JPH0611705B2 - 血小板減少症治療剤 - Google Patents
血小板減少症治療剤Info
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- JPH0611705B2 JPH0611705B2 JP63029819A JP2981988A JPH0611705B2 JP H0611705 B2 JPH0611705 B2 JP H0611705B2 JP 63029819 A JP63029819 A JP 63029819A JP 2981988 A JP2981988 A JP 2981988A JP H0611705 B2 JPH0611705 B2 JP H0611705B2
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- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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Description
【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 本発明は、種々の原因によって起こる造血障害に伴う血
小板減少症の治療剤に関し、更に詳しくは、ヒト造血因
子の一種であるヒト単球−マクロフアージコロニー刺激
因子を有効成分とする血小板減少症治療剤に関するもの
である。
小板減少症の治療剤に関し、更に詳しくは、ヒト造血因
子の一種であるヒト単球−マクロフアージコロニー刺激
因子を有効成分とする血小板減少症治療剤に関するもの
である。
(ロ)従来技術 種々の造血障害によって、顕著な血小板の減少または機
能低下に基づき、現に重篤な出血を見ているか、または
その恐れの強い病態に対して、血小板輸血が有力な手段
となっている。しかし、各医療の現場について見ると、
十分量の血小板製剤が迅速に供給されている状況ではな
く、かつ、血小板輸血に伴いＡＴＬ（adult T cell leu
kemia，成人Ｔ細胞白血病）やＡＩＤＳ（acquired immu
ne deficiency syndrome，後天性免疫不全症候群）等の
病原体であるウイルスに感染する危険性が著しく増大し
ている。
能低下に基づき、現に重篤な出血を見ているか、または
その恐れの強い病態に対して、血小板輸血が有力な手段
となっている。しかし、各医療の現場について見ると、
十分量の血小板製剤が迅速に供給されている状況ではな
く、かつ、血小板輸血に伴いＡＴＬ（adult T cell leu
kemia，成人Ｔ細胞白血病）やＡＩＤＳ（acquired immu
ne deficiency syndrome，後天性免疫不全症候群）等の
病原体であるウイルスに感染する危険性が著しく増大し
ている。
(ハ)本発明が解決しようとする問題点 白血病や悪性腫瘍の薬剤ないし放射線による治療中や、
再生不良性貧血の経過中において、重篤な出血を現に見
ているか、またはその恐れの強い病態に対して、血小板
の産生を促進することを目的として検討を行った結果、
本発明に係るヒト単球−マクロフアージコロニー刺激因
子を有効成分としてなる製剤を悪性腫瘍の化学療法にお
いて投与することによって血中の血小板レベルの正常値
への復帰が早急におこることを見いだして本発明を完成
した。
再生不良性貧血の経過中において、重篤な出血を現に見
ているか、またはその恐れの強い病態に対して、血小板
の産生を促進することを目的として検討を行った結果、
本発明に係るヒト単球−マクロフアージコロニー刺激因
子を有効成分としてなる製剤を悪性腫瘍の化学療法にお
いて投与することによって血中の血小板レベルの正常値
への復帰が早急におこることを見いだして本発明を完成
した。
(ニ)問題点を解決するための手段 本発明の治療剤の有効成分であるコロニー刺激糖蛋白質
（以下、ＣＳＦという）は、本出願人の１人が出願した
特願昭６２−１７８６９７号に記載されており、哺乳動
物の単球−マクロフアージ系細胞のコロニー形成刺激作
用を有し、次の方法によって製造される。
（以下、ＣＳＦという）は、本出願人の１人が出願した
特願昭６２−１７８６９７号に記載されており、哺乳動
物の単球−マクロフアージ系細胞のコロニー形成刺激作
用を有し、次の方法によって製造される。
健康人の尿をpH８．０〜９．０に調整し、尿中の粘性物
質を沈澱・除去し、その上澄を分子量１０，０００〜５
０，０００ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて濃
縮と脱塩を行う。
質を沈澱・除去し、その上澄を分子量１０，０００〜５
０，０００ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて濃
縮と脱塩を行う。
少なくとも２００倍以上に濃縮（蛋白質濃度として１％
（ｗ／ｖ）以上）した後pHを６．５〜７．５に調整し、
６０℃で１０時間加熱処理（ウイルス等の不活化）す
る。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばＤＥＡＥ−セルロース等、に有効成分を吸着させ
る。
（ｗ／ｖ）以上）した後pHを６．５〜７．５に調整し、
６０℃で１０時間加熱処理（ウイルス等の不活化）す
る。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばＤＥＡＥ−セルロース等、に有効成分を吸着させ
る。
次に０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（pH６．５〜７．５）
で該イオン交換体を洗浄した後０．２〜０．４Ｍの緩衝
液（pH６．５〜７．５）で有効成分を溶出する。該溶出
液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの塩
類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（pH６．５〜
７．５）で平衡化させたゲル濾過剤、例えばSephacryl
Ｓ−３００（Pharmacia社製）でゲル濾過し、分子量
範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を
回収する。次に該画分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で
平衡化させた疎水性親和体、例えばPhenyl-Sepharose
（Pharmacia社製）に吸着させ、０．５〜１．０Ｍの塩
含有緩衝液（pH６．５〜７．５）で溶出する。該溶出液
を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例え
ばＴＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達製）でゲル濾過
し、分子量範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルト
ンの画分を回収する。該画分を再度、濃縮し、０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（pH１〜２）で平衡化
した高速液体逆相カラム、例えば、Hi−Pore ＲＰ−３
０４（バイオラド社製）に吸着させ、０．１％ＴＦＡを
含む溶剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノール
の直線濃度勾配溶出法により溶出する。このようにして
得られたＣＳＦは、比活性１×１０８単位／mg・蛋白質
以上を有する純粋な物質である。
で該イオン交換体を洗浄した後０．２〜０．４Ｍの緩衝
液（pH６．５〜７．５）で有効成分を溶出する。該溶出
液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの塩
類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（pH６．５〜
７．５）で平衡化させたゲル濾過剤、例えばSephacryl
Ｓ−３００（Pharmacia社製）でゲル濾過し、分子量
範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を
回収する。次に該画分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で
平衡化させた疎水性親和体、例えばPhenyl-Sepharose
（Pharmacia社製）に吸着させ、０．５〜１．０Ｍの塩
含有緩衝液（pH６．５〜７．５）で溶出する。該溶出液
を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例え
ばＴＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達製）でゲル濾過
し、分子量範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルト
ンの画分を回収する。該画分を再度、濃縮し、０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（pH１〜２）で平衡化
した高速液体逆相カラム、例えば、Hi−Pore ＲＰ−３
０４（バイオラド社製）に吸着させ、０．１％ＴＦＡを
含む溶剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノール
の直線濃度勾配溶出法により溶出する。このようにして
得られたＣＳＦは、比活性１×１０８単位／mg・蛋白質
以上を有する純粋な物質である。
本発明のＣＳＦは更に本ＣＳＦに対する特異抗体との反
応を利用して製造することができる。
応を利用して製造することができる。
この製造法は、次の３つの工程からなる。以下順次説明
する。
する。
コロニー刺激糖蛋白質に対する特異抗体（以下、抗Ｃ
ＳＦ抗体という）の調製 前記第１の製造法又は、別個に行なったこの製造法によ
って得られた本発明のＣＳＦを用いて、哺乳動物例えば
ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等を免疫する。即ち、本
発明のＣＳＦを０．１〜１．０mg／ｍの濃度になるよ
うに生理食塩液に溶解して、フロントの完全アジュバン
トと等量混合し、哺乳動物の皮下へ、週１〜２回、４〜
８週間投与して免疫する。免疫動物の血中抗体価が上昇
したら、静注又は皮下注による追加免疫を行い、追加免
疫後３〜７日目に採血を行い、ＣＳＦ抗血清を採取す
る。採取した抗血清のＣＳＦに対する抗体価は、後述す
るＣＳＦ生物力価中和試験によって測定されるが、抗血
清中のＣＳＦ抗体価は、１ｍ当り５×１０６単位以上
のＣＳＦ生物力価を中和する抗血清を選択することが望
ましい。採取した抗血清は、２回の硫安塩析及びＤＥＡ
Ｅ−セルローズクロマトグラフィー等によって、免疫グ
ロブリンＧ又はＭ画分の抗ＣＳＦ抗体として精製する。
また必要であれば、ＣＳＦ又は抗ＣＳＦ抗体と交錯反応
を示す夾雑タンパク質をリガンドとする抗原カラムへ抗
ＣＳＦ抗体を通液し、抗ＣＳＦ抗体のみを吸着するか又
は夾雑タンパク質を吸着させて、更に抗ＣＳＦ抗体を精
製する。
ＳＦ抗体という）の調製 前記第１の製造法又は、別個に行なったこの製造法によ
って得られた本発明のＣＳＦを用いて、哺乳動物例えば
ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等を免疫する。即ち、本
発明のＣＳＦを０．１〜１．０mg／ｍの濃度になるよ
うに生理食塩液に溶解して、フロントの完全アジュバン
トと等量混合し、哺乳動物の皮下へ、週１〜２回、４〜
８週間投与して免疫する。免疫動物の血中抗体価が上昇
したら、静注又は皮下注による追加免疫を行い、追加免
疫後３〜７日目に採血を行い、ＣＳＦ抗血清を採取す
る。採取した抗血清のＣＳＦに対する抗体価は、後述す
るＣＳＦ生物力価中和試験によって測定されるが、抗血
清中のＣＳＦ抗体価は、１ｍ当り５×１０６単位以上
のＣＳＦ生物力価を中和する抗血清を選択することが望
ましい。採取した抗血清は、２回の硫安塩析及びＤＥＡ
Ｅ−セルローズクロマトグラフィー等によって、免疫グ
ロブリンＧ又はＭ画分の抗ＣＳＦ抗体として精製する。
また必要であれば、ＣＳＦ又は抗ＣＳＦ抗体と交錯反応
を示す夾雑タンパク質をリガンドとする抗原カラムへ抗
ＣＳＦ抗体を通液し、抗ＣＳＦ抗体のみを吸着するか又
は夾雑タンパク質を吸着させて、更に抗ＣＳＦ抗体を精
製する。
抗体結合支持体の調製工程 ＣＳＦ抗体を結合し得る不溶性支持体は、抗体蛋白質の
ＮＨ２−基又はＣＯＯＨ−基と化学結合できる不溶性支
持体であれば、公知のいずれのものでも使用できる。例
えば、臭化シアン活性化又はエポキシ化多糖体ゲル、フ
オルミル化多糖体ゲル、アミノエチル化又はヒドラジド
化ポリマー等である。不溶性支持体と抗ＣＳＦ抗体との
結合反応は、選択される不溶性支持体の結合基によって
条件が異なるので、結合反応の至適条件となるよう抗体
を調整する。例えば、臭化シアン活性化支持体の場合
は、pH８〜１０の炭酸緩衝液へ、エポキシ化支持体の場
合は、pH１０以上の溶液へ、またフオルミル化支持体の
場合は、中性の溶液へ、それぞれ抗体を溶解し、調整す
る。またその結合反応の温度条件も不溶性支持体によっ
て異なるが、本発明の結合反応の場合は、２５℃以下の
低温で行なうのが望ましい。特に臭化シアン活性化支持
体の場合は、４℃以下で行う。結合させる抗体量は、不
溶性支持体１ｇ（湿重量）当り、１０〜５０mg、好まし
くは２０〜３０mgであり、結合反応時の抗体濃度を１〜
４％（ｗ／ｖ）に調整する。結合反応終了後、支持体に
残った抗体非結合反応基を適当な処理法で不活性化し、
抗体結合支持体を得る。
ＮＨ２−基又はＣＯＯＨ−基と化学結合できる不溶性支
持体であれば、公知のいずれのものでも使用できる。例
えば、臭化シアン活性化又はエポキシ化多糖体ゲル、フ
オルミル化多糖体ゲル、アミノエチル化又はヒドラジド
化ポリマー等である。不溶性支持体と抗ＣＳＦ抗体との
結合反応は、選択される不溶性支持体の結合基によって
条件が異なるので、結合反応の至適条件となるよう抗体
を調整する。例えば、臭化シアン活性化支持体の場合
は、pH８〜１０の炭酸緩衝液へ、エポキシ化支持体の場
合は、pH１０以上の溶液へ、またフオルミル化支持体の
場合は、中性の溶液へ、それぞれ抗体を溶解し、調整す
る。またその結合反応の温度条件も不溶性支持体によっ
て異なるが、本発明の結合反応の場合は、２５℃以下の
低温で行なうのが望ましい。特に臭化シアン活性化支持
体の場合は、４℃以下で行う。結合させる抗体量は、不
溶性支持体１ｇ（湿重量）当り、１０〜５０mg、好まし
くは２０〜３０mgであり、結合反応時の抗体濃度を１〜
４％（ｗ／ｖ）に調整する。結合反応終了後、支持体に
残った抗体非結合反応基を適当な処理法で不活性化し、
抗体結合支持体を得る。
抗体結合支持体によるＣＳＦの精製工程 抗体結合支持体を０．５〜１．０Ｍの塩、例えば塩化ナ
トリウムを含むpH６〜８の緩衝液で洗浄する。洗浄した
抗体結合支持体は、カラムへ充填するか又は緩衝液に懸
濁させる。前者はカラム式、クロマトグラフィー、後者
は、バッチ式クロマトグラフィーとして使用する。本発
明のＣＳＦを含有する溶液は、例えば人尿濃縮液、ＣＳ
Ｆ産生細胞培養上澄液或いはＣＳＦ遺伝子組換え細胞培
養上澄液などが用いられ、これをpH６〜８に調整し、次
いで抗体結合支持体の洗浄に使用した前記緩衝液と同一
の緩衝液と平衡化させるか又は０．５〜１．０Ｍ濃度に
なるように塩化ナトリウムを加え、この処理液と抗体結
合支持体とを接触させる。接触はカラム式又はバッチ式
のクロマトグラフィーで行なわれ、カラム式クロマトグ
ラフィーの場合は、室温以下、好ましくは１０℃以下
で、流速５〜２０ml／cm2・時間で通液させ、ＣＳＦを
抗体結合支持体のカラムへ吸着させる。吸着ＣＳＦ量
は、抗体結合支持体１ｇ（湿重量）当り、５００〜２，
０００万単位が望ましい。吸着させた後、上記緩衝液を
通液として夾雑物質を洗浄・除去する。バッチ式クロマ
トグラフィーの場合は室温又は１０℃以下で上記処理液
と抗体結合支持体を混合し、１〜１０時間攪拌する。攪
拌後、ガラス濾紙等で濾過し、抗体結合支持体を回収す
る。該抗体結合支持体を上記の緩衝液で洗浄して、夾雑
物質を完全に除去する。抗体結合支持体と特異的に吸着
したＣＳＦは、抗源抗体複合体の解離液、例えばpH２〜
３の酢酸緩衝液、３〜４Ｍのチオシアン酸塩又は０．１
〜０．２Ｍの２，４−ジニトロフエノール等の溶液で抗
体結合支持体から溶出させる。カラム式クロマトグラフ
ィーの場合は、溶離液をカラムへ通液することによっ
て、またバッチ式クロマトグラフィーの場合は抗体結合
支持体を溶離液へ懸濁し、攪拌することによって、ＣＳ
Ｆを溶出させる。ここに得られるＣＳＦは不純物が除去
された純粋なＣＳＦである。
トリウムを含むpH６〜８の緩衝液で洗浄する。洗浄した
抗体結合支持体は、カラムへ充填するか又は緩衝液に懸
濁させる。前者はカラム式、クロマトグラフィー、後者
は、バッチ式クロマトグラフィーとして使用する。本発
明のＣＳＦを含有する溶液は、例えば人尿濃縮液、ＣＳ
Ｆ産生細胞培養上澄液或いはＣＳＦ遺伝子組換え細胞培
養上澄液などが用いられ、これをpH６〜８に調整し、次
いで抗体結合支持体の洗浄に使用した前記緩衝液と同一
の緩衝液と平衡化させるか又は０．５〜１．０Ｍ濃度に
なるように塩化ナトリウムを加え、この処理液と抗体結
合支持体とを接触させる。接触はカラム式又はバッチ式
のクロマトグラフィーで行なわれ、カラム式クロマトグ
ラフィーの場合は、室温以下、好ましくは１０℃以下
で、流速５〜２０ml／cm2・時間で通液させ、ＣＳＦを
抗体結合支持体のカラムへ吸着させる。吸着ＣＳＦ量
は、抗体結合支持体１ｇ（湿重量）当り、５００〜２，
０００万単位が望ましい。吸着させた後、上記緩衝液を
通液として夾雑物質を洗浄・除去する。バッチ式クロマ
トグラフィーの場合は室温又は１０℃以下で上記処理液
と抗体結合支持体を混合し、１〜１０時間攪拌する。攪
拌後、ガラス濾紙等で濾過し、抗体結合支持体を回収す
る。該抗体結合支持体を上記の緩衝液で洗浄して、夾雑
物質を完全に除去する。抗体結合支持体と特異的に吸着
したＣＳＦは、抗源抗体複合体の解離液、例えばpH２〜
３の酢酸緩衝液、３〜４Ｍのチオシアン酸塩又は０．１
〜０．２Ｍの２，４−ジニトロフエノール等の溶液で抗
体結合支持体から溶出させる。カラム式クロマトグラフ
ィーの場合は、溶離液をカラムへ通液することによっ
て、またバッチ式クロマトグラフィーの場合は抗体結合
支持体を溶離液へ懸濁し、攪拌することによって、ＣＳ
Ｆを溶出させる。ここに得られるＣＳＦは不純物が除去
された純粋なＣＳＦである。
以上のようにして製造された本発明のＣＳＦは次のよう
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、参考例１の方法により純化したＣＳＦを用い
た。
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、参考例１の方法により純化したＣＳＦを用い
た。
a)分子量 還元剤の非存在下に、Laemmli（Nature，２２７巻、６
８０−６８５頁，１９７０年）の方法によるドデシル硫
酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子
量を測定すると、７０，０００〜９０，０００ダルトン
であった。
８０−６８５頁，１９７０年）の方法によるドデシル硫
酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子
量を測定すると、７０，０００〜９０，０００ダルトン
であった。
次に、０．２Ｍメルカプトエタノールで還元し、同様の
方法で測定すると、分子量３５，０００〜４５，０００
ダルトンのサブユニットに解離した（第１図）。
方法で測定すると、分子量３５，０００〜４５，０００
ダルトンのサブユニットに解離した（第１図）。
第１図は、本発明のＣＳＦのドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の泳動図であり、Ａ〜
Ｅは非還元（２量体）、Ｆ，Ｇは分子量マーカー蛋白
質、Ｈ〜Ｌは還元（サブユニット）を示し、縦軸の数字
は分子量（×１０３ダルトン）を示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の泳動図であり、Ａ〜
Ｅは非還元（２量体）、Ｆ，Ｇは分子量マーカー蛋白
質、Ｈ〜Ｌは還元（サブユニット）を示し、縦軸の数字
は分子量（×１０３ダルトン）を示す。
b)サブユニット蛋白質のアミノ酸配列 ＮＨ２−末端アミノ酸配列は、純化ＣＳＦを気相アミノ
酸シーケンサーで常法により分析した。次に純化ＣＳＦ
を６Ｍグアニジンで変性させ、モノヨード酢酸でアルキ
ル化した後、脱塩し、トリプシン消化及び臭化シアン分
解を行った。トリプシン消化及び臭化シアン分解ペプチ
ドをVydacＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーで
分画し、分解されたペプチド画分を得、各画分をそれぞ
れ気相アミノ酸シーケンサーで分析し、ペプチド断片の
アミノ酸配列を分析した。トリプシン消化及び臭化シア
ン分解ペプチド断片のアミノ酸配列と本発明者らがクロ
ーニングしたｍＲＮＡの塩基配列から、サブユニット蛋
白質のアミノ酸一次構造を決定した。その結果は第１表
に示すとおりである。
酸シーケンサーで常法により分析した。次に純化ＣＳＦ
を６Ｍグアニジンで変性させ、モノヨード酢酸でアルキ
ル化した後、脱塩し、トリプシン消化及び臭化シアン分
解を行った。トリプシン消化及び臭化シアン分解ペプチ
ドをVydacＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーで
分画し、分解されたペプチド画分を得、各画分をそれぞ
れ気相アミノ酸シーケンサーで分析し、ペプチド断片の
アミノ酸配列を分析した。トリプシン消化及び臭化シア
ン分解ペプチド断片のアミノ酸配列と本発明者らがクロ
ーニングしたｍＲＮＡの塩基配列から、サブユニット蛋
白質のアミノ酸一次構造を決定した。その結果は第１表
に示すとおりである。
ＮＨ２−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から１４９
番目のグルタミンまでは、公知のＣＳＦ−１と同一であ
るが、１５０番目から２１４番目までの６５個のアミノ
酸は、公知のそれと全く異なっていた。
番目のグルタミンまでは、公知のＣＳＦ−１と同一であ
るが、１５０番目から２１４番目までの６５個のアミノ
酸は、公知のそれと全く異なっていた。
また、ＣＯＯ−末端のアミノ酸としては、サブユニット
蛋白質の分子量に応じ２１４番目にプロリンが検出され
た。１２２番目と１４０番目のアスパラギンは、Ａｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−グリコシド結合部
位を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定さ
れた。ここでＸは任意のアミノ酸を示す。
蛋白質の分子量に応じ２１４番目にプロリンが検出され
た。１２２番目と１４０番目のアスパラギンは、Ａｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−グリコシド結合部
位を有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定さ
れた。ここでＸは任意のアミノ酸を示す。
c)等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、ｐＩは３．１〜３．７であった。
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、ｐＩは３．１〜３．７であった。
d)糖鎖の構成単糖 ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度
勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニン
によるポストカラム標識した後、ケイ光法により同定し
た。本ＣＳＦ分子に含有される糖鎖は不均一であり、定
量することは困難であったが、構成単糖としてマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が
同定された。
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度
勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニン
によるポストカラム標識した後、ケイ光法により同定し
た。本ＣＳＦ分子に含有される糖鎖は不均一であり、定
量することは困難であったが、構成単糖としてマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が
同定された。
e)円二色性スペクトル 円二色性分散計（ＪＡＳＣＯ社製Ｊ−６００）で遠紫外
部に於けるＣＤスペクトルを測定した（第２図）。
部に於けるＣＤスペクトルを測定した（第２図）。
第２図は本発明のＣＳＦのＣＤスペクトルを示し、横軸
は波長（nm）、縦軸は楕円率（mdeg）を示す。波長２０
８nm及び２２２nmにおいて極小ピークがみとめられ、本
ＣＳＦの二次構造にα−ヘリックス構造が含まれている
ものと推定された。
は波長（nm）、縦軸は楕円率（mdeg）を示す。波長２０
８nm及び２２２nmにおいて極小ピークがみとめられ、本
ＣＳＦの二次構造にα−ヘリックス構造が含まれている
ものと推定された。
f)熱安定性 本ＣＳＦを１μｇ／ｍの濃度で、希釈緩衝液（pH７．
０）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加熱し、その
コロニー刺激活性（後述）を測定したが、活性の低下は
ほとんど認められなかった。
０）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加熱し、その
コロニー刺激活性（後述）を測定したが、活性の低下は
ほとんど認められなかった。
g)赤外線吸収スペクトル 本ＣＳＦの凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ
窓）によりフーリエ変換赤外分光装置（Nicolet社製５
ＤＸＣ）を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは第３
図に示すとおりであった。第３図の横軸は波数（cm-1）
を縦軸は透過率を示す。
窓）によりフーリエ変換赤外分光装置（Nicolet社製５
ＤＸＣ）を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは第３
図に示すとおりであった。第３図の横軸は波数（cm-1）
を縦軸は透過率を示す。
本ＣＳＦは１６５０cm-1、１２０１cm-1及び１１３３cm
-1に強い吸収、１５３７cm-1、１４３２cm-1及び１０６
８cm-1に中程度の吸収を示した。
-1に強い吸収、１５３７cm-1、１４３２cm-1及び１０６
８cm-1に中程度の吸収を示した。
上記の理化学的性質を有し、且つ哺乳動物の単球−マク
ロフアージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有する糖蛋
白質は、前記の製造法により人尿から製造され、バイア
ル瓶中で無菌的に凍結乾燥され、粉末状で密封される。
凍結乾燥に先だちＣＳＦの安定剤としての人血清アルブ
ミン及び溶解補助剤としてのアミノ酸又は糖類を含有す
る水溶液を加え、無菌濾過し、のち無菌的に凍結乾燥し
てもよい。
ロフアージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有する糖蛋
白質は、前記の製造法により人尿から製造され、バイア
ル瓶中で無菌的に凍結乾燥され、粉末状で密封される。
凍結乾燥に先だちＣＳＦの安定剤としての人血清アルブ
ミン及び溶解補助剤としてのアミノ酸又は糖類を含有す
る水溶液を加え、無菌濾過し、のち無菌的に凍結乾燥し
てもよい。
なお、本発明のＣＳＦのコロニー刺激活性は、マウス骨
髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で
測定した。ＣＳＦ試料を０．３％寒天、２０％牛胎児血
清（ＦＣＳ）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含むMc
Coy′ｓ５Ａ倍地１ｍと混合し、７．５％ＣＯ２通気
下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上の細
胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計
測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位は１
コロニーを形成させるに必要なＣＳＦ量と規定した。ま
た非活性は、ＣＳＦ蛋白質１mg当り形成されるコロニー
数（単位）で表した。その結果、本発明のＣＳＦは、
１．４×１０８単位／mg・蛋白質の比活性を有してい
た。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジ
ン染色して形態学的に分類したところ、９５％以上のコ
ロニーが単球−マクロフアージから形成されていた。
髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で
測定した。ＣＳＦ試料を０．３％寒天、２０％牛胎児血
清（ＦＣＳ）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含むMc
Coy′ｓ５Ａ倍地１ｍと混合し、７．５％ＣＯ２通気
下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上の細
胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数を計
測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位は１
コロニーを形成させるに必要なＣＳＦ量と規定した。ま
た非活性は、ＣＳＦ蛋白質１mg当り形成されるコロニー
数（単位）で表した。その結果、本発明のＣＳＦは、
１．４×１０８単位／mg・蛋白質の比活性を有してい
た。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−エオジ
ン染色して形態学的に分類したところ、９５％以上のコ
ロニーが単球−マクロフアージから形成されていた。
本発明の製剤は、例えば注射用生理食塩水、注射用蒸留
水等に１０〜１００mg／ｍに溶解して、点滴、直接静
注、筋肉内、又は皮下に投与される。
水等に１０〜１００mg／ｍに溶解して、点滴、直接静
注、筋肉内、又は皮下に投与される。
投与量は、１回１，０００単位／kg体重〜１５万単位／
kg体重を使用するが症状によっては適宜増・減量可能で
ある。
kg体重を使用するが症状によっては適宜増・減量可能で
ある。
投与時期は、化学療法及び放射線療法後、造血障害が始
まったと思われる時点がよい。投与は、血小板レベルが
一定状態になるまでその変動に応じて数回、数日間（２
〜１４日間）行ってもよい。
まったと思われる時点がよい。投与は、血小板レベルが
一定状態になるまでその変動に応じて数回、数日間（２
〜１４日間）行ってもよい。
投与対象は、造血障害によって誘起せしめられる血小板
減少症の患者であれば特に限定されない。
減少症の患者であれば特に限定されない。
(ホ)発明の効果 前記対象患者に、実施例に示すように、本発明の製剤を
投与したところ、血中内血小板レベルは、著明な改善が
認められた。またその投与結果として有害な副作用は観
察されなかった。かくして本発明の製剤は血小板減少症
治療剤として有用であることが示唆される。
投与したところ、血中内血小板レベルは、著明な改善が
認められた。またその投与結果として有害な副作用は観
察されなかった。かくして本発明の製剤は血小板減少症
治療剤として有用であることが示唆される。
(ヘ)実施例・参考例 以下に本発明の製剤の薬理効果についての実験例、毒性
についての実験例、臨床実施例、参考例を示すが、本発
明はなんらこれらの例に限定されるものではない。
についての実験例、臨床実施例、参考例を示すが、本発
明はなんらこれらの例に限定されるものではない。
実験例１（毒性） 参考例１により調製された糖蛋白質を用いて急性毒性を
リチャードらの方法（ジャーナル・オブ・フアルマコロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・セラビユテイク
ス、９０巻、９９頁、１９４９年）によりＣ５７ＢＬ系
雄性マウスで試験した。
リチャードらの方法（ジャーナル・オブ・フアルマコロ
ジー・アンド・エクスペリメンタル・セラビユテイク
ス、９０巻、９９頁、１９４９年）によりＣ５７ＢＬ系
雄性マウスで試験した。
その結果を第２表に示す。
臨床実施例１ 悪性腫瘍の患者に第１回目の化学療法後、観察のみ行い
（コントロール相）、２回目の化学療法後にｈＭ−ＣＳ
Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を連続７
日巻点滴静注した（製剤投与相）。経時的に血中の顆粒
球、血小板数を計測し、その変動を第３表に示す。ま
た、コントロール相と製剤投与相の血小板数の最低値お
よび血小板レベルが１０万／mm3以上に回復するのに要
する日数を比較し第４表に示す。
（コントロール相）、２回目の化学療法後にｈＭ−ＣＳ
Ｆを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を連続７
日巻点滴静注した（製剤投与相）。経時的に血中の顆粒
球、血小板数を計測し、その変動を第３表に示す。ま
た、コントロール相と製剤投与相の血小板数の最低値お
よび血小板レベルが１０万／mm3以上に回復するのに要
する日数を比較し第４表に示す。
治療法：1/19CPA(Cyclophosphamide) 600mg ACR(Aclarubicin) 60mg CDDP(Cis-platinum) 75mg 2/23CPA(Cyclophosphamide) 600mg ACR(Aclarubicin) 60mg CDDP(Cis-platinum) 75mg 2/24から７日間hM-CSF製剤投与 （８００万単位／day） 臨床実施例２ 悪性腫瘍の患者１０名に第１回目の化学療法後、観察の
み行い（コントロール相）、２回目の化学療法後にｈＭ
−ＣＳＦを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を
連続７日間点滴静注した（製剤投与相）。経済的に血中
の血小板数を計測し、コントロール相と製剤投与相の血
小板数の最低値および血小板レベルが１０万／mm3以上
に回復するのに要する日数を比較し第５表に示す。
み行い（コントロール相）、２回目の化学療法後にｈＭ
−ＣＳＦを有効成分としてなる糖蛋白質８００万単位を
連続７日間点滴静注した（製剤投与相）。経済的に血中
の血小板数を計測し、コントロール相と製剤投与相の血
小板数の最低値および血小板レベルが１０万／mm3以上
に回復するのに要する日数を比較し第５表に示す。
参考例１ 健常人の尿２００をpH８．５に調整し、沈澱物を濾過
除去し、分画分子量５０，０００ダルトンの限外濾過膜
（アミコン社、Ｈ１０×５０）で濃縮と脱塩を行った。
次に、濃縮液をpH７．０に調整し、密封容器内で６０
℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離（５，０
００×ｇ３０分間）して沈澱物を除去した後、０．０２
Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−セルロース
を０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩添加０．０
２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で溶出させた。溶出液を
限外濾過膜（アミコン社Ｈ１Ｐ１０）で濃縮して、Seph
acryl Ｓ−３００（フアルマシア社、φ４×８０cm）
を用い、１Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）でゲル濾過し
た。ゲル濾過での分子量範囲７０，０００〜１５０，０
００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫安添加緩衝液で平衡化
したPhenyl-Sepharose ４Ｂカラム（フアルマシア社
製、φ２×２０cm）に吸着させ、次いで、０．５Ｍ硫安
添加緩衝液（pH７．２）で溶出させた。溶出液を限外濾
過膜（旭化成製、ＮＭ−３）で濃縮して、ＴＳＫＧ−
３，０００ＳＷカラム（東洋曹達製、φ４×６００mm×
２）で高速液体クロマトグラフィーにかけ、分子量範囲
７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を得た。
この画分を再度濃縮し、Hi-PoreＲＰ−３０４（バイオ
ラド社製、φ４×１５０mm）の逆相カラムで０．１Ｍト
リフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル０−１００％
（pH２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグ
ラフィーにかけ、ＣＳＦを溶出し、精製された比活性
１．４×１０８単位／mg・蛋白質のＣＳＦを得た。上記
製造工程の各ステップにおけるＣＳＦの精製度は第６表
に示すとおりであった。
除去し、分画分子量５０，０００ダルトンの限外濾過膜
（アミコン社、Ｈ１０×５０）で濃縮と脱塩を行った。
次に、濃縮液をpH７．０に調整し、密封容器内で６０
℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離（５，０
００×ｇ３０分間）して沈澱物を除去した後、０．０２
Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−セルロース
を０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩添加０．０
２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で溶出させた。溶出液を
限外濾過膜（アミコン社Ｈ１Ｐ１０）で濃縮して、Seph
acryl Ｓ−３００（フアルマシア社、φ４×８０cm）
を用い、１Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）でゲル濾過し
た。ゲル濾過での分子量範囲７０，０００〜１５０，０
００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫安添加緩衝液で平衡化
したPhenyl-Sepharose ４Ｂカラム（フアルマシア社
製、φ２×２０cm）に吸着させ、次いで、０．５Ｍ硫安
添加緩衝液（pH７．２）で溶出させた。溶出液を限外濾
過膜（旭化成製、ＮＭ−３）で濃縮して、ＴＳＫＧ−
３，０００ＳＷカラム（東洋曹達製、φ４×６００mm×
２）で高速液体クロマトグラフィーにかけ、分子量範囲
７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を得た。
この画分を再度濃縮し、Hi-PoreＲＰ−３０４（バイオ
ラド社製、φ４×１５０mm）の逆相カラムで０．１Ｍト
リフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル０−１００％
（pH２．０）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグ
ラフィーにかけ、ＣＳＦを溶出し、精製された比活性
１．４×１０８単位／mg・蛋白質のＣＳＦを得た。上記
製造工程の各ステップにおけるＣＳＦの精製度は第６表
に示すとおりであった。
得られたＣＳＦは、前記した第１表に示す２１４個のア
ミノ酸配列を有していた。
ミノ酸配列を有していた。
参考例２ 参考例１で得られたＣＳＦで免疫され、抗体価が十分に
上昇したウサギ１０羽より抗ＣＳＦ抗血清を採取し、前
記の方法により精製された抗ＣＳＦ抗体を約４ｇ得
た。抗ＣＳＦ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）
中で透析し、２０mg／ｍ濃度に調整した。該抗体溶液
２００ｍを、あらかじめ蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩
衝液で洗浄した１００ｇのフオルミル−セルロフアイン
へ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化シアノホウ素
ナトリウム７００mgを加えて、更に１６時間攪拌し、フ
オルミル−セルロフアインと抗ＣＳＦ抗体を結合させ抗
体結合支持体を調製した。結合後、０．２Ｍトリス−塩
酸緩衝液で洗浄し、更に水素化シアノホウ素ナトリウム
５００mgを含むトリス緩衝液２００mlを加え、室温で４
時間攪拌して、未反応基を不活化した。次いで抗体結合
支持体を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０２Ｍリン
酸緩衝液で十分洗浄した。抗体結合支持体は、支持体１
ｇ当り、２９．５mgの抗ＣＳＦ抗体を結合していた。次
に、健常人尿１，０００を限外濾過濃縮機で濃縮し、
脱塩した後、ＤＥＡＥ−セルローズに吸着させ、非吸着
の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出
し、該溶出液に０．５Ｍ濃度になるよう塩化ナトリウム
を加えてＣＳＦを含有する溶液を調整した。このＣＳＦ
の比活性は２×１０５単位／mgであった。上記抗体結合
支持体１００ｇに対し、このＣＳＦを含有する溶液（全
量５００ml）を加え、１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式
クロマトグラフィー処理を行なった。攪拌後、ガラスフ
ィルターで濾過して、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ
ＮａＣｌを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体
結合支持体を十分に洗浄した。洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩
衝液（pH２．５）５００ｍを加え、１０℃、１時間攪
拌して、ＣＳＦを溶出した。溶出液のpHを７．０にした
後、限外濾過膜で濃縮・脱塩して、精製ＣＳＦ約１０mg
を得た。精製ＣＳＦの比活性は５．２×１０７単位／m
g、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９０％以上であっ
た。得られたＣＳＦは、前記した第１表に示す２１４個
のアミノ酸配列を有していた。
上昇したウサギ１０羽より抗ＣＳＦ抗血清を採取し、前
記の方法により精製された抗ＣＳＦ抗体を約４ｇ得
た。抗ＣＳＦ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）
中で透析し、２０mg／ｍ濃度に調整した。該抗体溶液
２００ｍを、あらかじめ蒸留水及び０．１Ｍリン酸緩
衝液で洗浄した１００ｇのフオルミル−セルロフアイン
へ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化シアノホウ素
ナトリウム７００mgを加えて、更に１６時間攪拌し、フ
オルミル−セルロフアインと抗ＣＳＦ抗体を結合させ抗
体結合支持体を調製した。結合後、０．２Ｍトリス−塩
酸緩衝液で洗浄し、更に水素化シアノホウ素ナトリウム
５００mgを含むトリス緩衝液２００mlを加え、室温で４
時間攪拌して、未反応基を不活化した。次いで抗体結合
支持体を０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０２Ｍリン
酸緩衝液で十分洗浄した。抗体結合支持体は、支持体１
ｇ当り、２９．５mgの抗ＣＳＦ抗体を結合していた。次
に、健常人尿１，０００を限外濾過濃縮機で濃縮し、
脱塩した後、ＤＥＡＥ−セルローズに吸着させ、非吸着
の夾雑物質を除去し、０．３Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出
し、該溶出液に０．５Ｍ濃度になるよう塩化ナトリウム
を加えてＣＳＦを含有する溶液を調整した。このＣＳＦ
の比活性は２×１０５単位／mgであった。上記抗体結合
支持体１００ｇに対し、このＣＳＦを含有する溶液（全
量５００ml）を加え、１０℃以下で一夜攪拌しバッチ式
クロマトグラフィー処理を行なった。攪拌後、ガラスフ
ィルターで濾過して、抗体結合支持体を集め、０．５Ｍ
ＮａＣｌを含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液で該抗体
結合支持体を十分に洗浄した。洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩
衝液（pH２．５）５００ｍを加え、１０℃、１時間攪
拌して、ＣＳＦを溶出した。溶出液のpHを７．０にした
後、限外濾過膜で濃縮・脱塩して、精製ＣＳＦ約１０mg
を得た。精製ＣＳＦの比活性は５．２×１０７単位／m
g、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９０％以上であっ
た。得られたＣＳＦは、前記した第１表に示す２１４個
のアミノ酸配列を有していた。
第１図は本発明のＣＳＦのドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の泳動
図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明ＣＳＦの
遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを示
す。 第１図において、 Ａ〜Ｅ……非還元物（２量体） Ｆ，Ｇ……分子量マーカ蛋白質 Ｈ〜Ｌ……還元物（サブユニット）
リアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の泳動
図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明ＣＳＦの
遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを示
す。 第１図において、 Ａ〜Ｅ……非還元物（２量体） Ｆ，Ｇ……分子量マーカ蛋白質 Ｈ〜Ｌ……還元物（サブユニット）
Claims (1)
- 【請求項１】造血障害によって誘起せしめられる血小板
減少症の治療及びその予防を目的として投与される、以
下に示す物理化学的性質を有する人尿由来のヒト単球−
マクロファージコロニー刺激因子を有効成分として成る
血小板減少症治療剤： a)分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であって、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した分子量が70,000〜90,000ダルトンであ
り、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブユニ
ットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で測定した分子量は、35,000〜45,000
ダルトンである； b)サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、以下に示
す214個のアミノ酸配列を有する； c)等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点(pI)
は、3.1〜3.7である； d)糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸である； e)円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長208n
m及び222nmにそれぞれ極小ピークがあり、α−ヘリック
ス構造を含んでいる； f)熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失われない； g)赤外線吸収スペクトル 凍結乾燥粉末について透過測定法（KBr窓）によりフー
リエ変換赤外分光装置（Nicolet社製5DXC）を用いて測
定した赤外線吸収スペクトルにおいて、1650cm-1、1201
cm-1及び1133cm-1に強い吸収、1537cm-1、1432cm-1及び
1068cm-1に中程度の吸収を示す。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63029819A JPH0611705B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 血小板減少症治療剤 |
| US07/308,593 US5114710A (en) | 1988-02-10 | 1989-02-10 | M-csf as a therapeutic agent for thrombocytopenia |
| KR1019890001511A KR970009890B1 (ko) | 1988-02-10 | 1989-02-10 | 혈소판감소증치료제 |
| CA000590795A CA1332149C (en) | 1988-02-10 | 1989-02-10 | Therapeutic agent for thrombocytopenia |
| EP89102324A EP0328132B1 (en) | 1988-02-10 | 1989-02-10 | Therapeutic agent for thrombocytopenia |
| ES89102324T ES2042818T3 (es) | 1988-02-10 | 1989-02-10 | Agente terapeutico para la trombocitopenia. |
| DE89102324T DE68907933T2 (de) | 1988-02-10 | 1989-02-10 | Therapeutisches Mittel für Thrombocytopenia. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63029819A JPH0611705B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 血小板減少症治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01207244A JPH01207244A (ja) | 1989-08-21 |
| JPH0611705B2 true JPH0611705B2 (ja) | 1994-02-16 |
Family
ID=12286632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63029819A Expired - Lifetime JPH0611705B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 血小板減少症治療剤 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5114710A (ja) |
| EP (1) | EP0328132B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0611705B2 (ja) |
| KR (1) | KR970009890B1 (ja) |
| CA (1) | CA1332149C (ja) |
| DE (1) | DE68907933T2 (ja) |
| ES (1) | ES2042818T3 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH07103041B2 (ja) * | 1989-04-04 | 1995-11-08 | 森永乳業株式会社 | 悪性腫瘍治療補助剤 |
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