JPH06165691A - プロテアーゼ阻害剤の生産方法 - Google Patents
プロテアーゼ阻害剤の生産方法Info
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Abstract
トヒルジンの生産についての新規の方法を提供すること
を目的とする。 【構成】 本法は、酵母のCUP1プロモーターを含んで成
る発現カセットを利用する。本発明は、形質転換酵母
株、新規の発現ベクター及びそれらの生産方法に関す
る。
Description
伝子操作された酵母細胞の援助を伴ってのトロンビン阻
害剤、より具体的にはデスルファトヒルジンの生産方
法、この遺伝子操作された酵母細胞、このデスルファト
ヒルジンのための遺伝子を担持するハイブリッドベクタ
ー、並びに、この酵母細胞及びこのハイブリッドベクタ
ーの調製方法に関する。ヒルジンは、ヒル内( 例えば、
薬用のヒルであるヒルド・メジシナリス(Hirudo medici
nalis)内) で、天然に生じた抗血液凝固剤である。この
ヒルジンは、一般的に、そのN-末端での疎水性アミノ酸
の蓄積及びC-末端での極性アミノ酸の蓄積、3 つのジス
ルフィド結合、及び抗血液凝固活性をもつ上記作用のポ
リペプチドである。殆どのヒルジンの独特の特徴は、そ
の分子のC-末端部分にチロシン硫酸塩の残基(Tyr63) が
存在することである。よく知られたヒルジン変異体HV1
、HV2 及びHV3 は別として、さらなるヒルジンが天然
に存在することが報告されている。例えば、同一阻害剤
のファミリーとしてのヒルジンの概念を支持する、M.Sc
harf et al.FEBS Lett.255,105-110(1989)を参照のこ
と。
1 は、最も重要な、そして最も具体的に知られているト
ロンビン阻害剤であって、血液凝固における最終段階(
前駆体フィブリノーゲンの血塊化可能なフィブリンへの
変換) を触媒するセリンプロテアーゼである。この血液
凝固のカスケードに関する他の酵素は、ヒルジンによっ
ては阻害されない。従来の抗血液凝固の治療における好
まれた抗血液凝固剤であるヘパリンに比較して、このヒ
ルジンは、それらの阻害作用を、直接的にトロンビン上
で発揮し、そして前者と異なり、アンチトロンビンIII
を通して作用しない。精製ヒルジンの薬理学的に検出さ
れ得る唯一の効果は、血液凝固の阻害及び血栓症の予防
である。副作用、例えば、心拍数、呼吸、血圧、栓球
数、フィブリノーゲン及びヘモグロビンについての作用
は、ヒルジンの犬への、高い投与量における静脈内投与
の後には、全く観察されなかった。一連のヒトのモデル
においては、ヒルジンが、実験的な血栓症(うっ血によ
り、またはトロンビンの注射により誘導される)におい
て、内毒素性ショックにおいて、そしてDIC(散在性の筋
肉内血液凝固) においても、効果的であると証明されて
いる。今まで直接比較テストが実施されたときには、ヒ
ルジンが、ヘパリンよりも優れていることが証明されて
きた。
び合成の遺伝子は、微生物宿主、例えば、大腸菌(Esche
richia coli)、及び特にサッカロミセス・セレビシエ(S
accharomyces cerevisiae)において、クローン化され、
そして発現されてきた。その発現生産物は、Tyr 63に上
記の硫酸塩のモノエステル基を欠いているのであるが、
- そして、それ故" デスルファトヒルジン" と称される
- それらが、天然の硫酸塩化されたヒルジンと本質的に
同じ生物学的活性を示すことが判明した。サッカロミセ
ス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)におけるデ
スルファトヒルジン変異体の発現に関して、いくつかの
強調されるべき点がある。強力な構成的または誘導的酵
母プロモーター( 例えば、PHO5、GAP 、α- 因子プロモ
ーター)、酵母のシグナルまたはリーダー配列( 例え
ば、上記インベルターゼもしくはPHO5のシグナル配列ま
たは上記α- 因子のリーダー) を含んで成り、そしてデ
スルファトヒルジン遺伝子を提供するデスルファトヒル
ジン発現カセットをもつエピソーム性ベクターを含むサ
ッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株は、たと
え、異なった程度までであっても、その発現、及びそれ
が単離される得る培養培地へのデスルファトヒルジンの
輸送を、提供する( 例えば、欧州特許出願番号200655、
225633、252854、340170及び341215を参照のこと) 。サ
ッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)に関して開発
された利用可能な発現システムは、医薬として利用でき
るデスルファトヒルジンにおいて、満足するには程遠い
収率しか与えない。この点において、そして臨床研究及
び、最終的には治療におけるデスルファトヒルジンが多
量に要求されることを考慮すれば、医薬として利用でき
るデスルファトヒルジンの経済的な大規模生産を可能に
する改良法の必要性が存在する。このような方法を提供
することが、本発明の目的である。
広く分布する、小さい、システインが豊富な金属結合ポ
リペプチドである。サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)は、上記CUP1遺伝子によりコードされている一
種類のMT蛋白を含む。このCUP1座は、酵母細胞に銅耐性
を与えることが示されている。銅耐性をもつサッカロミ
セス・セレビシエ(S.cerevisiae)の2 つの天然変異体が
知られている: 0.3mMの銅に対し感受性のある株は、上
記CUP1座の単一コピー( 上記CUP1遺伝子の、タンデムに
配置された2 つのコピーから成る) を含み、そしてcup1
S と称される、一方、0.3mM の銅に対し耐性のある株
は、タンデムに反復された数個のコピーを含み、そして
CUP1r と称される。銅耐性は、外からの銅の添加によ
る、CUP1の増幅とCUP1の翻訳の誘導との組合せに基づい
ている。このCUP1遺伝子の銅誘導性転写を促進するため
に必要な、シス作用の上流の活性化部位(UASC ) 、並び
に細胞因子のUAS C への結合が、同定された。この結合
因子は、上記CUP1遺伝子の銅誘導性転写のために必須で
あるACE1(=CUP2) の生産物である。このACE1蛋白は、銅
イオンに結合し、このことにより、そのコンフォメーシ
ョンを変更し、そして、そのDNA 結合ドメインを活性化
する転写活性化物質である。上記ACE1蛋白のコンフォメ
ーションの変更は、上記CUP1遺伝子が転写されることを
最終的に許容する。このCUP1システムの重要な特徴は、
その自動調節である。これは、上記CUP1蛋白それ自身が
銅イオンに結合する能力に依存する。それ故、このCUP1
蛋白は、細胞内の遊離の銅イオンと複合体を形成するこ
とにより、それ自身の合成を抑制するようであり、これ
が、次に、ACE1の活性化を妨害する。
のCUP1プロモーターを使用することに関する幾つかの例
が文献の中に存在する(T.R.Butt et al.,Microbiol.Re
v.51,351-364,1987;T.Etcheverry,Methods Enzymol.18
5,319-329,1990; 米国特許第4,940,661 号を参照のこ
と) 。記述された方法は、銅イオンを含む酵母最小培地
内で、CUP1発現カセットをもつ発現ベクターを宿す形質
転換された酵母株を培養することを含んでいる。化学的
に定義された最小培地が選ばれた。なぜなら、複合培地
の成分( 蛋白等) が、銅イオンと相互作用( 錯体形成)
し、そのことにより、ACE1の活性化を妨害すると、一般
的に信じられているからである。達成可能な細胞の密度
( 吸光度) 及び、結果として得られることができるタイ
ターは、対応して低い。後者の結果は、今までのとこ
ろ、遺伝子工学の研究及び生産における上記CUP1プロモ
ーターのシステムに関する広範囲にわたる利用を制限し
ている。
観察され得る発現レベルまたは効率に対する何らの有害
な効果を伴わずに、銅により誘導されるCUP1発現カセッ
トと組み合わせて、複合酵母培地を使用できることが見
つかった。さらに、上記CUP1プロモーターが、擬- 構成
的な方法で使用されたとき、すなわち、酵母によるデス
ルファトヒルジンの分泌を上記培養培地へ向けるため
に、ちょうど接種の時に、上記の培養培地に銅を供給す
るときは、このプロモーターは、強力な構成的酵母プロ
モーター、例えば、短縮された( 構成的な)GAP("GAPE
L") プロモーターよりも優れており、但し、この外来蛋
白デスルファトヒルジンは、上記酵母細胞に対し毒性は
ないことが、驚くべきことに見出された。
ジンの改良された生産方法であって、デスルファトヒル
ジンをコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で
連結されている酵母のシグナルペプチドをコードする第
一DNA 配列に作用可能な状態で連結されている酵母CUP1
プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA
配列から成るデスルファトヒルジン発現カセットを、含
んで成る酵母発現ベクターを宿す酵母株を複合培養培地
内で培養すること、並びに、生産されたデスルファトヒ
ルジンをその培養液から単離することを含んで成り、ち
ょうど接種の時に、培養培地に、CUP1プロモーターを誘
導する量の銅塩を供給するような生産方法に関する。
中に記載された、またはデスルファトヒルジンをコード
するDNA を含む形質転換された微生物株から得られるこ
とができる、全てのデスルファトヒルジン化合物を包含
すると意図される。このようなデスルファトヒルジン
は、例えば、デスルファトヒルジン変異体HV1 、HV2 及
びHV3(PA) 、並びにM.Scharf et al.(前記) により記載
された他のヒルジン蛋白である。ヒルジン活性をもつヒ
ルジン誘導体( すなわち、トロンビン阻害作用をもつ)
も、上記の用語" デスルファトヒルジン" によりカバー
されると理解されるべきである。このような誘導体は、
例えば、C-末端が短くなったデスルファトヒルジン、す
なわち、1 〜7 つの、好ましくは1 〜4 つのアミノ酸を
そのC-末端で欠いているデスルファトヒルジン、及び真
正なアミノ酸の代わりに単一または複数の例えば1 〜5
つのアミノ酸を置換することにより、後者とは異なって
いるヒルジンのムテインである。好ましいデスルファト
ヒルジンは、デスルファトヒルジン変異体HV1 である。
2-ミクロンのプラスミドを含むサッカロミセス・セレビ
シエ(S.cerevisiae)の株またはこの2-ミクロンの内因性
プラスミドにより修復(cured)されているような株を含
む( 欧州特許出願番号340170を参照のこと)。本発明に
記載の好ましい酵母株は、上記の内因性の2-ミクロンの
プラスミドを欠いている( いわゆる"cir0 株" と称す
る) 。好ましい酵母株は、単一または多数のプロテアー
ゼ- 欠損の酵母株、すなわち、特にカルボキシペプチダ
ーゼysc α及びyscYの蛋白分解活性及び、場合によって
さらに、プロテアーゼyscA及び/ またはyscBの活性を欠
いている酵母株である( 欧州特許出願番号341215を参照
のこと)。本発明に記載の方法に好適である酵母株は、
0 〜16、特に2 〜6 コピーの、染色体CUP1遺伝子を含
む。場合によっては、本発明に記載の酵母株は、1 〜3
つの、染色体ACE1遺伝子の追加的なコピーを含む。本発
明のさらなる態様においては、内因性の熱ショック因子
蛋白における突然変異をもっている酵母株が使用され
る。このような突然変異体は、ストレス条件下で、増大
されたCUP1の転写を導く(P.Silar et al.,Mol.Cell.Bio
l.(1991)11,1232-1238を参照のこと) 。
erevisiae)属由来の酵母株は、1 倍体、2 倍体または多
倍体であることができる。好ましい酵母株は、2 に等し
いまたはこれより大きい倍数性をもち、これらの株は、
例えば8 倍体、4 倍体、3 倍体及び特に2 倍体である。
サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)の2 倍体ま
たは多倍体株は、例えば、接合型 a及びαの2 つの1 倍
体株の接合により、またはプロトプラスト融合法により
構築される。本発明の好ましい態様においては、2 倍体
の酵母株は、2 つの1 倍体、及びその接合型のみが異な
っている相同遺伝子の酵母株を使用して作られる。
た方法を使用して培養される。それ故、本発明に記載の
形質転換された酵母株は、その酵母株が生存及び増殖す
るために必須である成分、例えば同化できる炭素及び窒
素源、無機塩、ビタミン、成長促進物質、例えば追加の
アミノ酸、砂糖、等を、含む液体の複合培養培地内で培
養される。
る対応する複合培養培地が、当業者によく知られてい
る。例えば、このような培養培地は、トリプトン、ペプ
トン、肉エキス、マルトエキス、酵母エキス、カサミノ
酸、コーンスティープリカー、大豆粉等、並びに特にそ
れらの混合物を含み、そして場合により、さらに、全て
の下記の必須成分が、上記培地に存在すべきでるという
ことを考慮して、砂糖(例えば、デキストロース、グル
コース、シュクロース等) 、ビタミン( 例えば、ビオチ
ン) 、個々のアミノ酸、無機塩( 例えば、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化
物、リン酸塩及び炭酸塩、さらに、微量元素、例えば、
鉄、亜鉛及びマンガンの対応する塩) 等を補われる。好
ましい培養培地は、場合によって、無機塩及びビタミン
を補われた、商業的に利用可能な培地YPD(酵母エキス(y
east extract) 、ペプトン(peptone) 、デキストロース
(dextrose);Methods Enzymol.194,13 を参照のこと)で
ある。
により行われる。この培養条件、例えば、温度、培地の
pH及び発酵時間は、デスルファトヒルジンの最大レベル
が作り出されるような方法で選択される。選ばれた酵母
株は、デスルファトヒルジンの満足すべき収率が得られ
るように、好ましくは、好気条件下、液浸培地内で、振
とうまたは攪拌を伴って、約25°〜33℃の、好ましくは
約28℃の温度にて、4から7 までのpH値で、例えば、約p
H5 〜6 で、そして少なくとも1 〜3 日間、好ましくは3
〜4 日間、培養される。培養は、バッチ工程、供給バ
ッチ(fed batch) 工程、連続供給バッチ工程、または連
続法として、実施され得る。
P1プロモーターを誘導する量の銅(II)塩、特に硫酸銅を
供給する。銅の最適量( デスルファトヒルジンの最大濃
度を提供する量) は、とりわけ、宿主細胞の遺伝的背
景、使用される発現ベクターの成分、及び培養培地の組
成に依存し、そして熟練者が使用する定型的なテスト、
例えば" タイトレーション"(添加銅量の関数として、HP
LCによりデスルファトヒルジンの濃度を測定すること)
により、測定されることができる。定型テストは、T.Et
cheverry( 上記引用文中に、文書中324 ページ) により
記載されている。正確な銅濃度の測定が、重要である。
なぜなら、不必要に高い銅レベルは、細胞の代謝機構の
抑制を引き起こすかもしれないからである。
ナルペプチドにかかわらず、生産されたデスルファトヒ
ルジンは、主として( すなわち、90% を超える) 、上記
培養培地に分泌される。このデスルファトヒルジンは、
常法により、そこから単離され得る。例えば、その最初
の段階は、通常、遠心分離法によりその培養液から細胞
を分離することにある。結果物である上澄は、大部分の
非蛋白物質を取り除くためにポリエチレンイミンによる
処理により、そしてその溶液を硫酸アンモニウムで飽和
することによる蛋白質の沈殿形成によりデスルファトヒ
ルジンに関して濃縮され得る。宿主蛋白は、存在する場
合には、酢酸( 例えば、0.1%、pH4 〜5)により酸性とす
ることで沈殿させることもできる。デスルファトヒルジ
ンのさらなる濃縮は、n-ブタノールにより上記の酢酸の
上澄を抽出することにより達成され得る。その他の精製
段階は、例えば、脱塩化、クロマトグラフィー法、例え
ば、イオン交換クロオマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、分配クロマトグラフィー、HPLC、逆相HP
LC、等を含む。上記混合液の構成物の分離は、透析によ
り、ゲル電気泳動または無担体電気泳動によるチャージ
に従って、好適なSephadexカラムによる分子サイズに従
って、例えば、抗体、特にモノクロナール抗体を伴う、
またはアフィニティークロマトグラフィーに好適な担体
と一緒になったトロンビンを伴うアフィニティークロマ
トグラフィーにより、あるいは、特に文献により知られ
た他の方法により、行われることもできる。一般的に
は、本質的に汚染物質を含まないデスルファトヒルジン
生産物を得るためには、ほんの少しの精製のみが必要で
ある。
ジン抗体( 例えば、モノクロナール抗体) を使用するテ
スト、トロンビン・テスト[M.U.Bergmeyer(ed.),Method
s inEnzymatic Analysis,Vol.II,p.314-316,Verlag Che
mie,Weinheim(FRG)1983] または血液凝固テスト[F.Mark
wardt et al.,Thromb.Haemost. 47,226(1982)] が、上
記の単離または精製段階の間、ヒルジンの活性を検出す
るために使用されることができる。クロマトグラフィー
法、例えば、HPLCを使用することも可能である。
は、以下に示す段階: - デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に
正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペ
プチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連
結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終
止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジ
ン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクターを用意
し、 - 上記の酵母発現ベクターにより酵母を形質転換し、
そして非形質転換細胞から形質転換細胞を選び出すこと を含んで成る組み換えDNA 技術により調製され得る。
配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグ
ナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状
態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の
転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファト
ヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクター
に関する。上記CUP1プロモーターのDNA 配列は、公知で
ある(T.R.Butt et al.,Proc.Natl.Acad.Sc.USA 81(198
4)3332-3336) 。従って、このCUP1プロモーターは、化
学的なDNA 合成により用意され得るし、または好適なDN
A プローブを使用して、例えば、polymerase chain rea
ction(PCR)( ポリメラーゼ連鎖反応) により、ゲノムの
サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)DNA から単
離され得る。本発明において使用されるCUP1プロモータ
ーは、転写開始シグナル、及び-105〜-148位(CUP1 の転
写開始部位に対して;P.Fuerst et al.Cell 55(1988)70
5-717)に位置する上流活性化配列(UASC ) を含む。好ま
しくは、UAS の現存5'制限部位が、例えば、上記CUP1遺
伝子の-455位に位置するBamHI 部位(T.R.Butt et al.,
前記) が、並びに、化学合成により、またはPCR におい
て使用されたオリゴヌクレオチドにより人工的に誘導さ
れる転写開始シグナル( 例えば、EcoRI 部位) の3'制限
部位が、利用される。上記の結果物である制限フラグメ
ント、特に、配列番号1の中で表される構築物内に含ま
れる、例えば、0.4kB のBamHI-EcoRI フラグメントが、
酵母のシグナルペプチドをコードするDNA 配列に連結さ
れ得る。
をコードするDNA 配列は、好ましくは、普通に分泌され
るポリペプチドをコードする酵母遺伝子に由来する。こ
の酵母シグナル配列は、例えば、上記酵母のインベルタ
ーゼ、α- 因子、フェロモンペプチダーゼ(KEX1)、" キ
ラー毒素" 及び抑制酵素である酸性ホスファターゼ(PHO
5)の遺伝子の、シグナル及びプレプロ配列、並びにアス
ペルギルス・アワモリ( Aspergillus awamori)からのグ
ルコアミラーゼのシグナル配列である。追加の配列、例
えば、特異的プロセシング・シグナルを担持することが
できるプロ- またはスペーサー- 配列も、前駆体分子の
正確なプロセシングを容易にする構築物の中に含まれる
ことができる。例えば、このプロセシング・シグナル
は、ゴルジ膜内に位置する酵母のエンドペプチダーゼに
より認識されるLys-Arg 残基を含む。本発明に記載の好
ましいシグナル配列は、酵母のPHO5遺伝子の、及び酵母
のインベルターゼ遺伝子のものである。
体をコードするDNA 配列は、ゲノムのヒルDNA から単離
されることができ、または2 本鎖デスルファトヒルジン
DNA(デスルファトヒルジンのds cDNA)は、デスルファト
ヒルジンのmRNAに対して相補的に作られて、または、デ
スルファトヒルジンもしくはそれらの誘導体のアミノ酸
配列をコードする遺伝子は、それ自体既知の方法で、化
学的及び酵素的方法により作られる。酵母の転写終止シ
グナルを含むDNA 配列は、好ましくは、転写終止及びポ
リアデニレーションに関する正しいシグナルを含む酵母
遺伝子の3'フランキング配列である。この好ましいフラ
ンキング配列は、酵母のPHO5遺伝子のものである。
をコードするDNA 配列、デスルファトヒルジンをコード
するDNA 配列、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA
配列は、それぞれ互いに作用可能な状態で連結されてい
る。すなわち、それらの正常な機能が維持されるような
方法で並置される。この列は、上記CUP1プロモーター
が、シグナル配列- デスルファトヒルジン遺伝子複合体
の正常な発現を生じさせ、上記転写終止シグナルが、本
来の転写終了及びポリアデニレーションを生じさせ、そ
して、上記シグナル配列が、上記シグナル配列の最終コ
ドンがデスルファトヒルジンの遺伝子の最初のコドンに
直接的に連結されて成熟デスルファトヒルジンの分泌が
生じるような方法で、上記デスルファトヒルジン遺伝子
に本来の読み取り枠内で連結されるようなものである。
このCUP1プロモーターは、好ましくは、主要mRNAの始点
とCUP1遺伝子のATG との間で上記シグナル配列に結合さ
れる。このシグナル配列は、翻訳開始のためのそれ自身
のATG をもつ。これらの配列の結合は、エンドヌクレア
ーゼの認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチド・リ
ンカーにより、もたらされることができる。
とは別に、本発明に記載の発現ベクターは、酵母の複製
起点を含んで成る。従って、このベクターは、複製起点
を含む2 ミクロンのDNA から生じたDNA セグメント、ま
たは、2 ミクロンのDNA をもたない酵母株が使われた場
合には、2 ミクロンのDNA の全体を含んで成る。後者の
タイプのベクターが、好ましい。例えば、本発明に記載
のベクターは、連続した形態において、完全な2 ミクロ
ンのDNA を含み、すなわち、2 ミクロンのDNAが、一
旦、制限エンドヌクレアーゼで解裂されると、その直線
状DNA が、再環化に先立って、そのベクターの他の成分
で連結される。この制限部位は、REP1、REP2及びFLP 遺
伝子の、並びに、2 ミクロンのDNA のORI 、STB 、IR1
及びIR2 部位の正常機能が維持されるように選ばれる。
場合によって、この制限部位は、2ミクロンのDNA のD
遺伝子も無傷であるように選ばれる。好適な制限部位
は、例えば、上記D 遺伝子内に位置するユニークPstI部
位、並びに上記遺伝子及び部位の全ての外に位置するユ
ニークHpaI及びSnaBI である。しかしながら、2 ミクロ
ンのDNA 内に、上記発現カセット、及び特に前述のよう
な、異なった( 例えば2つの) 制限部位でのさらなる成
分( 以下参照) を挿入することができそうである。
は、1 つ、またはそれより多くの、特に1 または2 つ
の、酵母のための選択的遺伝マーカー、並びに、バクテ
リアの宿主、特に大腸菌(Escherichia coli)のための上
記マーカー及び複製起点を含む。発明の好ましい態様に
おいては、2 ミクロンのDNA の環状形態の逆に反復する
FRT 部位間の2 つの領域は、おおよそ同じ長さをもつ。
このようなプラスミド誘導体は、2 つの逆に反復するFR
T 部位または追加の、3 つ目のFRT 部位を含んで成るこ
とができる。前者の種類のプラスミドを、本明細書中
で、" 対称2 ミクロン様ハイブリッドベクター" と称
し、後者の種類のプラスミドを、本明細書中で、" 対称
2 ミクロン様分散ベクター" と称する。それは、真に対
称なプラスミドではないにもかかわらず、それで形質転
換された酵母細胞内で、対称2 ミクロン様ハイブリッド
ベクターを生じさせる。
クターは、優先的には、バクテリアのまたはウイルスの
DNA 配列、すなわちバクテリアのゲノム、プラスミドも
しくはウイルス由来のDNA を含まない。しかしながら、
本発明の2 ミクロン様分散ベクターは、上記の対称2 ミ
クロン様ハイブリッドベクターが上記の分散ベクターか
ら生じているところの、形質転換された酵母内のベクタ
ーから切り取られた2つの直接的に反復したFRT 部位の
間の、原核生物起源のDNA 配列を含むことができる。こ
れらのDNA 配列は、以下に記載するようなバクテリアの
配列であり、そして、そのベクターに、本質的に構成的
な、または機能的な特徴を提供することができ、あるい
は、対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターまたは対称
分散ベクターを構築するために、非対称の2 ミクロン様
プラスミド誘導体のまたは" 非対称の" 分散ベクター
の、2 つの逆に反復されたFRT 部位の間の、上記2 つの
領域を埋める機能だけをもつこともできる。
クロン様ハイブリッドベクターにおいて、またはこのよ
うな対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターを生じさせ
る分散ベクターにおいて、2 つの逆に反復したFRT 間に
位置する領域の長さは、約1:1 から約5:4 までの比をも
ち、すなわち、その大きい方の領域は、その小さい方の
ものよりも約20% まで、より大きい。
マーカー遺伝子の表現型の発現による、形質転換細胞の
ための選択を容易にする、いずれのマーカー遺伝子も使
用できる。酵母のための好適なマーカーは、例えば、抗
生物質の耐性を発現するもの、または、栄養要求性株の
場合には、宿主の病変を補う遺伝子である。対応する遺
伝子は、例えば、抗生物質G418、ハイグロマイシンもし
くはブレオマイシンに耐性を与え、または、栄養要求性
酵母変異株、例えば、URA3、LEU2、LYS2もしくはTRP1遺
伝子における原栄養性を提供する。
えば、大腸菌(E.coli)において、便利に行われるので、
原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の遺伝マーカー、及
び原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の複製起点が、有
利に含まれる。これらは、対応する原核生物のプラスミ
ド、例えば、大腸菌(E.coli)のプラスミド、例えば、pB
R332またはpUC プラスミド、例えば、pUC18 またはpUC1
9 ( これらは、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の複
製起点、及び抗生物質、例えば、アンピシリンに耐性を
与える遺伝マーカーの両方を含む) から得ることができ
る。
ットとは別に、本発明に記載の複製起点及び遺伝マーカ
ーの上記発現ベクターは、場合によって、追加の発現カ
セット、例えば、1 〜3 つの追加のデスルファトヒルジ
ン発現カセット及び/ または追加の転写活性物質ACE1の
発現カセットを含む。この追加のデスルファトヒルジン
発現カセットは、それぞれ互いに同じか、または異な
り、そして、そのベクターに既に存在する上記CUP1- デ
スルファトヒルジン発現カセットと同じか、または異な
り、そして、それぞれ、デスルファトヒルジンをコード
する第二DNA 配列に本来の読み取り枠内で連結されたシ
グナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な
状態で連結された酵母のプロモーター、及び酵母の転写
終止シグナルを含むDNA 配列を含んで成る。このような
追加のデスルファトヒルジン発現カセット内の好適な酵
母プロモーターは、例えば、複合培地内の酵母によるデ
スルファトヒルジンの発現のために使用され得る構成的
または誘導的な酵母プロモーターである。このようなプ
ロモーターは、例えば、上記CUP1、GAPDH(それらの短縮
された構成的なバージョン、例えば、GAPFL 等) 、GAL1
(10)、PYK 、TPI 、ADH 及びPGK プロモーターである。
好ましいのは、上記の構成的なGAPFL プロモーターであ
る。好適なシグナル配列及び転写シグナルは、特に前記
のものである。
トは、例えば、欧州特許出願番号341215に記載されてい
る。追加のACE1発現カセットは、それ自体の転写並びに
翻訳の開始及び終了シグナルを含み、または、あるい
は、ACE1プロモーターとは異なる構成的または誘導的な
酵母プロモーター、例えば、CUP1もしくは構成的な( 短
縮)GAPDHプロモーター( 例えば、GAPFL プロモーター)
により、転写的に制御されている。好適なACE1発現カセ
ットは、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerev
isiae)のゲノムの1.7 kb EcoRVフラグメント内に含まれ
る(P.Fuerst et al.(1988)Cell55,705-717を参照のこ
と) 。そこでの正しいACE1プロモーターは、常法によ
り、他の酵母プロモーターにより置き換えられることが
できる。上記の追加的デスルファトヒルジン及び/ また
はACE 発現カセットの転写の方向は、必須ではなく、そ
して本発明のベクター内に既に存在する上記CUP1- デス
ルファトヒルジン発現カセットの転写の方向と同じであ
ることも、または反対であることもできる。
ーの調製方法にも関する。本発明に記載の発現ベクター
を、当業者に知られた方法により、例えば、通常の化学
的または生物学的なインビトロにおける合成を使用し
て、予め決めた順序で、デスルファトヒルジンをコード
する第二DNA に正しい読み取り枠内で連結された酵母の
シグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能
な状態で連結された酵母のCUP1プロモーター、及び酵母
の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成る上記CUP1-
デスルファトヒルジン発現カセットを、酵母及びバクテ
リアの宿主のための選択的遺伝マーカーを含むDNA フラ
グメントを、酵母及びバクテリアの宿主のための複製起
点を、そして場合により追加のデスルファトヒルジン及
び/ またはACE1発現カセットを連結することにより、調
製する。組み換えDNA 技術を使用して、好ましいベクタ
ーを構築し、そして調製する。組み換えDNA 技術による
調製のために、好適なDNA フラグメントを、常法により
インビトロにおいて連結する。次に、この連結混合物
を、使用される調節要素の性質に依存する好適な原核生
物または真核生物宿主に形質転換し、そして、所望のベ
クターを含む形質転換細胞を、通常の手順に従って選択
する。このベクターを、形質転換された宿主により増幅
することができ、そして常法により単離することができ
る。この宿主の選択は、上記ベクター上に位置するその
調節配列に依存する。本発明の上記発現ベクターが、原
核生物、例えば、大腸菌(E.coli)において機能的な調節
配列を含んで成るので、原核生物宿主、例えば、大腸菌
(E.coli)は、上記ベクターの構築及び増幅のために好ま
れる。
をコードする第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結
された酵母のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配
列に作用可能な状態で連結された酵母CUP1プロモータ
ー、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成
るデスルファトヒルジン発現カセットを含んで成る酵母
発現ベクターを宿す酵母株、並びにそれらの生産方法に
関する。本発明に記載の上記発現ベクターによる酵母の
形質転換は、当業者に知られた方法に従って達成され得
る。好ましい酵母株は、上記のものであり、特に、内因
性の2 ミクロンプラスミド("cir 0 株")を回復されてお
り、そして酵母のプロテアーゼ、例えば、ysc α及びys
cYにおける単一または多数の欠損があるサッカロミセス
・セレビシエ(S.cerevisiae)株である。このような酵母
株の生産方法は、例えば、欧州特許出願番号340170及び
341215に記載されている。染色体CUP1遺伝子の0 〜16個
の、特に2 〜6 個のコピーを含む酵母株は知られてお
り、そしてそれ自体公知の方法で調製され得る。例え
ば、例えば2 〜4 個の、CUP1遺伝子の染色体コピーを含
む従来の銅感受性酵母株から出発してその酵母のゲノム
に欠損を導入するにより、例えば、部位特異的突然変異
誘発または遺伝子破壊または遺伝子置換により、CUP1遺
伝子のより少ないコピーをもつ酵母株が調製され得る
[H.Rudolph et al.,Gene, 36(1985)87-95]。上記染色CU
P1遺伝子の配列が知られているので、適切に改良した突
然変異誘発性オリゴヌクレオチド・プライマーの調製を
含む、よく知られた部位特異的突然変異誘発手順[ 例え
ば、M.J.Zoller and M.Smith(1983) Methods Enzymol.1
00,468] を利用した挿入、置換、欠損により、後者を欠
陥とすることができる。
外来DNA により置換することができ、またはこの外来DN
A を、このCUP1の好適な制限部位に挿入することができ
る。例えば、現存する染色体CUP1遺伝子の全部または一
部分において欠陥のある酵母突然変異体を調製するため
に、外来DNA を、このCUP1遺伝子内にある好適な制限部
位に挿入することができる。この使用された酵母株が、
アミノ酸またはプリン( 例えば、ウラシル) の生合成に
関する酵素をコードする染色体遺伝子に欠陥を持つ場合
には、対応する無傷の遺伝子( 例えば、URA3) を、その
染色体CUP1遺伝子に挿入し、これにより、栄養要求性酵
母株において原栄養性を付与し、そしてCUP1からcup1に
その遺伝子型を同時に変更することができる。この遺伝
子置換または特異的突然変異誘発手順は、一般的に当業
者に利用されており、そして、完全に再現できる。銅に
対し緩やかな耐性をもつ与えられた酵母株の銅耐性を増
大させる( すなわち、染色体のCUP1遺伝子の数を増大す
る) ために、この酵母株を、CUP1座の増幅を引き起こす
培地内での高い銅濃度に晒すことができる。結果物であ
る生存酵母細胞は、その親株よりもより多くの染色体CU
P1遺伝子( 例えば、10〜16個) を含み、そしてそれ自体
公知の方法により上記培地から単離されることができ
る。
れた染色体CUP1遺伝子を全部、または一部分もつ、そし
て/ または特定のプロテアーゼに欠陥をもつ酵母株を創
り出す最新の方法は、好適な酵母株の減数***交差及び
四分子分析にある。この四分子は、その2 媒体細胞から
生じ、標準的な遺伝子技術に従い分析される。四分子の
4 つの胞子間のランダムな各種取り合わせは、それに続
く交差における好適な突然変異体の構築を許容する。ラ
ンダム胞子形成を、それに代わるシステムとして使用す
ることもできる。上記染色体ACE1遺伝子の1 〜3 個の追
加のコピーを含む酵母株を、常法により調製することも
できる。例えば、上記ACE1遺伝子を、抗生物質耐性を与
える染色体遺伝子の適切な制限部位に挿入することがで
き、または、上記ACE1遺伝子の上記のような追加のコピ
ー(copies)を含む得られた酵母株に、抗生物質感受性
を、そして、それぞれに、その対応するアミノ酸、プリ
ン、またはピリミジン塩基に関する原栄養性を与える、
アミノ酸またはプリンまたはピリミジン塩基の合成に関
連する遺伝子に挿入することができる。
々な態様を、添付した付属図面を参照しながら記載す
る。以下の例は、本発明を説明するものであり、そし
て、それらを限定するものとして解釈されるべきではな
い。 実験パート株及びプラスミド 大腸菌(E.coli) DH5αF':Eschericha coli K12F'endA1
hsdR17(r- m + )supE44thil recA1 pyrA relA1 PHI80la
cZdelM15 del(lacZYA-argF)U169;HanahandD(1983) によ
るプラスミドを用いた Eschericha coliの形質転換に関
する研究。J.Mol.Biol.166:577(Bethesda Research Lab
oratories) 酵母(S.cerevisiae) H449:Saccharomyces cerevisiaeMA
Ta,ura3 Δ15,leu2-3,leu2-112,prb1,cps1,[cir 0 ].DS
M4413;1988年2 月18日。 酵母(S.cerevisiae) HT462/TH3:MATα,cup1::URA3,kex
1,prc1,leu2-3;leu2-212;DSM7190;1992年7 月22日。 酵母(S.cerevisiae)株55.6B;MATa,his3,leu2,trp1,ura3
-52,cup1::URA3;Thiele,D.J. et al.Science 231(198
6),854-856 を参照のこと.
図 3; E.coliのためのアンピシリン耐性マーカー並びに
URA3及びdLEU2 サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevis
iae)選択マーカーをもつ酵母- E.coliシャトルベクタ
ー。それは、A 形態での完全な2ミクロン配列を含み、
そしてREP1、REP2及びFLP プロフィシェント(proficien
t)である。DSM4473;1988年3 月14日。 プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIR: 酵母グリセルアルデヒ
ド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の、短
い、構成的プロモーターの制御下でのデスルファトヒル
ジン変異体HV1 の発現のための酵母プラスミド。デスル
ファトヒルジンのコード配列は、好ましい酵母のコドン
から成る;EP-A-340 170 を参照のこと。 プラスミドpTZ18R:pUC18由来のプラスミドは、M13 複製
起点を含み、その為、一本鎖に成ることができ、そして
ヘルパーM13 ファージの助けを借りてM13 ファージの頭
に包み込まれることができる。Mead DA,Szczesna-Skoru
pa E,Kemper B,一本鎖DNA 'blue' T7 プロモータープラ
スミド: クローニング及び蛋白工学のための用途の広い
縦に並ぶプロモーターシステム.Protein Engineering 1
(1986),67-74(pharmacia). プラスミドpFBY2:このプラスミドは、酵母(S.cerevisia
e)の2 ミクロンプラスミド由来のFRT を含む166 塩基対
のAluIフラグメントを、pTZ18RのHindIII 部位とEcoRI
部位との間に挿入し、そしてXbaIにより切断した2 ミク
ロンプラスミドの全体を、pTZ18RのユニークXbaI部位に
挿入することにより構築される。DSM 6271;1990 年12月
14日。
8RのユニークXbaI部位にクローニングされたサッカロミ
セス・セレビシエ(S.cerevisiae)のURA3遺伝子の全体を
含む1.1kb のXbaIフラグメントから成る。このプラスミ
ドは、XbaIフラグメントを含む1.1kb のURA のための便
利な源として役立つ。 DSM 6272;1990年12月14日。 プラスミドpFBY5:pFBY5 は、サッカロミセス・セレビシ
エ(S.cerevisiae)の2 ミクロンプラスミドの全体を含む
大きなプラスミド、並びに、バクテリアのベクターpUC1
8 中のサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のUR
A3及びleu2遺伝子から作られる。このベクターのユニー
クなSalI部位に、1.1k塩基対のSalIフラグメントが挿入
され、このフラグメントは、PHO5シグナル配列に融合し
たサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)GAPDH 由
来のプロモーター、これに融合する合成ヒルジンをコー
ドするDNA フラグメント、次に、これに融合するPHO5タ
ーミネーターから成る発現カセットを含む。DSM 6273;1
990 年12月14日。 プラスミドpFBY29: このプラスミドは、LEU2遺伝子を含
む2k塩基対のBamHI/SalIフラグメントから成る。このフ
ラグメントは、pTZ18RのBamHI 部位とSalI部位との間に
挿入される。pFBY29は、LEU2を含む2.0k塩基対のフラグ
メント源として役立つ。DSM 6275;1990 年12月14日。 別段の定めなき場合、標準的な手順書に従い、全ての操
作を実施する( 例えば、maniatis,T.et al.:Molecular
cloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Lab
oratory,Cold Spring Harbor,New York(1982) 。
モーター、PHO5リーダー配列及び合成ヒルジン遺伝子を
含むハイブリッド遺伝子 分泌デスルファトヒルジンの誘導的・高レベルの発現を
達成するために、ヒルジンHV1 及びPHO5リーダー配列を
コードするDNA 配列を融合し、そして銅誘導可能CUP1プ
ロモーターの制御下に置く。pDP34(欧州特許出願番号34
0170、その中の図 3を参照のこと) は、大腸菌(E.coli)
にのためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdL
EU2 酵母選択マーカーをもつ酵母- 大腸菌(E.coli)シャ
トルベクターである。それは、A 形態で、完全な2 ミク
ロン配列を含み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィシ
ェントである。プラスミドpDP34 をBamHI により処理す
る。この制限部位の付着末端を、Klenow DNAポリメラー
ゼ反応によりフィルインする(T.Maniatis et al.,in:"M
olecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Sprin
g Harbor Laboratory,1982) 。このDNA をさらにSalIに
より切断し、そして11.8kbのベクターフラグメントを分
離用0.6%アガロースゲル上で単離する。電気的溶出及び
エタノール沈殿によりこのDNA を回収する。
セルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺
伝子の、短い、構成的プロモーターの制御下でのデスル
ファトヒルジン変異体HV1 の発現のための酵母プラスミ
ド; デスルファトヒルジンのコード配列は、好ましい酵
母のコドンから成る; 欧州特許出願番号340170を参照の
こと) をHindIII により処理する。付着末端を、Klenow
DNAポリメラーゼにより平滑末端に変換する。このDNA
をエタノール沈殿し、そしてさらに、SalIにより処理す
る。この1.1kb のSalI-[HindIII]/ 平滑末端フラグメン
トは、pBR322配列、GAPFL プロモーター、デスルファト
ヒルジンのコード配列( 好ましい酵母コドン) にフレー
ム内で融合されたPHO5シグナル配列、及びPHO5転写終止
フラグメントをもつ完全な発現カセットを含む。この1.
1kb フラグメントを分離用0.8%アガロースゲル上で単離
し、電気的溶出によりゲルから回収し、そしてDE52イオ
ン交換クロマトグラフィー及びエタノール沈殿により精
製する。
kbベクターフラグメント0.1 ピコモルを、10μl の60mM
Tris-HCl pH 7.5,10mM MgCl2 ,5mM DTT,3.5mM ATP及び
400ユニットのT4 DNAリガーゼ(Biolabs) 内で、16時
間、15℃で、連結する。1 μlの部分を、大腸菌(E.col
i)HB 101Ca2+ 細胞を形質転換するために使用する。5
つの形質転換された、アンピシリン耐性コロニーを分析
する。プラスミドDNA をBamHI 及びSalI/BamHIにより処
理する。正しい制限フラグメントをもつ1 つのコロニー
を選び、そしてpDP34/GAPFL-YHIRと呼ぶ( 詳しくは、欧
州特許出願番号340170を参照のこと) 。PHO5リーダー配
列に融合された合成ヒルジン遺伝子を、PHO5転写終止配
列をも含む0.5kb のEcoRI フラグメントとして、プラス
ミドpDP34/GAPFL-YHirから単離する。
としての以下の2 つのオリゴヌクレオチドを使用したpo
lymerase chain reaction(PCR)により、酵母(S.cerevis
iae)のゲノムの遺伝子から、CUP1プロモーター(T.R.But
t et al.(1984) Proc.Natl.Sci USA 81,3332-3336)をク
ローニングする。 5'-GGATCCATTACCGACATTTGGGCGCTAT ( 配列番号3) 5'-GAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTA ( 配列番号4)
中に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ、0.02mMのそ
れぞれのプライマー、並びに0.2mM のdATP、dCTP、TTP
及びdGTPを含む0.1ml 中で、100ng の酵母のgenomic DN
A(酵母株H449から単離した)をインキュベートする。92
℃で30秒、42℃で1 分間、そして72℃で1 分間、の30サ
イクル間、この反応物をインキュベートする。単離し、
精製し、そしてBamHI及びEcoRI による制限酵素処理の
後、0.4kb のCUP1プロモーターフラグメントを、BamHI
及びEcoRI により切断されたpBR322に挿入する。結果物
であるプラスミドpBR322-CUP1 を、EcoRI により制限酵
素処理する。このCUP1プロモーターを含む4.4kb のベク
ターを単離し、精製し、そして0.5kb のヒルジンフラグ
メントと連結する。大腸菌(E.coli)HB101 を、この得ら
れたプラスミドpPFY53を用い形質転換する。pPFY53を、
SalIを用いた処理により、デスルファトヒルジン・フラ
グメントの本来の方向についてテストする。CUP1プロモ
ーター、PHO5リーダー配列、ヒルジン遺伝子、及びPHO5
ターミネーターを含む1082塩基対のBamHI/SalIフラグメ
ントを、配列番号1に示す。
SalIフラグメントとして、pPFY53から単離する。次に、
このフラグメントを、SalIにより線状になったpDP34 に
挿入する。大腸菌(E.coli)HB101 を、生ずるプラスミド
pPFY56を用い形質転換する。kpnIを用いた処理によりそ
の方向をテストする。この形質転換された大腸菌(E.col
i)株を、大腸菌(E.coli)/PFY56と称する。pPFY56を図 1
に示す。
モーターからのヒルジン及びACE1プロ モーターからのAC
E1の同時発現 Ace1蛋白は、CUP1発現を制御する銅応答性転写因子であ
る。これは、構成的に発現される。制御は、翻訳後に起
こる。Perkin Elmer製PCR キット及びプライマーとして
の以下の2 つのオリゴヌクレオチドを使用したポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR) により、サッカロミセス・セレビシ
エ(S.cerevisiae)のゲノムDNA から、ACE1遺伝子(P.Fue
rst et al.(1988) Cell 55,705--717)をクローニングす
る。 5'-GATATCGATCGTGAAAGAATATTTGCT ( 配列番号5) 5'-GATATCATGAGGATGATGACAAAGAAGAC ( 配列番号6)
中に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ、0.02mMのそ
れぞれのプライマー、並びに0.2mM のdATP、dCTP、TTP
及びdGTPを含む0.1ml 中で、100ng の酵母のゲノムDNA
をインキュベートする。92℃で30秒、42℃で1 分間、そ
して72℃で1 分間、の30サイクル間、この反応物をイン
キュベートする。単離し、精製し、そしてEcoRV による
制限酵素処理の後、1.7kb のACE1遺伝子フラグメント
を、pPFY56( 例 1) のユニークSnaBI 部位に挿入してプ
ラスミドpPFY58を導き、このプラスミドを大腸菌(E.col
i)HB101 に形質転換する。NcoIを用いた制限酵素処理に
よりその方向をテストする。この形質転換された大腸菌
(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY58と称する。pPFY58
を図 2に示す。
ロモーターからのデスルファトヒルジ ン及びCUP1プロモ
ーターからのACE1の同時発現 タイトに調節された、高レベルのACE1発現を達成するた
めに、1.7kb のEcoRVフラグメント( 例 2) 上に存在す
る構成的なACE1プロモーターを、CUP1プロモーターに交
換する。このCUP1プロモーターへのACE1コード配列の融
合のために、部位特異的突然変異誘発法により、ACE1の
出発コドンの上流にEcoRI 部位を導入する。ACE1遺伝子
を含む1.7kb のEcoRV フラグメント( 例 2) を、ベクタ
ーpBluescriptKS+(Straragene,La Jolla,Ca,USA)のEcoR
V 部位にサブクローニングし、プラスミドpKSACE1 を与
える。ウラシル-DNA法(Bio-Rad Muta-Gene M13 kit,Bio
-Rad,Richmond,Ca,USA) を使用したインビトロ突然変異
誘発による新たなEcoRI 部位を導入するためには、以下
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。 5'-CTGATAATCAGTGAATTCACAGAATG-3' (配列番号7)
CE1 を、大腸菌(E.coli)CJ236 にトランスフェクトす
る。CJ236 からの一本鎖DNA を、M13 ヘルパー・ファー
ジを使用して単離する(Stratagene 、前記) 。200 ピコ
モルのオリゴヌクレオチドを、3 μl の1M Tris-HCl pH
8.0、0.3 μl の1M MgCl 2 、0.75μl の0.2M DTT、0.
6 μl の20mM ATP及び5 ユニットのT4ポリヌクレオチド
・キナーゼを含む0.03mlの液量内でリン酸化する。この
混合液を、37℃で60分間そして65℃で15分間インキュベ
ートする。リン酸化されたオリゴヌクレオチドを、以下
のように鋳型DNA にアニーリングする:pKSACE1由来のウ
ラシル含有DNA 0.1 ピコモルを、10μl のアニーリング
・バッファー(20mM Tris-HCl pH 7.5 、2mM MgCl 2、50
mM NaCl)中の2 ピコモルのリン酸化プライマーと共にイ
ンキュベートする。この混合液を、80℃で10分間インキ
ュベートし、そして次に、25℃まで徐々に冷却する。
ニーリング反応物を、4 μl の2mMdNTP's 、0.75μl の
0.5M Tris-HCl pH 7.5、0.75μl の0.1M MgCl 2 、2.2
μl の0.2M DTT、1 ユニットのT4 DNAポリメラーゼ及び
2 ユニットのT4 DNAリガーゼと共にインキュベートす
る。この反応液を、氷上で10分間、25℃で10分間、そし
て37℃で90分間インキュベートする。生ずる2 本鎖DNA
を、大腸菌(E.coli)JM101 に形質転換する。プラスミド
を調製し、そして正確なEcoRI 部位について分析する。
この新たなEcoRI 部位をもつ1 つのプラスミドをpKSACE
1-Eco 名付ける。ACE1プロモーターを伴わず、ACE1コー
ディング配列及び終止配列を含むpKSACE1-Eco 由来の1.
5kb のEcoRI フラグメントを、ACE1をCUP1プロモーター
の制御下に置くために、ベクターpBR322-CUP1(例 1) の
EcoRI 部位にクローニングする。この生ずるプラスミド
pCup-ACEを、大腸菌(E.coli)HB101 にトランスフェクト
する。
グメントを、BamHI により線状にしたベクターpDP34 に
連結する。10フェムトモルのBamHI により線状にしたベ
クターDNA 、30フェムトモルのBamHI/SnaBI フラグメン
ト、20mM Tris pH 7.5、5mMMgCl2 、1mM DTT 、0.1mM A
TP 及び1 ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl 中
で、連結を実施する。25℃で60分間のインキュベーショ
ン後、20mM Tris-HCl pH7.5、5mM MgCl2 、1mM DTT 、
0.1mM dNTP's及び1 ユニットの大腸菌(E.coli)DNA ポリ
メラーゼKlenowフラグメントを含む50μl 中で、この分
子を平滑末端にする。この混合液を、37℃で10分間イン
キュベートする。次に、この平滑末端の分子を、15℃で
18時間、20mM Tris-HCl pH 7.5、5mM MgCl2 、1mM DTT
、0.1mM ATP 及び1 ユニットのT4 DNAリガーゼを含む1
00 μl 中での連結により、環状にする。生ずるプラス
ミドpPFY54を、大腸菌(E.coli)HB101 にトランスフェク
トし、そしてPvuII を用いた制限酵素処理により、方向
についてテストする。CUP1- ヒルジン発現カセット( 例
1) を含むpPFY53由来の1.1kb のSalIフラグメントを、
salIにより直線状になったベクターpPFY54にサブクロー
ニングする。この得られたプラスミドpPFY59R を、大腸
菌(E.coli)HB101 にトランスフェクトする。その方向を
KpnIを用いた処理によりテストする。pPFY59R を担持す
る大腸菌(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY59R と名付
ける。pPFY59R を、図 3に示す。
ーターからのデスルファトヒルジンの発現 ヒルジンのmRNAレベルを増大するために、ヒルジン・コ
ーディング配列を、2つの異なるプロモーターから同時
に発現することができる。CUP1- ヒルジン発現カセット
を、プラスミドpPFY53( 例 1) からの1.1kb のSalIフラ
グメントとして単離する。このフラグメントを、ベクタ
ーpDP34/GAPFL-YHirのユニークSalI部位にクローニング
する。生ずるプラスミドpPFY79内のSalIフラグメントの
方向を、BamHI を用いた制限酵素処理によりテストす
る。pPFY79によりトランスフェクトされた大腸菌(E.col
i)HB101 を、大腸菌(E.coli)/PFY79と名付ける。pPFY79
を図 4に示す。
R 、pPFY79及びpDP34-GAPFL-YHirのよ るサッカロミセス
・セレビシエ(S.cerevisiae)の形質転換 サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456
を、欧州特許出願番号341215に記載されたように構築す
る。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevi
siae)株H449から出発して、2 つの引き続く一連の実験
において、2 つのカルボキシペプチダーゼysc α及びys
cYを、それぞれ、それらをコードする遺伝子であるKEX1
及びPRC1の破壊により、株H449から取り除く。最初に、
ysc αをコードする遺伝子であるKEX1を破壊する。この
目的のために、株H449を、KEX1をコード遺伝子をコード
するDNA フラグメントにより形質転換する。ここで、UR
A3遺伝子の全体が、KEX1コーディング領域に挿入され
る。ウラシルの原栄養性形質転換細胞を選択し、そして
ysc α活性の無いことについてテストする。次に、KEX1
座に挿入されたURA3遺伝子を、URA3遺伝子の破壊された
変異体であるura3Δ( 欧州特許出願番号341215を参照の
こと) を含むプラスミドを用いた形質転換により破壊す
る。ura3栄養要求性の形質転換細胞を選択し、そして以
下の段階において、カルボキシペプチダーゼyscYをコー
ドするそれらの内因性PRC1遺伝子内で破壊する。KEX1の
破壊について記載したような、全体として類似する方法
で、この実験を実施する。最終結果物である株H449相同
遺伝子誘導体はTr1456と称され、そして以下の遺伝子
型: Tr1456 = MATa,leu2-3,112,ura3,prb1,kex1::ura3,prc
1::ura3,[cir 0 ] をもつ。
FY58、pPFY59R 及びpPFY79による株Tr1456形質転換を、
Dohmen et al.[1989,Curr.Genet.15,319-325] に従い実
施する。形質転換された酵母細胞を、ロイシンが補わ
れ、そしてウラシルが欠如した酵母最小培地のプレート
上で選択する。単一の形質転換酵母クローンを単離
し、、これを: サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) Tr1456/pDP34/GAPFL-YHir サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) Tr1456/pPFY56 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) Tr1456/pPFY58 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) Tr1456/pPFY59R サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) Tr1456/pPFY79 と称する。
るデスルファトヒルジン発現 サッカロミセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisi
ae)Tr1456/pPFY56、サッカロミセス・セレビシエ(sacch
aromyces cerevisiae)Tr1456/pPFY58及びサッカロミセ
ス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae)Tr1456/pP
FY59R を、 Difco 酵母ナイトロジェンベース ( アミノ酸の含まない) 6.7 L-アスパラギン 10 L-ヒスチジン 1 L-ロイシン 0.1 グルコース 20 (g/l) から成る2 つの引き続きの培養において、それぞ
れ増殖させる。第一の培養を、30℃で60時間、そして 1
80r.p.m.で実施する。第二の培養を、第一培養の2%( 体
積対体積) により接種し、そして30℃で24時間、そして
180r.p.m. で実施する。24時間後、培養液を遠心分離
し、細胞を生理食塩水で1 回洗浄し、そして、それに異
なった濃度の硫酸銅が添加されている新しい培地( 前を
参照のこと)の、元の液量内に再懸濁する。この細胞
を、30℃、180r.p.m. で、さらに24時間増殖させ、その
後、遠心分離によりその細胞を取り出し、そして上澄み
中のデスルファトヒルジン量を、特許出願340170中に開
示されたようにHPLCにより測定する。結果を表 1に要約
する。
ミド構築物の1 つを含む全ての形質転換細胞において発
現される。発現は、絶対的に銅依存性である。なぜな
ら、添加銅の非存在下では、デスルファトヒルジンが殆
ど見られないからである。これらの条件下での最適銅濃
度は、0.05と0.25mMとの間にある。
ーに対するGAPFL-プロモーターの制御 下での、デスルフ
ァトヒルジン濃度の比較 以前に、欧州特許出願番号340170に記載されたように、
デスルファトヒルジンの発現は、強いGAPDH プロモータ
ーの短いフラグメントの制御下、豊富な、複合培地にお
いて最適となった。それ故、プラスミドを含むCUP1- プ
ロモーターを、これらの以前に開示された条件下に、+/
- 銅添加を行い比較する。さらに、銅添加についての最
適時間点を測定する。サッカロミセス・セレビシエ(Sac
charomyces cerevisiae)TR1456/pPFY56 、またはTR1456
/pPFY58 、またはTR1456/pPFY59R、またはTR1456/pDP34
/GAPFL-YHirの細胞を、 Difco 酵母ナイトロジェンベース ( アミノ酸の含まない) 6.7 L-アスパラギン 10 L-ヒスチジン 1 L-ロイシン 0.1 グルコース 20 (g/l) から成る20mlの合成培地内で、2 つの引き続きの
予培養において、それぞれ増殖させる。
培養を、28℃で60時間、そして 180r.p.m.で実施する。
第二の予培養を、第一予培養の2%( 体積対体積) により
接種し、そして28℃で24時間、そして180r.p.m. で実施
する。主培養の培地は、 ペプトン 5 酵母エキス 10 グルコース 20 シュクロース 40 硫酸アンモニウム 3 リン酸2 水素カリウム 2 硫酸マグネシウム7 水塩 0.5 塩化ナトリウム 0.1 塩化カルシウム 0.1 ビオチン 10-5 から成る。主培養(100ml培地) を、約2 x 106 細胞/ml
により接種し、そして28℃で96時間、そして180r.p.m.
でインキュベートする。200Mの濃度での無菌硫酸銅を、
主培養の接種後、0 時間、または7 時間、または11時
間、または14時間、または24時間目に、主培養に添加す
る。この発酵の終了時に、この培養液の一部分を取り出
し、遠心分離によりその細胞を取り出し、そしてこの培
養液の上澄を、前記のように、デスルファトヒルジンに
ついて分析する。結果を以下の表 2に示す。
すなわち、プロモーターによる誘導が、主培養の接種と
一緒に起こる) で使用したとき、並びに、ACE1- 遺伝子
が、ヒルジン発現カセットを含むプラスミド上に存在す
るとき、CUP1- プロモーターからのデスルファトヒルジ
ンの最も高い発現を得る。期待に反して、本明細書中に
開示する誘導条件下では、強力な構成的GAPDH-プロモー
ターの改良変異体の制御下のヒルジン発現カセットを含
む株サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)TR1456
/pDP34/GAPFL-YHir を用いてよりも、株サッカロミセス
・セレビシエ(S.cerevisiae)TR1456/pPFY58 及びTR1456
/pPFY59Rを用いて、より高い濃度のヒルジンを得る。
ンのCUP1指令分泌ついての銅濃度の最 適化 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)TR1456/pPFY56 、又はTR1456/pPFY58 、又はTR1456/p
PFY59R、又はTR1456/pDP34/GAPFL-YHir を、前セクショ
ンに記載したように、20mlの合成培地中で、2 つの引き
続きの予培養において、それぞれ増殖させる。主培養
を、前記の複合培地中で行い、そして約2x 106 細胞/ m
lにより接種し、そして28℃で96時間、そして180r.p.m.
でインキュベートする。主培養の接種の直後、下記濃
度での無菌硫酸銅を培地に添加する。その濃度は0 μM
、又は50μM 、又は200 μM 、又は500 μM 、又は1mM
、又は2.5mM 、又は5mM である。発酵終了時、培養液
の一部を取り出し、細胞を遠心分離により取り出し、そ
して培養上澄液を前記のようにデスルファトヒルジンに
ついて分析する。結果を以下の表 3に示す。
GAPDH-プロモーターの強構成的なGAPFL-フラグメント制
御下にあるときよりも、CUP1-YHir 発現カセットを使用
したときに、はるかに高い濃度のデスルファトヒルジン
を得る。200 〜500 μM より低い銅濃度では、転写活性
物質ACE1の遺伝子を含むプラスミドpPFY58及びpPFY59R
が、ACE1を欠いているプラスミドpPFY56よりも優れてい
る。
現カセットをもつプラスミドpDP34/[G APFL-HIR]Dの構築 プラスミドpDP34/[GAPFL-HIR]Dは、タンデムに配置され
た2 つのヒルジン発現カセットから成るDNA 挿入物を含
んで成る。この2 つのカセットは、同一であり、そして
PHO5シグナル配列及び短く構成的なGAP49(TDH3) プロモ
ーター(GAPFL)の制御下のデスルファトヒルジンHV1 の
コード配列並びにPHO5転写ターミネーターを含む。プラ
スミドpJDB207/[GAPFL-HIR]Dは、酵母ベクターpJDB207
中にこのタンデム発現カセットをもつ。この構築物は、
EP225633に記載されている。 pJDB207/[GAPFL-HIR]D
を、ユニークHindIII 部位で切断する。この制限部位の
付着末端を、klenow DNAポリメラーゼにより平滑末端に
変換する。0.01mg/ml のエチジウムブロマイドの存在中
での部分的なSalI処理により、2 つの発現カセットをも
つ2.1kb のSalI- 平滑末端フラグメントの単離をするこ
とができる。プラスミドpDP34(例 1を参照のこと) をBa
mHI を切断し、klenow DNAポリメラーゼにより処理し、
そしてSalIにより処理する。単離された大きなベクター
・フラグメントを、2.1kb のSalI- 平滑末端フラグメン
ントをクローニングするために使用する。正しいクロー
ンをpDP34/[GAPFL-HIR]Dと称し、反時計廻りの方向にク
ローンイングされたタンデム・カセットをもつ。
発現カセットをもつプラスミドを使用 して得られるヒル
ジン濃度の比較 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)TR1456/pPDP34/GAPFL-YHir、又はTR1456/pPFY56 、又
はTR1456/pPFY79 、又はTR1456/pDP34/[GAPFL-HIR]D
を、例 7に記載したように、2 つの引き続きの前培養、
次の主培養において、それぞれ増殖させる。主培養を、
約2 x 106 細胞/ mlにより接種し、そして28℃で96時
間、そして180r.p.m. でインキュベートする。主培養の
接種の直後、下記濃度での無菌硫酸銅を添加する。その
濃度は0 μM 、又は50μM 、又は200μM 、又は500 μM
、又は、750 μM 、又は1mM 、又は2.5mM である。発
酵終了時、培養液の一部を取り出し、細胞を遠心分離に
より取り出し、そして培養上澄液をHPLCによりデスルフ
ァトヒルジンについて分析する。結果を以下の表 4に示
す。
現カセット及び第 2の、銅誘導CUP1-YHir 発現カセット
を含むプラスミドpPFY79は、1.) 構成的な発現カセット
のみを含むpPD34/GAPFL-YHirの如きプラスミドよりも、
または 2.)銅誘導発現カセットのみを含むpPFY56/CUP1-
Hir の如きプラスミドよりも、または 3.)2 つの構成的
な発現カセットを含むpDP34/GAPFL-YHir+GAPFL-YHir の
如きプラスミドよりも優れている。
aromyces cerevisiae)株Tr1456の銅耐 性相同遺伝子変異
体の構築 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)株Tr1456は、- ほとんどは実験酵母株と同様に- 、培
地への銅添加に対し中程度に耐性である。この耐性は、
内因性CUP1座の約3 つのコピーを含む2kb の染色体DNA
セグメントの存在による[D.Hamer,et al.Science 228(1
985),685-690] 。培地中の大量の銅の存在下、より高い
耐性変異体が得られるが、これは、上記の2kb のCUP1含
有染色体DNA セグメントのタンデムの反復による。この
ような高い耐性変異体を構築するために、サッカロミセ
ス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456を、例 6に記載し
たように、合成最小培地に接種し、1.2mM の硫酸銅を補
給する。この培養を、30℃で8 日間、そして180r.p.m.
で行う。次ぎに、この培養液を、銅添加のない、単一コ
ロニーを得るのに好適な濃度での合成最小培地上にプレ
ーテングする。選択された個々のコロニーからのDNA を
調製し、EcoRI により処理し、アガロースゲル上で分離
し、そしてサザンブロット法によりCUP1座の存在及び長
さについて分析する。実験条件は、Hamer et al.[ 前記
を参照のこと] に従う。CUP1座の少なくとも10コピーの
中の、CUP1座の電気泳動法での移動における、その存在
を表すシフトをもつ1 つのコロニーを選び、そしてサッ
カロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1631と称す
る。
pPFY59R によるサッカロミセス・セレ ビシエ(S.cerevis
iae)株Tr1631の形質転換 プラスミドpPFY56、pPFY58、及びpPFY59R によるサッカ
ロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1631の形質転
換を、前記のように実施した。単一の形質転換酵母クロ
ーンを単離し、そして、サッカロミセス・セレビシエ(S
accharomyces cerevisiae) Tr1631/pPFY56、サッカロミ
セス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1631/
pPFY58及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae) Tr1631/pPFY59Rと称する。
ロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae) 株Tr1631と形質転
換株Tr1456との比較 サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1631/pPF
Y56 、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr16
31/pPFY58 、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisia
e)Tr1631/pPFY59Rの細胞、並びにサッカロミセス・セレ
ビシエ(S.cerevisiae)Tr1456/pPFY56 、サッカロミセス
・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456/pPFY58 、サッカロ
ミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Tr1456/pPFY59Rの細
胞を、例7及び8 に記載するように培養する。主培養の
接種直後、主培養液に、0 、0.5mM 、1mM 、2mM または
4mM の硫酸銅を添加する。この培養を30℃で72時間、そ
して180r.p.m. で行う。発酵終了時、培養液の一部を取
り出し、細胞を遠心分離により取り出し、そして培養上
澄液をHPLCによりデスルファトヒルジンについて分析す
る。結果を以下の表 5に示す。
の、形質転換銅耐性株サッカロミセス・セレビシエ(S.c
erevisiae)Tr1631における優れたデスルファトヒルジン
生産性を示している。
evisiae)株55.6B(cupp::URA3) とサッ カロミセス・セレ
ビシエ(S.cerevisiae)株TR1456との接合及び銅感受性に
関するその胞子の分析 CUP1座の中に欠損のあるサッカロミセス・セレビシエ
(S.cerevisiae)株55.6B(MATa his3 leu2 trp1 ura3-52,
cup1::URA3;Thiele,D.J.et al.Science231(1986),854-8
56を参照のこと) を、CUP1座の約3 つのコピーを担持す
る株TR1456(MATaleu2-3,212,ura3D5 kex1 prb1 prc1)
と接合させる。遺伝子型cup1::URA3/CUP1の2 倍体のヘ
テロ接合細胞を、この接合体から単離する。この2 倍体
から生じる4 倍体を、標準的な遺伝子技術[Methods in
Yeast genetics 1986(Sherman F.,Fink G.R.,Hicks J.
B.,eds.)Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.]に従っ
て分析される。それぞれの4 倍体の4 つの胞子の子孫
を、0 μM 、250 μM 、500 μMまたは1mM の硫酸銅を
補ったYPD 寒天プレート(2回蒸留した水1 リッター当た
り、10g の酵母エキス、20g のペプトン、20g のグルコ
ース及び25g の寒天) 上での増殖能力についてテストす
る。
いる胞子が、銅寒天上で僅かに増殖する子孫を生じさせ
るのに対し、無傷のCUP1遺伝子を受け継いでいる胞子
は、銅寒天上で活発に増殖する子孫を生じさせる。幾つ
かの完全な四分子の2 つの銅感受性胞子の子孫を、株TR
1456とのそれらの接合能力についてテストする。適切な
接合型の胞子の子孫を、TR1456と接合し、そして遺伝子
型cup1::URA3/CUP1 の2倍体ヘテロ接合細胞を、この接
合体から単離する。上記2 倍体細胞から生じた四分子を
分析し、そしてその胞子を、前記のように硫酸銅の感受
性についてテストする。約50の完全四分子から得られた
銅感受性コロニーを、SD寒天( 水1 リッター当たり、ア
ミノ酸を含まない6.7gのBacto 酵母ナイトロジェンベー
ス、20g のグルコース及び25g の寒天) 上、並びに200M
のロイシンを補ったSD寒天上での増殖についてテストす
る。このSD寒天上で増殖しないが、200Mのロイシンを補
ったSD寒天上では増殖するコロニーは、遺伝子型cup1::
URA3,HIS3,TRP1,leu2-3,212をもち、そしてさらなる研
究のために選択される。
ysc アルファの追加的欠損に関する 確認cup1::URA3突然変異体の分類並びに突然変異体の形
質転換 例 14 の下で開示されたように得られたサッカロミセス
・セレビシエ(S.cerevisiae)cup1::URA3突然変異体を、
KEX1及びPRC1遺伝子によりコードされるプロテアーゼの
欠損に関して、さらに分類する。このKEX1遺伝子内に欠
損のあるコロニーを、それらのa-因子分泌能力の減少に
基づいて同定する。野生型KEX1遺伝子を担持するコロニ
ーとKEX1遺伝子において突然変異誘発されたコロニーと
の間を区別するために使用される手順の詳細な説明につ
いては、欧州特許出願番号341215、文書中の例 1として
見いだすことができる。上記PRC1遺伝子内欠損コロニー
を、1 遺伝子の生産物、すなわちプロテアーゼyscYの蛋
白分解活性を測定する生化学的なテストにより同定す
る。このテストは、EP341215に記載されている。遺伝子
型cup1::URA3 kex1 prc1 leu2-3,212 の単一コロニーを
拾い上げ、そしてサッカロミセス・セレビシエ(Sacchar
omyces cerevisiae)HT462/TH3 と称する。株HT462/TH3
の細胞を、それぞれ、プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR、又
はプラスミドpPFY56、又はプラスミドpPFY58、又はプラ
スミドpPFY59R のいずれかにより形質転換する。形質転
換のために使用される方法は、EP341215に開示されてい
る。プラスミドpPFY56、又はプラスミドpPFY58、又はプ
ラスミドpPFY59R 、又はプラスミドpDP34/GAPFL-YHIRの
いずれかを含む単一形質転換酵母コロニーを拾い上げ
る。それぞれのタイプの1 つの形質転換コロニーをさら
なる研究のために選び、そして、それぞれを、サッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/p
PFY56 、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces c
erevisiae) TH3/pPFY58 、サッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY59R、及びサッカ
ロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3
/pDP34/GAPFL-YHIRと称する。
発酵 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TH3/pDP34/GAPFL-YHIR 、又はサッカロミセス・セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TH3/pPFY56 、又は
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TH3/pPFY58の細胞を、例 7に記載したように、20ml
の合成培地の2 つの引き続きの前培養において、それぞ
れ増殖させる。主培養を、例 7に開示した複合培地上で
行う。約2 x 106 細胞/ mlにより主培養を接種し、そし
て28℃で66時間、そして180r.p.m. でインキュベートす
る。主培養の接種の直後、下記濃度での無菌硫酸銅を主
培養液に添加する。その濃度は0 μM 、5 μM 、10μM
、25μM 、、50μM 、100μM 、500 μM である。発酵
終了時、培養液の一部を取り出し、細胞を濾過により取
り出し、そして培養上澄液をHPLCによりデスルファトヒ
ルジンについて分析する。結果を以下の表 6に示す。
る宿主細胞、例えば、TH3 においては、CUP1-YHir 発現
カセットに加えてACE1プロモーター下のACE1遺伝子のコ
ピーを含むプラスミドが導入されるとき、ヒルジンの最
大生産量を得る。プロモーター誘導のための硫酸銅の最
適濃度は、3 つまたはそれより多くのCUP1座のコピーを
含む株を使用したときよりも、はるかに低い。
変異体HV1 の生産 形質転換株サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae) Tr1456/pPFY56または株サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) Tr1456/pDP34/
GAPFL-YHIRの日常細胞貯蔵物を、50L 規模でのデスルフ
ァトヒルジンの生産のための接種源として使用する。日
常細胞貯蔵物のアンプルを、液体窒素コンテナ内のベー
パー相内に保存する。1 つのアンプルの含有物は、振と
うフラスコ培養の接種のために使用され、この振とうフ
ラスコは、 酵母ナイトロジェンベース 8.4 L-アスパラギン1 水塩 11.4 L-ヒスチジン 1.0 L-ロイシン 0.1 D-グルコース1 水塩 20.0 (g/L) から成る選択培地を含んで成る。上記500mL フラ
スコは、100mL の培地を含み、そして28℃で48時間、or
bital振とう機上で、180 回転/ 分の振とう速度にてイ
ンキュベートされる。
バッフルをもつ2Lフラスコ内に含まれる600mL の同じ培
地を含んで成る。第一予培養液からの接種レベルは、5%
(30mL)であり、そしてこのフラスコを、28℃で48時間、
orbital 振とう機上で、120回転/ 分の振とう速度にて
インキュベートする。第3 の前培養液を、4 つのバッフ
ル及び直径115mm のシングルディスクタービン攪拌翼を
備えた50L のステンレス鋼バイオリアクター内で発酵す
る。前記培地を、本培養のためにも使用し、出発液量
は、30L である。600mL の培養液を含むシングルの2Lフ
ラスコを、50L のバイオリアクターに接種するために使
用する(2.5%)。この発酵を、28℃の温度で48時間継続す
る。この攪拌速度は、600 回転/分、通気速度は、0.5vv
mであり、そしてリアクターを、0.3barの加圧を伴って
操作する。
た、同様の50L バイオリアクターを、デスルファトヒル
ジンの生産段階のために使用する。 肉ペプトン(Merck) 6.0 酵母エキス 37.5 硫酸アンモニウム 6.0 硫酸マグネシウム7 水塩 1.0 塩化ナトリウム 0.1 2 水素リン酸カリウム 4.0 (g/L) から成る培地を本段階で使用する。発酵の間に添
加されるグルコース1 水塩の溶液を補うために、24L に
減量される。第3 前培養段階からの接種レベルは、2.5%
である。この発酵を、28℃の温度で78時間継続し、この
攪拌速度は、900回転/ 分に設定する。加圧は、初期に
3.3barに設定し、そして48時間後、1.0barまで増加す
る。初期のエアー流量は、0.25vvm であるが、これを、
9 時間後0.5vvmに、24時間後0.75vvm に増加し、そして
終盤にはさらに、48時間後1.0vvmに増加する。発酵の経
過の間の加圧及び通気の増加を、適当な酸素供給を確保
し、そして20% の空気の飽和度よりも上の溶存酸素分圧
を維持するために行う。
溶解した10g の硫酸銅5 水塩を、CUP1プロモーターの制
御下にあるデスルファトヒルジンの発現を開始するため
に培養液に添加する。pH値は、発酵の前半部分の間、水
酸化アンモニウムの自動供給により維持されるところの
5.0 の値になる。増殖している酵母細胞によるエタノー
ルの過剰生産を回避するために、濃グルコース1 水塩溶
液(70%) を、60mL/ 時間の一定初期速度で供給する。18
時間後、5mL/時間から、発酵の終わりに360mL/時間の最
終値になるような率を伴い、供給速度を線型に増加す
る。この炭素源の限定供給( 供給- バッチ技術) は、単
純なバッチ培養により可能であるよりも、はるかに高い
最終バイオマス濃度及びデスルファトヒルジン濃度を支
持する。
要な時に泡を調節するために使用する。バイオリアクタ
ーからの出口ガスの一部を、酸素消費量及び二酸化炭素
発生速度についての情報を提供するために、オンライン
分析する。上記溶存酸素分圧も、滅菌適性Clark type電
極を使用してオンラン分析する。6 時間毎の間隔で、サ
ンプルを上記発酵物から取り出し、そして吸光度(OD)に
ついて測定し、そしてグルコース、エタノール、リン酸
塩及びマグネシウムについて分析する。デスルファトヒ
ルジン濃度を、HPLCにより観察する。発酵の終点に、分
泌デスルファトヒルジンを、培養上澄み液から回収す
る。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr14
56/pPFY56 の発酵濃度を、銅添加を伴わない、サッカロ
ミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456/pDP34/GAP
FL-YHIR の同一発酵と比較する。結果を表 7に示す。
ルジンの最終濃度だけでなく、デスルファトヒルジンの
比生産性を、構成的なGAPFL-YHIRシステムと比較して、
かなり改善する。
ヒルジン変異体HV1 の単離及び精製 酵母株Tr1456/pPFY56 を用いた50L 発酵( 例 17 を参照
のこと) の培養液からデスルファトヒルジンを単離す
る。逆相高速液体クロマトグラフィー及び分析的アニオ
ン交換クロマトグラフィーによる精製をモニタリングす
るイン- プロセスコントロールが実施される。得られた
データを、酵母株Tr1456/pDP34-GAPFL-YHir を用いた50
L 発酵の結果物と比較する。本発酵の終了後、pHを約3
に調整し、そして培養液を疎水性ポリマー樹脂にかけ
る。吸収されたデスルファトヒルジンをもつこの樹脂を
1MのNaCl溶液で洗浄し、そして酢酸アンモニウム緩衝液
で溶出する。蛋白活性を含む分画において、pH(pH3) 及
び誘導性を調整する。次ぎにデスルファトヒルジンを、
カチオン交換クロマトグラフィー(Macro-Prep S,Biora
d) を使用して、続く限外濾過により、さらに精製す
る。高分子量化合物及び着色不純物を取り除くために、
ゲル濾過を使用する。pHを5 に調整した後、デスルファ
トヒルジン含有分画を、アニオン交換樹脂(Macro-Prep
Q,Biorad) 上でクロマトグラフィーにかける。得られた
デスルファトヒルジン溶液を、逆相HPLC及びアニオン交
換クロマトグラフィーによる精製について分析する。プ
ラズマ発光分光法(plasma emission spectroscopy)を使
用して銅の含有量を測定する。
デスルファトヒルジンの生産が、あたかも株Tr1456/pDP
34-GAPFL-YHir を用いて生産されたような、HPLC及びFP
LCに関して少なくとも同質のデスルファトヒルジンの品
質を導くことを示している。銅誘導発酵において得られ
る、より高い濃度により、その下流のプロセシングのた
めの、デスルファトヒルジンの増加された収率を得る。
発酵培地への銅の添加は、その副産物のパターンにおい
て有意な変更を生じさせない。本データは、銅が、ppm
より低いレベルまで容易に取り除かれる得ることを示し
ている。
タン;7mMの MgCl 2 ;5mMのジチオトレイトール;100mMの
KCl;HCl でpH 7.5に) 中でのFspIにより、2 μg のpFBY
2 を完全に解裂する。制限エンドヌクレアーゼを、65℃
で10分間の加熱により不活性化する。水を添加すること
によりその容積を倍にし、そのDNA フラグメントを、0.
05mMのそれぞれのdATP、dCTP、dGTP及びdTTPの存在下、
37℃で30分間、T4ポリメラーゼの1 ユニットにより、平
滑末端とする。この酵素を、65℃で10分間の加熱により
不活性化する。エタノール沈殿の後、このDNA を、Hind
III 及びEcoRI により再び切断する。これらのフラグメ
ントを、TAE 緩衝液(40mMのトリス( ヒドロキシメチル)
アミノメタン;2mMのエチレンジアミンテトラ酢酸(2ナ
トリウム塩);酢酸でpH 7.6に) 中の2%LGT ゲル( 低ゲル
化温度のアガロース) 上で分離する。170 塩基対及び52
3 塩基対のフラグメントを切り出し、そしてDNA をElut
ipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。2 μ
g のpTZ18Rを、CA緩衝液中でEcoRI 及びHindIII により
完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中
の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.8k塩基対のバンドを切
り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィ
ーにより精製する。
ngを、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼによ
り、10pMの配列GGGATCCCのリン酸化されていないBamHI
リンカー及び1mM のATP 及び連結緩衝液と一緒に連結す
る。この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そ
してアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート(
水1 リッター当たり16g のトリプトン;10gの酵母エキ
ス;10gのNaCl) 上に置く。37℃で16時間のインキュベー
ション後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正しい
挿入物の存在を確認するためのEcoRI HindIII の二重処
理、及びその前のFspI部位内のBamHI リンカーを示すた
めのHindIII/BamHI の二重処理を使用して、ミニスクリ
ーニング(miniscreened)する。
より完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝
液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。701 塩基対のバンド
を切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラ
フィーにより精製する。2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中
でHindIII 及びPstIにより完全に解裂する。これらのフ
ラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離す
る。3.8k塩基対のフラグメントを切り出し、そのDNA を
ElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより精製する。
2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でPstI及びXbalI により
完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中
の0.8%LTG ゲル上で分離する。1.95k 塩基対のフラグメ
ントを切り出し、そのDNA をElutipD 商標登録クロマト
グラフィーにより精製する。
びEcoRI により完全に解裂する。これらのフラグメント
をTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.9k塩基
対のフラグメントを切り出し、そのDNA をElutipD 商標
登録クロマトグラフィーにより精製する。1mM のATP 及
び連結緩衝液の存在下、室温で3 時間、0.5 ユニットの
T4リガーゼにより、用意したフラグメントのそれぞれの
約20ngを共に連結する。この連結混合物を、40μl のコ
ンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換す
るために使用し、そしてアンピシリン、Xgal及びIPTGを
含む2YT プレート上に置く。37℃で16時間のインキュベ
ーション後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正し
い挿入物の存在を確認するためのEcoRI HindIII 及びPs
tI XbalIの二重処理、並びに新規のBamHI 部位の存在を
示すためのBamHI を使用して、ミニスクリーニング(min
iscreened)する。pFBY24は、プラスミドpTZ18R及び直接
的に繰替えされたFRT 部位により分割された2 μプラス
ミドの完全な配列をもつpFBY2 と同一である。但し、FL
P 遺伝子の3'末端のFspI部位にBamHI を挿入にてある。
裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LT
G ゲル上で分離する。2.0k塩基対のバンドを切り出し、
そのDNA をElutipD 商標登録クロマトグラフィーにより
精製する。2 μg のpFBY24を、CA緩衝液中でbamHI によ
り完全に解裂する。ベクターの自己連結を防止するため
に、65℃で30分間、BAP 緩衝液(50mM のトリス( ヒドロ
キシメチル) アミノメタン;50mM のNaCl;HClでpH8.0
に) 中の500 ユニットのBAPにより、5'のリン酸塩基を
取り除く。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%
LTG ゲル上で分離する。9.3k塩基対のバンドを切り出
し、そのDNA をElutipD商標登録クロマトグラフィーに
より精製する。1mM のATP 及び連結緩衝液の存在下、室
温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、用意し
たフラグメントのそれぞれの約20ngを共に連結する。こ
の連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.col
i)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そしてア
ンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上に置
く。37℃で16時間のインキュベーション後、白いコロニ
ーを拾い上げ、そしてその正しい挿入物の存在及び方向
を確認するためのBamHI 並びにSalI XbalIの二重処理を
使用して、ミニスクリーニング(miniscreened)する。pF
BY74は、酵母内でバクテリアの配列を失った2 ミクロン
のプラスミドを含んでいる対称なLEU2である。
築: 酵母内でバクテリアの配列を失い 、そしてCUP1p-ヒ
ルジン発現カセットを含む2 つの対称な2 ミクロン・ プ
ラスミド 2 μg のプラスミドpFBY4 を、EcoRI により解裂する。
得られたDNA-フラグメントを分析用0.8%アガロースゲル
上で分離し、切り出し、そしてElutipD 商標登録クロマ
トグラフィー(Schleicher und Schuell,Dassel,German
y)により精製する。このフラグメントを、0.05M のdAT
P、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在下、37℃で30
分間、引き続き、1 ユニットのT4ポリメラーゼにより平
滑末端とする。このポリメラーゼを、65℃で10分間、加
熱により不活性とする。室温で3 時間、0.5 ユニットの
T4リガーゼにより、0.4 ピコモルの配列GGTCGACCのリン
酸化されていないSalIリンカー及び1mM のATP と一緒
に、約30ngのフラグメントを連結する。この連結混合物
を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細
胞を形質転換するために使用し(Hanahan,D.:J.Mol.Bio
l.166(1983),557) 、そしてその細胞を、アンピシリン
を添加したLB培地上にプレーティングする。アンピシリ
ン耐性コロニーを拾い上げ、そしてその前のEcoRI 部位
内にSalIリンカーを示すためのSalIを用いてのそれらの
プラスミドDNA の切断による分析を行う。得られたプラ
スミドを、pMK2と呼ぶ。
の5'のリン酸塩基を、65℃で30分間、BAP-緩衝液中のBA
P(ウシ・アルカリ性ホスファターゼ) の500 ユニットに
より除去する。このフラグメントを分析用0.8%アガロー
スゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD 商標登録
クロマトグラフィー(Schleicher und Schuell,Dassel,G
ermany)により精製する。このフラグメントを、0.05M
のdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在下、37℃
で30分間、引き続き、1 ユニットのT4ポリメラーゼによ
り平滑末端とする。このポリメラーゼを、65℃で10分
間、加熱のより不活性とする。2 μg のpPFY53( 例 1を
参照のこと) をSalIにより解裂する。CUP1p-ヒルジン発
現カセットを含む1.3kb のフラグメントを、前記のよう
に、分析用0.8%アガロースゲル上で分離し、精製し、そ
してT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。この連結混
合物を、コンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を
形質転換するために使用し(Hanahan,D.:J.Mol.Biol.166
(1983),557) 、そしてその細胞を、アンピシリンを添加
したLB培地上にプレーティングする。アンピシリン耐性
コロニーを拾い上げ、そして正しい挿入物の存在を確認
するため、及び方向を決定するために、XbaIを用いて分
析する。生成されたプラスミドを、pMK3/1及びpMK3/2と
呼ぶ。pMK3/1は、URA3遺伝子と比べて同じ方向にあるCU
P1p-ヒルジン発現カセットを含むが、pMK3/2は、これと
逆方向にあるそれぞれの遺伝子を含む。
前記のように、BAP により、5'のリン酸塩基を取り除
き、そして得られたDNA-フラグメントを0.8%アガロース
ゲル及びElutipD 商標登録クロマトグラフィーを介して
精製する。2 μg のpMK3/2をSalIにより切断する。CUP1
p-ヒルジン発現カセット及びURA3を含む2.6kb のフラグ
メントを、前記のように、ゲルで精製し、そして平滑末
端とする。切断されたpFBY74及びpMK3/2フラグメントの
それぞれ約20ngを共に連結し、そして前記のように、コ
ンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞に形質転換す
る。正しい挿入物を確認するため、及び方向を決定する
ために、SalI及びNcoIによりそれらのプラスミドDNA を
切断して、アンピシリン耐性コロニーを分析する。2 つ
のプラスミドが得られ、pMK5x1及びpMK5x2と呼ぶ。これ
らの2 つのプラスミドの違いは、そのLEU2遺伝子と比べ
て、前者においては、CUP1p-ヒルジン発現カセットが逆
であるのに、後者においては、同じ方向をもつというこ
とである。
の2 つの1 倍体株の接合を介して生まれる。1 倍体株TR
1456の相同遺伝子の2 倍体変異体、接合型 a(例 5を参
照のこと) 、を得るためにTr1456の反対の接合型を、接
合型のスイッチングを介して操作しなければならない。
この方法の背景及び原理は、herskowitzand jensen(199
1),Methods in Enzymology,Vol.194,p.132-146 に概説
されている。GAL10 プロモーターの制御下のHOエンドヌ
クレアーゼ遺伝子、URA3マーカー及びCEN4ファンクショ
ンを含むプラスミドpGAL-HO により、株TR1456を形質転
換する(Herskowitz and Jensen(1991),Methods in Enzy
mology,Vol.194,p.132-146)。ロイシンを補いそしてウ
ラシルを欠いた酵母最小培地上での形質転換及び選択
を、例 5に記載したように実施する。単一の形質転換酵
母クローンを単離し、そして、 Difco 酵母ナイトロジェンベース w/o アミノ酸 8.4 L-アスパラギン 10 L-ヒスチジン 1 L-ロイシン 0.1 グルコース 20 (g/l) から成る20mlの合成培地中で1 つのクローンを増
殖させる。
う。引き続き培養液を、前記の培地であるが0.25% のグ
ルコースしか含まないものの中で、20倍希釈する。この
培養液を、再び30℃及び180rpmでインキュベートし、そ
してグルコース消費量を、グルコース・テスター・ステ
ィク(Diabur-Test 500商標登録,Boehringer Mannheim)
を使用してモニターする。グルコースを使い尽くと直ち
に、GAL10 プロモーターを誘導するために、2%の最終濃
度までガラクトースをフラスコに添加する。30℃及び18
0rpmで7 時間インキュベートした後、培養液1ml を取り
出し、そしてその細胞を洗浄し、例 7に記載した複合培
地の10mlに再懸濁し、さらに30℃及び180rpmで4 時間イ
ンキュベートする。次にその細胞のサンプルを取り出
し、水で希釈し、そして、以下の複合培地(g/l): Bacto 酵母エキス 20 Bacto ペプトン 10 Bacto 寒天 20 グルコース 20 上に、プレート当たり約200 細胞の濃度でプレーティン
グする。コロニーが約2mm の大きさになるまで、30℃で
2 日間、上記プレートをインキュベートする。
の標準的な検定('ハロー検定')により、細胞の型( a,
αまたは a/ α) についてテストする。使用した手順
は、Sprague(1991),Methods in Enzymology,Vol.194,p.
77-93 により、広範囲にわたって記載されている。α-
接合型を示す8 つのコロニーを拾い上げ、そしてそれぞ
れを、以下の複合培地(g/l): Bacto ペプトン 20 Bacto 酵母エキス 10 グルコース 20 の5ml に接種する。30 ℃で16時間、そして180rpmで細
胞を増殖させる。細胞のサンプルを取り出し、水で希釈
し、そして前記のように、複合培地上に、プレート当た
り約200 細胞の濃度でプレーティングする。コロニーが
約2mm の大きさになるまで、30℃で2 日間、上記プレー
トをインキュベートする。これらのコロニーを、ハロ検
定を使用して、α- 接合型についてテストする。付随し
て、例 5に記載したように、ロイシンを補いそしてウラ
シルを欠いた最小培地上でこのコロニーを複製する。pG
AL-HO プラスミドを欠いているコロニーは、この培地上
では増殖できない、なぜならば、それらは、URA3マーカ
ーを欠いているからである。繰り返しα- 接合型を示
し、そして上記のpGAL-HO プラスミドを欠いている1つ
のコロニーを、拾い上げ、複合培地上に再び塗布(restr
eaked)する。この株は、同一遺伝子の、TR1456の反対の
α- 接合型を表し、そしてGPY110と呼ばれる。
ての2 倍体の形成 株TR1456及び株GPY11 の斑点(patch) を、 Bacto ペプトン 20 Bacto 酵母エキス 10 グルコース 20 Bacto 寒天 10 (g/l) から成るYPD プレート上で、爪楊枝により注意深
く混合する。上記のプレートを、細胞が接合することを
可能にするために、室温でインキュベートする。約12時
間後、この接合混合物の接種物を、水で希釈し、そして
その一部分を、一本線としてYPD プレートに塗布する。
Leitz 顕微鏡( 倍率250 倍)と組み合わせたCIT Alcatel
Micromanipulatorを使用して、このプレートを、マイ
クロマニピュレーションに供する。接合体は、それらの
特徴的な形により、顕微鏡により簡単に検出できる。10
〜20の潜在的な接合体を、YPD プレート上でその接合混
合物から分離する。次に、このプレートを、接合体がコ
ロニーを形成するまで、2 〜3 日間、室温でインキュベ
ートする。この接合体の2 倍体の状態を、前記のような
接合フェロモンの生産に関する' ハロ検定' を行うこと
により確認する。2 倍体の細胞は、α- 因子または a-
因子のどちらも分泌しない。1 つの確認された2 倍体の
コロニーを選び、そしてGPY18 と呼ぶ。これは、株TR14
56の同一遺伝子の2 倍体の変異体である。
増殖する、プラスミドpPFY56またはpM K5x2で形質転換さ
れた株TR1456及びGPY18 によるデスルファトヒルジンの
生産 例 5に記載されたように、株TR1456及びGPY18 の細胞
を、それぞれ、プラスミドpPFY56( 例 1) 及びpMK5x2に
より形質転換する。株TR1456/pPFY56 、TR1456/pMK5x2
、GPY18/pPFY56及びGPY18/pMK5x2を、それぞれ、28℃
で72時間そして250rpmで、前培養液(10ml;例 23 に組成
を記載した)中で増殖させる。主培養の培地(50ml)を例
7に記載した。但し、硫酸銅を、1mMの濃度まで添加す
る。主培養液を、0.1 の吸光度600 での予培養液からの
細胞により接種する。この培養を、28℃で72時間、そし
て250rpmで行う。発酵の後、細胞を、遠心分離により取
り出し、そして上澄み液中のデスルファトヒルジン量
を、EP-A-340 170に開示したようにHPLCにより測定す
る。結果を表 8に要約する。
その1 倍体の親株TR1456に比べて、より高いヒルジン濃
度を示した。プラスミドpMK5x2による形質転換は、プラ
スミドpPFY56に比べて、その1 倍体またはその2 倍体の
いずれにおいても、より高いヒルジン濃度を導く。
ganismen(DSM),Mascheroder Weg 1b,D-3300 Braunschwe
igに寄託した( その寄託番号及び寄託日を以下に示す)
。 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)H449 DSM 4413 1988 年 2月18日 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 DSM 7190 1992 年 7月22日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY2 DSM 6271 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY4 DSM 6272 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY5 DSM 6273 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY29 DSM 6275 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) JM109/pDP34 DSM 4473 1988 年 3月14日
#1.25(EPO) (vi)先行出願データ: (A) 出願番号:EP 92810681.4 (B) 提出日:1992 年7 月4 日
= "HV1" 配列の特徴 特徴を表す記号 : terminator 存在位置 : 691..1068 他の情報 :標準名= "PHO5 転写ターミネーター" 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1069..1082 他の情報 :機能= "salI リンカー" 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 442..690 他の情報 :製品= " 一次転写物" 配列 GGATCCCCAT TACCGACATT TGGGCGCTAT ACGTGCATAT GTTCATGTAT GTATCTGTAT 60 TTAAAACACT TTTGTATTAT TTTTCCTCAT ATATGTGTAT AGGTTTATAC GGATGATTTA 120 ATTATTACTT CACCACCCTT TATTTCAGGC TGATATCTTA GCCTTGTTAC TAGTTAGAAA 180 AAGACATTTT TGCTGTCAGT CACTGTCAAG AGATTCTTTT GCTGGCATTT CTTCTAGAAG 240 CAAAAAGAGC GATGCGTCTT TTCCGCTGAA CCGTTCCAGC AAAAAAGACT ACCAACGCAA 300 TATGGATTGT CAGAATCATA TAAAAGAGAA GCAAATAACT CCTTGTCTTG TATCAATTGC 360 ATTATAATAT CTTCTTGTTA GTGCAATATC ATATAGAAGT CATCGAAATA GATATTAAGA 420 AAAACAAACT GTGAATTCAA A ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA 471 Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu -17 -15 -10 GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA TCT 519 Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser -5 1 5 GGT CAA AAC TTG TGT TTG TGT GAA GGT TCT AAC GTT TGT GGT CAA GGT 567 Gly Glu Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly 10 15 20 25 AAC AAG TGT ATC TTG GGT TCT GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTT ACC 615 Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr 30 35 40 GGT GAA GGT ACC CCA AAG CCA CAA TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA 663 Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu 45 50 55 GAA ATC CCA GAA GAA TAC TTG CAA TAGGATCCTG GTACGTTCCT CAAGGTGCTC 717 Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln 60 65 GTGTCTACAC CGAAAAATTC CAATGTTCTA ACGACACCTA CGTCAGATAC GTCATTAACG 777 ATGCTGTTGT TCCAATTGAA ACCTGTTCCA CTGGTCCAGG GTTCTCTTGT GAAATCAATG 837 ACTTCTACGA CTATGCTGAA AAGAGAGTAG CCGGTACTGA CTTCCTAAAG GTCTGTAACG 897 TCAGCAGCGT CAGTAACTCT ACTGAATTGA CCTTCTACTG GGACTGGAAC ACTACTCATT 957 ACAACGCCAG TCTATTGAGA CAATAGTTTT GTATAACTAA ATAATATTGG AAACTAAATA 1017 CGAATACCCA AATTTTTTAT CTAAATTTTG CCGAAAGATT AAAATCTGCA GCCAAGCTGG 1077 TCGAC 1082
る。
る。
る。
る。
Claims (24)
- 【請求項1】 デスルファトヒルジンの生産方法であっ
て、デスルファトヒルジンをコードする第二DNA 配列に
正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペ
プチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連
結されている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終
止シグナルを含むDNA 配列から成るデスルファトヒルジ
ン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベクターを宿す
酵母株を複合培養培地内で培養すること、並びに、生産
されたデスルファトヒルジンをその培養液から単離する
ことを含んで成り、ちょうど接種の時に、培養培地に、
CUP1プロモーターを誘導する量の銅塩を供給するような
生産方法。 - 【請求項2】 上記のデスルファトヒルジンが、デスル
ファトヒルジン変異体HV1 、HV2 、HV3 及びこれらのデ
スルファトヒルジン変異体のいずれかの誘導体から成る
群から選ばれている、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 デスルファトヒルジン変異体HV1 を生産
するための、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 上記の酵母株が、サッカロミセス・セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項5】 上記の酵母株が、サッカロミセス・セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のcir 0 株である、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 上記の酵母株が、1つのまたは多数のプ
ロテアーゼ- 欠損性である、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 上記の酵母株が、カルボキシペプチダー
ゼysc α及びyscYの活性において、欠損している、請求
項6に記載の方法。 - 【請求項8】 上記の酵母株が、0 〜16、特に2 〜6 コ
ピーの、その染色体CUP1遺伝子を含む、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項9】 上記の酵母株が、1 〜3 の追加のコピー
の染色体ACE1遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 上記の酵母株が、2 より大きいまたは
2 に等しい倍数性をもつ、請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 上記の酵母株が、2 倍体である、請求
項10に記載の方法。 - 【請求項12】 デスルファトヒルジンをコードする第
二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母
のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可
能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び
酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスル
ファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベ
クター。 - 【請求項13】 上記のCUP1プロモーターが、配列番号
1 で表される、0.4kB のBamHI-EcoRI フラグメントであ
る、請求項12に記載の酵母発現ベクター。 - 【請求項14】 シグナルペプチドをコードするDNA 配
列が、上記酵母のインベルターゼ、α- 因子、フェロモ
ンペプチダーゼ(KEX1)、" キラー毒素" 及び抑制性酸性
ホスファターゼ(PHO5)の遺伝子のシグナル及びプレプロ
配列、並びにアスペルギルス・アワモリ( Aspergillus
awamori)からのグルコアミラーゼのシグナル配列から成
るグループから選ばれている、請求項12に記載の酵母
発現ベクター。 - 【請求項15】 シグナルペプチドをコードする上記の
DNA 配列が、上記酵母のインベルターゼ及びPHO5の遺伝
子のシグナル配列から成るグループから選ばれている、
請求項12に記載の酵母発現ベクター。 - 【請求項16】 酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配
列が、転写終止及びポリアデニレーションのための正し
いシグナルを含む酵母遺伝子の3'フランキング配列であ
る、請求項12に記載の酵母発現ベクター。 - 【請求項17】 完全な2 ミクロンのDNA を含む、請求
項12に記載の酵母発現ベクター。 - 【請求項18】 1 〜3 の追加のデスルファトヒルジン
の発現カセットを含んで成る、請求項12に記載の酵母
発現ベクター。 - 【請求項19】 1 つの追加の転写活性化物質ACE1発現
カセットを含んで成る、請求項12に記載の酵母発現ベ
クター。 - 【請求項20】 対称性を示し、そしてバクテリアの配
列を欠いている、請求項12に記載の酵母発現ベクタ
ー。 - 【請求項21】 デスルファトヒルジンをコードする第
二DNA 配列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母
のシグナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可
能な状態で連結されている酵母CUP1プロモーター、及び
酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配列から成るデスル
ファトヒルジン発現カセットを、含んで成る酵母発現ベ
クターを宿している酵母株。 - 【請求項22】 請求項12に記載の酵母発現ベクター
を宿している、請求項21に記載の酵母株。 - 【請求項23】 倍数性が、2 より大きい、または2 に
等しい、請求項21に記載の酵母株。 - 【請求項24】 2 倍体である、請求項23に記載の酵
母株。
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