KR20100089845A - 헴 단백질의 안정화방법 및 보존용액 - Google Patents

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Abstract

헤모글로빈으로 대표되는 헴 단백질의 변성·분해 작용에 대해 유효한 헴 단백질의 안정화방법 및 보존용액을 제공하는 것이다.
헴 단백질을 함유하는 시료 중에 이미노카르본산 또는 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 헴 단백질의 안정화방법 및 보존용액으로 상기 이미노카르본산이 식(1)
Figure pct00005

(식 중, R은 수소원자 또는 수산기를 나타내고, X는 수소원자, 알카리금속 또는 암모늄기를 나타낸다.)로 나타나는 안정화방법 및 보존용액이다.

Description

헴 단백질의 안정화방법 및 보존용액{METHOD OF STABILIZING HEM PROTEIN AND STORAGE SOLUTION THEREFOR}
본 발명은 헴 단백질의 안정화방법에 관한 것이며, 특히 대변, 소변 또는 혈액시료 중의 헴 단백질 검사에 있어서 헴 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.
최근에 대장암 등의 소화기계 질환의 스크리닝 방법으로 소화기관으로 부터의 출혈에 기인하는 대변 중의 사람 헤모글로빈(변잠혈)의 검출이 널리 행해지고 있다. 이 사람 헤모글로빈의 검출방법은 종래의 화학적인 발색반응에 기초한 시험지법 대신에 사람 헤모글로빈에 특이적인 항체를 이용한 면역학적 방법이며, 식사제한을 필요로 하지 않는 간단한 검사방법으로 정착되어 있다.
사람 헤모글로빈의 면역학적 검출법으로는 예를 들면 한천 평판 내에서 항 사람 헤모글로빈 항체와 피검시료 중의 사람 헤모글로빈과의 침강선을 이용하는 1차원 면역확산법, 항 사람 헤모글로빈 항체를 감작한 라텍스입자를 사용하는 라텍스 응집법, 효소나 방사성 원소로 표지한 항 사람 헤모글로빈 항체를 사용하는 효소 면역법이나 방사성 면역법, 항 사람 헤모글로빈 항체를 감작한 골드콜로이드입자를 사용하는 골드콜로이드 응집 비색법 등을 들 수 있다.
하지만, 사람 헤모글로빈은 피검액 중에서는 서서히 변성하여 항원성이 저하되는 성질을 가지고 있다. 또한, 피검액 중의 사람 헤모글로빈은 보존온도 등의 보존조건에 따라 변성이 촉진되거나 대변 중의 세균이나 소화효소에 의해 분해되는 경우도 많다. 이와 같은 변성·분해의 결과, 사람 헤모글로빈의 입체구조가 파괴되어 항원성의 저하를 불러일으키게 된다. 이 때문에 면역학적인 사람 헤모글로빈의 측정방법으로는 헤모글로빈의 변성·분해는 잘못된 진단 결과를 야기한다.
한편, 변잠혈 검사에서는 피검자 자신이 자택 등에서 채취한 대변을 변용해액을 포함하는 밀폐용기에 용해하여 검사에 제공하는 경우가 많다. 이 경우, 대변 중의 사람 헤모글로빈은 용액 중에서 수일간 방치되거나 우편 등의 수송수단을 이용함으로써 고온하에 놓여지는 경우도 많다. 또한, 검사기관에서 채변하는 경우에도 다른 항복의 검사를 실시하고 있기 때문에 변잠혈을 검사하는데 많은 시간을 필요로 하는 경우도 있다. 이와 같은 상황하에서는 상술한 바와 같이 사람 헤모글로빈의 변성·분해가 발생하기 때문에 우수한 정밀도로 측정할 때에 방해가 되었다.
이와 같은 용액 중에서의 사람 헤모글로빈의 변성·분해를 방지하기 위해 예를 들면 티메로살이나 클로르헥시딘 등 일반적인 항균제를 첨가하는 방법(예를 들면, 특허문헌 1 참조) 외에 당류를 첨가하는 방법(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 사람 이외의 동물 헤모글로빈의 첨가(예를 들면, 특허문헌 3 참조), 사람 이외의 동물혈청의 첨가(예를 들면, 특허문헌 4 참조), 용균효소의 첨가(예를 들면, 특허문헌 5 참조), 철프로토포르피린의 첨가(예를 들면, 특허문헌 6 참조) 등이 제안되어 있다.
하지만, 이들 공보에 기재된 사람 헤모글로빈 안정화 기술로는 대변을 포함하는 검사액 중의 사람 헤모글로빈의 변성·분해를 충분히 억제할 수 없다.
이 외에도 에틸렌디아민테트라아세트산(이하, EDTA라 함)을 사용한 헤모글로빈 안정화방법이 제안되어 있다(예를 들면, 특허문헌 7 참조).
하지만, 본 발명자들에 의한 추가 시험 결과, EDTA 단독으로는 대변 중의 헤모글로빈에 대해 충분한 안정화 작용을 기대할 수 없다는 것이 확인되었다.
따라서, 본 출원인은 EDTA 단독보다도 안정화 효과가 높은 수용성 천이금속착체를 첨가하는 방법을 제안하고 있다(예를 들면, 특허문헌 8 참조). 또한 본 출원인은 페로시안 화합물과 공존시킨 헤모글로빈의 안정화방법(예를 들면, 특허문헌 9 참조), 헤모글로빈의 효소 분해산물을 공존시킨 헤모글로빈의 안정화 방법(예를 들면, 특허문헌 10 참조), 천이금속류를 공존시킨 헴 단백질의 안정화방법(예를 들면, 특허문헌 11 참조), 사과산 등의 유기산을 공존시킨 헴 단백질의 안정화방법(예를 들면, 특허문헌 12 참조) 및 탈지알부민을 공존시킨 헴 단백질의 안정화방법(예를 들면, 특허문헌 13 참조)이 기존에 제안되어 있다.
특개소63-271160호 공보 특개소63-243756호 공보 특개평2-296149호 공보 특개평4-145366호 공보 특공평5-69466호 공보 특개평5-281227호 공보 특개평5-99923호 공보 특개평7-229902호 공보 특개평11-118806호 공보 특개평11-218533호 공보 특개2001-249132호 공보 특개2003-014768호 공보 특개2003-194825호 공보
본 발명의 제 1 과제는 헤모글로빈으로 대표되는 헴 단백질의 변성·분해 작용에 대해 유효한 신규 헴 단백질의 안정화방법을 제공하는데 있다. 특히, 변성·분해 작용에 강한 대변성분과 공존하는 헤모글로빈을 효과적으로 안정화하는 기술의 제공을 목적으로 한다.
본 발명의 제 2 과제는 신규 헴 단백질의 안정화제를 이용한 헴 단백질의 보존용액을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 제 3 과제는 신규 헴 단백질의 안정화방법에 사용되는 특정 화합물을 제공하는 것에 있다.
본 발명은 하기 (1) 내지 (7)의 구성으로 이루어진 것이다.
(1) 헴 단백질을 함유하는 시료 중에 이미노카르본산 또는 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 헴 단백질의 안정화방법.
(2) 상기 이미노카르본산 또는 그 염이 하기 식(1)
Figure pct00001
(식 중, R은 수소원자 또는 수산기를 나타내고,
X는 수소원자, 알카리금속 또는 암모늄기를 나타낸다.)
로 나타나는 화합물 및 이들의 혼합물인 상기 (1)의 헴 단백질의 안정화방법.
(3) 상기 이미노카르본산염이 하기 식(2)
Figure pct00002
(식 중, X는 수소원자, 알카리금속 또는 암모늄기를 나타낸다.)로 나타나는 3-히드록시-2,2'-이미노디호박산 또는 그 염인 상기 (1) 또는 (2)의 헴 단백질의 안정화방법.
(4) 상기 이미노카르본산 또는 그 염의 농도가 0.001 내지 0.200mol/L의 범위인 상기 (1) 내지 상기 (3) 중 어느 하나에 기재된 헴 단백질의 안정화방법.
(5) 상기 헴 단백질이 헤모글로빈, 미오글로빈, 페록시다아제 또는 카탈라아제인 상기 (1)에 기재된 헴 단백질의 안정화방법.
(6) 상기 헴 단백질을 함유하는 시료가 대변, 소변 또는 혈액인 상기 (1)에 기재된 헴 단백질의 안정화방법.
(7) 상기 (1) 내지 상기 (3) 중 어느 하나에 기재된 이미노카르본산 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 헴 단백질의 보존용액.
(8) 상기 (1) 내지 상기 (6)의 어느 한 항에 기재된 헴 단백질의 안정화방법에 사용되는 이미노카르본산 또는 그 염.
본 발명의 헴 단백질의 안정화 방법으로는 헴 단백질에 대해 강한 변성·분해 작용을 갖는 생체성분, 특히, 대변 성분과의 공존하에서도 보호작용을 얻을 수 있다. 따라서, 생체 성분의 분석, 예를 들면 대변잠혈의 검출을 목적으로 하는 시료에 포함되는 헤모글로빈의 안정화에 유용하다. 특히, 항원구조의 보호가 요구되는 면역학적인 분석대상으로써의 헴 단백질에 대해 그 항원성의 유지에 공헌한다. 본 발명의 방법, 보존용액 및 헴 단백질의 안정화방법에 사용되는 화합물에 의해 대변시료 중의 헤모글로빈이 효과적으로 안정화되어 헤모글로빈의 변성·분해에 의한 위음성 결과의 방지를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 헴 단백질을 함유하는 시료 중에 이미노카르본산 또는 그 염을 공존시킨다. 이 이미노카르본산은 공지의 것 중에서 적절히 선택할 수 있으나, 특히, 상기 식(1)로 나타나는 화합물이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 식(2)로 나타나는 3-히드록시-2,2'-이미노디호박산 또는 그 염이다. 또한, 상기 식(1) 및 식(2)에서 X로 나타나는 알카리금속으로 예를 들면 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 사용되는 이미노카르본산은, 예를 들면, 아스파라긴산과 에폭시호박산을 원료로 하는 방법(예를 들면, 특개평9-183773호 공보), 말레산과 암모니아를 원료로 하는 방법(예를 들면, 미국특허 제639863호 명세서), 아스파라긴산과 말레산을 원료로 하는 방법(예를 들면, 특개평5-320109호 공보), 말레산 반에스테르와 말레산, 암모니아를 원료로 하는 방법(예를 들면, 특개평8-12631호 공보)으로 합성된 것을 사용할 수 있다.
헴 단백질을 함유하는 시료 중에서의 이미노카르본산 또는 그 염의 농도는 0.001 내지 0.200mol/L, 보다 바람직하게는 0.050 내지 0.150mol/L이다. 이 이미노카르본산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L미만이 되면 헴 단백질의 안정화 효과가 불충분하게 된다. 한편, 이미노카르본산 또는 그 염의 농도가 0.200mol/L을 초과하면 용해도가 저하하여 면역반응도 저해된다.
본 발명에서는 필수는 아니지만 필요에 따라 공지의 단백질 보호제를 추가함으로써 헴 단백질의 안정화 효과를 보다 높일 수 있다. 이와 같은 단백질 보호제로는 알부민이나 젤라틴으로 대표되는 불활성 단백질 등을 들 수 있다.
알부민은 임의의 것을 사용할 수 있지만, 특히, 동물의 혈청이나 달걀에서 유래되는 알부민이 바람직하다. 그 구체예로는 소, 말, 염소, 양, 돼지, 토끼 및 이들 동물의 새끼 또는 태아의 혈액에서 유래되는 알부민을 들 수 있다.
이 알부민에는 상기한 것 이외에 그 효소 분해물도 알려져 있으나 본 발명에서의 알부민에는 이와 같은 알부민에서 유도되는 단백질도 포함할 수 있다.
상기 단백질보호제 외에, 예를 들면, 미생물의 불필요한 번식을 방지하기 위한 항균제나 헴 단백질의 보존에 유리한 pH를 부여하는 완충제 등 지금까지 알려져 있는 많은 헴 단백질 보호성분의 첨가도 유효하다.
항균제로는 용균효소, 안식향산에틸, 페니실린, 펀지존(fungizon), 스트렙토마이신 혹은 세파마이신 외에 비페니실린계의 일련의 항생물질 등을 들 수 있다. 또한, 트립신 억제 인자나 α2매크로글로불린과 같은 프로테아제 억제물질도 헴 단백질을 안정화시키는 것으로 알려져 있다.
분산매의 pH는 헴 단백질을 안정하게 유지할 수 있는 범위로 설정한다. 극단적인 산이나 알카리조건 하에서는 헴 단백질의 안정성을 저해할 우려가 있으며 중성역의 pH가 바람직하다. 구체적으로는 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8정도의 pH로 한다.
pH를 유지하기 위해서는 적당한 완충제를 이용할 수 있다. 예를 들면, 히드록시에틸피페리진-2-에탄술폰산(이하, HEPES라 함)이나 피페라진-비스(2-에탄술폰산)(이하, PIPES이라 함) 등의 좋은 완충제는 헴 단백질의 구조가 가장 안정화된다고 생각되는 pH 6 내지 8을 부여함과 동시에 면역반응에 의해 헴 단백질을 검출할 때의 반응용 완충액으로도 이용되고 있는 것이며 특히, 바람직한 완충제로 들 수 있다. 그 외에 인산 완충액, 트리스 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액 등을 이용할 수도 있다.
본 발명의 헴 단백질의 안정화 방법은 대변, 소변, 혈액시료 중의 헴 단백질의 검출에 이용할 수 있다. 헴 단백질로는 헴을 구성성분으로 하는 단백질 중에서 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 헤모글로빈, 미오글로빈, 페록시다아제 또는 카탈라아제를 들 수 있다. 특히, 항원구조의 보호가 요구되는 면역학적인 분석대상으로써의 헴 단백질에 대해 그 항원성의 유지에 유용하다.
본 발명에서는 헴 단백질의 안정화 인자로 작용하는 이미노카르본산 또는 그 염류를 함유시킨 헤모글로빈의 보존용액을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 보존용액에는 필요에 따라 단백질 보호제 및 완충제를 함유시킬 수 있다. 단백질 보호제 및 완충제로는 상기한 것 중에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 헴 단백질의 안정화 기술을 응용한 헴 단백질의 면역학적 측정방법을 제공할 수 있다. 면역학적 측정방법으로는, 예를 들면, 라텍스 응집반응법, 골드콜로이드 응집반응법, 면역크로마토그래피법 또는 ELISA법 등을 들 수 있다. 모든 측정방법에서 헴 단백질 함유 시료에 이미노카르본산 또는 그 염류를 공존시킴으로써 보존 중의 항원활성은 보호되고 측정치의 저하가 억제된다.
본 발명의 헴 단백질의 안정화방법은 생체 시료 중에 존재하는 분석대상으로써의 헴 단백질을 안정화시키는데 유용하다. 특히, 헴 단백질을 인식하는 항체를 사용한 면역학적 방법에 의한 헴 단백질의 측정방법에서 측정대상이 되는 헴 단백질의 항원성을 고도로 안정화한다. 헴 단백질을 검출해야 하는 생체 시료에는 대변, 소변, 혈액이 알려져 있다. 특히, 대변 중의 헤모글로빈은 소화기에서의 출혈의 지표가 되며 소변 중의 헤모글로빈은 요로에서의 출혈의 지표가 된다.
본 발명의 안정화방법을 대변 시료에 존재하는 헤모글로빈에 응용하는 경우에는 대변을 현탁시키는 보존용액에 이미노카르본산 또는 그 염류를 첨가해 두면 좋다. 통상적인 대변 중의 헤모글로빈의 검출에 있어서는 대변을 적당한 보존액에 현탁시켜 필요에 따라 여과하여 면역학적인 분석용 시료로 한다.
이하, 실시예로 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 각 농도의 HIDS에 의한 헤모글로빈의 안정화 효과
0.05mol/L의 HEPES, 0.9%의 염화나트륨 및 잔부의 순수로 이루어지는 pH 7.0의 용액에 0 내지 0.2mol/L의 3-히드록시 -2,2'-이미노디호박산4나트륨(HIDS)을 이하의 표 1에 나타낸 농도로 각각 첨가한 보존용액을 조제했다. HIDS는 NIPPON SHOKUBAI CO., LTD.제를 사용했다.
이 보존용액에 용혈 헤모글로빈 또는 용혈 헤모글로빈과 변검체와의 혼합물을 첨가하고 각각의 시험액에 대해 헤모글로빈농도를 측정했다(직후농도). 다음으로 37℃에서 20시간 보존한 후의 헤모글로빈농도를 상기 직후농도로 제거하고 헤모글로빈의 잔존율을 산출했다.
헤모글로빈의 농도는 면역학적 헤모글로빈 측정 시약 OC-AUTO III(Eiken Chemical Co., Ltd.제)를 사용하여 OC 센서 NEO 분석기(Eiken Chemical Co., Ltd.제)로 측정했다.
표 1에 나타낸 바와 같이 HIDS를 헤모글로빈에만 첨가한 시험액의 경우에는 첨가농도 0.001mol/L부터 안정화 효과를 볼 수 있다. 또한, 헤모글로빈 및 변검체가 존재하는 시험액의 경우에도 첨가농도 0.005mol/L부터 안정화 효과를 볼 수 있다. 특히, HIDS의 첨가농도가 0.050mol/L이상인 경우, 헤모글로빈의 안정화 효과가 현저하다는 것을 알 수 있다.
HIDS에 의한 헤모글로빈 안정화 효과
항원 헤모글로빈 헤모글로빈+변검체
HIDS 첨가농도[mol/L] 잔존율(%) 잔존율(%)
-
0.001
0.005
0.010
0.050
0.075
0.100
0.150
0.200		 77.7
82.8
83.9
84.2
84.1
85.2
87.8
88.2
86.2		 27.5
28.8
32.3
39.2
50.8
53.9
55.9
57.8
46.3
비교예
실시예의 3-히드록시-2,2'-이미노디호박산4나트륨(HIDS) 대신에 에틸렌디아민-N,N,N',N'-4초산(EDTA), 이미노디초산(IDA), 또는 N-(2-히드록시에틸)이미노디초산(HIDA)을 첨가한 것 이외에는 실시예와 동일한 방법으로 헤모글로빈의 안정화 효과를 조사했다.
표 2에 나타낸 바와 같이 EDTA, IDA 또는 HIDA를 킬레이트제로 사용한 경우, 헤모글로빈만의 시험액에서는 현저한 안정화 효과를 볼 수 있었다. 하지만 대변의 공존 하에서는 IDA 및 HIDA를 킬레이트제로 사용한 경우, 안정화라고 말할 수준의 효과는 볼 수 없었다. EDTA를 사용한 경우는 변검체의 공존 하에서도 헤모글로빈의 안정화 효과가 조금 높은 수준인 것을 볼 수 있었지만 첨가농도 0.010mol/L이상에서는 실시예의 보존용액보다도 헤모글로빈의 안정화 효과는 각별히 작은 것이었다.
각종 킬레이트제에 의한 헤모글로빈 안정화 효과
항원 헤모글로빈 헤모글로빈+변검체
잔존율(%) 잔존율(%)
킬레이트제 무첨가 77.7 27.5
EDTA 첨가농도[mol/L]
0.001
0.010
0.050		 79.5
79.8
82.4		 34.3
35.8
37.1
IDA 첨가농도[mol/L]
0.001
0.010
0.050		 82.1
80.9
81.0		 28.0
27.3
26.3
HIDA 첨가농도[mol/L]
0.001
0.010
0.050		 80.3
79.3
81.6		 26.1
26.4
27.3
본 발명에 의하면 헴 단백질을 함유하는 시료 중에 이미노카르본산 또는 그 염을 공존시킴으로써 헴 단백질을 안정하게 유지할 수 있기 때문에 변잠혈검사에서의 헤모글로빈의 변성·분해에 의한 위음성을 방지할 수 있다. 그 결과 보다 정밀도가 높은 변잠혈검사를 행할 수 있다.

Claims (8)

  1. 헴 단백질을 함유하는 시료 중에 이미노카르본산 또는 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 하는 헴 단백질의 안정화 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 이미노카르본산 또는 그 염이 하기 식(1)
    [화학식 1]
    Figure pct00003

    (식 중, R은 수소원자 또는 수산기를 나타내고,
    X는 수소원자, 알카리금속 또는 암모늄기를 나타낸다. )
    로 나타나는 화합물 및 이들의 혼합물인 헴 단백질의 안정화 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 이미노카르본산염이 하기 식(2)
    [화학식 2]
    Figure pct00004

    (식 중, X는 수소원자, 알카리금속 또는 암모늄기를 나타낸다.)로 나타나는 3-히드록시-2,2'-이미노디호박산 또는 그 염인 헴 단백질의 안정화 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이미노카르본산 또는 그 염의 농도가 0.001 내지 0.200mol/L의 범위인 헴 단백질의 안정화 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 헴 단백질이 헤모글로빈, 미오글로빈, 페록시다아제 또는 카탈라아제인 헴 단백질의 안정화 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 헴 단백질을 함유하는 시료가 대변, 소변 또는 혈액인 헴 단백질의 안정화 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 이미노카르본산 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 헴 단백질의 보존용액.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 헴 단백질의 안정화방법에 사용되는 이미노카르본산 또는 그 염.
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