JPH0676337B2 - 高純度抗血友病性因子濃縮物の製造法 - Google Patents

高純度抗血友病性因子濃縮物の製造法

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JPH0676337B2
JPH0676337B2 JP60167835A JP16783585A JPH0676337B2 JP H0676337 B2 JPH0676337 B2 JP H0676337B2 JP 60167835 A JP60167835 A JP 60167835A JP 16783585 A JP16783585 A JP 16783585A JP H0676337 B2 JPH0676337 B2 JP H0676337B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は塩化ナリトウムと共に水酸化アルミニウムゲ
ル、ポリエチレングリコール及びグリシンを含む通常の
沈殿剤を用いて抗血友病性因子（AHF）含有分散体を多
段精製することにより該分散体からの改善された特異活
性及び減少されたフイブリノゲン（fibrinogen）不純物
量を有する高純度抗血友病性因子濃縮物（concentrat
e）の製造方法に関するものである。
ポルソン（Polson）による米国特許第3,415,804号に （１）水の存在下で蛋白物質をポリエチレングリコール
（PEG）と混合して分散体を生成させ、その際にPEG−水
分散体は溶媒相のみで存在し； （２）蛋白物質及び工程（１）における混合物中の残り
の成分の相対濃度を蛋白相及び水を含む水性液体相並び
に混合物の残りの成分を効果的に分離させるpH値及び温
度に調整し； （３）該蛋白相及び該水性液体相を工程（２）から分離
し；そして （４）蛋白性分別生成物を工程（３）からの該フラクシ
ヨンの少なくとも１つから回収することによる蛋白物質
の混合物の４段階の分別方法が定義されている。
この特許の方法に用いる際に適するポリエチレングリコ
ールは300〜100,000、好ましくは600〜20,000、更に好
ましくは1,500〜20,000、例えば6,000の範囲の分子量を
有する。またポルソンは十分公知の他のパラメータ、例
えばpH値を蛋白成分の等電点に近づけて調整し、そして
イオン性濃度を低め、且つ蛋白成分の分離を高めるため
に温度を増加させるか、または低下させることは同じ効
果を持たせるために該方法に使用し得ることを開示して
いる。
シヤンブロム（shanbrom）らによる米国特許第3,631,01
8号にAHFの濃縮物の改善された製造方法が開示されてお
り、その際に改善法は （１）最初に約３〜４重量％のポリエチレングリコール
を用い、続いて上澄みを回収し； （２）次にポリエチレングリコールを約10重量％までに
加え、続いて生じる沈殿を回収し；そして （３）最後に工程（２）からの沈殿の溶液に1.3〜1.8M
のグリシンを加え、続いて生じる沈殿を回収する３段階
沈殿においてポリエチレングリコール及びグリシンの両
方を用いてAHFの低温沈殿（cryoprecipitate）濃縮物を
分別する。
この特許の方法を用いる際に適するポリエチレングリコ
ールは200〜20,000、好ましくは400〜6,000、更に好ま
しくは約4,000の範囲の分子量を有している。この特許
は温度及びpH値に関していずれの限定した範囲も示して
いない。しかしながら、この特許における実施例４は室
温及びpH6.5〜6.88で沈殿を行うことを示している。
ジヨンソン（Johnson）らによる米国特許第3,652,530号
に最初に水酸化アルミニウムゲルを用いてpH5.6〜7.0
で、次にポリエチレングリコールを3.0〜6.5％の濃縮物
に、そして最後にポリエチレングリコールを10〜12％の
濃縮物に加えて高純度のAHFを含む沈殿を得ることから
なる順次３工程の沈殿におけるポリエチレングリコール
を用いる低温エタノール（cryo-ethanol）沈殿により得
られる沈殿物の抽出液を処理することにより高純度のAH
Fを調製する方法が開示されている。
フエケテ（Fekete）らによる米国特許第3,682,881号に
1.5〜1.8Mグリシンで処理されたクエン酸塩加血漿から
プロトンビン錯体及びAHF濃縮物の製造方法を開示して
いる。生じた沈殿をポリエチレングリコールを用いて最
初は３〜４％、次に10重量％の濃縮物に、そして最後に
1.8Mグリシンを用いて順次処理した。
シユワルツ（Schwarz）らによる米国特許第4,404,131号
に通常の分別、例えば低温沈殿により得られるＦ。VIII
を低温アルコールで沈殿させてＦ。VIII濃縮物を調製す
る改善された方法が開示されている。
フエケテらによる米国再発行特許第29,698号にヘパリン
の添加による低温沈殿で得られる血漿及び血漿フラクシ
ヨンから得られるAHFの収率を改善する方法が開示され
ている。次にヘパリン処理された低温沈殿をポリエチレ
ングリコール及びグリシンを用いて更に分別することが
できる。ヘパリン処理された低温沈殿を更に分別した場
合、ヘパリンは好ましくは２回、１回は最初の低温沈
殿、そして続いて更に分別された濃縮物に加えられる。
シヤンブロムによる米国特許第4,069,216号にシヤンブ
ロムらによる上記の米国特許第3,631,018号に関示され
た改善法が開示されており、その際にこの工程において
沈殿が起こるまでＦ。VIII及び６％ポリオールの緩衝溶
液を０〜５℃に保持する。
ミトラ（Mitra）らによる米国特許第4,386.068号に水酸
化アルミニウムゲルを用いてAHF蛋白質を含む低温沈殿
の水性懸濁液を処理し、生じる溶液を限外ろ過し、次に
限外ろ過物を緩衝液及び塩水中で溶液化することによる
AHF濃縮物の製造方法が開示されている。場合によつて
は、限外ろ過から生じる溶液を更に精製するために1.6
〜2.2Mグリシンで処理することができる。
ブロムバツク（Blomback）らによる米国特許第4,348,31
5号に不純物と共にＦ。VIIIを含む組成物を15℃及びpH
6.3〜7.8で1.5Mグリシンに溶解させてＦ。VIIIを含む溶
液及び不純物を含む沈殿を得ることにより低温沈殿また
はコーン（Cohn）・フラクシヨンI-Oから出発するＦ。V
III錯体の精製及び／または濃縮方法が開示されてい
る。場合によつては、この特許の方法には生じるＦ。VI
II含有グリシン溶液にPEGを加え、続いて沈殿させ、次
に精製させたＦ。VIIIを溶液から濃縮する追加の工程が
含まれる。
ロツク（Rock）による米国特許第4,203,891号に血液ま
たは血漿もしくは血漿フラクシヨンを供与者から直接ヘ
パリン、ナトリウムヘパリンまたはその混合物から選ば
れ、カルシウムの生理学的濃度を減少させない抗凝固剤
中に捕集し、そしてAHFを回収することにより全血液、
血漿または血漿フラクシヨンからの抗血友病性因子VIII
（AHF）の収率を増加させる方法が開示されている。好
ましくは、全血液または血漿の全容量を基準として0.1
〜10単位/mlの範囲で抗凝固剤を用い、そしてグリシ
ン、エタノール、エタノール−グリシン、ポリエチレン
グリコールまたはグリシン−ポリエチレングリコール沈
殿を用いる分別によりAHFを回収する。
ロツクらによる米国特許第4,289,691号に約１〜10単位/
mlの範囲の血漿中で使用されるヘパリンをカルシウムキ
レート化抗凝固剤中に血漿搬出法により捕集された新鮮
な血漿に加え、血漿を凍結し、血漿を再溶解し、低温沈
殿を血漿から単離し、低温沈殿を再溶解し、再溶解した
低温沈殿にクエン酸塩液ヘパリン緩衝溶液を加え、再溶
解し、緩衝液を加えた低温沈殿をヘパリン沈殿可能な冷
却不溶性グロブリンの存在下にて約０〜10℃で約１時間
を越える時間培養し、AHFに富む沈殿を分離し、そして
沈殿からAHFを単離することにより新鮮な血漿からAHFを
得る方法が開示されている。
アムラニ（Amrani）による米国特許第4,210,580号に硫
酸塩化されたムコ多糖類例えばヘパリンの存在下で約0.
15〜0.25mg/ml血漿（ヘパリン約22.5〜37.5単位/ml血
漿）の濃度にAHF及びフイブロネクチン（fibronectin）
を低温沈殿（０〜15℃）により分離し、そして単離する
方法が開示されている。生じるフイブロネクチン沈殿物
をクロマトグラフイーで精製し、そしてヘパリン上澄み
を陰イオン交換樹脂例えばヘパラソルブ（Heparasorb）
を有するDEAEと混合してヘパリンを除去し、90〜95％の
初期の凝血促進剤活性を有する上澄みを与える。
ロツクによる米国特許第4,383,989号にクエン酸塩緩衝
液を存在させずに新たに得られた血漿または血漿フラク
シヨンをヘパリン約６〜８単位/ml血漿の比でヘパリ
ン、ナトリウムヘパリンまたはその混合物中に直接捕集
し、そしてヘパリン沈殿可能な冷却不溶性グロブリンを
用いる冷却培養法（０〜10℃）を適用することによりAH
Fを得る方法が開示されている。
フエケテらによる米国特許出願第29,698号に低温沈殿に
より血漿または血漿フラクシヨンから得られるAHFの濃
縮物1ml当り0.01〜10単位のヘパリンを加えることによ
り血漿及び血漿フラクシヨンからのAHFの収率を改善す
る方法が開示されている。
スペイン国特許第8,307,101号（Derwent Abstract 84-0
25300/05）に低温沈殿の冷却精製、トリス−塩酸緩衝液
中での因子VIIIの抽出、ヘパリンを用いるプロトロンビ
ン錯体の脱活性化、及びポリエチレングリコールを用い
るフイブリノゲンの選択的沈殿による高純度AHFの製造
方法が開示されている。生じる溶液を追加のポリエチレ
ングリコールで処理して約０〜２℃で低温沈殿を含む因
子VIIIを得る。
抗血友病性因子（「AHF」及び「Ｆ。VIII」とも称す
る）の製造方法は促進された特異的活性及び純度に関す
る生成物の品質、及びまた生成物であるAHFの収率また
は回収率においてある程度の改善を与えるが、従来の方
法で得られるAHF特異的活性の減少を最少にして高収率
及び高純度でAHF濃縮物を得るために更に工程を改善す
る必要性が残されている。
本発明は血漿または血漿フラクシヨンからの抗血友病性
因子の一段または多段製造方法の別々及び異なつた工程
で単独で使用されていた２つまたはそれ以上の蛋白沈殿
剤を配合し、ある範囲内の沈殿剤及び出発物質を含む出
発抗血友病性因子の量及び比率、pH値並びに媒質の温度
を用いることにより、約10またはそれ以上の促進された
特異的活性、抗血友病性因子単位1,000当り20mgまたは
それ以下のフイブリノゲンの範囲に減少されたフイブリ
ノゲン量、及び従来法と比較して改善された抗血友病性
因子の収率を有する抗血友病性因子生成物を得ることが
できることからなる発見である。
従つて、ある特徴において、本発明は場合によつて、且
つ好ましくはヘパリンもしくはナトリウムヘパリンまた
はその混合物も含み、水酸化アルミニウムゲル、ポリエ
チレングリコール及びグリシンから選ばれる抗血友病性
因子蛋白沈殿剤を有する抗血友病性因子含有分散体また
は溶液を多段精製工程にて処理することにより高純度の
状態及び高収率で、且つ促進された抗血友病性因子凝固
活性を保持する抗血友病性因子濃縮物を製造する改善さ
れた方法であり、その際に該改善法は各々の沈殿におい
て沈殿物の配合体を用い、最初に分散体または溶液に酸
性のpH値及び約５〜10℃の温度下で抗血友病性因子含有
分散体または溶液の容量を基準として約１〜４重量％の
ポリエチレングリコールを有する約１〜３％の水酸化ア
ルミニウムゲルを加え、続いて生じる沈殿を捨て、そし
て生じる上澄みを溶液を回収し、次に回収された溶液中
のポリエチレングリコール濃度を最初の沈殿からの上澄
み溶液の容量を基準として約９〜15重量％に増加させる
に十分に加えられたポリエチレングリコールと生じる溶
液の全容量を基準として約10〜20重量％のグリシン及び
生じる溶液の全容量を基準として約10〜20％（重量／容
量）の塩化ナトリウムとの配合物を用い、酸性のpH値及
び約５〜10℃の温度で加え、続いて生じる上澄み液を捨
て、そして生じる沈殿を回収することにより抗血友病性
因子含有分散体または溶液を順次２段階で沈殿させるこ
とからなる。かくて回収された沈殿は高純度の抗血友病
性因子濃縮生成物を含有する。
他の特徴において、本発明は本発明による方法で製造さ
れる高純度抗血友病性因子濃縮物である。かくて生成さ
れる高純度抗血友病性因子濃縮物は通常の生理学的に適
用し得る水性緩衝溶液に溶解させることができ、このも
のに場合によつては通常の製薬学的賦形剤を加えて製薬
学的調製物を提供し得る。抗血友病性因子濃縮物または
その製薬学的調製物は通常の技術及び方法を用いて処理
し、感染性微生物を減少させるか、または除去し、次に
濃縮物または製薬学的調製物で処理された患者に非感染
性にさせることができる。
出発物質として、抗血友病性因子（AHF）を含む血漿ま
たは血漿フラクシヨンを用いることができる。好ましく
は、出発物質は血漿フラクシヨン、更に詳細にはAHF含
有低温沈殿、例えばハーシユゴールド（Hershgold）ら
によるＪ。Lab。＆Clin。Med。，67,23（1966）、ハー
ゲン（Hagen）らによる米国特許第3,973,002号及びリユ
ー（Liu）らによる米国特許第4,170,639号に記載される
方法により製造されるものであろう。約２〜６℃からの
温度で凍結された新鮮な血漿を溶解し、溶解した血漿を
遠心分離し、そして固体残渣−低温沈殿を捕集すること
により低温沈殿を生成させる。次に低温沈殿を水、水性
緩衝液または水性塩溶液、好ましくは射出用水（FWI）
に懸濁させることによりこのものを可溶化し、低温沈殿
の分散体または溶液を得る。低温沈殿は１〜80％（重量
／容量）、好ましくは約２〜50％（重量／容量）、更に
好ましくは約５〜25％（重量／容量）、そして最も好ま
しくは約10〜20％（重量／容量）の濃度で水溶液中に存
在させ得る。
好適な具体例において、本法において１つまたはそれ以
上の工程でヘパリンの添加を用いることができる。この
好適な具体例の特徴において、低温沈殿ヘパリンもしく
はナトリウムヘパリンまたはその混合物に約10〜200単
位/ml、更に好ましくは約30〜165単位/ml、特に好まし
くは約60単位/mlの範囲量の出発分散体または溶液を加
えることができる。本発明による方法においてここに記
載されるヘパリンを使用することにより収率は増加し、
そして一般的に生成物AHFの純度（特異活性により表
現）が高められる。
上記のように、本発明による改善された方法に使用され
る抗血友病性因子蛋白沈殿剤は十分公知であり、そして
単一または多段工程操作において通常単独で使用され、
抗血友病性因子を含む血漿蛋白を単離し、そして精製す
る。本発明による方法に使用される水酸化アルミニウム
懸濁液は水中での水酸化アルミニウムのいずれかの試薬
級ゲル懸濁液であることができる。一般に、用いる水酸
化アルミニウム懸濁液は懸濁液の全重量を基準として約
１〜３％の水中での水酸化アルミニウムの懸濁液であろ
う。用いる水酸化アルミニウム懸濁液の量は出発物質中
に含まれる蛋白質1g当り約0.1〜0.25gの水酸化アルミニ
ウム懸濁液を与える範囲であろう。
用いるポリエチレングリコール沈殿剤は一般的に酸化エ
チレンをエチレングリコールまたは水と反応させて末端
ヒドロキシル基及び末端ヒドロキシルエチル基間に反復
するオキシエチレン基を有する重縮合生成物を得ること
により生成される高分子量重合体である。しばしば「PE
G」と略記されるポリエチレングリコールは約200〜20,0
00、好ましくは約2,000〜10,000、更に好ましくは約3,0
00〜8,000、最も好ましくは約3,000〜4,000の分子量の
範囲であり得る。本発明による方法に用いる際に適し、
そして商業的に入手し得るポリエチレングリコール生成
物の例として、ユニオンカーバイド（Union Carbid
e）Corp。により販売される製品PEG 3550を挙げ得る。
最初の沈殿操作において、抗血友病性因子含有分散体ま
たは溶液の容量を基準として約１〜４重量％のポリエチ
レングリコールを１〜３％の水酸化アルミニウム懸濁液
と一緒にする。第二の沈殿操作において、最初の沈殿か
らの上澄み溶液の容量を基準として約９〜15重量％のポ
リエチレングリコールを生じる溶液の全重量を基準とし
て約10〜20重量％のグリシン及び生じる溶液の全容量を
基準として約10〜20重量％の塩化ナトリウムと一緒にす
る。第二の沈殿操作におけるポリエチレングリコールの
濃度は９〜15重量％のポリエチレングリコール濃度を得
るに十分なポヌエチレングリコールを最初の沈殿操作か
ら回収するポリエチレングリコール水溶液に加えること
により約９〜15％に調整することができる。また、最初
の沈殿操作から回収されるポリエチレングリコール水溶
液を限外ろ過して約９〜15％のポリエチレングリコール
を含む溶液を得ることができ、次にこのものにグリシン
及び塩化ナトリウムを加えることができる。この操作に
使用し得る代表的な限外ろ過膜にはAmiconTM PM 10（1
0,000ダルトン）、RomiconTM PM 10（10,000ダルトン）
などがある。（AmiconはAmicon Corporation,レキシン
トン、マサチユーセツツの商標であり;RomiconはRomico
n Corporation,ウオバーン、マサチユーセツツの商標で
ある）。例として限外ろ過工程に使用し得る適当な循環
ポンプにはAmicon LP-20（Amicon Corporation）空気圧
操作式ダイヤフラムポンプ及びWarren-Rupp Sandpiper
ポンプ（SAI-A-DB-I-SS型）（Thomas and Associate
s,コルテ・マデラ、カリフオルニア）がある。
本発明による方法に使用する際に適し、そして商業的に
入手し得るグリシン生成物の例として、味の素株式会
社、東京により販売されている製品であるグリシンを挙
げ得る。
本発明によりポリエチレングリコール及びグリシンと共
にいずれかの試薬級の塩化ナリトウム生成物を使用し得
る。
本発明の全工程には次の工程が含まれる： （ａ）血漿及び血漿フラクシヨンから選ばれる出発物質
を含む抗血友病性因子を単離し； （ｂ）工程（ａ）からの単離された抗血友病性因子含有
物質の水溶液を生成させ、その際に該溶液は随時及び好
ましくは生じる溶液の全容量を基準として約10〜200単
位/ml、更に好ましくは約30〜165単位/ml、特に好まし
くは約60単位/mlの範囲量でこのものに加えられるヘパ
リンもしくはナトリウムヘパリンまたはその混合物を更
に添加されており； （ｃ）工程（ｂ）からの物質を含む抗血友病性因子の溶
液に懸濁液の全重量を基準として約１〜３重量％、好ま
しくは約２〜３重量％の水中の水酸化アルミニウム、及
び工程（ｂ）からの溶液の容量を基準として約１〜４％
（重量／容量）のポリエチレングリコールを加え、生じ
る混合物のpH値を約6.6〜6.8に、且つ生じる混合物の温
度を約５〜10℃に調整し、そして生じる混合物を約15分
間攪拌することにより第一の血漿蛋白質を沈殿させ； （ｄ）例えば通常の遠心分離法により工程（ｅ）から生
じる沈殿を分離し、そして上澄みのポリエチレングリコ
ール水溶液を回収し； （ｅ）例えば十分なポリエチレングリコールを加える
か、または工程（ｄ）からのポリエチレングリコール水
溶液を限外ろ過することにより工程（ｄ）からのポリエ
チレングリコール水溶液のポリエチレングリコール濃度
と工程（ｄ）からの溶液の容量を基準として約９〜15％
（重量／容量）に調整し、更にかくして調整される溶液
に工程（ｅ）における溶液の全容量を基準として約10〜
20重量％のグリシン及び工程（ｅ）における溶液の全容
量を基準として約10〜20重量％の塩化ナトリウムを加
え、生じる混合物のpH値を5.7〜6.8に、且つ生じる混合
物の温度を約５〜10℃に調整し、そして生じる混合物を
約15分間攪拌することにより第二の血漿蛋白質を沈殿さ
せ； （ｆ）例えば通常の遠心分離法により上澄みのポリエチ
レングリコール水溶液を分離し、そして工程（ｅ）から
生じる沈殿を回収し； （ｇ）例えば塩化ナトリウム−グリシン緩衝溶液を用い
て約２℃でかくて回収される沈殿を洗浄し、そして沈殿
を回収し； （ｈ）工程（ｇ）からの洗浄された沈殿を適当な水性媒
質、例えばクエン酸塩−塩化ナトリウム−グリシン緩衝
溶液に溶解させ； （ｉ）工程（ｈ）で得られる溶液を無菌ろ過し；そして （ｊ）工程（ｉ）からの無菌ろ過した溶液を凍結乾燥し
て乾燥した高純度のAHF生成物を得る。
本発明の方法により製造される生成物からなる製薬学的
調製物は感染媒体、微生物を撲滅するか、もしくは不活
性化するか、または微生物の感染性を減少させ、且つ除
去し、そして該調製物を非ウイルス、殊に非肝炎感染性
にするために常法を用いて処理することができる。この
製薬学的製物は無菌ろ過するか、加熱処理するか、化学
的に処理するか、紫外線で処理するか、またはコロイド
状シリカ上で処理することができる。
例えば湿潤または乾燥状態（即ちそれ自体液体濃縮物ま
たは凍結乾燥物として）の調製物を必要に応じて一般に
熱安定剤の存在下にて約60〜85℃の温度で数分間から数
日間の期間加熱することができる。適当な安定剤には80
より大きい分子量を有する非極性陰イオン、糖、還元糖
及びアミノ酸が含まれる。
適当な非極性陰イオンの例にはカルボン酸、ヒドロキシ
カルボン酸及びアミノ酸の塩例えばカプリル酸、カプリ
ン酸、オレイン酸、ラウリン酸、吉草酸、アセチルフエ
ニルアラニン、アセチルロイシン及びアセチルトリプト
フアンのナトリウムまたはカリウム塩が含まれる。適当
な糖の例にはグルコース、シヨ糖及びマルトースなどが
含まれ、そして適当な還元糖の例にはエリトリトール及
びマンニトールが含まれる。適当なアミノ酸の例にはリ
ジン、グリシン、プロリン及びグルタミン酸などが含ま
れる。
限定しない例として、感染性微生物を減少させるか、ま
たは除去し、そして調製物をビールス感染性にする適当
な通常の公知の方法には米国特許第3,041,242号、同第
3,057,781号、同第3,227,626号、同第4,061,735号、同
第4,137,307号、同第4,297,344号、同第2,705,230号、
同第2,897,123号、同第3,284,301号、同第3,454,929
号、同第4,379,085号、同第4,370,264号、同第4,440,67
9号及び同第4,424,206号並びにヨーロツパ特許出願公告
第0,058,993号、同第0,077,870号及び同第0,094,611
号、並びに該特許中に開示された参考文献に記載される
ものが含まれる。
好適な具体例において、出願の譲り受け人（assignee）
により通常所有の1982年12月20日付け米国特許出願第45
1,646号に記載の熱的に鋭敏な、治療上活性のある蛋白
質をパスツール殺菌する方法を用いることができる。上
記の方法に従つて本発明の方法に応用した際に、代表的
な例としてAHF生成物を水性媒質中で最初に重量対容量
ベースで少なくとも約30％、好ましくは約54％から飽和
までのそれぞれシヨ糖及びエントリトールの如き糖及び
還元糖から選ばれる化合物を有するグリシン、リジン、
アルギニン及びアラニンから選ばれる少なくとも１つの
アミノ酸約0.04〜0.8Mと混合する。次にこの混合物を約
60〜75℃の温度及び約5.5〜8.0のpH値で少なくとも約10
時間加熱する。
次の実施例は本発明のいくつかの具体例のみを説明する
ものであり、そして範囲を限定するためのものではな
い。特記せぬ限りすべての部及び百分率は重量により、
そして温度はセツ氏度によるものである。
実施例１ 新たな低温沈殿400gを４倍容量の射出用水と20〜30℃で
混合した。溶解した低温沈殿を水懸濁液中の２％Al(OH)
364ml（低温沈殿1g当り２％Al(OH)30.16ml）及び分子量
3350を有するポリエチレングリコール（PEG3350、Union
Carbide Corp。）（62g）に加えて溶液中に３％PEGを
得た。1M酢酸を用いてpH値を6.7±0.1に調整した。生じ
た溶液を９℃に冷却し、次に8500rpmで15分間遠心分離
した。沈殿を捨て、そして上澄み液約1850mlを回収し
た。清浄な上澄みにPEG3350（148g）を加えて11％の最
終PEG濃度に調整した。13％グリシン（重量／容量）（2
40.5g）及び14％NaCl（重量／容量）（259g）を加え、
そしてpH値を約5.7に保持することによりこの溶液から
因子VIIIを沈殿させた。この溶液を６℃に冷却し、そし
て8500rpmで15分間遠心分離した。生じた沈殿（約30g）
をグリシン/NaCl緩衝液（13％グリシン/14％NaCl水溶
液）を用いて２℃で洗浄し、8500rpmで15分間遠心分離
し、そしてクエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝液（0.005M
クエン酸ナトリウム、0.13MNaCl及び0.1Mグリシンを含
む水溶液、pH7.2〜7.4）約400gに溶解させた。この生成
物を常法により無菌ろ過し、そして凍結乾燥することが
できた。無菌ろ過後、クエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝
液中にて９単位／A280の特異活性を有する高純度AHF生
成物の溶液400gがかくて得られ、ここにA280は280cm-1
での蛋白質の紫外吸光度であり、そして存在する蛋白質
量の尺度であり；そしてAHF凝血促進剤活性蛋白質の単
位/ml（Ｆ。VIII:C）＝35.0であつた。
比較例Ａ 次のように米国特許第3,631,018号（実施例４）に開示
された方法により比較AHF生成物を調製した： 試薬 クエン酸加食塩水−0.9％食塩水４重量部に対して0.1モ
ル濃度クエン酸ナトリウム１部。
グリシンクエン酸加食塩水−十分なグリシンを上のクエ
ン酸加食塩水に加えてそれぞれ0.1モル濃度のグリシン
溶液を調製した。
緩衝化された洗浄水−0.5モル濃度のクエン酸を用いて
0.5モル濃度のクエン酸ナトリウムをpH6.88に調整する
ことにより製造した緩衝化されたクエン酸塩1/100容量
を蒸留水に加えた。
酢酸−1.0規定及び0.1規定の両方の水溶液を調製。
グリシン−1.3モル濃度の水溶液を調製。
方法 低温沈殿120gにグリシンクエン酸加食塩水を加え、その
量は低温沈殿を表わす血漿の容量の十分の一である。温
環境（室温であるが30℃を越えない）中で低温沈殿及び
グリシンクエン酸加食塩水1500mlを混合して溶解させ
た。
溶解した低温沈殿を0.1規定酢酸でpH6.5に調整した。こ
の溶液にポリエチレングリコール4000を加えてPEG濃度
を3.5％に調整した。この混合物を室温で10分間温和に
攪拌し、次に5000r。ｐ。ｍ。で15分間遠心分離した。
上澄みを傾捨し、そして0.1規定水酸化ナトリウムでpH
6.88に調整した。この溶液に更にポリエチレングリコー
ル4000を加えてｉ＝最終PEG濃度10％に調整した。この
混合物を室温で30分間温和に攪拌し、そして5000r。
ｐ。ｍで１時間半遠心分離した。上澄み傾捨し、そして
沈殿を冷水（２℃）中で洗浄した。次に5000r。ｐ。ｍ
で−４℃の温度にて５分間スピン（spin）洗浄を行つ
た。上澄みを傾捨し、そして沈殿をクエン酸加食塩水に
再溶解させた。
再溶解した沈殿を0.1規定酢酸でpH6.88に調整し、次に
この溶液を６〜10℃の温度に冷却し、そしてグリシンに
関して1.8Mの溶液に調整するに十分なグリシンを加える
ことによりグリシンで再沈殿した。この混合物を２〜10
℃で45〜60分間攪拌した。グリシン沈殿物を洗浄し、清
澄し、次に凍結乾燥した。
公知の酢酸セルロース電気泳動法により測定した際の実
施例１の高純度AHF生成物及び比較例ＡのAHF生成物の種
々の蛋白成分の特異活性（単位／A280）及び相対百分率
を求めた。その結果を下の第１表及び第２表に示す。
第１及び第２表において、A1b＝アルブミン；α1＝アル
フア−１グロブリン；α2＝アルフア−２グロブリン；
β＝ベータ−グロブリン；φ＝フイブリノゲン；及びγ
＝ガンマ−グロブリンである。
第１表はAl(OH)3懸濁液及びPEG3350（３％）の配合物を
用いる実施例１並びにPEGのみ（3.5％）を用いる実施例
Ａにおける最初の沈殿に続いての中間体生成物における
相対的な特異活性及び蛋白質分布を示す。本発明による
方法からの中間体は従来の比較法の中間体のものとかな
り異なつた特性を有していることは注目されよう。
第２表はPEG（11％）、グリシン（13％）及びNaCl（14
％）の配合物を用いる実施例１における第二の沈殿に続
いて、そして実施例Ａにおける第二のPEG（10％）及び
第三の（最後の）グリシン沈殿に続いての最終生成物に
おける相対的な特異活性及び蛋白質分布を示す。本発明
による方法の代表である実施例１の生成物が従来法の代
表である実施例Ａの比較生成物と比べた場合、20倍を越
える大きさの特異活性及び完全に異なつた蛋白質分布を
有することが分るであろう。
実施例２ （ａ）500gの出発低温沈殿を用いる以外は実質的に実施
例１に記載の方法に従つて高純度AHF生成物の他の製造
を行つた。４倍容量の射出用水中の低温沈殿の溶液に対
して20〜30℃で水中の２％Al(OH)3懸濁液81.6ml及びPEG
3350 79gを加えて溶液中に３％PEGを得た。1M酢酸を用
いてpH値を約6.69に調整した。生じた溶液を８℃に冷却
し、次にろ過した。沈殿を捨て、そして上澄み溶液約23
65mlを回収した。生じた中間体はその特性を有してい
た：A280＝4.17;単位/mlAHF凝血促進剤活性蛋白質
（Ｆ。VIII:C）＝12.2;特異活性＝2.93。上澄み溶液を8
80ml及び1500mlの部分に分割した。1500mlの部分を下の
実施例３に記載のように更に処理した。
（ｂ）上記の最初の蛋白沈殿から回収した上澄み溶液88
0mlにPEG3350 70gを加えて最終PEG濃度11％に調整し
た。生じた溶液を470mlの２つの部分に分割した。１つ
の470mlの部分を下の比較例Ｂに記載のように更に処理
した。
（ｃ）11％PEGを含む溶液の他の470mlの部分にグリシン
（13％グリシン）61.1g及びNaCl（14％NaCl）65.8gを加
えた。生じた混合物のpH値を6.7に調整し、そしてこの
混合物を６℃に冷却し、次に8500r。ｐ。ｍ。で15分間
遠心分離した。生じた沈殿をグリシン/NaCl緩衝液を用
いて２℃で洗浄し、8500r。ｐ。ｍで15分間遠心分離
し、そしてクエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝液に溶解さ
せた。無菌ろ過後、22.4gの重さの溶液が得られた。生
じた生成物は次の特性を有していた：A280＝10.9;F。VI
II:C＝128.4単位/ml;特異活性＝11.8;及びフイブリノゲ
ン＝13.1％。
比較例Ｂ 実施例２の（ｂ）部において更に処理するために別にし
ておいた11％PEGを含む溶液の470mlの部分をpH6.7に調
整し、６℃に冷却し、そして8500r。ｐ。ｍ。で15分間
遠心分離した。生じた沈殿をグリシン−NaCl緩衝液を用
いて２℃で洗浄し、8500r。ｐ。ｍ。で15分間遠心分離
し、そしてクエン酢塩−NaCl−グリシン緩衝液に溶解さ
せた。無菌ろ過後、22.3gの重さの溶液を得た。生じた
生成物は次の特性を有していた：A280＝22.0;F。VIII:C
＝46.6単位/ml;特異活性＝2.21;及びフイブリノゲン＝1
9.5％。
実施例３ （ａ）実施例２、（ａ）部における最初の沈殿操作から
生じた上澄み溶液の1500mlの部分を32.5℃で限外ろ過し
て水を除去し、容量を3.6分の１に減少させ、そしてこ
れにより10.5±0.5％の最終PEG濃度を有するPEG水溶液4
15mlを得た。10.5±0.5％のPEGを含む生じた溶液を７℃
に冷却し、そして210ml及び200mlの部分に分割した。20
0mlの部分を下の比較例Ｃに記載のように更に処理し
た。
（ｂ）10.5±0.5％のPEGを含む溶液の210mlの部分にグ
リシン（13％グリシン）27.3g及びNaCl（14％NaCl）29.
4gを加えた。生じた混合物のpH値を7.06に調整し、そし
て混合物を９℃に冷却し、次に8500r。ｐ。ｍ。で15分
間遠心分離した。生じた沈殿をグリシン−NaCl緩衝溶液
を用いて２℃で洗浄し、8500r。ｐ。ｍ。で15分間遠心
分離し、そしてクエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝液に溶
解させた。無菌ろ過後、23.2gの重さの溶液を得た。生
じた生成物は次の特性を有していた：A280＝8.61;F。VI
II:C＝113.6単位/ml;特異活性＝13.2;及びフイブリノゲ
ン＝27.7％。
比較例Ｃ 実施例３、（ａ）部において更に処理するために別にさ
れたPEG10.5±0.5％を含む溶液の200mlの部分をpH7.06
に調整し、７〜９℃に冷却し、そして8500r。ｐ。ｍ。
で15分間遠心分離した。生じた沈殿をグリシン−NaCl緩
衝液を用いて２℃で洗浄し、8500r。ｐ。ｍ。で15分間
遠心分離し、そしてクエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝液
に溶解させた。無菌ろ過後、20.4gの重さの溶液を得
た。生じた生成物は次の特性を有していた：A280＝10.
9;F。VIII:C＝4.4単位/ml;特異活性＝0.4;及びフイブリ
ノゲン＝33.6％。
実施例４ 上の実施例１に記載のクエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝
液に溶解した実施例１による第二の沈殿工程から回収さ
れたAHFを含む約100gのペーストまたは沈殿の約100gの
溶液約2.75kgにグリシン、リジン、CaCl2及びシヨ糖を
加えて0.8モル/lのグリシン、0.8モル/lのリジン、2.0
ミリモル/lのCaCl2及び1.2g/mlのシヨ糖を含む混合物を
得た。この混合物を60℃で10時間加熱してパスツール殺
菌し、次にクエン酸塩−NaCl−グリシン緩衝液に対して
二重ろ過（diafilter）した。無菌ろ過後、次の特性を
有する溶液2.55kgを得た：A280＝3.91;AHF凝血促進剤活
性（VIII:C）32.2単位/ml;及び特異活性＝8.26単位／A
280。〔凝血促進剤活性（Ｆ。VIII:C）はラングデル（L
angdell）らによるＪ。Lab。Clin。Med。，41,637（195
3）及びプロクター（Procter）らによるAm。Ｊ。Clin。
Path。，36,212（1961）の方法から改良した−工程APTT
試験により測定した〕。
実施例５ 上の実施例１に記載のように約250mlのクエン酸塩−NaC
l−グリシン緩衝液に溶解させた、比較的に減少させた
量の試薬を用いて新たな低温沈殿250gで出発した実施例
１による第二の沈殿工程から回収されたAHFを含むペー
ストまたは沈殿の溶液約250mlにアルブミンを加えて2.5
mg/mlのアルブミンを含む溶液を得た。AHF濃縮物／アル
ブミン混合物を無菌ろ過し、無菌的に瓶に充てんし、そ
して通常の技術を用いて凍結乾燥した。瓶中に含まれる
凍結乾燥されたAHF濃縮物を68℃で72時間加熱してパス
ツール殺菌した。次に、この乾燥し、熱処理したAHF濃
縮物を射出用水10ml中で還元させた。この還元し、熱処
理した代表的瓶のAHF濃縮物は次の特性を有していた：
蛋白質含有量＝3.00mg/ml;F。VIII:C＝23.8単位/ml;及
び特異活性＝7.93単位/mg蛋白質。
実施例６ この実施例は出発物質の溶液にヘパリンを加えることを
用いる本発明の具体例により達成される改善法を更に説
明するものである。実質的に実施例１に記載の方法に従
つて、ヘパリンを用いて高純度AHF生成物を製造し、そ
の際に下の第３表に示す条件下で出発低温沈殿を溶解さ
せる最初の水中に該ヘパリンを配合させて導入するか、
またはヘパリンなしで行つた。
第３表中のデータは高純度AHF生成物が従来公知である
方法により製造された匹敵する生成物におけるフイブリ
ノゲンの量に対して生成物中のフイブリノゲン量の減少
を与える本発明の多段工程による利点に加えて、本発明
の多段工程による全体的な収率改善はこの工程において
低温沈殿を溶解させる際に用いられる水性媒質中か、ま
たは低温沈殿の溶液もしくは懸濁液にヘパリンを加える
ことにより更に改善し得ることを示している。上のデー
タは特異活性における変化を示し、いずれのパターンで
あるかを理解し、そして識別するものではないが、特に
大規模製造における収率の増大に利点があり、そしてフ
イブリノゲン量の減少により種々の、または低い特異活
性が許容される。
ヘパリンまたはその組成物の添加を用いる本発明の具体
例により製造された高純度AHF生成物は0.8Mグリシン、
0.8Mリジン、2.0ミリモルCaCl2及び1.2g/mlシヨ糖の存
在下で実施例５（68℃で72時間「乾式」加熱処理）また
は実施例４（60℃で10時間「湿式」加熱処理）に記載の
通りに処理し、生成物または組成物をパスツール殺菌す
ることができた。上の実施例6hに記載のように加えられ
たヘパリン（60μ/ml）を用いて製造されたAHFの代表的
試料を無菌ろ過し、そして実施例５に記載されるように
「乾式」加熱処理して「乾式」加熱処理工程における加
熱前のAHFの出発量を基準として最終平均80％の％収率
が得られた。上の実施例ｈ、ｊ、ｌ及びｎに記載のよう
に加えられたヘパリン（60μ/ml）を用いて製造されたA
HFの代表的試料を実施例４に記載のように「湿式」加熱
処理して「湿式」加熱処理工程における加熱前の出発AH
Fを基準として最終平均収率72％が得られた。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）血漿及び血漿フラクシヨンから選ば
    れる出発物質を含む抗血友病性因子を単離し； （ｂ）工程（ａ）からの出発物質を含むかくして単離さ
    れた抗血友病性因子の溶液を生成させ； （ｃ）工程（ｂ）からの出発物質を含む抗血友病性因子
    の溶液に、工程（ｂ）からの溶液の容量を基準として約
    １〜４％（重量／容量）のポリエチレングリコールを加
    え、生じる混合物のpH値を約6.6〜6.8に、且つ生じる混
    合物の温度を約５〜10℃に調整し、そして生じる混合物
    を約15分間攪拌することにより第一の血漿蛋白質を沈殿
    させ； （ｄ）工程（ｃ）から生じる沈殿を分離し、そして上澄
    みのポリエチレングリコール水溶液を回収し； （ｅ）工程（ｄ）からのポリエチレングリコール水溶液
    のポリエチレングリコール濃度を、工程（ｄ）からの溶
    液の容量を基準として約９〜15％（重量／容量）に調整
    し、生じる混合物のpH値を約5.7〜6.8に、且つ生じる混
    合物の温度を約５〜10℃に調整し、そして生じる混合物
    を約15分間攪拌することにより第二の血漿蛋白質を沈殿
    させ；そして （ｆ）工程（ｅ）からの上澄みのポリエチレングリコー
    ル水溶液を分離し、そして沈殿を回収する 工程により、促進された特異活性及び減少されたフィブ
    リノーゲン不純物を有する高純度抗血友病性因子濃縮物
    を製造する方法において、 （ｉ）工程（ｃ）における第一の沈殿におけるポリエチ
    レングリコールを、懸濁液の全重量を基準として約１〜
    ３重量％の水酸化アルミニウムを水中に含む懸濁液と一
    緒にし、その際水酸化アルミニウム懸濁液は出発物質を
    含む出発抗血友病性因子中の蛋白質1g当り水酸化アルミ
    ニウム約0.1〜0.25gの比で用い、そして （ii）工程（ｅ）における第二の沈殿におけるポリエチ
    レングリコールを、工程（ｅ）中の溶液の全容量を基準
    として約10〜20重量％のグリシン及び工程（ｅ）中の溶
    液の全容量を基準として約10〜20重量％の塩化ナトリウ
    ムと一緒にする ことを特徴とする改良法。
  2. 【請求項２】工程（ａ）において血漿から単離される抗
    血友病性因子を含む血漿フラクシヨンが低温沈殿物であ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】（ｉ）工程（ｃ）における第一の沈殿を、
    約２〜３重量％のポリエチレングリコール及び約２〜３
    ％の水酸化アルミニウムの水中の懸濁液を出発血漿フラ
    クシヨンの蛋白質1g当り約0.15〜0.2gの比の水酸化アル
    ミニウム懸濁液を用いて行い、そして（ii）工程（ｅ）
    における第二の沈殿を、約10〜15重量％のポリエチレン
    グリコールに対して、約12〜18重量％のグリシン及び約
    12〜18重量％の塩化ナトリウムを用いて行う特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】（ｉ）工程（ｃ）における第一の沈殿を、
    約２〜３重量％のポリエチレングリコール及び約２〜３
    ％の水酸化アルミニウムの水中の懸濁液を出発血漿フラ
    クシヨンの蛋白質1g当り約0.15〜0.2gの比の水酸化アル
    ミニウム懸濁液を用いて行い、そして（ii）工程（ｅ）
    における第二の沈殿を、約10〜15重量％のポリエチレン
    グリコールに対して約12〜18重量％のグリシン及び約12
    〜18重量％の塩化ナトリウムを用いて行う特許請求の範
    囲第２項記載の方法。
  5. 【請求項５】（ｉ）工程（ｃ）における第一の沈殿を、
    約３重量％のポリエチレングリコール及び３％の水酸化
    アルミニウムの水中の懸濁液を出発血漿フラクシヨンの
    蛋白質1g当り約0.16gの比の水酸化アルミニウム懸濁液
    を用いて行い、そして（ii）工程（ｅ）における第二の
    沈殿を、約10〜12重量％のポリエチレングリコールに対
    して、約12〜15重量％のグリシン及び約12〜15重量％の
    塩化ナトリウムを用いて行う特許請求の範囲第４項記載
    の方法。
  6. 【請求項６】（ｉ）工程（ｃ）における第一の沈殿を、
    約３重量％のポリエチレングリコール及び約３％の水酸
    化アルミニウムの水中の懸濁液を出発血漿フラクシヨン
    の蛋白質1g当り約0.16gの比の水酸化アルミニウム懸濁
    液を用いて行い、そして（ii）工程（ｅ）における第二
    の沈殿を、約11重量％のポリエチレングリコールに対し
    て約13重量％のグリシン及び約14重量％の塩化ナトリウ
    ムを用いて行う特許請求の範囲第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】工程（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも１つに
    おいて、ヘパリン、ナトリウムヘパリンまたはその混合
    物の少なくとも１種を溶液または懸濁液1mlあたり10〜2
    00単位の量の範囲内で加える特許請求の範囲第１項記載
    の方法。
  8. 【請求項８】工程（ｆ）から回収した沈殿を可溶化し、
    可溶化した沈殿を無菌ろ過し、次に無菌ろ過した可溶化
    沈殿を凍結乾燥する工程を更に含む特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  9. 【請求項９】工程（ｂ）において約60単位/mlのヘパリ
    ン、ナトリウムヘパリンまたはその混合物の少なくとも
    １種を加える特許請求の範囲第６項記載の方法。
  10. 【請求項１０】無菌ろ過した可溶化沈殿を処理して感染
    微生物を減少させ且つ除去し、そして無菌ろ過した可溶
    化沈殿を非肝炎感染性にする工程を更に含む特許請求の
    範囲第６項記載の方法。
  11. 【請求項１１】無菌ろ過した可溶化沈殿を処理して感染
    微生物を減少させ且つ除去し、そして無菌ろ過した可溶
    化沈殿を非肝炎感染性にする工程を更に含む特許請求の
    範囲第７項記載の方法。
  12. 【請求項１２】無菌ろ過した可溶化沈殿を処理して感染
    微生物を減少させ且つ除去し、そして無菌ろ過した可溶
    化沈殿を非肝炎感染性にする工程を更に含む特許請求の
    範囲第８項記載の方法。
JP60167835A 1984-10-04 1985-07-31 高純度抗血友病性因子濃縮物の製造法 Expired - Lifetime JPH0676337B2 (ja)

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