に関する。
本発明はまた、VEGFがサンプル中に存在するかどうかまたはどれだけの量のVEGFがサンプル中に存在するかを確認するための診断キットであって、本発明のポリペプチド、免疫グロブリン可変ドメイン（dAb）またはアンタゴニストおよび使用のための（例えば、サンプル中のVEGFの存在および／または量を確認するための）指示書を含む前記診断キットに関する。いくつかの実施形態において、キットはさらに、好適なバッファーまたは好適な検出試薬（例えば、本発明のポリペプチドもしくはdAbまたはそれと結合もしくはコンジュゲートした部分と結合する、検出可能なように標識した抗体もしくはその抗原結合フラグメント）などの、1以上の補助的な試薬を含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチドアンタゴニストまたはdAbを固体表面上に固定して、固定したポリペプチドまたはdAbがVEGFと結合するようにした固体表面を含むデバイスにも関する。抗体またはその抗原結合フラグメントを固定することができる任意の好適な固体表面、例えば、ガラス、プラスチック、糖類（例えば、アガロースビーズ）を使用することができる。所望であれば、支持体は固定を容易にするために所望の官能基を含有してもよいしまたは含有するように改変してもよい。デバイス、およびまたは支持体は、任意の好適な形状、例えば、シート、ロッド、ストリップ、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、ゲル、チューブ、球、チップ、プレートまたはディッシュなどを有してもよい。いくつかの実施形態において、デバイスはディップスティックである。
ファージディスプレイレパートリーを調製するために使用したpDOM13（aka pDOM33）のマルチクローニングサイトの図解である。 40μg/mlのトリプシンと30℃でインキュベートしたdAbの異なる時点から得たサンプルについて、いくつかのNovex10〜20％ Triceneゲル試験結果を示す。サンプルは、トリプシン添加直前、次いでトリプシン添加後の1時間、3時間および24時間に採取した。タンパク質は1 x SureBlueを用いて染色した。ゲルは、DOM15-10とDOM15-26-501の両方がトリプシンとの最初の3時間のインキュベーション中に有意に消化されたことを図解する。DOM15-26、D0M4-130-54およびDOM1h-131-511の消化はトリプシンによるインキュベーションのほんの24時間後に現れた。 DOMIh-131-511と24種の選択した変異体のアミノ酸配列の図解である。選択したクローン中の親配列と異なるアミノ酸を強調した（同一であるアミノ酸はドットで記した）。CDR1、CDR2およびCDR3に対応するループはボックスで囲んだ。 DOM4-130-54と27種の選択した変異体のアミノ酸配列の図解である。選択したクローン中の親配列と異なるアミノ酸を強調した（同一であるアミノ酸はドットで記した）。CDR1、CDR2およびCDR3に対応するループはボックスで囲んだ。 DOM15-26-555と21種の選択した変異体のアミノ酸配列の図解である。選択したクローン中の親配列と異なるアミノ酸を強調した（同一であるアミノ酸はドットで記した）。CDR1、CDR2およびCDR3に対応するループはボックスで囲んだ。 DOM15-10と16種の選択した変異体のアミノ酸配列の図解である。選択したクローン中の親配列と異なるアミノ酸を強調した（同一であるアミノ酸はドットで記した）。CDR1、CDR2およびCDR3に対応するループはボックスで囲んだ。 図7A〜7Dは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、親dAbであるDOM1h-131-511（図7A）ならびに3種の変異体dAb、DOM1h-131-203（図7B）、DOM1h-131-204（図7C）およびDOM1h-131-206（図7D）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースを示す。結果は、全ての3種の変異体が高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して親より耐性があることを示す。 図7A〜7Dは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、親dAbであるDOM1h-131-511（図7A）ならびに3種の変異体dAb、DOM1h-131-203（図7B）、DOM1h-131-204（図7C）およびDOM1h-131-206（図7D）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースを示す。結果は、全ての3種の変異体が高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して親より耐性があることを示す。 図7A〜7Dは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、親dAbであるDOM1h-131-511（図7A）ならびに3種の変異体dAb、DOM1h-131-203（図7B）、DOM1h-131-204（図7C）およびDOM1h-131-206（図7D）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースを示す。結果は、全ての3種の変異体が高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して親より耐性があることを示す。 図7A〜7Dは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、親dAbであるDOM1h-131-511（図7A）ならびに3種の変異体dAb、DOM1h-131-203（図7B）、DOM1h-131-204（図7C）およびDOM1h-131-206（図7D）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースを示す。結果は、全ての3種の変異体が高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して親より耐性があることを示す。 図8A〜8Cは、エラスターゼおよびロイコザイムとの一晩インキュベーション後の、dAb DOM1h-131-511（図8A）、DOM1h-131-202（図8B）およびDOM1h-131-206（図8C）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースである。これらのdAbは、親と比較して、エラスターゼおよびロイコザイムの両方によるタンパク質分解に対する耐性が増加することを示した。 図8A〜8Cは、エラスターゼおよびロイコザイムとの一晩インキュベーション後の、dAb DOM1h-131-511（図8A）、DOM1h-131-202（図8B）およびDOM1h-131-206（図8C）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースである。これらのdAbは、親と比較して、エラスターゼおよびロイコザイムの両方によるタンパク質分解に対する耐性が増加することを示した。 図8A〜8Cは、エラスターゼおよびロイコザイムとの一晩インキュベーション後の、dAb DOM1h-131-511（図8A）、DOM1h-131-202（図8B）およびDOM1h-131-206（図8C）と固定したTNFR1との結合を示すBIAcoreトレースである。これらのdAbは、親と比較して、エラスターゼおよびロイコザイムの両方によるタンパク質分解に対する耐性が増加することを示した。 dAb DOM1h-131-511、DOM1h-131-203、DOM1h-131-204、DOM1h-131-206、DOM1h-131-54、DOM1h-131-201およびDOM1h-131-202の、トリプシンとのインキュベーション前のサンプルおよび100μg/mlのトリプシンとの1時間、3時間および24時間のインキュベーション後のサンプルについての2つの4〜12％ Novex Bis-Trisゲル試験結果を示す。 図10A〜1OCは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、DOM4-130-54（図10A）、DOM4-130-201（図10B）およびDOM4-130-202（図10C）と固定したIL-1R1融合タンパク質との結合を示すBIAcoreトレースである。結果は、高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して、両方の変異体がそれらの親より耐性があることを示す。 図10A〜1OCは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、DOM4-130-54（図10A）、DOM4-130-201（図10B）およびDOM4-130-202（図10C）と固定したIL-1R1融合タンパク質との結合を示すBIAcoreトレースである。結果は、高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して、両方の変異体がそれらの親より耐性があることを示す。 図10A〜1OCは、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるインキュベーション後の、DOM4-130-54（図10A）、DOM4-130-201（図10B）およびDOM4-130-202（図10C）と固定したIL-1R1融合タンパク質との結合を示すBIAcoreトレースである。結果は、高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して、両方の変異体がそれらの親より耐性があることを示す。 図11A〜11Cは、エラスターゼおよびロイコザイムによる一晩のインキュベーション後の、DOM4-130-54（図11A）、D0M4-130-201（図11B）およびD0M4-130-202（図11C）と固定したIL-1R1融合タンパク質との結合を示すBIAcoreトレースである。これらのdAbは親と比較して、試験した両方のプロテアーゼに対して耐性が増加することを示した。 図11A〜11Cは、エラスターゼおよびロイコザイムによる一晩のインキュベーション後の、DOM4-130-54（図11A）、D0M4-130-201（図11B）およびD0M4-130-202（図11C）と固定したIL-1R1融合タンパク質との結合を示すBIAcoreトレースである。これらのdAbは親と比較して、試験した両方のプロテアーゼに対して耐性が増加することを示した。 図11A〜11Cは、エラスターゼおよびロイコザイムによる一晩のインキュベーション後の、DOM4-130-54（図11A）、D0M4-130-201（図11B）およびD0M4-130-202（図11C）と固定したIL-1R1融合タンパク質との結合を示すBIAcoreトレースである。これらのdAbは親と比較して、試験した両方のプロテアーゼに対して耐性が増加することを示した。 DOM15-26-555と6種の変異体のアミノ酸配列の図解である。選択したクローン中の親配列と異なるアミノ酸を強調した（同一であるアミノ酸はドットで記した）。 図13Aおよび13Bは、親dAb、DOM15-26-555（図13A）および最もプロテアーゼ耐性の高い変異体、DOM15-26-593（図13B）と固定したVEGFとの結合を示すBIAcoreトレースである。親と変異体を、BIAcoreで、200μg/mlの濃度のトリプシンとインキュベーション後に10OnMのdAb濃度におけるhVEGFとの結合について比較した。反応を3時間または24時間、37℃にて実施した。結果は、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、変異体が親より耐性であることを示す。 図13Aおよび13Bは、親dAb、DOM15-26-555（図13A）および最もプロテアーゼ耐性の高い変異体、DOM15-26-593（図13B）と固定したVEGFとの結合を示すBIAcoreトレースである。親と変異体を、BIAcoreで、200μg/mlの濃度のトリプシンとインキュベーション後に10OnMのdAb濃度におけるhVEGFとの結合について比較した。反応を3時間または24時間、37℃にて実施した。結果は、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、変異体が親より耐性であることを示す。 DOM15-26-555変異体によるhVEGF結合に与えるトリプシン処理の効果を示すグラフである。結果は明らかに、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、全ての変異体が親（DOM15-26-555）より耐性があることを示す。 DOM15-26-555またはDOM15-26-593の処理したおよび未処理のサンプル15μgを供給した2つのNovex 10〜20％ Tricineゲルを示す。サンプルは、トリプシン添加直前、次いでトリプシン添加後の1時間、3時間および24時間に採取した。タンパク質を1 x SureBlueを用いて染色した。ゲルは、DOM15-26-593のトリプシン耐性プロファイルがBIAcore実験により示されたプロファイルから変化したことを図解する。 DOM15-10および変異体15-10-11のアミノ酸配列の図解である。変異体中の、親配列と異なるアミノ酸を強調した（同一であるアミノ酸はドットで記した）。 図17Aおよび17Bは、親、DOM15-10（図17A）および変異体、DOM15-10-11（図17B）と固定したVEGFとの結合を示すBIAcoreトレースである。親と変異体を、200μg/mlの濃度のトリプシンとのインキュベーション後に、10OnMのdAb濃度におけるhVEGFとの結合についてBIAcoreで比較した。反応は1時間、3時間および24時間、37℃にて実施した。その結果は、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、親より耐性が高いことを示す。 図17Aおよび17Bは、親、DOM15-10（図17A）および変異体、DOM15-10-11（図17B）と固定したVEGFとの結合を示すBIAcoreトレースである。親と変異体を、200μg/mlの濃度のトリプシンとのインキュベーション後に、10OnMのdAb濃度におけるhVEGFとの結合についてBIAcoreで比較した。反応は1時間、3時間および24時間、37℃にて実施した。その結果は、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、親より耐性が高いことを示す。 DOM15-10およびDOM15-10-11のサンプル15μgを供給した2つのNovex 10〜20％ Tricineゲルを示す。サンプルは、トリプシン添加直前、次いでトリプシン添加後の1時間、3時間および24時間に採取した。タンパク質をSureBlue（1 x）を用いて染色した。結果は、BIAcore試験で見られた結合活性がタンパク質の完全性を直接反映することを示す。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図19A〜19Lは、DOM1h-131-511またはDOM4-130-54の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図3および図4に提示したアミノ酸配列をコードする。 図20A-20Eは、DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図5および図6に提示したアミノ酸配列をコードする。 図20A-20Eは、DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図5および図6に提示したアミノ酸配列をコードする。 図20A-20Eは、DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図5および図6に提示したアミノ酸配列をコードする。 図20A-20Eは、DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図5および図6に提示したアミノ酸配列をコードする。 図20A-20Eは、DOM15-26-555またはDOM15-10の変異体であるdAbをコードするいくつかの核酸のヌクレオチド配列を図解する。ヌクレオチド配列はそれぞれ、図5および図6に提示したアミノ酸配列をコードする。 pDOM38のベクター地図を示す。 25：1のdAb：トリプシン比で30℃にて色々な時点に対してトリプシンで処理したDOM10-53-474およびDOM15-26-593タンパク質のLabchipでのゲル試験結果を示す。矢印は全長タンパク質を示す。 MMCクロマトグラフィと続くアニオン交換による精製後の各サンプルに対して得た高い純度レベルを示すサイズ排除クロマトグラフィトレースである。UVを225nmにてモニターしかつカラムに1 x PBSと10％エタノール（v/v）を流した。単量体のパーセントは基線補正したピーク面積の積分によって計算した。 （続き） DOM1h-131-511、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206に対するプロテアーゼ安定性データを示す。 DOM1h-131-202、DOM1h-131-206およびDOM1h-131-511のBritton-Robinsonバッファー中で37℃および50℃における14日間安定性データを図解するSECである。全てのdAbのタンパク質濃度は1mg/mlであった。時点=0（TO）サンプルと比較して熱ストレス中のタンパク質および溶液中に残る単量体量に変化があったかををSECを用いて確認した。 図26A〜Iは、DOM1h-131-511（A〜C）、DOM1h-131-202（D〜F）およびDOM1h-131-206（G〜I）に与える熱ストレス（37および50℃）の効果を示すSECトレースを示す。また、T=0と比較した所与の時点において残った単量体のパーセントも示す。 （続き） （続き） 24時間、48時間ならびに7および14日間の熱ストレスにおける、DOM1h-131-202、DOM1h-131-206およびDOM1h-131-511のIEF分析を示す。サンプルはBritton-Robinson バッファー中で37℃または50℃にてインキュベートしておいたものである。 DOM1h-131-202、DOM1h-131-206およびDOM1h-131-511の50℃にて14日間インキュベーションの効果を示すTNFR-1 RBAである。タンパク質濃度は1mg/mlであると仮定した。抗原と結合しないネガティブ対照dAb（VHダミー）も示す。 A：DOM1h-131-202、B：DOM1h-131-206、およびC：DOM1h-131-511をほぼ100mg/mlにて7日間Britton-Robinsonバッファー中で+4℃にて貯蔵することの効果を図解する。UVを280nmにてモニターした。 （続き） Pari E-flowおよびLC+におけるDOM1h-131-202、DOM1h-131- 206およびDOM1h-131-511の噴霧器試験から得たデータを示す。いずれのBritton-Robinsonバッファーのタンパク質濃度も5mg/mlであった。 Britton-Robinsonバッファー中で5mg/mlにてDOM1h-131-202、DOM1h-131-206およびDOM1h-131-511の霧化する間の単量体濃度の相対的パーセント変化を図解する。 Pari LC+から霧化後の、Britton-Robinsonバッファー中のDOM1h-131-206およびDOM1h-131-511の、SECトレースを示す。 1時間にわたるPBS中の40mg/mlでの霧化プロセス中のDOM1h-131-206のSECトレースを示す。噴霧器カップとエーロゾル中のタンパク質は、霧化中にdAbが経験しうる剪断と熱ストレスの効果に対して非常に耐性がある。 3種のリードタンパク質（DOM1h-131-206およびDOM1h-131-511およびDOM1h-131-202）のそれぞれに対する沈降速度曲線を示す。DOM1h-131-206の低濃度サンプルについて観察される二項ピークはこの事例における細胞からのサンプル漏洩によるアーチファクトである。 バッファーおよびデバイスがGSK1995056A（DOM1h-131-511）の霧化した小滴サイズに与える効果を示す。 SECにより測定した二量体形成によって試験した様々なデバイスでの霧化後のGSK1995056A（DOM1h-131-511）の安定性である。 PariE-flowおよびLC+における、GSK1922567A（202）、GSK1995057A（206）およびGSK1995056A（511）の噴霧器試験を示す。A）Britton-Robinsonバッファー中の試験、B）PEGlOOO/スクロースバッファー中の試験。 ヒトTNFR1受容体結合アッセイにおけるTNFα用量曲線を示す。各サンプルは4複製を試験した。 ヒトTNFR1受容体結合アッセイにおける、GSKl922567A（DOM1h-131-202）、GSK1995057A（DOM1h-131-206）およびGSK1995056A（DOM1h-131-511）による阻害を示す。各サンプルは4複製を試験した。 VEGF RBAにおけるDOM15-26およびDOM15-26-593dAbの効力を図解する。 ラットへの5mg/mgの単一ボーラス用量の静脈内投与後のDMS1529（DOM15-26-593）およびDMS1545（DOM15-26-501）の薬物動態学を示す。 図42aは、単量体特性を確認する、DMS1529Fc融合体（DOM15-26-593Fc融合体）のSEC-MALLs（サイズ排除クロマトグラフ-多角度レーザー光散乱）分析を示す。2つの異なるバッチを示し、これらは屈折率（すなわち、濃度；破線）および光散乱（実線）に関して類似した特性を実証する。矢印でマークした線は分子量計算を意味する。 図42bは、単量体の特性を確認するDMS1529Fc融合体（DOM15-26-593Fc融合体）のAUC（分析超遠心）分析を示す。1バッチの材料を、PBSバッファー中の3つの異なる濃度、ほぼ0.2、0.5および1.0mg/mlで試験した。沈降速度の分析により、ほぼ8OkDaの分子量を確認した。 DMS1529（DOM15-26-593）およびDOM15-26-501のDSCトレースを示す。 2つの異なるバッチの10凍結-解凍サイクル前後のDMS1529（DOM15-26-593）に対するVEGF結合ELISAである。 10凍結-解凍サイクル前後のDOM15-26-593 SECプロファイルの一貫性を示す。 DMS1529融合体（DOM15-26-593Fc融合体）の加速安定性研究から得た結果を図解する；結合ELISAは示した温度における7日間インキュベーション後の活性を示す。 図47Aは37℃での14および15日間インキュベーション後のカニクイザルの血清におけるDMS1529（DOM15-26-593）の安定性を示す。 図47Bは37℃での14および15日間インキュベーション後のヒトの血清におけるDMS1529（DOM15-26-593）の安定性を示す。 VEGF RBAにおける、DOM15-26およびDOM15-26-593dAbのFc融合体（それぞれDMS1564および1529）としての効力を図解する。 DMS1529融合体（DOM15-26-593FC融合体）によるHUVEC細胞増殖の阻害を図解する。 pDom33ベクター地図である。 図51aは血清アルブミンと結合するdAbのアミノ酸配列を記す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図51bは血清アルブミンと結合するdAbの核酸配列を記す。 （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） （続き） 図52ＡはDOM15-26-593-Fc融合体のアミノ酸配列を記す。 図52Ｂは抗体Fcのアミノ酸配列を記す。 図52ＣはDOM15-26-593-Fc融合体の核酸配列を記す。
本明細書においては、明白かつ簡潔な明細書を書くことができるように、本発明を実施形態に言及して記載ししている。実施形態は、本発明から切り離すことなく、様々に組合わせるまたは分離することができると考えかつ解釈しなければならない。
特に定義していなければ、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者が当技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学）において通常解釈されるのと同じ意味を有する。分子、遺伝および生化学的方法（一般的には、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい；これらは本明細書に参照により組み入れられる）ならびに化学的方法に対する標準技法を使用している。
本明細書で使用する用語「血管内皮成長因子（VEGF）のアンタゴニスト」または「抗VEGFアンタゴニスト」などは、VEGFと結合しかつ（1以上の）VEGFの機能を阻害できる薬剤（例えば、分子、化合物）を意味する。
本明細書で使用する「ペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に接続された約2〜約50個のアミノ酸を意味する。
本明細書で使用する「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に接続された少なくとも約50個のアミノ酸を意味する。ポリペプチドは一般に三次構造を含み、機能性ドメインにフォールドされている。
本明細書で使用する、「プロテアーゼ分解に対する耐性」をもつペプチドまたはポリペプチド（例えばドメイン抗体（dAb））は、プロテアーゼ活性にとって好適な条件下でプロテアーゼとインキュベートしたとき、実質的にプロテアーゼによって分解されない。ポリペプチド（例えば、dAb）が実質的に分解されないというのは、プロテアーゼ活性に好適な温度、例えば37または50℃における約1時間プロテアーゼとのインキュベーションの後に、実質的にタンパク質の約25％以下、約20％以下、約15％以下、約14％以下、約13％以下、約12％以下、約11％以下、約10％以下、約9％以下、約8％以下、約7％以下、約6％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、約1％以下、または実質的に0％がプロテアーゼによって分解される場合である。タンパク質分解は、本明細書に記載の、好適な方法、例えば、SDS-PAGEによりまたは機能性アッセイ（例えば、リガンド結合）により評価することができる。
本明細書で使用する「ディスプレイシステム」は、物理、化学または機能的特徴などの所望の特徴に基づく選択のために、ポリペプチドまたはペプチドのコレクションにアクセスできるシステムを意味する。ディスプレイシステムは、好適なポリペプチドまたはペプチドのレパートリー（例えば、溶液中のまたは好適な支持体に固定されたもの）であってもよい。ディスプレイシステムは、細胞の発現システム（例えば、例えば形質転換、感染、トランスフェクトまたは形質導入した細胞における核酸のライブラリーの発現およびコードされたポリペプチドの細胞表面上のディスプレイ）または無細胞発現システム（例えば、乳濁液コンパートメント化およびディスプレイ）を利用するシステムであってもよい。例示のディスプレイシステムは、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの物理、化学および／または機能的特徴を連結する。かかるディスプレイシステムを利用すると、所望の物理、化学および／または機能的特徴を有するポリペプチドまたはペプチドを選択し、選択したポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸を容易に単離または回収することができる。核酸のコーディング機能とポリペプチドまたはペプチドの物理、化学および／または機能的特徴を連結する多数のディスプレイシステムが当技術分野で公知であり、例えば、バクテリオファージディスプレイ（ファージディスプレイ、例えばファージミドディスプレイ）、リボソームディスプレイ、乳濁液コンパートメント化ディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のディスプレイ、共有結合ディスプレイなどが挙げられる（例えば、EP 0436597（Dyax）、米国特許第6,172,197号（McCaffertyら）、米国特許第6,489,103号（Griffithsら）を参照されたい）。
本明細書で使用する「レパートリー」はアミノ酸配列多様性を特徴とするポリペプチドまたはペプチドのコレクションを意味する。レパートリーの個々のメンバーは、共通の構造的特徴（例えば、共通のコア構造）および／または共通の機能的特徴（例えば、共通のリガンド（例えば、ジェネリックリガンドまたは標的リガンド）と結合する能力）などの共通の特徴を有しうる。
本明細書で使用する「機能的」は特異的な結合特性などの生物学的活性を有するポリペプチドまたはペプチドを記載する。例えば、用語「機能的ポリペプチド」には、その抗原結合部位を介して標的抗原と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれる。
本明細書で使用する「ジェネリックリガンド」は、所与のレパートリーの機能的メンバーの実質的な部分（例えば、実質的に全て）と結合するリガンドを意味する。ジェネリックリガンド（例えば、共通のジェネリックリガンド）は所与のレパートリーの多くのメンバーと結合できるが、そのメンバーは共通の標的リガンドに対する結合特異性を有しなくてもよい。一般に、ポリペプチド上の機能的なジェネリックリガンド結合部位の存在（ジェネリックリガンドと結合する能力により示される）は、そのポリペプチドが正しくフォールドされて機能的であることを示す。ジェネリックリガンドの好適な例としては、スーパー抗原、レパートリーの機能的メンバーの実質的な部分に発現されるエピトープと結合する抗体などが挙げられる。
「スーパー抗原」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相互作用するジェネリックリガンドであって、相互作用する部位がこれらのタンパク質の標的リガンド結合部位とは異なる前記リガンドを意味する当技術分野の用語である。ブドウ球菌のエンテロトキシンはT細胞受容体と相互作用するスーパー抗原の例である。抗体と結合するスーパー抗原としては、IgG定常領域と結合するプロテインG（BjorckおよびKronvall, J.Immunol., 133:969 (1984)）；IgG定常領域およびVHドメインと結合するプロテインA（ForsgrenおよびSjoquist, J.Immunol., 97:822 (1966)）；およびVLドメインと結合するプロテインL（Bjorck, J.Immunol, 140: 1194 (1988)）が挙げられる。
本明細書で使用する「標的リガンド」は、ポリペプチドまたはペプチドが特異的にまたは選択的に結合するリガンドを意味する。例えば、ポリペプチドが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合、標的リガンドはいずれかの所望の抗原またはエピトープであってもよい。標的抗原との結合は、機能的であるポリペプチドまたはペプチドに依存する。
本明細書で使用する「抗体」はIgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEまたはフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド連結Fv、scFv、閉じたコンフォメーションの多特異的抗体、ジスルフィド連結scFv、ダイアボディなど）を意味し、自然に抗体を産生するいずれかの種由来であるか、または組換えDNA技法により作製されたものであるか；血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌から単離されたものである。
本明細書で使用する「抗体フォーマット」は、抗原に対する結合特異性をその構造に与えるために1以上の抗体可変ドメインを組み込むことができるいずれかの好適なポリペプチド構造を意味する。様々な、好適な抗体フォーマットが当技術分野で公知であり、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、Fvフラグメント（例えば、１本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合Fv）、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、dAb、VH、VHH、VL）、および前記のいずれかの改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコールまたは他の好適なポリマーまたはヒト化VHHの共有結合により改変された）が挙げられる。
表現「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、他のV領域またはドメインから独立した、抗原またはエピトープと結合する抗体可変ドメイン（VH、VHH、VL）を意味する。免疫グロブリン単一可変ドメインは他の可変領域または可変ドメインとともに、1つのフォーマット（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）中に存在してもよく、その場合、前記他の領域またはドメインはその単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要でない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインはさらなる可変ドメインとは独立して抗原と結合する）。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書で使用する「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、本明細書で使用する「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。「単一抗体可変ドメイン」は本明細書で使用する「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、一実施形態において、ヒト抗体可変ドメインであるが、また、げっ歯類（例えば、その内容を本明細書に参照によりその全てが組み入れられるWO 00/29004に開示された）、テンジクザメ（nurse shark）およびラクダ科動物VHH dAbなどの他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダ科動物VHHは、天然で軽鎖を欠く重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種から誘導された免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。VHHをヒト化することができる。
「ドメイン」は、タンパク質の残部とは独立した三次構造を有するフォールドされたタンパク質構造である。一般に、ドメインはタンパク質の個別の機能的特性に関わり、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの機能を喪失することなく、他のタンパク質に加えたり、取り除いたりまたは導入することができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの特徴である配列を含むフォールドされたポリペプチドドメインである。単一抗体可変ドメインは、それ故に、完全な抗体可変ドメイン、および、例えば、1以上のループが、抗体可変ドメインの特徴でない配列により置き換えられている改変された可変ドメイン、または末端切断されたかもしくはNまたはC末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも全長ドメインの結合活性および特異性を保持するフォールドされた可変ドメインのフラグメントを含む。
用語「ライブラリー」は異種ポリペプチドまたは核酸の混合物を意味する。ライブラリーは、それぞれが単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成される。この意味では、「ライブラリー」は「レパートリー」と同義語である。ライブラリーメンバー間の配列差はライブラリー中に存在する多様性に関わる。ライブラリーはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態であってもよく、または生物または細胞、例えば、核酸のライブラリーにより形質転換した細菌、ウイルス、動物または植物細胞などの形態であってもよい。一実施形態において、それぞれの個々の生物または細胞は、ただ1つまたは限られた数のライブラリーメンバーを含有する。一実施形態においては、核酸を発現ベクター中に組み込んで、核酸がコードするポリペプチドの発現を可能にする。一態様において、それ故に、ライブラリーは宿主生物の集団の形態をとってもよく、それぞれの生物は、ライブラリーの単一メンバーを核酸形態で含有する発現ベクターの1以上のコピーを含有し、核酸を発現してその対応するポリペプチドメンバーを生産する。従って、宿主生物の集団は多様なポリペプチドの大きいレパートリーをコードする能力を有する。
「ユニバーサルフレームワーク」は、Kabat（"Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services）に定義された配列に保存される抗体の領域に対応する、またはChothiaおよびLesk, (1987) J. MoI. Biol. 196:910-917に定義されたヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。ライブラリーおよびレパートリーは単一フレームワーク、またはかかるフレームワークのセットを利用してもよく、これにより、超可変領域だけの変化を通して実質的にいずれの結合特異性の誘導も可能になることがわかっている。
本明細書で使用する用語「用量」は、被験者に全てを1回投与によりで、または規定した時間内にわたり2回以上の投与により投与するリガンドの量（単位用量）を意味する。例えば、用量は、被験者に1日（24時間）（日用量）、2日、1週、2週、3週または1ヶ月以上のコースにわたり（例えば、1回投与により、または2回以上の投与により）投与するリガンド（例えば、標的抗原と結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンド）の量を意味しうる。用量間の間隔は任意の所望の時間量であってもよい。
表現「半減期」は、リガンド（例えば、dAb、ポリペプチドまたはアンタゴニスト）の血清濃度が、例えば、自然機構によって、リガンドの分解および／またはリガンドのクリアランスもしくは隔離により、in vivoで50％だけ低下するのにかかる時間を意味する。本発明のリガンドは、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する分子と結合することによってin vivoで安定化させかつその半減期を延長することができる。典型的には、かかる分子はそれ自体がin vivoで長い半減期を有する天然のタンパク質である。リガンドの半減期は、もしその機能的活性がin vivoで持続すれば、半減期を増加する分子に特異的でない類似のリガンドより増加する。例えば、ヒト血清アルブミン（HSA）と標的分子に特異的なリガンドを、HSAに対する特異性がない、すなわち、HSAと結合しないが他の分子と結合する同じリガンドと比較する。例えば、そのリガンドは細胞上の第3の標的と結合することができる。典型的には、その半減期は10％、20％、30％、40％、50％またはそれ以上増加する。半減期の2x、3x、4x、5x、10x、2Ox、30x、4Ox、5Oxまたはそれ以上の範囲の増加が可能である。あるいは、またはさらに、半減期の3Ox、4Ox、5Ox、6Ox、7Ox、80x、9Ox、10Ox、15Oxの範囲の増加が可能である。
本明細書で使用する「水力学的サイズ」は、水溶液を通過する分子の拡散に基づく分子の見かけのサイズを意味する。タンパク質の溶液を通過する拡散または運動を解析してタンパク質の見かけのサイズを導き出すことができ、この場合、サイズは、タンパク質粒子の「ストークの半径（Stokes radius）」または「水力学的半径」により与えられる。タンパク質の「水力学的サイズ」は質量と形状の両方に依存し、同じ分子量を有する2つのタンパク質がタンパク質の全体的形状に基づいて異なる水力学的サイズを有しうる。
本明細書で意味する用語「競合する」は、第1の標的とその対応する標的結合ドメインとの結合が、前記の対応する標的に特異的である第2の結合ドメインが存在すると阻害されることを意味する。例えば、立体的に、例えば結合ドメインの物理的ブロッキングにより、または標的に対するアフィニティまたは結合活性が低下する結合ドメインの構造または環境の改変により、結合を阻害されうる。競合ELISAおよび競合BiaCore実験を実施して第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとの間の競合を確認する方法の詳細は、WO 2006038027を参照されたい。
2つの配列の間の「相同性」または「同一性」または「類似性」の計算（これらの用語は本明細書で互換可能として使われている）は次の通り実施される。配列を最適な比較のためにアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第1と第2のアミノ酸または核酸配列の1つまたは両方にギャップを導入してもよく、比較のために非相同性配列を無視してもよい）。一実施形態において、比較のためにアラインメントする参照配列の長さは参照配列全長の少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、80％、90％、100％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が、第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められている場合、その分子はその位置で同一である（本明細書で使用するアミノ酸または核酸「相同性」はアミノ酸または核酸「同一性」と同等である）。2つの配列間の％同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数であり、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れたものである。本明細書に定義したアミノ酸およびヌクレオチド配列アラインメントならびに相同性、類似性または同一性は、アルゴリズム「BLAST 2 Sequences」を用いて、デフォールトパラメーターを使って調製しかつ決定することができる（Tatusova, T.A.ら, FEMS Microbiol Lett, 774:187-188 (1999)）。
選択方法
本発明は、一実施形態において、所望の、例えばVEGFと結合する生物学的活性を有するプロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドを選択する方法によって選択したポリペプチドおよびdAb、例えば抗VEGF dAbに関する。プロテアーゼ分解に対して高度に安定で耐性がありかつ所望の生物学的活性を有するポリペプチドを選択するための効率的なプロセスを作製する方法は、2つの選択圧力を用いる。本明細書に記載した、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドは、一般に生物学的活性を保持する。対照的に、ペプチドおよびポリペプチドに感受性のあるプロテアーゼは、本明細書に記載の方法でプロテアーゼにより切断または消化され、それ故にその生物学的活性を失う。従って、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは、一般に結合活性などのその生物学的活性に基づいて選択される。
本明細書に記載の方法はいくつかの利点を提供する。例えば、本明細書に開示しかつ例示したように、あるプロテアーゼ（例えば、トリプシン）によるタンパク質分解に対する耐性について選択した可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドはまた、他のプロテアーゼ（例えば、エラスターゼ、ロイコザイム）による分解に対する耐性も有する。一実施形態において、プロテアーゼ耐性はペプチドまたはポリペプチドのより高い融点（Tm）と相関がある。より高い融点は、より安定な可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドおよびポリペプチドを示すものである。一実施形態において、プロテアーゼ分解に対する耐性はまた、標的リガンドに対する高いアフィニティ結合と相関がある。従って、本明細書に記載の方法は、所望の生物学的活性を有しかつプロテアーゼ耐性があり安定であるので、in vivo治療および／または診断の用途に好適である、可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチド、ポリペプチドを選択し、単離しおよび／または回収する効率的な道筋を提供する。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性のない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドを越えるPKの改善と相関がある。PKの改善は、AUC（曲線下の面積）の改善および／または半減期の改善であってもよい。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性のない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドを超える、可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドの剪断および／または熱ストレスに対する安定性の改善および／または霧化中の凝集傾向の低下と相関がある。一実施形態において、プロテアーゼ耐性は、例えば、プロテアーゼ耐性のない可変ドメイン、アンタゴニスト、ペプチドまたはポリペプチドを超えて改善される貯蔵安定性の改善と相関がある。一態様においては、1つ、2つ、3つ、4つまたは全ての利点が提供され、その利点はプロテアーゼ分解に対する耐性、高いTmおよび標的リガンドとの高アフィニティ結合などである。
選択方法
一態様においては、プロテアーゼ（例えば、1以上のプロテアーゼ）による分解に耐性があるペプチドおよびポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー（例えば、ディスプレイシステム）から、ペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離しおよび／または回収する方法が提供される。一実施形態においては、本方法は、プロテアーゼ（例えば、1以上のプロテアーゼ）による分解に対して耐性があるペプチドおよびポリペプチドのライブラリーまたはレパートリー（例えば、ディスプレイシステム）から、ポリペプチドを選択し、単離しおよび／または回収する方法である。一般に、本方法は、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップ、そのライブラリーまたはレパートリーとプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、唾液）をプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびプロテアーゼによる分解に耐性がありかつ所望の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離しおよび／または回収するステップを含んでなる。プロテアーゼにより分解されたペプチドまたはポリペプチドは、一般にプロテアーゼの活性によって生物学的活性が低下するかまたはその生物学的活性を失う。従って、プロテアーゼ分解に対して耐性があるペプチドまたはポリペプチドは、結合活性（例えば、ジェネリックリガンドとの結合、特異的なリガンドとの結合、基質との結合）、触媒活性または他の生物学的活性などのそれらの生物学的活性に基づく方法を用いて、選択し、単離しおよび／または回収することができる。
ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーをプロテアーゼ（例えば、1以上のプロテアーゼ）と、プロテアーゼのタンパク質分解活性に好適な条件下で組み合わせる。プロテアーゼのタンパク質分解活性に好適な条件、およびタンパク質分解活性を有する生体調製物または混合物は当技術分野で周知であるか、または当業者は容易に決定することができる。所望であれば、好適な条件は、例えば、プロテアーゼ活性をある範囲のpH条件、プロテアーゼ濃度、温度下で試験することにより、および／またはライブラリーまたはレパートリーとプロテアーゼを反応させる時間の長さを変えることにより、同定または最適化することができる。例えば、いくつかの実施形態において、プロテアーゼ、例えばトリプシンのペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対する比（モル／モル基準で）は800〜80,00（例えば、8,000〜80,000）のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり、例えば、10μg/mlのプロテアーゼを使用する場合、その比は800〜80,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり；または例えば、100μg/mlのプロテアーゼを使用する場合、その比は8,000〜80,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態において、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）のペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対する比（重量／重量で、例えば、μg/μg基準で）は1,600〜160,000（例えば、16,000〜160,000）のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり、例えば、10μg/mlのプロテアーゼを使用する場合、その比は1,600〜160,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり；または例えば、100μg/mlのプロテアーゼを使用する場合、その比は16,000〜160,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態においては、プロテアーゼを少なくとも100または1000μg/mlの濃度で使用し、プロテアーゼ、例えばトリプシンのペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対するプロテアーゼ：ペプチド比（モル／モル基準で）は8,000〜80,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態においては、プロテアーゼを少なくとも10μg/mlの濃度で使用し、プロテアーゼ、例えばトリプシンのペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対するプロテアーゼ：ペプチド比（モル／モル基準で）は800〜80,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態において、例えばCが10μg/mlである場合、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）のペプチドまたはポリペプチド（例えば、可変ドメイン）に対する比（重量／重量で、例えば、μg/μg基準で）は1,600〜160,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドであり；またはCまたはC'が100μg/mlである場合、その比は16,000〜160,000のプロテアーゼ：ペプチドまたはポリペプチドである。一実施形態においては、濃度（cまたはc'）は少なくとも100または1000μg/mlプロテアーゼである。個々のまたは単離されたペプチドまたはポリペプチド（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）、例えば、既にレパートリーまたはライブラリーから単離しておいたものを試験するために、プロテアーゼを、好適なバッファー（例えば、PBS）中のペプチドまたはポリペプチドの溶液に加えて、次のペプチドまたはポリペプチド/プロテアーゼ溶液：例えば、少なくとも約0.01％（w/w）プロテアーゼ／ペプチドまたはポリペプチド、約0.01％〜約5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、約0.05％〜約5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、約0.1％〜約5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、約0.5％〜約5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、約1％〜約5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.01％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.02％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.03％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.04％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.05％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.06％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.07％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.08％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.09％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.1％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.2％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.3％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.4％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.6％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.7％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.8％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約0.9％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約1％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約2％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約3％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、少なくとも約4％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド、または約5％（w/w）プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチドの溶液を作ることができる。その混合物をプロテアーゼ活性にとって好適な温度（例えば、室温、約37℃）にてインキュベートしそしてサンプルを（例えば、1時間、2時間、3時間などの）時間間隔で取ることができる。サンプルを、SDS-PAGE分析またはリガンド結合などの好適な方法を用いてタンパク質分解について分析し、その結果を用いて分解の時間経過を確立することができる。
任意の所望のプロテアーゼを本明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、単一プロテアーゼ、色々なプロテアーゼの任意の所望の組合わせ、またはタンパク質分解活性を有する任意の生体調製物、生体抽出物、または生体ホモジネートを使用することができる。使用するプロテアーゼの同一性（identity）がわかっている必要はない。単独でまたは任意の所望の組合わせで使用できるプロテアーゼの好適な例としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、マトリックスメタルプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、トロンビン、プラスミン、カテプシン（例えば、カテプシンG）、プロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼ1、プロテイナーゼ2、プロテイナーゼ3）、サーモリシン、キモシン、エンテロペプチダーゼ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ9、カスパーゼ12、カスパーゼ13）、カルパイン、フィカイン、クロストリパイン、アクチニダイン、ブロメライン、およびセパラーゼなどが挙げられる。タンパク質分解活性を有する好適な生体抽出物、ホモジネートおよび調製物としては、痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵抽出液、胃液、唾液または涙などが挙げられる。プロテアーゼは、タンパク質分解が起こるための好適な量を使用する。例えば、本明細書に記載のように、プロテアーゼを約0.01％〜約5％（w/w、プロテアーゼ/ペプチドまたはポリペプチド）で使用することができる。プロテアーゼを、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むディスプレイシステム（例えば、ファージディスプレイシステム）と組合わせる場合、例えば、プロテアーゼを約10μg/ml〜約3mg/ml、約10μg/ml、約20μg/ml、約30μg/ml、約40μg/ml、約50μg/ml、約60μg/ml、約70μg/ml、約80μg/ml、約90μg/ml、約100μg/ml、約200μg/ml、約300μg/ml、約400μg/ml、約500μg/ml、約600μg/ml、約700μg/ml、約800μg/ml、約900μg/ml、約1000μg/ml、約1.5mg/ml、約2mg/ml、約2.5mg/mlまたは約3mg/mlの濃度で使用することができる。
プロテアーゼをペプチドまたはポリペプチド（ライブラリーまたはレパートリー）のコレクションと、プロテアーゼの活性に好適である温度にてインキュベートする。例えば、プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションを約20℃〜約40℃の温度にて（例えば、室温、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃にて）インキュベートすることができる。プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションを一緒に、タンパク質分解が起こるのに十分な時間インキュベートする。例えば、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションをプロテアーゼと一緒に、約30分間、約24または約48時間インキュベートすることができる。いくつかの例においては、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションをプロテアーゼと一緒に一晩、または少なくとも約30分間、約1時間、約1.5時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、約24時間、約48時間、またはもっと長くインキュベートする。
一般に、少なくとも初期の選択ラウンドにおいて（例えば、ディスプレイシステムを使用する場合）、プロテアーゼは、選択する所望の生物学的活性を有するクローンの数を、プロテアーゼとのインキュベーションを含まない選択と比較して、少なくとも1オーダーの量だけ低下させることが所望される。特別な例においては、プロテアーゼの量および本方法で用いられる条件は、回収されるクローンの数を、少なくとも約1 log（10のファクター）、少なくとも約2 log（100のファクター）、少なくとも約3 log（1000のファクター）または少なくとも約4 log（10,000のファクター）だけ低下させるのに十分なものである。回収するクローンの所望の低下をもたらすプロテアーゼの好適な量とインキュベーション条件は、通常の方法および／または本明細書に与えたガイダンスを用いて決定することができる。
プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションを組合わせ、任意の好適な方法（例えば、in vitro、in vivoまたはex vivo）を用いてインキュベートすることができる。例えば、プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションを好適な容器に入れて組合わせ、そしてプロテアーゼ活性に好適な温度で、静止、揺動、振とう、旋回などを加えることができる。所望であれば、例えば、ポリペプチドのコレクション（例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはレパートリー）を好適な動物（例えば、マウス）中に導入することにより、プロテアーゼとペプチドまたはポリペプチドのコレクションをin vivoまたはex vivo系で組合わせ、プロテアーゼ活性に十分な時間が経過した後に、ペプチドまたはポリペプチドのコレクションを回収することができる。他の例では、器官または組織をポリペプチドのコレクション（例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはレパートリー）を用いて灌流し、プロテアーゼ活性に十分な時間が経過した後に、ポリペプチドのコレクションを回収する。
インキュベーションの後、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを、結合活性などの所望の生物学的活性に基づいて選択することができる。所望であれば、プロテアーゼインヒビターを選択前に加えることができる。実質的に選択方法を妨害しない、任意の好適なプロテアーゼインヒビター（または2種以上のプロテアーゼの組合わせ）を用いることができる。好適なプロテアーゼインヒビターの例としては、α1-抗トリプシン、α2-マクログロブリン、アマスタチン、アンチパイン、抗トロンビンIII、アプロチニン、4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリドクロリド（AEBSF）、(4-アミジノ-フェニル)-メタン-スルホニルフルオリド（APMSF）、ベスタチン、ベンザミジン、キモスタチン、3,4-ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスファート（DIFP）、E-64、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エラスタチナール、ロイペプチン、N-エチルマレイミド、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、ペプスタチン、1、10-フェナントロリン、ホスホルアミドン、セリンプロテアーゼインヒビター、N-トシル-L-リシン-クロロメチルケトン（TLCK）、Na-トシル-Phe-クロロメチルケトン（TPCK）などが挙げられる。さらに、いくつかのクラスのプロテアーゼのインヒビターを含有する多数の調製物が市販されている［例えば、ロッシュ完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠（Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets(登録商標)）（Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, USA）があり、これはキモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、膵臓エキスおよびトリプシンを阻害する］。
プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを、所望の生物学的活性選択方法を用いて選択することができ、この方法は、所望の生物学的活性有するペプチドおよびポリペプチドを、所望の生物学的活性を有しないペプチドおよびポリペプチドから識別しかつそれらを選択することを可能にする。一般に、プロテアーゼにより消化または切断されたペプチドまたはポリペプチドはその生物学的活性を失う一方、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドは機能性を残存する。従って、生物学的活性に好適なアッセイを用いてプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択することができる。例えば、共通の結合機能（例えば、一般的リガンドの結合、特異的リガンドの結合、または基質の結合）は好適な結合アッセイ（例えば、ELISA、パニング）を用いて試験することができる。例えば、標的リガンドまたはプロテインA、プロテインLなどのジェネリックリガンドまたは抗体と結合するポリペプチドは、パニングによりまたは好適なアフィニティマトリックスを用いて、選択し、単離し、および／または回収することができる。パニングは、リガンド（例えば、ジェネリックリガンド、標的リガンド）の溶液を好適な容器（例えば、チューブ、ペトリ皿）に加え、リガンドを容器の壁に析出させるかまたはコートすることにより実施することができる。過剰なリガンドを洗浄除去してもよく、ポリペプチド（例えば、ファージディスプレイライブラリー）を容器に加えてもよく、そしてその容器を、ポリペプチドが固定したリガンドと結合するのに好適な条件下で維持する。無結合のポリペプチドを洗浄除去してもよく、結合したポリペプチドを、例えば、掻き取りまたはpH低下などの任意の好適な方法を用いて回収してもよい。
ファージディスプレイシステムを用いる場合、結合はファージELISAで試験することができる。ファージELISAは任意の好適な手順に従って実施することができる。一例として、選択の各ラウンドで生じたファージの集団を、選択した標的リガンドまたはジェネリックリガンドに対する結合についてELISAによりスクリーニングし、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを提示するファージを同定することができる。所望であれば、可溶ペプチドおよびポリペプチドを、標的リガンドまたはジェネリックリガンドに対する結合について、例えばELISAにより試薬を用いて、例えば、CまたはN末端タグに対して試験することができる（例えば、Winterら, (1994) Ann.Rev.Immunology 12, 433-55および同書の引用を参照されたい）。選択したファージの多様性はまた、PCR産物のゲル電気泳動により（Marksら, 1991, 前掲；Nissimら, 1994, 前掲）、プロービング（Tomlinsonら, (1992) J. Mol. Biol. 227, 116）またはベクターDNAの配列決定により試験することもできる。
VEGFに対する特異性に加えて、抗VEGFプロテアーゼ耐性ポリペプチド（例えば、単一抗体可変ドメイン）を含むアンタゴニストまたはポリペプチド（例えば、二重特異的リガンド）は、任意の所望の標的リガンド、例えば、ジェネリックリガンドまたはサイトカイン、成長因子、サイトカイン受容体、成長因子受容体、酵素（例えば、プロテアーゼ）、酵素の補因子、DNA結合タンパク質を含むヒトまたは動物タンパク質、脂質および糖類などに対する結合特異性を有することができる。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、dAb）またはアンタゴニストは、肺組織中のVEGFと結合する。一実施形態においては、アンタゴニストまたはポリペプチドはまた、肺組織中のさらなる標的とも結合する。
ディスプレイシステム（例えば、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結するディスプレイシステム）を本明細書に記載の方法で用いる場合、選択したペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増加することは有利であることが多い。こうすることは、本明細書に記載の方法または他の好適な方法を用いてさらなる選択のラウンドのための十分な量の核酸および／またはペプチドまたはポリペプチドを得るための、またはさらなるレパートリー（例えば、アフィニティ成熟レパートリー）を調製するための効率的な道筋を与える。従って、いくつかの実施形態において、本方法は、ディスプレイシステム（例えば、ファージ ディスプレイのように、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結するもの）を用いるステップ、ならびに、選択したペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増加するステップをさらに含んでなる。核酸をファージ増幅、細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応などの好適な方法を用いて増幅することができる。
本明細書に記載の方法は、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド、例えばdAbを単離するプログラムの一部分として利用することができ、このプログラムは、所望であれば、他の好適な選択方法を含んでもよい。その場合、本明細書に記載の方法は、他の選択方法を使う前または後などの任意の所望の時点で利用することができる。本明細書に記載の方法はまた、本明細書に記載および例示した選択を2回以上行うこともできる。
一例において、本発明の方法はVEGFと特異的に結合しかつトリプシンによる分解に耐性があるペプチドまたはポリペプチド、例えばdAbを選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップ、トリプシンによるタンパク質分解消化に好適な条件下でライブラリーまたはレパートリーをトリプシンと組合わせるステップ、ならびにトリプシンによる分解に耐性がありかつVEGFと特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収するステップを含む前記方法である。
特別な実施形態においては、トリプシンによる分解に耐性がありかつVEGFと特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を選択する方法が提供される。これらの実施形態においては、dAbを含むライブラリーまたはレパートリーを提供し、そしてトリプシンによるタンパク質分解消化に好適な条件下でトリプシン（またはトリプシンを含む生体調製物、抽出物またはホモジネート）と組合わせる。VEGFと特異的に結合するトリプシン耐性のdAbを選択する。例えば、トリプシン耐性dAbは、37℃にてトリプシンの0.04％（w/w）溶液中で少なくとも約2時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。一実施形態において、トリプシン耐性dAbは、37℃にてトリプシンの0.04％（w/w）溶液中で少なくとも約3時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。一実施形態において、トリプシン耐性dAbは、37℃にてトリプシンの0.04％（w/w）溶液中で、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、または少なくとも約6時間、または少なくとも約8時間、または少なくとも約9時間、または少なくとも約10時間、または少なくとも約11時間、または少なくとも約12時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。
ある例示の実施形態においては、トリプシンによる分解に耐性がありかつVEGFと特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を選択する方法が提供される。本方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップ、ファージディスプレイシステムをトリプシン（約100μg/ml）と組合わせるステップ、およびその混合物を約37℃にて、例えば、一晩（例えば、約12〜16時間）インキュベートするステップ、ならびに次いでVEGFと特異的に結合するdAbを提示するファージを選択するステップを含んでなる。
他の例において、その方法は、エラスターゼによる分解に耐性のあるペプチドまたはポリペプチド、例えば、dAbを選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップ、そのライブラリーまたはレパートリーとエラスターゼ（またはエラスターゼを含む生体調製物、抽出物もしくはホモジネート）をエラスターゼによるタンパク質分解消化に好適な条件下で組合わせるステップ、およびエラスターゼによる分解に耐性がありかつVEGF結合活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離しおよび／または回収するステップを含んでなる前記方法である。
特別な実施形態においては、エラスターゼによる分解に耐性がありかつVEGFと結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を選択する方法を提供する。これらの実施形態においては、dAbを含むライブラリーまたはレパートリーを提供し、そしてエラスターゼによるタンパク質分解消化に好適な条件下でエラスターゼ（またはエラスターゼを含む生体調製物、抽出物またはホモジネート）と組合わせる。VEGFと特異的に結合するエラスターゼ耐性のdAbを選択する。例えば、エラスターゼ耐性dAbは、37℃にてエラスターゼの0.04％（w/w）溶液中で少なくとも約2時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。一実施形態において、エラスターゼ耐性dAbは、37℃にてエラスターゼの0.04％（w/w）溶液中で少なくとも約12時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。一実施形態において、エラスター耐性dAbは、37℃にてエラスターの0.04％（w/w）溶液中で、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、または少なくとも約48時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。
ある実施形態においては、エラスターゼによる分解に耐性がありかつVEGFと結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を選択する方法が提供される。本方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップ、ファージディスプレイシステムをエラスターゼ（約100μg/ml）と組合わせるステップ、およびその混合物を約37℃にて、例えば、一晩（例えば、約12〜16時間）インキュベートするステップ、ならびに次いでVEGFと特異的に結合するdAbを提示するファージを選択するステップを含んでなる。
一例においては、ロイコザイムによる分解に耐性があるペプチドまたはポリペプチド（例えばdAb）を選択する方法であって、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーを提供するステップ、ロイコザイムによるタンパク質分解消化に好適な条件下でライブラリーまたはレパートリーをロイコザイム（またはロイコザイムを含む生体調製物、抽出物またはホモジネート）と組合わせるステップ、ならびにロイコザイムによる分解に耐性がありかつ特異的なVEGF結合活性を有するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離し、および／または回収するステップを含む前記方法を提供する。
特別な実施形態においては、ロイコザイムによる分解に耐性がありかつVEGFと結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を選択する方法が提供される。これらの実施形態においては、dAbを含むライブラリーまたはレパートリーを提供し、そしてロイコザイムによるタンパク質分解消化に好適な条件下でロイコザイム（またはロイコザイムを含む生物学的調製物、抽出物またはホモジネート）と組合わせる。VEGFと特異的に結合するロイコザイム耐性dAbを選択する。例えば、ロイコザイム耐性dAbは、37℃にてエラスターゼの0.04％（w/w）溶液中で少なくとも約2時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。一実施形態において、ロイコザイム耐性dAbは、37℃にてロイコザイムの0.04％（w/w）溶液中で少なくとも約12時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。一実施形態においては、ロイコザイム耐性dAbは、37℃にてロイコザイムの0.04％（w/w）溶液中で、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間インキュベートしたときに、実質的に分解されない。
ある例示の実施形態においては、ロイコザイムによる分解に耐性がありかつ特異的にVEGFと結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（dAb）を選択する方法を提供する。その方法は、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイシステムを提供するステップ、ファージディスプレイシステムをロイコザイム（約100μg/ml）と組合わせるステップ、およびその混合物を約37℃にて、例えば、一晩（例えば、約12〜16時間）インキュベートするステップ、ならびに次いで特異的にVEGFと結合するdAbを提示するファージを選択するステップを含んでなる。
他の態様においては、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、dAb）のレパートリーを作製する方法を提供する。その方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、そのペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼをプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを選択する、VEGFと特異的に結合する複数のペプチドまたはポリペプチドを回収するステップを含んでなる。その方法における使用に好適であるプロテアーゼ、ディスプレイシステム、プロテアーゼ活性のための条件、およびペプチドまたはポリペプチドを選択する方法は、他の方法についても本明細書に記載している。
いくつかの実施形態においては、その方法は、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むディスプレイシステム（例えば、核酸のコーディング機能と核酸がコードするペプチドまたはポリペプチドの機能的特徴を連結するディスプレイシステム）を使用し、さらに複数の選択したペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増幅または増加するステップを含んでなる。核酸は、ファージ増幅、細胞成長またはポリメラーゼ連鎖反応などの好適な方法を用いて増幅することができる。
特別な実施形態においては、抗VEGF dAbを含むプロテアーゼ耐性ポリペプチドのレパートリーを作製する方法を提供する。その方法は、抗VEGF dAbを含むポリペプチドのレパートリーを提供するステップ、ペプチドまたはポリペプチドのレパートリーとプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム）をプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびVEGFに対して結合特異性を有するdAbを含む複数のポリペプチドを回収するステップを含んでなる。本方法を用いて、ナイーブなレパートリー、またはVEGFに対する結合特異性を有する親dAbに基づくアフィニティ成熟レパートリーのような、所望の結合特異性への傾向をもつレパートリーを作製することができる。
ポリペプチド・ディスプレイシステム
一実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するために提供されるペプチドまたはポリペプチドのレパートリーまたはライブラリーは、好適なディスプレイシステムを含む。ディスプレイシステムは、プロテアーゼ（例えば、単一プロテアーゼまたはプロテアーゼの組合わせ）、およびタンパク質分解活性を有する任意の成体抽出物、ホモジネートまたは調製物（例えば、痰、粘液（例えば、胃粘液、鼻粘液、気管支粘液）、気管支肺胞洗浄液、肺ホモジネート、肺抽出液、膵臓抽出液、胃液、唾液、涙など）による分解に耐性でありうる。一実施形態において、ディスプレイシステムおよびディスプレイシステムと提示されるポリペプチドとの間の連結は、レパートリーの最も安定なペプチドまたはポリペプチドと少なくとも同じプロテアーゼに対する耐性を有する。これにより、選択して提示されるポリペプチドをコードする核酸を容易に単離しおよび／または増幅することが可能になる。
一例では、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド、例えばdAbを、溶液中に存在する、あるいはプラスチックまたはガラス（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロアレイなどのポリペプチドアレイ）などの好適な表面に共有結合または非共有結合で付着しているペプチドまたはポリペプチドのレパートリーから選択し、単離しおよび／または回収することができる。例えば、表面上に、それぞれ個別のライブラリーメンバー（例えば、ユニークなペプチド配列）がアレイ中の区切られた所定位置に配置するように作られた、ペプチドのアレイを利用することができる。かかるアレイ中のそれぞれのライブラリーメンバーの同一性は、アレイ中のその空間的位置により決定することができる。例えば、空間的位置に基づいて反応性メンバーの配列を同定して、標的リガンドと反応性ライブラリーメンバーとの間の結合相互作用が起こるアレイ中の位置を決定する（例えば、米国特許第5,143,854号、WO90/15070およびWO92/10092を参照されたい）。
一実施形態において、その方法は、核酸のコーディング機能と核酸がコードするポリペプチドの物理的、化学的および／または機能的特徴とを連結するディスプレイシステムを使用する。かかるディスプレイシステムはバクテリオファージまたは細胞（細菌）などの複数の複製可能な遺伝子パッケージを含んでもよい。一実施形態においては、ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーを含む。
いくつもの好適なバクテリオファージディスプレイシステム（例えば、一価のディスプレイおよび多価のディスプレイシステム）が記載されている。（例えば、Griffithsら、米国特許第6,555,313 Bl号（本明細書に参照により組み入れられる）；Johnsonら、米国特許第5,733,743号（本明細書に参照により組み入れられる）；McCaffertyら、米国特許第5,969,108号（本明細書に参照により組み入れられる）；Mulligan-Kehoe、米国特許第5,702,892号（本明細書に参照により組み入れられる）；Winter, G.ら, Annu.Rev.Immunol.12:433-455 (1994)；Soumillion, P.ら, Appl Biochem.Biotechnol 47(2-3): 175-189 (1994)：175-189（1994）；Castagnoli, L.ら, Comb.Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133(2001)を参照されたい）。例えば、バクテリオファージディスプレイシステムで提示されるペプチドまたはポリペプチドは、任意の糸状ファージ（例えば、fd、Ml3、Fl）、溶菌ファージ（例えば、T4、T7、λ）、またはRNAファージ{例えば、MS2）などの好適なバクテリオファージ上に提示することができる。
一般に、ペプチドまたはファージポリペプチドのレパートリーを好適なファージコートタンパク質（例えば、fd pIIIタンパク質）との融合タンパク質として提示するファージのライブラリーを作製するかまたは提供する。融合タンパク質は、ファージコートタンパク質の先端に、または、所望であれば、内部位置にペプチドまたはポリペプチドを提示することができる。例えば、提示するペプチドまたはポリペプチドは、pIIIのドメイン1のアミノ末端位置に存在してもよい（pIIIのドメイン1はN1とも呼ばれる）。提示するポリペプチドはpIII（例えば、pIIIのドメイン1のN末端）と直接融合していてもまたはリンカーを用いて融合していてもよい。所望であれば、融合体はさらにタグ（例えば、mycエピトープ、Hisタグ）を含んでもよい。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として提示するペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリーは、提示するペプチドまたはポリペプチドをコードするファージベクターまたはファージミドベクターを好適な宿主細菌中に導入しかつ得られる細菌を培養してファージを作るなどの任意の好適な方法を用いて（例えば、好適なヘルパーファージを用いるかまたは所望であればプラスミドを補って）作ることができる。ファージのライブラリーは、沈降および遠心分離などの好適な方法を用いて培養物から回収することができる。
ディスプレイシステムは、任意の所望の量の多様性を有するペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むことができる。例えば、レパートリーは、ある生物、生物のグループ（例えば、ラクダ科動物から単離したVHH dAbの配列のレパートリー）、所望の組織または所望の細胞型により発現された天然のポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含有してもよく、または無作為なまたは無作為化したアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含有してもよい。所望であれば、ポリペプチドは共通のコアまたはスカフォールドを共有してもよい。かかるレパートリーまたはライブラリー中のポリペプチドは、無作為なまたは無作為化したアミノ酸配列の規定された領域および共通のアミノ酸配列の領域を含んでもよい。ある特定の実施形態において、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドは、所望の酵素（例えば、ポリメラーゼ）などの所望の型または所望の抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ヒトVHまたはヒトVL）である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドディスプレイシステムはそれぞれのポリペプチドが抗体可変ドメインを含むポリペプチドのレパートリーを含むものである。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドはVH、VLまたはFv（例えば、１本鎖Fv）を含有しうる。
アミノ酸配列多様性を、任意の好適な方法を用いてペプチドまたはポリペプチドまたはスカフォールドの任意の所望の領域中に導入することができる。例えば、任意の好適な変異誘発法（例えば、低信頼度PCR、オリゴヌクレオチド介在性または部位特異的変異誘発、NNKコドンを用いる多様性）または任意の他の好適な方法を用いて多様化したポリペプチドをコードする核酸のライブラリーを調製することにより、アミノ酸配列多様性を抗体可変ドメインまたは疎水性ドメインの相補性決定領域などの標的領域中に導入することができる。所望であれば、ポリペプチドの多様化する領域を無作為化することができる。
レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは主に選択の問題であって、均一なポリペプチドサイズを必要としない。一実施形態において、レパートリー中のポリペプチドは少なくとも三次構造を有する（少なくとも1つのドメインを形成する）。
選択／単離／回収
プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドの一集団）は、好適な方法を用いてレパートリーまたはライブラリー（例えば、ディスプレイシステムで）から選択し、単離しおよび／または回収することができる。一実施形態においては、プロテアーゼ耐性ポリペプチドを、選択可能な特徴（例えば、物理的特徴、化学的特徴、機能的特徴）に基づいて選択しまたは単離する。好適である、選択可能な機能的特徴としては、レパートリーのペプチドまたはポリペプチドの生物学的活性、例えば、ジェネリックリガンド（例えば、スーパー抗原）との結合、標的リガンド（例えば、抗原、エピトープ、基質）との結合、抗体（例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現されるエピトープを介する）との結合、および触媒活性が挙げられる（例えば、Tomlinsonら、WO 99/20749；WO 01/57065；WO 99/58655を参照）。一実施形態において、選択はVEGFとの特異的結合に基づく。他の実施形態においては、選択をメンバーがプロテアーゼ耐性である第2のレパートリーを生じる機能的特性の選択に基づいて行い、次いで第2のレパートリーからVEGFと特異的に結合するメンバーを選択する。
いくつかの実施形態においては、実質的に全てのプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドが共通の選択可能な特性を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択および／または単離する。例えば、実質的に全てのプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドが共通のジェネリックリガンドと結合する、共通の標的リガンドと結合する、共通の抗体と結合する（または、共通の抗体が結合する）、または共通の触媒活性を有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリーまたはレパートリーから、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを選択することができる。この選択のタイプは、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティ成熟を行うときに、所望の生物学的活性を有する親ペプチドまたはポリペプチドに基づくプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを調製するために特に有用である。
共通のジェネリックリガンドとの結合に基づく選択は、元来のライブラリーまたはレパートリーの成分であったプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドの全てまたは実質的に全てを含有するペプチドまたはポリペプチドのコレクションまたは集団を得ることができる。例えば、標的リガンドまたはプロテインA、プロテインLもしくは抗体などのジェネリックリガンドと結合するペプチドまたはポリペプチドを、パニングによりまたは好適なアフィニティマトリックスを用いて、選択し、単離し、および／または回収することができる。パニングは、リガンド（例えば、ジェネリックリガンド、標的リガンド）の溶液を好適な容器（例えば、チューブ、ペトリ皿）に加え、リガンドが容器の壁に析出するかまたはコートするようにして実施することができる。過剰なリガンドを洗浄除去し、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとインキュベートしておいたレパートリー）を容器に加え、そしてペプチドまたはポリペプチドが固定したリガンドと結合するのに好適な条件下に容器を維持することができる。無結合のポリペプチドを洗浄除去し、結合したポリペプチドを、例えば、掻き取りまたはpH低下などのいずれかの好適な方法を用いて回収することができる。
好適なリガンドアフィニティマトリックスは一般に、リガンドを共有結合または非共有結合で付着させた固体支持体またはビーズ（例えば、アガロース）を含有する。アフィニティマトリックスをペプチドまたはポリペプチド（例えば、プロテアーゼとインキュベートしておいたレパートリー）と、バッチプロセス、カラムプロセスまたは任意の他の好適なプロセスを用いてペプチドまたはポリペプチドとマトリックス上のリガンドとの結合に好適な条件下で、組合わせることができる。アフィニティマトリックスと結合しないペプチドまたはポリペプチドを洗浄除去し、結合したペプチドまたはポリペプチドを、低pHバッファーによる、穏やかな変性剤（例えば、尿素）による、またはリガンドとの結合を競合するペプチドによるなどの好適な方法を用いて溶出し、回収することができる。一例では、ビオチン化した標的リガンドをレパートリーと、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドが標的リガンド（VEGF）と結合するのに好適な条件下で組合わせる。結合したペプチドまたはポリペプチドを、固定したアビジンまたはストレプトアビジン（例えば、ビーズ上の）を用いて回収する。
いくつかの実施形態において、ジェネリックリガンドは抗体またはその抗原結合フラグメントである。ライブラリーまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチドに実質的に保存されたペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴と結合する抗体または抗原結合フラグメントは特にジェネリックリガンドとして有用である。プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを単離し、選択しおよび／または回収するためのリガンドとして用いるのに好適な抗体および抗原結合フラグメントは、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の好適な方法を用いて調製することができる。
ライブラリー／レパートリー
他の態様においては、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドのレパートリー、プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドをコードするライブラリー、およびかかるライブラリーおよびレパートリーを作製する方法を提供する。
プロテアーゼ耐性のペプチドおよびポリペプチドをコードおよび／または含有するライブラリーは、任意の好適な方法を用いて調製または取得することができる。ライブラリーは、目的のペプチドまたはポリペプチド（例えば、ライブラリーから選択される抗VEGFペプチドまたはポリペプチド）に基づいて、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドをコードするように設計することができるし、または本明細書に記載の方法を用いて他のライブラリーから選択することができる。例えば、プロテアーゼ耐性ポリペプチドを濃縮したライブラリーを、好適なポリペプチドディスプレイシステムを用いて調製することができる。
一例においては、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、VH、Vk、Vλ）を含む提示されたポリペプチドのレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーとプロテアーゼを本明細書に記載のプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせる。プロテアーゼ耐性ポリペプチドが増強されたファージディスプレイライブラリーを得て、結合活性（例えば、ジェネリックリガンドと結合する、標的リガンドと結合する）などの所望の生物学的活性に基づいて回収する。一実施形態においては、回収は、ジェネリックリガンドとの結合に基づいて増強されたライブラリーを得て、次いでVEGFとの特異的結合に基づいてライブラリーの抗VEGFメンバーを選択する。
他の例では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、VH、Vk、Vλ）を含む提示されたポリペプチドのレパートリーを含むものであるファージディスプレイライブラリーを最初にスクリーニングして、所望の標的抗原（VEGF）に対して結合特異性を有するレパートリーのメンバーを同定する。所望の結合特異性を有するポリペプチドのコレクションを回収し、そのコレクションをプロテアーゼと本明細書に記載のタンパク質分解活性に好適な条件下で組合わせる。所望の標的結合特異性を有するプロテアーゼ耐性ポリペプチドのコレクションを回収して、プロテアーゼ耐性および高アフィニティのポリペプチドが濃縮されたライブラリーを得る。本明細書に記載のように、ある実施形態においては、この選択方法でのプロテアーゼ耐性は高アフィニティ結合と相関がある。
ポリペプチドの所望の型のレパートリーをコードするライブラリーは、任意の好適な方法を用いて作ることができる。例えば、所望の型のポリペプチド（例えば、ポリメラーゼ、免疫グロブリン可変ドメイン）をコードする核酸配列を得て、例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（PCR）系を用いて増幅することにより、化学的突然変異誘発（Dengら, J.Biol.Chem., 269:9533 (1994)）によりまたは細菌の変異誘発株（Lowら, J.MoI.Biol., 260:359 (1996)）を用いて、それぞれ1以上の変異を含有する核酸のコレクションを調製することができる。
他の実施形態においては、核酸の特別な領域を多様性に対して標的化することができる。選択した位置を変異誘発する方法も当技術分野では周知であり、例えば、PCRの使用を伴うまたは伴わないミスマッチオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの使用が挙げられる。例えば、合成抗体ライブラリーが、突然変異を抗原結合ループに標的化することにより作製されている。無作為なまたは半無作為な抗体H3およびL3領域を生殖系列免疫グロブリンV遺伝子セグメントに付加して、無変異のフレームワーク領域を伴う大きいライブラリーが作製されている（Hoogenboom and Winter (1992) 前掲； Nissimら,（1994） 前掲； Griffithsら,（1994） 前掲； DeKruifら,（1995） 前掲）。かかる多様化はいくつかのまたは全ての他の抗原結合ループを含むまで拡大されている（Crameriら, (1996) Nature Med., 2:100；Riechmannら, (1995) Bio/Technology, 13:475；Morphosys, WO 97/08320, 前掲）。他の実施形態においては、例えば、第1のPCRの産物を「メガプライマー」として利用する2ステップPCR手法により、核酸の特別な領域を多様性に対して標的化することができる（例えば、Landt、O.ら、Gene 96：125-128（1990））。
標的化多様性はまた、例えば、SOE PCRにより達成することもできる（例えば、Horton, R.M.ら, Gene 77:61-68 (1989)を参照）。
選択した位置における配列多様性は、ポリペプチドの配列を明示するコード配列を、いくつもの可能なアミノ酸（例えば、20種全てまたはそのサブセット）をその位置に組み込むように改変することによって達成することができる。IUPAC命名法を用いると、最も汎用しうるコドンはNNKであり、これは全てのアミノ酸ならびにタグ停止コドンをコードする。NNKコドンは所要の多様性を導入するために利用することができる。同じ目的を達成する他のコドンも使われ、それには、さらなる停止コドンTGAおよびTAAを生じるNNNコドンが含まれる。かかる標的化手法により、標的領域中の全配列空間を探求することが可能になる。
ライブラリーは公知の主鎖コンフォメーションを有するプロテアーゼ耐性の抗体ポリペプチドを含んでもよい（例えば、Tomlinsonら, WO 99/20749を参照）。
ライブラリーは好適なプラスミドまたはベクターで調製することができる。本明細書で使用する「ベクター」は、その発現および／または複製のために異種DNAを細胞中に導入するのに用いる個別のエレメントを意味する。プラスミド（例えば、細菌プラスミド）、ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体およびエピソームベクターを含む、任意の好適なベクターを利用することができる。かかるベクターを単純なクローニングおよび変異誘発に用いてもよいし、または発現ベクターをライブラリーの発現を駆動するために用いてもよい。ベクターおよびプラスミドは通常、1以上のクローニングサイト（例えば、ポリリンカー）、複製起点および少なくとも1つの選択可能なマーカー遺伝子を含有する。発現ベクターはさらに、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結シグナル、シグナル配列などのポリペプチドの転写と翻訳を駆動するエレメントを含有しうる。これらのエレメントを、ポリペプチドをコードするクローニングされたインサートと機能しうる形で連結された方法で配置し、かかる発現ベクターを発現に好適な条件下に（例えば、好適な宿主細胞で）維持すると前記ポリペプチドが発現されかつ生産されるようにする。
クローニングベクターおよび発現ベクターは一般に、ベクターが1以上の選択された宿主細胞で複製できるようにする核酸配列を含有する。典型的なクローニングベクターにおいて、この配列はベクターが宿主染色体DNAとは独立して複製できるようにする配列であって、複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母およびウイルスのかかる配列は、周知である。プラスミドpBR322由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、2ミクロンプラスミド起点は酵母に好適であり、そして様々なウイルス起点（例えばSV40、アデノウイルス）は哺乳動物細胞のクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点は哺乳動物の発現ベクターに必要でないが、これらをCOS細胞などの哺乳動物細胞に用いると高レベルのDNAを複製することができる。
クローニングまたは発現ベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有してもよい。かかるマーカー遺伝子は、選択培地で増殖する形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターによって形質転換されていない宿主細胞は、それ故に、培地で生存し得ない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える、栄養要求性欠失を補完する、または増殖培地で利用できない供給必須の栄養を補給するタンパク質をコードする。
好適な発現ベクターはいくつもの構成要素、例えば、複製起点、選択可能マーカー遺伝子、1以上の発現制御エレメント、例えば転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または1以上の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列などを含有しうる。発現制御エレメントおよびシグナルまたはリーダー配列は、もし存在すれば、ベクターまたは他の供給源により提供することができる。例えば、抗体鎖をコードするクローニングした核酸の転写および／または翻訳制御配列を用いて発現を指令することができる。
所望の宿主細胞における発現のためのプロモーターを提供することができる。プロモーターは構成的であってもまたは誘導性であってもよい。例えば、プロモーターを、核酸の転写を指令するように、抗体、抗体鎖またはそれらの部分をコードする核酸と機能しうる形で連結することができる。原核生物宿主（例えば、大腸菌用のβ-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系、lac、tac、T3、T7プロモーター）および真核生物宿主（例えば、サルウイルス40初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、EG-1aプロモーター）に対する様々な好適なプロモーターを利用しうる。
さらに、典型的な発現ベクターは、ベクターを担持する宿主細胞を選択するための選択可能なマーカー、および複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。抗生物質または薬物耐性を与える産物をコードする遺伝子が通常の選択可能なマーカーであって、原核細胞（例えば、β-ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性のためのTet遺伝子）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（G418またはジェネティシン）、gpt（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）において利用することができる。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は様々な宿主においてメトトレキセートによる選択を可能にする。酵母では、宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、LEU2、URA3、HIS3）が選択可能なマーカーとしてしばしば利用される。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、ならびにレトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノム中に組み込むことができるベクターの使用も考えられる。
原核生物（例えば、大腸菌などの細菌細胞）または哺乳動物細胞における発現のために好適な発現ベクターとしては、例えば、pETベクター（例えば、pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40；Novagen、その他）、ファージベクター（例えば、pCANTAB5E；Pharmacia）、pRIT2T（プロテインA融合ベクター；Pharmacia）、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、pEF-1（Invitrogen、Carlsbad、CA）、pCMV-SCRIPT、pFB、pSG5、pXT1（Stratagene、La Jolla、CA）、pCDEF3（Goldman, L.A.ら, Biotechniques, 21: 1013-1015 (1996)）、pSVSPORT（GibcoBRL、Rockville、MD）、pEF-Bos（Mizushima, S.ら, Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)）などが挙げられる。原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエ Schnieder S2細胞、Sf9）、酵母（P.methanolica、P.pastoris、S.cerevisiae）および哺乳動物細胞（例えば、COS細胞）などの様々な宿主における使用に好適である発現ベクターが利用可能である。
ベクターの例は、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列を発現できる発現ベクターである。従って、ジェネリックおよび／または標的リガンドによる選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖と発現により実施することができる。先に記載のように、選択ディスプレイシステムはバクテリオファージディスプレイであってもよい。従って、ファージまたはファージミドベクターを用いることができる。ベクターの例は、大腸菌複製起点（2本鎖複製のための）およびまたファージ複製起点（1本鎖DNA作製のための）を有するファージミドベクターである。かかるベクターの遺伝子操作と発現は当技術分野で周知である（HoogenboomおよびWinter（1992）前掲；Nissimら,（1994）前掲）。簡単に説明すると、ベクターは、ファージミドを選択するためのβ-ラクタマーゼ遺伝子、lacプロモーターおよびその下流の発現カセットを含有することができ、前記発現カセットは好適なリーダー配列、マルチクローニングサイト、1以上のペプチドタグ、1以上のタグ停止コドンおよびファージタンパク質pIIIを含有しうる。従って、大腸菌の様々なサプレッサーおよび非サプレッサー株を用いて、グルコース、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）またはVCSM13などのヘルパーファージを付加すると、このベクターは、大量のポリペプチドライブラリーメンバーだけ、またはそのいくつかがその表面上にポリペプチド-pIII融合体の少なくとも1つのコピーを含有する産物ファージを無発現のプラスミドとして複製し、生産することができる。
本明細書に記載のライブラリーとレパートリーは抗体フォーマットを含有することができる。例えば、ライブラリーおよびレパートリー内に含有されるポリペプチドは、改変されたまたは未改変の別々の全VHまたは全VLドメインであってもよい。scFvフラグメント、ならびに他の抗体ポリペプチドは、好適な方法を用いて容易に作ることができる。いくつもの好適な抗体遺伝子工学の方法が当技術分野では周知である。例えば、scFvは、2つの可変ドメインをコードする核酸を、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3などの適当なリンカーペプチドまたは他の好適なリンカーペプチドをコードする好適なオリゴヌクレオチドを用いて連結することにより形成することができる。リンカーは第1のV領域のC-末端と第2のV領域のN-末端を架橋する。Fv、FabおよびF(ab)2フラグメントなどの他の抗体フォーマットを構築する類似の技法を用いることができる。FabおよびF(ab)2フラグメントをフォーマット化するには、VHおよびVLポリペプチドを、再配列した遺伝子、生殖系列C遺伝子から単離するかまたは抗体配列データから合成できる定常領域セグメントと組合わせてもよい。本明細書に記載のライブラリーまたはレパートリーはVHまたはVLライブラリーまたはレパートリーであってもよい。
プロテアーゼ耐性可変ドメインを含むポリペプチドは標的リガンド（VEGF）結合部位およびジェネリックリガンド結合部位を含んでもよい。ある特定の実施形態において、ジェネリックリガンド結合部位はプロテインA、プロテインLまたはプロテインGなどのスーパー抗原に対する結合部位である。可変ドメインは任意の所望の可変ドメイン、例えばヒトVH（例えば、VH1a、VH1b、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6）、ヒトVλ（例えば、VλI、VλII、VλIII、VλIV、VλV、VλVIまたはVκ1）またはヒトVκ（例えば、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vκ7、Vκ8、Vκ9またはVκ10）または任意にヒト化されているラクダ科動物VHHに基づくことができる。
核酸、宿主細胞およびプロテアーゼ耐性ポリペプチドを作製する方法
本発明は、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドをコードする、例えば、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択した、単離されたおよび／または組換え体の核酸に関する。
本明細書で意味する「単離された」核酸は、その元来の環境中の（例えば、細胞中のまたはライブラリーなどの核酸混合物中の）他の物質（ゲノムDNA、cDNAおよび／またはRNAなどの他の核酸）から分離して取り出された核酸である。単離された核酸はベクター（例えば、プラスミド）の一部分として単離されたものであってもよい。
本明細書で意味する「組換え体」の核酸は、組換えDNA技法により作製された核酸であり、それには、例えば、制限酵素、相同的組換え、ウイルスなどを利用するベクターまたは染色体中へのクローニングなどの人工的組換え、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて調製した核酸に依存する方法が含まれる。
本発明はまた、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチド、例えば、本明細書に記載の方法により選択可能なまたは選択したペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を含む（1以上の）組換え核酸または発現構築物を含むものである、組換え宿主細胞にも関する。また、本発明の組換え宿主細胞をプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドの発現に適当な条件下に維持するステップを含んでなる、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを調製する方法も提供する。本発明の方法はさらに、所望であれば、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドを単離するかまたは、回収するステップを含んでなる。
例えば、プロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、1以上の核酸分子）、または、かかる核酸分子を含む発現構築物（すなわち、1以上の構築物）を、選択した宿主細胞に適当な方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を用いて、好適な宿主細胞中に導入し、核酸分子が機能しうる形で1以上の発現制御エレメントに連結された（例えば、ベクター中で、細胞中のプロセスにより作製されて宿主細胞ゲノム中に組み込まれた構築物中で）組換え宿主細胞を作製してもよい。得られる組換え宿主細胞を、コードされたペプチドまたはポリペプチドを生産する発現に好適な条件下に（例えば、インデューサーの存在のもとで、好適な動物中に、適当な塩、成長因子、抗生物質、栄養サプルメントなどを補充した好適な培地中に）維持してもよい。所望であれば、コードされたペプチドまたはポリペプチドを単離するかまたは回収してもよい（例えば、動物、宿主細胞、培地、乳から）。この方法はトランスジェニック動物の宿主細胞における発現を包含する（例えば、WO 92/03918、GenPharm Internationalを参照されたい）。
本明細書に記載の方法により選択したプロテアーゼ耐性のペプチドまたはポリペプチドはまた、好適なin vitro発現系で、化学合成によりまたは任意の他の好適な方法により作製することもできる。
ポリペプチド、dAbおよびアンタゴニスト
本明細書に記載および例示した、本発明のプロテアーゼ耐性dAbは一般にその標的リガンドと高アフィニティで結合する。従って、他の態様においては、VEGFと高アフィニティで結合する本発明のポリペプチドまたはdAbを選択し、単離しおよび／または回収する方法が提供される。一般に、本方法は、ペプチドまたはポリペプチド（例えばdAb）のライブラリーまたはレパートリーを提供するステップ、そのライブラリーまたはレパートリーとプロテアーゼ（例えば、トリプシン、エラスターゼ、ロイコザイム、パンクレアチン、痰）をプロテアーゼ活性に好適な条件下で組合わせるステップ、およびリガンド（例えば、標的リガンド）と結合するペプチドまたはポリペプチドを選択し、単離しおよび／または回収するステップを含んでなる。ライブラリーまたはレパートリーは、プロテアーゼ感受性のペプチドまたはポリペプチドが消化されうる条件下でプロテアーゼに曝されるので、プロテアーゼの活性は低結合アフィニティを有する安定性の低いポリペプチドを排除し、それにより高アフィニティ結合ペプチドまたはポリペプチドのコレクションを作ることができる。
例えば、本発明のポリペプチドまたはdAbは、表面プラズモン共鳴により測定して、VEGFと300nM〜1pM（すなわち、3x10-7〜5x10-12M）、例えば50nM〜1pM、例えば5nM〜1pMおよび例えば1nM〜1pMのアフィニティ（KD；表面プラズモン共鳴により測定してKD=Koff(kd)/Kon(ka)）；例えば1xlO-7M以下、例えば1x10-8M以下、例えば1x10-9M以下、例えば1x10-10M以下および例えば1x10-11M以下のKD；および／または5x10-1s-1〜1x10-7s-1、例えば1x10-2s-1〜1x10-6s-1、例えば5x10-3s-1〜1x10-5s-1、例えば5x10-1s-1以下、例えば1x10-2s-1以下、例えば1x10-3s-1以下、例えば1x10-4s-1以下、例えば1x10-5s-1以下、および例えば1x10-6s-1以下のKoff速度定数で結合することができる。
特別な理論に束縛されることなく、プロテアーゼに耐性のあるペプチドおよびポリペプチドはより低いエントロピーおよび／またはより高い安定化エネルギーを有すると思われる。従って、プロテアーゼ耐性と高アフィニティ結合との間の相関は、本明細書に記載の方法により選択されたペプチドおよびポリペプチドおよびdAbの表面の緻密さおよび安定性と関係がありうる。
一実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、VEGFの結合を、約1μM以下、約500nM以下、約100nM以下、約75nM以下、約50nM以下、約10nM以下または約1nM以下の阻害濃度50（IC50）で阻害する。
ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、特異的にVEGF、例えば、ヒトVEGFと結合し、そしてヒトVEGFから（表面プラズモン共鳴により測定して）300nM〜1pMまたは30OnM〜5pMまたは5OnM〜1pMまたは5OnM〜5pMまたは5OnM〜20pMまたは約10pMまたは約15pMまたは約2OpMの解離定数（KD）で解離する。ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、特異的にVEGF、例えば、ヒトVEGFと結合し、ヒトVEGFから（表面プラズモン共鳴により測定して）5x1O-1s-1〜1x10-7s-1、例えば1x1O-2s-1〜1x10-6s-1、例えば5x1O-1s-3〜1x10-5s-1、例えば5x1O-1s-1以下、例えば1x1O-2s-1以下、例えば1x1O-3s-1以下、例えば1x1O-4s-1以下、例えば1x10-5s-1以下および、例えば1x10-6s-1以下のKoff速度定数で解離する。
ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、特異的にVEGF、例えば、ヒトVEGFと、1x10-3M-1s-1〜1x10-7M-1s-1または1x10-3M-1s-1〜1x10-6M-1s-1または約1x10-4M-1s-1または約1x10-5M-1s-1のKonで結合する。一実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、特異的にVEGF、例えば、ヒトVEGFと結合し、ヒトVEGFから本節で規定した解離定数（KD）およびKoffで解離する。一実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、特異的にVEGF、例えば、ヒトVEGFと結合し、ヒトVEGFから本節で規定した解離定数（KD）およびKonで解離する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたはdAbは特異的にVEGF（例えば、ヒトVEGF）と本節で記述したKDおよび／またはKoffおよび／またはKonで結合しかつDOM15-26-593のアミノ酸配列と少なくともまたは少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含むものである。
ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストを大腸菌またはピキア属（Pichia）（例えば、P.pastoris）で発現させることができる。一実施形態において、大腸菌またはピキア属（Pichia）（例えば、P.pastoris）で発現させる場合、リガンドまたはdAb単量体は少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される。本明細書に記載のリガンドおよびdAb単量体を大腸菌またはピキア属（Pichia）（例えば、P.pastoris）で発現させると分泌可能であるが、これらを大腸菌またはピキア属（Pichia）を利用しない合成化学的方法または生物学的生産方法などの任意の好適な方法を用いて生産することもできる。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、ラクダ科動物免疫グロブリン可変ドメイン、またはラクダ科動物生殖系列抗体遺伝子セグメントがコードする免疫グロブリン可変ドメインにユニークである、例えば、位置108、37、44、45および／または47の1以上のフレームワークアミノ酸を含まない。
本発明によるVEGFのアンタゴニストは一価または多価であってもよい。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは一価であって、VEGFと相互作用する1つの結合部位を含有し、その結合部位は本発明のポリペプチドまたはdAbにより与えられる。一価のアンタゴニストは1つのVEGFと結合するので、受容体およびシグナル伝達を活性化に導く細胞表面上のVEGFの架橋またはクラスター形成を誘発することはできない。
他の実施形態において、VEGFのアンタゴニストは多価である。VEGFの多価アンタゴニストは2以上のVEGFに対する特別な結合部位を含有するかまたは2以上の異なるVEGFと結合する結合部位を含有することができ、その結合部位の少なくとも1つは本発明のポリペプチドまたはdAbにより提供される。例えば、本明細書に記載のVEGFのアンタゴニストは、VEGFと結合する本発明の特別なポリペプチドまたはdAbの2以上のコピー、またはVEGFと結合する本発明の2以上の異なるポリペプチドまたはdAbを含む二量体、三量体または多量体であってもよい。
ある特定の実施形態において、VEGFの多価アンタゴニストはVEGFの所望のエピトープまたはドメインに対する2以上の結合部位を含有する。
いくつかのリガンド（およびアンタゴニスト）は診断薬としての用途を有しうる、何故なら、これらを用いて、サンプル中のVEGFと結合して検出し、数値化または測定することができるからである。従って、どの程度のVEGFがサンプル中に存在しうるかを正確に決定することができる。
他の実施形態において、ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは特異的にVEGFと本明細書に記載のKDで結合し、標準マウス異種移植モデルの腫瘍増殖を抑制する（例えば、好適な対照と比較して、少なくとも約10％だけ、腫瘍増殖を阻害する）。一実施形態においては、ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、約1mg/kg以上、例えば約5または10mg/kgを投与した場合、標準マウス異種移植モデルで好適な対照と比較して少なくとも約25％だけ、または少なくとも約50％だけ腫瘍増殖を阻害する。
他の実施形態においては、ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストはVEGFと結合し、標準細胞アッセイにおいて<100nMのND5OでVEGFの活性に対してアンタゴニスト作用がある。
ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストは、有効量を投与すると、WO 2006038027およびWO 2006059108およびWO 2007049017に記載のような炎症性疾患の動物モデルにおいて有効である。一般に有効な量は約1mg/kg〜約10mg/kg（例えば、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、または約10mg/kg）である。慢性炎症性疾患のモデルを、当業者はヒトにおける治療の有効性を予測するものであると認識されている。
一般に、本リガンド（例えば、アンタゴニスト）は、精製された形態で薬理学的に適当な担体と一緒に利用しうる。典型的なこれらの担体としては、任意の生理食塩水および／または緩衝化媒質を含む水溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウムおよび乳酸リンゲルが含まれる。好適な生理学的に許容されるアジュバントは、もしポリペプチド複合体を懸濁液中に保つ必要があれば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択される。
静脈内ビヒクルとしては、リンゲルブドウ糖などを基剤にした液剤および栄養補充剤および電解質補充剤が挙げられる。抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤が存在してもよい（Mack (1982) Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition）。持続放出製剤を含む、様々な好適な製剤を用いることができる。
本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト）を、他の薬剤と別々に、または一緒に投与する組成物として利用することができる。これらには、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの様々な免疫治療薬が含まれる。医薬組成物としては、様々な細胞傷害剤または他の薬剤と本発明のリガンドを一緒にした「カクテル」、またはさらに、投与前にプールするかどうかを問わず、色々な標的抗原またはエピトープを用いて選択したリガンドのような色々な特異性を有する本発明によるリガンドの組合わせが挙げられる。
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に公知のいずれのものであってもよい。免疫療法を含む療法については、限定されるものでないが、本発明の選択したリガンドを、標準技法に従って任意の患者に投与することができる。
投与は、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、経皮的に、肺経路を介してを含む、任意の適当なモードによって、または、適当に、カテーテルによる直接注入によっても行うことができる。投与の用量と頻度は、患者の年齢、性別および症状、同時投与する他の薬物、臨床医が考慮すべき対応処置および他のパラメーターに依存しうる。投与は、適宜、局所であってもよく（例えば、肺投与による肺への局所送達、例えば、鼻腔内投与）または全身であってもよい。
本発明のリガンドは、貯蔵のために凍結乾燥しても、使用前に好適な担体中で再構築してもよい。この技法は通常の免疫グロブリンについて有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再構築技法を使うことができる。当業者は、凍結乾燥および再構築が様々な程度の抗体活性低下をもたらし（例えば、通常の免疫グロブリンについては、IgM抗体はIgG抗体より大きい活性低下の傾向があり）、従って使用レベルを上方調節して補償しなければならないことを理解するであろう。
本発明のリガンド（例えば、アンタゴニスト）を含有する組成物またはそのカクテルを予防および／または治療処置のために投与することができる。ある特定の治療応用において、選択した細胞の少なくとも部分的阻害、抑制、モジュレーション、死滅、またはいくつかの他の測定可能なパラメーターを達成するのに十分な量を「治療上有効な量」と定義する。この投与量を達成するために必要な量は疾患の重症度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存しうるが、一般に体重1kg当たりリガンド、例えばdAbまたはアンタゴニストの0.005〜5.0mgの範囲であり、0.05〜2.0mg/kg/用量の用量が通常使用される。予防上の応用については、疾患の発症を予防、抑制または遅延するために（例えば、緩解または静止状態を維持するかまたは急性期を防止するために）、本リガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様なまたは若干低い投与量で投与することができる。臨床医は、疾患を治療、抑制または予防するために適当な投与間隔を決定できるであろう。VEGFのリガンド（例えば、アンタゴニスト）を投与して慢性炎症性疾患を治療、抑制または予防する場合、1日当たり4回まで、毎週2回、毎週1回、2週間毎に1回、毎月1回、または2カ月毎に1回、例えば、約10μg/kg〜約80mg/kg、約100μg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約80mg/kg、約1mg/kg〜約70mg/kg、約1mg/kg〜約60mg/kg、約1mg/kg〜約50mg/kg、約1mg/kg〜約40mg/kg、約1mg/kg〜約30mg/kg、約1mg/kg〜約20mg/kg、約1mg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約10mg/kg、約10μg/kg〜約5mg/kg、約10μg/kg〜約2.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kgまたは約10mg/kgの用量で投与してもよい。特別な実施形態においては、VEGFのリガンド（例えば、アンタゴニスト）を、2週間毎に1回または1カ月に1回、約10μg/kg〜約10mg/kg（例えば、約10μg/kg、約100μg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kgまたは約10mg/kg）の用量で投与して疾患を治療、抑制または予防する。
本明細書に記載の組成物を用いて実施する治療または療法は、治療前に存在するかかる症候群と比較して、またはかかる組成物または他の好適な組成物で治療されてない個体（ヒトまたはモデル動物）または他の好適な対照におけるかかる症候群と比較して、もし1以上の症候群が（例えば、臨床評価スケールで少なくとも10％または少なくとも1点だけ）軽減されれば「有効」であると考えられる。症候群は、標的とする疾患または障害に応じて明らかに変化しうるが、当技術分野の臨床医または技術者はそれを測定することができるかかる症候群は、例えば、疾患または障害の1以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患、罹患した細胞数、などと相関のある酵素または代謝物のレベル）をモニターすることにより、物理的徴候（例えば、炎症、腫瘍サイズ、など）をモニターすることにより、または容認された臨床試験尺度により測定することができる。
同様に、本明細書に記載の組成物を用いて実施した予防は、もし1以上の症候群の発症または重症度が、前記組成物を用いて治療しなかった類似の個体（ヒトまたは動物モデル）と比較して遅延、軽減または消滅すれば、「有効」である。
本発明によるリガンド（例えば、アンタゴニスト）またはそのカクテルを含有する組成物を、予防および治療環境に利用して哺乳動物の選択された標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または除去を助けることができる。さらに、本明細書に記載の選択されたポリペプチドのレパートリーを体外でまたはin vitroで用いて、細胞の異種コレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇またはさもなくば効果的に除去することができる。哺乳動物から血液を体外でリガンドと組合わせて、望ましくない細胞を死滅またはさもなくば血液から除去する標準技法に従って哺乳動物へ戻すことができる。
本発明によるリガンド（例えば、アンタゴニスト）を含有する組成物を、予防および治療の環境で利用して哺乳動物の選択した標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または除去を助けることができる。
リガンド（例えば、抗VEGFアンタゴニスト、dAb単量体）を1以上のさらなる治療薬または活性剤と一緒に投与およびまたは製剤することができる。リガンド（例えば、dAb）をさらなる治療薬と共に投与する場合、リガンドはさらなる薬剤の投与の前に、同時に、または引き続いて投与してもよい。一般に、リガンドとさらなる薬剤は治療効果の重複を与える方法で投与する。
一実施形態において、本発明は、例えば癌（例えば、固体腫瘍）、炎症性疾患、自己免疫性疾患、血管増殖性疾患（例えばAMD（加齢に関係する黄斑変性症））から選択される疾患を治療、抑制または予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、VEGFと結合するポリペプチド、dAbまたは本発明によるVEGFのアンタゴニストの治療上有効な用量または量を投与するステップを含んでなる前記方法である。
本発明は、肺疾患を治療、抑制または予防する方法を提供する。
従って、他の実施形態において、本発明は肺疾患を治療、抑制または予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、本発明によるポリペプチド、dAbまたはVEGFのアンタゴニストの治療上有効な用量または量を投与するステップを含んでなる前記方法である。
特別な実施形態においては、VEGFのアンタゴニストを、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口吸入、鼻腔内点滴）によりまたは全身の送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）によりなどの肺送達を介して投与する。
本発明のさらなる態様においては、本発明によるポリペプチド、dAbまたはVEGFのアンタゴニストならびに製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
さらに、本発明は、本発明によるポリペプチド、dAbまたはVEGFのアンタゴニストまたは組成物を用いて疾患を治療する方法を提供する。ある実施形態において、その疾患は癌（例えば固体腫瘍）、または炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ、または自己免疫性疾患、またはAMD（加齢に関係する黄斑変性症）などの血管増殖性疾患である。
フォーマット
半減期の増加は、免疫グロブリン、とりわけ抗体、そしてとりわけ小サイズの抗体フラグメントのin vivo応用に有用である。かかるフラグメント（Fv、ジスルフィド結合Fv、Fab、scFv、dAb）は身体から速やかなクリアランスを受ける；従って、これらは身体のほとんどの部分に速やかに到達でき、産生するのが速く、取扱が容易である一方、これらのin vivo応用はin vivoでの残留性が短いために制限される。本発明の一実施形態は、リガンドのin vivoでの半減期増加およびその結果としてリガンドの機能活性の身体内での持続時間の延長によりこの問題を解決する。
薬物動態学的分析およびリガンド半減期を決定する方法は当業者にとって馴染みのものであろう。詳細は、Kenneth, A.ら :Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists、およびPetersら, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)に見出すことができる。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker出版, 2nd Rev.ex edition (1982)にも言及されており、tαおよびtβ半減期および曲線下面積（AUC）などの薬物動態学的なパラメーターが記載されている。
半減期（t1/2αおよびt1/2β）およびAUCはリガンドの血清濃度-対-時間曲線から決定することができる。WinNonlin分析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手しうる）を用いて、例えば、曲線をモデル化することができる。第1期（α期）にリガンドは主に患者内に分布され、いくらかの排除を伴う。第2期（β期）は末期であり、リガンドは分布されていて、血清濃度はリガンドが患者からクリアランスされるにつれて減少して行く。tα半減期は第1期の半減期であり、tβ半減期は第2期の半減期である。そして、一実施形態において、本発明は15分間以上の範囲のtα半減期を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、前記範囲の下限は30分間、45分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。さらに、またはあるいは、本発明によるリガンドまたは組成物は12時間以下の範囲のtα半減期を有しうる。一実施形態において、前記範囲の上限は11、10、9、8、7、6または5時間である。好適な範囲の一例は1〜6時間、2〜5時間または3〜4時間である。
一実施形態において、本発明は30分間以上の範囲のtβ半減期を有する本発明によるリガンド（ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニスト）またはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、前記範囲の下限は45分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。さらに、またはあるいは、本発明によるリガンドまたは組成物は21日以下の範囲のtβ半減期を有する。一実施形態において、前記範囲の上限は12時間、24時間、2日、3日、5日、10日、15日または20日である。一実施形態において、本発明によるリガンドまたは組成物は12〜60時間の範囲のtβ半減期を有しうる。さらなる実施形態において、前記半減期は12〜48時間の範囲でありうる。さらなる実施形態においてはさらに、前記半減期は12〜26時間の範囲でありうる。
上記判定基準に加え、またはあるいは、本発明は1mg.min/ml以上の範囲のAUC値（曲線下面積）を有する本発明によるリガンドまたはリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、前記範囲の下限は5、10、15、20、30、100、200または300mg.min/mlである。さらに、またはあるいは、本発明によるリガンドまたは組成物は600mg.min/ml以下の範囲のAUCを有する。一実施形態において、前記範囲の上限は500、400、300、200、150、100、75または50 mg.min/mlである。一実施形態において、本発明によるリガンドは次からなる群より選択される範囲のAUCを有しうる：15〜150mg.min/ml、15〜100mg.min/ml、15〜75mg.min/ml、および15〜50mg.min/ml。
本発明のポリペプチドおよびdAbおよびこれらを含むアンタゴニストは、例えば、PEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリン受容体または少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域を結合することにより、または抗体ドメインとのコンジュゲーションにより、さらに大きい水力学的サイズを有するようにフォーマットすることができる。例えば、ポリペプチドdAbおよびアンタゴニストは、抗体のさらに大きい抗原結合フラグメントとしてまたは抗体として（例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとしてフォーマットされた）フォーマットされる。
本発明のリガンド（例えば、dAb単量体および多量体）の水力学的サイズは、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィを用いてリガンドの水力学的サイズを決定することができる。リガンドの水力学的を決定するために好適なゲル濾過マトリックス、例えば架橋アガロースマトリックスは周知であり、容易に入手することができる。
リガンドフォーマットのサイズ（例えば、dAb単量体に付着したPEG部分のサイズ）は所望の応用に応じて変わりうる。例えば、リガンドが循環を離れて末梢組織中に入ることを意図する場合、リガンドの水力学的サイズを低く保って血液流からの血液外遊出を容易にすることが望ましい。あるいは、全身循環中に長時間留まるリガンドを有することが所望である場合、例えば、Ig様タンパク質としてフォーマットすることによりリガンドのサイズを増加することができる。
in vivo半減期を増加する抗原またはエピトープを標的化することによる半減期延長
リガンドの水力学的サイズとその血清半減期はまた、本発明のVEGF結合ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストを、本明細書に記載の、in vivo半減期を増加する抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗原結合フラグメント）とコンジュゲートまたは連結することにより増加することができる。例えば、本VEGF結合剤（例えば、ポリペプチド）を、抗血清アルブミンまたは抗新生児Fc受容体抗体もしくは抗体フラグメント、例えば、抗SAまたは抗新生児Fc受容体dAb、Fab、Fab'もしくはscFvと、または抗SAアフィボディまたは抗新生児Fc受容体アフィボディまたは抗-SAアビマーと、あるいは、好ましくは限定されるものでないが、CTLA-4、リポカリン、SpA、アフィボディ、アビマー、GroElおよびフィブロネクチンからなるグループから選択されるスカフォールドを含む抗-SA結合ドメインとコンジュゲートまたは連結することができる（これらの結合ドメインの開示については2008年2月8日出願のPCT/GB2008/000453を参照されたい、なおこれらのドメインおよび配列は本明細書に参照により組み入れられかつ本明細書の開示の一部分を形成する）。コンジュゲートは、血清アルブミンに結合する結合ドメインと（共有結合または非共有結合で）結合した本発明のポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストを含む組成物を意味する。
in vivo血清半減期を延長するために好適なポリペプチドとしてはまた、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド-神経医薬融合タンパク質（米国特許第5,977,307号を参照、その教示は本明細書に参照により組み入れられる）、脳毛細管内皮の細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様成長因子1（IGF1）受容体、インスリン様成長因子2（IGF2）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子X、α1-アンチトリプシンおよびHNF1αが挙げられる。血清半減期を延長する好適なポリペプチドとしてはまた、α-1糖タンパク質（オロソムコイド；AAG）、α-1抗キモトリプシン（ACT）、α-1ミクログロブリン（タンパク質HC；AIM）、抗トロンビンIII（ATIII）、アポリポプロテインA-1（ApoA-1）、アポリポタンパク質B（ApoB）、セルロプラスミン（Cp）、補体成分C3（C3）、補体成分C4（C4）、C1エステラーゼインヒビター（Cl INH）、C反応性タンパク質（CRP）、フェリチン（FER）、ヘモペキシン（HPX）、リポタンパク質(a)（Lp(a)）、マンノース結合タンパク質（MBP）、ミオグロビン（Myo）、プレアルブミン（トランスサイレチン；PAL）、レチノール結合タンパク質（RBP）、およびリウマチ様因子（RF）が挙げられる。
細胞外マトリックスからの好適なタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンが挙げられる。コラーゲンは細胞外マトリックスの主要なタンパク質である。ほぼ15種のタイプのコラーゲン分子が現在公知であり、身体の色々な部分に見出されていて、例えば、I型コラーゲン（身体のコラーゲンの90％に当たる）が骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内部器官に見出され、またはII型コラーゲンが軟骨、椎骨盤、脊索、および眼の硝子体液に見出される。
血液からの好適なタンパク質としては、例えば、血漿タンパク質、例えば、フィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例えば、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB）、血清アミロイドプロテインA、ハプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ-2-ミクログロブリン）、酵素および酵素インヒビター（例えば、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1-アンチトリプシンおよび膵臓トリプシンインヒビター）、免疫グロブリンタンパク質（例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリン軽鎖（κ/λ））などの免疫系タンパク質、輸送タンパク質（例えば、レチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン）、デフェンシン（例えば、β-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、好中球デフェンシン2および好中球デフェンシン3）などが挙げられる。
血液脳関門にまたは神経組織に見出される好適なタンパク質としては、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体などが挙げられる。
血清半減期をin vivoで延長する好適なポリペプチドとしてはまた、腎臓限局性タンパク質（例えば、ポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオン輸送体K1、ハイマン抗原）、肝臓限局性タンパク質（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、G250）、肺限局性タンパク質（例えば、IgAと結合する分泌性成分）、心臓限局性タンパク質（例えば、拡張型心筋症に関係するHSP27）、皮膚限局性タンパク質（例えば、ケラチン）、骨原性活性を示すタンパク質のトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのサブセットである形態形成のタンパク質（BMP）（例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8）などの骨特異的タンパク質、腫瘍特異的タンパク質タンパク質（例えば、栄養芽細胞抗原、ハーセプチン受容体、パラプレギン受容体、カテプシン（例えば、肝臓および脾臓に見出しうるカテプシンB））が挙げられる。
好適な疾患特異的タンパク質としては、例えば、活性化T細胞でのみ発現される抗原、例えば、LAG-3（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテジェリン（破骨細胞形成抑制因子）リガンド（OPGL；Nature 402, 304-309 (1999)を参照）、OX40（活性化T細胞で発現され、ヒトT細胞白血球病ウイルスI型（HTLV-I）産生細胞で特異的にアップレギュレートされるTNF受容体ファミリーのメンバー；Immunol. 165(1)：263-70(2000)を参照）が挙げられる。好適な疾患特異的タンパク質としてはまた、例えば、メタロプロテアーゼ（関節炎/癌に関係する）、例えばCG6512ショウジョウバエ、ヒトパラプレジン、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsH；および 血管形成成長因子、例えば酸性繊維芽細胞成長因子（FGF1）、塩基性繊維芽細胞成長因子（FGF2）、血管内皮成長因子/血管透過性因子（VEGF/VPF）、トランスフォーミング成長因子α（TGFα）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、アンジオゲニン、インターロイキン3（IL3）、インターロイキン8（IL8）、血小板由来の内皮成長因子（PD-ECGF）、胎盤成長因子（P1GF）、ミッドカイン血小板由来成長因子BB（PDGF）、およびフラクタルカインが挙げられる。
in vivoでの血清半減期を延長する好適なポリペプチドとしてはまた、熱ショックタンパク質（HSP）などのストレスタンパク質も挙げられる。HSPは通常、細胞内に見出される。HSPが細胞外に見出されると、これは細胞が死んでその内容物が流れ出したことの指標である。この非プログラム細胞死（壊死）は、外傷、疾患または傷害の結果として、細胞外HSPが免疫系からの応答を誘発するときに起こる。細胞外HSPとの結合は、本発明の組成物の疾患部位への限局化を生じうる。
Fc輸送に関わる好適なタンパク質としては、例えば、Brambell受容体（FcRBとしても知られる）が挙げられる。このFc受容体は2つの機能を有し、その両方とも送達に対して潜在的に有用である。その機能は、(1)母から子への胎盤を横切るIgGの輸送、(2)IgGの分解からの保護とそれによるその血清半減期の延長である。本受容体はIgGをエンドソームからリサイクルすると思われる（Holligerら, Nat Biotechnol 15(7)：632-6 (1997)を参照）。
血清アルブミンと結合するdAb
本発明は、一実施形態において、ポリペプチドまたはアンタゴニスト、例えば、TNFR1と結合する抗TNFR1 dAb（第1のdAb）および血清アルブミン（SA）と結合する第2のdAbを含む二重特異的リガンドを提供し、ここで、この第2のdAbは結合SAと、表面プラズモン共鳴により測定して、1nM〜1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400または500μM（すなわち、1x10-9〜5x10-4）、または100nM〜10μM、または1〜5μMまたは3〜70nMまたは1OnM〜1、2、3、4または5μMのKDで結合する。例えば、表面プラズモン共鳴により測定して、30〜70nMで結合する。一実施形態において、第1のdAb（またはdAb単量体）はSA（例えば、HSA）と、表面プラズモン共鳴により測定して、ほぼ1、50、70、100、150、200、300nMまたは1、2または3μMのKDで結合する。一実施形態において、第1の抗SA dAbと第2のVEGFに対するdAbを含む二重特異的リガンドについては、その標的に対する第2のdAbのアフィニティ（例えば、表面プラズモン共鳴により、例えばBiaCoreを用いて測定したKDおよび／またはKoff）は、SAに対する第1のdAbのアフィニティの1〜100000倍（例えば、100〜100000、または1000〜100000、または10000〜100000倍）である。一実施形態において、その血清アルブミンはヒト血清アルブミン（HSA）である。一実施形態において、第1のdAbはSA（例えば、HSA）とほぼ50、例えば70、100、150または200nMのKDで結合する。二重特異的リガンドの詳細はWO03002609、WO04003019およびWO04058821に見出される。
本発明のリガンドは、一実施形態において、血清アルブミン（SA）と、表面プラズモン共鳴により測定して、1nM〜1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400または500μM（すなわち、x10-9〜5x10-4）、または100nM〜10μM、または1〜5μMまたは3〜70nMまたは1OnM〜1、2、3、4または5μMのKDで結合するdAbを含む。例えば、表面プラズモン共鳴により測定して、30〜70 nMのKDで結合するdAbを含む。一実施形態において、第1のdAb（またはdAb単量体）はSA（例えば、HSA）と、表面プラズモン共鳴により測定して、ほぼ1、50、70、100、150、200、300nMまたは1、2または3μMのKDで結合する。一実施形態において、第1および第2のdAbは、リンカー、例えば、1〜4個のアミノ酸または1〜3個のアミノ酸、または3個を超えるアミノ酸または4、5、6、7、8、9、10、15または20個を超えるアミノ酸のリンカーにより連結される。一実施形態においては、より長いリンカー（3個を超えるアミノ酸）を用いて効力（アンタゴニスト中の1つまたは両方のdAbのKD）を増強する。
リガンドおよびアンタゴニストの特別な実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンと結合し、次からなる群より選択されるdAbと、アルブミンとの結合について競合する：
MSA-16、MSA-26（これらの配列の開示についてはWO 04003019を参照されたい、これらの配列およびそれらの核酸対応物は本明細書に参照により組み入れられ、本明細書の開示の一部を形成する）、
DOM7m-16（配列番号473）、DOM7m-12（配列番号474）、DOM7m-26（配列番号475）、DOM7r-1（配列番号476）、DOM7r-3（配列番号477）、DOM7r-4（配列番号478）、DOM7r-5（配列番号479）、DOM7r-7（配列番号480）、DOM7r-8（配列番号481）、DOM7h-2（配列番号482）、DOM7h-3（配列番号483）、DOM7h-4（配列番号484）、DOM7h-6（配列番号485）、DOM7h-1（配列番号486）、DOM7h-7（配列番号487）、DOM7h-22（配列番号489）、DOM7h-23（配列番号490）、DOM7h-24（配列番号491）、DOM7h-25（配列番号492）、DOM7h-26（配列番号493）、DOM7h-21（配列番号494）、DOM7h-27（配列番号495）、DOM7h-8（配列番号496）、DOM7r-13（配列番号497）、DOM7r-14（配列番号498）、DOM7r-15（配列番号499）、DOM7r-16（配列番号500）、DOM7r-17（配列番号501）、DOM7r-18（配列番号502）、DOM7r-19（配列番号503）、DOM7r-20（配列番号504）、DOM7r-21（配列番号505）、DOM7r-22（配列番号506）、DOM7r-23（配列番号507）、DOM7r-24（配列番号508）、DOM7r-25（配列番号509）、DOM7r-26（配列番号510）、DOM7r-27（配列番号511）、DOM7r-28（配列番号512）、DOM7r-29（配列番号513）、DOM7r-30（配列番号514）、DOM7r-31（配列番号515）、DOM7r-32（配列番号516）、DOM7r-33（配列番号517）（これらの配列の開示はWO 2007080392を参照されたい、これらの配列およびそれらの核酸対応物は本明細書に参照により組み入れられ、本明細書の開示の一部を形成する；この節の配列番号はWO 2007080392に記載のものである）、
dAb8（dAb1O）、dAb10、dAb36、dAb7r20（DOM7r20）、dAb7r21（DOM7r21）、dAb7r22（DOM7r22）、dAb7r23（DOM7r23）、dAb7r24（DOM7r24）、dAb7r25（DOM7r25）、dAb7r26（DOM7r26）、dAb7r27（DOM7r27）、dAb7r28（DOM7r28）、dAb7r29（DOM7r29）、dAb7r29（DOM7r29）、dAb7r31（DOM7r31）、dAb7r32（DOM7r32）、dAb7r33（DOM7r33）、dAb7r33（DOM7r33）、dAb7h22（DOM7h22）、dAb7h23（DOM7h23）、dAb7h24（DOM7h24）、dAb7h25（DOM7h25）、dAb7h26（DOM7h26）、dAb7h27（DOM7h27）、dAb7h30（DOM7h30）、dAb7h31（DOM7h31）、dAb2（dAb4,7,41）、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12（dAb7m12）、dAb13（dAb15）、dAb15、dAb1β（dAb21、dAb7m16）、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25（dAb26、dAb7m26）、dAb27、dAb30（dAb35）、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38（dAb54）、dAb41、dAb46（dAb47、52および56）、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1（DOM7r1）、dAb7r3（DOM7r3）、dAb7r4（DOM7r4）、dAb7r5（DOM7r5）、dAb7r7（DOM7r7）、dAb7r8（DOM7r8）、dAb7r13（DOM7r13）、dAb7r14（DOM7r14）、dAb7r15（DOM7r15）、dAb7r16（DOM7r16）、dAb7r17（DOM7r17）、dAb7r18（DOM7r18）、dAb7r19（DOM7r19）、dAb7h1（D0M7h1）、dAb7h2（DOM7h2）、dAb7h6（DOM7h6）、dAb7h7（DOM7h7）、dAb7h8（DOM7h8）、dAb7h9（D
OM7h9）、dAb7h1O（DOM7h1O）、dAb7h11（DOM7h11）、dAb7h12（DOM7h12）、dAb7h13（DOM7h13）、dAb7h14（DOM7h14）、dAb7p1（D0M7p1）、およびdAb7p2（DOM7p2）（これらの配列の開示についてはPCT/GB 2008/000453（2008年2月8日出願）を参照されたい、これらの配列およびそれらの核酸対応物は本明細書に参照により組み入れられて、本明細書の開示の一部を形成する）。代わりの名称をdAbの後の括弧内に示した。例えば、dAb8はdAb10という代わりの名称を有し、すなわちdAb8（dAb10）である。これらの配列はまた、図51aおよびbにも示した。
ある特定の実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンと結合し、かつ
MSA-16、MSA-26、
DOM7m-16（配列番号 473）、DOM7m-12（配列番号474）、DOM7m-26（配列番号475）、DOM7r-1（配列番号476）、DOM7r-3（配列番号477）、DOM7r-4（配列番号478）、DOM7r-5（配列番号479）、DOM7r-7（配列番号480）、DOM7r-8（配列番号481）、DOM7h-2（配列番号482）、DOM7h-3（配列番号483）、DOM7h-4（配列番号484）、DOM7h-6（配列番号485）、DOM7h-1（配列番号486）、DOM7h-7（配列番号487）、DOM7h-22（配列番号489）、DOM7h-23（配列番号490）、DOM7h-24（配列番号491）、DOM7h-25（配列番号492）、DOM7h-26（配列番号493）、DOM7h-21（配列番号494）、DOM7h-27（配列番号495）、DOM7h-8（配列番号496）、DOM7r-13（配列番号497）、DOM7r-14（配列番号498）、DOM7r-15（配列番号499）、DOM7r-16（配列番号500）、DOM7r-17（配列番号501）、DOM7r-18（配列番号502）、DOM7r-19（配列番号503）、DOM7r-20（配列番号504）、DOM7r-21（配列番号505）、DOM7r-22（配列番号506）、DOM7r-23（配列番号507）、DOM7r-24（配列番号508）、DOM7r-25（配列番号509）、DOM7r-26（配列番号510）、DOM7r-27（配列番号511）、DOM7r-28（配列番号512）、DOM7r-29（配列番号513）、DOM7r-30（配列番号514）、DOM7r-31（配列番号515）、DOM7r-32（配列番号516）、DOM7r-33（配列番号517）（この節の配列番号はWO 2007080392に現れる配列番号である）、
、dAb8、dAb10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7r13、dAb7r14、dAb7r15、dAb7r16、dAb7r17、dAb7r18、dAb7r19、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h1O、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13、dAb7h14、dAb7p1、およびdAb7p2
からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例えば、ヒト血清アルブミンと結合するdAbは、DOM7h-2（配列番号482）、DOM7h-3（配列番号483）、DOM7h-4（配列番号484）、DOM7h-6（配列番号485）、DOM7h-1（配列番号486）、DOM7h-7（配列番号487）、DOM7h-8（配列番号496）、DOM7r-13（配列番号497）、DOM7r-14（配列番号498）、DOM7h-22（配列番号489）、DOM7h-23（配列番号490）、DOM7h-24（配列番号491）、DOM7h-25（配列番号492）、DOM7h-26（配列番号493）、DOM7h-21（配列番号494）、DOM7h-27（配列番号495）（この節の配列番号はWO 2007080392に記載の配列番号である）、dAb8、dAb10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h1O、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13およびdAb7h14と、少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
ある特定の実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンと結合しかつ、
DOM7h-2（配列番号482）、DOM7h-6（配列番号485）、DOM7h-1（配列番号486）、DOM7h-7（配列番号487）、DOM7h-8（配列番号496）、DOM7h-22（配列番号489）、DOM7h-23（配列番号490）、DOM7h-24（配列番号491）、DOM7h-25（配列番号492）、DOM7h-26（配列番号493）、DOM7h-21（配列番号494）、DOM7h-27（配列番号495）（配列番号495）（この節の配列番号はWO 2007080392に記載の配列番号である）、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h1O、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13およびdAb7h14からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列と、少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらに特別な実施形態において、dAbは、ヒト血清アルブミンと結合するVκdAbでありかつ、DOM7h-2（配列番号482）、DOM7h-6（配列番号485）、DOM7h-1（配列番号486）、DOM7h-7（配列番号487）、DOM7h-8（配列番号496）（この節の配列番号はWO 2007080392に記載の配列番号である）、dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h1O、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13およびdAb7h14からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
さらに特別な実施形態において、dAbはヒト血清アルブミンと結合するVHdAbでありかつdAb7h30およびdAb7h31から選択される配列を有する。
さらに特別な実施形態において、dAbはdAb7h11またはdAb7h14である。
他の実施形態において、dAb、リガンドまたはアンタゴニストはヒト血清アルブミンと結合しかつ、前記アミノ酸配列のいずれかのCDRの1、2または3個、例えばdAb7h11またはdAb7h14のCDRの1、2または3個を含む。
血清アルブミンと結合する好適なラクダ科動物VHHとしては、WO 2004/041862（AblynxN.V.）におよびWO 2007080392に開示されたもの（これらのVHH配列およびそれらの核酸対応物は本明細書に参照により組み入れられ、本明細書の開示に一部分を形成する）、例えば、配列A（配列番号518）、配列B（配列番号519）、配列C（配列番号520）、配列D（配列番号521）、配列E（配列番号522）、配列F（配列番号523）、配列G（配列番号524）、配列H（配列番号525）、配列I（配列番号526）、配列J（配列番号527）、配列K（配列番号528）、配列L（配列番号529）、配列M（配列番号530）、配列N（配列番号531）、配列O（配列番号532）、配列P（配列番号533）、配列Q（配列番号534）が挙げられ、これらの配列番号はWO 2007080392またはWO 2004/041862（Ablynx N.V.）に引用された配列番号に対応する。ある特定の実施形態において、ラクダ科動物VHHはヒト血清アルブミンと結合し、かつWO 2007080392に開示されたALB 1または配列番号518〜534のいずれか1つと少なくとも約80％、または少なくとも約85％、または少なくとも約90％、または少なくとも約95％、または少なくとも約96％、または少なくとも約97％、または少なくとも約98％、または少なくとも約99％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（これらの配列番号はWO 2007080392またはWO 2004/041862に引用された配列番号に対応する）。
いくつかの実施形態において、リガンドまたはアンタゴニストは、本明細書に開示したいずれかの抗血清アルブミンdAbと、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）との結合について競合する抗血清アルブミンdAbを含むものである。
代わりの実施形態において、アンタゴニストまたはリガンドはVEGF（例えば、ヒトVEGF）に特異的な結合部分を含み、その部分は同時係属中の出願PCT/GB2008/000453（2008年2月8日出願）に記載の非免疫グロブリン配列を含み、これらの結合部分、それらの作製および選択（例えば、多様なライブラリーから）の方法ならびにそれらの配列の開示は、本明細書に参照により組み入れられ、本明細書の開示の部分を形成する。
半減期延長部分（例えば、アルブミン）とのコンジュゲーション
一実施形態においては、（1以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンおよびフラグメントおよびそれらの類似体）を本発明のVEGF結合ポリペプチド、dAbまたはアンタゴニストとコンジュゲートまたは結合する。VEGF結合フォーマットに使用する好適なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の例は、WO 2005077042に記載されており、この開示は本明細書に参照により組み入れられかつ本明細書の開示の一部を形成する。特に、次のアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体を本発明に使用することができる：
・配列番号1（WO 2005077042に開示されたもので、この配列は明白に参照により本開示に組み入れられる）；
・WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸1〜387を含んでなるアルブミン断片もしくは変異体；
・次からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるアルブミン、またはそれらの断片もしくは変異体：(a)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸54〜61；(b)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸76〜89；(c)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸92〜100；(d)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸170〜176；(e)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸247〜252；(f)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸266〜277；(g)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸280〜288；(h)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸362〜368；(i)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸439〜447；(j)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸462〜475；(k)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸478〜486；および(l)WO 2005077042の配列番号1のアミノ酸560〜566。
VEGF結合フォーマットに使用する好適なアルブミン、断片または類似体のさらなる例は、WO03076567に記載されており、この開示は本明細書に参照により組み入れられかつ本明細書の開示の一部を形成する。特に、次のアルブミン、断片または変異体を本発明に使用することができる：
・WO03076567に、例えば図3に記載のヒト血清アルブミン（この配列は参照により本明細書に明白に組み入れられる）；
・66,500の式分子量をもつ585個のアミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖から成るヒト血清アルブミン（HA）（Melounら, FEBS Letters 58:136 (1975)；Behrensら, Fed.Proc.34:591 (1975)；Lawnら, Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981)；Minghettiら, J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)を参照）；
・Weitkampら、Ann. Hum. Genet. 37：219（1973）に記載されたアルブミンの多型変異体または類似体または断片；
・EP 322094に記載のアルブミン断片または変異体、例えば、HA（1〜373）、HA（1〜388）、HA（1〜389）、HA（1〜369）、およびHA（1〜419）ならびに1〜369および1〜419の間の断片；
・EP399666に記載のアルブミン断片または変異体、例えば、HA（1〜177）およびHA（1〜200）およびHA（1〜X）（ここでXは178〜199の任意の番号である）の間の断片。
（1以上の）半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンおよびフラグメントおよびそれらの類似体）を用いて、本発明のVEGF結合ポリペプチド、dAbおよびアンタゴニストをフォーマットする場合、前記半減期延長部分を、VEGF結合部分（例えば、抗VEGFdAb）との直接融合による、例えば融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を用いることによるなどの好適な方法を用いてコンジュゲートすることができる（ここで、融合タンパク質はVEGF結合部分に対してNまたはC末端に位置する半減期延長部分をもつ1本鎖ポリペプチドとしてコードされる）。あるいは、コンジュゲーションは諸部分の間にペプチドリンカー、例えば、WO 03076567またはWO 2004003019に記載のペプチドリンカーを用いることにより達成することができる（これらのリンカー開示は参照により本開示に組み入れられ、本発明における使用例を提供する）。典型的には、in vivoで血清半減期を延長するポリペプチドは天然にin vivoで存在するものであり、欲しない物質を生物（例えば、ヒト）から除去する内因機構による分解または除去に対して耐性があるポリペプチドである。例えば、in vivoで血清半減期を延長するポリペプチドは、細胞外マトリックスからのタンパク質、血液中に見出されるタンパク質、タンパク質血液脳関門にまたは神経組織に見出されるタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚または骨限局性タンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、またはFc輸送に関わるタンパク質から選択することができる。
本開示を通して記載した本発明の実施形態において、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおける抗VEGF「dAb」の使用の代わりに、当技術の研究者は、VEGFと結合する本発明のdAbのCDRの1以上または3つ全てを含むポリペプチドまたはドメイン（例えば、好適なタンパク質スカフォールドまたは骨格、例えばアフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメインまたはEGFドメイン上に移植したCDR）を利用できると考えている。本開示は全体として、従って、dAbの代わりにかかるドメインを用いるアンタゴニストの開示を提供すると類推されるべきである。この点については、PCT/GB2008/000453（2008年2月8日出願）を参照されたい。本開示は参照により本明細書に組み入れられる。
一実施形態においては、それ故に、本発明のアンタゴニストはVEGFに対する結合特異性、またはかかるdAbの相補性決定領域を好適なフォーマットで有する免疫グロブリン単一可変ドメインまたはドメイン抗体（dAb）を含むものである。アンタゴニストはかかるdAbから成るかまたは本質的にかかるdAbから成るポリペプチドでありうる。アンタゴニストは、かかるdAb（またはdAbのCDR）を抗体フォーマット（例えば、IgG様フォーマット、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2）などの好適なフォーマットで含むポリペプチド、またはVEGFと結合するdAbおよび他の標的タンパク質、抗原またはエピトープ（例えば、血清アルブミン）と結合する第2のdAbを含む二重特異的リガンドであってもよい。
本発明によるポリペプチド、dAbおよびアンタゴニストは、当技術分野で公知である様々な、好適な抗体フォーマット、例えば、IgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体、二特異的抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメント（例えば、Fvフラグメント（例えば、１本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合Fv）、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント）、単一抗体可変ドメイン（例えば、VH、VL）、および前記のいずれかの改変バージョン（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールまたは他の好適なポリマーの共有結合またはヒト化VHHにより改変されたバージョン）としてフォーマットされていてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明は、IgG様フォーマットであるリガンド（例えば、抗VEGFアンタゴニスト）を提供する。かかるフォーマットは、IgG分子（2本の重鎖と2本の軽鎖）からなる通常の4本鎖構造を有し、ここで1以上の可変領域（VHおよびまたはVL）が本発明のdAbで置き換えられている。一実施形態においては、可変領域（2つのVH領域および2つのVL領域）のそれぞれがdAbまたは単一可変ドメインで置き換えられ、それらの少なくとも1つは本発明による抗VEGF dAbである。IgG様フォーマットに含まれるdAbまたは単一可変ドメインは同じ特異性または異なる特異性を有してもよい。いくつかの実施形態において、IgG様フォーマットは四価であり、1つ（抗VEGFのみ）、2つ（抗VEGFと抗SA）、3つまたは4つの特異性を有してもよい。例えば、IgG様フォーマットは単特異的であって、同じ特異性を有する4つのdAbを含んでもよく；二特異性であって、同じ特異性を有する3つのdAbと異なる特異性を有する他のdAbを含んでもよく；二特異性であって、同じ特異性を有する2つのdAbと共通のしかし異なる特異性を有する2つののdAbを含んでもよく；三特異性であって、同じ特異性を有する第1と第2のdAb、異なる特異性を有する第3のdAb、および第1、第2および第3のdAbとは異なる特異性を有する第4のdAbを含んでもよく；四特異性であって、それぞれが異なる特異性を有する4つのdAbを含んでもよい。IgG様フォーマットの抗原結合フラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv）を調製してもよい。一実施形態において、IgG様フォーマットまたはその抗原結合フラグメントはVEGFと架橋せず、例えば、そのフォーマットはVEGFに対して一価であってもよい。もし補体活性化および／または抗体依存性細胞傷害性（ADCC）機能が所望であれば、リガンドはIgG1様フォーマットであってもよい。所望であれば、IgG様フォーマットは変異した定常領域（変異体IgG重鎖定常領域）を含んで、Fc受容体との結合および／または補体を固定する能力を最小化してもよい（例えば、Winterら, GB 2,209,757 B；Morrisonら, WO 89/07142；Morganら, WO 94/29351, 1994年12月22日を参照されたい）。
本発明のリガンド（ポリペプチド、dAbおよびアンタゴニスト）を、第2の免疫グロブリン単一可変ドメインと直接融合した第1の免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する融合タンパク質としてフォーマットすることができる。所望であれば、かかるフォーマットはさらに半減期延長部分を含んでもよい。例えば、リガンドは、血清アルブミンと結合する免疫グロブリン単一可変ドメインと直接融合した第2の免疫グロブリン単一可変ドメインと直接融合した第1の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。
一般に標的に対して結合特異性をもつ結合部位を有するポリペプチドドメインの配向、およびリガンドがリンカーを含むかどうかは設計選択の問題である。しかし、リンカーを伴うまたは伴わない、いくつかの配向は他の配向より優れた結合特性を提供しうる。全ての配向（例えば、dAb1-リンカー-dAb2；dAb2-リンカー-dAb1）は本発明に包含され、所望の結合特性を提供する配向を含有するリガンドはスクリーニングにより容易に同定することができる。
dAbの単量体、二量体および三量体を含む本発明によるポリペプチドおよびdAbを、CH2およびCH3ドメインの1つまたは両方、および任意にヒンジ領域を含む抗体Fc領域と連結することができる。例えば、単一ヌクレオチド配列としてFc領域と連結されたリガンドをコードするベクターを用いてかかるポリペプチドを調製することができる。
本発明はさらに、上記dAb単量体、例えば、抗VEGF dAb単量体の二量体、三量体および多量体を提供する。
コドン最適化配列
前記のように、本発明の実施形態は、本発明のポリペプチドおよび可変ドメインをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する。以下の説明に示すように、同じ可変ドメインをコードする約70％同一のコドン最適化配列を作ることができる（この場合、可変ドメインアミノ酸配列はDOM1h-131-206と同一である）。この例では配列を、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コドン最適化配列1〜3）または大腸菌（コドン最適化配列4および5）による発現について最適化した。
本発明者らは、遺伝コードの縮重を考慮に入れて計算を行い、DOM1h-131-206の（以下にDOM1h- 131-206 WTとして示した）ヌクレオチド配列とDOM1h-131-206に同一である可変ドメインをなおコードする理論的ヌクレオチド配列がコードする、それぞれの縮重コドン内のヌクレオチド変化の数を最大化した。計算結果は、理論的配列がDOM1h-131-206と57％同一性だけ有しうることを明らかにした。
コドン最適化配列1
DNA 配列
Figure 2010528647
対応するAA配列
Figure 2010528647
・WT配列と74.1％ヌクレオチド配列同一性
Figure 2010528647
コドン最適化配列2
DNA 配列
Figure 2010528647
対応するAA配列
Figure 2010528647
・WT配列と71.1％ヌクレオチド配列同一性
Figure 2010528647
コドン最適化配列3
DNA配列
Figure 2010528647
対応するAA配列
Figure 2010528647
・WT配列と72.6％ヌクレオチド配列同一性
Figure 2010528647
コドン最適化配列4
DNA配列
Figure 2010528647
対応するAA配列
Figure 2010528647
・WT配列と76.5％ヌクレオチド配列同一性
Figure 2010528647
コドン最適化配列5
DNA 配列
Figure 2010528647
対応するAA配列
Figure 2010528647
・WT配列と78.4％ ヌクレオチド 配列同一性
Figure 2010528647
例示
例示A：ヒトTNFR1に対するドメイン抗体のリード選択と特徴付け
作製したドメイン抗体はファージライブラリーから誘導した。可溶性選択および受動吸収されたヒトTNFR1に対するパニングの両方を、関連の標準的方法によって実施した。ヒトTNFR1を可溶性組換えタンパク質として、R&D systems（カタログ番号636-R1-025/CF）またはPeprotech（カタログ番号310-07）のいずれかから購入し、直接（受動選択の場合）、または一級アミンを介するカップリングを利用するビオチン化後に使用し、次いで生物学的アッセイにおけるその活性の品質管理ならびに質量分析によるそのMWおよびビオチン化程度の分析を行った。典型的には、3ラウンドの選択を、毎回、次のラウンドの抗原のレベルを低下して実施した。
選択した出力を、抗TNFR1結合クローンの存在についてファージELISAによりスクリーニングした。DNAをこれらのファージ選択物から単離し、発現ベクター中にサブクローニングして可溶性dAbフラグメントを発現させた。可溶性dAbフラグメントを96ウエルプレートに発現させ、その上清を用いて、抗c-myc検出による直接結合ELISA、またはストレプトアビジン/ビオチン化したTNFR1 BIAcore（登録商標）チップを用いるBIAcore（登録商標）を利用して、抗TNFR1結合dAbの存在についてスクリーニングし、オフ速度（off-rate）によって格付けした。
下記のリード分子を、DOM1h-131（WO 2006038027に開示）と名付けた親dAbから誘導した。この分子は、ファージディスプレイライブラリーから、3ラウンドの選択の後に、6OnMのビオチン化抗原を用いて選択された。ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンコートしたDynaビーズを捕獲試薬として選択の各ラウンドで交替し、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンに対するバインダーの選択を防止した。この段階のリードDOM1h-131の効力は、MRC-5繊維芽細胞/IL-8放出細胞アッセイで決定すると、低いマイクロモル範囲にあった。BIAcore(登録商標)で測定した結合動力学は、典型的に速いオン／速いオフ速度を提示した。このDOM1h-131リード分子の、C末端mycタグ付き単量体としての大腸菌発現レベルは8mg/lの領域であった。
リードのアフィニティ成熟：
DOM1h-131のアフィニティ成熟を進めて、より高い効力と改善された生物物理学的特徴をもつ突然変異体を作製した（DOM1h-131から誘導したリードのアミノ酸配列については図3を参照）。エラープローンPCRポリメラーゼ（Genemorph II、Stratagene）を用いて、エラープローンライブラリー（dAb配列当たり1アミノ酸変化の平均数、ライブラリーサイズ8x107）を作製した後、これらのエラープローンライブラリーを用いて、7ラウンドの選択を実施した。この計画によって、クローンDOM1h-131-8、すなわち、4つのアミノ酸変化（フレームワーク1（FR1）に1つ、CDR1に1つ、CDR3に1つ、およびFR4に1つ）によって、MRC-5細胞アッセイ（〜4nM）により測定した効力でほぼ100倍の改善を与える分子を単離した。このアッセイでは、MRC-5細胞を試験サンプルと1時間インキュベートし、次いでTNF-α（200pg/ml）を加えた。一晩インキュベーションの後、IL-8放出を、IL-8 ABI 8200細胞の検出アッセイ（FMAT）を用いて測定した。TNF-α用量曲線が各実験に含まれた。このアッセイにおいて、dAbとTNFR1結合を競合するために用いたTNF-αの濃度（200pg/ml）は、最大TNF-α応答のほぼ70％であった。
さらに効力を改善するために、単一アミノ酸位置を、エラープローンリード・コンセンサス情報により示唆されるキー位置において、オリゴ部位特異的変異誘発により多様化した。このプロセスの間、DOM1h-131-8クローン、DOM1h-131-24（補正前の元来の名称、DOM1h-131-8-2）の改善バージョンをBIAcore(登録商標)スクリーニングを介して単離したが、これは単一K94Rアミノ酸突然変異（Kabatによるアミノ酸番号）を有し、200〜30OpMのRBA効力があった。
このリードに基づくさらなるエラープローンライブラリーおよびそれから誘導したNNSライブラリーを作製し、熱処理を利用して3ラウンドのファージ選択を行った（方法については、Jespers Lら, "Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage by heat denaturation（熱変性によりファージ上で選択した凝集耐性ドメイン抗体）", Nat Biotechnol. 2004 Sep;22 (9):l 161-5を参照）。この選択の間、ライブラリーをプールし、選択のラウンド2から誘導したクローンは熱安定性がより高いと考えられるDOM1h-131-53などのdAbを得た。これらのクローンはより優れた生物物理的特徴を有しうると仮定した。クローンDOM1h-131-53におけるいくつかのフレームワーク変異を生殖系列化してクローンDOM1h-131-83を作製した。このクローンは、前記ファージディスプレイ選択を用いるかまたは乳濁液を使うin vitroコンパートメント化技法を用いる、オリゴ指向の個々のCDR変異誘発を介するさらなる多様性に対する基礎を形成した。ファージディスプレイ計画によって、リードDOM1h-131-117およびDOM1h-131-151を作製した。in vitroコンパートメント化技法によりDOM1h-131-511を作製した。
この段階で、これらの3つのリードを、生物物理学的および生物学的アッセイで比較すると、DOM1h-131-511が最良の特性をもつ分子であった。さらにこれらの分子を、トリプシンまたはロイコザイムの存在のもとでのタンパク質分解性切断に対する耐性について試験した。ロイコザイムは嚢胞性線維症の患者から得たプールした痰から成り、高レベルのエラスターゼおよび他のプロテアーゼを含有し、肺疾患のin vivo症状に対する疑似物として使った。このデータは、3つのリードDOM1h-131-117、DOM1h-131-151およびDOM1h-131-511が全てトリプシンまたはロイコザイムの存在のもとで速やかに分解することを示した。この知見から、患者におけるDOM1h-131-511のin vivo持続性に関心を持ち、トリプシンに対する耐性の改善について選択する計画を開発した。かかるトリプシン耐性の改善はこの分子の他の生物物理学的特性に有利な効果を有しうるという仮説を建てた。本質的に標準ファージ選択方法を改変し、抗原での選択の前にプロテアーゼの存在のもとでの選択できるようにした。この目的で、新しいファージベクターを遺伝子操作で作製し、このベクターではc-mycタグを欠失させて、提示されたdAbをファージから切り離すことなくトリプシンの存在のもとで選択することを可能にした。DOM1h-131-511に基づくエラープローンライブラリーを作製してpDOM33ベクターにクローニングした（pDOM33ベクターマップについては図50を参照）。このライブラリーから作製したファージストックを、1mg/mlまたは100μg/mlトリプシンのいずれかを用いて37℃にて24時間、前処理し、次いでプロテアーゼインヒビターとしてRoche完全プロテアーゼインヒビター（2x）を加えてトリプシン活性をブロックし、その後、関連抗原で選択した。4ラウンドの選択を実施した。発現した可溶性TNFR1結合dAbを、BIAcore(登録商標)を用いて、プロテアーゼの存在および非存在のもとでそれらのTNFR1と結合する能力について、トリプシンの存在（最終トリプシン濃度100μg/mlまたは1000μg/mlにて）または非存在のもとで、1時間または一晩、37℃でのインキュベーションにて試験した。
これによって、2つのリード分子DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206が単離され、これらはBIAcore(登録商標)抗原結合実験によりプロテアーゼ耐性の改善を示した。興味深いことが認められ、DOM1h-131-511と比較して、DOM1h-131-202はただ1つの突然変異をCDR2（V53D）（全てKabatによるアミノ酸番号）に有したが、DOM1h-131-206はただ2つの突然変異を有し、第1の突然変異はDOM1h-131-202（CDR2におけるV53D突然変異）と同じであり、第2の突然変異はFR3のY91Hであった（図3を参照）。このFR3のY91H突然変異は3-20ヒト生殖系列遺伝子に存在し、この残基がヒト抗体に存在することを示す。3つのクローンDOM1h-131-511、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206は図3に示したアミノ酸配列を有する。
分子の活性を次の通り測定した：DOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206のヒトTNFR1との結合に対するBIAcore(登録商標)結合アフィニティアセスメント。
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206の、ヒト組換え大腸菌に発現されたヒトTNFR1との結合に対する結合アフィニティをBIAcore(登録商標)分析により試験した。分析はビオチン化ヒトTNFR1を用いて実施した。1400 RUのビオチン化TNFR1をストレプトアビジン（SA）チップにコートした。その表面を穏やかな酸溶出条件を用いて再生し、基線に戻した。DOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206を、規定濃度にて50μl/分の流速でこの表面上を通過させた。この作業はBIAcore(登録商標)3000マシーンで実施し、データを分析して結合の1：1モデルに適合させた。結合データは、全ての試験した分子に対して1：1モデルとよく適合した。全てのKD値をkonおよびkoff速度から計算した。BIAcore(登録商標)試験は25℃にて実施した。
以下のデータは3つの独立実験から得たものである。各実験において、結果は、kdについては最高dAb濃度、kaについてはより低い濃度を用いて多数のフィット値を平均することにより計算した。そのデータを結果の平均および標準偏差（カッコ内）として提示する（表1）。
表１：ヒトTNFR1と結合するDOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206のBIAcore(登録商標)データ
Figure 2010528647
D0M1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206は同様に、かつ高アフィニティでヒトTNFR1と結合した。DOM1H-131-202とDOM1H-131-206はそれぞれ0.55nMおよび0.47nMの平均アフィニティで結合する。D0M1H-131-202とDOM1H-131-206の両方は、DOM1H-131-511（1.07nMの平均アフィニティを有する）と比較して、若干優れたアフィニティを有する。
受容体結合アッセイ：
ヒトTNFR1に対するdAbの効力を受容体結合アッセイで測定した。
このアッセイは、TNF-αのTNFR1との結合およびこの相互作用をブロックする可溶性dAbの能力を測定する。TNFR1-FC融合体を、ヤギ抗ヒトIgG（H&L）を予めコートしたビーズ上に捕獲する。受容体をコートしたビーズを、黒色側板で透明底の384ウエルプレート中で、TNF-α（10ng/ml）、dAb、ビオチンコンジュゲートした抗TNFαおよびストレプトアビジンalex afluor 647と共にインキュベートした。6時間後に、そのプレートをABI 8200細胞検出システムで読取り、ビーズに関係する蛍光を測定した。もしdAbがTNF-αとTNFR1の結合をブロックすれば、蛍光強度は低下しうる。
データを、ABI 8200分析ソフトウエアを用いて分析した。濃度効果曲線と効力（EC50）値を、Graph Padプリズムおよび可変スロープのS字型用量応答曲線を用いて決定した。アッセイは3回、別々に繰り返した。各実験でTNF-α用量曲線を得た（図38および39）。TNFR1（10ng/ml）に対するdAb結合と競合するために用いたTNF-αの濃度は、このアッセイにおける最高TNF-α応答のほぼ90％である。
代表的なグラフを図39に掲げるが、この図はTNF-αのTNFR1との結合を阻害するdAbの能力を示す。全ての3つの実験で、ネガティブ対照サンプル（HEL4、抗-卵白リゾチームdAbおよびVHダミー）は、高濃度で、TNF-αとTNFR1の間の相互作用を弱くしか阻害しない。試験サンプルおよびポジティブ対照（R&D Systemsから入手した抗TNFR1 mAb、mAb225）およびEnbrel(登録商標)（エタネルセプト；IgG1のFc部分に連結したTNFR2から成る二量体の融合体；慢性関節リウマチの治療用に認可済み）に対する平均効力（EC50）値を表2に示す。
表2：3つの繰り返し実験に対する、TNFR1受容体結合アッセイにおけるDOM1H-131-202、DOM1H-131-206およびDOM1H-131-511に対する効力（EC50）値
Figure 2010528647
このアッセイにおいて、DOMIH-131-206は、試験した他の2種のdAbより強力であり、市販の抗TNFR1mAb、MAB225（R and D Systems）と類似の効力を有すると思われる。
リードクローンの発現をピキア・パストリス（Pichia pastoris）から下記の通り行った：
3種のリード分子の一次アミノ酸配列を用いて、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）における分泌発現について最適化コドンを作製した。DOM1H-131-206の最適化コドンと非最適化コドンとの間には75％配列同一性が存在する。3種の合成遺伝子を発現ベクターpPIC-Zα（Invitrogenから入手）中にクローニングし、次いで2つのピキア属（Pichia）株、X33およびKM71H中に形質転換した。形質転換した細胞を増加する濃度のゼオシン（100、300、600および900μg/ml）上にプレーティングし、多重の組込み体をもつクローンを選択した。各細胞株および構築物に対してほぼ15クローンを選択し、発現スクリーニングを行った。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において遺伝子コピー数の高／低と発現レベルの間の相関は完全には判らないので、いくつかのクローンをゼオシン濃度範囲全域から拾った。高生産性について広範囲にスクリーニングを行わなかったクローンを用いて、5L発酵槽試験を行った。これによって、相当な量のさらなる研究用材料の生産が可能になった。
タンパク質特徴付けのための材料生産：
プロテインA系クロマトグラフィ樹脂を広範囲に用いて、VHdAbを菌培養上清から精製した。これによって、ほとんどの場合に通常＞90％の高純度材料を生じる単一ステップ精製方法が可能になり、いくつかの分子に対しては、低pHの溶出条件にすると凝集物の形成をもたらすことができる。dAbに対するアフィニティ樹脂の能力が限られている問題もあり；これは、発酵槽からの処理する樹脂の相当な量を使用することを意味しうる。特徴付けおよびさらなる安定性および噴霧器研究のための高品質材料を生産するために、下流の精製プロセスは、一次捕獲ステップとして混合モードの電荷誘導樹脂を使い、次いでアニオン交換を行うように工夫した。著しい最適化をすることなく、この方法によりほぼ95％の純度で発現されたdAbのほぼ70％の回収が可能になった。
混合モード電荷誘導樹脂、GE Healthcare製のCapto MMC上での捕獲ステップについては、カラム平衡化を5OmMリン酸ナトリウムpH 6.0を用いて実施し、上清を希釈またはpH調節する必要なしに供給する。カラムを洗浄した後に、タンパク質を、5OmM Tris pH 9.0の溶出バッファーを用いて、pH勾配により溶出する。具体的な洗浄条件と勾配条件は、溶出されるタンパク質のpIに応じて若干変わりうる。
溶出液ピークを、次いでアニオン交換クロマトグラフィを用いる流通ステップによってさらに精製する。このステップでアルコール オキシダーゼなどの残りのHMW汚染を除去しかつ内毒素を低減する。樹脂を、塩無添加でPBSまたはリン酸バッファーpH7.4のいずれかを用いて平衡化する。Capto MMCからの溶出液をアニオン交換樹脂に供給すると、dAbは結合しないで流通液から回収される。内毒素および他の汚染物は樹脂と結合する。PBSバッファーを使う場合、塩が存在すると、このステップのタンパク質回収は、無塩で達成される86％回収より91％回収に改善される。しかし、塩が存在すると内毒素除去の効力を低減し、このステップ後のdAbの典型的な内毒素レベルは、塩が存在しないときに得られる＜1.0EU/mlのレベルと比較して、塩を含むときは58EU/mlと測定された。
タンパク質特徴付け：
5L発酵槽試験から得た材料を、同一性についてはエレクトロスプレー質量分析、アミノ末端配列決定および等電点電気泳動を用いて、また純度についてはSDS-PAGE、SECおよびGelcode糖タンパク質染色キット（Pierce）を用いて特徴付けた。
同一性：
各タンパク質の最初の5残基のアミノ末端配列分析を（EVQLL...）と予測した。質量分析は、50：50 H2O:0.1％氷酢酸を含有するアセトニトリルにバッファー交換しておいたタンパク質のサンプルについて、C4 Zip-チップ（Millipore）を用いて実施した。3種のタンパク質のそれぞれについて測定した質量は、内部ジスルフィド結合の形成による-2の質量差を認めると、一次アミノ酸配列（平均質量を用いて計算した）に基づく理論質量の0.5Da内にあった。IEFを用いて、各タンパク質に対して異なるpIに基づいてタンパク質を同定した。
純度：
3種のタンパク質を1μgおよび10μg量で重複して非還元SDS-PAGEゲルに供給した。全ての事例で単一バンドが観察された。サイズ排除クロマトグラフィも実施して純度のレベルを実証した。サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）については、lOOμgの各タンパク質を0.5ml/分で流通するTOSOH G2000 SWXLカラムに供給した。移動相はPBS/10％エタノールであった。
候補選択のためのdAb安定性の研究：
COPDの適応については、dAbを肺中に、例えば噴霧器デバイスを用いて送達する必要がありうる。この事は、タンパク質が使用する噴霧器の型に応じて、ある範囲の剪断および熱ストレスを受けること、従って肺環境でプロテアーゼによる酵素分解を受けうるを意味する。この型のデバイスを用いて、タンパク質を送達して、正しい粒子径分布を形成し、噴霧器送達後に機能性を保持することができるかを確認した。それ故に、各分子のある範囲の物理的なストレスに対する内因的安定性を研究して、基線安定性および最も感受性の高い安定性を示すアッセイを決定した。各タンパク質の安定性は、溶解に用いたバッファー溶液に依存しうるものであり、いくつかの前製剤の研究が必要であった。バッファー、pHなどの情報も、下流の精製プロセスおよび引き続いての貯蔵中のタンパク質の安定性を理解するために有用でありうる。ある範囲の物理的ストレスへの曝露中の分子の変化を特徴づけるために、ある範囲の分析技法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）、SDS-PAGEおよび等電点電気泳動（IEF）を利用した。
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206のプロテアーゼ安定性の評価：
DOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206のプロテアーゼ安定性を、過剰プロテアーゼ中の所定時間のプレインキュベーション後に、残留結合活性のBIAcore(登録商標)分析により評価した。およそ1400RUのビオチン化TNFR1をストレプトアビジン（SA）チップにコートした。25OnMのDOMIH-131-202、DOM1H-131-511およびD0M1H-131-206を、PBS単独と、または1OOμg/mlのトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムと共に、1、3、および24時間、30℃にてインキュベートした。プロテアーゼインヒビターのカクテルを加えることにより、反応を停止した。dAb/プロテアーゼ混合物を次いでTNFR1コートしたチップ上に、参照セル差引きをして、通過させた。チップ表面は、各注入サイクルの間に、10μlの0.1MグリシンpH 2.2を用いて再生した。ヒトTNFR1と結合した（10秒間）、プロテアーゼと予めインキュベートしたDOM1H-131-202、DOM1H-131-511およびDOM1H-131-206の画分を、プロテアーゼとインキュベーションしてないdAb結合と比較して測定した。BIAcore(登録商標)試験は25℃で行った。
データは3つの独立した実験から得た。バーグラフは結果の平均値を示し、誤差バーは結果の標準誤差を示す（結果については図24を参照）。
DOM1H-131-202およびDOM1H-131-206は、DOM1H-131-511と比較して、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムによるタンパク質分解に対してより高い耐性を有することが見出された。DOM1H-131-511と比較して、DOM1H-131-202とDOM1H-131-206の間の差は、トリプシンでは1時間後、そしてエラスターゼまたはロイコザイムでは3時間後に最も顕著である。
DSCを用いて決定した熱安定性：
分子が最高の安定性を有するpHを決定するために、示差走査熱量計（DSC）を用いてBritton-Robinsonバッファー中の各dAbの融点（Tm）を測定した。Britton-Robinsonは3成分バッファー系（酢酸塩、リン酸塩およびホウ酸塩）から構成されるので、前記溶液中で3〜10のpH範囲を生じうる。理論的pIはタンパク質一次アミノ酸配列から決定した。DSCから求めた、dAbがその最高の内因熱安定性を有するpHは、DOM1H-131-202（202）についてはpH7、DOM1H-131-206（206）についてはpH7〜7.5そしてDOM1H-131-511（511）についてはpH7.5であることを見出した。その後の全てのストレスおよび安定性試験については、次のpHを各dAbに対して用いた；Britton-Robinsonバッファー中で、DOM1H-131-202（202）およびDOM1H-131-206（206）に対してpH7.0、およびDOM1H-131-511（511）に対してpH7.5。結果を次の表3に総括する：
表3：Britton-Robinsonバッファー中で1mg/mlにてDSCにより測定した、DOM1H-131-202（202）、DOM1H-131-206（206）およびDOM1H-131-511（511）のpHおよびTmの総括
Figure 2010528647
内因溶解度試験：
全てのリードdAbを遠心Vivaspin濃縮機で濃縮し（5Kカットオフ）、それらの最大溶解度と濃縮時の回収レベルを決定した。実験は、Britton-Robinsonバッファー中で最も安定なpHにて実施した。サンプル体積と濃度を経時的に測定し、予測濃度からの偏差ならびにサンプルの％回収を記録した。
全てのタンパク質は、Britton-Robinsonバッファー中で100mg/mlを超えて濃縮できることを見出した。DOM1H-131-202（202）とDOM1H-131-206（206）の両方はDOM1H-131-511（511）と比較して予想より低い回収率を示したが、それでも許容レベル内にあった。
リードdAbの噴霧器送達：
色々な噴霧器と製剤バッファーを試験することにより、本dAbは広範囲の噴霧化デバイスを用いて効果的に送達しうることを実証した。さらに重要なこととして、初めて、dAbの製剤バッファー中の噴霧化が有効な肺送達に所望される粒子径分布（＜5μmの液滴のパーセントを用いて比較して）を生じる一方、タンパク質機能性を維持することを示した。これをさらに以下に記載する。
様々なデバイスの性能比較：
DOM1H-131-511（511）を、液剤用噴霧器の3つの主なグループ、すなわち、超音波噴霧器、ジェット噴霧器および振動メッシュ噴霧器からのそれぞれ2つのデバイスを含む、6つの噴霧器デバイスで試験した。各デバイスにおいて、dAbを5mg/mlにてある範囲のPEG濃度にわたり試験した。各サンプルについて、＜5μmの液滴サイズのパーセントを、Malvern Spraytekデバイス（Malvern Instruments Limited、UK）を用いて測定し、その結果を図35に示した。噴霧後の各サンプルの安定性を、SECを用いて試験し、カップに残留する材料中のおよび採集したエーロゾル中の、両方の二量化したサンプルの量を分析した。結果は図36に見ることができる。二量体形成の程度が低いほど、安定性は高い。
ほとんどのデバイスは正しいサイズ範囲で液剤の40％以上を送達できるが、eFlow（振動メッシュ噴霧器デバイス）およびPARI LC（ジェット噴霧器）デバイスがより優れた性能を有し、PARI LC*（星印）デバイスは、バッファー中にPEGが含まれる場合、80％以上送達することができる。このPEGを用いる送達の増加はまた、eFlowについても、またそれより低い程度であるが、PARI LC+についても観察される。
重要なことは、dAbの活性も噴霧後に保持されることであった（図8の結果を参照されたい）。
バッファー添加剤の効果：
DOM1H-131-511（511）は安定性が低いので、その5OmMリン酸塩製剤バッファーはPEG1000およびスクロースの両方を含有しかつその粘度は、dAbを剪断および熱ストレスから保護するのを助けるために、1.2％（w/vスクロース）を含有する5OmMリン酸塩バッファー中の約2％〜約10％ PEG1000の溶液の粘度にほぼ等しいとして規定される範囲内にある。DOM1H-131-202（202）およびDOM1H-131-206（206）の両方はより高いTmを有しかつ熱ストレスに対してかなり改善された安定性を示すので、全ての分子を元来の製剤バッファーおよびBritton-Robinsonバッファー（製剤バッファーより低い粘度を有する）中で試験した。dAbを、E-flowとPariLC+デバイスの両方で、処理時間3.5分間、タンパク質濃度5mg/mlにて試験し、Malvern Spraytekデバイスを用いて粒子径分布を決定した。比較として、噴霧器デバイスを用いて送達する嚢胞性線維症用の市販薬（呼称、標準プロテインX）を、それ自体の製剤バッファー中で試験した。結果を図37に示す。肺深部中への良い送達と分布のための理想的な粒子径は6ミクロン未満、例えば＜5μmである。全てのdAbは、Britton-Robinsonバッファーおよび製剤バッファー（前記の通り）の両方で比較しうるレベルの5μm未満の粒子径を与える。しかし、より高い粘度の製剤バッファーは、正しいサイズ範囲、例えば、＜5μm内の粒子を生成するのに特に有利でありうる。デバイスのカップ中のdAbの濃度は、噴霧前後のA280測定値により決定した。タンパク質濃度は有意に変化しないことが見出され、タンパク質もまたビヒクルも送達中に選択的に噴霧されないことを示した。
結論：
上記の通り、dAbなどのポリペプチドはある範囲の市販の噴霧器デバイスで噴霧することができ、重要なこととして、これらは噴霧後に安定性および生物学的活性を保持し、噴霧後に顕著な凝集が観察されないことを実証した。PEGなどの増粘賦形剤をバッファー製剤に加えると、粒子径分布および5μm未満の液滴サイズのパーセントを改善することができ、従って、潜在的に肺深部へのdAb送達を改善する。
dAbの肺への送達はまた、dAb濃度を例えば約40mg/mlまでの濃度におよび送達時間を増加することによっても、dAb安定性または活性を低下することなく改善することができる。
（実施例１）
ファージベクターpDOM13
糸状ファージ（fd）ディスプレイベクター、pD0M13を用いた。このベクターはファージコートタンパク質IIIとの融合タンパク質を生成する。pD0M13のマルチクローニングサイトを図1に図解する。dAbをコードする遺伝子はSalI/NotIフラグメントとしてクローニングした。
（実施例２）
ファージディスプレイされた、ある範囲のトリプシン耐性をもつドメイン抗体（dAb）についての試験プロテアーゼ選択
dAbすなわち、IL-1R1と結合するDOM4-130-54、TNFR1と結合するDOM1h-131-511、VEGFと結合するDOM15-10、DOM15-26およびDOM15-26-501をコードする遺伝子を、pD0M13にクローニングして、これらのdAbを提示するファージを標準技法により作製した。ファージをPEG沈降により精製し、PBSに再懸濁し、そして滴定した。
上記dAbは、単離されたタンパク質として試験すると、トリプシンによる分解に抵抗するある範囲の能力を提示した。分解に対する耐性は次の通り試験した：PBS中のdAb（1mg/ml）をトリプシン（40μg/ml）と30℃にてインキュベートし、25：1のdAb：トリプシン分子量比を得た。サンプル（30μl）を、トリプシンの添加直前、および次いでT=1時間、3時間、および24時間に採取した。プロテアーゼ活性を、Roche Completeプロテアーゼインヒビター（2x）を添加して中和化し、次いで液体窒素に浸漬し、ドライアイス上で貯蔵した。15μgの各dAbサンプルを次いでNovex 10-20％トリシンゲル上の電気泳動により分析し、タンパク質をSureBlue（1x）で染色した。
DOM15-10とDOM15-26-501の両方は、最初の3時間、有意に消化された。DOM15-26、DOM4-130-54およびDOM1h-131-511はより安定であり、dAbの消化は24時間後にのみ見られた（図2）。
また、ファージ提示したdAbをトリプシンの存在のもとでインキュベートし、ファージ提示したdAbのトリプシン耐性が単離した可溶性dAbで得た結果と相関があるかを評価した。様々なトリプシン濃度とインキュベーション時間を試験した。全ての場合に、Roche Completeプロテアーゼインヒビターによるトリプシンの中和化後、ファージをジェネリックリガンド：すなわちプロテインA（全てのVHドメイン抗体、例えば、DOM1h-131、DOM15-26、DOM15-26-501と結合する）またはプロテインL（全てのVKドメイン抗体、例えば、D0M4-130-54、DOM15-10と結合する）と結合する能力について試験した。また、ファージを標的抗原との結合についても試験した。両方の場合に、結合は、タンパク質分解に対する耐性を介するdAb構造完全性の保持と相関があると思われた。結合活性は、ELISAにより（ファージとコンジュゲートした抗体を用いて）、または結合したファージの溶出条件および指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞の感染後の力価分析により測定した。
ファージにおけるDOM15-10、DOM15-26およびDOM15-26-501についての試験
各dAbを1時間室温にてある範囲のトリプシン濃度（100μg/ml、10μg/mlおよび0μg/ml）で処理した。トリプシン活性をRoche Completeプロテアーゼインヒビター（IX）を用いてブロックし、次いでファージを2％ Marvellを含むPBSに希釈し、5OnMのビオチン化抗原（組換えヒトVEGF（R&D systems））と共に1時間室温にてインキュベートした。1時間室温にて2％ Marvellを含むPBSで予めブロックしたストレプトアビジンコートしたビーズ（Dynabeads M-280（Invitrogen））を加え、次いでその混合物を5分間室温にてインキュベートした。Dynabeadsとのインキュベーションステップは全て回転ホィール上で行った。ビーズを1mlの0.1％ Tween-20を含むPBSで8回洗浄して無結合のファージを洗い流した。結合したファージを0.5mlの0.1MグリシンpH2.2で溶出し、100μlの1M Tris-HCL pH8.0で中和した。溶出したファージを用いて指数関数的に増殖するTG1細胞に感染させ（1時間、37℃にて）テトラサイクリンプレート上にまいた。プレートを一晩、37℃にてインキュベートし、コロニーを計数した（表4を参照）。最良の結果は100μg/mlトリプシンとのインキュベーションによる選択から観察された。DOM15-26の収率は、DOM15-10およびDOM15-26-501と比較して約10倍増加した。
第2の実験を実施して、より厳しいインキュベーション条件下でこれらの結果をさらに確認した。ファージ提示したdAbを、1時間または2時間、37℃にて攪拌（250rpm）処理した。最良の結果を、100μg/mlトリプシンとの2時間インキュベーションによる選択から観察した。DOM15-26の収率は、DOM15-26-501の収率より200倍高くかつDOM15-10の収率より1000倍高かった。
第3の実験では、DOM15-26およびDOM15-26-501を提示するファージをスタート時に1：1で混合した。これらを次いで、トリプシン（1000μg/ml）と共にまたはトリプシン無しで2時間、37℃にて攪拌しながら（250rpm）インキュベートし、次いで上記の通り抗原結合について選択した。各選択から得た10個のコロニーの配列決定は、トリプシン前処理なしの選択についてはクローンの混合集団（DOM15-26：4/10；DOM15-26-501：6/10）を表したが、トリプシンによる選択からの全てのクローンは予想通り、DOM15-26をコードした。
これらの実験は、dAbを提示するファージにプロテアーゼを加えることにより、最もタンパク質分解的に安定なdAbを提示するファージが（ジェネリックリガンドまたは抗原上のパニング後に）優先的に選択される選択圧力を得ることができることを示す。
Figure 2010528647
ファージにおけるD0M4-130-54による試験
D0M4-130-54を上記と類似のプロトコルで試験した。変えたパラメーターは、トリプシンの濃度、インキュベーションの温度と長さであった。バイオパニングを、IL-R1-Fc（IL-IR1とFcの融合体）に対して、PBS中の1nMの濃度で行った。ファージ力価の有意な低下は、100μg/mlトリプシンによる一晩、37℃でのファージのインキュベーション後にのみ観察された（表5を参照）。
Figure 2010528647
DOM1h-131ファージによる試験
DOM1h-131ファージ（アミノ酸配列がDOM1h-131-511と密接に関連がある）を、0μg/ml、10μg/ml、100μg/mlおよび1000μg/mlトリプシンで1時間室温にて処理した。消化を25 x 完全プロテアーゼインヒビター（Roche）を加えて阻害した。ファージの連続2倍希釈液を1nM TNFR1でコートしたELISAプレートに流下して、結合ファージを抗M13-HRPで検出した。
結果を下表6に示す。
Figure 2010528647
これらの試験は明らかに、トリプシンによるタンパク質分解に対して様々な程度の耐性のdAbを提示するファージに、トリプシン100μg/mlと温度37℃の選択圧力を適用することが適当であることを示す。
プロテアーゼによるインキュベーション時間は、所望であれば、各ファージが提示するdAbについて最適化することができる。
（実施例３）
ファージ提示したドメイン抗体のレパートリーの、プロテアーゼ選択
4つのレパートリーを、次のdAb：DOM4-130-54、DOM1h-131-511、DOM15-10およびDOM15-26-555を親分子として作製した。Stratagene Mutazyme IIキット、ビオチン化したプライマーおよび50μl反応液に対して5〜50pgのテンプレートを用いて、無作為変異誘発をPCRにより遺伝子に導入した。SalIおよびNotIでの消化の後に、インサートをストレプトアビジンコートしたビーズで無消化の産物から精製し、pDOM13の対応する部位にライゲートした。大腸菌TB1細胞を、精製ライゲーション混合物を用いて形質転換し、テトラサイクリン-耐性クローンの大レパートリーを得た：8.5x108（D0M4-130-54）、1.5x109（DOM1h-131-511）、6x108（DOM15-10）および3xlO9（DOM15-26-555）。
ファージライブラリーをPEGで二重沈降により調製し、PBSに再懸濁した。
アミノ酸突然変異率は、DOM1h-131-511およびD0M4-130-54レパートリーについて、それぞれ2.3および4.4であった。機能性は、96クローンをファージELISAでプロテインAまたはプロテインLによりコートしたウエル（1μg/mlで）を用いて試験することにより評価した。クローンの62.5％および27％がそれぞれDOM1h-131-511およびDOM4-130-54レパートリーのdAbの機能提示を示した。
アミノ酸突然変異率は、DOM15-10およびDOM15-26-555レパートリーについて、それぞれ2.5および4.6であった。機能性は、96クローンをファージELISAでプロテインAまたはプロテインLによりコートしたウエル（1μg/mlで）を用いて試験することにより評価した。クローンの31.3％および10.4％がそれぞれDOM15-10およびDOM15-26-555レパートリーのdAbの機能提示を示した。
DOM4-130-54およびDOM1h-131-511レパートリー
4ラウンドの選択をこれらのライブラリーで行い、改善されたプロテアーゼ耐性をもつdAbを選択した。
第1のラウンドの選択は、プロテアーゼ処理無しの抗原結合（1nMまたは1OnM抗原）によるものであって、ライブラリーをクリーンアップして抗原と高アフィニティで結合していないクローンを取り除いた。ラウンド1からの出力は108〜1010範囲であり（1011ファージの入力と比較して）、ライブラリーの大部分が抗原と高アフィニティで結合したことを示す。
ラウンド2において、100μg/mlトリプシンによるプロテアーゼ処理を導入し、その出力を下表7に示した。
Figure 2010528647
dAbをトリプシンで37℃にて一晩処理すると、有意な選択が行われた。この出力をラウンド3へ進め、ここでファージを1mg/mlまたは100μg/mlトリプシンで37℃にて24時間処理した。ラウンド3からのトリプシン処理したファージの力価は、DOM1h-131-511レパートリーについて105〜106、DOM4-130-154レパートリーについて107〜108であった。
ラウンド3からの全ての出力（DOM1h-131-511およびDOM4-130-154の1mg/mlおよび100μg/ml）を、100μg/mlトリプシンと共に1nM抗原に対する第4ラウンドによる選択にかけた。力価は106〜108の範囲であり、ラウンド3で見られたものと類似した。DOM1h-131-511レパートリーについてはいくらかの濃縮が見られたが、D0M4-130-54レパートリーでは濃縮が見られなかった。
DOM15-10とDPMI5-26-555レパートリー
第1のラウンドの選択は、2nMビオチン化したhVEGF（ヒト血管内皮成長因子）濃度で、プロテアーゼ処理無しで行ってライブラリーをクリーンアップし、抗原と高いアフィニティで結合しないクローンを除去した。ラウンド1からの出力は約108（DOM15-10の1010ファージおよびDOM15-26-555の1011ファージの入力と比較して）であり、ライブラリーの大部分が抗原と高アフィニティで結合したことを示す。
第2および第3ラウンドの選択を2nMのビオチン化hVEGFで実施した。hVEGFでのパニングの前に、ファージをトリプシン（100μg/ml）の存在のもとで37℃にて振とう器中で（250rpm）インキュベートした。インキュベーション時間はDOM15-10レパートリーについて1時間、DOM15-26-555レパートリーについて2時間であった。
出力は次の通りであった：DOM15-10レパートリーでの選択の第2および第3ラウンドについては1.5xlO6および9xlO5；DOM15-26-555での選択の第2および第3ラウンドについては2.2xlO8および3.9xlO9。
（実施例４）
選択出力の分析：DOM4-130-54およびDOM1h-131-511レパートリー
ラウンド3およびラウンド4からの全ての出力をpD0M5ベクター中にサブクローンし、そしてJM83細胞中に形質転換した。pD0M5ベクターはpUC119系のベクターであった。タンパク質の発現はPlacプロモーターにより駆動する。GAS1リーダー配列（WO 2005/093074を参照）は単離された、可溶性dAbの大腸菌JM83の周辺質および培養上清中への分泌を保証した。96および72個の個々のコロニーをラウンド3およびラウンド4から無作為に拾って発現させた。
12〜24個のクローンをそれぞれのラウンド3およびラウンド4出力から配列決定した。両方の選択物中のコンセンサス変異誘発を観察し、コンセンサスモチーフを保持するおよそ25クローンを選んでさらなる特徴付けを行った。これらのクローンのアミノ酸配列を図3（DOM1h-131-511選択された変異体）および図4（D0M4-130-54選択された変異体）に示し、DNA配列として図19A〜19Lに掲げた。選択したクローンにおける親配列と異なるアミノ酸は強調されている（同一であるアミノ酸はドットによりマークした）。CDR1、CDR2およびCDR3に対応するループはボックスで囲んだ。
これらのクローンを大量に発現させ、プロテインL（D0M4-130-54変異体について）およびプロテインA（DOM1h-131-511変異体について）上で精製し、そしてトリプシン（100μg/mlまたは1000μg/ml最終濃度）の存在または非存在のもとで37℃にて1時間または一晩インキュベーションの後に、BIAcoreで抗原結合について試験した。
一般に、DOM4-130-54選択からの出力はより安定であり、ほとんどのクローンがトリプシン耐性を1時間残存し、最良のクローンは耐性を一晩残存した。対照的に、DOM1h-131-511選択からの少数のクローンはトリプシン耐性を1時間残存したが、どのクローンも耐性を一晩残存しなかった。
（実施例５）
選択出力の分析：DOM15-10およびDOM15-26-555レパートリー
トリプシン前処理による選択の効果を、最初に、モノクローナルファージELISAに与えるトリプシン消化の有無で試験した。各ライブラリーの選択の第2ランドから18個のコロニーおよび選択の第3ランドから24個のコロニーを拾ったクローンDOM15-10、DOM15-26-501およびDOM15-26を対照として用いた。さらなる対照には、トリプシン選択の第2および第3ラウンド後の各ライブラリーからの増幅および精製ファージ溶液が含まれた。
各ファージサンプルを2つの画分に分割して、第1を100μg/mlトリプシンで処理し、第2はトリプシンで無処理とした。両画分のインキュベーションを、1時間37℃にて攪拌（250rpm）しながら実施し、Roche完全プロテアーゼインヒビター（1x）を加えてブロックした。
ファージELISAをトリプシン消化および無消化サンプルを用いて実施した。ELISAウエルを、0.1M炭酸水素塩バッファー中の濃度1μg/mlのニュートラアビジンを用いてコートした。PBSによる洗浄ステップおよび抗原コートしたウエルをPBS中の1％ Tween-20による1時間室温でのブロッキングの後に、それらのウエルをPBS中の1％ Tween-20に濃度100ng/mlにて希釈したビオチン化hVEGFを用いてコートした。次に、それらのウエルをPBSで洗浄し、そして1％Tween-20/PBSで1：1に希釈した処理したまたは無処理のファージ上清を加えた。37℃で30分間インキュベーションの後、ウエルを1％Tween-20/PBSで洗浄し、次いで抗M13ファージ-HRPコンジュゲート（1％Tween-20/PBSに1/5000で希釈したもの）と37℃で30分間インキュベーションした。次いでウエルをPBSとペルオキシダーゼで洗浄した。反応をSureBlue試薬を加えることにより開始した。約10分間後、等価体積の1M HClを用いて反応を停止し、ウエルをOD450nMで読取った。
トリプシンで処理した不安定な対照DOM15-10およびDOM15-26-501のELISA読取値は0.404より低いOD450を与え、この値を不安定なクローンの境界値と仮定した。0.404より低いODを与える全てのサンプルは不安定であると考えた。この値を超える全てのサンプルは安定であると考えた。
Figure 2010528647
表8は、各ライブラリーのトリプシン選択の第2および第3ラウンド後における安定なクローンのパーセントを示す。トリプシン耐性クローンの濃縮が、選択の第3ランド後の両方のライブラリーで認められる。各選択後の増幅された精製ファージ混合物を含有する対照ELISAウエルの値は、トリプシン消化後の各事例において0.404より遥かに高かった。さらに、選択の第3ランドからのトリプシン処理ファージを、選択の第2ランドからのトリプシン処理ファージと比較するとシグナルの小さい増加が観察された。DOM15-10ファージライブラリーは出発値の約14％の増加を示した。DOM15-26-555ファージライブラリーは出発値の約2％に当たる増加を示した。
全体として、これらの結果は、トリプシン前処理での選択が、DOM15-10およびDOM15-26-555レパートリーからトリプシン-耐性ファージクローンを選択するのに有効であったことを示す。
選択（DOM15-26-555）の第2および第3ラウンドからのおよび選択（DOM15-10）の第3ランドだけからの全ての出力をpD0M5ベクター中にサブクローニングし、そしてHB2151エレクトロコンピテント細胞中に形質転換した。このpD0M5ベクターはpUC119に基づくベクターである。タンパク質の発現はPlacプロモーターにより駆動する。GAS1リーダー配列は単離された、可溶性dAbの大腸菌HB2151の周辺質および培養上清中への分泌を保証した。選択（3および4）の各ラウンドからの184個の個々のコロニーを、無作為に拾って1ml培養体積に発現させた。
細菌の上清を、HBS-EP BIAcoreバッファー（1：1体積比）に希釈し、二重に分割した。トリプシンを、1つのバイアルだけに20μg/mlの最終濃度で加えた。インキュベーションを40分間、37℃にて攪拌（250rpm）しながら実施した。反応をRoche完全プロテアーゼインヒビター（IX）を用いてブロックした後、両方のトリプシン処理済みおよび無処理ファージ懸濁物をBIAcore 3000で抗原結合について試験した（SAセンサーチップでビオチン化したhVEGFの2,000RU）。
クローンを拾う判定基準は、無処理dAbと比較して、トリプシン処理済みdAbの＜15％の抗原結合の低下（選択した時点で到達した最大RUに基づいて）であって、これはプロテアーゼ処理に対する一般的なdAb安定性および抗原からのdAbの解離の2時点間の＜40％の解離速度（off-rate）低下を反映しうる。これらの値に基づいて、DOM15-26-555ライブラリーの選択の第2および第3ラウンドの両方からの60クローンおよびDOM15-10ライブラリーの選択の第3ランドからの17クローンを配列決定した。両方のライブラリー出力中のコンセンサス突然変異を観察し、コンセンサスモチーフを保持するおよそ17クローンを選んでさらなる特徴付けを行った。これらのクローンのアミノ酸配列を図5（DOM15-26-555、選択された変異体）および図6（DOM1h-10、選択された変異体）に示し、DNA配列として図20A〜20Eに掲げた。選択したクローン中の親配列から異なるアミノ酸を強調した（同一であるものはドットによるマークした）。CDR1、CDR2およびCDR3に対応するループはボックスで囲んだ。
これらのクローンを50ml発現培養に発現し、HBS-EPバッファーに10OnM濃度で希釈したプロテインA（DOM15-26-555変異体について）またはプロテインL（DOM15-10変異体について）で精製し、そして37℃にて攪拌しながら（250rpm）トリプシン（20μg/ml最終濃度）の存在または非存在のもとで1.5時間のインキュベーションの後に、抗原結合についてBIAcoreで試験した。
これらのクローンをまた、実施例2に記載の方法を用いてトリプシン耐性について試験した。タンパク質をPBSにバッファー交換し、1mg/mlに濃縮した。25μgのタンパク質を1μgのトリプシン（Promega）と混合し、および0時間および24時間、30℃にてインキュベートした。この時間の後、反応をRoche完全プロテアーゼインヒビター（IX）およびDTT、ならびにローディング剤を用いてブロックし、サンプルを5分間、100℃にて変性した。次いで15μgの各サンプルをNovex10-20％トリシンゲル上で電気泳動により分析し、タンパク質をSureBlue（Ix）で染色した。
一般に、DOM15-26-555選択からの出力はより安定であって、ほとんどのクローンはBIAcoreで試験したときに1.5時間かつSDS-PAGEを泳動したときに一晩トリプシンに対する耐性を保持した。対照的に、DOM15-10選択からの少数のクローンだけが、SDS-PAGEで泳動したときトリプシン一晩処理に対して耐性であった。
（実施例６）
DOM1h-131-511変異体の同定
DOM1h-131-203、DOM1h-131-204およびDOM1h-131-206をさらに詳しく分析した。これらを、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩、37℃におけるインキュベーション後に、50OnMのdAb濃度にてBIAcoreで比較した。BIAcoreトレースを図7に示す。その結果は、高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して、両方の変異体がそれらの親より耐性があることを明らかに示す。また2つのdAb、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206をそれらの親と、ロイコザイム、エラスターゼおよびパンクレアチンを含むある範囲の他のプロテアーゼに対して、上記条件下で100μg/mlのプロテアーゼ濃度において比較した。これらのdAbは、試験した全てのプロテアーゼに対して、親と比較して、タンパク質分解に対する耐性が増加することを示した。エラスターゼおよびロイコザイムについてのBIAcoreトレースを図8に示す。
各dAbの5μMを100μg/ml配列決定グレードのトリプシンで0、1、3および24時間処理した。反応を25 X Roche完全プロテアーゼインヒビターで阻害し、反応物を4〜12％ Novex Bis-Trisゲルで泳動させた。ゲルを図9に示す。
（実施例７）
D0M4-130-54変異体の同定
D0M4-130-201およびD0M4-130-202をさらに詳しく分析した。これらを、異なるトリプシン濃度（0〜100μg/mlの範囲）による一晩37℃におけるBIAcoreトレースを図10に示す。その結果は明らかに、高濃度のトリプシン（100μg/ml）におけるタンパク質分解に対して、全ての3つの変異体がそれらの親より耐性があることを示す。また、DOM4-130-201およびDOM4-130-202を、ロイコザイム、エラスターゼおよびパンクレアチンを含むある範囲の他のプロテアーゼに対して、その親と上記条件下で、100μg/mlのプロテアーゼ濃度で比較した。その結果は、トリプシンより明らかでなかったが、リードdAbは、試験した全てのプロテアーゼに対して、親と比較してタンパク質分解に対して耐性の増加を示した。エラスターゼおよびロイコザイムについてのBIAcoreトレースを図11に示す。
各dAbの5μMを、100μg/ml配列決定グレードのトリプシンで0、1、3および24時間処理した。反応物を25 X Roche完全プロテアーゼインヒビターで阻害し、反応物を4〜12％ Novex Bis-Trisゲルで泳動した。ゲルを図9に示す。
（実施例８）
DOM1h-131-511およびD0M4-130-54変異体のさらなる特徴付け
dAbを最初に示差走査熱量計（DSC）を用いて分析し、トリプシン耐性の増加が融点（Tm）の増加と相関があるかどうかを確認した。トリプシン安定性の増加はTmの増加と確かに相関がある（表9を参照）。
Figure 2010528647
また、DOM1h-131-511由来のdAbをMRC-5細胞に基づくアッセイで比較した（表10を参照）。このアッセイにおいて、TNFα刺激性IL-8放出を中和するdAbの能力を測定して、トリプシン安定性の増加が効力を低下させるかどうかを確認した。しかし、トリプシン耐性dAbの活性はこのアッセイで実質的に影響を受けなかった。
Figure 2010528647
DOM4-130-54由来のdAbを受容体結合アッセイで試験して、これらがなお同じIL-IのIL-RIとの結合を阻害する能力を有するかを確かめた（表11を参照）。トリプシン耐性dAbの活性はこのアッセイにおいて影響を受けなかった。
Figure 2010528647
（実施例９）
DOM15-26-555変異体の同定
DOM15-26-588、DOM15-26-589、DOM15-26-591、およびDOM15-26-593を、それらの親ならびに、効力および安定性に最大のインパクトを有しうる突然変異（E6VおよびF100S/I）を組み合わせて変異誘発により作製した2つのさらなるdAb、DOM15-26-594およびDOM15-26-595と一緒に、さらに詳しく分析した。配列を図12に示した。200μg/mlの濃度のトリプシンとインキュベーション後に、クローンをBIAcoreで10OnMのdAb濃度におけるhVEGFとの結合について比較した。反応は3時間および24時間、37℃にて攪拌しながら（250rpm）実施した。最良のクローン、DOM15-26-593とその親のBIAcoreトレースを図13に示す。他の結果を図14にチャートとして示す。結果は明らかに、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、全ての変異体が親より耐性であることを示す。
またDOM15-26-593とその親のトリプシン耐性を、処理したおよび無処理のサンプルをSDS-PAGEで泳動して試験した。簡単に説明すると、タンパク質をPBSにバッファーを交換し、1mg/mlに濃縮した。25μgのタンパク質を1μgの配列決定グレードトリプシン（Promega）と混合し、および0時間、1時間、3時間および24時間、30℃にてインキュベートした。この時間の後、反応をRoche完全プロテアーゼインヒビター（1x）を用いてブロックし、DTT、ならびにローディング剤、を加えた。サンプルを5分間、100℃にて変性した。15μgの各サンプルをNovex10-20％トリシンゲルに供給し、タンパク質をSureBlue（1x）で染色した。結果を図15に示す。この実験におけるDOM15-26-593のトリプシン耐性プロファイルはBIAcore実験により示されたプロファイルから変化し、反応条件の相異がトリプシン切断の最終結果に影響を与えうることを示唆した。それにも関らず、DOM15-26-593は、他の選択されたクローンより、下記の通り、優れた生物物理学的特性、ならびにアフィニティを有する。DOM15-26-555変異体の特性の総括を下表12に示す。
Figure 2010528647
（実施例１０）
DOM15-10変異体の同定
DOM15-10-11を、その親D0M15-10と一緒に、さらに詳しく分析した。配列を図16に示す。トリプシンとの200μg/mlの濃度にてインキュベーション後に、dAbを、BIAcoreでhVEGF結合について10OnMのdAb濃度にて比較した。反応を1時間、3時間および24時間、37℃にて攪拌しながら（250rpm）実施した。これらのdAbのBIAcoreトレースを図17に示す。結果は明らかに、24時間のトリプシン処理後のタンパク質分解に対して、選択した変異体が親より耐性があることを示す。
またリードおよびその親のトリプシン耐性を、処理したおよび無処理のサンプルをSDS-PAGEで泳動して試験した。簡単に説明すると、タンパク質をPBSにバッファーを交換し、1mg/mlに濃縮した。25μgのタンパク質を1μgの配列決定グレードトリプシン（Promega）と混合し、そして0時間、1時間、3時間および24時間、30℃にてインキュベートした。この時間の後、反応をRoche完全プロテアーゼインヒビター（1x）を用いてブロックし、そしてDTT、ならびにローディング剤、を加えた。サンプルを5分間、100℃にて変性した。15μgの各サンプルをNovex10-20％トリシンゲルに供給し、タンパク質をSureBlue（1x）で染色した。結果を図18に示す。この場合、トリプシン耐性プロファイルはBIAcoreトリプシン試験と優れた相関があり、結合活性は直接タンパク質完全性を反映することを示す。
（実施例１１）
DOM15-26-555およびDOM15-10変異体のさらなる特徴付け
dAbを示差走査熱量計（DSC）を用いて分析して、トリプシン耐性の増加が融点（Tm）の増加と相関があるかどうかを確認した。結果を表13に示す。DOM15-26-555変異体のトリプシン耐性と融点との間には相関がある。リードDOM15-26-588とDOM15-26-593はTmの改善を示したが、他のクローンは示さなかった。注目すべきことは、DOM15-26-555とDOM15-10親分子の両方はスタート時に、DOM4-130-54およびDOM1h-131-511親分子（スタート時のTm：57.9〜54.1℃）より遥かに高いTm（63.3〜63.7℃）を有するが、プロテアーゼ耐性クローンは全体に、類似した範囲のTm（DOM1h-131-511/D0M4-130-54変異体は65.1℃の平均Tm、そしてDOM15-26-55/DOM15-10変異体は64.9℃の平均Tm）に到達することである。
Figure 2010528647
またdAbを受容体結合アッセイで比較し、BIAcore動力学を測定して、トリプシン安定性の増加が効力を低下させたかどうかを確認した。しかしこのアッセイにおいて、dAbの活性は実質的に影響を受けなかったかまたは改善すら生じた。結果を表14に示す。
Figure 2010528647
Tm上昇の利点
ほとんどのタンパク質（ドメイン抗体を含む）は2つの状態：フォールドされた状態（生物学的活性分子に導く）とフォールドされてないの状態（機能的活性を保持しない）で存在する。これらの2つの状態は全ての温度で共存し、各状態の相対的比率は通常、定数K（フォールディングと無フォールディングの動力学定数の関数である）により決定される。融点は通常、K=1、すなわち、フォールドしたタンパク質の分率がフォールドしてないタンパク質の分率と等しい温度として定義される。定数Kはタンパク質の安定化と不安定化の分子間相互作用により決定され、それ故に、タンパク質のアミノ酸配列により主に決定される。温度、pH、バッファー組成、圧力などの外因パラメーターがKに、それ故に融点に影響を与える。
フォールドされてないタンパク質は分解機構にとって容易な標的である：すなわち、（i）ジスルフィド結合の曝露は環境に応じて酸化または還元のリスクを増加する、（ii）骨格柔軟性の上昇は自己タンパク質分解反応にとって好都合となる、（iii）ペプチドセグメントの曝露は、in vivoでプロテアーゼに対する、生産過程でプロテアーゼに対する、そして下流プロセシングおよび長期貯蔵中にキャリオーバープロテアーゼに対する標的を提供する、ならびに（iv）凝集し易いセグメントの曝露は分子間凝集およびタンパク質沈降に導く。全ての場合に、（i）バッチ再現性を保証する、（ii）保存長期安定性を保証する、および（iii）in vivo効力を保証する努力を危うくするタンパク質完全性、タンパク質含量およびタンパク質活性の喪失が起こる。
自然においてタンパク質は進化により、体温で十分に機能しかつホメオスタシスな機構を介して容易に置き換えられるように設計されている。生物工学的プロセスを介して製造される治療タンパク質は色々な環境に遭遇する；それらはしばしば組換えDNA技法により外来宿主において生産され、大容器中で高い量で発現され、下流プロセスまで通して非常に重要なpHの変化を受けるかまたはバッファー組成であって、最後に非生物学的バッファー中で高濃度にて長時間貯蔵される。新しい送達技法（例えば吸入、皮下パッチ（sc patch）、徐放ナノ微粒子（slow delivery nanoparticles））も、治療タンパク質が受けるストレスに加わる。最後に、タンパク質工学技法の出現により、生産の増強または全く新規の治療タンパク質の生産をもたらしている。ほとんどの工学的技法はアミノ酸配列を改変または新しいアミノ酸配列を作製することを目指すin vitroに基づく技法であるので、生物学的タンパク質を徐々に改善してきた進化プロセスは起こらない、それ故にストレス耐性について最適な性能に及ばないタンパク質をもたらす。
本発明の技法は、ダーウィンの進化を介するタンパク質が遭遇する条件の1つを再生することを目的とする。ペプチドまたはポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインを、組織再造形およびタンパク質恒常性に大きい役割を果たすプロテアーゼと共に注入する。機能への適合が改善されたタンパク質をもたらしうるいずれかの特別な突然変異を、それが機能する環境に適合する能力について試験する。このプロセスを、本発明の一実施形態において再現する：すなわち、ペプチドまたはポリペプチド変異体のレパートリーを作製してプロテアーゼに曝す。第2のステップにおいて、変異体のレパートリーを特定の標的と接触させる。プロテアーゼによる分解に持続したタンパク質変異体だけが標的と結合し、従って、「バイオパニング」と呼ばれる単純なアフィニティ精製プロセスにより回収することができるこのシステムはin vivoプロセスと比較していくつもの利点を提供する：すなわち、タンパク質レパートリーはより広い範囲の条件と、例えば、ある範囲のプロテアーゼと、より高い濃度にて、より長い時間、色々なバッファー中でまたはpHで、および色々な温度にて遭遇することができる。従って、このin vitro技法は、そのタンパク質が由来する環境より広範囲の環境で機能しかつ安定なまま残存するタンパク質を設計する手法を提供する。明らかにこの技法は、生物工学産業に、特に治療タンパク質の領域に複数の利点を提供する。
（実施例１２）
プロテアーゼ耐性リードに対するPK関係データ
4つのdAb系列のそれぞれについての親dAbおよびプロテアーゼ耐性dAbをさらにin vivoで評価した（リストと詳細については下表15を参照）。
Figure 2010528647
アスタリスク：MRC5/ILバイオアッセイにより決定した。
短剣符：RBAアッセイにより決定した。
注記：DOM15-26-501は、本特許出願において先に例示したDOM15-26-555の親バージョンである。DOM15-26-555はCDR1（I34M）に1つの生殖系列アミノ酸突然変異を有する。DOM15-26-501はDOM15-26-555より低い融点（52℃対63.3℃）を有し、トリプシンによる消化に対する感受性が増加している。PK研究用にDOM15-26-555でなくDOM15-26-501を選んだのは、これがDOM15-26-593と比較して乏しい安定性のより優れた代表であることによる。
本発明者らは耐性を次の通り翻訳することができる：
1は低い。
2は中度である。
3は良い。
4は高い。
5は非常に高い。
従って、これは親分子のトリプシン耐性は次の通りである：
D0M4-130-54は良い。
DOM1h-131-511は良い。
DOM15-10は低い。
DOM15-26-501は低い。
選択したリードについては次の通りである：
D0M4-130-202は非常に高い。
DOM1h-131-206は非常に高い。
DOM15-10-11は高い。
DOM15-26-593は高い。
ドメイン抗体はサイズが小さい（12〜15kDa）ので、静脈内または皮下に注入すると、速やかに、循環からクリアされる。実際、腎の糸球体の濾過カットオフは50kDa超であり、それ故にdAbなどの小タンパク質は、腎を通過するので循環に保持されない。それ故に、in vivoでプロテアーゼに対する耐性の長期間効果を評価するために、本発明者らは全身のの滞在を延長する部分を用いてドメイン抗体をタグ付けする。半減期を延長するいくつかの手法（例えば、PEG、Fc融合、アルブミン融合など）が文献に報じられている。本出願においては、ドメイン抗体にヒトIgG1抗体のFc部分を用いてタグ付け（またはフォーマット）した。このフォーマットは2つの利点を提供する：(i)得られるdAb-Fcの分子サイズはほぼ75kDaであり、これは循環中の保持を保証するのに十分な大きさである、(ii)抗体Fc部分はFcRn受容体（「ブランベル（Brambell）」受容体としても公知である）と結合する。この受容体は上皮細胞、内皮細胞および肝細胞に限局して、抗体およびアルブミンの寿命の延長に関わる：実際、抗体および他の血清タンパク質の飲作用時に、このタンパク質は酸性化エンドソームに向かい、ここでFcRn受容体は、抗体をエンドソームへの移行前に（Fc部分との結合を介して）奪取してこれらを循環に戻す。従って、Fc部分をdAbにタグ付けすることにより、dAbが、少なくとも2つのコンパートメント、すなわち血清とプレエンドソームのコンパートメント（これらはそれぞれタンパク質分解酵素の特定のセットを含有する）に長期間曝されうることが保証される。さらに、FcRn受容体は経細胞輸送に介在し、これにより、Fcを担持するタンパク質は血管外空間と往来して遊走する。
Fcによるフォーマット形成は、VHとVK dAbをコードする遺伝子とヒトIgG1 Fcコードする遺伝子とを、短い介在性ペプチドリンカー（太字）を介して融合することにより実施した：すなわち、
VH dAb（下線部）については：
EVQ......GQGTLVTVSSASTHTCPPCPAPELLGGP...(hIgG1Fc)...PGK*
VK dAb（下線部）については：
DIQ.........GQGTKVEIKRTVAAPSTHTCPPCPAPELLGGP...(hIgG1Fc)...PGK*。
材料は、HEK293/6E細胞の一過性トランスフェクションにより、293-フェクチン（Invitrogen）を用いて標準プロトコルに従い作製した。これらの細胞を、pTTシリーズのベクター（Durocherら, 2002）と一緒に用いると、高レベルで一過的に発現するよう設計した。こうして改変したpTT5ベクター（pDOM38）中にdAb遺伝子をクローニングし、Fc融合体を発現するベクターを作製した（図21を参照）。トランスフェクトした細胞から上清をトランスフェクション5日後に収穫し、遠心分離により透明化し、そして0.2μmフィルターを通して濾過した。dAb-Fc融合タンパク質をプロテインAストリームライン樹脂（GE Healthcare）上に捕獲することにより精製した。タンパク質をカラムから1OmMクエン酸ナトリウムpH 3で溶出し、次いで1Mクエン酸ナトリウムpH 6を加えて、10OmMクエン酸ナトリウムpH 6の最終組成物に到達した。
このdAb-Fc分子を、ラットにおけるin vivo半減期について、雌性Sprague-Dawleyラット（1グループ当たりn=3）への5mg/kgの標的用量にて試験した。注目すべきことは次の通りであった：標的用量を用いると、ラットの標的濃度を大幅に超過したので、親dAbとトリプシン耐性dAbの間のアフィニティの差（実施例11を参照）はin vivoで分子の結末に影響を与えないと予想される。従って、dAb間のPKプロファイルの差が抗原非依存性排除プロセスを反映すると予想される。
血液サンプルを、投与後、0.03、1、4、8、24、48、72、96、120および168時間に採取した。血餅形成の後、血清を取出し、次いでhIL-1R1、TNFR1またはVEGF抗原捕獲アッセイで試験した。：
hIL-1R1抗原捕獲アッセイ：
4μg/mL 抗-hIL-1R1でコートする。
ブロックする。
500ng/mL shIL-1R1を加える。
サンプルを加える。
抗-ヒトFcHRPの1：10,000で検出する。
TNFR1抗原捕獲アッセイ：
0.1μg/mL sTNFR1でコートする。
ブロックする。
サンプルを加える。
抗-ヒトFcHRPの1：10,000で検出する。
VEGF抗原捕獲アッセイ：
0.25μg/mL VEGFでコートする。
ブロックする。
サンプルを加える。
抗-ヒトFcHRPの1：10,000で検出する。
アッセイからの生データを各血清サンプル中の濃度に変換した。
各時点における平均μg/mL値を次いでWinNonLinで非コンパートメント分析（NCA）を用いて分析した。各dAb-Fc対のPKプロファイルを表16に示す。これは測定したPKパラメーターを総括するものである。
Figure 2010528647
結果は明らかに、dAbーFc対、4-130-54〜Ih-131-206のPKプロファイルはほとんど上書きしうる一方、このプロファイルは他の対のプロファイルとは大きく変わることを示す。その効果は、AUC/Dを考えるとよくわかる：すなわち、15-10のAUC/Dは15-10-11のAUC/Dの42％でしかない。15-26-501のAUC/Dは15-26-593のAUC/Dの11％でしかない。この重要な差は（程度は低いが）半減期にも影響を与える：すなわち、15-10と15-10-11について、それぞれ、43.2時間に対して56.6時間である。もっと大きい差がDOM15-26系列について見られる：すなわち、15-26-501と15-26-593について、それぞれ、12.9時間に対して86.2時間である。実際、非コンパートメント分析を用いる優れたPK分析を行うには、少なくとも4データ点を直線回帰勾配をフィットするために用いるべきであり、かつ半減期を見積る期間は計算する半減期の少なくとも3倍であるべきである。
本実施例に記載の生物物理学的特性に照らし合わせると、所与のdAbのトリプシンによる分解に抵抗する能力は、dAb-Fc融合体のラット血清中において長期間循環する能力と相関があると思われる。実際、実施例10などの実施例に示されるように、DOM15-10およびDOM15-26-501は最も分解性のdAbである：すなわち、30℃にてほぼ3時間の1μgのトリプシンの存在のもとで、25μgdAbのインキュベーションは完全に分解する。本研究の他の全てのdAbは（トリプシンで選択されていたか（すなわち、DOM15-10-11、DOM15-26-593、DOM4-130-202およびDOM1h-131-206）または既に親分子のようにいくらかのトリプシン耐性を有していたか（D0M4-130-54およびDOM1h-131-511）を問わず）、dAb-Fc分子中に再形成されると、比較しうるPKプロファイルを有する。従って本PK研究は、これらのdAbが非常に低いタンパク質分解耐性を有すると、タンパク質分解感受性がdAbのin vivo安定性に最大の影響を与えることを示唆する。また、ある特定のレベルを超えると、トリプシンによる分解に対する耐性のさらなる増分（例えば、D0M4-130-206-対-DOM4-130-54）がin vivo排除をさらに低下するdAb-Fc分子の能力に有意に加わることはないことも示す。
3事例、すなわちD0M4-130-202、DOM1h-131-206およびDOM15-26-593において、トリプシンの存在のもとで選択すると、熱安定性（融点により定義した）の増加した新しい分子をもたらした。そのPK研究は、本研究のデータセットにおいて、融点が観察されたPKプロファイルを合理化するのに十分なパラメーターでないことを示し；実際、DOM15-10はDOM15-10-11より高いTmを有するものの、循環からDOM15-10-11より速やかにクリアされる。他の点では、DOM4-130系列の2つのdAbは著しく異なるTm（10℃の差）を有するものの、dAb-Fc分子中にフォーマットされると、ほとんど同一のin vivo安定性を示す。注意すべきは、融点はin vivo安定性を予測する重要なパラメーターとしてそれ自体除外されるものではない。本研究のデータセットでは、大きいTm差（54℃以上の）はdAbのin vivoでの結末に有意な影響を与えないことがちょっと起こっただけである。これは、54℃より低い融点において、dAbのin vivo安定性が熱安定性と、またはおそらく熱安定性およびプロテアーゼ耐性とすら相関がありうることを排除するものでない。
（実施例１３）
DOM10-53-474でのトリプシン選択
精製DOM10-53-474のトリプシン安定性：
DOM10-53-474はIL-13と高能力で結合するドメイン抗体である。トリプシンの存在のもとでこのdAbの安定性を評価するために、精製dAbをトリプシンで長時間消化し、それをゲル上で泳動させて可能なタンパク質分解を試験した。25μlの精製DOM10-53-474（1mg/ml）をlμlの配列決定グレードトリプシン（1mg/ml）とインキュベートして25：1のdAb：トリプシン分子量比を得て、これを30℃にてインキュベートした。dAbをトリプシンと1時間、4時間および24時間インキュベートし、4μlのRoche完全プロテアーゼインヒビターを加えてプロテアーゼ活性を中和し、次いで氷上でインキュベートした。時点0のサンプルを、トリプシンを加えずにプロテアーゼインヒビターをdAbに加えることにより作った。次いで、2μlのサンプルを、製造業者の指示書に従いLabchipを用いて電気泳動により分析した。
図22は、トリプシンと長い時間インキュベートしたDOM10-53-474のゲル試験結果を示す。比較のために、トリプシンに安定なdAbの1つ、DOM15-26-593も、以上説明したようにトリプシンで処理し、並べて泳動した。図に示したように、DOM15-26-593は、トリプシンとの24時間インキュベーション後ですら安定である。しかしDOM10-53-474は24時間後にある程度まで消化されたが、1時間および4時間の時点では安定である。これらのデータは、DOM10-53-474はトリプシンによる分解に対してある範囲の耐性を有するが、最もトリプシンに安定なdAbの1つ、DOM15-26-593ほど安定でないことを示唆する。
ファージ提示したDOM10-53-474のトリプシン安定性：
ファージ提示したDOM10-53-474のトリプシン安定性を評価するために、DOM10-53-474をコードする遺伝子をpDOM33のSal/Not部位中にクローニングし（図50）、標準技法によってファージを作製した。ファージをPEG沈降により精製し、PBSに再懸濁して滴定した。
ファージ提示したdAbをトリプシンと異なる時間インキュベートし、トリプシン耐性を評価した。トリプシンでのインキュベーション後に、安定性を指数関数的に増殖する大腸菌TG1細胞の感染後の力価分析により測定した。
100μlのファージを、100μg/mlトリプシン中で1時間、2時間、4時間および一晩、37℃にて、振とう型インキュベーターでインキュベートした。トリプシン活性をRoche完全プロテアーゼインヒビター（x2）でブロックし、次いでファージを2％ marvelを含むPBSで希釈し、1OnMビオチン化IL-13と1時間室温にてインキュベートした。1時間室温にてPBS中の2％ marvell溶液で予めブロックしたストレプトアビジンコートしたビーズ（Dynabeads M-280（Invitrogen））を加え、次いでその混合物を5分間室温にてインキュベートした。Dynabeadsとのインキュベーションステップは全て回転ホィール上で行った。ビーズを1mlのPBS中の0.1％ Tween-20溶液で8回洗浄して無結合のファージを洗い流した。結合したファージを、0.1MグリシンpH2.2の溶液の0.5mlで溶出し、100μlの1M Tris-HCL pH8.0で中和した。溶出したファージを用いて指数関数的に増殖するTG1細胞に感染させ（1時間、37℃にて）、テトラサイクリンプレート上にまいた。プレートを37℃にて一晩インキュベートし、コロニー計数を行った。トリプシンによる消化後のファージ出力力価を表17に総括した。トリプシンと長い時間インキュベートすると、ファージ力価は低下した。24時間インキュベーション後に、全てのファージが消化された。
表17：ファージ提示したDOM-10-53-474親について実施した、トリプシン選択の出力力価
Figure 2010528647
トリプシンに対してさらに耐性のあるdAbの選択：
トリプシンによる分解に対してさらに耐性のあるdAbを選択する目的で、Stratergene Mutazyme 11キット、ビオチン化プライマーおよび50μl反応用の5〜50pgのテンプレートを用いて、PCRにより、無作為突然変異をDOM10-53-474をコードする遺伝子に導入した。Sal1およびNot1での消化の後に、インサートをストレプトアビジンコートしたビーズで無消化の産物を除去して精製し、pDOM33の対応する部位中にライゲートした。大腸菌TB1細胞を、精製ライゲーション混合物を用いて形質転換し、DOM10-53-474のエラープローン・ライブラリーを得た。ライブラリーのサイズは1.9x109であり、アミノ酸突然変異率は1.3であった。
3ラウンドの選択をこのライブラリーで行い、改善されたプロテアーゼ耐性をもつdAbを選択した。第1のラウンドの選択は、トリプシン無処理の抗原によって実施し、ライブラリーをクリーンアップして抗原と高アフィニティで結合していないクローンを取り除いた。選択は1OnM IL-13で行った。ラウンド1からの出力は2 x 109であり、6 x 1010の入力ファージと比較して、ライブラリーの大部分が抗原と高アフィニティで結合したことを示す。
第2および第3ラウンドの選択を1nMのビオチン化IL-13で実施した。IL-13でのパニングの前に、ファージを1OOμg/mlのトリプシンの存在のもとで37℃にて振とう器中で（250rpm）インキュベートした。第2のラウンド選択については、トリプシンインキュベーションを1時間、室温にてまたは37℃にて行った。ラウンド2選択からの出力を表18に示す。
表18 第2ラウンド選択後の出力ファージ力価
Figure 2010528647
1時間37℃のトリプシン処理によるラウンド2選択からのファージ出力を第3ラウンド選択の入力として用いた。第3ラウンド選択については、ファージを1OOμg/mlトリプシンで、しかし、さらに長時間：すなわち、37℃にて2時間、37℃にて4時間、室温にて一晩、または37℃にて一晩にわたって処理した。
第3ラウンド選択の出力力価を表19に総括する。
表19：第3ラウンド選択後の出力ファージ力価
Figure 2010528647
ラウンド1、2および3からの各選択出力のいくつかのクローンを配列決定してその配列多様性を評価した。トリプシン無処理の選択の第1ランドの後、選択出力の50％は親DOM10-53-474配列を有した。選択の第2ランドの後、親のパーセントは75％へ増加した。選択の第3ランドの後、親のパーセントは80％へ増加した。
このデータは、DOM10-53-474は既にトリプシンによる分解に耐性があり、これらのトリプシン選択から多くの新しいクローンを選択できないことを示す。図22は、精製タンパク質をトリプシンで消化したときに、DOM10-53-474は一晩のトリプシン処理後でも完全に消化されないことを示した。しかし、選択出力中にDOM10-53-474よりもっとトリプシン耐性のある新しいクローンが存在するかどうかを確かめるために、一晩トリプシンで37℃で処理したファージ選択3の出力をpD0M5中にサブクローニングした。100クローンを次いで配列決定し、トリプシン耐性クローンを探した。分析した100クローンの中で、26クローンだけが新しい配列を有したが、これらのクローンはトリプシン切断部位（リシンまたはアルギニン）に突然変異を有せず、これらのクローンはトリプシンに対してDOM10-53-474を超える耐性を有しないことを示唆した。
（実施例１４）
トリプシンの存在のもとでのファージ選択により、リードDOM0101（抗TNFR1）dAb中に導入された貯蔵および生物物理学的改善：
リード分子DOM1h-131-511のプロテアーゼ耐性を改善するために、トリプシンの存在のもとでファージ選択を先に記載の通り行った。本方法は、親DOM1h-131-511分子と比較して改善されたトリプシン安定性をもつある範囲のクローンを生産した。トリプシンの作用に対して最も有意な改善を示した2つのクローン、DOM1h-131-202とDOM1h-131-206を選択してさらに特徴付けを行った。以下に概説したさらなる研究は、トリプシンの作用に改善された耐性をもつと共に、主に分子の剪断および熱ストレスに対する安定性に関する他の有利な効果が存在することを示す。これらの2つのパラメーターは、バイオ医薬品製品の貯蔵および有効期間安定性を増加するための中心的役割を果たす。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）におけるリードDOM0101 dAbの生産：
3種のリード分子の一次アミノ酸配列をコードする遺伝子を用いて、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において分泌性タンパク質を生産した。3種の合成遺伝子（DOM1h-131-511、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206）を発現ベクターpPIC-Zα中にクローニングし、次いで2種のPichia菌株、X33およびKM71H中に形質転換した。形質転換した細胞を増加する濃度のゼオシン（100、300、600および900μg/ml）上にプレーティングし、多重組込体をもつクローンを選択した。次いでいくつかのクローンを2Lフラスコ中でスクリーニングして高発現細胞株を同定した。次いで最良の発現クローンを用いて5Lスケールで発酵槽にて材料を生産した。
タンパク質精製および材料特徴付け：
特徴付けとさらなる安定性研究のための高品質材料を生産するために、下流の精製プロセスを工夫し、一次捕獲ステップとして混合モード電荷誘導樹脂（Capto MMC）を、次いでアニオン交換（Q Sepharose）を利用した。大きな最適化をすることなく、この方法によりほぼ95％の純度で発現されるdAbのほぼ70％の回収が可能になった。材料を、同一性についてはエレクトロスプレー質量分析、アミノ末端配列決定および等電点電気泳動を用いて、純度についてはSDS-PAGEおよびSEC（サイズ排除クロマトグラフィ）を用いて特徴付けた。
タンパク質同一性：
各タンパク質の最初の5残基のアミノ末端配列分析は（EVQLL...）と予想した。質量分析を、50：50 H2O：（0.1％氷酢酸を含有する）アセトニトリルにバッファー交換しておいたタンパク質のサンプルについて、C4 Zip-チップ（Millipore）を用いて実施した。3種のタンパク質のそれぞれについて測定した質量は、内部ジスルフィド結合の形成による-2の質量差を容認すると、一次アミノ酸配列（平均質量を用いて計算した）に基づく理論質量の0.5Da内にあった。IEFを用いて、各タンパク質に対して異なるそのpIに基づいてタンパク質を同定した。
タンパク質純度：
3種のタンパク質を1μgおよび10μg量で重複して非還元SDS-PAGEゲルに供給した。全ての場合に単一バンドを観察した。
サイズ排除クロマトグラフィも実施して純度のレベルを実証した。サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）については、lOOμgの各タンパク質を0.5ml/分で流しながらTOSOH G2000 SWXLカラムに供給した。移動相はPBS/10％エタノールであった。単量体のパーセントを曲線下面積に基づいて測定した（図23参照）。
DOM1h-131-511、-202および-206の安定性の比較
プロテアーゼ安定性の評価：
DOM1h-131-511、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206のプロテアーゼ安定性を、過剰プロテアーゼ中で所定時間のプレインキュベーション後の残留結合活性をBIAcore(登録商標)により分析して評価した。およそ1400RUのビオチン化TNFR1をストレプトアビジン（SA）チップにコートした。25OnMのDOM1h-131-511、DOM1 h-131-202およびDOM1h- 131-206を、PBSだけと、またはlOOμg/mlのトリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムと共に、1、3、および24時間、30℃にてインキュベートした。プロテアーゼインヒビターのカクテルを加えることにより、反応を停止した。dAb/プロテアーゼ混合物を、参照セル差引を用いて、次いでTNFR1コートしたチップ上を通過させた。チップ表面を、各注入サイクルの間に、10μlの0.1MグリシンpH2.2を用いて再生した。プロテアーゼで（10秒で）予めインキュベートした、ヒトTNFR1と結合したDOM1h-131-511、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の画分を、プロテアーゼ無処理のdAb結合と比較して測定した。BIAcore(登録商標)試験は25℃にて実施した。以下のデータは3つの独立実験から得たものである。バーグラフは結果の平均値を示し、誤差バーは結果の標準誤差を示す（図24）。
DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206は、DOM1h-131-511と比較して、トリプシン、エラスターゼまたはロイコザイムによるタンパク質分解に対してより高い耐性を有することを示すことがわかった。DOM1h-131-511と比較して、DOM1h-131-202とDOM1h-131-206の間の差は、トリプシンでは1時間後、そしてエラスターゼまたはロイコザイムでは3時間後に最も顕著である。ほとんどの試験した条件のもとで、DOM1h-131-206がDOM1h- 131-202と比較して若干安定性が高い傾向が存在する。
DSCを用いて決定したdAbの熱安定性：
リード分子が最高の安定性を有するpHを決定するために、示差走査熱量計（DSC）を用いてBritton-Robinsonバッファー中の各dAbの融点（Tm）を測定した。Britton-Robinsonは3成分バッファー系（それぞれ40mlの酢酸、リン酸およびホウ酸）から構成されるので、前記溶液中で3〜10のpH範囲を得ることができる。理論的pIはタンパク質一次アミノ酸配列から決定した。DSCから、dAbが最高の内因熱安定性を有するpHは、DOM1h-131-202についてはpH 7、DOM1h-131-206についてはpH 7〜7.5そしてDOM1h-131-511についてはpH 7.5であることを見出した。その後のストレスおよび安定性試験については、全て、次のpHを各dAbに対して用いた；Britton-Robinsonバッファー中でDOM1h-131-202、GSK1995057A DOM1h-131-206に対してpH 7.0、およびDOM1h-131-511（511）に対してpH 7.5。結果を表20に総括する。
表 20：DSCによりBritton-Robinson バッファー中で1mg/mlにて測定したDOM1h-131-202、DOM1h-131-206およびDOM1h-131-511のpHおよびTmの総括。温度は180℃/時間の傾斜であった。
Figure 2010528647
2週間の熱安定性試験：
通常、高温で長期間を耐えるタンパク質の能力はよい安定性の指標である。これらの条件下で、タンパク質はいくつかの凝集などの物理的プロセスまたは化学的改変を受けることがある。dAb（1mg/ml）を37および50℃にて14日間、Britton-Robinsonバッファー中でインキュベートした。SECを用いて、14日間にわたり溶液中に残る単量体の量を決定した（図25）。
図25から、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方は熱ストレスに対してDOM1h-131-511より有意に安定であるのを見ることができる。タンパク質を37および50℃などの高温に曝すことは、薬物の長期有効期限の指標を得るために日常行われる。これらの室温より高い温度を利用して、室温での長期貯蔵に関連する脱アミド化、酸化または凝集などの通常のプロセスを加速する。溶液中の凝集形成のレベルはまた、SECを用いてモニターすることもできる（図26A〜I）。37℃で14日後、溶液からのDOM1h-131-511のロスは、SECにより測定すると高次凝集物の沈降および形成に起因しうる（図26B）。タンパク質の有意に低いロスは、DOM1h-131-202およびDOM1h-131-206の両方でも、37℃にて14日後に見られ、特にDOM1h-131-206の場合、凝集形成の増加が非常に少ないかまたは実質的に無い（図26H）。50℃では、分子間の差はさらに一層強調され、14日後にDOM1h-131-206はDOM1h-131-202より高温で優れた安定性を示し、高分子量凝集物の形成の有意な減少を示す（図 26）。t=0と比較して、DOM1h-131-206は14日後に凝縮物形成のほんの少しの増加を示した（図26I）が、DOM1h-131-511はほとんどが溶液から沈降析出した（図26C）。
これは、トリプシン選択によりdAb中に導入された変化、例えば熱安定性の改善が37℃および50℃でのタンパク質貯蔵安定性を有意に改善したことを示す。DOM1h-131-202およびさらに有意にDOM1h-131-206の両方は明らかに、溶液安定性および高温での凝集物形成傾向を改善し、これは+4℃および室温などのもっと関連ある温度における長期間貯蔵安定性の改善を直接意味しうる。
熱ストレス実験の24時間、48時間、7日および14日の時点から得たサンプルを次いでIEFにより分析して、タンパク質全体の電荷に影響を与えうるなんらかの生物物理学的変化をタンパク質が受けたかを確認した（図27）。
DOM1h-131-202とDOM1h-131-206の両方はここでも、37℃でDOM1h-131-511と比較して有意な変化を示さない。DOM1h-131-511については、かすかな第2バンドが24時間後に37℃にて現れる。この特別なバンドはタンパク質の二量体化に因るものであると思われ、こうして電荷をマスクし、2集団の分子を生じる。50℃にて、分子間の差はさらに顕著であり、DOM1h-131-206は明らかに高温で有意な変化を示さないが、DOM1h-131-202は24時間後に若干の改変の徴候を示すつつある。大部分のDOM1h-131-511は、Britton-Robinson.中で48時間後に沈降による失われる。
50℃でのT=O、7および14日時点にTNFR-1 RBAにより分析して、高温への曝露後のタンパク質の機能性を確認した（図28）。このアッセイは現在、ストレスによる分子の僅かな変化を検出する上でSECまたはIEFのような感受性はないが、dAbはなお抗原と結合できることを示すために用いることはできる。
DOM1h-131-511に対する曲線の左へのシフトは、dAbの大部分が沈降により失われた事実を反映する。溶液中に残った材料はなお抗原と結合することができる。図25に示すように、DOM1h-131-202とDOM1h-131-206の両方の大部分は14日後であっても溶液中に維持され得る。RBAは全ての可溶性タンパク質がなお機能的であり、TNFR1と結合できることを示す。
高タンパク質濃度における貯蔵安定性試験：
+4℃で非常に高いタンパク質濃度における貯蔵安定性を研究する実験を行い、これらの条件下で各分子の挙動を調べた。全てのリードdAbを、遠心式Vivaspin濃縮機（5K カットオフ）により、Britton-Robinsonバッファー中でそれらの最も安定なpHにて、ほぼ100mg/mlまで濃縮した。次いでほぼ100mg/mlのサンプルを+4℃にて7日間放置し、次いで、SECにより分析して、高濃度で貯蔵中に何らかの他の物理的な変化がサンプルに起こったかを調べた（図29）。サンプルは1 x PBS 10％エタノール（v/v）でほぼ1mg/mlに希釈した後、SECカラムに通した。
SECトレースから、DOM1h-131-202もまたDOM1h-131-206も、7日後の凝集体の形成に有意な増加を示さないが、DOM1h-131-511については単量体濃度のほぼ2％低下が見られる。
リードdAbの噴霧器送達：
初期段階の毒物学および臨床研究のために、dAbを液剤として製剤し、噴霧デバイスを介して送達しうる。デバイス（例えば、超音波、ジェットまたは振動メッシュ）に応じて、dAbは噴霧されて所定の粒子径のエーロゾルを形成するので、ある程度の剪断および熱ストレスを受けうる。DOM1h-131-202とDOM1h-131-206の両方は、DOM1h-131-511と比較して、より高いTmを有しかつ熱ストレスに対してかなり改善された安定性を示すので、全てのdAbを、2つの噴霧器デバイスで試験してそれらが噴霧中に誘導される剪断／熱ストレスにどのように応答したかを調べた。噴霧したエーロゾルからのタンパク質とデバイス中に残存するdAb（すなわち、カップ中の）の両方を、次いでSECにより分析して、プロセス中に作製された凝集物の量を決定した。
全ての分子を、Britton-Robinsonバッファー中で最も安定なpHにて試験した。dAbを、E-flow Rapid（振動篩）とPari LC+（ジェット噴霧器）の両方で、処理時間3.5分間、タンパク質濃度5mg/mlにて試験し、Malvern Spraytekを用いて粒子径分布を決定した。結果を図30に示す。肺深くへの優れた送達および分布のために、理想的な粒子径は＜5μmである。全てのdAbは、Britton-Robinsonバッファー中で5μm未満の比較しうるレベルの粒子径を与える。デバイスのカップ中のdAbの濃度は、噴霧前後のA280測定値により決定した（データは示してない）。タンパク質濃度は有意に変化しないことが判り、タンパク質もまたビヒクルも送達中に優先的に噴霧されないことを示した。
Britton-Robinsonバッファー中の噴霧されたサンプルをSECで試験して、タンパク質が何らかの物理的変化を受けたかを確認した。図31は、SECにより測定した、カップまたはエーロゾル中の相対的パーセント変化を示す。DOM1h-131-202とDOM1h-131-206の両方が、DOM1h-131-511と比較して比較的小さい単量体濃度変化を受けたのを見ることができる。これは、改善されたTmをもつDOM1h-131-202とDOM1h-131-206の両方は噴霧中に凝集する傾向が低いことを実証する。
図32は、噴霧後のBritton-Robinsonバッファー中のDOM1h-131-206とDOM1h-131-511に対する実際のSECトレースを示し、単量体中の相対的ロス（図31）が二量体形成に因ることを実証する。再びこれも、DOM1h-131-202とDOM1h-131-206が示す高い熱安定性は、非最適化製剤バッファー中ですら有意な凝集を防止できるという理論をさらに支持する確証を提供する。
毒性学および安全性評価研究のためには、患者に投与する治療用量より有意に高いレベルでdAbを動物中に送達することが必要である。これは、有意に高いタンパク質濃度を用いることおよび／またはdAbを長期間にわたり送達することによってのみ達成することができる。DOM1h-131-511は3.5分間にわたり5mg/mlで噴霧時に凝集物を形成することが既に示されたので、DOM1h-131-206をPBS中の40mg/mlで試験し、Pari LC+を用いて1時間まで噴霧した。カップとエーロゾルからのサンプルを試験全体にわたる時点で採取し、dAbが長い噴霧によって剪断または熱ストレスによりSECおよびタンパク質濃度（A280nm測定値）により測定して凝集を起こすかを調べた。表21は、A280により測定したカップおよびエーロゾルの両方中のdAbのタンパク質濃度を示す。
表21：Pari LC+を用いてほぼ40mg/mlでdAbの噴霧中に、カップおよびエーロゾルの両方に対するA280吸収読取値により決定したDOM1h-131-206のタンパク質濃度測定値。希釈誤差と計器誤差を容認すると、サンプル濃度は1時間にわたるdAbの噴霧後に変化しない。
Figure 2010528647
表21から、タンパク質の濃度は試験中に有意に変化しなかったことを見ることができ、凝集によるタンパク質の有意なロスは無かったことを実証する。図33は、1時間の噴霧期間にわたり、DOM1h-131-206は、SECにより測定した二量体などの何らかの高次凝集物を形成しないことを示す。これは明らかに、トリプシン選択により分子中に導入された生物物理学的特性の改善は剪断および熱ストレスに対するdAb耐性を有意に増加すること、およびこのことは貯蔵有効期間およびタンパク質を高次凝集物を形成しないように噴霧する能力の改善に直接関係付けることができるのを実証する。
リードdAbの溶液状態：
全ての3種のリードdAbの主な分解経路は、最初に二量体化、続いてさらなる凝集および最終的に沈降に導く自己会合であると思われるので、3種のリード分子を、分析用超遠心分離（AUC）により研究して自己会合の程度を測定した。タンパク質を、沈降平衡法および沈降速度法の2つの方法により研究した。
沈降平衡法については、3種のサンプルを、0.5mg/ml〜5mg/mlの範囲の3つの異なる濃度で3つの異なる回転子速度を用いる遠心分離効果で試験した。この方法により、DOM1h-131-511は安定な二量体（26.1〜34.4kDa）であり、DOM1h-131-202はKd=1.3μMと測定された濃度において比較的安定な二量体状態をもつ単量体／二量体平衡物（22.7〜27.8kDa）であり、そしてDOM1h-131-206は、単量体と二量体会合に対して360μMのKdをもつ主に単量体（15.4〜17.9kDa）であることが確認された。
沈降速度法によると全てのサンプルは希釈時にある程度の解離を示した。図34に示した得られた結果から、DOM1h-131-511に対して観察された沈降係数は、高次凝集物を示し、希釈時のそのピークシフトはこれらの凝集物の解離を示す。タンパク質凝集と解離はお互いに相殺し、沈降平衡により観察された安定な二量体である印象を与えうる。DOM1h-131-202に対して観察された沈降係数は迅速な動的平衡を示し、それ故に単量体と二量体ピークはお互いに分離できず、サンプルの質量にとって適当であるより高い沈降係数をもつ単一ピークを与える。この結果は、沈降平衡法により得た結果と一致し、解離定数は1μMであると測定された。DOM1h-131-206は、他の2つのサンプルよりももっと単量体を含み、他の2つのサンプルに対する2.5sと比較して1.9sの沈降係数を有することを確認した。このデータは沈降平衡データとよく一致する。測定した濃度（360μMのKdのほぼ10倍以下）において、サンプルは主に単量体である。
（実施例１５）
DOM15-26-593 dAbの効力増強：
VEGFR2受容体結合アッセイにおけるDOM15-26-593dAbの親DOM15-26を越える効力の増強の一例を図40に示す。本アッセイにおいて、VEGFのVEGFR2との結合を阻止する潜在的インヒビターの能力は、プレートに基づくアッセイで測定する。本アッセイにおいては、VEGFR2-Fcキメラを96-ウエルELISAプレート上にコートし、これに、試薬dAbの希釈シリーズとインキュベートしておいた、予め定めた量のVEGFを加えた。無結合のタンパク質を洗い流した後、受容体と結合したVEGFを、抗VEGF抗体を用いて検出し、そのレベルを比色定量により決定した。用量-応答効果は、試験物質濃度の関数としてVEGF結合のパーセント阻害をプロットした。有効なインヒビターはそれ故に、低濃度でリガンド結合の実質的ブロックを示すインヒビターである。
FC融合体効力と半減期：
腫瘍の治療における、VEGFブロックの治療潜在能力は30年間にわたって認められている。癌の慢性的性質によって、バイオ医薬品はその効果に介在する長い血清半減期が必要であるとされており、これは腎濾過による循環からの遊離dAbの急速なクリアランスと矛盾する。癌治療のための抗血管形成剤としてのVEGFdAbの効用を評価するために、リードドメイン抗体をハイブリッドリンカーを介して野生型ヒトIgG1 Fcとの融合体としてフォーマットし、FcRn介在性抗体サルベージ経路の利用による長い血清半減期をもつ二価分子を形成させた。
このFc融合フォーマットにおいては、リードのトリプシン選択されたdAb、DOM15-26-593の効力を、先に記載のアッセイを用いて最初の親dAb（DOM15-26）およびトリプシン易分解性dAb（DOM15-26-501）と比較した。結果を表22に示す。
表22 Fc融合フォーマット中のDOM15-26リードの効力（RBA）と半減期特性
Figure 2010528647
これらの結果から、二量体Fc融合フォーマットにおいて、アフィニティと効力は、結合特性の効果によって、遊離dAbと比較して増強されることがわかる。このFcフォーマットにおいて、トリプシン選択のお蔭でDOM15-26-593は効力が増強され、維持されかつさらに高くすらなったことは明らかである。さらに、熱およびプロテアーゼ安定性の改善は、分子のin vivo薬物動態学的挙動における著しい変化を意味する。DOM15-26-501と比較したDOM15-26-593の排除半減期の改善（図41を参照）は おそらくdAbの安定性の増加の直接の結果であって、これがエンドソームのコンパートメント内で起こるdAbの分解プロセスに対する耐性を高めると思われる。それ故に、プロテアーゼ安定性の増加したdAbは、タンパク質分解が生物学的分子の代謝回転に関わる活性プロセスである血清、粘膜表面および様々な組織コンパートメントなどの他の生物学的コンパートメント中で、より長く持続することができる。
薬物動態学的クリアランスプロファイル：
DOM15-26-593およびDOM15-26-501の薬物動態学的クリアランスのプロファイルを、DOM15-26-593およびDOM15-26-501の3ラットへの5mg/kgの濃度のi.v.投与後に測定した。血清中のDOM15-26-593およびDOM15-26-501のレベルを次いで、直接VEGF結合標準ELISAアッセイおよび抗ヒトFc抗体を用いて測定し、そして、血清サンプル中の無傷の薬物だけを検出した。全ての薬物動態学的プロファイルを下表23に示す。
表23 ラットのDOM15-26とD0M15-26-593のFc融合体の薬物動態学的パラメーターの総括
Figure 2010528647
これらの結果から、DOM15-26-593は有意な改善された薬物動態学的プロファイルを有し、例えば半減期の延長およびクリアランス速度の低下があることを見ることができる。
DOM15-26-593の有意な効力および薬物動態学的特性の改善は、ある範囲の他の生物物理学的属性の分析にも表れる。
溶液状態特性：SEC-MALLs & AUCによる分析：
DOM15-26-593の溶液状態を、サイズ排除クロマトグラフィ-多角度レーザー光散乱（SEC-MALLS）と分析用超遠心分離（AUC）の両方により試験した。SEC-MALLSは、Superdex 200 GFカラム（アガロースマトリックス）に、Dulbecco's PBS（Sigma）中、0.3ml.min-1の流速で流し、屈折率（Wyatt Optilab rEXでのRI検出）およびMALLS（Wyatt TREOS MALLS検出器での検出）を検出した。データはASTRAソフトウエア2を用いて分析し、DOM 15-26-593の別々のバッチを分析して両方共に、2.5mg/ml以下の濃度の溶液中では計算分子量78〜81KDa（無傷の分子量のほぼ76kDaと一致する）の単量体として挙動することを示した。
AUC分析については、DOM15-26-593をPBS中に0.2、0.5および1.0mg/mlの濃度で希釈し、沈降速度試験をBeckman XL-A分析用超遠心分離機で40000rpmにて行った。データは5分間隔に20℃の設定温度で取得した。データをSEDFITソフトウエアを用いて分析し、沈降係数分布をc(S)またはls-g(s*)ルーチンを用いて作製した。
この分析結果は、DOM15-26-593が2.5mg/ml以下の濃度の溶液中では計算分子量78〜81KDa（計算した無傷の分子量のほぼ76kDaと一致する）の単量体として挙動することを示した（図42aおよび42b）。
熱融解特性：DSCによる分析
DOM15-26-593（およびFc融合体）について次の実験を行った：示差走査熱量計を用いてdAbとFc融合体の熱安定性を分析した。簡単に説明すると、タンパク質をマイクロ熱量計中にバッファー対照を用いて2mg.ml-1の濃度で置いた。サンプルを20℃から100℃まで180℃.hr-1の速度で適当なバッファー中で加熱し、熱変性データを「Origin」ソフトウエアを使い、分析するタンパク質の性質に適するフィットモデルを用いて分析した。
トリプシン選択したdAbの熱安定性増加（65℃、図43中段パネル）はFc融合体（64.5℃、図43上段パネル）で維持されている。DOM15-26-501dAb（52℃、図43下段パネル）のTm曲線を比較のために示す。
凍結-解凍、温度ストレスおよび血清成分に対する安定性
DOM15-26-593（およびFc融合体）について次の実験を行った：
DOM15-26-593 dAbの安定性特性は、DOM15-26-593 dAbを物理的および生物学的ストレスにかけたときに、そのVEGFと結合する能力に最小限の影響しか与えないことを意味する（図44〜47（aおよびb）を参照）。VEGF dAb-Fc融合体のVEGFとの結合は、全ての場合に、ELISAにより確認された。簡単に説明すると、96ウエルELISAプレートを、炭酸塩バッファー中の250mg/ml VEGF165を用いて一晩コートした。プレートを次いでPBS中の1％BSAを用いてブロックした後、同じバッファーに希釈した試験物質を加えた。無結合の材料を60分間インキュベーション後に洗い流し、結合した材料をHRP-コンジュゲートした抗-ヒトIgGの1：10,000で希釈し次いで「SureBlue」発色基質を用いて検出し、そして1M HClによって停止した。
例えば、その分子を、繰り返して、液体窒素（-196℃）から体温（37℃）へ、ELISAにより測定した結合活性の喪失なしに、10サイクル凍結-解凍することができる（図 44）。この処理はまた、通常のサイズ排除クロマトグラフィにより試験して、分子凝集状態に明らかな改変をもたらさない（図45）。さらなる試験は、その分子を-8O℃〜55℃のある範囲の色々な温度に置くと、168時間後に最高のインキュベーション温度においてだけ、抗原結合活性のほんのわずかな低下が起こりうることを実証した（図46）。さらに、ヒトまたはカニクイザルサル由来の血清と共に37℃で14日間インキュベーションしても、ELISAにより測定したVEGF結合に対する抗原結合能力のロスを生じなかった（図47aおよび47b）。
VEGFR2受容体結合アッセイおよびHUVEC細胞アッセイにおける効力：
上記の受容体結合アッセイを用いてDOM15-26-593 dAb-Fc融合体の効力を評価した（図48）。DOM15-26-593 dAbはこのアッセイで効力の増加を有し、VEGFのVEGFR2との結合をin vitroでブロックするdAbの能力を確立することが見出された。DMS1529の効力をまた、HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞）アッセイで実証し、ここでは、VEGF刺激によるHUVE細胞の増殖をブロックするVEGFアンタゴニストの能力を測定した。簡単に説明すると、およそ4e3のHUVE細胞を96ウエルプレートのウエル中に分散し、これにVEGFと試験物質の希釈シリーズの混合物をVEGFの最終濃度が5ng/ml（またはさもなくば、用量-応答滴定により決めた濃度）になるように加える。細胞を37℃にてさらに4日間インキュベートし、その時点で細胞数を「CellTiter」などの細胞定量試薬を用いて測定する。これにより、実験の4日間にわたる、標準と比較した細胞増殖の比色測定が可能になる。予め定めたVEGFの量および様々な試験材料の量で固定したインキュベーション期間の終期に、細胞数を測定した。アンタゴニストの効力が大きいほど、観察される細胞増殖が低下する（図49）。

Claims (84)

  1. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と少なくとも97％同一であるアミノ酸配列を含む抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  2. 6位（番号付けはKabatによる）にバリンを含む、請求項１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  3. 99位（番号付けはKabatによる）にロイシンを含む、請求項１または２に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  4. 30位（番号付けはKabatによる）にリシンを含む、請求項１〜３に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  5. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  6. DOM15-26-593（図20cに示した）の核酸配列から選択される配列と少なくとも80％同一であるヌクレオチド配列によりコードされた、抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  7. DOM15-26-593（図20cに示した）の核酸配列と同一である配列によりコードされた、抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、抗VEGFアンタゴニスト。
  9. 第1および第2の免疫グロブリン単一可変ドメインを含んで、それぞれの可変ドメインが請求項1〜7のいずれか1項に記載されている、請求項8のアンタゴニスト。
  10. 前記単一可変ドメインの単量体または前記単一可変ドメインのホモ二量体を含む、請求項8または9に記載のアンタゴニスト。
  11. そのまたはそれぞれの単一可変ドメインのアミノ酸配列が、DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一である、請求項8、9または10に記載のアンタゴニスト。
  12. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  13. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  14. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  15. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  16. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  17. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  18. DOM15-26-593（図5に示した）のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むか、またはDOM15-26-593のアミノ酸配列から14以下のアミノ酸位置においてアミノ酸配列が異なりかつDOM15-26-593のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  19. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  20. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  21. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  22. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  23. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  24. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  25. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1配列と少なくとも50％同一であるCDR1配列を有しかつDOM15-26-593のCDR2配列と少なくとも50％同一であるCDR2配列を有しかつDOM15-26-593のCDR3配列と少なくとも50％同一であるCDR3配列を有する抗VEGFアンタゴニスト。
  26. DOM15-26-593（図5に示した）のCDR1、CDR2および／またはCDR3の配列を含む免疫グロブリン単一可変ドメインを含むものである、抗VEGFアンタゴニスト。
  27. DOM15-26-593と、VEGFとの結合を競合する抗VEGFアンタゴニスト。
  28. VEGF結合部位を含むプロテアーゼ耐性免疫グロブリン単一可変ドメインであって、(i)37℃にて、少なくとも10μg/mlプロテアーゼの濃度（c）で少なくとも1時間の時間（t）；または(ii)30℃にて、少なくとも40μg/mlプロテアーゼの濃度（c'）で少なくとも1時間の時間（t）、インキュベートした時に可変ドメインがプロテアーゼに耐性である前記免疫グロブリン単一可変ドメイン。
  29. 濃度（cまたはc'）が少なくとも100または1000μg/mlのプロテアーゼである、請求項28に記載の可変ドメイン。
  30. 時間（t）が1、3または24時間または一晩である、請求項28または29に記載の可変ドメイン。
  31. 可変ドメインが（i）および濃度（c）が10または100μg/mlプロテアーゼおよび時間（t）が1時間である条件のもとで耐性である、請求項28に記載の可変ドメイン。
  32. 可変ドメインが（ii）および濃度（c'）が40μg/mlプロテアーゼおよび時間（t）が3時間である条件のもとで耐性である、請求項28に記載の可変ドメイン。
  33. プロテアーゼがトリプシン、エラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される、請求項28〜32のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  34. プロテアーゼがトリプシンである、請求項28〜33のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  35. 可変ドメインがトリプシンならびにエラスターゼ、ロイコザイムおよびパンクレアチンから選択される少なくとも1つの他のプロテアーゼに耐性である、請求項28〜34のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  36. 可変ドメインが条件(i)または(ii)のもとでのインキュベーション後にVEGFと特異的に結合する、請求項28〜35のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  37. 可変ドメインが条件(i)または(ii)のもとでのインキュベーション後にELISAで少なくとも0.404のOD450読取値を有する、請求項36に記載の可変ドメイン。
  38. 可変ドメインが条件(i)または(ii)のもとでのインキュベーション後にプロテインAまたはプロテインLと特異的に結合する、請求項28〜37のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  39. 可変ドメインが条件(i)または(ii)のもとでのインキュベーション後にゲル電気泳動で実質的に単一バンドを提示する、請求項28〜38のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  40. 請求項1〜7、12〜18、および28〜39のいずれか1項に記載の可変ドメインを含むVEGFアンタゴニスト。
  41. 経口送達用の請求項40に記載のVEGFアンタゴニスト。
  42. 患者の胃腸管への送達用の請求項40または41に記載のVEGFアンタゴニスト。
  43. 経口送達用医薬品の製造における請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの使用
  44. 患者の胃腸管への送達用の医薬品の製造における請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの使用。
  45. 可変ドメインがトリプシン、エラスターゼおよび／またはパンクレアチンに対して耐性である、請求項40、41または42に記載のアンタゴニストまたは請求項43または44に記載の使用。
  46. 肺送達用の請求項40に記載のVEGFアンタゴニスト。
  47. 患者の眼への送達用の請求項40に記載のVEGFアンタゴニスト。
  48. 肺送達用の医薬品の製造における請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの使用。
  49. 患者の眼への送達用の医薬品の製造における請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの使用。
  50. 可変ドメインがトリプシンに対して耐性である、請求項46または47に記載のアンタゴニストまたは請求項48または49に記載の使用。
  51. 請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの製薬上有効な量を患者に投与することを含む、患者の胃腸管または患者の肺または肺組織または眼への医薬品の経口送達または送達の方法。
  52. 癌、炎症、自己免疫疾患、またはAMDまたはVEGFが介在する症状または疾患、COPDまたは肺炎を治療および／または予防するための請求項40に記載のVEGFアンタゴニスト。
  53. 癌、炎症、自己免疫疾患、またはAMDまたはVEGFが介在する症状または疾患、COPDまたは肺炎を治療および／または予防するための医薬品の製造における請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの使用。
  54. 前記症状が肺癌、結腸直腸癌、頭頚癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌および卵巣癌からなる群より選択される、請求項52に記載のアンタゴニストまたは請求項53に記載の使用。
  55. 前記症状がAMDである、請求項52に記載のアンタゴニストまたは請求項53に記載の使用。
  56. 前記炎症疾患が炎症性腸疾患でありかつクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項52に記載のアンタゴニストまたは請求項53に記載の使用。
  57. 前記慢性閉塞性肺疾患が慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎および気腫からなる群より選択される、請求項52に記載のアンタゴニストまたは請求項53に記載の使用。
  58. 前記肺炎が細菌性肺炎である、請求項52に記載のアンタゴニストまたは請求項53に記載の使用。
  59. 前記細菌性肺炎がブドウ球菌性肺炎である、請求項52に記載のアンタゴニストまたは請求項53に記載の使用。
  60. 癌を治療および／または予防するための請求項40に記載のVEGFアンタゴニスト。
  61. 癌を治療および／または予防するための医薬品の製造における請求項40に記載のVEGFアンタゴニストの使用。
  62. 前記癌が肺癌、結腸直腸癌、頭頚癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌および卵巣癌からなる群より選択される固体癌である、請求項60に記載のアンタゴニストまたは請求項61に記載の使用。
  63. 請求項40、46、47または50に記載のVEGFアンタゴニストを含有する肺送達デバイス。
  64. デバイスが吸入器または鼻腔内投与デバイスである、請求項63に記載のデバイス。
  65. 請求項40または41に記載のVEGFアンタゴニストを含む経口製剤。
  66. 製剤が錠剤、丸薬、カプセル、液体またはシロップである、請求項65に記載の製剤。
  67. 前記アンタゴニストが請求項1〜7、12〜18および28〜39のいずれか1項に記載の可変ドメインを含む、請求項8〜11および40〜66のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイスまたは製剤。
  68. 前記アンタゴニストが少なくとも50℃のTmを有する可変ドメインを含む、請求項8〜11および40〜66のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイスまたは製剤。
  69. 前記アンタゴニストが少なくとも50℃のTmを有する可変ドメインを含む、請求項1〜7、12〜18および28〜39のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  70. 前記アンタゴニストが標準HUVEC細胞アッセイにおいて500nM〜50pMのND50でヒトVEGFを中和化する可変ドメインを含む、請求項8〜11および40〜66のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、使用、方法、デバイスまたは製剤。
  71. 標準HUVEC細胞アッセイにおいて500nM〜50pMのND50でヒトVEGFを中和化する、請求項1〜7、12〜18および28〜39のいずれか1項に記載の可変ドメイン。
  72. 請求項1〜7、12〜18および28〜39、69および71のいずれか1項に記載の可変ドメインを含む二重特異的リガンド。
  73. 請求項1〜7、12〜18および28〜39、69および71のいずれか1項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドをコードする単離されたまたは組換え体核酸。
  74. 請求項73に記載の核酸を含むベクター。
  75. 請求項73に記載の核酸または請求項74に記載のベクターを含む宿主細胞。
  76. 免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを作製する方法であって、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを作製する前記核酸またはベクターを発現するために好適な条件下に、請求項75に記載の宿主細胞を維持するステップを含んでなる前記方法。
  77. ポリペプチドを単離するステップおよび、必要に応じて、変異体、例えば、単離されたポリペプチドより改善されたアフィニティおよび／またはND50を有する突然変異体を作製するステップをさらに含んでなる、請求項76に記載の方法。
  78. 請求項1〜7、12〜18および28〜39、69および71のいずれか1項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項8〜11、19〜27、40〜42、45〜47、50、52、54〜60、62、67、68および70のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、ならびに製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
  79. DOM15-26-593のアミノ酸配列（図5に示した）と少なくとも97％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  80. DOM15-26-593のヌクレオチド配列（図20Cに示した）と少なくとも80％同一である配列によりコードされたポリペプチド。
  81. 請求項79または80に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
  82. 請求項79または80に記載のポリペプチドまたは請求項81に記載の融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換え体核酸。
  83. 抗体定常ドメインを含む、請求項1〜7、12〜18および28〜39、69および71のいずれか1項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは請求項8〜11、19〜27、40〜42、45〜47、50、52、54〜60、62、67、68および70のいずれか1項に記載のアンタゴニストまたは請求項79もしくは80に記載のポリペプチド。
  84. 必要に応じて、FcのN末端が可変ドメインのC末端と連結している（必要に応じて、直接連結している）抗体Fcドメインを含む、請求項83に記載の可変ドメイン、アンタゴニストまたはポリペプチド。
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