JPH0582367B2

JPH0582367B2 -

Info

Publication number: JPH0582367B2
Application number: JP14968883A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Shibata; Takeshi Suehiro
Original assignee: NIPPON SEIYAKU KK
Current assignee: NIPPON SEIYAKU KK
Priority date: 1983-08-18
Filing date: 1983-08-18
Publication date: 1993-11-18
Also published as: JPS6042336A; DE3430320A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は静脈内投与可能な高純度免疫グロブリ
ンを効率よく製造する方法に関する。

従来、主にコーンの低温エタノール分画法によ
つて製造された免疫グロブリン製剤は、その中に
含まれる免疫グロブリンの凝集体が示すとされる
高い抗補体活性のため、静脈内への投与は禁じら
れ、筋注が行なわれていた。静脈内投与可能な免
疫グロブリンを得る方法が多数考案・報告され、
一部は既に実用化されている。

その中にはペプシンやプラスミン等の酵素で処
理することによつて、免疫グロブリンのFcフラ
グメントを除去あるいは修飾することによつて抗
補体活性を低下させる方法や、免疫グロブンリ分
子内のジスルフイド結合を化学修飾（スルフオ
化、還元アルキル化等）することによつて、抗補
体活性を低下させる方法等が報告されている。

また免疫グロブリンの凝集体を除く方法として
水溶性重合体、特にポリエチレングリコールを用
いる方法についてもいくつか報告されている。例
えば、マイヤー・ルーイス・コーバルは（特開昭53−
72816号）、血漿蛋白分画等をアルブミンと２％
ポリエチレングリコール（以下PEGと略）を含
む低イオン強度の水で抽出し、PEG濃度を
4.0W／Ｖ％にあげ、不純物を除き、さらにエタ
ノール４−12％で再度不純物を除き、PH７−８、
PEG10−12W／Ｖ％、あるいはエタノール20〜
30W／Ｖ％で沈澱する抗補体活性の低いガンマグ
ロブリンを得ている。

ハルデマール・シユナイダーら（特公昭55−
12001号）はPH3.5〜8.0（特にPH6.5〜6.9）のヒド
ロキシエチルスターチ１〜30％溶液にガンマグロ
ブリン溶液とPEG10％溶液を加え、生じるガン
マグロブリン凝集体の沈澱を除いた後20％PEG
溶液と混合して静注用ガンマグロブリンを得てい
る。

シユナイダーらはまたPEG4000による種々の
血漿蛋白質の精製を報告しているが（Vox
Sang.31：141、1976及びFolia Haem
atologica103：938、1976）、その中でPEGで精製
した免疫グロブリンあるいはコーンの画分溶液
にヒドロキシエチルスターチ６−10％、ベントナ
イト0.5−2.5％加え凝集免疫グロブリンを除去
し、PH7.0、PEG25％で静注可能な免疫グロブリ
ンを得ている。

マルタ・アクブルらは（特開昭55−47628号）
免疫グロブリン溶液にPEGを60−90ｇ／加え、
沈澱を除去後、PEG70−100ｇ／として静注可
能なガンマグロブリンを沈澱として得ている。

アルフレツド・ボルソンらは（特公昭55−
38932号）、分子量6000のポリアルキレングリコー
ル４〜4.8％、PH４−５の条件で凝集体を除去し、
免疫グロブリンの純化を行なつている。

木村篤介らは（特開昭55−20317号）コーンの
画分溶液にPEG4000 ３〜４％加え、凝集体を
除去した上清にPEG6〜８％となるよう加え、免
疫グロブリンを精製している。

ホセ・ベンサドン・ラレド（特開昭57−206625
号）は、ポリエチレンポリプロピレングリコール
系のポリマー１〜３％をコーンの画分の溶液に
加え、活性炭を助剤として不溶性物質を別し、
抗補体活性を有しない免疫グロブリンＧを製造し
ている。

本発明者らも、例えばコーンの画分のような
粗免疫グロブリンを原料として、PEG4000（日本
薬局方でマクロゴール4000に相当するもの）を用
いて免疫グロブリン凝集体を分離除去する方法に
ついて詳細に条件を検討した結果、次の知見を得
た。

粗免疫グロブリンからPEG4000を用いて凝集
体を除去する場合、その溶媒の粗製及びPHが大き
な影響を及ぼすが、その分画工程中にアミノ酢酸
を共存させることにより、免疫グロブリン凝集体
が選択的に有利に沈澱し効率よく静注可能な純化
免疫グロブリンが得られること。次いで陰イオン
交換体で吸着処理することによつて、さらに抗補
体活性が低下すること。そのようにして得られた
純化免疫グロブリンから混入するPEGを除去す
るには、低温エタノール沈澱によつて免疫グロブ
リンを沈澱させるか、あるいは陽イオン交換体に
吸着せしめた後よく洗滌し、吸着された純化免疫
グロブリンを塩濃度を高めて溶出することによ
り、静注可能な抗補体活性の極めて低い高純度免
疫グロブリンを効率よく製造できることを知り、
この発明を考案した。

以下に本発明の方法を説明する。

粗免疫グロブリン（例えばコーンの画分）の
ペーストあるいは凍結乾燥粉末をアミノ酢酸加食
塩水溶液にタンパク濃度3.0〜5.0W／Ｖ％、PH6.0
〜7.0となるように溶解し、PEG4000を6.0〜
7.0W／Ｖ％となるように加え、生じる免疫グロ
ブリン凝集体の沈澱を遠心分離によつて除去す
る。

この際のアミノ酢酸の濃度は0.5〜2.0W／Ｖ
％、塩化ナトリウムの濃度は0.5〜1.5W／Ｖ％で
あることが望ましい。特にアミノ酢酸は0.5％以
下では沈澱の分別生成の効果が不充分であり2.0
％以上にした場合も同様である。

次いで上清をPH7.0〜8.0とした後、PEG4000を
10.0〜15.0％となるように追加し生じた沈澱（免
疫グロブリン単量体が主成分）を遠心分離によつ
て集める。

この沈澱を凍結乾燥の安定剤（例えば、グルコ
ース2.5W／Ｖ％）を含む0.9％塩化ナトリウム溶
液で溶解（PH6.8〜7.2）し、過除菌、凍結乾燥
して製剤を得ることが出来る。

このようにして得られる免疫グロブリン製剤は
抗補体活性が低く静注可能であるが、さらに精製
するためには、この沈澱を0.03〜0.07Mの塩化ナ
トリウム溶液又は0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液
加塩化ナトリウム溶液（0.03〜0.06M）等にタン
パク濃度5.0〜10.0W／Ｖ％、PH7.0〜7.5となるよ
う溶解し、同じ溶液で平衡化した陰イオン交換体
（例えばDEAEセフアデツクスＡ−50，DEAEセ
フアローズCL−6B，QAEセフアデツクスＡ−50
（（いずれもスウエーデン国フアイルマシア社製))、
DEAセルロフアインAH((生化学工業(株)社製))、
スフエロジルDEA((仏国ローヌプーラン社製))
等）のカラムを通過させることによつて抗補体活
性をさらに低下させることもできる。

日本国内においては、抗補体活性は50mg／mlの
免疫グロブリン溶液と100CH50／mlの補体溶液
を等量混合して37℃１時間保温し、消費される補
体が20CH50以下であればよいとされている。即
ち0.4CH50／タンパクmg以下（生物学的精剤基
準）である。

そのため静注用免疫グロブリン製剤としては
0.4CH50／mg以下の抗補体活性が求められるが、
その値は低い方がよいと考えられる。

製剤中のPEG含量を減らすには、上述の如く
にして得られる免疫グロブリン溶液（PEG沈澱
を溶解した溶液あるいはその溶液の陰イオンカラ
ム通過液）にコーンの方法に従つて、低温でエタ
ノールを25％となるように加え、その沈澱を遠心
分離によつて集めることによつて可能である。

あるいは0.03〜0.07Mの塩化ナトリウムあるい
はリン酸緩衝加塩化ナトリウム溶液に溶解した免
疫グロブリンをPH5.0〜6.0で陽イオン交換体（例
えばCM−セフアデツクスＣ−50，CM−セフア
ローズCL−6B，SPセフアデツクスＣ−50((いず
れもスウエーデン国フアルマシア社製))、CMセ
ルロフアインAH((生化学工業(株)社製))、スフエロ
ジルＣ((仏国ローヌプーラン社製))等）のカラム
に吸着させた後、カラムを洗つてPEGを除き、
次いで0.15M塩化ナトリウム液（PH7.0〜7.5）で
免疫グロブリンを溶出することによつても可能で
ある。

本発明の実施例を以下に示す。

実施例１コーンの低温エタノール分画法によつて得られ
た画分（免疫グロブリン）ペースト300ｇを0.9
％塩化ナトリウム、0.5％アミノ酢酸水溶液に溶
解し、0.5N塩酸でPH6.0とした後1000mlとする。
（蛋白濃度3.8％、抗補体活性千単位／mg）この溶液をゆるやかに攪拌しながら40％PEG
溶液177mlを滴下した。（PEG6.0％）生じた沈澱
を遠心分離によつて除去した上清に0.5N水酸化
ナトリウム溶液を加えてPH7.5とし、40％PEG溶
液260mlを加え（PEG12％）、遠心分離により沈
澱を得た。この沈澱には免疫グロブリン凝集体は
含まれず、0.9％塩化ナトリウム、2.5％ブドウ糖
溶液で溶解した時の抗補体活性は0.3単位／mgで
あつた。この溶液を除菌過・凍結乾燥し、静脈
内投与可能な製剤を得た。

実施例２コーン法によつて得られた免疫グロブリン粉末
100ｇを0.9％塩化ナトリウム、1.0％アミノ酢酸
溶液に溶解し、0.5N塩酸でPH6.5とした後、1000
mlとした。（タンパク濃度3.9％、抗補体活性８単
位／mg）この溶液をゆるやかに攪拌しながら、40％
PEG溶液194mlを滴下し（PEG6.5％）、生じる沈
澱を遠心分離によつて除去して得た上清に0.5N
水酸化ナトリウムを加えて、PH7.5とした後、40
％PEG溶液250mlを加え（PEG13％）、遠心分離
によつて沈澱を得た。

この沈澱を0.5％塩化ナトリウム、0.5％グリシ
ン溶液200mlに溶解し（PH7.2、抗補体活性0.3単
位／mg）、同じ溶液で平衡化したDEAEセフアデ
ツクスＡ−50カラム（径５cm、長さ15cm）を通過
させた。この通過液を、タンパク濃度５％、ブド
ウ糖2.5％、塩化ナトリウム0.9％に調整し（抗補
体活性0.2単位／mg）過除菌・凍結乾燥して静
注用製剤を得た。

実施例３実施例２と同様の操作によつて得られた免疫グ
ロブリン溶液を0.9％塩化ナトリウム溶液で600ml
にした後、冷却し、コーンの常法に従つて53.3％
エタノール530mlを滴下し（エタノール25％）、生
じた沈澱を遠心分離によつて集め、グルコース
2.5％、塩化ナトリウム0.9％、タンパク濃度5.0％
となるように溶解した。この溶液の抗補体活性は
９単位／mlであつた。

次いでこの溶液を過除菌・凍結乾燥して静注
用製剤を得た。

また実施例１の操作によつて得られた免疫グロ
ブリン溶液を用いて、前記と同様の操作を行なつ
たところ、得られた溶液の抗補体活性は14単位／
mlであつた。

実施例４実施例２と同様の操作によつて得られた免疫グ
ロブリン溶液を、塩化ナトリウム0.25％、グリシ
ン0.25％となるように希釈し、PH5.5とした。

同じ組成の溶液で平衡化したCMセフアローズ
CL−6Bカラム（径5.0cm、長さ15cm）を通過させ
免疫グロブリンを吸着させた。カラムを平衡化し
た溶液でよく洗滌した後、0.9％塩化ナトリウム、
2.5％グルコース溶液（PH7.0）で吸着した免疫グ
ロブリンを溶出させる。

この溶液のタンパク濃度を５％とした時抗補体
活性は８単位であつた。溶液を過除菌後、凍結
乾燥して静注用製剤を得た。

また実施例１の操作によつて得られた免疫グロ
ブリン溶液を用いて、前記と同様の操作を行なつ
たところ、得られた溶液の抗補体活性は13単位／
mlであつた。

Claims

【特許請求の範囲】１粗製免疫グロブリンをアミノ酢酸0.5〜
2.0W／Ｖ％の存在下、PH6.0〜7.0、タンパク濃度
3.0〜5.0W／Ｖ％となるように溶解し、この溶液
にポリエチレングリコール4000を6.0〜7.0W／Ｖ
％となるように加え、生じる免疫グロブリン凝集
体及び他の夾雑蛋白質の沈澱を除去し、上清をPH
7.0〜8.0とした後ポリエチレングリコール4000を
10.0〜15.0W／Ｖ％となるように加え、抗補体活
性の低い高純度免疫グロブリンを沈澱として採取
することを特徴とする免疫グロブリンの製造方
法。２粗製免疫グロブリンをアミノ酢酸0.5〜
2.0W／Ｖ％の存在下、PH6.0〜7.0、タンパク濃度
3.0〜5.0W／Ｖ％となるように溶解し、この溶液
にポリエチレングリコール4000を6.0〜7.0W／Ｖ
％となるように加え、生じる免疫グロブリン凝集
体及び他の夾雑蛋白質の沈澱を除去し、上清をPH
7.0〜8.0とした後ポリエチレングリコール4000を
10.0〜15.0W／Ｖ％となるように加え、抗補体活
性の低い高純度免疫グロブリンを沈澱として採取
し、次いでこの沈澱を溶解して陰イオン交換体カ
ラムを通過させることにより、更に抗補体活性を
低下させることを特徴とする高純度免疫グロブリ
ンの製造方法。３粗製免疫グロブリンをアミノ酢酸0.5〜
2.0W／Ｖ％の存在下、PH6.0〜7.0、タンパク濃度
3.0〜5.0W／Ｖ％となるように溶解し、この溶液
にポリエチレングリコール4000を6.0〜7.0W／Ｖ
％となるように加え、生じる免疫グロブリン凝集
体及び他の夾雑蛋白質の沈澱を除去し、上清をPH
7.0〜8.0とした後ポリエチレングリコール4000を
10.0〜15.0W／Ｖ％となるように加え、抗補体活
性の低い高純度免疫グロブリンを沈澱として採取
し、次いでこの沈澱を溶解して高純度免疫グロブ
リン溶液としたものに直接、あるいは該溶液を陰
イオン交換体カラムに通過させた後、低温でエタ
ノールを加え、生じた沈澱を採取することによつ
て、含有するポリエチレングリコール濃度を減少
せしめることを特徴とする高純度免疫グロブリン
の製造方法。４粗製免疫グロブリンをアミノ酢酸0.5〜
2.0W／Ｖ％の存在下、PH6.0〜7.0、タンパク濃度
3.0〜5.0W／Ｖ％となるように溶解し、この溶液
にポリエチレングリコール4000を6.0〜7.0W／Ｖ
％となるように加え、生じる免疫グロブリン凝集
体及び他の夾雑蛋白質の沈澱を除去し、上清をPH
7.0〜8.0とした後ポリエチレングリコール4000を
10.0〜15.0W／Ｖ％となるように加え、抗補体活
性の低い高純度免疫グロブリンを沈澱として採取
し、次いでこの沈澱を溶解した高純度免疫グロブ
リン溶液、あるいは該溶液を陰イオン交換体カラ
ムに通過させた後の溶液を、PH5.0〜6.0とし、陽
イオン交換体に吸着させ、交換体を洗浄してポリ
エチレングリコールを除去した後、吸着された高
純度免疫グロブリンを塩濃度の高い溶出液で溶出
させることを特徴とする高純度免疫グロブリンの
製造方法。