PT88556B - Processo de integracao genomica estavel e de expressao de uma sequencia de cadificacao estranha, em leveduras - Google Patents
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Description
MEMORIA DESCRITIVA
ANTECEDENTES DO INVENTO presente invento refere-se a um processo para efectuar a transposição mediada pela transcriptase inversa em cromossomas de leveduras hospedeiras usando um vector baseado em Ty contendo uma sequência de codificação estranha controlada por um promotor de leveduras patente.
Boeke et al., Cell. 40, 491-500 (1985) desenvolveram um e_n saio eficaz para a transposição de Tyl envolvendo um elemento fun cional Tyl. Inclui-se um elemento Tyl controlado pelo promotor GALI (TyH3) num plasmídeo URA3 de 2 micra de cópias múltiplas, e a transposição é induzida quando se efectua □ crescimento das cêlulas em galactose como fonte de carbono, a baixa temperatura. Além disso, uma sequência de ADN curta (isto ê, um fragmento lacO de 40 pb) foi inserida numa região não essencial de Tyl (próximo do LTR 3') sem inibir significativamente a transposição.
Boeke et al., Cell, 40, 491-500 (1985) descrevem um sistema para α estudo da transposição de Tyl em que um elemento Tyl qe neticamente marcado (isto ê, um elemento Tyl contendo um segmento lacO) é fundido com o promotor de leveduras controlável GALI, e aquando da indução pela galactose, a frequência de transposição, tanto do elemento marcada como dos elementos Tyl genómicos, aumejn ta drasticamente. Boeke et al. descrevem também que um intrão (o intrão do gene 51 da proteína ribossómica de leveduras, de 398 nucleótidos^ rp 5l) implantado no doador Tyl é correctamente cortado do elemento Tyl durante a transposição, provando que o ARN de Tyl ê o intermediário na transposição. Mais ainda, Boeke et al. concluem que o movimento dos polimorfismos das sequências entre os LTRs que ocorrem durante a transposição segue o modelo da transcrição inversa dos retrovirus. Boeke et al. não fazem quaisquer observaçães ou sugestões em relação à transcrição do elemento Tyl geneticamente marcada.
Garfinkel et al., Cell, 42, 507-517 (1985) descrevem que uma actividade de transcriptase inversa codificada por Tyl se encontra efectivamente presente em células induzidas por transposi68 163
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-3ção, que contêm um plasmídeo que possui um elemento Tyl (TyH3) contendo um segmento lacO sob o controlo do promotor GAL1.
Boeke et al., Décima Segunda Conferência Internacional em Genética de Leveduras e Biologia Molecular, Edimburgo, Escócia, Setembro 17-21, 1984, descrevem fusões de genes em vectores de 2 micra (pGTyl73 e pGTyH3) em que os elementos do promotor GAL1 promovem a transcrição de dois elementos Ty diferentes, Tyl73 (um elemento Ty isolado como uma mutação knock-out no gene LYS2) e TyH3 (um elemento Ty isolado como um revertente (revertant) de his 3Δ4 (uma delecção do promotor). Boeck et al. descrevem também que células transformadas com pGTyH3 e pGTyl73 crescem normalmente num meio contendo glucose mas, quando o promotor GALl é induzido, o crescimento é ligeiramente inibido por pGTyl73 e fortemente ini bido com pGTyH3. Boeke et al. descrevem também uma mutação de in serção do plasmídeo pGTyH3 em que o gene Kmr de Tn903 foi inserido em dois pontos correspondentes às estruturas de leitura aberta do elemento Ty. Boeke etal. não fazem quaisquer observações ou sugestões em relação à a) transposição de pGTyH3, pGTyl73 ou dos plasmídeos mutantes de inserção interna pGTyH3 ou b) transcrição do gene Kmr por células transformadas com o plasmídeo mutante de inserção interna pGTyH3.
Foi agora descoberto que utilizando um sistema de vectores compreendendo um elemento Tyl ou Ty2 modificado de 5, cerevisiae podem ser induzidas a transposição mediada pela transcriptase inversa e a integração estável de uma sequência de codificação estranha, controlada por promotores de leveduras apropriados, nos cromossomas das leveduras. Esses elementos Tyl ou Ty2 modificados que contêm cassetes de expressão possuindo um potente promotor de leveduras, e um gene estranho de interesse (por exemplo pARG3-GALK ou pCUPl-GALK) possuindo tamanhos tão grandes como 2 kilobases (kb) podem ser transpostos com relativa facilidade e eficiência.
De facto, podem obter-se, por genoma, vários casos de transposição numa sé experiência (como observado por análise após indução da transposição). Podem obter-se números de cópias de vectores integrados mais elevados após ciclos de transposição múltiplos.
As cópias são integradas e disseminadas de forma estável (não re68 163
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-4petidas em tandem) nos cromossomas, permitindo um crescimento extenso do hospedeiro na ausência de pressão selectiva. Por outro lado, é importante notar que esses vectores integrados estão distribuídos homogeneamente na população de células enquanto que os plasmídeos têm usualmente tendência para a segregação. Assim, o método do presente invento permite a síntese do produto da sequêjn cia de codificação estranha, de interesse, num nível bem definido e com a mesma eficiência para cada célula da população. 0 proces. so deste invento pode também permitir a introdução da cassete de expressão, com um número de cópias elevado, no genóma, uma vez que a maioria das sequências genémicas de S. cerevisiae não são essenciais em condições de crescimento clássicas.
SUivÁríC do invento presente invento refere-se a um vector compreendendo um promotor, preferivelmente um promotor indutível, ligado operativa, mente a um elemento Tyl ou Ty2 funcional, em que esse elemento Tyl ou Ty2 compreende uma cassete de expressão contendo um promotor ds leveduras potente ligado operativamente a uma sequência de codificação estranha.
presente invento refere-se ainda a uma célula de levedura hospedeira, preferivelmente S. cerevisiae, transformada com esse vector; e este invento refere-se também a um processo para efectuar a integração genómica estável e a expressão da sequência de codificação estranha, processo esse que compreende a cultura dessa célula de levedura hospedeira transformada, preferivelmente 5. cerevisiae, sob condições que permitam a funcionalidade do pro, motor potente de leveduras.
Com o termo cassete de expressão pretende significar-se qualquer região discreta de ADN que funciona em leveduras como uma unidade de expressão de genes completa. Com o termo unidade de expressão de genes completa pretende-se significar uia gene es. trutural e o promotor e regiões reguladoras requeridos para a sua transcrição e tradução.
Com o termo promotor pretende-se significar qualquer região a montante de uma sequência de codificação de um gene estruI
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tural que permite que se dê a ligação da ARN polimerase e a trarts criçao da sequência de codificação. Por região reguladora signa, fica-se qualquer região que regula a transcrição do gene. Por gene estrutural significa-se uma sequência de codificação que serve como molde para a síntese de ARN e que permite a síntese da proteína de interesse em leveduras.
Pele termo promotor indutível significa-se um promotor que seja funcional numa célula de levedura hospedeira, como 5. cerevisiae , e cuja actividade seja controlada por um sinal ou condi, ção externa, por exemplo variação de temperatura, presença ou ausência de um nutriente, etc..
Com o termo elemento Tyl ou Ty2 funcional significa-se qualquer derivado de um elemento Tyl ou Ty2 de ocorrência natural, que compreenda um promotor de leveduras potente ligado operativamente a uma sequência de codificação de um gene estranho e retenha ainda a sus capacidade para ser transposto para o genóma de uma célula de levedura hospedeira, como S. cerevisiae, transforma da com esse elemento.
Com o termo ligado operativamente significa-se que um promotor e uma sequência de codificação se encontram fundidos de tal forma que permitam a transcrição e a tradução da sequência de codificação.
Com o termo promotor de leveduras potente significa-se um promotor que seja funcional numa célula de levedura hospedeira, como S. cerevisiae, e que permita a produção de níveis de expressão elevados de proteínas heterólogas em leveduras.
Com o termo sequência de codificação estranha significa-se uma sequência de codificação que não ocorra naturalmente no genóma da célula de levedura hospedeira.
Com o termo transposição significa-se a inserção não homóloga, mediada pela transcriptase inversa, do elemento Tyl ou Ty2 funcional do vector do presente invento, nos cromossomas de célula de levedura hospedeira, num local não ocupado por um elemento Ty previamente existente. 0 mecanismo pelo qual a transposição ocorre efectivamente encontra-se descrito em maior detalhe fí
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-6por Boeke et al., Csll, 40, 491-500 (1985).
Com o termo ocorrência de transposição significa-se a transcrição completa do elemento Tyl ou Ty2 funcional do vector do presente invento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura l(a) apresenta o gene estrutural GALK de E. coli adaptado, utilizado na construção das cassetes de expressão de GALK usadas nos vsctores descritos nos Exemplos. Este GALK contém uma região de terminal amino modificada mas codifica para uma galactoquinase activa.
A figura l(b) apresenta as regiões 5’ dos genes CARI (arg_i nase), ARG3 (ornitina transcarbamilase) e CUP1 (metalotioneína).
Cada região 5' contém um sítio BamHI após o ATG, permitindo assim a associação funcional com GALK.
A figura l(c) apresenta a associação das regiões promotoras de CARI, ARG3 e CUP1 com a sequência de codificação de GALK usando sítios BamHI para criar as cassetes de expressão.
A figura 2(a), Parte A, apresenta a organização de p3efl267 que contém uma construção pGALl-Tyl.
A figura 2(a), Parte B, apresenta a organização de pRIT12938, pRIT12946 e pRITl2945 que são derivados de p0efl267 e que contém cassetes de expressão compreendendo o promotor GALK de CARI (pRIT12938), o promotor GALK de ARG3 (pRIT12946) e o promotor GALK de CUP1 (pRITl2945) introduzidos no sitio de restrição Saci de p0efl267.
A figura 2(b) apresenta a estrutura das construções pGALl-Tyl contendo as cassetes de expressão de GALK descritas nos Exem pios. As setas representam as orientações dos transcritos Ty e GALK.
DESCRIÇÃO DETALHADA DD INVENTO
Os elementos Ty são uma família dos elementos transponíveis, de ocorrência natural, da levedura Saccharomyces cerevisiae que são estruturalmente semelhantes aos próvirus retrovirais e à família de elementos cópia da Drosophila. Para uma revisão deta68 163
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|l;
-7lhada destes elementos Ty, veja-se, por exemplo, Mellor et al., Yeast, 2, 145-152 (1986). Estes elementos Ty podem ser isolados de uma estirpe de S, cerevisiae por técnicas conhecidas. Existem diversas estirpes disponíveis de S. cerevisiae em depósitos públicos, por exemplo, o American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. 0 número e distribuição destes elementos varia de estirpe para estirpe. Estes elementos possuem um compri. mento aproximado de 5,9 kilobases (kb). Sequências delta terminalmente repetidas ou repetições directas de terminais longos (LTRS) com aproximadamente 335 pares de bases (pb) rodeiam uma re gião interna de 5,3 kb. Os elementos Ty são transcritos de LTR para LTR formando um ARN que ê terminalmente redundante para 45 nucleõtidos. Esta estrutura é idêntica à estrutura global do ARN genómico retroviral. Os elementos Ty contêm uma sequência que po, de servir como um sitio indutor de ligação de ARNt, adjacente a 5’ de LTR e uma região oligo-purina que pode induzir a síntese da segunda cadeia, adjacente a 3' de LTR. Mais ainda, a organização funcional dos elementos Ty é semelhante à organização da região gag-pol dos retrovírus. Nos elementos Ty existem duas estruturas de leitura aberta sobrepostas; isto á, tya, que é provavelmente equivalente ao gene gag retroviral e especifica uma proteína com homologia com as proteínas de ligação de ADN; e tyb, que codifica para uma proteína com homologia para as regiões de protease, integrase e transcriptass inversa do gene pol retroviral. 0 produto genético de tyb, pensa-se ser sintetizado como uma proteína de fusão tya-tyb resultando de um desvio de estrutura especifico na terminação de tya que põe tyb em estrutura com tya. Existem duas classes de elementos Ty, isto é, Tyl e Ty2, que diferem essencialmente em duas grandes substituições internas. A construção dos vectores de expressão, baseados em Tyl ou Ty2 eficazes do presente invento requer a utilização de promotores de leveduras potentes que não contêm elementos do tipo terminador de transcrição nem quaisquer outras sequências que pudessem proibir a ocorrência da transcrição completa de forma a que não hajam interferências com a síntese do ARN comprido que é necessário para a transposição destas construções (Figura la). De facto, num siste. ma deste tipo o ARN comprido que é produzido quando o promotor i_n
Ι*’.....'.....
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-8dutível ê induzido, é utilizado como ARNm na síntese de maquinaria de transposição e é também o molde no processo de transposição.
presente inuento refere-se a um vector compreendendo um promotor ligado operativamente a um elemento Tyl ou Ty2 funcional, no qual este elemento Tyl ou Ty2 compreende uma cassete de expres. são contendo um promotor de leveduras potente, ligado operativamente a uma sequência de codificação estranha. Este vector pode ser construído por métodos convencionais bem conhecidos na especija lidade. Preferivelmente, emprega-se um elemento Tyl para constru. ir esse vector, e tal elemento Tyl empregue é derivado de TyH3 que se encontra descrito em detalhe em Boeke et al., Cell, 40, 491-500 (1985). Como referido acima, o vector do presente invento compre ende um promotor ligado operativamente a um elemento Tyl ou Ty2 funcional. Pode empregar-se qualquer vector indutível ou não indutível que seja funcional na célula de levedura hospedeira na qual o vector será transformado. Preferivelmente, o vector é indutível. Da mesma forma, preferivelmente, o promotor empregue é o promotor GAL1 descrito na Patente dos Estados Unidos 4 661 454 depositada em 28 de Abril de 1987. Como referido acima, o elemeji to Tyl ou Ty2 funcional do vector do presente invento compreende uma cassete de expressão contendo um promotor de levedura potente ligado operativamente a uma sequência de codificação estranha. Po. de empregar-se qualquer promotor de leveduras potente, quer indutível quer não indutível, que seja funcional na célula de levedura hospedeira na qual o vector será transformado, desde que esse promotor permita a ocorrência de transcrição completa da sequência de codificação estranha. Preferivelmente o promotor de levedura potente pertence ao gene ARG3 de S, cerevisiae ou ao gene CUP1 de 5. cerevisiae. Pode empregar-se qualquer sequência de co dificação estranha que possa ser transcrita e traduzida na célula de levedura hospedeira para produzir uma proteína com actividade biológica. Preferivelmente, essa proteína possui actividade biológica terapêutica.
Este invento refere-se também a uma célula de levedura hos. pedeira transformada com o vector deste invento. Esta transforma
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-9ção pode ser conseguida por técnicas convencionais, como o método de Ito et al., 3. Bacteriol. , 153, 163-168 (1983). Preferivelmeji te, a célula de levedura hospedeira pertence ao género Saccharomyces , mais preferivelmente pertence à espécie S. cerevisiae.
Este invento refere-se também a um processo para efectuar a integração gsnómica estável e a expressão de uma sequência de codificação estranha, processo esse que compreende a cultura do hospedeiro transformado do presente invento em condições tais que permitam que o promotor potente de leveduras compreendido pelo vector actue. Por exemplo, se o promotor de leveduras potente em pregue for um promotor indutível, como GAL1, a célula de levedura hospedeira Aeverá ser cultivada num meio contendo galactose suficiente para permitir a indução do promotor GAL1. Da mesma forma, se o promotor de leveduras potente empregue for o promotor ARG3 de 3. cerevisiae, o meio de cultura empregue deverá conter NH4T suficiente para permitir a indução do promotor ARG3.
Todas as sequências de promotores de leveduras potentes não estão isentos dos elementos do tipo terminador ou de outras sequêri cias que proíbem a transcrição completa, tais como sequências que interaetuam com as proteínas reguladoras. Por exemplo, a região promotora URA3 contém um terminador bidireccional potente(entre as bases 45 e 155 a montante do primeiro ATG). Veja-se Yarger et al., foi. Cell. Biol., 6, 1095 (1986). No caso do promotor CARI, a região 5' de CARI descrita nos Exemplos, pode dar-se a ocorrência ds uma ou algumas destas interferências possíveis.
Nos Exemplos que se seguem, descrevem-se completamente cori cretizações específicas do invento. Os Exemplos pretendem ser ilustrativos do presente invento e não deverão ser entendidos como limitativos do âmbito do invento.
EXEMPLOS
MATERIAIS E PROCESSOS
a. Estirpes e plasmídeos
- Utilizaram-se duas estirpes de S. cerevisiae nos Exemplos; GRF167 (his3 Δ200, ura3-167 e 3UG2-1D (trpl ura 3 gall δ) |pr
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-10- 0 plasmídeo p0ef724 ê idêntico a pGTyH3, descrito previamejn te. Veja-se, Boeke et ai., Csll, 40, 491-500 (1985). p0efl267 é derivado de p0ef724 (introdução de um sítio Saci em lugar do sítio BglII de Tyl 3’). p0sf724 ê um plasmídeo baseado em Ty com 2 micrcn. Todos os plasmídeos baseados em Ty usados nas experiênci as de transposição descritas nestes Exemplos são derivados de p3ef!267 no qual são introduzidas sequências de codificação de ADN estranhas (cassetes GALK) no sítio de restrição Saci, como descrito em detalhe, infra. As cassetes de expressão de GALK foram também introduzidas num plasmídeo de baixo número de cópias VCp50. Veja-se Dohnstcn e Davis, Mol. Cell. Biol., 4-, 1440 (1984). Transferiram-se fragmentos HindIII-Ncol (tratados com polimerase de T4) ds pRIT12938, pRITl2945 e pRIT12946 para o plasmídeo YCp5O digerido por HindiΠ-BamHI (tratado com polimerase de T4). Veja-se Figura 2a. XYI2 é um derivado de PFL1 (Chevallier et al.,
Gene, 11 , 11-19 (1980) e contém a cassete de expressão de pARG3-GALK com a sequência de terminação de transcrição do gene ARG3.
b. Meio de cultura
Utilizam-se meios ricos em YEPD (2$, cada, de extracto de levedura, peptona, glucose ou galactose) e meios mínimos YNB (0,67'j de base azotada de leveduras sem aminoácidos, com ou sem sulfato de amónio) para crescimento das estirpes de S. cerevisiae.
YNS sem sulfato de amónio foi suplementado com arginina, 1 mg/ /ml, como única fonte de azoto. Os meios YNB foram suplementados com 2zo de glucose ou 2$ de galactose como únicas fontes de azoto.
Descreve-se, em Boeke et al., (Mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984)) um meio contendo ácido fluoroorótico.
c. Transformação
A transformação de E. coli com o ADN plasmídico foi efectua da de acordo com Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 69, 2110-2114 (1972). A transformação das leveduras foi efectuada co. mo descritc por Ito et al., 0. Sacteriol., 153, 163-168 (1983).
d. Análise das sequências de ADN qenómico de S. cerevisiae (l) 0 ADN gersómico total de S. cerevisiae foi isolado de acordo com Davis et al,, Methods in Enzymoloqy, 65, 404-411 (1980)
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-11com alterações insignificantes. Efectuaram-se as restrições de ADN, electroforese e análise de manchas Southern, de acordo com o descrito em Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
(2) Utiliza-se um fragmento de ADN de GALK com 1,1 kb para a detecção das cassetes de expressão transpostas. Veja-se Figura l(a), l(b) e l(c). Utiliza-se um fragmento específico de ADN de Tyl com 420 pb para a análise da transposição do Tyl residente (BglII-EcoRi). 0 fragmento de ADN de CARI Xmnl-BamHI com
850 pb ê utilizado como controlo para as digestões totais do ADN genómico em análises de manchas Southern (análise de ADN das estirpes possuindo cassetes pARG3-GALK ou pCUPl-GALK integradas no seu genoma).
e. Determinação de actividades especificas de galactoquinase
As actividades enzimáticas específicas da galactoquinase (GALK) foram medidas como descrito em Rymond et al., Gene, 25, 249-262 (1983) e normalizadas para os níveis totais de proteína, quantificados pelo método de Folin de Lomry et al«, 3. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951).
f. Experiências da transposição (vejam-se também as Figuras 2a e
2b)
Usando o plasmídeo p3ef724 (ou os derivados descritos infra) a transposição foi efectuada como se segues (1) transformação da estirpe de S. cerevisiae recipiente (comple mentação de mutação ura3) em meio YNB com 2% de glucose a 30SC.
(2) Purificação dos transformados (colónias isoladas).
(3) Indução da transposição. As células são deixadas crescer djj rante 5 dias, a 222C, em meio YNB com 2% de galactose.
(4) Selecção das colónias ura3 (estirpes que tenham perdido 0 plasmídeo em meio contendo ácido fluoroorático).
(5) Purificação das estirpes ura3 (colónias isoladas em meio YEPD).
(6) Pesquisa de estirpes ura3 que crescem em galactose como fonte de carbono, se a estirpe recipiente for gall (3WG2-1D). Análise
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-12do ADN genómico total por hibridação com uma sonda de ADN específica para GALK.
3. Construção dos vectores do presente invento e resultados das experiências de transposição
Pode preparar-se um vector do presente invento como um derivado da construção pGTyH3 (p3ef724) descrita em Boeke et al♦,
Cell, 40, 491-500 (1985), a qual ê aqui incorporada como referência. Por exemplo, em pGTyH3, um promotor de leveduras potente, como g promotor GAL1, substitui a região U3 do LTR 5' de Tyl, de tal forma que a síntese de transcritos Tyl funcionais ê controlada por indução pela galactose. Em cada vector do presente invento, a sequência de codificação estranha é inserida numa região de Tyl não essencial, de forma que o elemento Tyl permaneça funcional. Por exemplo, uma sequência sintética de ADN contendo o sitio de restrição Saci foi primeiro introduzida por meios convencionais no sítio 3' Bg III de TyH3 para criar p3efl267. A sequência de codi. ficação estranha foi inserida no único sítio de restrição Saci por meios convencionais. Veja-se a Figura 2. 0 gene estrutural da galactoquinase ds E, coli (GALK) foi seleccionado como um exemplo de uma sequência de codificação estranha (e pode também ser uti li. zado como marcador selectivo, permitindo assim a selecção dos casos de transposição numa estirpe de S, cerevisiae de recipiente de gall).
a sequência de codificação ds GALK utilizada contém uma re gião NH2 terminal modificada, mas codifica para uma galactoquinase activa. Veja-se, Rymond et al., Gene, 25, 249-262 (1983). Fun diram-se três regiães promotoras de S. cerevisiae, diferentes, com GALK nos vectores Tyl, isto é CARI, ARG3 e CUPl. As sequênci as destas regiões promotoras correspondem às regiões 5’ a montante dc ATG dos genes de S. cerevisiae correspondentes e foram adapta, das com sítios ds restrição BamHI permitindo a associação funcional com GALK. Veja-se a Figura 2.
A região 5’ do gene CARI (gene estrutural da arginase) cojn tém pelo menos duas regiões reguladoras correspondendo a dois cori trolos diferentes, isto ê, repressão do catabólito azoto (Cunin et al., Mol. Cell. Biol., 5., 1339-1348 (1985) e indução especifi68 163
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-13ca da arginina (Messenguy e Dubois, Mol. Gen. Genet., 189, 148-156 (1983). A região 5' do gene CARI ê isolada como um fragmento de AON XmnI-3amHI com 820 pb que contêm a região promotora e a maior parte das sequências reguladoras. A região de controlo envolvida na repressão do catabólito azoto não está completamente incluída.
A sequência 5' de ARG3 (gene estrutural da ornitina transcarbamilase) contém duas regiões reguladoras. 0 ARG3 é regulado pelo controla geral de aminoácidos e pelo controlo específico da Arginina descrita por Messenguy et al., (1983) acima citado, e Crabeel et al., Mol. Cell Biol», 2, 1339-1348 (1985), A região 5' de ARG3 está contida num fragmento de AON Xhol-BatnHI com 800 pb que contém o promotor e todas as sequências reguladoras. Veja-se Figura l(b).
A sequência 5’ de CUP1 (gene estrutural da metalotionina de 5. cerevisiae) contém as regiões de AON envolvidas na indução do cobre. 0 fragmento EcoRV-BamHI, com 300 pb, do gene CUP1 usado contém estas regiães de AON.
Estes três promotores, isto é, CARI, ARG3 e CUP1 foram associados com GALK usando o sítio BamHI com o gene GALK, e os fragmeji tos de AON resultantes foram inseridos no único sítio Saci de p3efl267 (após tratamento com polimerase de T4). 0s plasmídeos de multicópia resultantes, isto é pRIT12938 (Figura 2(b);
£ PRIT12946 (Figura 2(b)) e pRIT12945 (F igura 2(b)) foram utilizados em experiências de transposição numa estirpe GAL+ ura3 de 5« cerevisiae, e também numa estirpe gall ura3 de S. cerevisiae (3WG2-1D) porque a galactoquinase de E. coli pode complementar a mutação de gall (crescimento em galactose (2$) como fonte de carbono).
Efectuaram-se, nas diferentes regiães reguladoras, compara, ções de velocidades de crescimento em galactose, desses estirpes de S. cerevisiae transformadas com os vectores aqui descritos, eri volvendo construções YCp50 de baixo número de cópia contendo cassetes de expressão.
As eficiências de complementação (velocidades de crescime_n to em galactose) sao referidas às regiões reguladoras e aos núme68 163
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-14ros de cópia das cassetes de expressão de GALK. Como pode ser visto na Tabela 1, o promotor CARI ê mais eficiente em arginina como fonte de azoto (indução especifica, ausência de repressão do catabólito azoto), o promotor ARG3 s mais eficiente quando se usa NH4* cono fonte de azoto (ausência de repressão na ausência de arginina) e o promotor CUPl ê mais eficiente na presença de cobre (indução específica). Estes efeitos são mais pronunciados quar.do se usam plasmídeos de baixo número de cópia.
A maior parte das experiências de transposição foi efectua da na estirpe gall Δ ura3 trpl, 3WG2-1D, porque após indução da transposição e oura dos plasmídeos, as estirpes que tenham verifi cado um ou vários casos de transposição (isto ê, possuindo uma ou várias cópias da cassete de expressão integradas nos cromossomas) podem ssr facilmente identificadas pela sua capacidade de crescer a
em galactose como fonte ds carbono. E interessante notar que as velocidades de crescimento destas estirpes são semelhantes às velocidades de crescimento da estirpe CWG2-1D contendo as cassetes GALK correspondentes localizadas num plasmideo YCp50 de baixo númsrc -de cópia.
Ds resultados de uma série de experiências de transposição encontram-se sumarizados na Tabela 2 que apresenta as eficiências ds transposição. Efectuaram-se outras experiências a uma tempera, t-ura inferior (169C) com resultados semelhantes (não houve aumento significativo das eficiências).
Usando as três cassetes de expressão (pCARl-GALK, pARG3-GALK e pCUPl-GALK), os ensaios de transposição foram efectuados nas di. fsrentes condições reguladoras (MH4 + ou arginina como fontes de azoto nc caso dos promotores CARI e ARG3 e na presença ou ausência de cobre no caso do promotor CUPl). 0 plasmideo p3ef724 que é equivalente a p3efl267 (sítio BglII original em lugar do sítio Saci) foi utilizado como controlo (isto é, não se inseriu ADN estranho em Tyl) em experiências de transposição para a estirpe GAL+ (GRF167-his3 ura3). 0 plasmideo pRITl2938 contendo a construção de Tyl (pCARI-GALK) foi introduzido na mesma estirpe GAL+ e na e.s tirpe gall Δ , CWG2-1D (trpl ura3 gallA),
No caso da cassete de CAR1-GALK, pRIT12938, analisaram-se
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mais de 100 estirpes após indução da transposição e cura dos plajs mideos, mas não se observou nunca a transposição de GALK após aná lise da capacidade da estirpe 0VJG2-1D gall Δ de crescer em galacto se com arginina como sua fonte de azoto e análise de ADN usando uma sonda de ADN específica para GALK. Veja-se a Tabela 2. No entanto, a construção GALI-Tyl-CARI-GALK de pRIT12938 ê eficiente em relação à síntese da maquinaria de transposição, porque se observou uma indução da transposição de Tyl residente usando o plasmídeo pRIT12938, isto é, pelo menos 40% das estirpes verificou um ou muitos casos de transposição. Veja-se a Tabela 2.
Estes resultados indicam que o gene híbrido CAR1-GALK não é compatível com a transposição eficiente mediada pela transcripta se inversa, provavelmente, porque o promotor CARI não permite a ocorrência da transcrição (ou permite-a apenas com uma frequência baixa) que ê necessária para a transposição dos vectores do preseji te invento, possivelmente porque este promotor contém uma sequência do tipo terminação de transcrição. 0 tamanho da cassete de expressão introduzida não ê incompatível com a transposição porque as sequências de ADN estranho que possuam comprimentos semelhantes podem ser eficazmente transpostas como descrito infra? com maior detalhe. Os resultados da avaliação dos vectores Tyl contendo os genes híbridos ARG3-GALK e CUP1-GALK revelaram que nesses vectores a transposição ê relativamente eficaz. Nas experiências referidas na Tabela 2, 15 a 44% das estirpes analisadas após indução da transposição e cura de plasmideos tinham verificado pelo menos um casa de transposição (integração de Tyl modificado nos cromossomas). No entanto, as frequências de transposição desse elemento Tyl modificado são aproximadamente 10 vezes inferiores às frequêjn cias de transposição obtidas usando a construção Tyl pGALl original (isto é transposição do elemento Tyl controlado por pGALl + el mentos cromossómicos de Tyl)·
Após indução de transposição e cura dos plasmideos, estas estirpes foram analisadas em relação à sua capacidade de crescer em galactose como fonte de carbono, com NH^* como fonte de azoto para a expressão óptima do promotor ARG3 e na presença de cobre no caso de pCUPl-GALK para a expressão óptima do promotor CUP1.
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-16Nestas condições, a capacidade de crescimento em galactose foi sempre correlacionada com a presença de cópias GALK integradas nos cromossomas, como determinada por análise de ADN usando uma sonda especifica para GALK. As velocidades de crescimento em galactose das estirpes possuindo uma ou algumas cópias de vectores integradas e da estirpe contendo a construção de baixo número de cópias em YCpSO, são semelhantes. Nestas experiências, as estirpes que verificam um, dois ou três casos de transposição (l, 2 ou 3 cópias integradas) foram facilmente obtidas estimando-se o número de cópias pelo número de fragmentos BamHI genómicos reconhe eidos com a sonda GALK (existe apenas um sítio BamHI nas construções Tyl).
Nestas experiências não se observou variações significativas nas eficiências de transposição com as cassetes ARG3-GALK ou CUP1-GALK nas diferentes condições reguladoras, particularmente no caso do plasmídeo pCUPl-GALK pRITl2945, onde uma forte variação na velocidade de crescimento sm galactose resultante da variação na sintese da galactoquinase (devida à ausência de cobre versus presença ds cobre) não influenciou significativamente a eficiência de transposição na estirpe gall Δ 3WG2-1D (l/eja-se a Tabela 2).
Em relação à expressão das cassetes GALK inseridas em Tyl, como apresentado na Tabela 3, parece que a influência da indução do promotor GAL1 na expressão de GALK ê fraca ou mesmo inexistente. De facto, as estirpes contendo pRIT12946 (cassete ARG3-GALK) sintetizam quantidades semelhantes de galactoquinase quando crescem em glucose (não há expressão de Tyl) ou em galactose (indução da expressão de Tyl) como fontes de carbono, e as actividades específicas da galactose são da mesma ordem que com os plasmídeos de 2 micra usuais em que ARG3-GALK, não é inserido num elemento Tyl. Por outro lado, as estirpes possuindo uma cópia pARG3-GALK integrada no cromossoma, sintetizam quantidades de galactoquinase semelhantes às da mesma estirpe contendo um plasmídeo de baixo número de cópias ccm a mesma cassete de expressão.
Para aumentar a eficiência do processo do presente invento, podem introduzir-se marcadores de selecção apropriados, como o gene CLIP1 de S, cerevisiae (metalotioneína), nos vectores do in68 163
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-17vento em adição às cassetes de expressão, permitindo assim, a selecção de estirpBS que verificam um maior número de casos de trans, posição numa única experiência. Se se empregar o gene CUP1 como marcador de selecção, a estirpe recipiente usada deverá ser uma estirpe Cupls ou CuplA . Para evitar uma diminuição possível na eficiência de transposição quando se emprega um marcador de selec çao, pode ser útil reduzir as. sequências Ty do vector ao seu tama. nho mínimo, permitindo a encapsulação eficiente do transcripto, produzindo-se o maquinismo da transposição usando um plasmídeo de auxílio. Por exemplo, as sequências 5‘ que se estendem para □ primeiro sítio Bgllí de Tyl são provavelmente suficientes. Um veç tor deste tipo será idêntico a, por exemplo, pRIT12946, com a excepção de a sequência interna de Tyl que se prolonga do sítio Bgllí 5' para o ponto correspondente ao sítio Saci no elemento Tyl, estar ausente. Um vector deste tipo deverá provavelmente ser utili zado em conjunto com um elemento auxiliar Ty que possua o seu LTR 3' substituído por outra sequência de terminação da transcrição, mas que seja controlado por um promotor indutível (por exemplo GALl). 0 elemento auxiliar pode ser parte de um plasmídeo independente do plasmídeo do presente invento. 0 elemento Ty au xiliar não se transpãe mas produz as proteínas Tya e Tyb requeri, das pelo plasmídeo do presente invento para a transposição. Da mesma forma, o nível de expressão dos vectores Ty pode ser aumentado por modificação ou mudança do promotor GALl, por exemplo substituição por sequências CUP1 5’.
sistema de vectores do presente invento pode oferecer muitas vantagens em comparação com episomas. As cópias do vector são integradas de forma estável e disseminadas (não repetidas em tandem) nos cromossomas, permitindo o crescimento na ausência de pressão selectiva. Da mesma forma, as cassetes integradas são distribuídas homogeneamente na população celular, enquanto que os plasmídeos têm usualmente uma tendência para a segregação. Assim, o processo do presente invento permite a síntese do produto genético a um nível bem definido e com a mesma eficiência em cada célula da população.
A Tabela 1 seguinte apresenta as propriedades de crescimeri to da estirpe gall JWG2-1D, contendo os plasmídeos de número de cópia ,múltiplo pRIT12946, pRIT12938 ou pRIT12945 ou os plasmídeos
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de baixo nómero de cópias derivados de YCp50, isto ê, pRITl2947, pRIT12948 ou pRIT12949.
A Tabela 2 seguinte apresenta as frequências de transposição das cassetes de expressão GALK em diferentes condições de crescimento.
A Tabela 3 seguinte apresenta os níveis de galactoquinase produzidos pelas estirpes 3WG2-1D que comportam a cassete de expressão pARG3-GALK num plasmídeo derivado de p0efl267 ou YCp50 ou possuindo um transposão (Tyl-pARG3-GALK) integrado no cromossç) ma hospedeiro de S, cerevisiae.
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-21TABELA 3
Níveis de galactoquinase de estirpes 3WG2-1D comportando a casses te de expressão pARG3-GALK num plasmídeo de multicópia (2yw), num plasmídeo de baixo número de cópia (YCp50) ou possuindo um trans. posão (Tyl-pARG3-GALK) integrado nos cromossomas. 0 plasmídeo pRIT12946 de 2^u contém a cassete pARG3-GALK na construção pGALIl-Tyl, A expressão de GALK foi comparada em glucose ou galactose como fontes de carbono (respectivamente, ausência de expressão de Tyl ou expressão de Tyl induzida). Nos vectores YCp50 o promotor GALl está ausente.
Plasmídeo | Fontes de carbono e azoto | Actividade especifica de GALK | |
(nM galactose/b | ng/prot) | ||
XY12 (plasmídeo | φ NH, glucose 2% | 93 | 000 |
convencional de | |||
2/t contendo ARG3 | |||
-GALK) | |||
pRIT12946 (2^) | NH4 + glucose 2% | 64 | 500 |
pRIT12946 (2^) | NH4 + galactose 2% | 98 | 000 |
pRIT12948 (YCp5Q) | NH4 + glucose 2% | 22 | 200 |
pRIT12948 (YCp50) | ΝΗ^+ galactose 2% | 29 | 600 |
p0efl267 | NH4 + glucose 2% | Não detectado | |
330 (cassete | NH,+ glucose 2% | 12 | 400 |
transposta) | |||
335 (cassete | NH.+ glucose 2% | 12 | 300 |
transposta) | |||
342 (cassete | NH,+ glucose 2% | 23 | 800 |
transposta) | q | ||
340 (cassete | NH, glucose 2% | 20 | 400 |
transposta) |
163
6195/GT/JC
SKR Case 12083-1
Apesar de as descrições e exemplos acima descreverem total, mente o invento e as suas concretizações preferidas, deverá enteri der-se que o invento não fica limitado às concretizações particulares descritas. Assim, o invento inclui todas as concretizações que ss encontram dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.
Claims (28)
-
68 163 /7 // B 6195/GT/OC ,7-lf Í!· Jj·/ SKR Case 12083-1 ' -23- REIVINDICAÇÕES 1 - Vector compreendendo um promotor ligado operativamente a um elemento Tyl ou Ty2 funcional, caracterizado por esse elemejn to Tyl ou Ty2 compreender uma cassete de expressão contendo um promotor de leveduras, potente, ligado operativamente a uma sequên cia de codificação estranha. - 2 - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor ser GAL1.
- 3 - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vector compreender um elemento Tyl funcional.
- 4 - Vector de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o elemento Tyl funcional ser um derivado de TyH3.
- 5 - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ocr conter adicionalmente um marcador de selecção.
- 6 - Vector de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o marcador de selecção ser o gene CllPl de S o cerevisiae.
- 7 - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de codificação estranha codificar uma proteína con actividade biológica.
- 8 - Vector ds acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a proteína possuir actividade biológica terapêutica.
- 9 - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado P~r o promotor de leveduras, potente, pertencer ao gene ARG3 de 9. cerevisiae.IC - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por c promotor· de leveduras, potente, pertencer ao gene CUP1 de 5. cerevisiae.
- 11 - Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um derivado de p0efl267 e compreender a cassete de expres. são inserida no seu sítio Saci.
- 12 - Célula ds levedura, hospedeira, transformada com um vector, caracterizsda por o referido vector compreender um promotor ligado operativamente a um elemento Tyl ou Ty2 funcional, com68 1633 6195/GT/jCSKR Case 12083-1-24preendsndo esse elemento Tyl ou Ty2 uma cassete de expressão contendo um promotor de leveduras potente ligado operativamente a uma sequência de codificação estranha.
- 13 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por pertencer ao género Saccharomyces.
- 14 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por pertencer à espécie S. cerevisiae.
- 15 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o promotor ssr GALl*
- 16 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o vector conter um elemento Tyl funcional.
- 17 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o elemento Tyl funcional ser um derivado de TyH3.
- 18 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a cassete de expressão conter adicionalmente um marcador de selecção.
- 19 - Hospedeiro de accrdo com a reivindicação 18, caracterizado por o marcador de selecção ser o gene CUP1 de 5. cerevisiae.
- 20 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a sequência de codificação estranha codificar uma proteína com actividade biológica.
- 21 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a proteína possuir actividade biológica terapêutica.
- 22 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o promotor de leveduras potente pertencer aogene ARG3 da S« cerevisiae.
- 23 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o promotor de leveduras potente pertencer ao gene CUP1 de S, cerevisiae.
- 24 - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o vector ser derivado de p0efl267 e compreender a cassete de expressão inserida no seu sítio Saci.
- 25 - Processo para efectuar a integração genómica estável68 1638 6195/GT/3CSKR Case 12083-1-25ε a expressão de uma sequência de codificação estranha, caracterizado por compreender cultivar o hospedeiro da reivindicação 12 sob condiçães que permitam que o promotor de leveduras potente actue.
- 26 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracteri zado por o promotor de leveduras potente ser um promotor inductí vel.
- 27 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri zado por o vector inductível ser GALl.
- 28 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri zado por o promotor inductível pertencer ao gene CUP1 de 5. cere visiae.
- 29 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri zado por o promotor inductível pertencer ao gene ARG3 de S, cere visiae.
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-
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